KR20180053679A - 단일 뉴클레오타이드 해상도를 가진 다가 프로브 - Google Patents

단일 뉴클레오타이드 해상도를 가진 다가 프로브 Download PDF

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KR20180053679A
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다에 김
폴 마틴 로스
가빈 메레디스
엘리자베스 에이. 맨라오
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나노스트링 테크놀로지스, 인크.
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Abstract

본 발명은 특히, 단일 염기 해상도(예를 들어 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입 및 결실의 검출)를 이용하여 DNA 및 RNA의 정확하고 강력한 효소- 및 증폭-불포함 검출을 가능하게 하는 중합체 가닥, 프로브, 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다. 이러한 조성물, 방법 및 키트는 추가로, DNA 및/또는 RNA 및 단백질 표적의 동시적인 검출을 제공할 수 있다.

Description

단일 뉴클레오타이드 해상도를 가진 다가 프로브
본 발명은 단일 뉴클레오타이드 해상도를 가진 다가 프로브에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2015년 9월 3일에 출원된 미국 가출원 62/213,812 및 2016년 2월 8일에 출원된 미국 가출원 62/292,690에 대해 우선권 및 이득을 주장한다. 상기 언급된 출원은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
배경기술
핵산 검출에서, 안정성이 높은 프로브와 특이성이 높은 프로브 사이에서 상쇄(trade-off)가 존재하며; 예를 들어, 더 긴 길이를 가진 프로브는 높은 용융 온도를 가지고 있으며 고도로 안정하지만, 이러한 프로브는 특이성이 결여되어 있고 단일 염기 치환을 검출하지 못한다. 단일 염기 해상도를 이용하여 DNA 및 RNA의 정확하고 강력한 효소- 및 증폭-불포함 검출을 가능하게 하는 프로브, 조성물, 방법 및 키트가 요망되고 있다.
본 발명은 단일 염기 해상도(예를 들어 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입 및 결실의 검출)를 이용하여 DNA 및 RNA의 정확하고 강력한 효소-프리 및 증폭-프리 검출을 가능하게 하는 중합체 가닥, 프로브, 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제1 양태는 적어도 (1) 제1 표적 결합 영역, (2) 제1 상보성 영역 및 (3)　서열 특이적 영역을 가진 제1 중합체 가닥, 및 적어도 (1) 제2 표적 결합 영역 및 (2) 제2 상보성 영역을 가진 제2 중합체 가닥을 포함하는 중합체 가닥 쌍에 관한 것이다. 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적은 동일한 핵산 분자 내에 있고, 제1 표적 결합 영역의 표적은 제2 표적 결합 영역의 표적과 겹치지 않는다. 제1 상보성 영역은 제2 상보성 영역과 상보적이다.
본 발명의 제2 양태는 시료를 제1 양태의 중합체 가닥 쌍과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이러한 양태는 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
시료내 핵산을 검출하는 것에 관한 본 발명의 각각의 양태에서, 각각의 제1 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식(identify)하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점(quantum dot), 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다.
본 발명의 제3 양태는 제1 양태의 복수의 중합체 가닥 쌍을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 중합체 가닥 쌍은 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 중합체 가닥 쌍은 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제4 양태는, 시료를 제1 양태의 복수의 중합체 가닥 쌍들과 접촉시키거나 시료를 제3 양태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태는 (1) 제1 중합체 가닥 쌍에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 제1 중합체 가닥 쌍 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출하고, (2) 적어도 제2 중합체 가닥 쌍에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 적어도 제2 중합체 가닥 쌍 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제5 양태는 제1 양태의 중합체 가닥 쌍 및 포획(capture) 중합체 가닥을 포함하는 중합체 가닥 트리오(trio)에 관한 것이다. 포획 중합체 가닥은 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 가진 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 (2) 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역들의 표적들은 겹치지 않고, 동일한 핵산 분자 내에 존재한다.
본 발명의 제6 양태는, 시료를 제5 양태의 중합체 가닥 트리오와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이러한 양태는, 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 중합체 가닥 트리오 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제7 양태는 제5 양태의 복수의 중합체 가닥 트리오를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 중합체 가닥 트리오는 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 중합체 가닥 트리오는 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제8 양태는 시료를 제5 양태의 복수의 중합체 가닥 트리오들과 접촉시키거나 시료를 제7 양태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태는 (1) 제1 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 제1 중합체 가닥 트리오 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출하고, (2) 적어도 제2 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 적어도 제2 중합체 가닥 트리오 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제9 양태는, 제1 양태의 중합체 가닥 쌍의 제1 상보성 영역 및 제2 상보성 영역이 혼성화된 경우 수득되는 부분적 이중 가닥 핵산 프로브에 관한 것이다. 혼성화 시, 제1 중합체 가닥 및 제2 중합체 가닥은 제1 양태의 중합체 가닥 쌍의 각각의 특징을 갖는 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 형성한다.
본 발명의 제10 양태는, 시료를 제9 양태의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이러한 양태는, 부분적 이중 가닥 핵산 프로브에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 부분적 이중 가닥 핵산 프로브 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제11 양태는 제9 양태의 복수의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브들을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 이중 가닥 핵산 프로브는 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 이중 가닥 핵산 프로브는 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제12 양태는, 시료를 제9 양태의 복수의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브들과 접촉시키거나 시료를 제11 양태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태는 (1) 제1 부분적 이중 가닥 핵산 프로브에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 제1 부분적 이중 가닥 핵산 프로브 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출하고, (2) 적어도 제2 부분적 이중 가닥 핵산 프로브에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 적어도 제2 부분적 이중 가닥 핵산 프로브 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제13 양태는 제9 양태의 복수의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브들 및 복수의 포획 중합체 가닥을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 제1 포획 중합체 가닥은 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 (2) 제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 적어도 제2 포획 중합체 가닥은 각각 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 (2) 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 각각의 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역들의 표적들은 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제14 양태는 적어도 (1) 제1 표적 결합 영역, (2) 제2 표적 결합 영역, (3) 제1 표적 결합 영역과 제2 표적 결합 영역 사이의 스페이서 및 (4) 서열 특이적 영역을 포함하는 다가 중합체 가닥에 관한 것이다. 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 동일한 핵산 분자 내에 존재하고, 제1 표적 결합 영역의 표적이 제2 표적 결합 영역의 표적과 겹치지 않는다. 스페이서는 중합체 사슬, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.
본 발명의 제15 양태는 시료를 제14 양태의 다가 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이러한 양태는 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제16 양태는 제14 양태의 복수의 다가 중합체 가닥을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 다가 중합체 가닥은 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 다가 중합체 가닥은 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제17 양태는 시료를 제14 양태의 복수의 다가 중합체 가닥들과 접촉시키거나 시료를 제16 양태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태는 (1) 제1 다가 중합체 가닥에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 제1 다가 중합체 가닥 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출하고, (2) 적어도 제2 다가 중합체 가닥에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 적어도 제2 다가 중합체 가닥 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제18 양태는 제14 양태의 다가 중합체 가닥 및 포획 중합체 가닥을 포함하는 다가 중합체 가닥 듀오(duo)에 관한 것이다. 포획 중합체 가닥은 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 갖는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 (2) 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적은 겹치지 않고, 동일한 핵산 분자 내에 존재한다.
본 발명의 제19 양태는 시료를 제18 양태의 다가 중합체 가닥 듀오와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이러한 양태는 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 중합체 가닥 트리오 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제20 양태는 제18 양태의 복수의 다가 중합체 가닥 듀오를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 다가 중합체 가닥 듀오는 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 다가 중합체 가닥 듀오는 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제21 양태는 시료를 제18 양태의 복수의 다가 중합체 가닥 듀오들과 접촉시키거나 시료를 제20 양태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태는 (1) 제1 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합을 검출하거나 제1 중합체 가닥 트리오 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출하고, (2) 적어도 제2 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 적어도 제2 중합체 가닥 트리오 상의 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 조성물들 중 임의의 조성물은 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 시료를, 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제22 양태는 제3 양태, 제7 양태, 제11 양태, 제13 양태, 제16 양태 또는 제20 양태의 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 양태들 중 임의의 양태의 방법을 수행하는 데 필요한 다른 구성성분이 키트에 포함될 수 있다. 키트는 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 각각의 양태에서, 표지된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 검출 가능한 표지 단량체로 표지될 수 있다. 표지는 올리고뉴클레오타이드의 말단에, 올리고뉴클레오타이드 내의 임의의 포인트에, 또는 이들의 조합에 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 아민-변형을 가진 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 이러한 아민-변형은 검출 가능한 표지를 뉴클레오타이드에 커플링할 수 있다. 본 발명의 표지된 올리고뉴클레오타이드는 다양한 표지 단량체들, 예컨대 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 화학발광 마커, 비오틴, 또는 직접적으로(예를 들어 발광에 의해) 또는 간접적으로(예를 들어 형광표지된 항체의 결합에 의해) 검출될 수 있는 것으로 당업계에 공지된 다른 단량체 중 임의의 단량체를 이용하여 표지될 수 있다. 본 발명에 의해 이용될 수 있는 표지의 바람직한 예는 형광단이다. 비제한적으로 GFP-관련 단백질, 시아닌 염료, 플루오레세인, 로다민, ALEXA Fluor™, 텍사스 레드(Texas Red), FAM, JOE, TAMRA 및 ROX를 포함하는 몇가지 형광단들이 뉴클레오타이드의 표지를 위한 표지 단량체로서 사용될 수 있다. 몇가지 상이한 형광단들이 공지되어 있으며, 전체 스펙트럼을 아우르는 형광단들이 계속해서 제조되고 있다.
본 발명의 각각의 양태에서, 표지 부착 위치는 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화(비공유 결합)될 수 있다. 대안적으로, 위치는 검출 가능한 표지가 결여된 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있다. 각각의 위치는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 21개 내지 100개 또는 그 이상의 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 각각의 위치에 혼성화되는 표지된 올리고뉴클레오타이드의 수는 올리고뉴클레오타이드의 위치의 길이 및 크기에 따라 다르다. 위치는 약 12개 내지 약 1,500개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 12개 내지 약 1,500개 뉴클레오타이드 길이로 다양하다. 실시형태에서, 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 800개 내지 약 1,300개 리보뉴클레오타이드로 다양하다. 다른 실시형태에서, 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 20개 내지 약　55개 데옥시리보뉴클레오타이드로 다양하며; 이러한 올리고뉴클레오타이드는 약 65℃ 내지 약 85℃, 예를 들어 약 80℃의 용융/혼성화 온도를 갖도록 설계된다. 예를 들어, 길이가 약 1,100개 뉴클레오타이드인 위치는, 각각의 올리고뉴클레오타이드가 약 45개 내지 약 25개의 데옥시리보뉴클레오타이드 길이를 포함하는, 약 25개 내지 약 45개의 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 실시형태에서, 각각의 위치는 길이가 약 33개 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 약 34개의 표지된 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된다. 표지된 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는, 단일 가닥 DNA이다.
본 발명의 각각의 양태에서, (위치와 표지된 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 통해) 각각의 위치와 결합된 표지는 선행 위치 또는 후속 위치의 표지와 공간적으로 분리 가능하고 스펙트럼적으로 분해 가능하다(resolvable). 프로브의 공간적으로 분리 가능하고 스펙트럼적으로 분해 가능한, 순서가 매겨진(ordered) 일련의 표지들은 본원에서 바코드 또는 표지 코드로서 지칭된다. 바코드 또는 표지 코드는 특정 프로브에 의해 결합된 표적 핵산 또는 표적 단백질의 인식을 가능하게 한다.
용어 "하나 이상의", "적어도 하나의" 등은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 이상, 및 이들 수 사이의 임의의 수이지만 이들로 한정되는 것은 아닌 것으로 이해된다. 따라서, "적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드"는 예를 들어 2개의 올리고뉴클레오타이드, 6개의 올리고뉴클레오타이드 및 10개의 올리고뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다.
이와는 반대로, 용어 "~ 이하"는 언급된 값보다 작은 각각의 값을 포함한다. 예를 들어, "100개 이하의 뉴클레오타이드"는 100, 99, 98, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 및 0개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
용어 "복수의", "적어도 2개의", "2개 이상의", "적어도 2의" 등은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 이상 및 이들 수 사이의 임의의 수를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 것으로 이해된다. 따라서, "적어도 2의 중합체 가닥 쌍"은 2개의 중합체 가닥 쌍, 10개의 중합체 가닥 쌍, 100개의 중합체 가닥 쌍 및 1000개의 중합체 가닥 쌍을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 유사하게는, "적어도 2의 핵산 분자"는 2개의 핵산 분자, 20개의 핵산 분자, 40개의 핵산 분자 및 60개의 핵산 분자를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, "적어도 2의 포획 중합체 가닥"은 2개의 포획 중합체 가닥, 500개의 포획 중합체 가닥, 1000개의 포획 중합체 가닥 및 5000개의 포획 중합체 가닥을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 더욱이, "적어도 2의 표지 부착 위치"는 2개의 표지 부착 위치, 4개의 표지 부착 위치, 6개의 표지 부착 위치 및 8개의 표지 부착 위치를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시형태에서, 1, 2, 3,　4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 이상, 및 이들 수 사이의 임의의 수의 핵산이 검출될 수 있다. 실시형태에서, 검출 단계는 각각의 핵산의 풍부도(abundance)를 정량화하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 프로브 및 방법은 5 ng의 신선한 또는 포르말린-고정 파라핀-포매된(FFPE) 게놈 DNA(gDNA)로부터 약 5%의 대립유전자 빈도를 갖는 체세포 변이체의 검출을 가능하게 한다.
US2003/0013091, US2007/0166708, US2010/0015607, US2010/0261026, US2010/0262374, US2010/0112710, US2010/0047924, US2014/0371088, US2014/0017688 및 US2011/0086774에 기재된 바와 같은 NanoString Technologies®의 nCounter® 프로브, 시스템 및 방법이 표적 단백질 및/또는 표적 핵산의 인식에 바람직한 수단이다. NanoString Technologies®의 nCounter® 프로브, 시스템 및 방법은 복수의(800개 이상의) 개별 표적 단백질 및/또는 표적 핵산들의 동시적인 다중화된(multiplexed) 인식을 가능하게 한다. 상기 언급된 특허 공개들은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. NanoString Technologies®의 상기 언급된 nCounter® 프로브, 시스템 및 방법은 본원에 기재된 임의의 양태 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
단일 nCounter® 카트리지(예를 들어 이의 단일 레인(lane))는 상기 언급된 nCounter® 프로브, 시스템 및 방법과 본원에 기재된 양태 또는 실시형태의 조합으로부터 복수의 개별 표적 단백질 및/또는 표적 핵산들의 동시적인 다중화된 인식에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 양태 또는 실시형태는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양태 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
개시내용이 이의 상세한 설명과 함께 기재되어 있긴 하지만, 상기 설명은 본 개시내용을 예시하는 것이고 이의 범위를 제한하려는 것이 아니며, 이의 범위는 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정된다. 다른 양태, 이점 및 변형은 하기 청구항의 범위에 포함된다.
본원에서 인용된 특허 및 과학적 문헌은 당업자에게 입수 가능한 지식을 구축한다. 본원에서 인용된 모든 미국 특허들 및 공개되거나 비공개된 미국 특허 출원들은 원용에 의해 포함된다. 본원에서 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원들은 원용에 의해 포함된다. 본원에서 인용된 모든 다른 공개된 참조문헌, 문서, 사본 및 과학적 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면이 포함된 이러한 특허 또는 특허 출원의 복사본은 요청 시 필요한 수수료를 지불하여 특허청으로부터 제공받게 될 것이다.
도 1은 예시적인 중합체 가닥, 중합체 가닥 쌍 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 도시한 것이다. 도 1a는 제1 표적 결합 영역(적색)을 포함하는 제1 중합체 가닥 및 제2 표적 결합 영역(녹색)을 포함하는 중합체 가닥 쌍을 도시한 것이다. 도 1b는 표지 모이어티(녹색 원형)를 가진 제1 중합체 가닥 및 친화성 모이어티(별표)를 가진 제2 중합체 가닥을 포함하는 중합체 가닥 쌍을 도시한 것이다. 도 1c는 중합체 가닥 쌍을 도시한 것이며, 여기서, 제1 중합체 가닥은 선형 조합으로 공유결합 연결된 복수의(6개가 도시되어 있음) 표지 부착 위치를 포함하는 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되어 있으며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되며; 대안적으로, 서열 특이적 영역은 선형 조합으로 공유결합 연결된 복수의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합된다. 도 1d 내지 도 1g는 중합체 가닥 쌍을 도시하고 있으며, 여기서, 각각의 제1 상보성 영역은 제2 상보성 영역에 혼성화됨으로써, 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 생성한다. 도 1f는 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있으며, 여기서, 복수의 표지 부착 위치들 중 하나는 표지 단량체가 결여된(열린 검정색 원형으로 도시되어 있음) 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있다. 도 1g는 리포터 프로브에 결합된 서열 특이적 영역을 가진 중합체 가닥 쌍/이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있으며, 여기서, 리포터 프로브는 복수의(5개가 도시되어 있음) 표지 부착 위치를 포함하고 있으며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있다. 각각의 유색 원형은 각각의 표지 부착 위치와 결합되어 있거나 서열 특이적 영역과 결합되어 있는 전체 표지 단량체를 나타낸다. 도 1 및 본 명세서 내 다른 어느 곳에서 도시된 색상은 비제한적이며; 당업계에 공지된 다른 유색 표지 및 다른 검출 가능한 표지가 본 발명의 프로브에 사용될 수 있다.
도 2는, 각각이 핵산 분자에 결합되어 있는, 도 1과 유사한 중합체 가닥 쌍/이중 가닥 핵산 프로브들을 도시하고 있다. 도 2b는 핵산에 결합된 포획 중합체 가닥을 도시하고 있으며; 포획 중합체 가닥은 친화성 모이어티(별표)를 포함한다.
도 3은 각각이 적어도 하나의 스페이서(청색 곡선으로 도시되어 있음)를 포함하는 예시적인 중합체 가닥, 중합체 가닥 쌍 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있다. 도 3a는 각각의 중합체 가닥이 스페이서를 포함하는 중합체 가닥 쌍을 도시하고 있다. 도 3b는 제1 중합체 가닥이 스페이서를 갖고 있는 중합체 가닥 쌍을 도시하고 있다. 도 3c는 제2 중합체 가닥이 스페이서를 갖고 있는 중합체 가닥 쌍을 도시하고 있다. 도 3e는 제1 중합체 가닥이 친화성 모이어티(별표)를 포함하는 중합체 가닥 쌍/이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있다. 도 3f는 복수의 표지 부착 위치들 중 하나가 표지 단량체가 결여된(열린 검정색 원형으로 도시되어 있음) 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있는 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있다.
도 4는, 각각이 핵산 분자에 결합되어 있는, 도 3과 유사한 중합체 가닥 쌍/이중 가닥 핵산 프로브들을 도시하고 있다. 도 4c는 핵산에 결합된 포획 중합체 가닥을 도시하고 있으며; 포획 중합체 가닥은 다시, 적어도 하나의 친화성 모이어티(별표)를 포함하는 단일 가닥 핵산에 의해 결합되어 있다.
도 5는 본 발명의 중합체 가닥, 중합체 가닥 쌍 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 사용하여 핵산 분자를 검출하는 소정의 단계를 도시하고 있다. 도 5a는 제1 중합체 가닥이 핵산 분자에 결합하고 있는 것을 도시하며; 제1 중합체 가닥은 스페이서를 포함한다. 도 5b는 제2 중합체 가닥이 핵산 분자에 결합되어 있으며, 제1 상보성 영역이 제2 상보성 영역에 혼성화되는 이후의 단계를 도시하고 있다. 제1 중합체 가닥 및 제2 중합체 가닥이 핵산 분자에 동시에 제공된다는 점에서 도 5b의 단계가 본 방법에서 제1 단계일 수 있으며; 대안적으로, 먼저 제1 중합체 가닥 및 제2 중합체 가닥이 이들의 상보성 영역을 통해 혼성화될 수 있고(이로써 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 생성함), 그런 다음 프로브가 핵산 분자에 제공됨을 주지한다. 도 5c는 리포터 프로브에 결합된 서열 특이적 영역을 갖고 있는 도 5b의 이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있으며, 여기서, 리포터 프로브는 복수의(4개가 도시되어 있음)의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있다. 도 5c에 도시된 복합체의 각각의 구성성분이 핵산에 개별적으로 또는 동시에 제공될 수 있음을 주지한다.
도 6은 본 발명의 중합체 가닥, 중합체 가닥 쌍 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 사용하여 핵산 분자를 검출하는 다른 단계를 도시하고 있다. 도 6a는 이중 가닥 핵산 프로브, 및 핵산 분자에 결합된 포획 중합체 가닥을 도시하고 있다. 도 6b는 리포터 프로브에 결합된 서열 특이적 영역을 갖고 있는 도 6a의 이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있으며, 여기서, 리포터 프로브는 복수의(6개가 도시되어 있음)의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있다. 핵산 분자는 또한, 포획 중합체 가닥에 의해 결합되어 있으며, 이는 다시 적어도 하나의 친화성 모이어티(별표)를 포함하는 단일 가닥 핵산에 의해 결합되어 있다.
도 7은 본 발명의 중합체 가닥, 중합체 가닥 쌍 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 사용하여 핵산 분자를 검출하는 또 다른 일련의 단계를 도시하고 있다. 도 7a는 핵산 분자에의 포획 중합체 가닥의 초기 결합을 도시하고 있다. 이후 도 7c에서, 제2 중합체 가닥이 핵산 분자에 결합한다.
도 8은 예시적인 중합체 가닥, 중합체 가닥 쌍 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있으며, 여기서, 각각의 제1 중합체 가닥은 절단 가능한 링커(보라색 삼각형으로 도시되어 있음)를 포함한다. 도 8c에서, 리포터 프로브가 친화성 모이어티(별표)를 포함하고, 도 8d에서는 일부의 서열 특이적 영역이 친화성 모이어티를 포함한다.
도 9a는 핵산 분자에 결합된 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 도시하고 있으며, 여기서, 제1 중합체 가닥은 절단 가능한 링커(보라색 삼각형으로 도시되어 있음)를 포함한다. 절단 가능한 링커를 절단하기에 충분한 힘(적색 번개모양 볼트)이 적용된다. 도 9b는 부분적 이중 가닥 핵산 프로브로부터 방출된 리포터 프로브에 결합되어 있는 서열 특이적 영역의 일부를 도시하고 있다. 그런 다음, 방출된 리포터 프로브가 검출될 수 있다. 이러한 예에서, 방출된 서열 특이적 영역의 일부는 친화성 모이어티를 포함하며, 이러한 친화성 모이어티는 후속 단계에서 포획될 수 있다.
도 10은 예시적인 다가 중합체 가닥을 도시한 것이다. 도 10a는 제1 표적 결합 영역(녹색), 제2 표적 결합 영역(적색), 제1 표적 결합 영역과 제2 표적 결합 영역 사이의 스페이서, 및 서열 특이적 영역(제2 표적 결합 영역의 좌측에 존재함)을 포함하는 다가 중합체 가닥을 도시하고 있다. 도 10b는 표지 모이어티(적색 원형)를 포함하는 다가 중합체 가닥을 도시한 것이다. 도 10c는 선형 조합으로 공유결합 연결된 복수의(6개가 도시되어 있음)의 표지 부착 위치를 포함하는 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 연결된 다가 중합체 가닥을 도시하고 있으며, 여기서, 5개의 표지 부착 위치들은 적어도 하나의 표지 단량체(유색 원형)를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있고, 하나의 표지 부착 위치는 표지 단량체가 결여된(열린 검정색 원형으로 도시되어 있음) 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있으며; 대안적으로, 서열 특이적 영역은 선형 조합으로 공유결합 연결된 복수의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합되어 있다. 도 10d는 리포터 프로브에 결합된 서열 특이적 영역을 갖는 다가 중합체 가닥을 도시하고 있으며, 여기서, 리포터 프로브는 복수의(6개가 도시되어 있음) 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있다. 각각의 유색 원형은 각각의 표지 부착 위치와 결합되거나 서열 특이적 영역과 결합된 전체 표지 단량체를 나타낸다.
도 11은, 각각이 핵산 분자에 결합되어 있는, 도 10과 유사한 다가 중합체 가닥을 도시하고 있다. 도 11b는 핵산에 결합된 포획 중합체 가닥을 도시하고 있으며; 포획 중합체 가닥은 친화성 모이어티(별표)를 포함한다.
도 12는 각각이 하나의 스페이서(청색 곡선으로 도시됨)를 포함하는 예시적인 다가 중합체 가닥을 도시하고 있다. 도 12b는 친화성 모이어티(별표)를 포함하는 다가 중합체 가닥을 도시하고 있다. 도 12e는 복수의 표지 부착 위치들 중 하나가 표지 단량체가 결여된(열린 검정색 원형으로 도시되어 있음) 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 결합되어 있는 다가 중합체 가닥을 도시한 것이다.
도 13은 각각이 핵산 분자에 결합되어 있는 도 12와 유사한 다가 중합체 가닥을 도시하고 있다. 도 13c는 핵산 분자에 결합된 다가 중합체 가닥 및 포획 중합체 가닥을 도시하고 있으며; 포획 중합체 가닥은 다시, 적어도 하나의 친화성 모이어티(별표)를 포함하는 단일 가닥 핵산에 의해 결합되어 있다.
도 14는 다가 중합체 가닥 및 포획 중합체 가닥을 사용하여 핵산 분자를 검출하는 예시적인 단계를 보여준다.
도 15는 절단 가능한 링커(보라색 삼각형으로 도시됨)를 포함하는 예시적인 다가 중합체 가닥을 도시하고 있다. 도 15d 내지 도 15f의 다가 중합체 가닥은 각각 하나의 스페이서(청색 곡선으로 도시됨)를 포함하는 반면, 도 15a 내지 도 15c의 다가 중합체 가닥에는 스페이서가 결여되어 있다.
도 16은 본 발명의 1가 프로브 및 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브/다가 중합체 가닥에 대한 용융 온도 분포를 예시하는 그래프를 보여준다.
도 17은 본 발명의 방법에 사용 가능한, 시료내 하나 이상의 핵산의 검출 단계를 개괄한 것이다.
도 18은 NanoString Technologies®의 기존의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용하는 BRAF V600E SNP 검출 실험(실시예 1)에 사용되는 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브(도 18a)를 도시한 것이다. 도 18b는 도 18a의 3개의 프로브에 의해 결합된 핵산 서열을 보여준다. 도 18c는 실시예 1에서 수득된 결과의 서브세트를 보여준다.
도 19 내지 도 22는 BRAF V600E SNP 검출 실험(실시예 1)에서 수득된 부가적인 결과를 예시한 것이다.
도 23은 BRAF V600E SNP 검출 실험(실시예 1)에서 수득된 결과를 기반으로 한 양호하게 수행되는 2-암(two-armed) 프로브에 대한 프로브 설계 경향을 예시한 것이다.
도 24는 NanoString Technologies®의 기존의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용하는 EGFR T790M SNP 검출 실험(실시예 1)에서 수득된 결과를 제공한다.
도 25는 4개의 실험들로부터 수득된 결과를 기반으로 한 양호하게 수행되는 2-암 프로브에 대한 프로브 설계 경향을 예시한 것이다. 실시예 1에 더 기재되어 있다.
도 26은 핵산 분자에 결합된 도 1 내지 도 3과 유사한 중합체 가닥 쌍/이중 가닥 핵산 프로브, 및 핵산에 결합된 포획 중합체 가닥을 도시하고 있으며; 포획 중합체 가닥은 다시, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 의해 결합되어 있다. 중합체 가닥 쌍/이중 가닥 핵산 프로브에 의해 검출 가능한 SNP가 도시되어 있다.
도 27은 KRAS의 엑손 2, 코돈 12 및 13에서 단일 뉴클레오타이드 변이체(SNV)에 대한 참조 서열을 보여준다. 참조 서열 및 SNV 유전자좌에 특이적인 프로브가 제조되었으며, 시험되었다.
도 28a 내지 도 28d는 실시예 2에 기재된 KRAS 엑손 2 핫스팟 실험에 사용된 프로브를 보여준다. KRAS 엑손 2 핫스팟을 둘러싸고 있는 주형 서열이 상부를 따라 도시되어 있다. 매칭 참조 프로브 및 10개의 SNV 돌연변이체 프로브들이 도시되어 있으며, 2개의 표적 결합 영역들이 청색 및 적색으로 강조되어 있다. 모든 실험에 공통의 프로브 B 올리고(도 26에서 적색)가 사용되었다. 도 28a는 전체 서열을 보여주며, 도 28b 내지 도 28d는 각각 도 28a의 서열의 1/3을 보여준다.
도 29는 실시예 2에 기재된 KRAS 엑손 2 핫스팟 실험의 결과를 보여준다. 각각의 유전자좌에서의 특이성은, 모든 KRAS 엑손 2 프로브들에 대한 계수의 퍼센트로서 표적과 정확하게 매칭하는 프로브에 대한 디지털 계수의 퍼센트에 의해 결정된다.
도 30은 EGFR의 엑손 19 및 이의 공지된 결실 변이체를 보여준다.
도 31a 내지 도 31d는 실시예 3의 EGFR 엑손 19 결실 실험에 사용된 프로브를 보여준다. EGFR 엑손 19 결실을 둘러싸고 있는 주형 서열은 상부를 따라 도시되어 있다. 매칭 참조 프로브 및 3개의 돌연변이체 프로브들이 도시되어 있으며, 2개의 표적 결합 영역들이 청색 및 적색으로 강조되어 있다. 결실 영역은 프로브 서열에서 분홍색으로 강조된 갭으로 도시되어 있다. 모든 실험들은 공통의 프로브 B 올리고(도 26에서 적색)를 사용하였다. 도 31a는 전체 서열을 보여주고, 도 31b 내지 도 31d는 각각 도 31a의 서열의 1/3을 보여준다.
도 32는 실시예 3에 기재된 EGFR 엑손 19 결실 실험의 결과를 보여준다. 각각의 결실 서열에 대한 특이성은, 모든 EGFR 엑손 19 프로브들에 대한 계수의 퍼센트로서 표적과 정확하게 매칭하는 프로브에 대한 디지털 계수의 퍼센트에 의해 결정된다.
도 33a 내지 도 33d는 실시예 4의 멀티플렉스 SNV 실험에 사용된 프로브를 보여준다. 7개의 SNV 유전자좌들을 각각 둘러싸고 있는 주형 서열은 상부를 따라 도시되어 있다. 매칭 WT 및 SNV 돌연변이체 프로브가 도시되어 있으며, 2개의 표적 결합 영역들은 청색 및 적색으로 강조되어 있다. 각각의 유전좌에 대한 프로브 B 올리고는 황색으로 강조되어 있다. 도 33a는 전체 서열을 보여주고, 도 33b 내지 도 33d는 각각 도 33a의 서열의 1/3을 보여준다.
도 34는 실시예 4의 멀티플렉스 SNV 실험 결과를 보여준다. 3개의 세포주 DNA 시료인 SKMEL 2, SKMEL 5 및 SKMEL 28을 7개의 SNV 돌연변이에 대해 유전자형 분석을 수행하였으며; 유전자 및 코스믹(cosmic) 인식을 도표에 나타낸다. 백그라운드에 걸친 신호를 야생형(WT) 및 돌연변이체(Mut) 서열에 매칭하는 프로브에 대해 도시한다.
도 35는 다른 방법에 의해 결정된 유전자형과 비교하여 실시예 4의 멀티플렉스 SNV 실험에 의해 결정된 유전자형을 보여준다. qPCR 결과를, 동일한 세포주로부터 취한 시료를 이용한 TaqMan™ 검정법을 사용하여 확인하였다. NGS 및 WGS 결과는 문헌으로부터 취해진다.
도 36은 실시예 5의 3D 생물학 실험 결과를 보여주며, 이러한 실험은 DNA SNV, RNA 유전자 발현 및 단백질을 동시에 검출한다. 3개의 세포주에 BRAF 저해 약물인 베무라페닙(vemurafenib)을 투약하였다. 3개의 세포주는 BRAF V600E 돌연변이에 WT인 SW 48, 돌연변이에 대해 이종성인 RPMI 7591, 및 이중 돌연변이체인 SKMEL 28이었다. 베무라페닙은 BRAF V600E 돌연변이를 함유하는 세포를 특이적으로 표적화한다. 모든 데이터는 3중 중복으로 수행되었다. 각각의 세포주의 유전자형을 SNV DNA 검정법을 사용하여 확인하였다. 약물 처리로 인한 유전자 발현(상부) 및 단백질 발현(하부)의 변화는 BRAF V600E 유전자형에 따라 다르다.
도 37은 단백질 검출에 사용된 3개 유형의 프로브들을 보여준다. 상부 배치에서, 프로브는 단백질-결합 도메인에 결합된 핵산을 포함하며; 이 배치에서, 절단 가능한 모티프(예를 들어 절단 가능한 링커, 도시되어 있지 않음)는 핵산과 단백질-결합 도메인 사이에 포함되거나 또는 핵산 그 자체 내에 포함될 수 있다. 중간 배치에서, 단백질-결합 도메인은 핵산에 결합되고, 프로브는 핵산에 혼성화한다. 프로브(표적-결합 도메인, 및 단백질-결합 도메인(녹색으로 도시됨)에 결합된 핵산을 포함함)는, 표적 결합 도메인이 단백질 표적에 결합하기 이전 또는 이후에 프로브에 의해 결합될 수 있다(도 38에 도시된 바와 같음). 절단 가능한 모티프는 백본, 또는 단백질-결합 도메인에 결합된 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다에 포함될 수 있다. 하부 배치에서, 단백질-결합 도메인은 핵산에 결합되고, 중간 올리고뉴클레오타이드(적색으로 도시됨)가 프로브, 및 단백질-결합 도메인에 결합된 핵산 둘 다에 혼성화한다.
도 38은 도 37의 중간 프로브 및 하부 프로브를 보여준다. 상부의 2개 이미지는, 프로브가 단백질에 결합하기 이전 및 이후의 프로브를 보여준다. 다음 이미지는, 프로브의 절단 가능한 모티프가 절단된 이후의 프로브를 보여주며; 이 이미지에서, 절단 가능한 모티프는 핵산과 표적 결합 도메인 사이에 존재한다. 일단 핵산이 방출되면, 핵산은 신호 올리고뉴클레오타이드로서 간주될 수 있다. 하부 이미지에서, 신호 올리고뉴클레오타이드(프로브의 방출된 핵산)는 리포터 프로브에 의해 결합되어 있다.
도 39는 도 37에 도시된 중간 배치의 프로브 및 도 38의 프로브로부터의 신호 올리고뉴클레오타이드의 방출을 보여준다. 프로브 내의(또는 리포터 프로브에서의) 절단 가능한 모티프의 위치는, 어떤 물질이 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드와 함께 포함되는지에 영향을 미친다.
도 40은 실시예 6에 기재된 KRAS 엑손 2 돌연변이핫스팟 실험의 결과를 보여준다. 각각의 혼성화 반응에서의 총 계수는 참조 계수에 의해 지배되고, 예상된 변이체 계수는 5%로 존재한다.
도 41은 실시예 7에 기재된 EGFR 엑손 19 삽입-결실 핫스팟 실험의 결과를 보여준다. 각각의 혼성화 반응에서의 총 계수는 참조 계수에 의해 지배되고, 변이체 주형에 대한 예상된 변이체 계수는 5%로 존재한다.
도 42는 실시예 8에 기재된 멀티플렉스 SNV 검출 실험의 결과를 보여준다. 2개의 FFPE-유래 게놈 DNA(gDNA) 시료들의 동일한 부피의 혼합물은 SNV 검정법에 의해 검정된 10개의 돌연변이를 포함하는 시료를 제공하며, 존재율은 1% 내지 10%이다.
도 43은 실시예 8에 기재된 핫스팟 실험에서 멀티플렉스 SNV 검출 실험으로부터의 변이체 프로브 계수의 비교를 보여준다.
도 44는 실시예 8에 기재된 핫스팟 실험에서 멀티플렉스 SNV 검출 실험으로부터의 p-값의 비교를 보여준다. 참조 시료를 변이체 시료와 비교한 계수에서의 유의한 차이는, 변이체 시료 내에서의 돌연변이체 대립유전자의 존재를 가리킨다.
도 45는 실시예 9에 기재된 바와 같은 SNV 및 유전자 융합 전사체의 동시적인 검출에 대한 전반적인 실험적 작업흐름도를 보여준다.
도 46은 실시예 9에 기재된 바와 같은 동시적인 SNV 및 융합 검출 실험에서 사용된 SNV 및 프라이머의 SNV 패널 및 특징에 의해 조사된 SNV의 목록을 보여준다.
도 47은 실시예 9에 기재된 데이터에 대한 SNV 돌연변이체 대립유전자-특이적 프로브 계수 비교를 보여준다. 이러한 비교는 참조 gDNA 시료와 비교하여, COSM532-함유 FFPE gDNA 시료로부터 검출된 KRAS COSM532 돌연변이에 대해 약 100배 초과의 계수를 보여준다.
도 48은 실시예 9에 기재된 데이터에 대한 SNV 참조 대립유전자-특이적 프로브 계수 비교를 보여준다. 이러한 비교는 참조 gDNA 시료 및 COSM532-함유 FFPE gDNA 시료로부터의 참조 대립유전자 검출에서 유의한 차이가 없음을 보여준다.
도 49는 실시예 9에 기재된 바와 같이 SNV를 동시에 검정하면서 수득된 폐 융합 유전자 검정법 계수를 보여준다. 데이터는 대조군 시료에서만 EML4-ALK 융합의 증거를 보여준다.
도 50은 실시예 9에 기재된 바와 같이 SNV를 동시에 검정하면서 수득된 폐 융합 유전자 검정법 계수를 보여준다. 데이터는 대조군 시료에서만 CCDC6-RET 융합의 증거를 보여준다.
도 51은 실시예 9에 기재된 바와 같이 SNV를 동시에 검정하면서 수득된 폐 융합 유전자 검정법 계수를 보여준다. 데이터는 대조군 시료에서만 SLC34A2-ROS1 융합의 증거를 보여준다.
도 52는 실시예 9에 기재된 바와 같이 SNV를 동시에 검정하면서 수득된 폐 융합 유전자 검정법 계수를 보여준다. 데이터는, 동시적인 SNV 및 융합 전사체 검출 검정법 동안 사용된 상이한 RNA 공급원들이 유의하게 상이한 SNV 검정법 프로브 계수들을 제공하지 않음을 보여준다.
본 발명은 부분적으로는, 단일 염기 해상도(예를 들어 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입 및 결실의 검출)를 이용하여 DNA 및 RNA의 정확하고 강력한 효소- 및 증폭-불포함 검출을 가능하게 하는 중합체 가닥, 프로브, 조성물, 방법 및 키트를 기반으로 한다.
본 발명은 특이적인 혼성화 사건을 인식하고/거나 정량화하기 위한 다양한 '검출' 기술(예를 들어 형광, 색원성 및 질량 분광법)과 조합될 수 있다. 예로서, 본원에 개시된 중합체 가닥 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브는 광범위하게 다양한 판독 리포터들, 예를 들어, 형광 리포터(단일 분자, 마이크로입자를 통한 다분자, DNA 오리가미(origami), 롤링 원형 증폭, 및 분지형 DNA), 화학발광, 색원성, 질량 태그(질량 분광법용) 및 효소적 리포터와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 표준 핵산 혼성화 방법은 본 발명의 프로브에 사용되도록 개조될 수 있다. 더욱이, 본원에 개시된 중합체 가닥 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브는 NanoString Technologies®의 형광 광학 바코드 시스템, 예를 들어 nCounter® 시스템과 상용성이고 함께 사용될 수 있으며; 따라서, nCounter® 시스템의 작업흐름도에서 최소의 변화가 존재한다. 아울러, 본원에 개시된 중합체 가닥 및 부분적 이중 가닥 핵산 프로브는 단일 염기 해상도를 이용한 멀티플렉스 핵산 검출 및 디지털 정량화(예를 들어 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입 및 결실의 검출)를 제공하며; 이들은 현재 이용 가능한 기술에 대한 상당한 개선이다.
핵산 검출용 프로브의 설계는 안정성과 특이성 사이의 교환이다. 더 긴 프로브(예를 들어 35개 염기 쌍들)는 높은 용융 온도(Tm) 및 상대적으로 좁은 Tm 분포를 가지며; 이들 프로브는 밀착적이고 완전한 결합을 제공하지만, 특이성이 낮고 일반적으로 1개 또는 2개 이상의 미스매치를 검출하지 못한다. 한편, 더 짧은 프로브(예를 들어 10개 염기 쌍들)는 낮은 Tm 및 매우 넓은 Tm 분포를 가지며; 이들 프로브는 불량한 결합력을 제공하지만, 매우 특이적이고 단일 염기 식별이 가능하다. 본 발명은 2개의 짧은 핵산 결합 영역을 가진 프로브를 개시함으로써 이러한 문제점을 해결하며, 이들 핵산 결합 영역은 함께 안정성 및 특이성을 제공하고 단일 염기 치환을 검출할 수 있다. 도 16은 본 발명의 이러한 이점들을 예시한 것이다.
도 16에 도시된 바와 같이, 약 10개 염기 쌍의 표적 결합 도메인을 가진 짧은 프로브는 낮은 온도 및 넓게 분포된 용융 온도를 가지며, 약 35개 염기 쌍의 표적 결합 도메인을 가진 긴 프로브는 높은 온도 및 좁게 분포된 용융 온도를 가진다. 이와는 대조적으로, 본 발명은 낮은 온도 및 좁게 분포된 용융 온도를 가진 2개의 짧은 표적 결합 도메인(예를 들어 8개 염기 쌍 + 9개 염기 쌍; 9개 염기 쌍 + 11개 염기 쌍, 및 10개 염기 쌍 + 13개 염기 쌍)을 가진 프로브를 제공한다.
본 발명에서, 상대적으로 짧은 핵산 결합 영역은 높은 특이성을 유지하는 것을 도와 단일 염기 식별을 가능하게 하면서도, 한편으로는 2개의 핵산 결합 영역들은 함께, 이들 2개 핵산 결합 영역들 유래의 서열들이 표적 서열과 완벽하게 매치될 때 혼성화된 암의 용융 온도를 증가시킨다. 핵산 결합 영역 내에서의 단일 미스매치는 상대적으로 짧은 핵산 결합 영역 길이로 인해 안정한 혼성화를 방지하고, 하나의 결합 영역 단독으로는 안정한 혼성화를 유지하기에 너무 짧다. 2개의 핵산 결합 영역들이 모두 완벽한 매치로 혼성화할 때에만, 안정하고 특이적인 혼성화가 유지될 수 있고, 후속적으로 다양한 수단들에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 프로브는, 핵산 검출용 프로브의 설계 시, 이전에 요구된 안정하고 민감한 결합과 단일 염기 치환에 대한 민감도 사이의 교환을 무효화한다.
본 발명의 특이적 프로브는 단일 염기 치환을 99% 초과의 정확도로 검출할 수 있다. 실시예 1을 참조한다.
본 발명의 제1 양태는 적어도 (1) 제1 표적 결합 영역, (2) 제1 상보성 영역 및 (3)　서열 특이적 영역을 가진 제1 중합체 가닥, 및 적어도 (1) 제2 표적 결합 영역 및 (2) 제2 상보성 영역을 가진 제2 중합체 가닥을 포함하는 중합체 가닥 쌍에 관한 것이다. 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적은 동일한 핵산 분자 내에 있고, 제1 표적 결합 영역의 표적은 제2 표적 결합 영역의 표적과 겹치지 않는다. 제1 상보성 영역은 제2 상보성 영역과 상보적이다.
제1 양태의 예시적인 중합체 가닥 쌍은 도 1a 내지 1c, 3a 내지 3c, 8a, 8b, 8d 및 8e에 예시되어 있다.
제1 양태의 실시형태에서, 제1 중합체 가닥은 (예를 들어 제1 표적 결합 영역과 제1 상보성 영역 사이에) 스페이서를 포함할 수 있고/거나 제2 중합체 가닥은 (예를 들어 제2 표적 결합 영역과 제2 상보성 영역 사이에) 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 중합체 사슬, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. '폴딩 접합부(folding joint)들' 사이의 스페이서는 안정화를 위해 응력점(stress point)을 경감시키고; 스페이서는 영역들 사이의 접합부 또는 영역 내의 접합부 상의 '굽힘(bending)' 변형력(strain)을 완화시키기 위해 포함될 수 있다.
제1 양태의 실시형태에서, 제1 표적 결합 영역, 제1 상보성 영역 및 서열 특이적 영역 중 적어도 하나는 단일 가닥 핵산(예를 들어 DNA 또는 RNA)이다. 제1 중합체 가닥 전체가 단일 가닥 핵산 분자일 수 있다. 제2 표적 결합 영역 및 제2 상보성 영역 중 적어도 하나는 단일 가닥 핵산(예를 들어 DNA 또는 RNA)이다. 제2 중합체 가닥 전체가 단일 가닥 핵산 분자일 수 있다.
제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역은 핵산 분자(즉, 동일한 핵산 분자)에 결합할 수 있다. 핵산 분자는 DNA, 예를 들어 진핵생물 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, 박테리아 게놈 DNA, 고세균 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, cDNA 및 합성(즉, 비-천연) DNA일 수 있다. 핵산 분자는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(스플라이싱-전 또는 스플라이싱-후 mRNA), 비-코딩 RNA(ncRNA), 리보좀 RNA(rRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 바이러스 RNA, 박테리아 RNA 및 합성(즉, 비-천연) RNA일 수 있다. 핵산 분자는 상응하는 야생형 핵산 분자와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이, 예를 들어 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이는 제1 표적 결합 영역의 표적 및/또는 제2 표적 결합 영역의 표적 내에 존재할 수 있으며; 대안적으로 또는 부가적으로, 돌연변이는 2개의 표적들 외부에 존재할 수 있다. 돌연변이가 1개 초과의 염기 변화에 상응하는 경우, 돌연변이에 상응하는 하나 이상의 염기는 제1 표적 결합 영역의 표적 내에 존재할 수 있고, 돌연변이에 상응하는 하나 이상의 염기는 제2 표적 결합 영역의 표적 내에 존재할 수 있다.
제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적은 하나 이상(예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 100, 1000, 또는 그 이상 및 이들 수 사이의 임의의 수)의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있으며; 2개의 중합체 가닥들이 (이들의 상보성 영역을 통해) 서로 혼성화하고 핵산 내의 각각의 표적에 결합할 수 있는 한, 2개의 표적들 사이의 분리 거리에는 상한이 없다. 부분적으로, 1개 또는 2개의 스페이서의 길이는 2개의 표적들 사이의 분리 거리를 결정하여, 스페이서 또는 스페이서들이 더 길수록, 핵산 내의 각각의 표적에 대한 안정한 결합 및 2개의 중합체 가닥들의 안정한 혼성화를 여전히 허용하면서도, 2개의 표적들이 더 멀리 분리될 수 있다. 대안적으로, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적은 인접해 있을 수 있다(즉, 뉴클레오타이드에 의해 분리되지 않음).
제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역의 길이는 각각 약 5개 내지 약 35개 뉴클레오타이드 길이이고, 예를 들어 10개 내지 30개 뉴클레오타이드이다. 예로서, 각각의 표적 결합 영역은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 제1 표적 결합 영역의 길이 및 제2 표적 결합 영역의 길이는 합하여, 약 55개 뉴클레오타이드 이하이다(즉, 10개 초과의 뉴클레오타이드 내지 60개 미만의 뉴클레오타이드, 및 이들 수 사이의 모든 합계).
제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도 및/또는 제2 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도는 약 5℃ 내지 약 35℃(예를 들어 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35℃)이다. 제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도와 제2 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도는 약 30℃ 이하(예를 들어 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 및 0℃)만큼 상이하다. 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역은 대략 동일한 측정 또는 예측된 용융 온도를 가질 수 있다. 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역 전체의 측정 또는 예측된 용융 온도는 약 25℃ 내지 약 60℃(예를 들어 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60℃)이다.
제1 상보성 영역 및/또는 제2 상보성 영역은 각각 약 12개 내지 약 60개(예를 들어 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60개) 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
제1 양태의 실시형태에서, 제1 중합체 가닥의 서열 특이적 영역은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함할 수 있다. 각각의 표지 부착 위치는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 결합할 수 있다. 적어도 하나의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지 단량체, 예를 들어 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체를 포함한다. 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체는 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에는 표지 단량체가 결여되어 있을 수 있다. 서열 특이적 영역은 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
제1 양태의 실시형태에서, 제1 중합체 가닥의 서열 특이적 영역은 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 이러한 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함한다. 각각의 표지 부착 위치는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 결합할 수 있다. 적어도 하나의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지 단량체, 예를 들어 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체를 포함한다. 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체는 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에는 표지 단량체가 결여되어 있을 수 있다. 서열 특이적 영역 및/또는 단일 가닥 핵산 백본은 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
제1 양태의 실시형태에서, 서열 특이적 영역은 리포터 프로브의 일부에 결합할 수 있다. 리포터 프로브는 적어도 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 포함한다. 이러한 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함한다. 각각의 표지 부착 위치는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 결합할 수 있다. 적어도 하나의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지 단량체, 예를 들어 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체를 포함한다. 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체는 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에는 표지 단량체가 결여되어 있을 수 있다. 리포터 프로브는 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다. 서열 특이적 영역에 상보적인 리포터 프로브의 결합 부위는 약 20개 내지 약 50개(예를 들어 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50개) 뉴클레오타이드 길이이다.
제1 양태의 실시형태에서, 제1 중합체 가닥의 서열 특이적 영역은 적어도 하나의 표지 단량체, 예를 들어 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 표지 단량체는 서열 특이적 영역 내 뉴클레오타이드에 공유결합 부착될 수 있거나, 서열 특이적 영역의 일부에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 공유결합 부착될 수 있다. 서열 특이적 영역은 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
제1 양태의 실시형태에서, 제2 중합체 가닥은 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
제1 양태의 실시형태에서, 제1 중합체 가닥은 제1 상보성 영역과 서열 특이적 영역 사이에 절단 가능한 링커를 추가로 포함하며; 대안적으로, 절단 가능한 링커는 서열 특이적 영역 내에 존재한다. 절단 가능한 링커는 광-절단(photo-cleavable) 가능한, 화학적으로 절단 가능한 및/또는 효소적으로 절단 가능한 링커일 수 있다. 광-절단 가능한 링커는 적합한 간섭성(coherent) 광원(예를 들어 레이저 및 UV 광원) 또는 적합한 비간섭성 광원(예를 들어 아크 램프(arc-lamp) 및 발광 다이오드(LED))에 의해 제공되는 광에 의해 절단될 수 있다.
본 발명의 제2 양태는 시료를 제1 양태 및/또는 제1 양태의 임의의 실시형태의 중합체 가닥 쌍과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유 부
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공유결합 연결되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
제2 양태에 따른 핵산의 검출에 대한 예시적인 방법은 도 2a, 2c, 4a, 4b 및 5에 예시되어 있다.
실시형태에서, 제2 양태는 시료를 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 포획 중합체 가닥은 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 갖는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역 및 (2) 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적은 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제3 양태는 제1 양태 및/또는 제1 양태의 임의의 실시형태의 복수의 중합체 가닥 쌍을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 중합체 가닥 쌍은 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 중합체 가닥 쌍은 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제4 양태는 시료를 제1 양태 및/또는 제1 양태의 임의의 실시형태의 복수의 중합체 가닥 쌍들과 접촉시키거나 시료를 제3 양태 및/또는 제3 양태의 임의의 실시형태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 각각의 제1 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 제1 중합체 가닥 쌍 및 적어도 제2 중합체 가닥 쌍에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 제4 양태는 시료를 복수의 제3 중합체 가닥들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 제1 포획 중합체 가닥은 적어도, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역 및 제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 적어도 제2 포획 중합체 가닥은 각각 적어도, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역 및 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 각각의 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역들의 표적들은 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제5 양태는 제1 양태 및/또는 제1 양태의 임의의 실시형태의 중합체 가닥 쌍 및 포획 중합체 가닥을 포함하는 중합체 가닥 트리오에 관한 것이다. 포획 중합체 가닥은 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 가진 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 (2) 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역들의 표적들은 겹치지 않고, 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제6 양태는, 시료를 제5 양태 및/또는 제5 양태의 임의의 실시형태의 중합체 가닥 트리오와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는, 중합체 가닥 트리오 상의 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
제6 양태에 따른 핵산의 검출에 대한 예시적인 방법은 도 2b, 4c, 6a, 6b, 7 및 9에 예시되어 있다.
본 발명의 제7 양태는 제5 양태 및/또는 제5 양태의 임의의 실시형태의 복수의 중합체 가닥 트리오를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 중합체 가닥 트리오는 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 중합체 가닥 트리오는 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제8 양태는 시료를 제5 양태 및/또는 제5 양태의 임의의 실시형태의 복수의 중합체 가닥 트리오들과 접촉시키거나 시료를 제7 양태 및/또는 제7 양태의 임의의 실시형태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 각각의 제1 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 제1 중합체 가닥 트리오 및 적어도 제2 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제9 양태는, 제1 양태 및/또는 제1 양태의 임의의 실시형태의 중합체 가닥 쌍의 제1 상보성 영역 및 제2 상보성 영역이 혼성화된 경우 수득되는 부분적 이중 가닥 핵산 프로브에 관한 것이다. 혼성화 시, 제1 중합체 가닥 및 제2 중합체 가닥은 제1 양태 및/또는 제1 양태의 임의의 실시형태의 중합체 가닥 쌍의 각각의 특징을 갖는 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 형성한다. 부가적으로, 이러한 양태의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브는 제1 표적 및 제2 표적으로부터 측정 또는 예측된 용융 온도를 약 40℃ 내지 약 60℃(예를 들어 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60℃)로 가진다.
제9 양태의 예시적인 부분적 이중 가닥 핵산 프로브는 도 1d 내지 1g, 3d 내지 3g, 8c 및 8f에 예시되어 있다.
본 발명의 제10 양태는 시료를 제9 양태의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
제10 양태에 따른 핵산의 검출에 대한 예시적인 방법은 도 2a 내지 2c, 4a, 4b 및 5에 예시되어 있다.
실시형태에서, 제10 양태는 시료를 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 포획 중합체 가닥은 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 갖는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 (2) 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적은 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제11 양태는 제9 양태 및/또는 제9 양태의 임의의 실시형태의 복수의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브들을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 이중 가닥 핵산 프로브는 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 이중 가닥 핵산 프로브는 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제12 양태는, 시료를 제9 양태 및/또는 제9 양태의 임의의 실시형태의 복수의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브들과 접촉시키거나 시료를 제11 양태 및/또는 제11 양태의 임의의 실시형태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 각각의 제1 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 제1 부분적 이중 가닥 핵산 프로브 및 적어도 제2 부분적 이중 가닥 핵산 프로브에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 제12 양태는 시료를 복수의 제3 중합체 가닥들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 제1 포획 중합체 가닥은 적어도, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역 및 제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 적어도 제2 포획 중합체 가닥은 각각 적어도, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역 및 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 각각의 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역들의 표적들은 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제13 양태는 제9 양태 및/또는 제9 양태의 임의의 실시형태의 복수의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브들 및 복수의 포획 중합체 가닥을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 제1 포획 중합체 가닥은 적어도, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 적어도 제2 포획 중합체 가닥은 각각 적어도, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 각각의 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역들의 표적들은 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제14 양태는 적어도 (1) 제1 표적 결합 영역, (2) 제2 표적 결합 영역, (3) 제1 표적 결합 영역과 제2 표적 결합 영역 사이의 스페이서 및 (4) 서열 특이적 영역을 포함하는 다가 중합체 가닥에 관한 것이다. 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 동일한 핵산 분자 내에 존재하고, 제1 표적 결합 영역의 표적이 제2 표적 결합 영역의 표적과 겹치지 않는다. 스페이서는 중합체 사슬, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. '폴딩 접합부들' 사이의 스페이서는 안정화를 위해 응력점을 경감시키고; 스페이서는 영역들 사이의 접합부 또는 영역 내의 접합부 상의 '굽힘' 변형력을 완화시키기 위해 포함될 수 있다.
제14 양태의 예시적인 다가 중합체 가닥은 도　10, 12 및 15에 예시되어 있다.
제14 양태의 실시형태에서, 제1 표적 결합 영역, 제1, 제2 표적 결합 영역 및 서열 특이적 영역 중 적어도 하나는 단일 가닥 핵산(예를 들어 DNA 또는 RNA)이다. 다가 중합체 가닥 전체는 단일 가닥 핵산 분자일 수 있다.
제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역은 핵산 분자(즉, 동일한 핵산 분자)에 결합할 수 있다. 핵산 분자는 DNA, 예를 들어 진핵생물 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, 박테리아 게놈 DNA, 고세균 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, cDNA 및 합성(즉, 비-천연) DNA일 수 있다. 핵산 분자는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(스플라이싱-전 또는 스플라이싱-후 mRNA), 비-코딩 RNA(ncRNA), 리보좀 RNA(rRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 바이러스 RNA, 박테리아 RNA 및 합성(즉, 비-천연) RNA일 수 있다. 핵산 분자는 상응하는 야생형 핵산 분자와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이, 예를 들어 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 돌연변이는 제1 표적 결합 영역의 표적 및/또는 제2 표적 결합 영역의 표적에 존재할 수 있으며; 대안적으로 또는 부가적으로, 돌연변이는 2개의 표적들 외부에 존재할 수 있다.
제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적은 하나 이상의 뉴클레오타이드(예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 100, 1000개 또는 그 이상 및 이들 수 사이의 임의의 수)에 의해 분리될 수 있으며; 2개의 중합체 가닥들이 핵산 내의 각각의 표적에 결합할 수 있는 한, 2개의 표적들 사이의 분리 거리에는 상한이 없다. 부분적으로, 스페이서의 길이는 2개의 표적들 사이의 분리 거리를 결정하여, 스페이서 또는 스페이서들이 더 길수록, 핵산 내의 각각의 표적에 대한 안정한 결합을 여전히 허용하면서도, 2개의 표적들이 더 멀리 분리될 수 있다. 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적은 인접해 있을 수 있다(즉, 뉴클레오타이드에 의해 분리되지 않음).
제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역의 길이는 각각 약 5개 내지 약 35개 뉴클레오타이드 길이이고, 예를 들어 10개 내지 30개 뉴클레오타이드이다. 예로서, 각각의 표적 결합 영역은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 제1 표적 결합 영역의 길이 및 제2 표적 결합 영역의 길이는 합하여, 약 55개 뉴클레오타이드 이하이다(즉, 10개 초과의 뉴클레오타이드 내지 60개 미만의 뉴클레오타이드, 및 이들 수 사이의 모든 합계).
제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도 및/또는 제2 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도는 약 5℃ 내지 약 35℃(예를 들어 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35℃)이다. 제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도와 제2 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도는 약 30℃ 이하(예를 들어 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 및 1℃)만큼 상이하다. 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역은 대략 동일한 측정 또는 예측된 용융 온도를 가질 수 있다. 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역 전체의 측정 또는 예측된 용융 온도는 약 25℃ 내지 약 60℃(예를 들어 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60℃)이다.
제14 양태의 실시형태에서, 다가 중합체 가닥의 서열 특이적 영역은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함할 수 있다. 각각의 표지 부착 위치는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 결합할 수 있다. 적어도 하나의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지 단량체, 예를 들어 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체를 포함한다. 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체는 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에는 표지 단량체가 결여되어 있을 수 있다. 다가 중합체 가닥은 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
제14 양태의 실시형태에서, 다가 중합체 가닥의 서열 특이적 영역은 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 이러한 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함한다. 각각의 표지 부착 위치는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 결합할 수 있다. 적어도 하나의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지 단량체, 예를 들어 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체를 포함한다. 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체는 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에는 표지 단량체가 결여되어 있을 수 있다. 서열 특이적 영역 및/또는 단일 가닥 핵산 백본은 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
제14 양태의 실시형태에서, 서열 특이적 영역은 리포터 프로브의 일부에 결합할 수 있다. 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함한다. 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함한다. 각각의 표지 부착 위치는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 결합할 수 있다. 적어도 하나의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지 단량체, 예를 들어 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체를 포함한다. 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체는 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에는 표지 단량체가 결여되어 있을 수 있다. 리포터 프로브는 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다. 서열 특이적 영역에 상보적인 리포터 프로브의 결합 부위는 약 20개 내지 약 50개(예를 들어 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50개) 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
제14 양태의 실시형태에서, 다가 중합체 가닥의 서열 특이적 영역은 적어도 하나의 표지 단량체, 예를 들어 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 표지 단량체는, 서열 특이적 영역 내의 뉴클레오타이드에 공유결합 부착될 수 있거나 서열 특이적 영역의 일부에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 공유결합 부착될 수 있다. 서열 특이적 영역은 적어도 하나의 친화성 모이어티, 예를 들어 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘, 또는 고형 기질 상에서 직접적으로 또는 간접적으로 포획될 수 있는 또 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
제14 양태의 실시형태에서, 다가 중합체 가닥은 제2 표적 결합 영역과 서열 특이적 영역 사이에 절단 가능한 링커를 추가로 포함하며; 대안적으로, 절단 가능한 링커는 서열 특이적 영역 내에 존재한다. 절단 가능한 링커는 광-절단 가능한, 화학적으로 절단 가능한 및/또는 효소적으로 절단 가능한 링커일 수 있다. 광-절단 가능한 링커는 적합한 간섭성 광원(예를 들어 레이저 및 UV 광원) 또는 적합한 비간섭성 광원(예를 들어 아크 램프 및 발광 다이오드(LED))에 의해 제공되는 광에 의해 절단될 수 있다.
본 발명의 제15 양태는 시료를 제14 양태 및/또는 제14 양태의 임의의 실시형태의 다가 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 다가 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
제15 양태에 따른 핵산의 검출에 대한 예시적인 방법은 도 11a, 11c, 13a 및 13b에 예시되어 있다.
실시형태에서, 제15 양태는 시료를 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 포획 중합체 가닥은 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 갖는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 (2) 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적은 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제16 양태는 제14 양태 및/또는 제14 양태의 임의의 실시형태의 복수의 다가 중합체 가닥을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 다가 중합체 가닥은 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 다가 중합체 가닥은 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제17 양태는 시료를 제14 양태 및/또는 제14 양태의 임의의 실시형태의 복수의 다가 중합체 가닥들과 접촉시키거나 시료를 제16 양태 및/또는 제16 양태의 임의의 실시형태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 각각의 다가 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 제1 다가 중합체 가닥 및 적어도 제2 다가 중합체 가닥에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 제17 양태는 시료를 복수의 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 제1 포획 중합체 가닥은 적어도, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역 및 제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 적어도 제2 포획 중합체 가닥은 각각 적어도, 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역 및 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 각각의 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역들의 표적들은 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제18 양태는 제14 양태 및/또는 제14 양태의 임의의 실시형태의 다가 중합체 가닥 및 포획 중합체 가닥을 포함하는 다가 중합체 가닥 듀오에 관한 것이다. 포획 중합체 가닥은 적어도, (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 갖는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및 (2) 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다. 제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적은 겹치지 않고, 동일한 핵산 분자 내에 존재한다. 포획 중합체 가닥은 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌에 기재된 바와 같은 포획 프로브와 동의어이다.
본 발명의 제19 양태는 시료를 제18 양태 및/또는 제18 양태의 임의의 실시형태의 다가 중합체 가닥 듀오와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 다가 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 중합체 가닥 트리오 상의 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
제19 양태에 따른 핵산의 검출에 대한 예시적인 방법은 도 11b, 13c 및 14에 예시되어 있다.
본 발명의 제20 양태는 제18 양태 및/또는 제18 양태의 임의의 실시형태의 복수의 다가 중합체 가닥 듀오를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 양태에서, 제1 다가 중합체 가닥 듀오는 제1 핵산 분자에 결합할 수 있고, 적어도 제2 다가 중합체 가닥 듀오는 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있다. 제1 핵산 분자는 적어도 제2 핵산 분자와 상이하다.
본 발명의 제21 양태는 시료를 제18 양태 및/또는 제18 양태의 임의의 실시형태의 복수의 다가 중합체 가닥 듀오들과 접촉시키거나 시료를 제20 양태 및/또는 제20 양태의 임의의 실시형태의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 복수의 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 이 양태에서, 각각의 다가 중합체 가닥은 (a) 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (b) 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; (c) 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 리포터 프로브는 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합은 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역; 또는 (d) 하나 이상의 표지 단량체를 포함하는 서열 특이적 영역으로서, 여기서, 하나 이상의 표지 단량체는 핵산 분자를 인식하는, 서열 특이적 영역을 가진다. 하나 이상의 표지 단량체는 비오틴, 화학발광 마커, 염료, 효소, 형광색소, 나노입자, 양자점, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로부터 선택된다. 이러한 양태는 제1 중합체 가닥 트리오 및 적어도 제2 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출함으로써 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제22 양태는 제3 양태 및/또는 제3 양태의 임의의 실시형태, 제7 양태 및/또는 제7 양태의 임의의 실시형태, 제11 양태 및/또는 제11 양태의 임의의 실시형태, 제13 양태 및/또는 제13 양태의 임의의 실시형태, 제16 양태 및/또는 제16 양태의 임의의 실시형태 또는 제20 양태 및/또는 제20 양태의 임의의 실시형태의 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 조성물들 중 임의의 조성물은 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 시료를, 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 각각의 양태에서, 표지된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 검출 가능한 표지 단량체로 표지될 수 있다. 표지는 올리고뉴클레오타이드의 말단에, 올리고뉴클레오타이드 내의 임의의 포인트에, 또는 이들의 조합에 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 아민-변형을 가진 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 이러한 아민-변형은 검출 가능한 표지를 뉴클레오타이드에 커플링할 수 있다. 본 발명의 표지된 올리고뉴클레오타이드는 다양한 표지 단량체들, 예컨대 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 화학발광 마커, 비오틴, 또는 직접적으로(예를 들어 발광에 의해) 또는 간접적으로(예를 들어 형광표지된 항체의 결합에 의해) 검출될 수 있는 것으로 당업계에 공지된 다른 단량체 중 임의의 단량체를 이용하여 표지될 수 있다. 본 발명에 의해 이용될 수 있는 표지의 바람직한 예는 형광단이다. 비제한적으로 GFP-관련 단백질, 시아닌 염료, 플루오레세인, 로다민, ALEXA Fluor™, 텍사스 레드, FAM, JOE, TAMRA 및 ROX를 포함하는 몇가지 형광단들이 뉴클레오타이드의 표지를 위한 표지 단량체로서 사용될 수 있다. 몇가지 상이한 형광단들이 공지되어 있으며, 전체 스펙트럼을 아우르는 형광단들이 계속해서 제조되고 있다.
본 발명의 각각의 양태에서, 결합 위치의 수는 1 내지 100 또는 그 이상의 범위이다. 실시형태에서, 위치의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 15, 20, 30, 40, 50, 100의 범위 또는 이들 수 사이의 임의의 범위이다. 사실상, 핵산 검출을 위한 위치의 수는, 조작 그 자체가 당업자의 능력 내에 잘 존재하기 때문에 제한이 없다. 동시적으로 검출 가능한("다중화된") 핵산 분자의 수는 표지 부착 위치의 수에 따라 다르다. 예로서, 2개의 결합 위치가 존재하고 각각의 위치에 대해 2개의 가능한 유색 표지 단량체들이 존재하는 경우, 4개의 핵산 분자가 검출될 수 있으며; 3개의 결합 위치가 존재하고 각각의 위치에 대해 2개의 가능한 유색 표지 단량체들이 존재하는 경우, 8개의 핵산 분자가 검출될 수 있고; 3개의 결합 위치가 존재하고 각각의 위치에 대해 3개의 가능한 유색 표지 단량체들이 존재하는 경우, 27개의 핵산 분자가 검출될 수 있다.
본 발명의 각각의 양태에서, 표지 부착 위치는 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화(비공유 결합)될 수 있다. 대안적으로, 위치는 검출 가능한 표지가 결여된 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있다. 각각의 위치는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 21개 내지 100개 또는 그 이상의 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 각각의 위치에 혼성화되는 표지된 올리고뉴클레오타이드의 수는 올리고뉴클레오타이드의 위치의 길이 및 크기에 따라 다르다. 위치는 약 300개 내지 약 1,500개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 20개 내지 약 1,500개 뉴클레오타이드 길이로 다양하다. 실시형태에서, 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 800개 내지 약 1,300개 리보뉴클레오타이드로 다양하다. 다른 실시형태에서, 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 20개 내지 약　55개 데옥시리보뉴클레오타이드로 다양하며; 이러한 올리고뉴클레오타이드는 약 65℃ 내지 약 85℃, 예를 들어 약 80℃의 용융/혼성화 온도를 갖도록 설계된다. 예를 들어, 길이가 약 1,100개 뉴클레오타이드인 위치는, 각각의 올리고뉴클레오타이드가 약 45개 내지 약 25개의 데옥시리보뉴클레오타이드 길이를 포함하는, 약 25개 내지 약 45개의 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 실시형태에서, 각각의 위치는 길이가 약 33개 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 약 34개의 표지된 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된다. 표지된 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는, 단일 가닥 DNA이다.
본 발명의 각각의 양태에서, (위치와 표지된 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 통해) 각각의 위치와 결합된 표지는 선행 위치 또는 후속 위치의 표지와 공간적으로 분리 가능하고 스펙트럼적으로 분해 가능하다. 프로브의 공간적으로 분리 가능하고 스펙트럼적으로 분해 가능한, 순서가 매겨진(ordered) 일련의 표지들은 본원에서 바코드 또는 표지 코드로서 지칭된다. 바코드 또는 표지 코드는 특정 프로브에 의해 결합된 표적 핵산 또는 표적 단백질의 인식을 가능하게 한다.
용어 "하나 이상의", "적어도 하나의" 등은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 이상, 및 이들 수 사이의 임의의 수이지만 이들로 한정되는 것은 아닌 것으로 이해된다. 따라서, "적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드"는 예를 들어 2개의 올리고뉴클레오타이드, 6개의 올리고뉴클레오타이드 및 10개의 올리고뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다.
용어 "복수의", "적어도 2개의", "2개 이상의", "적어도 2의" 등은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 이상 및 이들 수 사이의 임의의 수를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 것으로 이해된다. 따라서, "적어도 2의 중합체 가닥 쌍"은 2개의 중합체 가닥 쌍, 10개의 중합체 가닥 쌍, 100개의 중합체 가닥 쌍 및 1000개의 중합체 가닥 쌍을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 유사하게는, "적어도 2의 핵산 분자"는 2개의 핵산 분자, 20개의 핵산 분자, 40개의 핵산 분자 및 60개의 핵산 분자를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, "적어도 2의 포획 중합체 가닥"은 2개의 포획 중합체 가닥, 500개의 포획 중합체 가닥, 1000개의 포획 중합체 가닥 및 5000개의 포획 중합체 가닥을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 더욱이, "적어도 2의 표지 부착 위치"는 2개의 표지 부착 위치, 4개의 표지 부착 위치, 6개의 표지 부착 위치 및 8개의 표지 부착 위치를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
중합체 가닥 또는 프로브는 화학적으로 합성될 수 있거나, 프로브를 인코딩하는 핵산이 클로닝된 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 중합체 가닥 또는 프로브는 본 발명의 방법 및 키트에 사용될 수 있다.
당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 주어진 핵산에 대해, 측정 또는 예측된 용융 온도(Tm) 값은 용액 조건, 예를 들어 1가(예를 들어 Na+) 양이온 및 2가 양이온(예를 들어 Mg2+)의 농도, 및 유리(free) 뉴클레오타이드(예를 들어 dNTP)의 농도에 따라 다르다. 또한, 중합체 가닥 및 표적 핵산 분자의 농도와 관련이 있다. 일반적으로, 본원에 언급된 바와 같이, Tm은 핵산 화학 분야의 당업자에게 공지된 알고리즘을 사용하여 "예측되며"; 그렇더라도, 측정과 예측 사이에 잠재적인 오차율은 항상 존재한다. 이러한 오차율은 전형적으로 ±2℃ 내지 ±3℃이다. 가장 보편적으로, 본원에 언급된 Tm은 Tm 예측에 대한 표준 용액 농도 하에 존재하며, 예로서, 15 mM Na+, 0 mM Mg2+, 0 mM dNTP, 및 100 pM 중합체 가닥 내지 820 mM Na+, 0　mM Mg2+, 0 mM dNTP 및 250 nM 중합체 가닥 하에 존재한다. 또한, 중합체 가닥 및/또는 영역의 길이가 측정 또는 예측된 용융 온도에 영향을 미치는 것으로 잘 공지되어 있으며; 따라서, 용융 온도는 중합체 가닥 영역, 예를 들어 표적 결합 영역 및/또는 상보성 영역의 길이를 다양하게 함으로써 조절될 수 있다.
본 발명의 임의의 중합체 가닥 또는 프로브는 친화성 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 친화성 모이어티의 비제한적인 예들은 하기에 제공되어 있다. 대부분의 친화성 모이어티는 이중 목적: 중합체 가닥, 부분적 이중 가닥 프로브 및/또는 리포터 프로브의 고정을 위한 앵커로서, 및 중합체 가닥, 부분적 이중 가닥 프로브 및/또는 리포터 프로브(완전히 또는 오로지 부분적으로 어셈블리되었든지 간에)의 정제를 위한 모이어티로서 역할을 할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
소정의 실시형태에서, 친화성 모이어티는 단백질 단량체이다. 단백질 단량체의 예로는, 면역글로불린 불변 영역(문헌[Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience] 참조), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST; 문헌[Smith, 1993, Methods Mol. Cell. Bio. 4:220-229), 이. 콜라이(E. coli) 말토스 결합 단백질(문헌[Guan et al., 1987, Gene 67:21-30]) 및 다양한 셀룰로스 결합 도메인(미국 특허 5,496,934; 5,202,247; 및 5,137,819; 문헌[Tomme et al., 1994, Protein Eng. 7:117-123]) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 친화성 모이어티는 특이적인 결합 파트너에 의해 인지되고, 따라서 결합 파트너에의 친화적인 결합에 의해 단리 및 고정을 촉진하며, 이러한 결합 파트너는 고형 지지체 상에 고정될 수 있다. 예를 들어, 친화성 모이어티는 에피토프일 수 있고, 결합 파트너는 항체일 수 있다. 이러한 에피토프의 예로는, FLAG 에피토프, 아미노산 408-439에서의 myc 에피토프, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 에피토프 또는 디곡시게닌("DIG") 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 실시형태에서, 친화성 모이어티는 또 다른 단백질 또는 아미노산, 예를 들어 아비딘/스트렙타비딘 및 비오틴에 의해 인지되는 단백질 또는 아미노산 서열이다.
실시형태에서, 중합체 가닥, 부분적 이중 가닥 프로브 및/또는 리포터 프로브는 아비딘-비오틴 결합 쌍을 통해 기질에 고정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 중합체 가닥, 부분적 이중 가닥 프로브 및/또는 리포터 프로브는 비오틴 모이어티를 포함하고, 기질은 아비딘을 포함한다. TB0200(Accelr8), SAD6, SAD20, SAD100, SAD500, SAD2000(Xantec), 슈퍼아비딘(SuperAvidin)(Array-It®), 스트렙타비딘 슬라이드(카탈로그 #MPC 000, Xenopore) 및 STREPTAVIDIN슬라이드(카탈로그 #439003, Greiner Bio-one)를 포함하여, 아비딘을 포함하는 유용한 기질은 상업적으로 입수 가능하다. 그러나, 당업자에게 공지된 아비딘을 포함하는 임의의 기질이 사용될 수 있다.
기질은, 이의 형태가 친화성 모이어티를 포함하는 중합체 가닥, 부분적 이중 가닥 프로브 및/또는 리포터 프로브의 선택적 고정을 방해하지 않는 한, 임의의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 기질은 디스크, 슬라브(slab), 스트립, 비드, 서브마이크로입자, 코팅된 자기 비드, 겔 비드, 마이크로타이터 웰, 슬라이드, 막, 프릿(frit) 형태 또는 당업자에게 공지된 다른 형태를 가질 수 있다. 기질은 선택적으로, 기질에 걸친 또는 기질을 통한 액체의 흐름을 돕는 하우징, 예컨대 크로마토그래피 컬럼, 스핀 컬럼, 주사기 배럴, 파이펫, 파이펫 팁, 96웰 또는 384웰 플레이트, 마이크로채널 및 카필러리(capillary) 내에 배치된다.
본 발명은 임의의 시료, 예를 들어 생물학적 시료에 존재하는 하나 이상의 핵산을 검출하기 위한 중합체 가닥, 프로브, 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 시료는 비제한적으로, 사실상 임의의 유기체의 세포(1차 세포, 배양된 세포주, 외식편으로부터 해리된 세포), 세포 용해물 또는 추출물(비제한적으로 단백질 추출물, RNA 추출물; 정제된 mRNA를 포함함), 조직(배양된 조직 또는 외식된 조직을 포함함) 및 조직 추출물(비제한적으로 단백질 추출물, RNA 추출물; 정제된 mRNA를 포함함); 체액(비제한적으로 혈액, 소변, 혈청, 림프, 담즙, 뇌척수액, 장액, 수성 또는 유리액(vitreous humor), 초유(colostrum), 가래, 양수, 침, 항문 및 질 분비물, 땀 및 정액, 여출물(transudate), 삼출물(exudate)(예를 들어 종기 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 수득된 유체) 또는 관절(예를 들어 정상적인 관절, 또는 류마티스 관절염, 골관절염, 통풍 또는 화농성 관절염과 같은 질병에 걸린 관절)로부터 수득된 유체 등으로서, 포유류 시료가 바람직하고, 인간 시료가 특히 바람직함; 환경적 시료(비제한적으로 대기, 농업, 물 및 토양 시료를 포함함); 생물학적 무기작용제(warfare agent) 시료; 세포외 유체, 세포 배양물 유래의 세포외 상층액, 박테리아 내의 봉입체(inclusion body), 세포 구획물(cellular compartment), 세포의 주변세포질(periplasm) 및 미토콘드리아 구획을 포함하는 연구용 시료를 포함하는 임의의 수의 물질을 포함할 수 있다.
시료는 다세포 유기체를 포함하는 사실상 임의의 유기체, 예를 들어 식물계, 진균류 및 동물계로부터 수득될 수 있으며; 바람직하게는, 시료는 동물, 예를 들어 포유류로부터 수득된다. 인간 시료가 특히 바람직하다.
생물학적 시료는 생물학적 표본으로부터 간접적으로 유래될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산이 세포 전사체, 예를 들어 mRNA인 경우, 본 발명의 생물학적 시료는 mRNA의 역전사에 의해 생성되는 cDNA를 함유하는 시료일 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 생물학적 시료는 생물학적 표본을 분획화, 예를 들어 크기 분획화 또는 막 분획화시킴으로써 제조된다.
시료는 핵산 계내 혼성화 방법 또는 면역조직화학 방법에 따라 제조되고 유리 슬라이드 또는 적합한 고형 지지체 상에 고정된 (살아 있거나 고정된) 세포 또는 (살아 있거나 고정된, 예를 들어 포르말린-고정 파라핀-포매된(FFPE)) 조직 절편일 수 있다. 조직 시료는 포매되고, 연속적으로 박절된 다음, 현미경 슬라이드 상에 고정될 수 있다. 세포 또는 조직 절편의 표면으로의 접근은 보존되고, 이로써 유체 교환이 허용되며; 이러한 유체 교환은 유체 챔버 시약 교환 시스템(예를 들어 미국 오레건주 벤드 소재의 Grace™ Bio-Labs)을 사용하여 달성될 수 있다. 연속적인 조직 절편들은 서로 대략 5 ㎛ 내지 15 ㎛일 수 있다. 블라킹 단계는 중합체 가닥, 프로브 또는 조성물이 적용되기 이전 및/또는 이후에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 중합체 가닥, 프로브, 조성물, 방법 및 키트는 질환의 진단에 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환을 진단하거나 진단이라는 용어는 질환을 예측하거나 진단하며, 질환의 소인을 확인하며, 질환의 치료를 모니터링하며, 질병의 치료 반응을 진단하고, 질환, 질환 진행 및 질환의 특정 치료에 대한 반응을 예후를 예상하는 것을 포함한다. 예를 들어, 조직 시료는 시료내 질병 또는 악성 세포 유형의 마커의 존재 및/또는 양을 (질병에 걸리지 않은 상태와 비교하여) 확인함으로써 질병 또는 암을 진단하거나 단계화(staging)하기 위해, 본원에 기재된 임의의 중합체 가닥, 부분적 이중 가닥 핵산 프로브, 방법 또는 키트에 따라 검정될 수 있다. 조직 시료는 생검된 종양 또는 이의 일부, 즉 임상적으로 연관된 조직 시료일 수 있다. 예를 들어, 종양은 유방암 유래일 수 있다. 시료는 절제된 림프절일 수 있다. 조직 시료는 종양 세포(예를 들어 고형 종양 또는 액체형 종양 유래임), 종양 세포로부터 방출된 핵산, 또는 종양 세포로부터 방출된 단백질을 함유할 수 있는 액체 생검일 수 있다.
본 발명의 조성물 및 키트는 시료내 단백질 및/또는 핵산의 결합을 촉진하기 위해, 즉 혼성화 반응을 수행하기 위해, 중합체 가닥, 부분적 이중 가닥 핵산 프로브, 및 다른 시약, 예를 들어 완충제 및 당업계에 공지된 다른 시약을 포함할 수 있다.
키트는 또한 비제한적으로, 표지된 올리고뉴클레오타이드를 중합체 가닥 또는 리포터 프로브에 혼성화하며, 리포터 프로브를 중합체 가닥 또는 부분적 이중 가닥 핵산 프로브에 결합시키며, 중합체 가닥 또는 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 시료내 핵산 분자에 결합시키고, 제1 중합체 가닥과 제2 중합체 가닥을 혼성화하여 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 형성하는 데 필요한 정보를 포함하여 키트의 구성성분들의 사용 설명서를 포함할 것이다.
키트는, 이러한 키트와 함께 포함된 중합체 가닥 또는 부분적 이중 가닥 핵산 프로브 및/또는 리포터 프로브를 결합시키고 선택적으로 검출하기에 적합한 표면을 포함하는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 표면은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 결합될 수 있다.
키트는 생물학적 시료 유래의 핵산의 추출을 위한 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
키트는 혼성화 시약, 정제 시약, 고정 시약 및 이미징 시약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
표지 단량체 및/또는 리포터 프로브를 포함하는 중합체 가닥은 상업적으로 입수 가능한 카트리지, 소프트웨어, 시스템, 예를 들어 nCounter® 카트리지를 사용하는 nCounter® 시스템을 사용하여 검출 및 정량화될 수 있다.
nCounter® 분석 시스템의 베이시스(basis)는 검정되어야 하는 각각의 핵산 분자에 지정되는 독특한 코드이다(국제 특허 출원 PCT/US2008/059959 및 문헌[Geiss et al. Nature Biotechnology. 2008. 26(3): 317-325]; 이들의 내용은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 코드는, 검정되어야 하는 각각의 핵산 분자에 대한 독특한 바코드를 생성하는, 순서가 매겨진 일련의 유색 형광 스팟들로 구성된다.
일반적으로, 본원에 기재된 방법은 NanoString Technologies®의 DV2 시약을 사용할 수 있다. DV2 시약을 사용하면, 제1 중합체 가닥 및/또는 부분적 이중 가닥 프로브가 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되고, 이러한 백본은 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있고, 여기서, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식한다. 부가적으로, 포획 중합체 가닥 또는 포획 프로브가 사용되는 경우, 이는 적어도 (1) 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역 및 (2) 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역을 포함한다.
NanoString Technologies®의 DV2 시약을 사용하는 본원에 기재된 방법은 적어도 하기의 단계를 포함한다: (1) 최대 설계 신뢰성/강력성을 달성하는 설계 규칙 세트에 따라 핵산의 일부(예를 들어 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합이 위치하는 부분)를 커버하는 중합체 가닥/프로브를 설계한다; (2) DV2 시약의 모든 필요한 구성성분들을 적절한 농도에서 핵산 분자와 함께 혼합하고, 혼성화를 위해 정해진 온도(들)에서 정해진 시간(들) 동안 인큐베이션한다; 및 (3) 형광 검출 및 분석 이전에, 과량의 중합체 가닥/프로브, 포획 중합체 가닥 및/또는 리포터 프로브를 제거하기 위해 필요한 정제를 수행한다. 이들 단계는 각각 NanoString Technologies®에 의해 공개된 특허 문헌에 보다 완전히 기재되어 있으며; 예를 들어 US2014/0371088을 참조한다.
일반적으로, NanoString Technologies®의 DV2 시스템은 제조 및 사용을 위한 다중화 가능한(multiplexable) 태그-기반 리포터 시스템 및 방법과 관련이 있다. 태그-기반 나노리포터 시스템은, 검정법의 유전자-특이적 구성성분이 리포터 프로브 및 포획 시약으로부터 분리되고 저렴하고 널리 입수 가능한 DNA 올리고뉴클레오타이드에 의해 가능하기 때문에, 검정법 설계에서 경제적이고 신속한 유연성을 허용한다. 단일 세트의 리포터 프로브는, 간단히 검정법의 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드(즉, 표적 결합 영역을 포함하는 중합체 가닥) 부분을 대체함으로써 상이한 실험들에서 무한정의 다양한 유전자들에 대해 해독된 정보(readout)로서 사용될 수 있다. 비-태그-기반 리포터 시스템에서, 리포터 프로브 및 포획 시약(예를 들어 표지 부착 영역 및 결합된 표지, 및 친화성 모이어티)은 표적 결합 영역에 공유 부*공유결합 연결된다. 이들은 변형이 복잡하고 비용이 많이 든다.
US2003/0013091, US2007/0166708, US2010/0015607, US2010/0261026, US2010/0262374, US2010/0112710, US2010/0047924, US2014/0371088, US2014/0017688 및 US2011/0086774에 기재된 바와 같은 NanoString Technologies®의 nCounter® 프로브, 시스템 및 방법은 표적 단백질 및/또는 표적 핵산의 인식에 바람직한 수단이다. NanoString Technologies®의 nCounter® 프로브, 시스템 및 방법에 의해, 복수의(800개 이상의) 별개의 표적 단백질 및/또는 표적 핵산들의 동시적인 다중화된 인식이 가능하다. 각각의 상기 언급된 특허 공개문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. NanoString Technologies®의 상기 언급된 nCounter® 프로브, 시스템 및 방법은 본원에 기재된 임의의 양태 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
단일 nCounter® 카트리지(예를 들어 이의 단일 레인)는 상기 언급된 nCounter® 프로브, 시스템 및 방법과 본원에 기재된 양태 또는 실시형태의 조합으로부터 복수의 별개의 표적 단백질 및/또는 표적 핵산들의 동시적인 다중화된 인식에 사용될 수 있다.
시료내 복수의 핵산 분자들 중 각각의 핵산 분자의 상대적인 풍부도는 단일의 다중화된 혼성화 반응에서 측정될 수 있다. 시료가 복수의 중합체 가닥, 다가 중합체 가닥, 부분적 이중 가닥 핵산 프로브, 조성물 등과 조합되고, 혼성화가 발생한다. 표지 단량체는 완전히 자동화된 이미징 및 데이터 수합 장치(디지털 분석기, NanoString Technologies®)를 사용하여 검출되며, 이로써 각각의 핵산 분자의 풍부도가 정량화된다. 각각의 시료에 대해, 약 600개의 시야(FOV; fields-of-view)가 이미징되며(1376 X 1024 픽셀), 이는 대략 10 mm2의 결합 표면을 나타낸다. 전형적인 이미징 밀도는 멀티플렉싱 정도, 시료 투입량 및 전반적인 핵산 분자 풍부도에 따라 1개 시야 당 약 100개 내지 1200개의 계수된 리포터 프로브이다. 데이터는 1개 시료 당 1개 핵산 분자 당 계수의 수를 열거하는 간단한 스프레드 시트 형태의 결과물이다.
본 발명의 표지 단량체는 당업계에서 입수 가능한, 특이적인 신호를 검출할 수 있는 임의의 수단에 의해 검출될 수 있다. 표지 단량체가 형광을 내는 경우, 적절한 여기 공급원(excitation source)의 적합한 고려가 조사될 수 있다. 가능한 공급원으로는, 아크 램프, 제논 램프, 레이저, 발광 다이오드 또는 이들의 일부 조합 등이 있을 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 적절한 여기 공급원은 적절한 광학 검출 시스템, 예를 들어 인버티드 형광 현미경, 에피-형광 현미경 또는 공초점 현미경과 함께 사용된다. 바람직하게는, 중합체 가닥 또는 리포터 프로브 상의 스팟들의 서열을 확인하기에 충분한 공간 해상도로 검출을 가능하게 할 수 있는 현미경이 사용된다.
본원에 개시된 단일 뉴클레오타이드 변이(SNV) 프로브 및 방법은 5 ng의 신선한 또는 포르말린-고정 파라핀-포매된(FFPE) 게놈 DNA(gDNA)로부터 약 5%의 대립유전자 빈도를 가진 체세포 변이체의 검출을 허용한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다.
문맥으로부터 구체적으로 언급되거나 명확해지지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "또는"은 "또는" 및 "및"을 둘 다 포함하고 망라하는 것으로 이해된다.
문맥으로부터 구체적으로 언급되거나 명확해지지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 당업계에서 정상적인 관용 범위, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내에 존재하는 것으로 이해된다. 약이라는 용어는 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 내에 존재하는 것으로 이해될 수 있다. 문맥상 명확하게 다르게 언급되지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치들은 용어 "약"에 의해 변형된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 당업계의 당업자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 다른 중합체 가닥, 프로브, 조성물, 방법 및 키트가 본 발명의 실시에 사용될 수 있더라도, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원에 사용된 용어는 특정한 실시형태를 설명하려는 목적이고 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1: NanoString Technologies ® 의 기존의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용한 SNP 검출 실험
BRAF 유전자의 V600E 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP)을 검출하는 실험을 수행하였다.
도 18a는 이 실시예에서 사용된 3개의 부분적 이중 가닥 프로브들: 야생형 표적을 검출하기 위한 제1 프로브 및 이러한 표적의 2개의 돌연변이체 버전들(m1 및 m2)을 검출하기 위한 2개의 프로브를 보여준다. 이 실험에서, NanoString Technologies® DV2 시스템을 사용하였다. 이러한 프로브는 10개 뉴클레오타이드 및 8개 뉴클레오타이드 길이("10+8")의 표적 결합 영역을 포함하였으며, m1 및 m2 돌연변이체는 8개 뉴클레오타이드 표적 결합 영역에 의해 검출되었다.
3개의 프로브들에 대한 합성 표적(BRAF 엑손 15에 상응함)은 도 18b에 도시되어 있다. 이 실험에서, 제1 표적 결합 도메인의 표적 및 제2 표적 결합 도메인의 표적은 인접해 있다.
혼성화를 실온에서 수행하였다. 25개 시야(FOV)를 가진 NanoString Technologies nCounter® 디지털 분석기 상에서 이미징화하기 이전에는, 어떠한 정제 단계도 수행하지 않았다.
99%의 정확한 단일 염기 식별을 가진 우수한 결과를 10+8 프로브에서 관찰하였다. 도 18c를 참조한다.
다른 길이의 표적 결합 도메인을 가진 프로브들(즉, 11+36, 12+36, 13+36, 14+16, 14+17, 14+28, 14+30, 14+36, 15+15, 15+18, 15+22, 15+25, 15+26, 15+27, 15+28, 15+29, 16+18, 16+22, 16+23, 16+24, 16+25, 16+26, 16+27, 18+22, 18+25, 19+19, 19+20, 19+21, 20+20 및 20+21)을 시험하였다. 특히, 11개의 프로브들에서는 야생형 대립유전자 검출에 대해 99.5% 초과의 특이성이 존재하였다(도 19의 좌측 패널의 보라색 밴드 참조). 2개의 프로브들에 있어서는 돌연변이체 대립유전자 검출에 대해 99.8% 초과의 특이성이 존재하였다(도 19의 우측 패널의 보라색 밴드 참조).
부가적으로, 본 발명의 프로브는 고도로 민감하며 약 10 fM까지의 합성 핵산 내에서 야생형 표적을 검출할 수 있고(도 20 참조), 약 75 ng의 게놈 DNA 시료 내에서 야생형 표적을 검출할 수 있는 것으로 나타났다(도 21 참조).
본 발명의 프로브는 야생형 게놈 DNA와 혼합된 합성 돌연변이체 표적 핵산을 검출할 수 있는 것으로 나타났다. 이때, 프로브는 총 300 ng의 게놈 DNA 시료 내에서, 약 5%의 합성 돌연변이체 표적 핵산을 포함하는 용액을 검출할 수 있었다(백그라운드 수준은 음성 대조군 측정을 통해 확인되었음)(도 22 참조).
이들 데이터(특히 도 19에 나타나 있음)는, 표적 결합 영역의 길이가 특이성을 개선하도록 조정될 수 있음을 가리킨다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 제1 표적 결합 영역과 제2 표적 결합 영역 사이의 용융 온도의 차이, 및 제1 표적 결합 영역에 대한 용융 온도와 제2 표적 결합 영역에 대한 용융 온도의 합계를 포함한 연관성을 기반으로 "양호하게 거동하는(well-performing)" 프로브를 예측할 수 있다. 이 실시예의 선별된 데이터에 대해, 도 23은, Tm이 15 mM Na+ 및 100 pM 프로브 농도 조건 하에 계산된 경우, 양호하게 거동하는 프로브가 20℃ 미만(예를 들어 약 0℃ 내지 약 10℃)의 Tm 차이를 가지며, 약 40℃ 내지 약 60℃(예를 들어 약 47℃ 내지 약 52℃)의 Tm 합계를 가짐을 보여준다. "SNR"은 신호 대 노이즈 비율(Signal to Noise Ratio)을 의미한다.
EGFR 유전자의 T790M SNP를 검출하는 실험을 또한 수행하였다.
상이한 길이의 표적 결합 도메인을 갖는 다양한 프로브들(즉, 8+23, 8+25, 9+23, 9+25, 10+22, 11+14, 11+17, 11+19, 12+14, 12+15, 13+14, 14+14, 14+15, 15+13 및 15+14)을 시험하였다. 하나의 프로브에서는 야생형 대립유전자 검출에 대해 우수한 결과(99.8% 초과의 특이성)가 나타났으며, 또 다른 프로브에서는 돌연변이체 대립유전자 검출에 대해 99.8% 초과의 특이성이 나타났다(도 24의 보라색 밴드 참조).
양호하게 거동하는 2-암 프로브에 대한 프로브 설계 경향을 4개의 실험으로부터 수득된 결과를 기반으로 확인하였다. 도 25는 RAF V600E SNP 실험, EGFR T790M SNP 실험, 및 KRAS G12 및 EGFR L858에 대한 2개의 다른 SNP 검출 실험들을 기반으로 한 프로브 설계에 대한 신생 규칙을 예시하고 있다(데이터는 나타나 있지 않음).
도 25에 도시된 바와 같이, 양호하게 거동하는 프로브는 20℃ 미만의 Tm 차이, 및 약 47℃ 내지 약 52℃의 Tm 합계를 가진다.
선행 실시예는 당업자에게 본 발명의 실시 방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 주어져 있으며, 본 발명자들이 무엇을 본 발명으로서 간주하는지의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 사용된 수(예를 들어 양 및 농도)에 대해 정확성을 보장하려고 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차는 설명되어야 한다. 다르게 지시되지 않는 한, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실시예 2: NanoString Technologies ® 의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용한, 핫스팟 영역 내에서의 SNV 검출 실험
KRAS 엑손 2 핫스팟 내에서 단일 뉴클레오타이드 변이체(SNV)를 검출하는 실험을 수행하였다.
도 26은 이 실시예에서 사용된 것과 유사한 부분적 이중 가닥 프로브의 밑그림이다. 이 실험에서, NanoString Technologies® DV2 시스템을 사용하였다. 이 실시예 또는 본원에 개시된 임의의 실시예에서 도 26에 도시된 프로브는 도 1 내지 도 15에 도시된 임의의 프로브, 프로브 쌍 또는 조성물로 대체될 수 있다. 도 26에서, 표적 서열(회색) 상의 단일 뉴클레오타이드는 기존의 NanoString 리포터 올리고(녹색)와 함께 "프로브 A"(청색)로 지칭되는 2-암 어댑터(adapter) 프로브를 사용하여 검출될 수 있다. 어댑터 프로브는 스템(stem) 서열을 통해 함께 혼성화된 2개의 올리고들로 구성된다. 이들 실험에서, 2개 올리고들은 모두 표적 서열 상의 인접한 영역에 혼성화한다. 부가적으로, 프로브 스템과 각각의 올리고의 혼성화 영역들 사이에 PEG 링커가 존재할 수 있다. 여기서, 단일 뉴클레오타이드 미스매치가 프로브 혼성화를 방해할 것이기 때문에, 단일 뉴클레오타이드 특이성은 2-암 프로브에 의해 달성되었다. 표적 서열은, 어댑터 "프로브 B"(적색) 및 포획 프로브(오렌지색)를 포함하는 기존의 NanoString 기술에 의해 표면에 포획되었다.
도 27에 도시된 참조 서열 및 SNV 유전자좌에 특이적인 프로브들(몇몇 공지된 단일 뉴클레오타이드 변이체들을 함유하는 코돈 12 및 코돈 13을 포함하는 엑손 2)을 시험하였다. 각각의 프로브는 13개 내지 24개 뉴클레오타이드 길이의 2개의 표적 결합 영역들을 포함하였으며, 2개의 영역들 중 더 짧은 영역에 SNV 돌연변이가 존재하였다. 각각의 프로브의 서열 및 위치는 도 28a 내지 도 28d에 나타나 있다(도 28a는 전체 서열을 도시하고 있으며, 도 28b 내지 도 28d는 각각 도 28a의 서열의 1/3을 도시하고 있음). 종합하여, 프로브 풀(pool)은 KRAS 엑손 2에 특이적인 11개의 프로브, 및 KRAS 엑손 2에 비특이적인 23개의 프로브(백그라운드 프로브)를 함유하였다.
합성 표적을 사용하여, 프로브 풀의 각각의 프로브의 특이성을 시험하였다. 프로브 풀을 참조 서열 및 10개의 SNV 돌연변이체들을 포함하는 11개의 KRAS 표적 변이체들 각각에 대해 개별적으로 시험하였다. 백그라운드 표적을 각각의 반응에 포함시켰다.
혼성화 반응을 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였으며, NanoString Technologies® nCounter® 분석 시스템을 사용하여 분석하였다. 혼성화 반응은 25 pM의 NanoString DV2 리포터, 100 pM의 각각의 프로브 B, 20 pM의 각각의 프로브 A, 50 ng의 연어 정자 DNA 및 3.6 x 106개의 합성 표적 복사체를 5x SSPE 염 내에 포함하였다. 반응물을 65℃에서 적어도 16시간 동안 혼성화시킨 다음, NanoString Technologi® nCounter® 분석 시스템으로 옮겼다.
프로브 풀 내의 각각의 프로브에 대한 디지털 계수는, 각각의 SNV 유전자좌에 대한 프로브의 특이성이 96% 초과인 것으로 보여주었다. 특이성은 모든 KRAS 표적들에 대한 계수와 비교하여, 프로브의 의도된 표적에 대한 주어진 프로브의 계수의 퍼센트에 의해 결정되었다. 도 29를 참조한다.
이들 실험을, 표준 티민(T) 염기를 함유하는 주형, 뿐만 아니라 각각의 티민 뉴클레오타이드가 우라실(U)로 치환된 주형에서도 수행하였다. 2개의 주형 변이체들 모두는 동일한 결과를 나타내었다.
실시예 3: NanoString Technologies ® 의 기존의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용한 결실 검출 실험
EGFR 엑손 19에서의 결실을 검출하는 실험을 수행하였다.
이 실험에서, NanoString Technologies® DV2 시스템을 도 26에 도시된 2-암 프로브 구조물과 함께 사용하였다. 이 실시예 또는 본원에 개시된 임의의 실시예에서 도 26에 도시된 프로브는 도 1 내지 도 15에 도시된 임의의 프로브, 프로브 쌍 또는 조성물로 대체될 수 있음을 주지한다. 도 30에 도시된 참조 서열 및 결실을 함유하는 3개의 표적들에 특이적인 프로브들을 시험하였다. 각각의 프로브는 18개 내지 21개 뉴클레오타이드 길이의 2개의 표적 결합 영역들을 포함하였다. 각각의 프로브의 서열 및 위치는 도 31a 내지 도 31d에 나타나 있다(도 31a는 전체 서열을 도시하고 있으며, 도 31b 내지 도 31d는 각각 도 31a의 서열의 1/3을 도시하고 있음). 종합하여, 프로브 풀은 EGFR 엑손 19에 특이적인 4개의 프로브, 및 EGFR 엑손 19에 비특이적인 11개의 프로브(백그라운드 프로브)를 함유하였다.
합성 표적을 사용하여, 프로브 풀의 각각의 프로브의 특이성을 시험하였다. 프로브 풀을 참조 서열 및 3개의 결실 돌연변이체 서열들을 포함하는 4개의 EGFR 표적 변이체들 각각에 대해 개별적으로 시험하였다. 백그라운드 표적을 각각의 반응에 포함시켰다.
혼성화 반응을 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였으며, NanoString Technologies® nCounter® 분석 시스템을 사용하여 분석하였다. 혼성화 반응은 25 pM의 NanoString DV2 리포터, 100 pM의 각각의 프로브 B, 20 pM의 각각의 프로브 A, 50 ng의 연어 정자 DNA 및 3.6 x 106개의 합성 표적 복사체를 5x SSPE 염 내에 포함하였다. 반응물을 65℃에서 적어도 16시간 동안 혼성화시킨 다음, NanoString Technologi® nCounter® 분석 시스템으로 옮겼다.
프로브 풀 내의 각각의 프로브에 대한 디지털 계수는, 각각의 SNV 유전자좌에 대한 프로브의 특이성이 96% 초과인 것으로 보여주었다. 특이성은 모든 EGFR 표적들에 대한 계수와 비교하여, 프로브의 의도된 표적에 대한 주어진 프로브의 계수의 퍼센트에 의해 결정되었다. 도 32를 참조한다.
실시예 4: NanoString Technologies ® 의 기존의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용한 멀티플렉스 SNV 검출 실험
단일 반응에서 다수의 SNV 돌연변이들을 검출하는 실험을 수행하였다.
이 실험에서, NanoString Technologies® DV2 시스템을 도 26에 도시된 2-암 프로브 구조물과 함께 사용하였다. 이 실시예 또는 본원에 개시된 임의의 실시예에서 도 26에 도시된 프로브는 도 1 내지 도 15에 도시된 임의의 프로브, 프로브 쌍 또는 조성물로 대체될 수 있음을 주지한다. 7개의 상이한 유전자좌에서 참조 서열 및 SNV 서열에 특이적인 프로브들을 시험하였다. 각각의 프로브는 18개 내지 21개 뉴클레오타이드 길이의 2개의 표적 결합 영역들을 포함하였다. 각각의 프로브의 서열 및 위치는 도 33a 내지 도 33d에 나타나 있다(도 33a는 전체 서열을 도시하고 있으며, 도 33b 내지 도 33d는 각각 도 33a의 서열의 1/3을 도시하고 있음). 종합하여, 프로브 풀은 14개의 2-암 프로브들, 및 내인성 대조군으로서 작용한 RNAseP에 대한 1개의 단일-암 프로브를 함유하였다.
Qiagen®의 DNeasy 혈액 & 조직 키트를 사용하여 3개의 세포주들로부터 DNA를 추출하였다. 20 ng의 DNA를 20 ㎕ PCR 반응에서, TaqMan™ Hotstart 2x 마스터믹스를 200 nM 포워드 및 리버스 프라이머 올리고들과 함께 하기 서모사이클러(thermocycler) 프로그램을 사용하여 증폭시켰다: (1) 95℃에서 30초, (2) 95℃에서 15초, 56℃에서 30초, (4) 68℃에서 30초, (5) 단계 (2) 내지 단계 (4)를 18 사이클 동안 반복함, 및 (6) 68℃에서 300초. 사용 이전에, 증폭된 DNA를 95℃까지 10분 동안 가열한 다음 얼음 상에서 급속 냉각시킴으로써 변성시켰다.
프로브 풀을 3개의 세포주 각각으로부터 증폭된 DNA에 대해 개별적으로 시험하여, 7개의 관심 유전자좌들 각각의 유전자형을 확인하였다.
혼성화 반응을 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였다. 혼성화 반응은 25 pM의 NanoString DV2 리포터, 100 pM의 각각의 프로브 B, 20 pM의 각각의 프로브 A 및 5 ㎕의 증폭된 DNA를 5x SSPE 염 내에 포함하였다. 반응물을 65℃에서 적어도 16시간 동안 혼성화시킨 다음, nCounter® 분석 시스템으로 옮겼다.
이들 실험에서, 본원에 기재된 혼성화 반응을, Protein Plus와 함께 NanoString Technologies nCounter PanCancer 프로파일 유전자 발현 패널을 함유하는 개별 혼성화 반응과 조합하였다. 조합된 혼성화 반응을 NanoString Technologies® nCounter® 분석 시스템 상에서 진행시켰다.
참조(야생형, WT) 및 SNV(돌연변이체, Mut) 프로브에 대한 디지털 계수를 비교하고, 각각의 유전자좌에서의 유전자형을, 어떤 프로브가 백그라운드를 능가하는 신호를 보여주는가에 의해 결정하였다. 도 34를 참조한다.
이러한 SNV 검정법을 사용하여 각각의 세포주 및 각각의 유전자좌에 대해 결정된 유전자형은 TaqMan™ 유전자형 검정법을 포함하는 다른 방법 및 공개된 데이터에 의해 결정된 유전자형과 매칭되었다. 도 35를 참조한다.
실시예 5: 3D 생물학: 동일한 장비 상에서 DNA SNV, RNA 유전자 발현 및 단백질 프로파일의 동시 검출
본원에 기재된 SNV 검출 검정법을 다른 NanoString Technologies® 검정법과 조합하는 실험을 수행하였다.
3개의 세포주들 각각으로부터 유래된 세포들을 DNA, RNA 및 단백질 시료 제조용으로 나누었다. 초기 가공 후, RNA와 단백질을 단일 혼성화 반응으로 조합하였다. DNA를 개별 반응에서 혼성화시켰다.
DNA 혼성화 반응: Qiagen®의 DNeasy 혈액 & 조직 키트를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 실시예 3에 기재된 바와 같이 증폭시키거나, Covaris 장비를 사용하여 300 bp 분절로 절단하였다. 사용 이전에, DNA를 95℃까지 10분 동안 가열한 다음 얼음 상에서 급속 냉각시킴으로써 변성시켰다. NanoStrinTechnologies® DV2 시스템을 도 26에 도시된 2-암 프로브 구조물과 함께 사용하였다. 이 실시예 또는 본원에 개시된 임의의 실시예에서 도 26에 도시된 프로브는 도 1 내지 도 15에 도시된 임의의 프로브, 프로브 쌍 또는 조성물로 대체될 수 있음을 주지한다. 관심 SNV의 유전자형을, 실시예 3에 기재된 바와 같이 야생형 및 돌연변이체 서열에 특이적인 프로브를 사용하여 결정하였다. 혼성화 반응을 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였다. 혼성화 반응은 25 pM의 NanoString DV2 리포터, 100 pM의 각각의 프로브 B, 20 pM의 각각의 프로브 A 및 5 ㎕의 증폭된 DNA(또는 500 ng의 비증폭된 Covaris Sheared DNA)를 5x SSPE 염 내에 포함하였다. 반응물을 65℃에서 적어도 16시간 동안 혼성화시켰다.
RNA: 단백질 혼성화 반응: 동일한 혼성화에서 RNA와 단백질을 조합하기 위한 프로토콜은 기존의 NanoString Technologies 제품들에 대한 프로토콜에 나타나 있다. RNA를 Qiagen®의 RNeasy 키트를 사용하여 추출하거나, 용해된 세포로부터 직접 취하였다. 단백질 가공을 위해, 세포 용해물을 NanoString Technologies 단백질 검정법에서와 같이, 용해 완충제(2% SDS, 100 mM Tris pH 6.8, 50 mM DTT)를 이용하여 제조하고, 단백질 결합 플레이트에 첨가한 다음, 관심 단백질에 특이적인 DNA 태깅(tagged) 항체와 함께 인큐베이션하였다. 비결합된 항체를 세척해낸 후, 잔여 항체를 RLT 완충제에 현탁시켰다. 이 RLT 완충제를 표준 NanoString Technologies® nCounter® 혼성화 반응에서 단백질 표적에서 사용하였다. 혼성화 반응을, RNA 표적 및 단백질 표적 둘 다에 특이적인 nCounter 리포터를 포함하는 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였다. 반응을 65℃에서 적어도 16시간 동안 혼성화시켰다.
DNA 혼성화 반응 및 RNA:단백질 혼성화 반응을 조합한 직후, 이들 반응을 NanoString Technologies® nCounter® 분석 시스템 상에서 진행시켰다.
DNA SNV 프로브에 대한 디지털 계수를 RNA 유전자 발현 프로브 및 단백질 프로브에 대한 계수와 동시에 측정하였다.
이 기술을 사용하여, 다차원 정보를 동일한 시료로부터 동시에 확인할 수 있다. 도 36을 참조한다. 단백질 검출에 유용한 예시적인 프로브 및 사용 방법은 도 37 내지 도 39에 도시되어 있다.
실시예 6: NanoString Technologies ® 의 기존의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용한, 핫스팟 영역 내에서의 SNV 검출 실험
KRAS 엑손 2 핫스팟 내에서 단일 뉴클레오타이드 변이체(SNV)를 검출하는 실험을 수행하였다.
도 26은 이 실시예에서 사용된 것과 유사한 부분적 이중 가닥 프로브의 밑그림이다. 이 실험에서, NanoString Technologies® DV2 시스템을 사용하였다. 이 실시예 또는 본원에 개시된 임의의 실시예에서 도 26에 도시된 프로브는 도 1 내지 도 15에 도시된 임의의 프로브, 프로브 쌍 또는 조성물로 대체될 수 있다. 참조 서열 및 SNV 변이체 서열에 특이적인 프로브를 시험하엿다. 각각의 프로브는 13개 내지 23 뉴클레오타이드 길이의 2개의 표적 결합 영역들을 포함하였다. KRAS 엑손 2 유전자좌에 대해, 하나의 참조 프로브 및 12개의 상이한 변이체 영역들에 특이적인 12개의 프로브들을 함유하는 프로브 풀을 사용하여, 해당 영역을 검정하였다. 이들 프로브를, 게놈의 다른 영역들에 특이적인 64개의 다른 참조 프로브들 및 136개의 다른 변이체 프로브들을 포함하는 프로브 풀에 사용하였다.
데옥시티민 대신에 데옥시우라실(U)을 함유하는 합성 표적을 사용하여, 프로브 풀의 각각의 프로브의 특이성을 시험하였다. dU-함유 주형은 SNV 검정법의 증폭 단계에서 생성되는 PCR 생성물을 모방하였다. 프로브 풀을 개별 반응 웰에서, 12개의 KRAS 표적 변이체 각각의 3.6 x 106개 복사체 및 참조 서열의 72 x 106개 복사체에 대해 시험하였다. 이는 다수의 참조 서열의 맥락에서 약 5%의 민감도에 해당하였다. 대부분의 반응물에는 하나의 변이체 주형이 존재하였으나, 참조 시료를 시뮬레이션하기 위해 하나의 반응물에는 변이체 주형이 존재하지 않았다. 하나의 반응물에는 2개의 변이체 주형이 존재하였다.
혼성화 반응을 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였다. 혼성화 반응은 25 pM의 NanoString Technologie® DV2 리포터, 100 pM의 각각의 프로브 T, 20 pM의 각각의 149개 변이체 SNV 프로브S, 100 pM의 각각의 64개의 참조 프로브S 및 5 ㎕의 증폭된 DNA를 5x SSPE 염 내에 포함하였다. 부가적으로, 200 pM의 프로브 M(감쇠기 올리고(Attenuator Oligo))을 사용하여, 과도한 참조 신호를 약화시키고, 각각의 SNV 검정법에서 5%의 민감도를 보장하였다. 감쇠기 올리고는 DV2 리포트 태그에 역상보적인(reverse complement) 표준 35량체 올리고이었으며; 이들 감쇠기 올리고는 프로브S 혼성화 부위를 차단하였다. 반응물을 65℃에서 16시간 동안 혼성화시킨 다음, nCounter® 분석 시스템으로 옮겼다.
EGFR 엑손 19 프로브 그룹 내의 각각의 프로브에 대한 디지털 계수는 각각의 반응에서 일관된 참조 신호를 보여주었으며, 변이체 프로브 유래의 제2 계수는 반응 내 정확한 변이체 주형에 특이적이었다. 총 계수의 분포를, 주어진 프로브의 의도된 표적에 대한 해당 프로브의 특이성의 추정값으로서 계산하였다. 도 40을 참조한다.
실시예 7: NanoString Technologies ® 의 기존의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용한 결실 검출 실험
EGFR 엑손 19에서의 삽입-결실을 검출하는 실험을 수행하였다.
이 실험에서, NanoString Technologies® DV2 시스템을 도 26에 도시된 2-암 프로브 구조물과 함께 사용하였다. 이 실시예 또는 본원에 개시된 임의의 실시예에서 도 26에 도시된 프로브는 도 1 내지 도 15에 도시된 임의의 프로브, 프로브 쌍 또는 조성물로 대체될 수 있음을 주지한다. 각각의 프로브는 17개 내지 24개 뉴클레오타이드 길이의 2개의 표적 결합 영역들을 포함하였다. 종합하여, EGFR 엑손 19 유전자좌에 대해, 하나의 참조 프로브 및 9개의 변이체 서열들에 특이적인 9개의 변이체 프로브들을 함유하는 프로브 풀을 사용하여, 해당 영역을 검정하였다. 이들 프로브를 게놈의 다른 영역에 특이적인 64개의 다른 참조 프로브들 및 139개의 다른 변이체 프로브들과 함께 사용하였다.
데옥시티민 대신에 데옥시우라실을 함유하는 합성 표적을 사용하여, 프로브 풀의 각각의 프로브의 특이성을 시험하였다. 이는 SNV 검정법의 증폭 단계에서 생성되는 PCR 생성물을 모방하였다. 프로브 풀을 개별 반응 웰에서, 9개의 EGFR 엑손 19 표적 변이체 각각의 3.6 x 106개 복사체 및 참조 서열의 72 x 106개 복사체에 대해 시험하였다. 이는 다수의 참조 서열의 맥락에서 약 5%의 민감도에 해당하였다. 대부분의 반응물에는 하나의 변이체 주형이 존재하였으나, 참조 시료를 시뮬레이션하기 위해 하나의 반응물에는 변이체 주형이 존재하지 않았다.
혼성화 반응을 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였다. 혼성화 반응은 20 pM의 NanoString DV2 리포터, 100 pM의 각각의 프로브 T, 20 pM의 각각의 149개 변이체 SNV 프로브S, 100 pM의 각각의 64개의 참조 프로브S 및 5 ㎕의 증폭된 DNA를 5x SSPE 염 내에 포함하였다. 부가적으로, 200 pM의 프로브 M(감쇠기 올리고)을 사용하여, 과도한 참조 신호를 약화시키고, 각각의 SNV 검정법에서 5%의 민감도를 보장하였다. 감쇠기 올리고는 DV2 리포트 태그에 역상보적인 표준 35량체 올리고이었으며, 이들 감쇠기 올리고는 프로브S 혼성화 부위를 차단하였다. 반응물을 65℃에서 16시간 동안 혼성화시킨 다음, nCounter® 분석 시스템으로 옮겼다.
EGFR 엑손 19 프로브 그룹 내의 각각의 프로브에 대한 디지털 계수는 각각의 반응에서 일관된 참조 신호를 보여주었으며, 변이체 프로브 유래의 제2 계수는 반응 내 정확한 변이체 주형에 특이적이었다. 총 계수의 분포를, 주어진 프로브의 의도된 표적에 대한 해당 프로브의 특이성의 추정값으로서 계산하였다. 도 41을 참조한다.
실시예 8: NanoString Technologies ® 의 기존의 DV2 리포터 프로브와 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용한, 핫스팟 내에서의 멀티플렉스 SNV 검출 실험
단일 반응에서 다수의 SNV 돌연변이들을 검출하는 실험을 수행하였다.
이 실험에서, NanoString Technologies® DV2 시스템을 도 26에 도시된 2-암 프로브 구조물과 함께 사용하였다. 이 실시예 또는 본원에 개시된 임의의 실시예에서 도 26에 도시된 프로브는 도 1 내지 도 15에 도시된 임의의 프로브, 프로브 쌍 또는 조성물로 대체될 수 있음을 주지한다. 43개의 상이한 유전자좌에서 참조 서열 및 SNV 서열에 특이적인 프로브들을 시험하였다. 각각의 프로브는 13개 내지 27개 뉴클레오타이드 길이의 2개의 표적 결합 영역들을 포함하였다. 종합하여, 프로브 풀은 178개의 상이한 2-암 프로브들, 및 대조군으로서 작용하는 다양한 내인성 및 외인성 표준 프로브들을 함유하였다.
정제된 게놈 DNA(gDNA) 시료를 Horizon Discovery로부터 구매한 포르말린-고정 파라핀-포매된(FFPE) 절편으로부터 추출하였으며, 각각의 절편은 4개 또는 9개의 SNV들을 2% 내지 17.5%의 빈도로 함유하도록 조작되었다. 2개의 제품들을 함께 풀링함으로써(HD200 + HD 301), 패널에서 43개의 표적들에 걸쳐 검정된 114개의 SNV 중 10개의 SNV를 함유하는 시료를 제작하였다. 각각의 돌연변이체는 도 42에 도시된 바와 같이 1% 내지 10%의 비율로 존재할 것이다.
참조 시료로서, Coriell 시료 NA12878을 사용하였다. 이 시료는 검정된 모든 유전자좌들에서 참조 신호만 나타내는 것으로 확인되었다.
5 ng의 각각의 DNA를 43개의 커스텀(custom) 프라이머 쌍들을 사용하여 증폭시켜, 하기 서모사이클러 프로그램을 사용하여 관심 SNV 유전자좌를 증폭시켰다: (1) 37℃에서 30분, (2) 50℃에서 600초, (3) 95℃에서 180초, (4) 95℃에서 30초, (5) 56℃에서 120초, (7) 68℃에서 30초, (8) 단계 (4) 내지 단계 (7)을 21 사이클 동안 반복함, 및 (9) 68℃에서 300초. 사용 이전에, 증폭된 DNA를 95℃까지 10분 동안 가열한 다음 얼음 상에서 급속 냉각시킴으로써 변성시켰다.
혼성화 반응을 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였다. 혼성화 반응은 25 pM의 NanoString Technologies® DV2 리포터, 100 pM의 각각의 프로브 T, 20 pM의 각각의 114개의 변이체 SNV 프로브S, 100 pM의 각각의 43개의 참조 프로브S 및 5 ㎕의 증폭된 DNA를 5x SSPE 염 내에 포함하였다. 부가적으로, 200 pM의 프로브 M(감쇠기 올리고)을 사용하여, 과도한 참조 신호를 약화시키고, 각각의 SNV 검정법에서 5%의 민감도를 보장하였다. 감쇠기 올리고는 DV2 리포트 태그에 역상보적인 표준 35량체 올리고이었으며, 이들 감쇠기 올리고는 프로브S 혼성화 부위를 차단하였다. 반응물을 65℃에서 16시간 동안 혼성화시킨 다음, nCounter® 분석 시스템으로 옮겼다.
검출 가능한 수준으로 존재할 것으로 예상된 참조 프로브 및 변이체 프로브(변이체, 돌연변이체)에 대한 디지털 계수를 3회 중복하여 비교하였다. 변이체 시료내 10개의 변이체 프로브는 참조 시료 내의 동일한 프로브의 계수보다 상당히 상승된 것으로 나타났다. 도 43을 참조한다. Log2 변이체-대-참조 비율을 표로 만들고 t-점수를 계산함으로써 p-값을 생성하였다. 모든 예상된 변이체 프로브들은 p-값을 0.05 유의성 미만으로 제공하였다. 모든 참조 프로브들은 p-값을 0.05 유의성 수준을 초과하여 제공하였다. 도 44를 참조한다.
실시예 9: NanoString Technologies ® 의 기존의 DV2 리포터 프로브 및 NanoString Technologies ® nCounter ® 폐 유전자 융합 패널과 함께 중합체 가닥 쌍/부분적 이중 가닥 프로브를 사용한, nCounter® 시스템 상에서의 동시적인 SNV 검출 및 RNA 융합 전사체 검출
폐암과 연관된 SNV 돌연변이 및 RNA 유전자 융합 전사체의 존재를 동시에 검출하기 위한 실험을, 포르말린-고정 파라핀-포매된(FFPE) 조직 시료로부터 추출된 환자-유래의 게놈 DNA 및 동일한 조직 시료로부터 추출된 RNA 또는 포르말린-고정 파라핀-포매된(FFPE) 배양된 세포로 구성된 상업적인 대조군 시료로부터 추출된 RNA 상에서 수행하였다.
DNA 및 RNA를, Qiagen®(독일 소재)의 AllPrep® DNA/RNA FFPE 키트(카탈로그 번호 ID: 80234)를 판매회사의 권고된 프로토콜에 따라 사용하여 단일 FFPE 절편으로부터 추출하였다.
FFPE 배양된 세포는 Horizon Discovery Group PLC(영국 캠브리지 소재)로부터 상업적으로 입수되었으며, ALK-RET-ROS1 융합 RNA 참조 표준(카탈로그 ID: HD784)인 것으로 기재된다. 이러한 상업적인 시료를 단일 10 ㎛ 두께의 FFPE 절편 또는 "컬(curl)"로서 제공하였다. 판매회사는 이러한 상업적인 시료를, 융합 백그라운드로부터 조작되었거나 클론적으로 유래된 세포주로 구성된 고도로 특징화된 생물학적-관련 참조 물질로서 추가로 기재하고 있다. 이러한 상업적인 시료는 부가적으로, EML4-ALK 융합(변이체 1; COSMIC ID: COSF463), CCDC6-RET 융합(COSMIC ID: COSF1272) 및 SLC34A2-ROS1 융합(COSMIC ID: COSF1197)에 대해 양성인 것으로 기재되어 있다.
환자 유래의 FFPE 시료(케이스 ID: 82430 유래의 표본 ID: 1194863B)를 Asterand Bioscience(미국 미시간주 디트로이트 소재)로부터 입수하였다. 판매회사는 유전자형-특이적 PCR을 사용하여 시료를 예비스크리닝하였으며, KRAS p.G13D SNV(c.38G>A; COSMIC ID: COSM532)에 대해 양성임을 확인하였고, 그런 다음 이 실시예에 사용하였다. 표본을 57세의 비히스패닉계 백인 남성에서 수행된 폐 종양 폐엽절제술로부터 입수하였다. 종양은 UICC 기(Stage): T1bN0M0이고 중등도로 분화된 점액성 유형의 폐 선암종(비소세포폐암종(NSCLC) 형태)으로서 기재되었다. 표본을 FFPE 블락(block)으로서 구매하였으며, 하나 이상의 절편으로부터 DNA 및 RNA를 추출하기 위해 개개의 약 10　㎛ 절편을 블락으로부터 절단하였다.
전반적인 실험 작업흐름도는 도 45에 도시되어 있다. 실험에서, 추출된 게놈 DNA(gDNA)를 SNV 검정법 작업흐름도를 통해, 추출로부터 예비증폭 및 SNV-특이적 프로브 풀과의 16시간의 혼성화를 통해 처리하였다. 이와 병행하여, 추출된 총 RNA를 nCounter® Vantage™ 폐 융합 패널 프로브(NanoString Technologies®, 미국 워싱턴주 시애틀 소재; 카탈로그 번호 XT-CSO-LKFU1-12)를 이용하여, 공개된 사용자 프로토콜 1개 당 16시간의 혼성화를 통해 처리하였다. 병행한 16시간의 혼성화 후, 2개의 혼성화 반응물들을 풀링하고, 혼합한 다음, 자동화된 정제, 고정 및 이미징을 위해 단일 nCounter® 카트리지 레인 내로 로딩하였다. 각각의 단일 레인 내의 양성 프로브 계수를 nCounter® 시스템 상에서의 자동화된 현미경 이미징에 의해 나열하였다. SNV 및 융합 전사체의 검출은 나열 데이터를 기반으로 하였으며, 계수가 백그라운드 계수 수준을 유의하게 초과하는 경우 양성이었다.
구체적으로는 구현된 실험에서, 10 ㎕ 반응물 중 5 ng의 FFPE-추출된 DNA를 도 46에 열거된 11개의 프라이머 쌍들을 사용하여 증폭시켜, 관심 SNV 유전자좌를 하기 서모사이클러 프로그램을 사용하여 증폭시켰다: 37℃에서 30분, (2) 50℃에서 600초, (3) 95℃에서 180초, (4) 95℃에서 30초, (5) 56℃에서 120초, (7) 68℃에서 30초, (8) 단계 (4) 내지 단계 (7)을 20 사이클 동안 반복함, 및 (9) 68℃에서 300초. 사용 이전에, 증폭된 DNA를 95℃까지 10분 동안 가열한 다음 얼음 상에서 급속 냉각시킴으로써 변성시켰다.
혼성화 반응을 기존의 NanoString Technologies® 프로토콜 및 시약을 사용하여 수행하였다. 15　㎕ SNV-검출 혼성화 반응은 25 pM의 NanoString Technologies® DV2 리포터, 100 pM의 각각의 프로브 B(즉, SNV 프로브 T 풀), 20 pM의 각각의 26개의 변이체 SNV 2-암 프로브(도 3h 참조), 100 pM의 각각의 11개의 참조 2-암 프로브(2-암 프로브의 풀을 본원에서는 프로브S 풀로도 지칭함) 및 5 ㎕의 증폭된 DNA를 5x SSPE 완충제 내에 포함하였다. 부가적으로, 200 pM의 프로브 M(감쇠기 올리고 풀)을 사용하여, 과도한 참조 신호를 약화시키고, 각각의 SNV 돌연변이체 대립유전자에 대해 5%의 민감도를 보장하는 수의 PCR 사이클이 사용될 수 있게 하였다. 감쇠기 올리고는 DV2 리포트 태그에 역상보적인 표준 35량체 올리고이었으며, 이들 감쇠기 올리고는 DV2 리포터 혼성화 서열로부터 2-암 프로브를 경쟁적으로 차단한다. 각각의 2-암 프로브는 12개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 2개의 표적 결합 영역을 포함하였다. 부가적인 대조군 프로브를 또한, 혼성화 반응에 포함시켰다. SNV 검출 반응물을 65℃에서 16시간 동안 혼성화시킨 후, 풀링하고, 마찬가지로 65℃에서 16시간 동안 (120 ng의 RNA 투입물을 사용하여) 혼성화된 표준 15　㎕ RNA/융합-프로브 혼성화 반응물과 혼합하였다. 풀링 및 혼합 후, 조합된 혼성화 반응물을 자동화된 가공 및 나열을 위해 nCounter® 분석 시스템으로 옮겼다. 시료와 검정법 패널의 하기 조합을 동일한 nCounter® 카트리지 상에서 평가하였다: A) 참조 NA12878 게놈 DNA(gDNA) 단독 상에서의 SNV 검정법, B) 동일한 환자 유래의 FFPE 시료로부터 추출된 RNA 상에서의 nCounter® Vantage™ Lung 융합 패널 검정법과 조합된, FFPE로부터 추출된 환자 유래의 gDNA 상에서의 동시적인 SNV 검정법, 및 C) Horizon Discovery ALK-RET-ROS1 융합 RNA 참조 표준 FFPE 시료로부터 추출된 RNA와 조합된, FFPE로부터 추출된 환자 유래의 gDNA 상에서의 동시적인 SNV 검정법.
인간 게놈 DNA 참조 시료로서, 시료 NA12878(Coriell Institute, 미국 뉴저지주 캠던 소재)을 사용하였다. 이 시료는 검정된 모든 유전자좌들에서 참조 신호만 나타내는 것으로 확인되었다. 5 ng의 이러한 비-FFPE gDNA를 오로지 SNV 프로브 패널만 이용하여(17 사이클의 예비증폭 PCR을 이용하여) 상기와 같이 가공하였다. 65℃에서 16시간 동안 혼성화한 후, 이 대조군에 대한 혼성화 반응물을 동일한 nCounter® 카트리지의 레인 1 내로 로딩하고, 여기서 모든 다른 측정을 수행하였다.
내부 대조군을 기반으로 한 SNV 프로브 계수의 정상화 후, 실험 시료 B 및 C(상기 2개의 단락들에 기재되어 있음) 유래의 참조 대립유전자 프로브 및 변이체 대립유전자 프로브에 대한 디지털 계수를 NA12878 참조 시료로부터 수득된 매칭된 프로브 계수와 비교하였다. 2개 데이터 세트(이 실시예에서 시료 A 대 시료 C)의 히스토그램은, 도 47에 도시된 바와 같이, 오로지 유의하게 상이한 프로브-계수는 FFPE 시료내 KRAS COSM532 돌연변이에 대한 SNV 프로브에 상응하였음을 보여주었다. 이와는 대조적으로, 도 48에 도시된 바와 같이, 2개의 시료들 사이에서 참조 대립 유전자에 대한 유의한 프로브 계수 차이는 나타나지 않았다. 이는, FFPE-유래의 gDNA가, 모든 조사된 유전자좌들에 참조 대립유전자를 가지고 있다는 증거로서 해석된다. 시료 A 및 시료 B를 비교하였을 때, 정성적으로 동일한 결과가 수득되었다. 도 52 및 하기에 첨부된 이의 설명은, 시료 B 및 시료 C가 고도로 상관관계가 있는 SNV 계수를 제공함을 보여준다.
최소로 가공된 융합-프로브 검정법 계수를, 조힙 시료 B와 C에 대한 데이터로부터 (상기 3개 단락들에서 기재된 바와 같이) 평가하였다. ALK 유전자 유래의 전사체를 검출하도록 설계된 프로브의 계수에 대한 히스토그램이 도 49에 도시되어 있다. 5' 대 3' ALK 전사체 불균형에 대한 명백한 증거가 융합 양성 대조군에 나타나 있고 -- 전사된 ALK 유전자의 3' 위치에 매칭하는 프로브인 'ALK_3P-1', 'ALK_3P_2', 'ALK_3P_3' 및 'ALK_3P_4'에 대한 계수는 동일한 유전자의 5' 위치에 매칭하는 프로브(ALK_5P-n 시리즈)의 계수보다 유의하게 더 높았고 -- 특이적인 EML4_13:ALK_20 전사체가 동일한 시료에 존재한다는 증거가 있었으며; 이들 결과는 둘 다, 이러한 대조군에 EML4-ALK 융합이 존재한다는 보고와 일치하였다. 이와는 대조적으로, 환자 시료에는 5'/3' ALK 전사체 불균형 또는 임의의 특이적인 ALK 융합의 증거가 희박하였다.
RET 및 NTRK1 유전자 유래의 전사체를 검출하도록 설계된 프로브의 계수에 대한 히스토그램이 도 50에 도시되어 있다. 5' 대 3' ALK 전사체 불균형에 대한 명백한 증거가 융합 양성 대조군에 나타나 있고, 특이적인 CCDC6_1:RET_12 전사체가 동일한 시료에 존재한다는 증거가 있으며; 이들 결과는 둘 다, 이러한 대조군에 CCDC6:RET 융합이 존재한다는 보고와 일치하였다. 이와는 대조적으로, 환자 시료에는 5'/3' RET 전사체 불균형 또는 임의의 특이적인 RET 또는 NTRK1 융합의 증거가 희박하다.
ROS1 유전자 유래의 전사체를 검출하도록 설계된 프로브의 계수에 대한 히스토그램이 도 51에 도시되어 있다. 5' 대 3' ROS1 전사체 불균형에 대한 명백한 증거가 융합 양성 대조군에 나타나 있고, 하나 이상의 특이적인 SLC34A2_4:ROS1 전사체가 동일한 시료에 존재한다는 증거가 있으며; 이들 결과는 둘 다, 이러한 대조군에 SLC34A2:ROS1 융합이 존재한다는 보고와 일치하였다. 이와는 대조적으로, 환자 시료에는 5'/3' ROS1 전사체 불균형 또는 임의의 특이적인 ROS1 융합의 증거가 희박하다.
환자 유래의 FFPE RNA에서 융합 전사체의 증거를 검출하는 데 실패한 결과는, SNV 드라이버(driver) 돌연변이를 가진 종양이, KRAS COSM532 돌연변이에서와 같이, 융합-유래의 드라이버 돌연변이, 예컨대 ALK, RET 및 ROS1와 연관된 돌연변이를 거의 갖고 있지 않다는 관찰과 일치한다.
RNA 융합-유전자 전사체의 검출을 위한 동시적인 검정법은 SNV 검정법 프로브 계수에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 정상화 후, nCounter® Vantage™ 폐 융합 패널을 이용하여 환자-매칭 FFPE RNA의 동시적인 검정법으로부터 수득된 SNV 프로브 계수는, 상업적인 Horizon HD784 대조군으로부터 수득된 FFPE RNA를 이용하여 진행된 유사한 검정법으로부터 수득된 SNV 프로브 계수와 근접하게 매칭되었다. 이는 도 52에 나타나 있다. 도면에서, 2개 데이터세트 모두에서 가장 높은 계수는, 돌연변이체 KRAS COSM532 대립유전자의 존재를 검출한 SNV 프로브로부터의 계수이다(오렌지색 점으로서 표시됨). 11개의 모든 조사된 유전자좌들에 대한 참조 대립유전자 SNV 프로브는 예상된 바와 같이 그 다음으로 가장 높은 프로브 신호 그룹(녹색 점으로서 표시됨)으로 나타나 있다. 마지막으로, 11개의 유전자좌 클러스터에서 돌연변이체 대립유전자의 부재를 검출하도록 설계된 SNP 프로브는 일반적으로 매우 낮은 계수로 존재하였으며, 통상 100개 미만이다(도 52에서 청색 점으로서 표시됨).

Claims (155)

  1. 중합체 가닥 쌍으로서,
    제1 중합체 가닥으로서, 적어도
    (1) 제1 표적 결합 영역,
    (2) 제1 상보성 영역, 및
    (3) 서열 특이적 영역
    을 포함하는 제1 중합체 가닥, 및
    제2 중합체 가닥으로서, 적어도
    (1) 제2 표적 결합 영역, 및
    (2) 제2 상보성 영역
    을 포함하는 제2 중합체 가닥
    을 포함하며;
    제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 동일한 핵산 분자 내에 존재하며, 제1 표적 결합 영역의 표적은 제2 표적 결합 영역의 표적과 겹치지 않고;
    제1 상보성 영역이 제2 상보성 영역에 상보적인 것인 중합체 가닥 쌍.
  2. 제1항에 있어서, 제1 중합체 가닥이 제1 표적 결합 영역과 제1 상보성 영역 사이에 스페이서를 포함하거나, 제2 중합체 가닥이 제2 표적 결합 영역과 제2 상보성 영역 사이에 스페이서를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  3. 제1항에 있어서, 제1 표적 결합 영역, 제1 상보성 영역 및 서열 특이적 영역 중 적어도 하나가 단일 가닥 핵산인 중합체 가닥 쌍.
  4. 제3항에 있어서, 단일 가닥 핵산이 DNA 또는 RNA인 중합체 가닥 쌍.
  5. 제3항에 있어서, 제1 중합체 가닥이 단일 가닥 핵산 분자인 중합체 가닥 쌍.
  6. 제1항에 있어서, 제2 표적 결합 영역 및 제2 상보성 영역 중 적어도 하나가 단일 가닥 핵산인 중합체 가닥 쌍.
  7. 제6항에 있어서, 단일 가닥 핵산이 DNA 또는 RNA인 중합체 가닥 쌍.
  8. 제6항에 있어서, 제2 중합체 가닥이 단일 가닥 핵산 분자인 중합체 가닥 쌍.
  9. 제2항에 있어서, 스페이서가 중합체 사슬인 중합체 가닥 쌍.
  10. 제9항에 있어서, 중합체 사슬이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  11. 제9항에 있어서, 중합체 사슬이 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  12. 제2항에 있어서, 제1 중합체 가닥이 제1 표적 결합 영역과 제1 상보성 영역 사이에 스페이서를 포함하고, 제2 중합체 가닥이 제2 표적 결합 영역과 제2 상보성 영역 사이에 스페이서를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  13. 제12항에 있어서, 스페이서가 중합체 사슬인 중합체 가닥 쌍.
  14. 제13항에 있어서, 중합체 사슬이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  15. 제13항에 있어서, 중합체 사슬이 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  16. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자이거나 또는 RNA 분자인 중합체 가닥 쌍.
  17. 제16항에 있어서, RNA 분자가 메신저 RNA(스플라이싱-전 또는 스플라이싱-후 mRNA), 비-코딩 RNA(ncRNA), 리보좀 RNA(rRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 바이러스 RNA, 박테리아 RNA 또는 합성 RNA인 중합체 가닥 쌍.
  18. 제16항에 있어서, DNA 분자가 진핵생물 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, 박테리아 게놈 DNA, 고세균 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, cDNA 또는 합성 DNA인 중합체 가닥 쌍.
  19. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 상응하는 야생형 핵산 분자와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  20. 제19항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 중합체 가닥 쌍.
  21. 제1항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  22. 제21항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  23. 제22항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 4개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  24. 제23항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 6개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  25. 제24항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 10개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  26. 제21항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 하나의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  27. 제1항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 핵산 분자 내에서 인접해 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  28. 제1항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 또는 제2 표적 결합 영역의 표적이 상응하는 야생형 핵산 분자와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  29. 제28항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 중합체 가닥 쌍.
  30. 제28항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 각각 상응하는 야생형 핵산 분자와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  31. 제30항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 중합체 가닥 쌍.
  32. 제1항에 있어서, 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역이 각각 약 5개 내지 약 35개 길이의 뉴클레오타이드인 중합체 가닥 쌍.
  33. 제32항에 있어서, 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역이 각각 약 10개 내지 약 30개 길이의 뉴클레오타이드인 중합체 가닥 쌍.
  34. 제33항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 길이 및 제2 표적 결합 영역의 길이의 합계가 약 55개 이하의 뉴클레오타이드인 중합체 가닥 쌍.
  35. 제1항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 5℃ 내지 약 35℃이고, 제2 표적의 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 5℃ 내지 약 35℃인 중합체 가닥 쌍.
  36. 제1항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도와 제2 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 30℃ 이하로 상이한 것인 중합체 가닥 쌍.
  37. 제36항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도와 제2 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 20℃ 이하로 상이한 것인 중합체 가닥 쌍.
  38. 제1항에 있어서, 제1 상보성 영역 및 제2 상보성 영역이, 820 mM Na+ 이온 및 250 nM 중합체 가닥 농도와 대략 동등한 용액 조건 하에 약 60℃ 내지 약 90℃의 측정 또는 예측된 용융 온도를 가지는 것인 중합체 가닥 쌍.
  39. 제1항에 있어서, 제1 상보성 영역 및 제2 상보성 영역이 각각 약 12개 내지 약 60개 길이의 뉴클레오타이드인 중합체 가닥 쌍.
  40. 제1항에 있어서, 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  41. 제1항에 있어서, 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 RNA 또는 DNA인 중합체 가닥 쌍.
  43. 제42항에 있어서, 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  44. 제43항에 있어서, 적어도 하나의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 중합체 가닥 쌍.
  45. 제43항에 있어서, 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체가 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  46. 제41항에 있어서, 단일 가닥 핵산 백본이 적어도 하나의 친화성 모이어티에 부착되어 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  47. 제1항에 있어서, 서열 특이적 영역이 적어도 하나의 친화성 모이어티에 부착되어 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  48. 제1항에 있어서, 서열 특이적 영역이 리포터 프로브의 일부에 결합할 수 있고, 리포터 프로브가, 적어도
    서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위, 및
    단일 가닥 핵산 백본
    을 포함하며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  49. 제48항에 있어서, 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 RNA 또는 DNA인 중합체 가닥 쌍.
  50. 제48항에 있어서, 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  51. 제50항에 있어서, 적어도 하나의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 중합체 가닥 쌍.
  52. 제50항에 있어서, 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체가 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있는 것인 중합체 가닥 쌍.
  53. 제48항에 있어서, 리포터 프로브가 친화성 모이어티를 추가로 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  54. 제48항에 있어서, 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위가 약 20개 내지 약 50개 길이의 뉴클레오타이드인 중합체 가닥 쌍.
  55. 제54항에 있어서, 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위가 약 35개 길이의 뉴클레오타이드인 중합체 가닥 쌍.
  56. 제1항에 있어서, 서열 특이적 영역이 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그(mass tag), 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  57. 제56항에 있어서, 적어도 하나의 표지 단량체가 서열 특이적 영역 내의 뉴클레오타이드에 공유결합 부착되는 것인 중합체 가닥 쌍.
  58. 제56항에 있어서, 적어도 하나의 표지 단량체가, 서열 특이적 영역의 일부에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 공유결합 부착되는 것인 중합체 가닥 쌍.
  59. 제1항에 있어서, 제1 중합체 가닥이 제1 상보성 영역과 서열 특이적 영역 사이에 절단 가능한 링커를 추가로 포함하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  60. 제59항에 있어서, 절단 가능한 링커가 광-절단 가능한 것인 중합체 가닥 쌍.
  61. 제59항에 있어서, 절단 가능한 링커가 화학적으로 절단 가능한 것인 중합체 가닥 쌍.
  62. 제59항에 있어서, 절단 가능한 링커가 효소적으로 절단 가능한 것인 중합체 가닥 쌍.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 상보성 영역과 제2 상보성 영역이 혼성화되는 경우, 제1 중합체 가닥 및 제2 중합체 가닥이 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 형성하는 것인 중합체 가닥 쌍.
  64. 제63항에 따른 부분적 이중 가닥 핵산 프로브.
  65. 제64항에 있어서, 제1 표적 및 제2 표적으로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 40℃ 내지 약 60℃인 부분적 이중 가닥 핵산 프로브.
  66. 제65항에 있어서, 제1 표적 및 제2 표적으로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 44℃ 내지 약 58℃인 부분적 이중 가닥 핵산 프로브.
  67. 제66항에 있어서, 제1 표적 및 제2 표적으로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 47℃ 내지 약 57℃인 부분적 이중 가닥 핵산 프로브.
  68. 제64항에 있어서, 제1 표적으로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 5℃ 내지 약 35℃이고, 제2 표적으로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 5℃ 내지 약 35℃인 부분적 이중 가닥 핵산 프로브.
  69. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 복수의 중합체 가닥 쌍을 포함하는 조성물로서, 제1 중합체 가닥 쌍이 제1 핵산 분자에 결합할 수 있으며, 적어도 제2 중합체 가닥 쌍이 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있고, 제1 핵산 분자가 적어도 제2 핵산 분자와 상이한 것인 조성물.
  70. 중합체 가닥 트리오(trio)로서,
    (a) 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 중합체 가닥 쌍, 및
    (b) 포획 중합체 가닥으로서, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하는 포획 중합체 가닥
    을 포함하고,
    제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적이 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재하는 것인 중합체 가닥 트리오.
  71. 제70항에 따른 복수의 중합체 가닥 트리오를 포함하는 조성물로서, 제1 중합체 가닥 트리오가 제1 핵산 분자에 결합할 수 있으며, 적어도 제2 중합체 가닥 트리오가 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있고, 제1 핵산 분자가 적어도 제2 핵산 분자와 상이한 것인 조성물.
  72. 제64항에 따른 복수의 부분적 이중 가닥 핵산 프로브를 포함하는 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 복수의 포획 중합체 가닥을 추가로 포함하며,
    제1 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하며,
    적어도 제2 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하는 것인 조성물.
  74. 시료내 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 중합체 가닥 쌍과 접촉시키는 단계로서,
    (a) 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식(identify)하거나;
    (b) 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 시료를 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하고,
    제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적이 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재하는 것인 방법.
  76. 시료내 복수의 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 제1 중합체 가닥 쌍 및 적어도 제2 중합체 가닥 쌍과 접촉시키는 단계로서,
    (a) 각각의 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 각각의 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 제1 중합체 가닥 쌍 및 적어도 제2 중합체 가닥 쌍에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 시료를 복수의 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며,
    제1 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하고;
    적어도 제2 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하는 것인 방법.
  78. 시료내 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제64항에 따른 부분적 이중 가닥 핵산 프로브와 접촉시키는 단계로서,
    (a) 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 포획 중합체 가닥과 시료를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 포획 중합체 가닥이,
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 적어도 포함하는 영역을 적어도 포함하고,
    제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적이 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재하는 것인 방법.
  80. 시료내 복수의 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를, 제64항에 따른 제1 부분적 이중 가닥 핵산 프로브 및 적어도 제2 부분적 이중 가닥 핵산 프로브와 접촉시키는 단계로서,
    (a) 각각의 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 각각의 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 제1 중합체 가닥 쌍 및 적어도 제2 중합체 가닥 쌍에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 시료를 복수의 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며,
    제1 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하고;
    적어도 제2 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하는 것인 방법.
  82. 시료내 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제70항에 따른 중합체 가닥 트리오와 접촉시키는 단계로서,
    (a) 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  83. 시료내 복수의 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제70항에 따른 제1 중합체 가닥 트리오 및 적어도 제2 중합체 가닥 트리오와 접촉시키는 단계로서,
    (a) 각각의 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 각각의 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 제1 중합체 가닥 트리오 및 적어도 제2 중합체 가닥 트리오에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  84. 다가 중합체 가닥으로서, 적어도
    제1 표적 결합 영역,
    제2 표적 결합 영역,
    제1 표적 결합 영역과 제2 표적 결합 영역 사이의 스페이서, 및
    서열 특이적 영역
    을 포함하며;
    제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 동일한 핵산 분자 내에 존재하고, 제1 표적 결합 영역의 표적이 제2 표적 결합 영역의 표적과 겹치지 않는 것인 다가 중합체 가닥.
  85. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역, 제2 표적 결합 영역 및 서열 특이적 영역 중 적어도 하나가 단일 가닥 핵산인 다가 중합체 가닥.
  86. 제85항에 있어서, 단일 가닥 핵산이 DNA 또는 RNA인 다가 중합체 가닥.
  87. 제85항에 있어서, 다가 중합체 가닥이 단일 가닥 핵산 분자인 다가 중합체 가닥.
  88. 제87항에 있어서, 단일 가닥 핵산이 DNA 또는 RNA인 다가 중합체 가닥.
  89. 제84항에 있어서, 스페이서가 중합체 사슬인 다가 중합체 가닥.
  90. 제89항에 있어서, 중합체 사슬이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  91. 제89항에 있어서, 중합체 사슬이 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  92. 제84항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자이거나 또는 RNA 분자인 다가 중합체 가닥.
  93. 제92항에 있어서, RNA 분자가 메신저 RNA(스플라이싱-전 또는 스플라이싱-후 mRNA), 비-코딩 RNA(ncRNA), 리보좀 RNA(rRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 바이러스 RNA, 박테리아 RNA 또는 합성 RNA인 다가 중합체 가닥.
  94. 제92항에 있어서, DNA 분자가 진핵생물 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 엽록체 DNA, 박테리아 게놈 DNA, 고세균 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, cDNA 또는 합성 DNA인 다가 중합체 가닥.
  95. 제84항에 있어서, 핵산 분자가 상응하는 야생형 핵산 분자와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  96. 제95항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다가 중합체 가닥.
  97. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  98. 제97항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  99. 제98항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 4개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  100. 제99항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 6개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  101. 제100항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 10개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  102. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 하나의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  103. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 핵산 분자 내에서 인접해 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  104. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 또는 제2 표적 결합 영역의 표적이 상응하는 야생형 핵산 분자와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  105. 제104항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다가 중합체 가닥.
  106. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 표적 및 제2 표적 결합 영역의 표적이 각각 상응하는 야생형 핵산 분자와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  107. 제106항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 단일 뉴클레오타이드의 다형성(SNP), 삽입, 결실 및 유전자 융합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다가 중합체 가닥.
  108. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역이 각각 약 5개 내지 약 35개 길이의 뉴클레오타이드인 다가 중합체 가닥.
  109. 제108항에 있어서, 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역이 각각 약 10개 내지 약 30개 길이의 뉴클레오타이드인 다가 중합체 가닥.
  110. 제109항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 길이 및 제2 표적 결합 영역의 길이의 합계가 약 55개 이하의 뉴클레오타이드인 다가 중합체 가닥.
  111. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 5℃ 내지 약 35℃이고, 제2 표적의 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 5℃ 내지 약 35℃인 다가 중합체 가닥.
  112. 제84항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도와 제2 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 30℃ 이하로 상이한 것인 다가 중합체 가닥.
  113. 제112항에 있어서, 제1 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도와 제2 표적 결합 영역의 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 20℃ 이하로 상이한 것인 다가 중합체 가닥.
  114. 제84항에 있어서, 서열 특이적 영역이, 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  115. 제84항에 있어서, 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 RNA 또는 DNA인 다가 중합체 가닥.
  117. 제116항에 있어서, 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  118. 제117항에 있어서, 적어도 하나의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다가 중합체 가닥.
  119. 제117항에 있어서, 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체가 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  120. 제115항에 있어서, 단일 가닥 핵산 백본이 적어도 하나의 친화성 모이어티에 부착되어 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  121. 제84항에 있어서, 서열 특이적 영역이 적어도 하나의 친화성 모이어티에 부착되어 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  122. 제84항에 있어서, 서열 특이적 영역이 리포터 프로브의 일부에 결합할 수 있고, 리포터 프로브가, 적어도
    서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위, 및
    단일 가닥 핵산 백본
    을 포함하며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하고, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  123. 제122항에 있어서, 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 RNA 또는 DNA인 다가 중합체 가닥.
  124. 제122항에 있어서, 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  125. 제124항에 있어서, 적어도 하나의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다가 중합체 가닥.
  126. 제124항에 있어서, 제1 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체가 적어도 제2 표지 부착 위치에서의 적어도 하나의 표지 단량체와 스펙트럼적으로 또는 공간적으로 구별될 수 있는 것인 다가 중합체 가닥.
  127. 제122항에 있어서, 리포터 프로브가 친화성 모이어티를 추가로 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  128. 제122항에 있어서, 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위가 약 20개 내지 약 50개 길이의 뉴클레오타이드인 다가 중합체 가닥.
  129. 제123항에 있어서, 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위가 약 35개 길이의 뉴클레오타이드인 다가 중합체 가닥.
  130. 제84항에 있어서, 서열 특이적 영역이 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 것인 다가 중합체 가닥.
  131. 제130항에 있어서, 적어도 하나의 표지 단량체가 서열 특이적 영역 내의 뉴클레오타이드에 공유결합 부착되는 것인 다가 중합체 가닥.
  132. 제130항에 있어서, 적어도 하나의 표지 단량체가, 서열 특이적 영역의 일부에 혼성화된 뉴클레오타이드에 공유결합 부착되는 것인 다가 중합체 가닥.
  133. 제84항에 있어서, 제1 또는 제2 표적 결합 영역과 서열 특이적 영역 사이에, 또는 서열 특이적 영역 내에 절단 가능한 링커를 추가로 포함하는 다가 중합체 가닥.
  134. 제133항에 있어서, 절단 가능한 링커가 광-절단 가능한 것인 다가 중합체 가닥.
  135. 제133항에 있어서, 절단 가능한 링커가 화학적으로 절단 가능한 것인 다가 중합체 가닥.
  136. 제133항에 있어서, 절단 가능한 링커가 효소적으로 절단 가능한 것인 다가 중합체 가닥.
  137. 제84항에 있어서, 제1 표적 및 제2 표적의 합계로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 25℃ 내지 약 60℃인 다가 중합체 가닥.
  138. 제137항에 있어서, 제1 표적 및 제2 표적의 합계로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 44℃ 내지 약 58℃인 다가 중합체 가닥.
  139. 제138항에 있어서, 제1 표적 및 제2 표적의 합계로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 47℃ 내지 약 57인 다가 중합체 가닥.
  140. 제84항에 있어서, 제1 표적으로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 5℃ 내지 약 35℃이고, 제2 표적으로부터 측정 또는 예측된 용융 온도가 약 5℃ 내지 약 35℃인 다가 중합체 가닥.
  141. 제84항 내지 제140항 중 어느 한 항에 따른 복수의 다가 중합체 가닥을 포함하는 조성물로서, 제1 다가 중합체 가닥이 제1 핵산 분자에 결합할 수 있으며, 적어도 제2 다가 중합체 가닥이 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있고, 제1 핵산 분자가 적어도 제2 핵산 분자와 상이한 것인 조성물.
  142. 다가 중합체 가닥 듀오(duo)로서,
    (a) 제84항 내지 제140항 중 어느 한 항에 따른 다가 중합체 가닥, 및
    (b) 포획 중합체 가닥으로서, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하는 포획 중합체 가닥
    을 포함하고,
    제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적이 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재하는 것인 다가 중합체 가닥 듀오.
  143. 제142항에 따른 복수의 다가 중합체 가닥 듀오를 포함하는 조성물로서, 제1 다가 중합체 가닥 듀오가 제1 핵산 분자에 결합할 수 있으며, 적어도 제2 다가 중합체 가닥 듀오가 적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있고, 제1 핵산 분자가 적어도 제2 핵산 분자와 상이한 것인 조성물.
  144. 시료내 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제84항 내지 제140항 중 어느 한 항에 따른 다가 중합체 가닥과 접촉시키는 단계로서,
    (a) 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  145. 제144항에 있어서, 시료를 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하고,
    제1, 제2 및 제3 표적 결합 영역의 표적이 겹치지 않고 동일한 핵산 분자 내에 존재하는 것인 방법.
  146. 시료내 복수의 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제84항 내지 제140항 중 어느 한 항에 따른 제1 다가 중합체 가닥 및 적어도 제2 다가 중합체 가닥과 접촉시키는 단계로서,
    (a) 각각의 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 제1 다가 중합체 가닥 및 적어도 제2 다가 중합체 가닥에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  147. 제146항에 있어서, 시료를 복수의 포획 중합체 가닥과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며,
    제1 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    제1 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하고;
    적어도 제2 포획 중합체 가닥이, 적어도
    적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 영역, 또는 적어도 하나의 친화성 모이어티를 포함하는 단일 가닥 핵산에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 영역, 및
    적어도 제2 핵산 분자에 결합할 수 있는 제3 표적 결합 영역
    을 포함하는 것인 방법.
  148. 시료내 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제142항에 따른 다가 중합체 가닥 듀오와 접촉시키는 단계로서,
    (a) 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  149. 시료내 복수의 핵산의 검출 방법으로서,
    (1) 시료를 제142항에 따른 제1 다가 중합체 가닥 듀오 및 적어도 제2 다가 중합체 가닥 듀오와 접촉시키는 단계로서,
    (a) 각각의 서열 특이적 영역이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (b) 각각의 서열 특이적 영역이 단일 가닥 핵산 백본에 공유결합 부착되며, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (c) 서열 특이적 영역이 리포터 프로브에 결합되거나 결합될 수 있으며, 리포터 프로브가 서열 특이적 영역에 상보적인 결합 부위 및 단일 가닥 핵산 백본을 적어도 포함하고, 백본이 선형 조합으로 공유결합 연결된 적어도 2개의 표지 부착 위치를 포함하며, 각각의 표지 부착 위치가 적어도 하나의 표지 단량체를 포함하는 적어도 하나의 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있으며, 표지 단량체의 선형 조합이 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하거나;
    (d) 서열 특이적 영역이 하나 이상의 표지 단량체를 포함하며, 하나 이상의 표지 단량체가 제1 핵산 분자 또는 적어도 제2 핵산 분자를 인식하며;
    적어도 하나의 표지 단량체 및 하나 이상의 표지 단량체가 형광색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 질량 태그, 화학발광 마커, 비오틴, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 또 다른 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (2) 제1 다가 중합체 가닥 듀오 및 적어도 제2 다가 중합체 가닥 듀오에 대한 표지 단량체의 선형 조합 또는 하나 이상의 표지 단량체를 검출하여, 시료내 제1 핵산 분자 및 적어도 제2 핵산 분자를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  150. 제69항, 제71항, 제72항, 제73항, 제141항 및 제143항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  151. 제150항에 있어서, 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함하는 키트.
  152. 제69항, 제71항 내지 제73항, 제141항 및 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  153. 제74항 내지 제83항, 제143항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 시료를, 단백질 표적을 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  154. 제69항, 제71항 내지 제73항, 제141항 및 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 또 다른 NanoString Technologies® nCounter® 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  155. 제74항 내지 제83항, 제143항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 시료를, 적어도 또 다른 NanoString Technologies® nCounter® 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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