JPH1048182A - Decision apparatus for base sequence - Google Patents
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- JPH1048182A JPH1048182A JP9130668A JP13066897A JPH1048182A JP H1048182 A JPH1048182 A JP H1048182A JP 9130668 A JP9130668 A JP 9130668A JP 13066897 A JP13066897 A JP 13066897A JP H1048182 A JPH1048182 A JP H1048182A
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Abstract
Description
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡあるいはＲＮＡの
塩基配列決定方法及び塩基配列決定装置に係わり、特に
測定時間の短縮に好適な方法及び装置に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method and an apparatus for determining the base sequence of DNA or RNA, and more particularly to a method and apparatus suitable for shortening the measurement time.
【従来の技術】従来、ＤＮＡなどの塩基配列決定はＤＮ
Ａ断片を放射性元素で標識し、長さに応じてゲル電気泳
動分離したパターンをオートラジオグラフイーで写真に
転写し、ＤＮＡバンドパターンを読み取ることによりな
されていた。これは手間と時間のかかる難点があった。
そこで放射性標識に代わり、蛍光標識を用いて、実時間
でＤＮＡ断片を分離検出して塩基配列を決定する手法が
発展してきた。このような蛍光標識を用いた実時間検出
法及びこれに用いる光検出型電気泳動装置については、
例えば、ジャーナル オブ バイオケミカル アンド
バイオフイジカルメソーズ １３（１９８６）３１５−
３２３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ
１３（１９８６）３１５−３２３）、あるいはネーチ
ャー ３２１，１２，６月，１９８６，第６７４頁−第
６７９頁（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．３２１ １２ Ｊｕ
ｎｅ １９８６）に記載されている。2. Description of the Related Art Conventionally, DNA and other nucleotide sequences have been
The fragment A was labeled with a radioactive element, the pattern obtained by gel electrophoresis separation according to the length was transferred to a photograph by autoradiography, and the DNA band pattern was read. This had the disadvantage that it was troublesome and time-consuming.
Thus, a technique has been developed in which a DNA fragment is separated and detected in real time to determine a base sequence by using a fluorescent label instead of a radioactive label. About the real-time detection method using such a fluorescent label and the light detection type electrophoresis apparatus used for the method,
For example, Journal of Biochemical and
Bioactive Physical Methods 13 (1986) 315-
323 (Journal of Biochemical)
l and Biophysical Methods
13 (1986) 315-323), or Nature 321, December, June, 1986, pp. 674-679 (Nature Vol. 321 12 Ju).
ne 1986).
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術では、泳
動開始から測定終了までに５〜１０時間もの長時間を要
する難点があった。このような長時間泳動を必要とする
原因はゲル電気泳動現象の詳細が知られていないこと、
実時間検出法ではオートラジオグラムを目視してバンド
を読み取る時の位置分解能よりも光検出の位置分解能が
悪く、長い泳動路を必要とすること、それにもかかわら
ずオートラジオグラフイーと同じような通常８％程度の
高いアクリルアミド濃度の泳動分離器で測定を行なって
いることなどによる。本発明の課題はこの難点を解決
し、短時間で測定を終了しえるＤＮＡあるいはＲＮＡの
塩基配列決定方法及び装置を提供することにある。In the above-mentioned prior art, there is a problem that it takes as long as 5 to 10 hours from the start of the electrophoresis to the end of the measurement. The reason why such long-time electrophoresis is required is that the details of the gel electrophoresis phenomenon are not known,
In the real-time detection method, the position resolution of light detection is lower than the position resolution when reading bands by observing the autoradiogram, and a long electrophoresis path is required. This is due to the fact that the measurement is carried out using a migration separator having a high acrylamide concentration of usually about 8%. An object of the present invention is to provide a method and an apparatus for determining the base sequence of DNA or RNA, which can solve the above-mentioned difficulties and can complete the measurement in a short time.
【課題を解決するための手段】そこで上記短時間計測と
いう目的は、ゲル電気泳動の諸条件を最適化することに
より達成される。具体的には、電気泳動分離器に用いる
ゲルのポリアクリルアミド濃度Ｃを２％〜６％とするこ
とで達成される。より詳細には、測定上支障のない電界
強度及び温度Ｔの下で、隣接するＤＮＡバンドを識別す
ると共に泳動に要する時間ｔをできるだけ小さくするよ
うなゲル濃度Ｃ、及び泳動開始点からレーザ照射部まで
の泳動距離（泳動路長）Ｌを選ぶ。Accordingly, the object of the short-time measurement is achieved by optimizing various conditions of gel electrophoresis. Specifically, this is achieved by setting the polyacrylamide concentration C of the gel used for the electrophoresis separator to 2% to 6%. More specifically, under the electric field intensity and the temperature T at which there is no problem in the measurement, the gel concentration C for identifying the adjacent DNA band and minimizing the time t required for the electrophoresis as much as possible, and the laser irradiation part from the electrophoresis start point. Up to the migration distance (migration path length) L.
【作用】塩基長ＮのＤＮＡ断片の泳動速度Ｖ（Ｎ）を用
いると泳動路長Ｌを泳動するに要する時間ｔは（数１）
と表示できる。Using the electrophoresis speed V (N) of a DNA fragment having a base length of N, the time t required for electrophoresis of the electrophoresis path length L is (Equation 1)
Can be displayed.
【数１】 ｔ＝Ｌ／Ｖ（Ｎ） …（数１） Ｖ（Ｎ）はゲル中の電界強度Ｅに比例し、Ｖ（Ｎ）＝Ｅ
・Ｖ0（Ｎ，Ｃ，Ｔ）と表され、比例係数Ｖ0（Ｎ，Ｃ，
Ｔ）は、ＤＮＡ断片の塩基数即ち塩基長Ｎ、ポリアクリ
ルアミドの濃度Ｃ、及び温度Ｔの関数である。T = L / V (N) (Equation 1) V (N) is proportional to the electric field strength E in the gel, and V (N) = E
V 0 (N, C, T), and the proportional coefficient V 0 (N, C, T)
T) is a function of the number of bases of the DNA fragment, that is, the base length N, the concentration C of polyacrylamide, and the temperature T.
【数２】 ｔ＝Ｌ／｛Ｅ・Ｖ0（Ｎ，Ｃ，Ｔ）｝ …（数２） 電界強度Ｅを高くすると泳動に要する時間ｔは小さくで
きるが、ジュール熱が発生してゲル板の温度Ｔが高くな
りＤＮＡバンドの分離に支障をきたす。測定上支障のな
い電界強度Ｅ及び温度（Ｔ）の下で、ＤＮＡバンドを識
別すると共に泳動に要する時間ｔをできるだけ小さくす
るようなゲル濃度Ｃ及び泳動路長Ｌを選ぶことにより短
時間計測を実現できる。T = L / {E · V 0 (N, C, T)} (Equation 2) When the electric field strength E is increased, the time t required for electrophoresis can be shortened. , The temperature T increases, which hinders DNA band separation. Under the electric field intensity E and the temperature (T) at which there is no problem in the measurement, the DNA band is identified and the gel concentration C and the migration path length L are selected so as to minimize the time t required for the electrophoresis. realizable.
【実施例】以下、本発明の一実施例を図１〜図５を用い
て説明する。図１は本発明による光検出型電気泳動装置
の一例である。レーザー源３１から得た励起用レーザー
１はレンズ２を通して側面から電気泳動ゲル４に入る。
電気泳動ゲル４は石英板３に保持されている。蛍光標識
ＤＮＡなどの試料３２は、例えばゲル４の上端部を泳動
開始点として泳動分離されながらゲル４の下端部に向か
つて進んでゆく。泳動開始点から一定距離の所をレーザ
ー１は照射し、そこを通過する蛍光標識ＤＮＡからの蛍
光をフイルタ５付きレンズ６で集光し、イメージ増幅器
７で増幅しリレーレンズ８を通した後ビジコンカメラ９
で検出する。得られた信号は計算機１０で処理され出力
される。レーザーを側面から入れる代わりに前面から一
定路上をスキャンして照射してもよい。泳動時間は（数
２）からわかるように泳動開始点からレーザ照射部まで
の距離（泳動距離）Ｌ、ポリアクリルアミドゲルの濃度
Ｃ、ゲル板の上下両端に加える電圧ｖ（あるいはゲル中
での電界強度Ｅ）に依存する。図２は種々のゲル濃度Ｃ
におけるＤＮＡ断片の泳動時間ｔを示したものである。
ＤＮＡ断片の泳動時間ｔは、泳動速度Ｖ（Ｎ）が電界強
度Ｅに比例すること及び図２から（数２）と表示でき
る。なお、Ｖ0（Ｎ，Ｃ，Ｔ）＝ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ
（Ｔ）である。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS One embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS. FIG. 1 shows an example of a photodetection type electrophoresis apparatus according to the present invention. The excitation laser 1 obtained from the laser source 31 enters the electrophoresis gel 4 from the side through the lens 2.
The electrophoresis gel 4 is held on the quartz plate 3. The sample 32 such as a fluorescence-labeled DNA advances toward the lower end of the gel 4 while being subjected to electrophoretic separation with the upper end of the gel 4 as an electrophoresis starting point, for example. The laser 1 irradiates a certain distance from the electrophoresis start point, and the fluorescence from the fluorescently labeled DNA passing therethrough is collected by the lens 6 with the filter 5, amplified by the image amplifier 7, passed through the relay lens 8, Camera 9
To detect. The obtained signal is processed and output by the computer 10. Instead of inserting the laser from the side, it may scan and irradiate a fixed road from the front. As can be seen from (Equation 2), the migration time is the distance (migration distance) L from the migration start point to the laser irradiation part, the concentration C of the polyacrylamide gel, the voltage v applied to the upper and lower ends of the gel plate (or the electric field in the gel). Intensity E). FIG. 2 shows various gel concentrations C
5 shows the migration time t of the DNA fragment in FIG.
The migration time t of the DNA fragment can be expressed as (Equation 2) from FIG. 2 that the migration speed V (N) is proportional to the electric field strength E. V 0 (N, C, T) = f (C, T) N + g
(T).
【数３】 ｔ＝（Ｌ／Ｅ）｛ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）｝ …（数３） 即ち、泳動時間ｔは、泳動距離Ｌ、ゲル中での電解強度
Ｅの逆数（１／Ｅ）に比例する。ここで、ｆ（Ｃ，Ｔ）
及びｇ（Ｔ）はポリアクリルアミドの濃度Ｃ、及び温度
Ｔの関数である。塩基長Ｎを零に漸近した時の泳動時間
ｔ0は（数３）のＬ・ｇ（Ｔ）／Ｅに等しく、ｔ0＝Ｌ・
ｇ（Ｔ）／Ｅであり、ｔ0はＬに比例し、ｇ（Ｔ）、Ｅ
に依存するが、濃度Ｃによらない（（数３）はこのｔ0
を用いて、ｔ＝（Ｌ／Ｅ）ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｔ0とな
る）。図１からｔ0≒２７分である。（数１）及び（数
３）からＶ（Ｎ）は（数４）と表示できる。T = (L / E) {f (C, T) N + g (T)} (Equation 3) That is, the migration time t is determined by the migration distance L and the reciprocal of the electrolysis intensity E in the gel (1 / E). Where f (C, T)
And g (T) are a function of the concentration C of the polyacrylamide and the temperature T. The migration time t 0 when the base length N is asymptotically reduced to zero is equal to L · g (T) / E in (Equation 3), and t 0 = L ·
g (T) / E, where t 0 is proportional to L, g (T), E
Depends on, it does not depend on the concentration C ((number 3) The t 0
With, and t = (L / E) f (C, T) N + t 0). From FIG. 1, t 0 ≒ 27 minutes. From (Equation 1) and (Equation 3), V (N) can be expressed as (Equation 4).
【数４】 Ｖ（Ｎ）＝Ｅ／｛ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）｝ …（数４） 時間ｔだけ泳動した時の隣接したバンドの間隔ｄは（数
５）となる。V (N) = E / {f (C, T) N + g (T)} (Equation 4) The interval d between adjacent bands when electrophoresed for time t is (Equation 5).
【数５】 ｄ＝｛Ｖ（Ｎ）−Ｖ（Ｎ＋１）｝ｔ ＝Ｌ／｛Ｎ＋（ｇ（Ｔ）／ｆ（Ｃ，Ｔ））｝ …（数５） この（数５）からバンド間隔ｄは塩基長Ｎの値が大きい
時、ポリアクリルアミドの濃度Ｃにあまり依存せず、Ｌ
／Ｎに近くなることがわかる。例えば、Ｌ＝２２０ｍｍ
とする時、Ｎ＝１００、２００、３００、４００塩基に
対して、Ｌ／Ｎ＝２．２、１．１、０．７３、０．５５
となる。図３は実測のバンド間隔の濃度依存性を種々の
塩基長Ｎについて示したものである。泳動距離は２２ｃ
ｍである。塩基長Ｎが１００程度と短い時にはゲル濃度
Ｃを上げるとバンド間隔ｄも大きくなるが、塩基長Ｎが
２００以上、とくに３００あるいは４００になってくる
とゲル濃度Ｃ、６％ではバンド間隔はほぼ一定になり、
６％以上のゲルの使用は単に泳動時間の増大を招くだけ
であることがわかる。一方、ＤＮＡバンド幅ωはゲル濃
度Ｃにほとんど依存せず、√Ｌにほぼ比例することが実
験から確認できた。そこで、ωは（数６）で表わすこと
ができる。D = {V (N) -V (N + 1)} t = L / {N + (g (T) / f (C, T))} (Equation 5) From this (Equation 5), the band interval When the value of the base length N is large, d does not depend much on the concentration C of polyacrylamide.
/ N. For example, L = 220 mm
L / N = 2.2, 1.1, 0.73, 0.55 for N = 100, 200, 300, 400 bases
Becomes FIG. 3 shows the concentration dependence of the actually measured band interval for various base lengths N. Migration distance is 22c
m. When the base length N is as short as about 100, the band interval d increases when the gel concentration C is increased. However, when the base length N is 200 or more, particularly 300 or 400, the band interval is almost equal at the gel concentration C and 6%. Become constant,
It can be seen that the use of 6% or more of the gel merely causes an increase in the migration time. On the other hand, it was confirmed from the experiment that the DNA bandwidth ω hardly depends on the gel concentration C and is almost proportional to ΔL. Therefore, ω can be represented by (Equation 6).
【数６】 ω＝ω0（Ｎ，Ｔ）√Ｌ …（数６） 図４は種々の塩基長Ｎの泳動時間のポリアクリルアミド
ゲル濃度依存性を示したものである（図２では塩基長Ｎ
に対する泳動時間ｔの変化を示したが、図２を書きかた
図４は、ポアクリルアミド濃度Ｃに対する泳動時間ｔの
変化を示し、濃度Ｃを零に漸近した時の泳動時間は図２
に示すｔ0であり、濃度Ｃによらない）。濃度Ｃのほぼ
２乗に比例して泳動時間が増大することがわかる。温度
Ｔを一定にした時、泳動時間ｔは泳動路長Ｌとゲル濃度
Ｃの函数である。二つの隣接バンドを識別するには少な
くともｄ≧ωである必要がある。そこでｄ＝ωとおい
て、泳動時間ｔをゲル濃度Ｃだけの函数にして、泳動時
間ｔを最小にするゲル濃度Ｃを求めた。ｄ＝ω、（数
５）、（数６）から（数７）のようにＬを求め、（数
３）に代入して（数８）を得る。Ω = ω 0 (N, T) √L (Equation 6) FIG. 4 shows the polyacrylamide gel concentration dependence of the migration time of various base lengths N (base length in FIG. 2). N
FIG. 4 shows how the migration time t changes with respect to the polyacrylamide concentration C. The migration time when the concentration C is asymptotically reduced to zero is shown in FIG.
A t 0 shown in, not according to the concentration C). It can be seen that the migration time increases in proportion to the square of the concentration C. When the temperature T is kept constant, the migration time t is a function of the migration path length L and the gel concentration C. At least d ≧ ω is required to distinguish two adjacent bands. Then, with d = ω, the migration time t was made a function of the gel concentration C only, and the gel concentration C that minimized the migration time t was determined. L is obtained as in (Equation 7) from d = ω, (Equation 5) and (Equation 6), and is substituted into (Equation 3) to obtain (Equation 8).
【数７】 Ｌ＝ω0 2（Ｎ，Ｔ）｛Ｎ＋（ｇ（Ｔ）／ｆ（Ｃ，Ｔ））｝2 …（数７）L = ω 0 2 (N, T) ｛N + (g (T) / f (C, T))｝ 2 (Equation 7)
【数８】 ｔ＝ω0 2（Ｎ，Ｔ）｛ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ）｝3／｛Ｅｆ2（Ｃ，Ｔ）｝ …（数８） （数８）を用い（ｄｔ／ｄＣ）＝０からＣを変化させた
時にｔを極小とするＣ値が求めるゲル濃度である。T = ω 0 2 (N, T) ｛f (C, T) N + g (T)｝ 3 / ｛Ef 2 (C, T)｝ (Equation 8) / DC) = 0 The C value that minimizes t when C is changed from 0 is the gel concentration to be determined.
【数９】 （ｄｔ／ｄＣ）＝｛ω0 2（Ｎ，Ｔ）／（Ｅｆ4（Ｃ，Ｔ））｝× ｛３（ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ（Ｔ））2ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ−２（ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ ｇ（Ｔ））3｝ｆ（Ｃ，Ｔ）｛ｄｆ（Ｃ，Ｔ）／ｄＣ｝＝０ …（数９） （数９）より、ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ｇ（Ｔ）を得る。即
ち図４上で（ｔ−ｔ0）＝（Ｌ／Ｅ）ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝
（Ｌ／Ｅ）２ｇ（Ｔ）＝２ｔ0となるゲル濃度Ｃがｔを
最小にするもので、塩基長Ｎが１００、２００、３００
及び４００の時、それぞれ６．２％、４．３％、３．２
％及び２．６％である。なお、ｔの最小値ｔminは、
（数３）のｔ＝（Ｌ／Ｅ）｛ｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＋ｇ
（Ｔ）｝にｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝２ｇ（Ｔ）を代入して、ｔ
＝（Ｌ／Ｅ）｛３ｇ（Ｔ）｝を得て、さらにｔ0＝Ｌ・
ｇ（Ｔ）／Ｅを用いると、ｔmin＝３ｔ0≒３×２７＝８
１（分）となり、図４においてｔminに対応する濃度Ｃ
を読み取れば上記のｔを最小にするゲル濃度Ｃとなる。
実際の分析では２００〜３００塩基長の分析をすること
が多い。二つの隣接バンドを識別して分離に必要なゲル
泳動路長Ｌ（＝Ｌ*）は、（数７）にｆ（Ｃ，Ｔ）Ｎ＝
２ｇ（Ｔ）を代入して求めることができる。(Dt / dC) = {ω 0 2 (N, T) / (Ef 4 (C, T))} × {3 (f (C, T) N + g (T)) 2 f (C, T) N−2 (f (C, T) N + g (T)) 3 {f (C, T)} df (C, T) / dC} = 0 (Equation 9) (C, T) N = 2g (T) is obtained. That is, in FIG. 4, (t−t 0 ) = (L / E) f (C, T) N =
(L / E) 2g (T) = 2t 0 , the gel concentration C minimizes t, and the base length N is 100, 200, 300
And 400, 6.2%, 4.3%, and 3.2, respectively.
% And 2.6%. Note that the minimum value t min of t is
T = (L / E) ｛f (C, T) N + g in (Equation 3)
Substituting f (C, T) N = 2g (T) into (T)｝, t
= (L / E) {3g (T)}, and t 0 = L ·
Using g (T) / E, t min = 3t 0 ≒ 3 × 27 = 8
1 (minute), and the density C corresponding to t min in FIG.
Is read, the gel concentration C is obtained to minimize the above-mentioned t.
In actual analysis, analysis of 200 to 300 bases is often performed. The gel migration path length L (= L * ) required for discriminating the two adjacent bands and separating them is expressed by (Equation 7) as f (C, T) N =
It can be obtained by substituting 2g (T).
【数１０】 Ｌ*＝（９／４）Ｎ2ω0 2（Ｎ，Ｔ） …（数１０） ω0（Ｎ，Ｔ）は、（数６）より泳動路長Ｌ0の時のバン
ド幅の実測値ωobsからωobs／√Ｌ0により求めること
ができ、Ｌ*＝（９／４）Ｎ2ωobs 2／Ｌ0となる。ゲル
板厚さを０．３ｍｍとし、電界強度５０Ｖ／ｃｍの時に
泳動時間を最小とするポリアクリルアミド濃度Ｃと泳動
路長Ｌ（＝Ｌ*）及びその時の泳動時間ｔ）を、以下
に、｛塩基長Ｎ：ポリアクリルアミド濃度Ｃ（％）：泳
動路長Ｌ（＝Ｌ*）（ｃｍ）：泳動時間ｔ（分）｝とし
て示す。図２（図４）の結果を得たときの泳動路長を
Ｌ’とするとき、ｔ0＝Ｌ’・ｇ（Ｔ）／Ｅ≒２７分で
あるから、ｇ（Ｔ）／Ｅ＝２７／Ｌ’となり、ｔ0が
Ｌ’に比例するから、泳動路長Ｌ*を泳動するに要する
泳動時間３ｔ0は、３ｔ0＝（８１／Ｌ’）Ｌ*から得ら
れる（なお、以下の結果を与えるＬ’は約２２ｃｍであ
る）。 ｛Ｎ＝１００：Ｃ＝６．２％：Ｌ*＝ ６ｃｍ：ｔ＝
２２分｝ ｛Ｎ＝２００：Ｃ＝４．３％：Ｌ*＝１５ｃｍ：ｔ＝
５６分｝ ｛Ｎ＝３００：Ｃ＝３．２％：Ｌ*＝２８ｃｍ：ｔ＝１
０６分｝ ｛Ｎ＝４００：Ｃ＝２．６％：Ｌ*＝４１ｃｍ：ｔ＝１
５６分｝ ここで示した値は１つの目安であり、泳動電圧、泳動ゲ
ルの濃度、ゲルの厚さなどで若干変化する。しかし、長
い塩基長のＤＮＡ断片を含む試料を、少なくともｄ≧ω
として、二つの隣接バンドを識別する好適なバンド間隔
で高速に電気泳動分離するには、ポリアクリルアミド濃
度が２％〜６％のゲルの使用が好適であることがわか
る。この濃度範囲は、従来使用されていた濃度よりはは
るかに低い濃度である。ここで得た条件は約１．５時間
で３００塩基までの計測を行なうことができる。 図５
には３％ゲルを用いて泳動路長２２ｃｍで測定した結果
を示す。泳動路長が２８ｃｍよりも短いので分離は十分
ではないが、３００塩基近傍の塩基が識別できることが
わかる。３００塩基長のＤＮＡ断片の泳動時間は７７分
であった。L * = (9/4) N 2 ω 0 2 (N, T) (Equation 10) ω 0 (N, T) is a band at the migration path length L 0 according to (Equation 6). It can be obtained from the measured width value ω obs by ω obs / √L 0 , and L * = (9/4) N 2 ω obs 2 / L 0 . The polyacrylamide concentration C, the migration path length L (= L * ) and the migration time t) at which the migration time is minimized when the gel plate thickness is 0.3 mm and the electric field strength is 50 V / cm are as follows: Base length N: polyacrylamide concentration C (%): migration path length L (= L * ) (cm): migration time t (minute)}. When the migration path length when the result of FIG. 2 (FIG. 4) is obtained is L ′, since t 0 = L ′ · g (T) / E ≒ 27 minutes, g (T) / E = 27 / L ′, and t 0 is proportional to L ′, so that the migration time 3t 0 required to migrate the migration path length L * is obtained from 3t 0 = (81 / L ′) L * (the following: L 'giving the result is about 22 cm). ｛N = 100: C = 6.2%: L * = 6 cm: t =
22 minutes｝ N = 200: C = 4.3%: L * = 15 cm: t =
56 minutes｝ N = 300: C = 3.2%: L * = 28 cm: t = 1
06 minutes｝ N = 400: C = 2.6%: L * = 41 cm: t = 1
56 minutes｝ The values shown here are only a guide and slightly vary depending on the migration voltage, the concentration of the migration gel, the thickness of the gel, and the like. However, at least d ≧ ω
It can be seen that the use of a gel having a polyacrylamide concentration of 2% to 6% is suitable for high-speed electrophoretic separation at a suitable band interval for discriminating two adjacent bands. This concentration range is much lower than the concentration conventionally used. The conditions obtained here can measure up to 300 bases in about 1.5 hours. FIG.
Shows the results of measurement using a 3% gel at a migration path length of 22 cm. Since the migration path length is shorter than 28 cm, separation is not sufficient, but it can be seen that bases near 300 bases can be identified. The electrophoresis time of the DNA fragment having a length of 300 bases was 77 minutes.
【発明の効果】本発明によれば従来５〜１０時間を必要
としていたＤＮＡ断片の測定が１時間余で行なうことが
でき、塩基配列決定に必要な時間を飛躍的に短縮できる
という効果がある。また、蛍光計測ではゲルからの散乱
光や蛍光が背景光となり検出下限を決めていたが、低い
ゲル濃度ではこれら背景光も低下するので高感度検出が
できる利点もある。According to the present invention, the measurement of a DNA fragment, which conventionally required 5 to 10 hours, can be performed in less than 1 hour, and the time required for base sequence determination can be greatly reduced. . In the fluorescence measurement, the scattered light and the fluorescence from the gel serve as background light, and the lower limit of detection is determined. However, at a low gel concentration, the background light also decreases, so that there is an advantage that high sensitivity detection is possible.
【図１】本発明による光検出型電気泳動装置の１実施例
の概念図。FIG. 1 is a conceptual diagram of one embodiment of a light detection type electrophoresis apparatus according to the present invention.
【図２】本発明の実施例での種々のポリアクリルアミド
ゲル濃度における塩基長と泳動時間の関係を示す図。FIG. 2 is a diagram showing the relationship between base length and migration time at various polyacrylamide gel concentrations in Examples of the present invention.
【図３】本発明の実施例での種々の塩基長のバンド間隔
のゲル濃度依存性を示す図。FIG. 3 is a graph showing the gel concentration dependency of the band intervals of various base lengths in Examples of the present invention.
【図４】本発明の実施例での各塩基長の泳動時間のゲル
濃度依存性を示す図。FIG. 4 is a graph showing the gel concentration dependence of the migration time of each base length in Examples of the present invention.
【図５】本発明の実施例での３％ポリアクリルアミドゲ
ル（泳動路長２２ｃｍ）を用いて得たＤＮＡ断片スペク
トルを示す図。FIG. 5 is a view showing a DNA fragment spectrum obtained using a 3% polyacrylamide gel (migration path length: 22 cm) in an example of the present invention.
１…レーザ、２…レンズ、３…石英板、４…ゲル板、５
…フイルター、６…結像レンズ、７…イメージ増幅器、
８…リレーレンズ、９…ビジコンカメラ、１０…計算
機、１１〜１６…それぞれ２％、３％、４％、５％、６
％、８％ポリアクリルアミドゲルを用いた時の泳動時間
と塩基長の関係、１７〜２０…１００、２００、３００
及び４００塩基のＤＮＡ断片のバンド間隔あるいは泳動
時間のゲル濃度による変化、１６…末端がグアニン
（Ｇ）で終わる断片群のスペクトル、１７’…末端がチ
ミン（Ｔ）で終わる断片群のスペクトル、３１…レーザ
ー源、３２…試料。DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Laser, 2 ... Lens, 3 ... Quartz plate, 4 ... Gel plate, 5
... a filter, 6 ... an imaging lens, 7 ... an image amplifier,
8: relay lens, 9: vidicon camera, 10: computer, 11 to 16: 2%, 3%, 4%, 5%, 6 respectively
%, Relationship between electrophoresis time and base length when using 8% polyacrylamide gel, 17 to 20 ... 100, 200, 300
And the change in the band interval or the migration time of the DNA fragment of 400 bases depending on the gel concentration, the spectrum of the group of fragments ending with guanine (G) at 16..., The spectrum of the group of fragments ending with thymine (T) at 17 ′. ... laser source, 32 ... sample.
Claims (8)
体を用いて電気泳動しながら、分離された前記断片にレ
ーザ光を照射し、前記蛍光標識から発生した蛍光を検出
して、前記核酸試料の塩基配列を決定する塩基配列決定
装置であって、前記泳動媒体中のポリアクリルアミド濃
度が２％〜６％であり、３００塩基長までの前記断片を
１．５時間以下で検出することを特徴とする塩基配列決
定装置。The method comprises the steps of: irradiating a fluorescently labeled fragment of a nucleic acid sample with a laser beam while electrophoresing the fragment using an electrophoresis medium, detecting fluorescence generated from the fluorescent label, A base sequencer for determining a base sequence of a nucleic acid sample, wherein the polyacrylamide concentration in the electrophoresis medium is 2% to 6%, and the fragment up to 300 bases in length is detected in 1.5 hours or less. A base sequence determination device characterized by the above-mentioned.
体を用いて電気泳動しながら、分離された前記断片にレ
ーザ光を照射し、前記蛍光標識から発生した蛍光を検出
して、前記核酸試料の塩基配列を決定する塩基配列決定
装置であって、前記断片の泳動開始点から前記レーザ光
が照射される部位までの泳動路長Ｌを、塩基長Ｎの前記
断片が泳動する泳動時間ｔを、前記泳動媒体濃度Ｃ、及
び前記塩基長Ｎを変化させて計測し、前記塩基長Ｎを０
に漸近した時に得られる泳動時間をｔ0、前記泳動路長
ＬがＬ0である時の前記断片の実測のバンド幅をωobs、
前記泳動媒体中の電界強度をＥ、前記核酸試料の計測対
象の塩基長をＮ’とする時、前記断片の泳動距離Ｌ’を
Ｌ’＝（３ωobsＮ’／２）2／Ｌ0、泳動時間ｔをｔ＝
３ｔ0Ｌ’／Ｌとすることを特徴とする塩基配列決定装
置。2. Fluorescently labeled fragments of a nucleic acid sample are electrophoresed using an electrophoresis medium, and the separated fragments are irradiated with laser light to detect fluorescence generated from the fluorescent labels. A base sequence determination device for determining a base sequence of a nucleic acid sample, wherein a migration path length L from an electrophoresis start point of the fragment to a site irradiated with the laser beam is determined by a migration time for the fragment having a base length N to migrate. t is measured by changing the electrophoretic medium concentration C and the base length N, and setting the base length N to 0
The migration time obtained when asymptotically approaching is t 0 , the measured bandwidth of the fragment when the migration path length L is L 0 is ω obs ,
When the electric field strength in the electrophoresis medium is E and the base length of the nucleic acid sample to be measured is N ′, the electrophoresis distance L ′ of the fragment is L ′ = (3ω obs N ′ / 2) 2 / L 0 , The migration time t is t =
An apparatus for determining a nucleotide sequence, which is set to 3t 0 L ′ / L.
て、前記泳動媒体中のポリアクリルアミド濃度が２％〜
６％であることを特徴とする塩基配列決定装置。3. The base sequencer according to claim 2, wherein the concentration of polyacrylamide in the electrophoresis medium is 2% to 2%.
A base sequence determination device characterized in that the ratio is 6%.
て、前記泳動媒体の厚さが０．３ｍｍであることを特徴
とする塩基配列決定装置。4. The base sequencer according to claim 2, wherein said electrophoresis medium has a thickness of 0.3 mm.
体を用いて電気泳動しながら、分離された前記断片にレ
ーザ光を照射し、前記蛍光標識から発生した蛍光を検出
して、前記核酸試料の塩基配列を決定する塩基配列決定
装置であって、所定の塩基長の前記断片が前記泳動媒体
の所定の距離を泳動するに要する泳動時間を最小とする
ように、前記泳動媒体濃度が決定されることを特徴とす
る塩基配列決定装置。5. A method for irradiating a fluorescently labeled fragment of a nucleic acid sample with a laser beam while electrophoresing the fragment using a migration medium, detecting fluorescence generated from the fluorescent label, A base sequence determination device for determining a base sequence of a nucleic acid sample, wherein the concentration of the migration medium is such that the fragment having a predetermined base length minimizes migration time required to migrate a predetermined distance of the migration medium. A base sequence determination device characterized by being determined.
て、前記泳動媒体中のポリアクリルアミド濃度が２％〜
６％であることを特徴とする塩基配列決定装置。6. The apparatus for determining a base sequence according to claim 5, wherein the concentration of polyacrylamide in the electrophoresis medium is 2% or less.
A base sequence determination device characterized in that the ratio is 6%.
間にわたり電気泳動する泳動媒体と、該泳動媒体により
分離された前記断片にレーザ光を照射する光照射手段
と、前記レーザ光の照射により前記蛍光標識から発生し
た蛍光を検出する光検出手段とを有し、前記核酸試料の
塩基配列を決定する塩基配列決定装置であって、前記泳
動媒体中のポリアクリルアミド濃度が２％〜６％であ
り、前記光照射手段は前記レーザ光を、前記泳動媒体の
厚さの方向の側面から照射することを特徴とする塩基配
列決定装置。7. An electrophoresis medium for electrophoresing a fluorescence-labeled fragment of a nucleic acid sample for a predetermined period of time, a light irradiating means for irradiating the fragment separated by the electrophoresis medium with laser light, and irradiating the laser light. And a light detecting means for detecting the fluorescence generated from the fluorescent label by the method according to (1), wherein the polyacrylamide concentration in the electrophoresis medium is 2% to 6%. Wherein the light irradiation means irradiates the laser light from a side surface in a thickness direction of the electrophoresis medium.
間にわたり電気泳動する泳動媒体と、該泳動媒体により
分離された前記断片にレーザ光を照射する光照射手段
と、前記レーザ光の照射により前記蛍光標識から発生し
た蛍光を検出する光検出手段とを有し、前記核酸試料の
塩基配列を決定する塩基配列決定装置であって、前記泳
動媒体中のポリアクリルアミド濃度が２％〜６％であ
り、前記泳動媒体の面に対してスキャンしながら照射す
ることを特徴とする塩基配列決定装置。8. An electrophoresis medium for electrophoresing a fluorescence-labeled fragment of a nucleic acid sample for a predetermined time, a light irradiating means for irradiating the fragment separated by the electrophoresis medium with laser light, and irradiating the laser light. And a light detecting means for detecting the fluorescence generated from the fluorescent label by the method according to (1), wherein the polyacrylamide concentration in the electrophoresis medium is 2% to 6%. And irradiating the surface of the electrophoresis medium while scanning the base medium.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9130668A JP2853706B2 (en) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | Base sequence determination method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9130668A JP2853706B2 (en) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | Base sequence determination method |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63039385A Division JP2804038B2 (en) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | Base sequence determination method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1048182A true JPH1048182A (en) | 1998-02-20 |
| JP2853706B2 JP2853706B2 (en) | 1999-02-03 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP9130668A Expired - Fee Related JP2853706B2 (en) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | Base sequence determination method |
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-
1997
- 1997-05-21 JP JP9130668A patent/JP2853706B2/en not_active Expired - Fee Related
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| JP2853706B2 (en) | 1999-02-03 |
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