JPH10337200A - 遺伝子発現の定量方法 - Google Patents
遺伝子発現の定量方法Info
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- JPH10337200A JPH10337200A JP9313398A JP9313398A JPH10337200A JP H10337200 A JPH10337200 A JP H10337200A JP 9313398 A JP9313398 A JP 9313398A JP 9313398 A JP9313398 A JP 9313398A JP H10337200 A JPH10337200 A JP H10337200A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 複数の試料に含まれる同一の遺伝子を同一の
反応系で増幅させてることにより遺伝子発現の定量方法
を提供する。 【解決手段】 少なくとも２種類の試料に含まれるｃＤ
ＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプターを付加し、該
アダプターが付加されたｃＤＮＡを含む各試料を等量混
合した後前記ｃＤＮＡを増幅し、得られる増幅産物の量
比を求めることを特徴とする遺伝子発現の定量方法。
反応系で増幅させてることにより遺伝子発現の定量方法
を提供する。 【解決手段】 少なくとも２種類の試料に含まれるｃＤ
ＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプターを付加し、該
アダプターが付加されたｃＤＮＡを含む各試料を等量混
合した後前記ｃＤＮＡを増幅し、得られる増幅産物の量
比を求めることを特徴とする遺伝子発現の定量方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子発現の定量
方法に関する。
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子発現のレベルを定量するには、一
般にノーザンハイブリダイゼーションが行われている。
実験室レベルで通常の定量を行うには５ｐｇのＲＮＡが
存在すれば検出が可能である。しかし、遺伝子の発現量
が極めて少ない場合は、0.3 〜３μｇのｍＲＮＡが必要
とされている。従って、限られた量のサンプルしか入手
できない場合（例えば臨床検体など）は、ノーザンハイ
ブリダイゼーションを適用することは困難である。
般にノーザンハイブリダイゼーションが行われている。
実験室レベルで通常の定量を行うには５ｐｇのＲＮＡが
存在すれば検出が可能である。しかし、遺伝子の発現量
が極めて少ない場合は、0.3 〜３μｇのｍＲＮＡが必要
とされている。従って、限られた量のサンプルしか入手
できない場合（例えば臨床検体など）は、ノーザンハイ
ブリダイゼーションを適用することは困難である。
【０００３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、他の
手法と比較して最も高感度にＤＮＡ又はＲＮ Ａを検出
することができる手法である。しかし、ＰＣＲによる遺
伝子の発現の定量は、いわゆる「インターナルコントロ
ール」（内部基準）として標的分子と同様の増幅効率を
有するＤＮＡ断片を用いて、検量線を作成する対照実験
を行わなければならないことから、操作が煩雑である。
さらに、定量的ＰＣＲを行うには、定量の対象となる遺
伝子ごとに検量線を作成する必要があるため、研究や遺
伝子の診断を行うには手間がかかる。
手法と比較して最も高感度にＤＮＡ又はＲＮ Ａを検出
することができる手法である。しかし、ＰＣＲによる遺
伝子の発現の定量は、いわゆる「インターナルコントロ
ール」（内部基準）として標的分子と同様の増幅効率を
有するＤＮＡ断片を用いて、検量線を作成する対照実験
を行わなければならないことから、操作が煩雑である。
さらに、定量的ＰＣＲを行うには、定量の対象となる遺
伝子ごとに検量線を作成する必要があるため、研究や遺
伝子の診断を行うには手間がかかる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子発現
の定量方法を提供することを目的とする。
の定量方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、少なくとも２種類の試
料に含まれるｃＤＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプ
ターを付加して同一の反応系で増幅させることにより、
遺伝子発現を容易に定量し得ることに成功し、本発明を
完成するに至った。
基づいて鋭意研究を行った結果、少なくとも２種類の試
料に含まれるｃＤＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプ
ターを付加して同一の反応系で増幅させることにより、
遺伝子発現を容易に定量し得ることに成功し、本発明を
完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、少なくとも２種類の
試料に含まれるｃＤＮＡのそれぞれに種類の異なるアダ
プターを付加し、該アダプターが付加されたｃＤＮＡを
含む試料を等量混合した後前記ｃＤＮＡを増幅し、得ら
れる増幅産物の量比を求めることを特徴とする遺伝子発
現の定量方法である。アダプターとしては、例えば長さ
の異なるヌクレオチド、又は制限酵素部位を少なくとも
１箇所有するヌクレオチド、あるいは互いに配列の異な
るヌクレオチドを含むものが挙げられる。以下、本発明
を詳細に説明する。
試料に含まれるｃＤＮＡのそれぞれに種類の異なるアダ
プターを付加し、該アダプターが付加されたｃＤＮＡを
含む試料を等量混合した後前記ｃＤＮＡを増幅し、得ら
れる増幅産物の量比を求めることを特徴とする遺伝子発
現の定量方法である。アダプターとしては、例えば長さ
の異なるヌクレオチド、又は制限酵素部位を少なくとも
１箇所有するヌクレオチド、あるいは互いに配列の異な
るヌクレオチドを含むものが挙げられる。以下、本発明
を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明は、複数の試料に含まれる
同一の遺伝子を同一の反応系で増幅させて定量するため
の方法である。すなわち、少なくとも２種類の試料に含
まれるｃＤＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプター配
列を付加し、このアダプター配列が付加されたｃＤＮＡ
を含む各試料を等量混合した後ｃＤＮＡを増幅し、増幅
されたｃＤＮＡの量比を求めることを特徴とするもので
あり、いわゆるアダプター付加競合ＰＣＲと呼ばれる。
以下、各工程について説明する。
同一の遺伝子を同一の反応系で増幅させて定量するため
の方法である。すなわち、少なくとも２種類の試料に含
まれるｃＤＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプター配
列を付加し、このアダプター配列が付加されたｃＤＮＡ
を含む各試料を等量混合した後ｃＤＮＡを増幅し、増幅
されたｃＤＮＡの量比を求めることを特徴とするもので
あり、いわゆるアダプター付加競合ＰＣＲと呼ばれる。
以下、各工程について説明する。
【０００８】(1) ｃＤＮＡの調製 図１に示す通り、まず、定量の対象となるｃＤＮＡが含
まれる少なくとも２種類の試料を調製する。本発明では
便宜上２種類の試料に含まれるｃＤＮＡを例に説明す
る。ｃＤＮＡが含まれる試料の一方を試料Ａ、他方を試
料Ｂとする。試料Ａ及び試料Ｂ中のｃＤＮＡの調製は、
ともに公知のいずれかの手法により得ることができ、例
えば各種臓器の細胞等からポリ(A)+RNA を調製して逆転
写酵素を作用させる手法（Gubler,U and Hoffman,B.J.,
Gene,25,263-269 (1983); Okayama,H and Berg,P.,Mol.
Cell.Biol.,18,5294 (1982))等が挙げられる。
まれる少なくとも２種類の試料を調製する。本発明では
便宜上２種類の試料に含まれるｃＤＮＡを例に説明す
る。ｃＤＮＡが含まれる試料の一方を試料Ａ、他方を試
料Ｂとする。試料Ａ及び試料Ｂ中のｃＤＮＡの調製は、
ともに公知のいずれかの手法により得ることができ、例
えば各種臓器の細胞等からポリ(A)+RNA を調製して逆転
写酵素を作用させる手法（Gubler,U and Hoffman,B.J.,
Gene,25,263-269 (1983); Okayama,H and Berg,P.,Mol.
Cell.Biol.,18,5294 (1982))等が挙げられる。
【０００９】本発明において定量の対象となるｃＤＮＡ
を含む試料Ａと試料Ｂとは、異なる組織又は細胞由来の
ものであっても同一の組織又は細胞由来のものであって
もよい。例えば、試料Ａを肝細胞抽出液、試料Ｂを腎細
胞抽出液として使用することができる。また、定量の対
象となるｃＤＮＡの種類としては、各種臓器ＲＮＡ由来
のもの、例えば肝臓由来のアポリポタンパク質をコード
するｃＤＮＡ、及び腎臓ＲＮＡ由来のアポリポタンパク
質をコードするｃＤＮＡなどが挙げられるが、これらに
限定されない。さらに、ｃＤＮＡの量は、いずれか一方
が既知であっても、ともに未知であってもよい。一方の
ｃＤＮＡの量がわかっている場合は、他方のｃＤＮＡの
絶対量を知ることができ、両者の量がわからない場合
は、両ｃＤＮＡの相対的差を知ることができる。
を含む試料Ａと試料Ｂとは、異なる組織又は細胞由来の
ものであっても同一の組織又は細胞由来のものであって
もよい。例えば、試料Ａを肝細胞抽出液、試料Ｂを腎細
胞抽出液として使用することができる。また、定量の対
象となるｃＤＮＡの種類としては、各種臓器ＲＮＡ由来
のもの、例えば肝臓由来のアポリポタンパク質をコード
するｃＤＮＡ、及び腎臓ＲＮＡ由来のアポリポタンパク
質をコードするｃＤＮＡなどが挙げられるが、これらに
限定されない。さらに、ｃＤＮＡの量は、いずれか一方
が既知であっても、ともに未知であってもよい。一方の
ｃＤＮＡの量がわかっている場合は、他方のｃＤＮＡの
絶対量を知ることができ、両者の量がわからない場合
は、両ｃＤＮＡの相対的差を知ることができる。
【００１０】(2) アダプターの付加 次に、特定の制限酵素（例えばMboI、NlaIII、HpaII 、
TaqI等) で試料Ａ及び試料Ｂ中のｃＤＮＡをそれぞれ切
断した後、当該切断部位にアダプターを付加する（図
１，(1) 及び(2) ）。アダプターとは、増幅を行った際
に増幅されたｃＤＮＡを区別することができるように設
計されたオリゴヌクレオチドを意味し、ｃＤＮＡの制限
酵素切断部位に連結できるように二本鎖として設計され
るものである。該アダプターは、試料Ａ中のｃＤＮＡに
付加するアダプターの長さと試料Ｂ中のｃＤＮＡに付加
するアダプターの長さとが異なるように設計するか、あ
るいは試料Ａ中のｃＤＮＡに付加するアダプター及び試
料Ｂ中のｃＤＮＡに付加するアダプターに含まれる制限
酵素認識部位が少なくとも１箇所含まれるように設計す
るか、あるいは試料A中のｃＤＮＡに付加するアダプタ
ーのヌクレオチド配列と試料Ｂ中のｃＤＮＡに付加する
アダプターのヌクレオチド配列とが異なるように設計す
ることができる。
TaqI等) で試料Ａ及び試料Ｂ中のｃＤＮＡをそれぞれ切
断した後、当該切断部位にアダプターを付加する（図
１，(1) 及び(2) ）。アダプターとは、増幅を行った際
に増幅されたｃＤＮＡを区別することができるように設
計されたオリゴヌクレオチドを意味し、ｃＤＮＡの制限
酵素切断部位に連結できるように二本鎖として設計され
るものである。該アダプターは、試料Ａ中のｃＤＮＡに
付加するアダプターの長さと試料Ｂ中のｃＤＮＡに付加
するアダプターの長さとが異なるように設計するか、あ
るいは試料Ａ中のｃＤＮＡに付加するアダプター及び試
料Ｂ中のｃＤＮＡに付加するアダプターに含まれる制限
酵素認識部位が少なくとも１箇所含まれるように設計す
るか、あるいは試料A中のｃＤＮＡに付加するアダプタ
ーのヌクレオチド配列と試料Ｂ中のｃＤＮＡに付加する
アダプターのヌクレオチド配列とが異なるように設計す
ることができる。
【００１１】これらのアダプターは、例えば以下のよう
にして調製される。なお、アダプターは、化学合成によ
り得ることができ、また、アダプターを蛍光標識又は放
射性同位元素により標識しておくこともできる。
にして調製される。なお、アダプターは、化学合成によ
り得ることができ、また、アダプターを蛍光標識又は放
射性同位元素により標識しておくこともできる。
【００１２】(i) 長さの異なるアダプターの場合 ２種類のアダプターのうち、互いに共通する配列を作製
する（図１のアダプターにおいて太く「━」で示した部
分）。次に、一方の配列に、さらに５〜15塩基の配列を
付加して両アダプターを長さにより区別できるようにす
る。この場合、付加する配列は、増幅に用いられるアダ
プタープライマーが付く位置とｃＤＮＡの付着末端との
間に位置するように作製する（図１，試料Ｂにおけるア
ダプターの破線（…）で示した部分）。
する（図１のアダプターにおいて太く「━」で示した部
分）。次に、一方の配列に、さらに５〜15塩基の配列を
付加して両アダプターを長さにより区別できるようにす
る。この場合、付加する配列は、増幅に用いられるアダ
プタープライマーが付く位置とｃＤＮＡの付着末端との
間に位置するように作製する（図１，試料Ｂにおけるア
ダプターの破線（…）で示した部分）。
【００１３】なお、各試料に過剰に混合されたアダプタ
ーを除去するため、すなわち、アダプターが付加した試
料のみを回収できるようにするため、各試料中のｃＤＮ
Ａには抗原と抗体、酵素とその基質、ビオチンとアビジ
ンのように、ある特定の物質が特異的に反応する物質を
付加しておくことが好ましい（図１）。図１には、ビオ
チン（「-b」）が付加されているｃＤＮＡを例示した。
但し、原料であるRNAの量が多い場合は、RNAの逆転写に
より得られるcDNAの量と遊離のアダプターとの相対的な
差は少ないと考えられる。従って、このような場合はア
ダプターを除去する必要がないため、上記特定の物質を
付加しなくてもよい。
ーを除去するため、すなわち、アダプターが付加した試
料のみを回収できるようにするため、各試料中のｃＤＮ
Ａには抗原と抗体、酵素とその基質、ビオチンとアビジ
ンのように、ある特定の物質が特異的に反応する物質を
付加しておくことが好ましい（図１）。図１には、ビオ
チン（「-b」）が付加されているｃＤＮＡを例示した。
但し、原料であるRNAの量が多い場合は、RNAの逆転写に
より得られるcDNAの量と遊離のアダプターとの相対的な
差は少ないと考えられる。従って、このような場合はア
ダプターを除去する必要がないため、上記特定の物質を
付加しなくてもよい。
【００１４】(ii)制限酵素部位を導入する場合 アダプターに導入する制限酵素部位は、アダプターに少
なくとも１箇所含まれるように設計するが、定量の対象
となるｃＤＮＡを含む試料の数に対応して定めてもよ
い。制限酵素としては、例えばMluI、NotI、SalI、Sfi
I、XhoI等が挙げられるがこれらに限定されるものでは
ない。例えば、２種類の試料中に含まれるｃＤＮＡを定
量する場合は、アダプターに制限酵素部位をそれぞれ１
箇所導入してもよく、２箇所導入してもよい。なお、制
限酵素部位は、アダプタープライマーが付く位置とｃＤ
ＮＡの付着末端との間に含まれるようにする。
なくとも１箇所含まれるように設計するが、定量の対象
となるｃＤＮＡを含む試料の数に対応して定めてもよ
い。制限酵素としては、例えばMluI、NotI、SalI、Sfi
I、XhoI等が挙げられるがこれらに限定されるものでは
ない。例えば、２種類の試料中に含まれるｃＤＮＡを定
量する場合は、アダプターに制限酵素部位をそれぞれ１
箇所導入してもよく、２箇所導入してもよい。なお、制
限酵素部位は、アダプタープライマーが付く位置とｃＤ
ＮＡの付着末端との間に含まれるようにする。
【００１５】ここで、制限酵素部位を１箇所導入する場
合は、認識される制限酵素が互いに異なるようにアダプ
ターの配列を設計する。例えば、試料Ａ中のｃＤＮＡに
連結させるアダプターにはSalI部位を、試料Ｂ中のｃＤ
ＮＡに連結させるアダプターにはMluI部位を導入する。
制限酵素部位を２箇所以上導入する場合は、種類の異な
る制限酵素部位が２箇所含まれるように各試料中のｃＤ
ＮＡにそれぞれ導入する（図２）。そして、制限酵素処
理した際にそのうちの１箇所の制限酵素部位のみで切断
されるようにし、かつ、一方のｃＤＮＡに付加されたア
ダプターを切断する制限酵素により他方のｃＤＮＡに付
加されたアダプターが切断されないようにしておく。
合は、認識される制限酵素が互いに異なるようにアダプ
ターの配列を設計する。例えば、試料Ａ中のｃＤＮＡに
連結させるアダプターにはSalI部位を、試料Ｂ中のｃＤ
ＮＡに連結させるアダプターにはMluI部位を導入する。
制限酵素部位を２箇所以上導入する場合は、種類の異な
る制限酵素部位が２箇所含まれるように各試料中のｃＤ
ＮＡにそれぞれ導入する（図２）。そして、制限酵素処
理した際にそのうちの１箇所の制限酵素部位のみで切断
されるようにし、かつ、一方のｃＤＮＡに付加されたア
ダプターを切断する制限酵素により他方のｃＤＮＡに付
加されたアダプターが切断されないようにしておく。
【００１６】例えば、図２に示すように、試料Ａ及び試
料Ｂ中のｃＤＮＡを定量する場合において、各アダプタ
ーに２種類の制限酵素部位（MluI及びNotIなど）が含ま
れるようにアダプターを設計し合成したときは、試料Ａ
中のｃＤＮＡに付加されたアダプターは制限酵素MluIの
みで認識されるようにし、NotIでは認識されないように
NotI部位の一部を置換等しておくようにする（図２で
は、NotIに横線を上書きして表示した）。また、試料Ｂ
中のｃＤＮＡに付加されたアダプターは制限酵素NotIの
みで認識されるようにし、MluIでは認識されないように
MluI部位の一部を置換等しておくようにする（図２で
は、MluIに横線を上書きして表示した）。なお、アダプ
ターが付加した試料のみを回収できるようにするため、
ビオチン等を付加しておくことが好ましい。
料Ｂ中のｃＤＮＡを定量する場合において、各アダプタ
ーに２種類の制限酵素部位（MluI及びNotIなど）が含ま
れるようにアダプターを設計し合成したときは、試料Ａ
中のｃＤＮＡに付加されたアダプターは制限酵素MluIの
みで認識されるようにし、NotIでは認識されないように
NotI部位の一部を置換等しておくようにする（図２で
は、NotIに横線を上書きして表示した）。また、試料Ｂ
中のｃＤＮＡに付加されたアダプターは制限酵素NotIの
みで認識されるようにし、MluIでは認識されないように
MluI部位の一部を置換等しておくようにする（図２で
は、MluIに横線を上書きして表示した）。なお、アダプ
ターが付加した試料のみを回収できるようにするため、
ビオチン等を付加しておくことが好ましい。
【００１７】(iii) 互いにヌクレオチド配列の異なるア
ダプターを用いる場合 本発明では、アダプターのヌクレオチド配列が互いに同
じ配列とならないように、任意に設計及び合成して種類
の異なるアダプターを使用することもできる。このアダ
プターを用いた場合は、当該アダプターの配列と相補的
な配列を有し、かつハイブリダイズすることができるオ
リゴヌクレオチドを調製し、該オリゴヌクレオチドを標
識することによって検出することができるものである。
ダプターを用いる場合 本発明では、アダプターのヌクレオチド配列が互いに同
じ配列とならないように、任意に設計及び合成して種類
の異なるアダプターを使用することもできる。このアダ
プターを用いた場合は、当該アダプターの配列と相補的
な配列を有し、かつハイブリダイズすることができるオ
リゴヌクレオチドを調製し、該オリゴヌクレオチドを標
識することによって検出することができるものである。
【００１８】例えば、一方の試料中のcDNAに付加するア
ダプターをアダプターXとし、他方の試料中のcDNAに付
加するアダプターをアダプターYとすると、アダプターX
の配列とアダプターYの配列とは、アダプタープライマ
ーが付加する領域を除いて異なっており、アダプターX
とハイブリダイズするヌクレオチドが、少なくともアダ
プターYとはハイブリダイズできないようにそれぞれの
アダプターを作製する。アダプターX及びアダプターYの
ヌクレオチド配列は任意に設計し合成することができ
る。この場合、上記各アダプターのヌクレオチド配列の
長さは同一でも異なってもよく、その長さは15〜50塩
基、好ましくは25〜30塩基である。
ダプターをアダプターXとし、他方の試料中のcDNAに付
加するアダプターをアダプターYとすると、アダプターX
の配列とアダプターYの配列とは、アダプタープライマ
ーが付加する領域を除いて異なっており、アダプターX
とハイブリダイズするヌクレオチドが、少なくともアダ
プターYとはハイブリダイズできないようにそれぞれの
アダプターを作製する。アダプターX及びアダプターYの
ヌクレオチド配列は任意に設計し合成することができ
る。この場合、上記各アダプターのヌクレオチド配列の
長さは同一でも異なってもよく、その長さは15〜50塩
基、好ましくは25〜30塩基である。
【００１９】ここで、増幅を行う際のアダプタープライ
マーが付加する領域は、２種類のアダプターともに共通
の配列を有している。従って、ハイブリダイズさせるヌ
クレオチドは、各アダプター配列のうち、アダプタープ
ライマーが付加する領域とはハイブリダイズしないよう
に設計・作製することが必要である。従って、この条件
を満たす限り、ヌクレオチドをハイブリダイズさせる領
域は、アダプターの全体の領域であっても一部の領域で
あってもよい。
マーが付加する領域は、２種類のアダプターともに共通
の配列を有している。従って、ハイブリダイズさせるヌ
クレオチドは、各アダプター配列のうち、アダプタープ
ライマーが付加する領域とはハイブリダイズしないよう
に設計・作製することが必要である。従って、この条件
を満たす限り、ヌクレオチドをハイブリダイズさせる領
域は、アダプターの全体の領域であっても一部の領域で
あってもよい。
【００２０】(3) ｃＤＮＡの増幅 前記のようにしてアダプターが付加されたｃＤＮＡを含
む試料Ａと試料Ｂとをそれぞれ等量混合した後、これら
試料に含まれるｃＤＮＡを鋳型として増幅を行う（図１
及び２）。増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により行われる。
む試料Ａと試料Ｂとをそれぞれ等量混合した後、これら
試料に含まれるｃＤＮＡを鋳型として増幅を行う（図１
及び２）。増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により行われる。
【００２１】プライマーとしては、アダプタープライマ
ー及び遺伝子特異的プライマーが挙げられる。アダプタ
ープライマーとは、前記設計されたアダプターにハイブ
リダイズすることができるプライマーであり、遺伝子特
異的プライマーとは、定量の対象となるｃＤＮＡにおい
て少なくとも一部の領域にハイブリダイズすることがで
きるプライマーである。各プライマーは、20〜25塩基の
長さを有するものであり、例えば化学合成により得るこ
とができる。
ー及び遺伝子特異的プライマーが挙げられる。アダプタ
ープライマーとは、前記設計されたアダプターにハイブ
リダイズすることができるプライマーであり、遺伝子特
異的プライマーとは、定量の対象となるｃＤＮＡにおい
て少なくとも一部の領域にハイブリダイズすることがで
きるプライマーである。各プライマーは、20〜25塩基の
長さを有するものであり、例えば化学合成により得るこ
とができる。
【００２２】なお、ＰＣＲのサイクル数や温度条件等は
適宜定めることができる。各ｃＤＮＡ断片は、その量比
を保ちながら増幅し、それぞれのｃＤＮＡ断片がどの臓
器におけるｍＲＮＡ由来の断片であるのかアダプターに
より区別できるため、下記の検出及び定量により、最終
産物の量比から絶対的又は相対的発現量を測定すること
ができる。
適宜定めることができる。各ｃＤＮＡ断片は、その量比
を保ちながら増幅し、それぞれのｃＤＮＡ断片がどの臓
器におけるｍＲＮＡ由来の断片であるのかアダプターに
より区別できるため、下記の検出及び定量により、最終
産物の量比から絶対的又は相対的発現量を測定すること
ができる。
【００２３】(4) 増幅産物の検出及び定量 等量混合された試料Ａ及び試料ＢについてＰＣＲを行っ
た後、蛍光標識の場合はオートシークエンサー（ファル
マシア社等）又はイメージスキャナー（Molecular Dyna
mics社) により、また、放射性同位元素を用いた場合は
デンシトメーター等により増幅産物の検出を行う。
た後、蛍光標識の場合はオートシークエンサー（ファル
マシア社等）又はイメージスキャナー（Molecular Dyna
mics社) により、また、放射性同位元素を用いた場合は
デンシトメーター等により増幅産物の検出を行う。
【００２４】(i) 長さの異なるアダプターを使用した場
合 検出によって得られたデータをもとに、以下の式を用い
て２種類の試料中のｃＤＮＡの量比（ｍ1/ｍ2 ）を求め
る。検出により得られたデータ（観察値）をａ1 とする
と、式Ｉ： ａ1 ＝ｍ1/ｍ2 ((１＋ｅ1)n /(１＋ｅ2)n ) （Ｉ） と表すことができる。
合 検出によって得られたデータをもとに、以下の式を用い
て２種類の試料中のｃＤＮＡの量比（ｍ1/ｍ2 ）を求め
る。検出により得られたデータ（観察値）をａ1 とする
と、式Ｉ： ａ1 ＝ｍ1/ｍ2 ((１＋ｅ1)n /(１＋ｅ2)n ) （Ｉ） と表すことができる。
【００２５】ここで、ｍ1 は試料Ａ中のｃＤＮＡの量、
ｍ2 は試料Ｂ中のｃＤＮＡの量を表す。また、ｅ1 及び
ｅ2 はともに０以上１以下の定数である。そして、ｎは
サイクル数である。なお、各試料中のｃＤＮＡに付加し
たアダプターをそれぞれ相互に入れ換えて前記と同様に
増幅及び定量を行い、前記と同様にしてｃＤＮＡの量比
（ｍ1/ｍ2）を求め、これを先に求めた量比との幾何平
均をとることが好ましい。
ｍ2 は試料Ｂ中のｃＤＮＡの量を表す。また、ｅ1 及び
ｅ2 はともに０以上１以下の定数である。そして、ｎは
サイクル数である。なお、各試料中のｃＤＮＡに付加し
たアダプターをそれぞれ相互に入れ換えて前記と同様に
増幅及び定量を行い、前記と同様にしてｃＤＮＡの量比
（ｍ1/ｍ2）を求め、これを先に求めた量比との幾何平
均をとることが好ましい。
【００２６】従って、アダプターを入れ替えて前記と同
様に試験を行った結果得られた観察値をｂ1 とすると、
式II： ｂ1 ＝ｍ1/ｍ2 ((１＋ｅ2)n /(１＋ｅ1)n ) （II） と表すことができることから、式Ｉ及びIIより、ｍ1 と
ｍ2 との量比ｍ1/ｍ2 の幾何平均は、次式III: ｍ1/ｍ2 ＝（ａ1ｂ1）1/2 (III) で表される。
様に試験を行った結果得られた観察値をｂ1 とすると、
式II： ｂ1 ＝ｍ1/ｍ2 ((１＋ｅ2)n /(１＋ｅ1)n ) （II） と表すことができることから、式Ｉ及びIIより、ｍ1 と
ｍ2 との量比ｍ1/ｍ2 の幾何平均は、次式III: ｍ1/ｍ2 ＝（ａ1ｂ1）1/2 (III) で表される。
【００２７】(ii)制限酵素部位を導入したアダプターを
用いた場合 一方、制限酵素部位（例えばMluI及びNotI等の２種類）
を導入したアダプターを用いた場合は、アダプターが付
加されたｃＤＮＡを含む各試料を等量混合し、増幅した
後、試料Ａ中のｃＤＮＡについてはMluIで切断し、試料
Ｂ中のｃＤＮＡについてはNotIで切断することにより両
試料のアダプターを区別して検出操作を行う。その結
果、アダプターの切断部位が異なるので、ＰＣＲを行っ
た際の両者の断片の大きさに差が生じ、試料Ａ及び試料
Ｂ中におけるｃＤＮＡの量比を求めることができる。
用いた場合 一方、制限酵素部位（例えばMluI及びNotI等の２種類）
を導入したアダプターを用いた場合は、アダプターが付
加されたｃＤＮＡを含む各試料を等量混合し、増幅した
後、試料Ａ中のｃＤＮＡについてはMluIで切断し、試料
Ｂ中のｃＤＮＡについてはNotIで切断することにより両
試料のアダプターを区別して検出操作を行う。その結
果、アダプターの切断部位が異なるので、ＰＣＲを行っ
た際の両者の断片の大きさに差が生じ、試料Ａ及び試料
Ｂ中におけるｃＤＮＡの量比を求めることができる。
【００２８】すなわち、ＰＣＲ反応の際のアダプタープ
ライマーを蛍光色素や放射性同位元素で標識すると、得
られる増幅産物は前記蛍光色素又は放射性同位元素で標
識される（図２，☆印）。従って、制限酵素処理により
切断された断片は標識部位が除かれるため検出されず、
切断されない断片のみが検出される。そして、一方の制
限酵素で処理したときに電気泳動のバンドやオートシー
クエンサーのエレクトロフェログラム等として現れる断
片と、他方の制限酵素で処理したときにバンドやエレク
トロフェログラム等として現れる断片とを比較すること
により両者のｃＤＮＡの量比を測定することができる。
例えば、制限酵素MluI及びNotI部位を付加したアダプタ
ーを用いてＰＣＲを行った後に電気泳動を行った場合
は、増幅産物をMluIで処理したときに現れるバンドは試
料Ｂ由来のｃＤＮＡであり、NotIで処理したときに現れ
るバンドは試料Ａ由来のｃＤＮＡであるから（図２）、
両バンドをデンシトメーター等で数値化し、前記(i) と
同様に計算を行ってｃＤＮＡの量比を求めることができ
る。
ライマーを蛍光色素や放射性同位元素で標識すると、得
られる増幅産物は前記蛍光色素又は放射性同位元素で標
識される（図２，☆印）。従って、制限酵素処理により
切断された断片は標識部位が除かれるため検出されず、
切断されない断片のみが検出される。そして、一方の制
限酵素で処理したときに電気泳動のバンドやオートシー
クエンサーのエレクトロフェログラム等として現れる断
片と、他方の制限酵素で処理したときにバンドやエレク
トロフェログラム等として現れる断片とを比較すること
により両者のｃＤＮＡの量比を測定することができる。
例えば、制限酵素MluI及びNotI部位を付加したアダプタ
ーを用いてＰＣＲを行った後に電気泳動を行った場合
は、増幅産物をMluIで処理したときに現れるバンドは試
料Ｂ由来のｃＤＮＡであり、NotIで処理したときに現れ
るバンドは試料Ａ由来のｃＤＮＡであるから（図２）、
両バンドをデンシトメーター等で数値化し、前記(i) と
同様に計算を行ってｃＤＮＡの量比を求めることができ
る。
【００２９】アダプターに導入した制限酵素部位が１箇
所であっても、増幅産物を２つに分け、各制限酵素で処
理することにより長さの異なる断片が得られるので、前
記と同様にして検出することができる。例えば図２にお
いて、図２に示すアダプターの代わりに、試料Ａ（肝由
来）中のｃＤＮＡにSalI部位のみを導入したアダプター
を付加し、試料Ｂ（腎由来）中のｃＤＮＡにMluI部位の
みを導入したアダプターを付加して等量混合し、増幅さ
せた後、SalI処理群及びMluI処理群に試料を分け、各制
限酵素で処理したとすると、SalI処理群ではMluI部位を
有する断片（即ち腎由来ｃＤＮＡ）が検出され、MluI処
理群ではSalI部位を有する断片（即ち肝由来ｃＤＮＡ）
が検出される。これにより、両試料中のｃＤＮＡの発現
量比を求めることができる。アダプターを入れ替えて同
じ操作を行うことにより、SalI処理では肝由来のｃＤＮ
Ａが、MluI処理では腎由来のｃＤＮＡが検出されるの
で、同様にしてｃＤＮＡの発現量比を求め、先に求めた
比との幾何平均をとることができる。
所であっても、増幅産物を２つに分け、各制限酵素で処
理することにより長さの異なる断片が得られるので、前
記と同様にして検出することができる。例えば図２にお
いて、図２に示すアダプターの代わりに、試料Ａ（肝由
来）中のｃＤＮＡにSalI部位のみを導入したアダプター
を付加し、試料Ｂ（腎由来）中のｃＤＮＡにMluI部位の
みを導入したアダプターを付加して等量混合し、増幅さ
せた後、SalI処理群及びMluI処理群に試料を分け、各制
限酵素で処理したとすると、SalI処理群ではMluI部位を
有する断片（即ち腎由来ｃＤＮＡ）が検出され、MluI処
理群ではSalI部位を有する断片（即ち肝由来ｃＤＮＡ）
が検出される。これにより、両試料中のｃＤＮＡの発現
量比を求めることができる。アダプターを入れ替えて同
じ操作を行うことにより、SalI処理では肝由来のｃＤＮ
Ａが、MluI処理では腎由来のｃＤＮＡが検出されるの
で、同様にしてｃＤＮＡの発現量比を求め、先に求めた
比との幾何平均をとることができる。
【００３０】(iii) 互いにヌクレオチド配列の異なるア
ダプターを用いる場合 まず、前記の通り作製した各アダプターのヌクレオチド
配列と相補的であって各アダプターとそれぞれ特異的に
ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを
合成する。当該オリゴヌクレオチドは、前記の通り一方
のアダプターとはハイブリダイズすることができるが、
他方のアダプターとはハイブリダイズすることができな
いように設計及び合成されている。なお、ハイブリダイ
ズさせるオリゴヌクレオチドは、二本鎖のうちいずれか
一方の鎖とハイブリダイズすることができればよい。
ダプターを用いる場合 まず、前記の通り作製した各アダプターのヌクレオチド
配列と相補的であって各アダプターとそれぞれ特異的に
ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを
合成する。当該オリゴヌクレオチドは、前記の通り一方
のアダプターとはハイブリダイズすることができるが、
他方のアダプターとはハイブリダイズすることができな
いように設計及び合成されている。なお、ハイブリダイ
ズさせるオリゴヌクレオチドは、二本鎖のうちいずれか
一方の鎖とハイブリダイズすることができればよい。
【００３１】次に、作製されたオリゴヌクレオチド配列
を標識する。標識物質としては、例えば蛍光色素又は放
射性同位元素等が挙げられる。そして、試料を等量混合
してPCRを行った後の反応産物中に、上記標識オリゴヌ
クレオチドを添加し、アダプター領域の配列（アダプタ
ープライマーが付加する領域を除く）と標識オリゴヌク
レオチドとをハイブリダイズさせる。ここで、上記アダ
プター配列を有する増幅産物のDNAは二本鎖として形成
されているので、ハイブリダイズは、増幅産物を一本鎖
にした後に行う。二本鎖DNAから一本鎖DNAへの変性につ
いては、例えばPCRにおける変性反応（94℃で30秒等）
により行うことができ、ハイブリダイゼーションについ
ては、例えばPCRにおけるアニーリング反応(55℃で1分
等）により行うことができる。
を標識する。標識物質としては、例えば蛍光色素又は放
射性同位元素等が挙げられる。そして、試料を等量混合
してPCRを行った後の反応産物中に、上記標識オリゴヌ
クレオチドを添加し、アダプター領域の配列（アダプタ
ープライマーが付加する領域を除く）と標識オリゴヌク
レオチドとをハイブリダイズさせる。ここで、上記アダ
プター配列を有する増幅産物のDNAは二本鎖として形成
されているので、ハイブリダイズは、増幅産物を一本鎖
にした後に行う。二本鎖DNAから一本鎖DNAへの変性につ
いては、例えばPCRにおける変性反応（94℃で30秒等）
により行うことができ、ハイブリダイゼーションについ
ては、例えばPCRにおけるアニーリング反応(55℃で1分
等）により行うことができる。
【００３２】但し、ハイブリダイゼーション後に、遊離
の標識オリゴヌクレオチドを除去しなければならないた
め、ハイブリダイズさせる方の鎖を固相に固定しておく
必要がある。固相への固定は、例えばビオチン-ストレ
プトアビジン等が用いられる。この場合は、固相にスト
レプトアビジンを結合させ、ハイブリダイズさせる方の
アダプター鎖にビオチンを結合させることにより、ハイ
ブリダイズした鎖を容易に固定することができる。最後
に、ハイブリダイゼーション後の標識物質の蛍光値や濃
度等を測定し、前記の測定方法と同様にしてcDNAの量比
を求めることができる。
の標識オリゴヌクレオチドを除去しなければならないた
め、ハイブリダイズさせる方の鎖を固相に固定しておく
必要がある。固相への固定は、例えばビオチン-ストレ
プトアビジン等が用いられる。この場合は、固相にスト
レプトアビジンを結合させ、ハイブリダイズさせる方の
アダプター鎖にビオチンを結合させることにより、ハイ
ブリダイズした鎖を容易に固定することができる。最後
に、ハイブリダイゼーション後の標識物質の蛍光値や濃
度等を測定し、前記の測定方法と同様にしてcDNAの量比
を求めることができる。
【００３３】(5) 分子インデックス法への応用 本発明の方法は、いわゆる分子インデックス法により分
類されたｃＤＮＡの定量に応用することができる。分子
インデックス法とは、特定の３種類の制限酵素（ClassI
IS制限酵素：FokI、BsmA1 及びBamF1 ）と、該制限酵素
切断部位に連結させるためのオリゴヌクレオチドとを用
いることによって発現遺伝子（ｃＤＮＡ）を分類する方
法であって、該制限酵素の用い方及び該オリゴヌクレオ
チドの種類により発現遺伝子（ｃＤＮＡ）を576 のグル
ープに分類し、個々の断片を分離する方法である（加藤
菊也，「発現遺伝子の識別表示技術」,BIO INDUSTRY,13
(6),p16-23,1996 、及び特開平8-322598号公報）。
類されたｃＤＮＡの定量に応用することができる。分子
インデックス法とは、特定の３種類の制限酵素（ClassI
IS制限酵素：FokI、BsmA1 及びBamF1 ）と、該制限酵素
切断部位に連結させるためのオリゴヌクレオチドとを用
いることによって発現遺伝子（ｃＤＮＡ）を分類する方
法であって、該制限酵素の用い方及び該オリゴヌクレオ
チドの種類により発現遺伝子（ｃＤＮＡ）を576 のグル
ープに分類し、個々の断片を分離する方法である（加藤
菊也，「発現遺伝子の識別表示技術」,BIO INDUSTRY,13
(6),p16-23,1996 、及び特開平8-322598号公報）。
【００３４】本発明では、分子インデックス法により分
類されたＤＮＡ断片が含まれる少なくとも２種類の試料
をそれぞれ等量混合して増幅させ、その量比を測定する
ことができる。その際、分子インデックス法に使用する
オリゴヌクレオチドに１又は複数の制限酵素部位を導入
することにより、該オリゴヌクレオチドを本発明におけ
るアダプターとして使用して前記と同様の反応を行うこ
とにより、ｃＤＮＡの定量を行うことができる。分子イ
ンデックス法は多数の断片をＰＣＲで増幅する方法であ
るため、本発明のアダプター付加競合ＰＣＲを用いる
と、非特異的反応産物が各試料に共通して出現しても、
発現に差のある断片の同定が容易になるという利点を有
する。
類されたＤＮＡ断片が含まれる少なくとも２種類の試料
をそれぞれ等量混合して増幅させ、その量比を測定する
ことができる。その際、分子インデックス法に使用する
オリゴヌクレオチドに１又は複数の制限酵素部位を導入
することにより、該オリゴヌクレオチドを本発明におけ
るアダプターとして使用して前記と同様の反応を行うこ
とにより、ｃＤＮＡの定量を行うことができる。分子イ
ンデックス法は多数の断片をＰＣＲで増幅する方法であ
るため、本発明のアダプター付加競合ＰＣＲを用いる
と、非特異的反応産物が各試料に共通して出現しても、
発現に差のある断片の同定が容易になるという利点を有
する。
【００３５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲を限定するものではない。 〔実施例１〕アダプター付加競合ＰＣＲ 本実施例では、アポリポタンパク質をコードするｃＤＮ
Ａについて、マウス肝組織及びマウス腎組織を用いて、
その量比を測定した。
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲を限定するものではない。 〔実施例１〕アダプター付加競合ＰＣＲ 本実施例では、アポリポタンパク質をコードするｃＤＮ
Ａについて、マウス肝組織及びマウス腎組織を用いて、
その量比を測定した。
【００３６】(1) 一本鎖ｃＤＮＡの合成 マウスの冷凍組織（肝臓及び腎臓）を粉砕した後、グア
ニジンイソチオシアネート法で得られたマウス肝臓及び
腎臓由来の全RNA(３μg)を含む蒸留水７μlに、化学合
成したビオチン化オリゴ (dT)18 プライマーを加えて7
0℃で２〜３分加熱し、次に以下の反応液の組成中で37
℃で１時間保温した。
ニジンイソチオシアネート法で得られたマウス肝臓及び
腎臓由来の全RNA(３μg)を含む蒸留水７μlに、化学合
成したビオチン化オリゴ (dT)18 プライマーを加えて7
0℃で２〜３分加熱し、次に以下の反応液の組成中で37
℃で１時間保温した。
【００３７】
【００３８】(2) 二本鎖ｃＤＮＡの合成 前記(1) で得られたマウス肝臓及び腎臓由来の一本鎖ｃ
ＤＮＡに、以下の組成の反応液をそれぞれ加え、16℃で
１時間、さらに室温で１時間反応させ、二本鎖ｃＤＮＡ
を合成した。
ＤＮＡに、以下の組成の反応液をそれぞれ加え、16℃で
１時間、さらに室温で１時間反応させ、二本鎖ｃＤＮＡ
を合成した。
【００３９】
【００４０】反応終了後、0.25M EDTA(pH7.5) 3 μl 及
び5M NaCl 2 μlを加えた後、フェノール抽出及びエタ
ノール沈殿を行った。得られたｃＤＮＡを蒸留水120 μ
lに溶解した。 (3) 制限酵素による切断 以下の組成の反応液を、37℃で1 時間保温した。
び5M NaCl 2 μlを加えた後、フェノール抽出及びエタ
ノール沈殿を行った。得られたｃＤＮＡを蒸留水120 μ
lに溶解した。 (3) 制限酵素による切断 以下の組成の反応液を、37℃で1 時間保温した。
【００４１】
【００４２】反応終了後、75℃で10分加熱し、９倍量の
蒸留水で希釈して以下のアダプター付加反応に使用し
た。 (4) アダプター付加反応
蒸留水で希釈して以下のアダプター付加反応に使用し
た。 (4) アダプター付加反応
【００４３】試料としてマウス肝臓由来ｃＤＮＡ、並び
にマウス肝臓ｃＤＮＡと腎臓由来ｃＤＮＡとの混合物を
用いた。試料及びアダプターの組合せは表１の通りであ
る。
にマウス肝臓ｃＤＮＡと腎臓由来ｃＤＮＡとの混合物を
用いた。試料及びアダプターの組合せは表１の通りであ
る。
【００４４】
【表１】
【００４５】なお、遺伝子特異的プライマーとしてアポ
リポタンパク質A-1 特異的プライマーを用い、アダプタ
ープライマーとしてC1S(Cy5 標識) を用いた。各プライ
マー及の配列は以下の通りである。
リポタンパク質A-1 特異的プライマーを用い、アダプタ
ープライマーとしてC1S(Cy5 標識) を用いた。各プライ
マー及の配列は以下の通りである。
【００４６】アポリポタンパク質A-1 特異的プライマ
ー: 5'-TTATTGTAAGAAAGCCAATGCG-3'（配列番号１） アダプタープライマーC1S : 5'-GTACATATTGTCGTTAGAACG
C-3'（配列番号２） また、アダプターの配列は以下の通りである。 MA-1: 5'-GATCCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'(＋鎖；配列
番号３） 3'-GCGCAAGATTGCTGTTATACATG-5'(−鎖；配列番号４） MA-4: 5'-GATCGAGCACTCTTAGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'
(＋鎖；配列番号５） 3'-CTCGTGAGAATCGCAAGATTGCTGTTATACATG-5'(−鎖；配列
番号６） 上記組成の反応液を16℃で一晩保温した。
ー: 5'-TTATTGTAAGAAAGCCAATGCG-3'（配列番号１） アダプタープライマーC1S : 5'-GTACATATTGTCGTTAGAACG
C-3'（配列番号２） また、アダプターの配列は以下の通りである。 MA-1: 5'-GATCCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'(＋鎖；配列
番号３） 3'-GCGCAAGATTGCTGTTATACATG-5'(−鎖；配列番号４） MA-4: 5'-GATCGAGCACTCTTAGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3'
(＋鎖；配列番号５） 3'-CTCGTGAGAATCGCAAGATTGCTGTTATACATG-5'(−鎖；配列
番号６） 上記組成の反応液を16℃で一晩保温した。
【００４７】(5) ＰＣＲ反応 それぞれのサンプルに、5M NaCl 5 μl、及び10mg/ml
ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ(streptavidin-co
ated paramagnetic beads)３μlを加えて20分間静置
し、サンプルをビーズに吸着させた。その後、測定対象
のｃＤＮＡが含まれる２種類のサンプル（表１）を混合
後、ビーズを蒸留水で洗浄し、均等に４分割した後、そ
れぞれのサンプルに以下の反応液を加えた。
ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ(streptavidin-co
ated paramagnetic beads)３μlを加えて20分間静置
し、サンプルをビーズに吸着させた。その後、測定対象
のｃＤＮＡが含まれる２種類のサンプル（表１）を混合
後、ビーズを蒸留水で洗浄し、均等に４分割した後、そ
れぞれのサンプルに以下の反応液を加えた。
【００４８】
【００４９】上記組成の各反応液について、94℃で30
秒、55℃で１分及び72℃で１分を１サイクルとしてこれ
を30〜35サイクル行い、その後、72℃で20分反応させ
た。反応終了後、下記の組成の溶液を加え、37℃で１時
間保温した。
秒、55℃で１分及び72℃で１分を１サイクルとしてこれ
を30〜35サイクル行い、その後、72℃で20分反応させ
た。反応終了後、下記の組成の溶液を加え、37℃で１時
間保温した。
【００５０】
【００５１】最終産物を熱変性後、0.5 μlをPharmacia
ALF express sequencer により解析した。結果を図３
に示す。そして、式Ｉ及びIIを用いてピークの面積から
式Ｉ及びIIにおけるａ1 及びｂ1 の値（(a) 、(b) 、
(c) 及び(d) ）を算出した結果、表２に記載の値が得ら
れた。
ALF express sequencer により解析した。結果を図３
に示す。そして、式Ｉ及びIIを用いてピークの面積から
式Ｉ及びIIにおけるａ1 及びｂ1 の値（(a) 、(b) 、
(c) 及び(d) ）を算出した結果、表２に記載の値が得ら
れた。
【００５２】
【表２】
【００５３】表２の(a) 及び(c) と(b) 及び(d) とは、
互いにアダプタープライマーを入れ換えて試験した結果
を表す。なお、表２の(a) 〜(d) は、図３の(a) 〜(d)
にそれぞれ対応する。これらの結果を用いて、式III に
基づいて幾何平均を算出した。結果を以下に示す。
互いにアダプタープライマーを入れ換えて試験した結果
を表す。なお、表２の(a) 〜(d) は、図３の(a) 〜(d)
にそれぞれ対応する。これらの結果を用いて、式III に
基づいて幾何平均を算出した。結果を以下に示す。
【００５４】(1) （肝臓ｃＤＮＡ 3μl ＋腎臓ｃＤＮＡ
7μl ）／（肝臓ｃＤＮＡ 10 μl）の場合（表２の(a)
及び(c) ）： ｍ1/ｍ2 ＝ 0.35 （期待値0.3 ） (2) （肝臓ｃＤＮＡ 1μl ＋腎臓ｃＤＮＡ 9μl ）／
（肝臓ｃＤＮＡ 10 μl）の場合（表２の(b) 及び(d)
）： ｍ1/ｍ2 ＝ 0.10 （期待値0.1 ） アポリポタンパク質は肝臓でしか発現しないため、それ
ぞれのピークの比率は肝臓のｃＤＮＡの比率に相当する
ことが期待される。そして、上記結果よりほぼ期待通り
の値を得ることができた。
7μl ）／（肝臓ｃＤＮＡ 10 μl）の場合（表２の(a)
及び(c) ）： ｍ1/ｍ2 ＝ 0.35 （期待値0.3 ） (2) （肝臓ｃＤＮＡ 1μl ＋腎臓ｃＤＮＡ 9μl ）／
（肝臓ｃＤＮＡ 10 μl）の場合（表２の(b) 及び(d)
）： ｍ1/ｍ2 ＝ 0.10 （期待値0.1 ） アポリポタンパク質は肝臓でしか発現しないため、それ
ぞれのピークの比率は肝臓のｃＤＮＡの比率に相当する
ことが期待される。そして、上記結果よりほぼ期待通り
の値を得ることができた。
【００５５】〔実施例２〕分子インデックス法への応用 (1) ｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡの合成は実施例１と同様に行った。但し、通常
のオリゴdTプライマーの代わりに以下のプライマー（do
uble-anchored oligo-dT primer と呼ばれる)を等量混
合したものを用いた。プライマー量として、10pmol/μl
のものを１．５μｌ 使用した。 5'-GGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' （配列番号７） 5'-CAGCTGTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' （配列番号８） 5'-CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' （配列番号９） (2) ClassIIS制限酵素(FokI)による切断 下記組成の反応液を、37℃で50分〜１時間保温した。
のオリゴdTプライマーの代わりに以下のプライマー（do
uble-anchored oligo-dT primer と呼ばれる)を等量混
合したものを用いた。プライマー量として、10pmol/μl
のものを１．５μｌ 使用した。 5'-GGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' （配列番号７） 5'-CAGCTGTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' （配列番号８） 5'-CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' （配列番号９） (2) ClassIIS制限酵素(FokI)による切断 下記組成の反応液を、37℃で50分〜１時間保温した。
【００５６】
【００５７】(3) アダプター付加反応 アダプターとして、制限酵素を１箇所含む次の２種類を
用いた。 i) Nxyz-C1GMR このビオチン化アダプターは、付着末端に配列Nxyz[ N
はA 、G 、C 又はT(4種類の塩基の混合) を表し、xyz
はとりうる64通りの組合せの塩基配列の一つを表す。]
で示される塩基配列を有し、アダプターの配列内に制限
酵素SalI認識部位を有するものである。配列は以下の通
りである。 5'-biotin-GTACATATTGTCGTTAGAACGCACTCGTCGACGCG-3'
（＋鎖，配列番号１０） 5'-NxyzCGCGTCGACGAGTGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' （−
鎖，配列番号１１）
用いた。 i) Nxyz-C1GMR このビオチン化アダプターは、付着末端に配列Nxyz[ N
はA 、G 、C 又はT(4種類の塩基の混合) を表し、xyz
はとりうる64通りの組合せの塩基配列の一つを表す。]
で示される塩基配列を有し、アダプターの配列内に制限
酵素SalI認識部位を有するものである。配列は以下の通
りである。 5'-biotin-GTACATATTGTCGTTAGAACGCACTCGTCGACGCG-3'
（＋鎖，配列番号１０） 5'-NxyzCGCGTCGACGAGTGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' （−
鎖，配列番号１１）
【００５８】ii) Nxyz-C1GSR このビオチン化アダプターは、付着末端に配列Nxyz[ N
はA 、G 、C 又はT(4種類の塩基の混合) を表し、xyz
はとりうる64通りの組合せの塩基配列の一つを表す。]
で示される塩基配列を有し、アダプターの配列内に制限
酵素MluI認識部位を有するものである。配列は以下の通
りである。 5'-biotin-GTACATATTGTCGTTAGAACGCACGCGTCTACGCG-3'
（＋鎖，配列番号１２） 5'-NxyzCGCGTAGACGCGTGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' （−
鎖，配列番号１３） 次に、上記アダプターを用いて、下記反応液の組成にて
結合反応を行った。
はA 、G 、C 又はT(4種類の塩基の混合) を表し、xyz
はとりうる64通りの組合せの塩基配列の一つを表す。]
で示される塩基配列を有し、アダプターの配列内に制限
酵素MluI認識部位を有するものである。配列は以下の通
りである。 5'-biotin-GTACATATTGTCGTTAGAACGCACGCGTCTACGCG-3'
（＋鎖，配列番号１２） 5'-NxyzCGCGTAGACGCGTGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' （−
鎖，配列番号１３） 次に、上記アダプターを用いて、下記反応液の組成にて
結合反応を行った。
【００５９】
【００６０】蒸留水で10μl に調製し、16℃で一晩保温
する。結合反応終了後、サンプルに蒸留水40μl 、及び
10×T バッファー(NEBバッファー 4 ) 5μl を添加し、
さらに制限酵素BsmFI を0.3unit 添加し、65℃で50分保
温した。
する。結合反応終了後、サンプルに蒸留水40μl 、及び
10×T バッファー(NEBバッファー 4 ) 5μl を添加し、
さらに制限酵素BsmFI を0.3unit 添加し、65℃で50分保
温した。
【００６１】(4) 常磁気性ビーズによるアダプターの回
収 ビーズを分注するマイクロチューブを、PBS 0.1% BSAで
コーティングした。チューブは、１×B&W バッファー(1
0mM Tris-HCl pH7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA)で２回洗浄し
た。ストレプトアビジン被覆常磁気性ビーズを、１×B&
W バッファー(10mM Tris-HCl pH7.5, 1M NaCl, 1mM EDT
A)で２回洗浄し、等量の１×B&W バッファーに懸濁し
た。また、5N NaOH を希釈して0.1M NaOH を作製した。
この操作は、アダプター回収の直前に行った。
収 ビーズを分注するマイクロチューブを、PBS 0.1% BSAで
コーティングした。チューブは、１×B&W バッファー(1
0mM Tris-HCl pH7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA)で２回洗浄し
た。ストレプトアビジン被覆常磁気性ビーズを、１×B&
W バッファー(10mM Tris-HCl pH7.5, 1M NaCl, 1mM EDT
A)で２回洗浄し、等量の１×B&W バッファーに懸濁し
た。また、5N NaOH を希釈して0.1M NaOH を作製した。
この操作は、アダプター回収の直前に行った。
【００６２】サンプルに、5M NaCl 15μl 、及び10mg/m
l 常磁性ビーズ 5μl を添加し、時々攪拌しながら20分
間静置した。比較したい２つのサンプルを混合した後0.
1M NaOH 50μl で１回洗浄した。１×B&W バッファー 5
0 μl で１回洗浄した後、蒸留水50μl で２回洗浄し
た。 (5) 一次ＰＣＲ反応 ｃＤＮＡを吸着させたビーズを３等分し、下記の組成の
反応液中でＰＣＲ反応を行った。
l 常磁性ビーズ 5μl を添加し、時々攪拌しながら20分
間静置した。比較したい２つのサンプルを混合した後0.
1M NaOH 50μl で１回洗浄した。１×B&W バッファー 5
0 μl で１回洗浄した後、蒸留水50μl で２回洗浄し
た。 (5) 一次ＰＣＲ反応 ｃＤＮＡを吸着させたビーズを３等分し、下記の組成の
反応液中でＰＣＲ反応を行った。
【００６３】
【００６４】ＰＣＲは、94℃で１分、55℃で１分及び72
℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを20サイクル行
った。 (6) 制限酵素による切断 一次ＰＣＲ反応終了後、反応終了液５μl を二つ作製
し、一方には制限酵素MulI 1 unit を含む５×高バッフ
ァー 5μl 、他方には制限酵素SalI 1 unit を含む５×
高バッファー 5μl を加え、37℃で１時間保温した。 (7) 二次ＰＣＲ反応 下記の組成の反応液中でＰＣＲ反応を行った。
℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを20サイクル行
った。 (6) 制限酵素による切断 一次ＰＣＲ反応終了後、反応終了液５μl を二つ作製
し、一方には制限酵素MulI 1 unit を含む５×高バッフ
ァー 5μl 、他方には制限酵素SalI 1 unit を含む５×
高バッファー 5μl を加え、37℃で１時間保温した。 (7) 二次ＰＣＲ反応 下記の組成の反応液中でＰＣＲ反応を行った。
【００６５】
【００６６】ＰＣＲは、94℃で１分、55℃で１分及び72
℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを20サイクル行
った。反応終了後、下記の組成のT4DPase ミックスを加
え、37℃で１時間保温した。
℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを20サイクル行
った。反応終了後、下記の組成のT4DPase ミックスを加
え、37℃で１時間保温した。
【００６７】
【００６８】保温後、72℃で10分加熱後、透析して２μ
l を熱変性した後、日立製自動シークエンサーにかけ
た。結果を図４に示す。図４中、１）はフルオログラム
表示、２）はエレクトロフェログラム表示（縦軸は蛍光
強度、横軸は鎖長を時間で表示したもの）であり、Ａは
検出の目的となる断片の蛍光強度、Ｂは非特異的に発現
した断片であって試料の両方に共通して現れる断片の蛍
光強度を示す。また、図４においてａはNxyz-C1GMR (xy
z ＝CTC)と肝臓RNA 、ｂは Nxyz-C1GSR (xyz＝CTC)と腎
臓RNA との間でライゲーションを行った後混合し、doub
le anchored primer Cを使ってPCR 反応を行った結果で
あって、ａは制限酵素MluI消化したもの、ｂは制限酵素
SalI消化したものである。また、ｃはNxyz-C1GMR (xyz
＝CTC)と腎臓ＲＮＡ、ｄは Nxyz-C1GSR (xyz＝CTC)と肝
臓ＲＮＡとの間でライゲーションを行った後混合し、do
uble anchored primer Cを使ってPCR 反応行った結果で
あって、ｃは制限酵素MluI消化したもの、ｄは制限酵素
SalI消化したものである。各断片における蛍光強度を表
３に示す。なお、表３中、定量の目的断片の蛍光強度
を、共通に発現している断片の蛍光強度で補正した。
l を熱変性した後、日立製自動シークエンサーにかけ
た。結果を図４に示す。図４中、１）はフルオログラム
表示、２）はエレクトロフェログラム表示（縦軸は蛍光
強度、横軸は鎖長を時間で表示したもの）であり、Ａは
検出の目的となる断片の蛍光強度、Ｂは非特異的に発現
した断片であって試料の両方に共通して現れる断片の蛍
光強度を示す。また、図４においてａはNxyz-C1GMR (xy
z ＝CTC)と肝臓RNA 、ｂは Nxyz-C1GSR (xyz＝CTC)と腎
臓RNA との間でライゲーションを行った後混合し、doub
le anchored primer Cを使ってPCR 反応を行った結果で
あって、ａは制限酵素MluI消化したもの、ｂは制限酵素
SalI消化したものである。また、ｃはNxyz-C1GMR (xyz
＝CTC)と腎臓ＲＮＡ、ｄは Nxyz-C1GSR (xyz＝CTC)と肝
臓ＲＮＡとの間でライゲーションを行った後混合し、do
uble anchored primer Cを使ってPCR 反応行った結果で
あって、ｃは制限酵素MluI消化したもの、ｄは制限酵素
SalI消化したものである。各断片における蛍光強度を表
３に示す。なお、表３中、定量の目的断片の蛍光強度
を、共通に発現している断片の蛍光強度で補正した。
【００６９】
【表３】
【００７０】ａ及びｄは肝臓由来の断片、ｂ及びｃは腎
臓由来の断片であるから、肝臓での発現量と腎臓での発
現量との比はａ／ｂ及びｄ／ｃである。補正値によれ
ば、ａ／ｂは4.04であり、ｄ／ｃは4.41であることか
ら、量比の幾何平均は4.21である。従って、本発明の方
法を分子インデックス法に応用することができ、増幅産
物の量比を求めることができた。
臓由来の断片であるから、肝臓での発現量と腎臓での発
現量との比はａ／ｂ及びｄ／ｃである。補正値によれ
ば、ａ／ｂは4.04であり、ｄ／ｃは4.41であることか
ら、量比の幾何平均は4.21である。従って、本発明の方
法を分子インデックス法に応用することができ、増幅産
物の量比を求めることができた。
【００７１】
【発明の効果】本発明により、遺伝子発現の定量方法が
提供される。本発明の方法は、臨床検体のように多数の
サンプルを扱う場合、あるいは多数の遺伝子の定量を行
う場合に特に有用である。
提供される。本発明の方法は、臨床検体のように多数の
サンプルを扱う場合、あるいは多数の遺伝子の定量を行
う場合に特に有用である。
【００７２】
配列番号：1 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTATTGTAAG AAAGCCAATG CG 22
【００７３】配列番号：2 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTACATATTG TCGTTAGAAC GC 22
【００７４】配列番号：3 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GATCCGCGTT CTAACGACAA TATGTAC 27
【００７５】配列番号：4 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG 23
【００７６】配列番号：5 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GATCGAGCAC TCTTAGCGTT CTAACGACAA TATGTAC 37
【００７７】配列番号：6 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTACATATTG TCGTTAGAAC GCTAAGAGTG CTC 33
【００７８】配列番号：7 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGATCCTTTT TTTTTTTTTT TTA 23
【００７９】配列番号：8 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGCTGTTTT TTTTTTTTTT TTA 23
【００８０】配列番号：9 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTCGAGTTTT TTTTTTTTTT TTA ２３
【００８１】配列番号：１０ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTACATATTG TCGTTAGAAC GCACTCGTCG ACGCG 35
【００８２】配列番号：11 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified-site 存在位置：2..4 特徴を決定した方法：E 他の情報：とりうる64通りの組合せの塩基配列のうちの
一つを表す。
一つを表す。
【００８３】 配列： NNNNCGCGTC GACGAGTGCG TTCTAACGAC AATATGTAC 39
【００８４】配列番号：12 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTACATATTG TCGTTAGAAC GCACGCGTCT ACGCG 35
【００８５】配列番号：13 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified-site 存在位置：2..4 特徴を決定した方法：E 他の情報：とりうる64通りの組合せの塩基配列のうちの
一つを表す。
一つを表す。
【００８６】 配列： NNNNCGCGTA GACGCGTGCG TTCTAACGAC AATATGTAC 39
【図１】本発明の定量方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の定量方法の概要を示す図である。
【図３】ｃＤＮＡのＰＣＲ産物についてシークエンサー
により解析を行った結果を示す図である。
により解析を行った結果を示す図である。
【図４】ｃＤＮＡのＰＣＲ産物についてシークエンサー
により解析を行った結果を示す図である。
により解析を行った結果を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 少なくとも２種類の試料に含まれるｃＤ
ＮＡのそれぞれに種類の異なるアダプターを付加し、該
アダプターが付加されたｃＤＮＡを含む各試料を等量混
合した後前記ｃＤＮＡを増幅し、得られる増幅産物の量
比を求めることを特徴とする遺伝子発現の定量方法。 - 【請求項２】 種類の異なるアダプターが、互いに長さ
の異なるヌクレオチド、又は制限酵素部位を少なくとも
１箇所有するヌクレオチドを含むものである請求項１記
載の定量方法。 - 【請求項３】 種類の異なるアダプターが、互いに配列
の異なるヌクレオチドを含むものである請求項１記載の
定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9313398A JP2905192B2 (ja) | 1997-04-07 | 1998-04-06 | 遺伝子発現の定量方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-88495 | 1997-04-07 | ||
| JP8849597 | 1997-04-07 | ||
| JP9313398A JP2905192B2 (ja) | 1997-04-07 | 1998-04-06 | 遺伝子発現の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10337200A true JPH10337200A (ja) | 1998-12-22 |
| JP2905192B2 JP2905192B2 (ja) | 1999-06-14 |
Family
ID=26429862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9313398A Expired - Fee Related JP2905192B2 (ja) | 1997-04-07 | 1998-04-06 | 遺伝子発現の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2905192B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6248534B1 (en) | 1999-05-25 | 2001-06-19 | Kikuya Kato | Method for determining the detection value of a target RNA |
| WO2007063807A1 (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Olympus Corporation | 核酸の一次構造変化の解析方法 |
-
1998
- 1998-04-06 JP JP9313398A patent/JP2905192B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6248534B1 (en) | 1999-05-25 | 2001-06-19 | Kikuya Kato | Method for determining the detection value of a target RNA |
| WO2007063807A1 (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Olympus Corporation | 核酸の一次構造変化の解析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2905192B2 (ja) | 1999-06-14 |
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