JPH10324693A - フルクトース−2,6−ビスリン酸の精製方法 - Google Patents
フルクトース−2,6−ビスリン酸の精製方法Info
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- JPH10324693A JPH10324693A JP9134192A JP13419297A JPH10324693A JP H10324693 A JPH10324693 A JP H10324693A JP 9134192 A JP9134192 A JP 9134192A JP 13419297 A JP13419297 A JP 13419297A JP H10324693 A JPH10324693 A JP H10324693A
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Abstract
フルクトース−2,6−ビスリン酸の精製方法を提供す
る。 【解決手段】 フルクトース−2,6−ビスリン酸含有
液から陰イオン交換材料を用いてフルクトース−2,6
−ビスリン酸を精製するに際し、溶出液として一価の金
属のアルカリ塩の溶液を用いることを特徴とするフルク
トース−2,6−ビスリン酸の精製方法。
Description
2,6−ビスリン酸(以下、F2,6P2と略記する)
の精製方法に関するものである。
は、例えば、インスリンホルモンによる調節、グルカゴ
ンやアドレナリンによる調節、セカンドメッセンジャー
と呼ばれるサイクリックアデノシン5’−モノリン酸に
よる調節、アデノシン5’−モノリン酸(以下、AMP
と略記する)、アデノシン5’−トリリン酸(以下、A
TPと略記する)、クエン酸による調節、F2,6P2
による調節等が報告されている。
連の経路により行われ、この経路において、ホスホフル
クトキナーゼ1酵素( E.C.2.7.1.11 :
以下、PFK1と略記する)は重要な調節因子である。
このPFK1を活性化するF2,6P2が糖代謝に関す
る因子として重要であることが、近年確認されている。
さらに、F2,6P2は、糖尿病、糖尿病合併症治療剤
及び肝細胞増殖促進剤として有用であることが報告され
ている(特開平2―202822号公報参照)。
(1)フルクトース−1,6−ビスリン酸(以下、F
1,6P2と略記する)から、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを触媒としてフルクトース−1,2−サイクリ
ック−6−ビスリン酸(以下、FCPと略記する)を
得、さらにこのFCPをアルカリで部分分解することに
より製造する方法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー誌、117巻、319頁(1981
年)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー誌、256巻、8679頁(1981年)、特開昭6
0−161994号公報参照〕と、(2)酵母の菌体破
砕液からポリエチレングリコール沈殿、セファクリルブ
ルー(Sephacryl-blue)樹脂、CMセファデックス(CM
-Sephadex )樹脂を用いて精製したホスホフルクトキナ
ーゼ2酵素( E.C.2.7.1.105 :以下、
PFK2と略記する)をフルクトース−6−リン酸(以
下、F6Pと略記する)とATPとに作用させることに
より製造する方法〔バイオケミストリー誌、32巻、1
1147頁(1993年)参照〕が知られている。
と、F6P、F1,6P2、FCP、ATP等の不純物
が合成反応液に混在するため、この合成反応液からF
2,6P2を分離精製することが必要となる。合成反応
液からF2,6P2を精製する方法として、特開平9−
107986号公報には、F2,6P2の合成反応液を
陰イオン交換樹脂にアプライし、洗浄後、炭酸水素ナト
リウムの水溶液で溶出する方法が開示されている。
リウムを用いて溶出を行うと、高濃度の水溶液を使用す
ることが必要となり、このため、F2,6P2の回収液
(溶出液)から炭酸水素ナトリウムを除去すること(脱
塩)が困難であるという問題があった。
ことのできるF2,6P2の精製方法を提供することを
目的とするものである。
な課題を解決するために鋭意検討の結果、一価の金属の
アルカリ塩の溶液を用いれば、F2,6P2を低濃度の
溶液でも溶出することができるということを見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、フルク
トース−2,6−ビスリン酸含有液から陰イオン交換材
料を用いてフルクトース−2,6−ビスリン酸を精製す
るに際し、溶出液として一価の金属のアルカリ塩の溶液
を用いることを特徴とするフルクトース−2,6−ビス
リン酸の精製方法を要旨とするものである。
F2,6P2は、動物組織中に微量物質として存在する
下記一般式で表わされる糖リン酸化合物である。
ては、陰イオン交換樹脂や陰イオン交換膜が挙げられ、
これらは3級アミン基やピロリジル基等の陰イオン交換
基を有するものであれば特に限定されるものではなく、
一般に市販されているものを使用すればよい。市販され
ている陰イオン交換樹脂としては、ダイアイオンWAシ
リーズ(三菱化学社製)、ダウエックスWGRシリーズ
(室町化学工業社製)、セファデックスシリーズ(ファ
ルマシア社製)等が挙げられる。
オン交換材料にF2,6P2含有液を接触させて、F
2,6P2を材料に吸着させる。接触の方法としては、
例えば樹脂を用いる場合にはカラム法、バッチ法のいず
れの方法でもよい。また、膜を用いる場合には、加圧通
液、減圧通液、自然通液のいずれの方法でもよい。
は、F2,6P2の量が陰イオン交換材料中の陰イオン
交換基の数と同量又は少なくなることが好ましい。
陰イオン交換材料を必要に応じて洗浄した後、一価の金
属のアルカリ塩を含む溶出液で溶出する。一価の金属と
しては、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム等
のアルカリ塩が挙げられ、特にナトリウム、カリウムが
好ましい。
ましく、本発明に使用する塩としては、水酸化ナトリウ
ム又は水酸化カルシウムが特に好ましい。
少なくとも一種が含まれていればよく、複数が含まれて
いてもよいし、また、その他の塩が含まれていてもよい
が、塩濃度が高くなる(複数の塩が含まれると)と、こ
れらの塩を除去する操作に手間がかかるので好ましくな
い。
アルカリ塩を含有するものであれば特に限定されるもの
ではなく、水溶液、リン酸、イミダゾール、ヘペス、酢
酸、グリシン等の緩衝液、有機溶媒との混合溶液等を用
いることができる。
しては、1〜500mMであることが好ましく、特に1
0〜100mMであることが好ましい。
の溶液の代わりに中性塩の溶液を用いるとF2,6P2
を溶出するには数百mM〜数Mの濃度の溶液を用いるこ
とが必要となり、このため、脱塩操作が困難になる。ま
た、二価以上の金属塩を利用すると溶出中にF2,6P
2が析出してしまう。
溶出液は、電気透析や逆浸透膜等により容易に脱塩を行
うことができる。また、凍結乾燥等を行うことにより粉
末状で得ることができる。
る。
ccharomyces cerevisiae)BJ2168/pAB10
(FERM P−15210)をグルコース(石津製薬
社製、品番036−0064)2重量%、カザミノ酸
(日水製薬社製、品番05834)0.5重量%、アミ
ノ酸非含有窒素源(DIFCO社製、品番0919−1
5−3)0.67重量%、L−ロイシン(石津製薬社
製、品番012−4021)30mg/リットル、L−
トリプトファン(石津製薬社製、品番015−331
1)30mg/リットルを含む培地(pH5.2)20
リットルに植菌し、30℃で30リットルジャーファー
メンターを用いて培養した。この培養液20リットル
を、ガラクトース(石津製薬社製、品番012−330
3)2重量%、カザミノ酸0.5重量%、アミノ酸非含
有窒素源0.67重量%、L−ロイシン30mg/リッ
トル、L−トリプトファン30mg/リットルを含む培
地(pH5.2)400リットルに加え、30℃で50
0リットルジャーファーメンターを用いて24時間培養
することにより4.2Kgの菌体を得た。
A〔50mMのTris−HCl(石津製薬社製、品番
325−2070)、20mMのKCl(石津製薬社
製、品番034−5283)、2mMのβ−メルカプト
エタノール(mercaptoethanol、石津製
薬社製、品番043−0461)、2mMのEDTA
(石津製薬社製、品番042−0621)を含む、pH
7.5〕500ミリリットルに懸濁し、この懸濁液をD
YNO−MILL破砕機(type KDL、シンマル
エンタープライゼス社製)と直径0.25mmのガラス
ビーズ(シンマルエンタープライゼス社製)を用いてガ
ラスビーズ破砕をした。得られた菌体破砕液のPFK2
活性は75ユニットであった。この菌体破砕液に高分子
凝集剤(ユニフロッカーUF−304、ユニチカ社製)
の1.5重量%溶液を、破砕液量の12%相当分を加え
た。5分間撹拌した後、この液を遠心分離(4℃、5
分、8000rpm)し、上清を回収した。得られた上
清をデアエセファロースFF(DEAE-SepharoseFF、ファ
ルマシア製)及びブルーセファロースCL−6B(Blue
-Sepharose CL-6B、ファルマシア製)を直列につないだ
カラムに充填した後、バッファーAのKCl濃度を2M
にした溶液により、PFK2を溶出した。この時のPF
K2活性は8ユニットであり、PFK1の活性は検出限
界以下であった。
5−2070)、20mMのMgCl2 (石津製薬社
製、品番013−3043)、15mMのATP(シグ
マ社製、品番A−5394)、10mMのF6Pを含む
反応液(pH9.0)50ミリリットルに、参考例1で
精製したPFK2を50ミリユニット/ミリリットルと
なるように加えて30℃で反応を行った。反応開始から
4.5時間後、反応液を煮沸して反応を停止した結果、
反応収率41%でF2,6P2が合成されていた。
Hを8.0に調節し、1mMのNADH(ベーリンガー
社製、品番128023)を添加した。これに、10ユ
ニット/リットルのアルドラーゼ(ベーリンガー社製、
品番102652)、20ユニット/リットルのトリオ
ースリン酸イソメラーゼ(ベーリンガー社製、品番10
9754)及び10ユニット/リットルのグリセロール
−3−リン酸脱水素酵素(ベーリンガー社製、品番12
7752)を添加し、28℃で反応を行った。反応開始
から1時間後、反応液を煮沸して反応を停止した。反応
停止後、反応液中のF1,6P2の量を測定したところ
F1,6P2は検出されなかった。
製)10ミリリットルをカラムに充填し、蒸留水100
ミリリットルで洗浄した後、蒸留水で2倍に希釈した上
記のF1,6P2を分解除去した反応液をアプライし、
蒸留水200ミリリットルでF2,6P2含有液を溶出
することにより、反応溶液からアデノシン、ATP、A
MPなどのアデノシンを有する化合物を除去した。
樹脂ダイアイオン WA10(DIAION WA1
0、三菱化学社製、OH型)4ミリリットルを充填した
カラムにアプライし、0.02MのNaCl水溶液(石
津製薬社製)100ミリリットルでF2,6P2を溶出
した。その結果を図1に示す。図1は、陰イオン交換樹
脂ダイアイオン WA10を用いてF2,6P2含有液
を精製したときの結果を示す図であり、縦軸に濃度を、
横軸にフラクションナンバーを示している。図1から、
NaClの水溶液を用いることにより低い濃度の溶液で
も効率よくF2,6P2とF6Pを分離することができ
るとがわかる。
液を、逆浸透膜(NTR−7250、日東電工社製)を
用いて電気伝導度が10mmhoになるまで蒸留水で脱
塩濃縮した。脱塩作用に要した時間は2時間であった。
この濃縮液を、4℃で50時間凍結乾燥することにより
43mgのF2,6P2の粉末を得た。
外は実施例1と同様にしてF2,6P2の精製を行った
ところ、逆浸透膜による脱塩操作に40時間かかった。
以上の結果から、溶出液をNaHCO3 の水溶液からN
aClの水溶液に代えることにより脱塩に要する時間を
約20分の1に短縮することができることがわかる。
の低い溶液を用いて精製することが可能となるので,の
ちの脱塩に要する時間を非常に短縮することができる。
いてF2,6P2を精製したときの結果を示す図であ
る。
Claims (1)
- 【請求項1】 フルクトース−2,6−ビスリン酸含有
液から陰イオン交換材料を用いてフルクトース−2,6
−ビスリン酸を精製するに際し、溶出液として一価の金
属のアルカリ塩の溶液を用いることを特徴とするフルク
トース−2,6−ビスリン酸の精製方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9134192A JPH10324693A (ja) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | フルクトース−2,6−ビスリン酸の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9134192A JPH10324693A (ja) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | フルクトース−2,6−ビスリン酸の精製方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10324693A true JPH10324693A (ja) | 1998-12-08 |
Family
ID=15122594
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9134192A Pending JPH10324693A (ja) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | フルクトース−2,6−ビスリン酸の精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10324693A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100395252C (zh) * | 2006-06-12 | 2008-06-18 | 南京工业大学 | 一种连续分离1,6-二磷酸果糖的方法 |
-
1997
- 1997-05-23 JP JP9134192A patent/JPH10324693A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100395252C (zh) * | 2006-06-12 | 2008-06-18 | 南京工业大学 | 一种连续分离1,6-二磷酸果糖的方法 |
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