JPH10324693A - Purification of fructose-2,6-bisphosphate - Google Patents
Purification of fructose-2,6-bisphosphateInfo
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- JPH10324693A JPH10324693A JP9134192A JP13419297A JPH10324693A JP H10324693 A JPH10324693 A JP H10324693A JP 9134192 A JP9134192 A JP 9134192A JP 13419297 A JP13419297 A JP 13419297A JP H10324693 A JPH10324693 A JP H10324693A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、フルクトース−
２，６−ビスリン酸（以下、Ｆ２，６Ｐ２と略記する）
の精製方法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a fructose-
2,6-bisphosphoric acid (hereinafter abbreviated as F2,6P2)
And a method for purifying.
【０００２】[0002]
【従来の技術】生体における糖代謝の調節機構として
は、例えば、インスリンホルモンによる調節、グルカゴ
ンやアドレナリンによる調節、セカンドメッセンジャー
と呼ばれるサイクリックアデノシン５’−モノリン酸に
よる調節、アデノシン５’−モノリン酸（以下、ＡＭＰ
と略記する）、アデノシン５’−トリリン酸（以下、Ａ
ＴＰと略記する）、クエン酸による調節、Ｆ２，６Ｐ２
による調節等が報告されている。2. Description of the Related Art Regulation mechanisms of glucose metabolism in living organisms include, for example, regulation by insulin hormone, regulation by glucagon and adrenaline, regulation by cyclic adenosine 5'-monophosphate called second messenger, and adenosine 5'-monophosphate ( Below, AMP
Adenosine 5′-triphosphate (hereinafter A)
TP), regulation by citric acid, F2,6P2
Has been reported.
【０００３】生体における糖代謝は解糖系と呼ばれる一
連の経路により行われ、この経路において、ホスホフル
クトキナーゼ１酵素（ Ｅ．Ｃ．２．７．１．１１ ：
以下、ＰＦＫ１と略記する）は重要な調節因子である。
このＰＦＫ１を活性化するＦ２，６Ｐ２が糖代謝に関す
る因子として重要であることが、近年確認されている。
さらに、Ｆ２，６Ｐ２は、糖尿病、糖尿病合併症治療剤
及び肝細胞増殖促進剤として有用であることが報告され
ている（特開平２―２０２８２２号公報参照）。[0003] Glucose metabolism in living organisms is carried out by a series of pathways called glycolysis, in which phosphofructokinase 1 enzyme (EC 2.7.1.11:
Hereinafter, abbreviated as PFK1) is an important regulator.
It has recently been confirmed that F2 and 6P2 that activate PFK1 are important as factors relating to glucose metabolism.
Furthermore, it has been reported that F2,6P2 is useful as a therapeutic agent for diabetes and diabetic complications and as a hepatocyte proliferation promoter (see JP-A-2-202822).
【０００４】従来、Ｆ２，６Ｐ２の製造方法としては、
（１）フルクトース−１，６−ビスリン酸（以下、Ｆ
１，６Ｐ２と略記する）から、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを触媒としてフルクトース−１，２−サイクリ
ック−６−ビスリン酸（以下、ＦＣＰと略記する）を
得、さらにこのＦＣＰをアルカリで部分分解することに
より製造する方法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー誌、１１７巻、３１９頁（１９８１
年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー誌、２５６巻、８６７９頁（１９８１年）、特開昭６
０−１６１９９４号公報参照〕と、（２）酵母の菌体破
砕液からポリエチレングリコール沈殿、セファクリルブ
ルー（Sephacryl-blue）樹脂、ＣＭセファデックス（CM
-Sephadex ）樹脂を用いて精製したホスホフルクトキナ
ーゼ２酵素（ Ｅ．Ｃ．２．７．１．１０５ ：以下、
ＰＦＫ２と略記する）をフルクトース−６−リン酸（以
下、Ｆ６Ｐと略記する）とＡＴＰとに作用させることに
より製造する方法〔バイオケミストリー誌、３２巻、１
１１４７頁（１９９３年）参照〕が知られている。Conventionally, as a method of manufacturing F2,6P2,
(1) Fructose-1,6-bisphosphate (hereinafter referred to as F
1,6P2) to obtain fructose-1,2-cyclic-6-bisphosphoric acid (hereinafter abbreviated as FCP) using dicyclohexylcarbodiimide as a catalyst, and further produce the FCP by partially decomposing it with an alkali. How to do [European Journal of
Biochemistry, 117, 319 (1981)
Journal of Biological Chemistry, 256, 8679 (1981);
No. 0-161994], and (2) polyethylene glycol precipitation from a yeast cell lysate, Sephacryl-blue resin, CM Sephadex (CM).
-Sephadex) resin purified using phosphofructokinase 2 enzyme (EC 2.7.1.105: hereinafter)
PFK2) to fructose-6-phosphate (hereinafter abbreviated as F6P) and ATP (Biochemistry, Vol. 32, 1
1147 (1993)].
【０００５】このような方法でＦ２，６Ｐ２を合成する
と、Ｆ６Ｐ、Ｆ１，６Ｐ２、ＦＣＰ、ＡＴＰ等の不純物
が合成反応液に混在するため、この合成反応液からＦ
２，６Ｐ２を分離精製することが必要となる。合成反応
液からＦ２，６Ｐ２を精製する方法として、特開平９−
１０７９８６号公報には、Ｆ２，６Ｐ２の合成反応液を
陰イオン交換樹脂にアプライし、洗浄後、炭酸水素ナト
リウムの水溶液で溶出する方法が開示されている。When F2,6P2 is synthesized by such a method, impurities such as F6P, F1,6P2, FCP, and ATP are mixed in the synthesis reaction solution.
It is necessary to separate and purify 2,6P2. A method for purifying F2,6P2 from a synthesis reaction solution is disclosed in
Japanese Patent No. 1079886 discloses a method in which a synthesis reaction solution of F2 and 6P2 is applied to an anion exchange resin, washed, and eluted with an aqueous solution of sodium hydrogen carbonate.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】しかし、炭酸水素ナト
リウムを用いて溶出を行うと、高濃度の水溶液を使用す
ることが必要となり、このため、Ｆ２，６Ｐ２の回収液
（溶出液）から炭酸水素ナトリウムを除去すること（脱
塩）が困難であるという問題があった。However, when elution is carried out using sodium hydrogen carbonate, it is necessary to use a high-concentration aqueous solution, and therefore, from the F2,6P2 recovered liquid (eluate), There was a problem that it was difficult to remove sodium (desalting).
【０００７】本発明は、溶出後の脱塩操作を容易に行う
ことのできるＦ２，６Ｐ２の精製方法を提供することを
目的とするものである。[0007] It is an object of the present invention to provide a method for purifying F2,6P2 which can easily perform a desalting operation after elution.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、一価の金属の
アルカリ塩の溶液を用いれば、Ｆ２，６Ｐ２を低濃度の
溶液でも溶出することができるということを見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、フルク
トース−２，６−ビスリン酸含有液から陰イオン交換材
料を用いてフルクトース−２，６−ビスリン酸を精製す
るに際し、溶出液として一価の金属のアルカリ塩の溶液
を用いることを特徴とするフルクトース−２，６−ビス
リン酸の精製方法を要旨とするものである。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have made intensive studies to solve such problems, and as a result, using a solution of an alkali salt of a monovalent metal, a solution of F2,6P2 in a low-concentration solution can be obtained. However, they have found that they can be eluted, and have completed the present invention. That is, in the present invention, when fructose-2,6-bisphosphate is purified from a fructose-2,6-bisphosphate-containing solution using an anion exchange material, a solution of an alkali salt of a monovalent metal is used as an eluate. The gist of the present invention is a method for purifying fructose-2,6-bisphosphate, which is characterized in that it is used.
【０００９】[0009]
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
Ｆ２，６Ｐ２は、動物組織中に微量物質として存在する
下記一般式で表わされる糖リン酸化合物である。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
F2,6P2 is a sugar phosphate compound represented by the following general formula, which is present as a trace substance in animal tissues.
【００１０】[0010]
【化１】 Embedded image
【００１１】本発明に用いられる陰イオン交換材料とし
ては、陰イオン交換樹脂や陰イオン交換膜が挙げられ、
これらは３級アミン基やピロリジル基等の陰イオン交換
基を有するものであれば特に限定されるものではなく、
一般に市販されているものを使用すればよい。市販され
ている陰イオン交換樹脂としては、ダイアイオンＷＡシ
リーズ（三菱化学社製）、ダウエックスＷＧＲシリーズ
（室町化学工業社製）、セファデックスシリーズ（ファ
ルマシア社製）等が挙げられる。The anion exchange material used in the present invention includes an anion exchange resin and an anion exchange membrane.
These are not particularly limited as long as they have an anion exchange group such as a tertiary amine group or a pyrrolidyl group.
Generally, commercially available ones may be used. Examples of commercially available anion exchange resins include Diaion WA series (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), Dowex WGR series (manufactured by Muromachi Chemical Co., Ltd.), and Sephadex series (manufactured by Pharmacia).
【００１２】本発明においては、まず、このような陰イ
オン交換材料にＦ２，６Ｐ２含有液を接触させて、Ｆ
２，６Ｐ２を材料に吸着させる。接触の方法としては、
例えば樹脂を用いる場合にはカラム法、バッチ法のいず
れの方法でもよい。また、膜を用いる場合には、加圧通
液、減圧通液、自然通液のいずれの方法でもよい。In the present invention, first, an F2,6P2-containing liquid is brought into contact with such an anion exchange material to obtain
2,6P2 is adsorbed on the material. As a method of contact,
For example, when a resin is used, any of a column method and a batch method may be used. When a membrane is used, any of a pressurized liquid passing, a reduced pressure liquid passing, and a natural liquid passing may be used.
【００１３】接触させるＦ２，６Ｐ２含有液の量として
は、Ｆ２，６Ｐ２の量が陰イオン交換材料中の陰イオン
交換基の数と同量又は少なくなることが好ましい。The amount of the F2,6P2-containing liquid to be brought into contact is preferably such that the amount of F2,6P2 is equal to or less than the number of anion exchange groups in the anion exchange material.
【００１４】このようにしてＦ２，６Ｐ２を吸着させた
陰イオン交換材料を必要に応じて洗浄した後、一価の金
属のアルカリ塩を含む溶出液で溶出する。一価の金属と
しては、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム等
のアルカリ塩が挙げられ、特にナトリウム、カリウムが
好ましい。After the anion exchange material on which F2 and 6P2 have been adsorbed is washed as necessary, it is eluted with an eluate containing a monovalent metal alkali salt. Examples of the monovalent metal include alkali salts such as lithium, sodium, potassium, and cesium, and sodium and potassium are particularly preferable.
【００１５】また、アルカリ成分としては、水酸基が好
ましく、本発明に使用する塩としては、水酸化ナトリウ
ム又は水酸化カルシウムが特に好ましい。The alkaline component is preferably a hydroxyl group, and the salt used in the present invention is particularly preferably sodium hydroxide or calcium hydroxide.
【００１６】本発明においては、溶出液にこれらの塩が
少なくとも一種が含まれていればよく、複数が含まれて
いてもよいし、また、その他の塩が含まれていてもよい
が、塩濃度が高くなる（複数の塩が含まれると）と、こ
れらの塩を除去する操作に手間がかかるので好ましくな
い。In the present invention, it is sufficient that the eluate contains at least one of these salts, more than one of them may be contained, and other salts may be contained. When the concentration is high (when a plurality of salts are contained), the operation for removing these salts is troublesome, which is not preferable.
【００１７】溶出液としては、このような一価の金属の
アルカリ塩を含有するものであれば特に限定されるもの
ではなく、水溶液、リン酸、イミダゾール、ヘペス、酢
酸、グリシン等の緩衝液、有機溶媒との混合溶液等を用
いることができる。The eluate is not particularly limited as long as it contains such a monovalent metal alkali salt, and may be an aqueous solution, a buffer solution such as phosphoric acid, imidazole, hepes, acetic acid, glycine, etc. A mixed solution with an organic solvent or the like can be used.
【００１８】溶出液の一価の金属のアルカリ塩の濃度と
しては、１〜５００ｍＭであることが好ましく、特に１
０〜１００ｍＭであることが好ましい。The concentration of the monovalent metal alkali salt in the eluate is preferably from 1 to 500 mM, more preferably from 1 to 500 mM.
Preferably it is 0-100 mM.
【００１９】本発明において、一価の金属のアルカリ塩
の溶液の代わりに中性塩の溶液を用いるとＦ２，６Ｐ２
を溶出するには数百ｍＭ〜数Ｍの濃度の溶液を用いるこ
とが必要となり、このため、脱塩操作が困難になる。ま
た、二価以上の金属塩を利用すると溶出中にＦ２，６Ｐ
２が析出してしまう。In the present invention, when a solution of a neutral salt is used instead of a solution of an alkali salt of a monovalent metal, F2,6P2
It is necessary to use a solution having a concentration of several hundred mM to several M in order to elute, which makes the desalting operation difficult. In addition, when a divalent or higher metal salt is used, F2,6P
2 precipitates.
【００２０】このようにして精製されたＦ２，６Ｐ２の
溶出液は、電気透析や逆浸透膜等により容易に脱塩を行
うことができる。また、凍結乾燥等を行うことにより粉
末状で得ることができる。The eluate of F2,6P2 thus purified can be easily desalted by electrodialysis, reverse osmosis membrane or the like. Further, it can be obtained in a powder form by freeze-drying or the like.
【００２１】[0021]
【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。Next, the present invention will be described in detail with reference to examples.
【００２２】参考例１（ＰＦＫ２の精製） ＰＦＫ２組み換え酵母サッカロミセス・セレビジエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）ＢＪ２１６８／ｐＡＢ１０
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５２１０）をグルコース（石津製薬
社製、品番０３６−００６４）２重量％、カザミノ酸
（日水製薬社製、品番０５８３４）０．５重量％、アミ
ノ酸非含有窒素源（ＤＩＦＣＯ社製、品番０９１９−１
５−３）０．６７重量％、Ｌ−ロイシン（石津製薬社
製、品番０１２−４０２１）３０ｍｇ／リットル、Ｌ−
トリプトファン（石津製薬社製、品番０１５−３３１
１）３０ｍｇ／リットルを含む培地（ｐＨ５．２）２０
リットルに植菌し、３０℃で３０リットルジャーファー
メンターを用いて培養した。この培養液２０リットル
を、ガラクトース（石津製薬社製、品番０１２−３３０
３）２重量％、カザミノ酸０．５重量％、アミノ酸非含
有窒素源０．６７重量％、Ｌ−ロイシン３０ｍｇ／リッ
トル、Ｌ−トリプトファン３０ｍｇ／リットルを含む培
地（ｐＨ５．２）４００リットルに加え、３０℃で５０
０リットルジャーファーメンターを用いて２４時間培養
することにより４．２Ｋｇの菌体を得た。Reference Example 1 (Purification of PFK2) PFK2 recombinant yeast Saccharomyces cerevisiae (Sa
ccharomyces cerevisiae) BJ2168 / pAB10
(FERM P-15210) was composed of 2% by weight of glucose (manufactured by Ishizu Pharmaceutical Co., Ltd., product number: 036-0064), 0.5% by mass of casamino acid (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., product number: 05834), and a nitrogen source containing no amino acid (manufactured by DIFCO) , Part number 0919-1
5-3) 0.67% by weight, L-leucine (manufactured by Ishizu Pharmaceutical Co., Ltd., product number 012-4021) 30 mg / liter, L-leucine
Tryptophan (Ishizu Pharmaceutical Co., Ltd., product number 015-331)
1) Medium containing 30 mg / liter (pH 5.2) 20
The mixture was inoculated to 1 liter and cultured at 30 ° C. using a 30 liter jar fermenter. Twenty liters of this culture solution was added to galactose (Ishizu Pharmaceutical Co., product number 012-330
3) 400% of a medium (pH 5.2) containing 2% by weight, 0.5% by weight of casamino acid, 0.67% by weight of an amino acid-free nitrogen source, 30 mg / L of L-leucine and 30 mg / L of L-tryptophan. 50 at 30 ° C
By culturing for 24 hours using a 0-liter jar fermenter, 4.2 Kg of cells were obtained.
【００２３】次に、得られた菌体２００ｇをバッファー
Ａ〔５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（石津製薬社製、品番
３２５−２０７０）、２０ｍＭのＫＣｌ（石津製薬社
製、品番０３４−５２８３）、２ｍＭのβ−メルカプト
エタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、石津製
薬社製、品番０４３−０４６１）、２ｍＭのＥＤＴＡ
（石津製薬社製、品番０４２−０６２１）を含む、ｐＨ
７．５〕５００ミリリットルに懸濁し、この懸濁液をＤ
ＹＮＯ−ＭＩＬＬ破砕機（ｔｙｐｅ ＫＤＬ、シンマル
エンタープライゼス社製）と直径０．２５ｍｍのガラス
ビーズ（シンマルエンタープライゼス社製）を用いてガ
ラスビーズ破砕をした。得られた菌体破砕液のＰＦＫ２
活性は７５ユニットであった。この菌体破砕液に高分子
凝集剤（ユニフロッカーＵＦ−３０４、ユニチカ社製）
の１．５重量％溶液を、破砕液量の１２％相当分を加え
た。５分間撹拌した後、この液を遠心分離（４℃、５
分、８０００ｒｐｍ）し、上清を回収した。得られた上
清をデアエセファロースＦＦ（DEAE-SepharoseFF、ファ
ルマシア製）及びブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（Blue
-Sepharose CL-6B、ファルマシア製）を直列につないだ
カラムに充填した後、バッファーＡのＫＣｌ濃度を２Ｍ
にした溶液により、ＰＦＫ２を溶出した。この時のＰＦ
Ｋ２活性は８ユニットであり、ＰＦＫ１の活性は検出限
界以下であった。Next, 200 g of the obtained cells were added to buffer A [50 mM Tris-HCl (manufactured by Ishizu Pharmaceutical Co., Ltd., product no. 325-2070), 20 mM KCl (manufactured by Ishizu Pharmaceutical Co., product no. β-mercaptoethanol (mercaptoethanol, manufactured by Ishizu Pharmaceutical Co., product number 043-0461), 2 mM EDTA
PH (including Ishizu Pharmaceutical Co., Ltd., part number 042-0621)
7.5] in 500 ml, and suspend this suspension in D
Glass beads were crushed using a YNO-MILL crusher (type KDL, manufactured by Shinmaru Enterprises) and glass beads having a diameter of 0.25 mm (manufactured by Shinmaru Enterprises). PFK2 of the obtained cell lysate
The activity was 75 units. A polymer flocculant (UniFlocker UF-304, manufactured by Unitika Ltd.) is added to the cell lysate.
Was added in an amount corresponding to 12% of the volume of the crushed liquid. After stirring for 5 minutes, the solution was centrifuged (4 ° C., 5
8000 rpm), and the supernatant was recovered. The obtained supernatant was subjected to DEAE-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) and Blue Sepharose CL-6B (Blue
-Sepharose CL-6B, manufactured by Pharmacia) was packed in a column connected in series, and the KCl concentration of buffer A was increased to 2M.
The PFK2 was eluted by the above solution. PF at this time
The K2 activity was 8 units, and the activity of PFK1 was below the detection limit.
【００２４】参考例２（Ｆ２，６Ｐ２の酵素合成） ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（石津製薬社製、品番３２
５−２０７０）、２０ｍＭのＭｇＣｌ2 （石津製薬社
製、品番０１３−３０４３）、１５ｍＭのＡＴＰ（シグ
マ社製、品番Ａ−５３９４）、１０ｍＭのＦ６Ｐを含む
反応液（ｐＨ９．０）５０ミリリットルに、参考例１で
精製したＰＦＫ２を５０ミリユニット／ミリリットルと
なるように加えて３０℃で反応を行った。反応開始から
４．５時間後、反応液を煮沸して反応を停止した結果、
反応収率４１％でＦ２，６Ｐ２が合成されていた。Reference Example 2 (enzymatic synthesis of F2,6P2) 50 mM Tris-HCl (manufactured by Ishizu Pharmaceutical Co., product number 32)
5-2070), a reaction solution (pH 9.0) containing 20 mM MgCl 2 (manufactured by Ishizu Pharmaceutical Co., Ltd., product number 013-3043), 15 mM ATP (manufactured by Sigma Co., product number A-5394), and 10 mM F6P. Then, PFK2 purified in Reference Example 1 was added thereto at a concentration of 50 milliunits / milliliter and reacted at 30 ° C. After 4.5 hours from the start of the reaction, the reaction solution was boiled to stop the reaction.
F2,6P2 was synthesized at a reaction yield of 41%.
【００２５】このＦ２，６Ｐ２合成液をＨＣｌによりｐ
Ｈを８．０に調節し、１ｍＭのＮＡＤＨ（ベーリンガー
社製、品番１２８０２３）を添加した。これに、１０ユ
ニット／リットルのアルドラーゼ（ベーリンガー社製、
品番１０２６５２）、２０ユニット／リットルのトリオ
ースリン酸イソメラーゼ（ベーリンガー社製、品番１０
９７５４）及び１０ユニット／リットルのグリセロール
−３−リン酸脱水素酵素（ベーリンガー社製、品番１２
７７５２）を添加し、２８℃で反応を行った。反応開始
から１時間後、反応液を煮沸して反応を停止した。反応
停止後、反応液中のＦ１，６Ｐ２の量を測定したところ
Ｆ１，６Ｐ２は検出されなかった。The F2,6P2 synthesis solution is p-poured with HCl.
H was adjusted to 8.0, and 1 mM NADH (Boehringer, product number 128023) was added. 10 units / liter aldolase (Boehringer,
Product number 102652), 20 units / liter triosephosphate isomerase (Boehringer, product number 10)
9754) and 10 units / liter of glycerol-3-phosphate dehydrogenase (Boehringer, part number 12)
7752) and reacted at 28 ° C. One hour after the start of the reaction, the reaction solution was boiled to stop the reaction. After the reaction was stopped, F1,6P2 was not detected when the amount of F1,6P2 in the reaction solution was measured.
【００２６】活性炭（ダイヤホープＳ８０、三菱化学社
製）１０ミリリットルをカラムに充填し、蒸留水１００
ミリリットルで洗浄した後、蒸留水で２倍に希釈した上
記のＦ１，６Ｐ２を分解除去した反応液をアプライし、
蒸留水２００ミリリットルでＦ２，６Ｐ２含有液を溶出
することにより、反応溶液からアデノシン、ＡＴＰ、Ａ
ＭＰなどのアデノシンを有する化合物を除去した。A column was filled with 10 ml of activated carbon (Dia Hope S80, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and distilled water 100
After washing with milliliters, the reaction solution obtained by decomposing and removing the F1,6P2 diluted twice with distilled water was applied,
Elution of the F2,6P2-containing solution with 200 ml of distilled water allows adenosine, ATP, A
Compounds with adenosine such as MP were removed.
【００２７】実施例１ 参考例２で得られたＦ２，６Ｐ２含有液を陰イオン交換
樹脂ダイアイオン ＷＡ１０（ＤＩＡＩＯＮ ＷＡ１
０、三菱化学社製、ＯＨ型）４ミリリットルを充填した
カラムにアプライし、０．０２ＭのＮａＣｌ水溶液（石
津製薬社製）１００ミリリットルでＦ２，６Ｐ２を溶出
した。その結果を図１に示す。図１は、陰イオン交換樹
脂ダイアイオン ＷＡ１０を用いてＦ２，６Ｐ２含有液
を精製したときの結果を示す図であり、縦軸に濃度を、
横軸にフラクションナンバーを示している。図１から、
ＮａＣｌの水溶液を用いることにより低い濃度の溶液で
も効率よくＦ２，６Ｐ２とＦ６Ｐを分離することができ
るとがわかる。Example 1 The F2,6P2-containing liquid obtained in Reference Example 2 was used as an anion exchange resin DIAION WA1.
0, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, OH type) was applied to a column packed with 4 ml, and F2,6P2 was eluted with 100 ml of 0.02 M NaCl aqueous solution (manufactured by Ishizu Pharmaceutical Co., Ltd.). The result is shown in FIG. FIG. 1 is a diagram showing the results when the F2,6P2-containing solution was purified using the anion exchange resin DIAION WA10.
The horizontal axis indicates the fraction number. From FIG.
It can be seen that the use of an aqueous solution of NaCl enables efficient separation of F2, 6P2 and F6P even with a solution having a low concentration.
【００２８】このようにして精製したＦ２，６Ｐ２含有
液を、逆浸透膜（ＮＴＲ−７２５０、日東電工社製）を
用いて電気伝導度が１０ｍｍｈｏになるまで蒸留水で脱
塩濃縮した。脱塩作用に要した時間は２時間であった。
この濃縮液を、４℃で５０時間凍結乾燥することにより
４３ｍｇのＦ２，６Ｐ２の粉末を得た。The F2,6P2-containing liquid thus purified was desalted and concentrated with distilled water using a reverse osmosis membrane (NTR-7250, manufactured by Nitto Denko Corporation) until the electric conductivity became 10 mmho. The time required for the desalting action was 2 hours.
This concentrated solution was freeze-dried at 4 ° C. for 50 hours to obtain 43 mg of F2,6P2 powder.
【００２９】比較例１ 溶出液として０．５ＭのＮａＨＣＯ3 水溶液を用いる以
外は実施例１と同様にしてＦ２，６Ｐ２の精製を行った
ところ、逆浸透膜による脱塩操作に４０時間かかった。
以上の結果から、溶出液をＮａＨＣＯ3 の水溶液からＮ
ａＣｌの水溶液に代えることにより脱塩に要する時間を
約２０分の１に短縮することができることがわかる。Comparative Example 1 Purification of F2,6P2 was carried out in the same manner as in Example 1 except that a 0.5 M NaHCO 3 aqueous solution was used as an eluate. It took 40 hours to perform a desalting operation using a reverse osmosis membrane.
From the above results, the eluate was converted from an aqueous solution of NaHCO 3 to N
It can be seen that the time required for desalination can be reduced to about one-twentieth by replacing the aqueous solution of aCl.
【００３０】[0030]
【発明の効果】本発明によれば、Ｆ２，６Ｐ２を塩濃度
の低い溶液を用いて精製することが可能となるので，の
ちの脱塩に要する時間を非常に短縮することができる。According to the present invention, it is possible to purify F2,6P2 using a solution having a low salt concentration, so that the time required for subsequent desalting can be greatly reduced.
【図１】陰イオン交換樹脂ダイアイオン ＷＡ１０を用
いてＦ２，６Ｐ２を精製したときの結果を示す図であ
る。FIG. 1 is a diagram showing the results when F2,6P2 was purified using anion exchange resin DIAION WA10.
Claims (1)
液から陰イオン交換材料を用いてフルクトース−２，６
−ビスリン酸を精製するに際し、溶出液として一価の金
属のアルカリ塩の溶液を用いることを特徴とするフルク
トース−２，６−ビスリン酸の精製方法。1. A fructose-2,6-bisphosphoric acid-containing solution, which is prepared by using an anion exchange material and fructose-2,6-bisphosphate.
-A method for purifying fructose-2,6-bisphosphoric acid, which comprises using a solution of an alkali salt of a monovalent metal as an eluent when purifying bisphosphoric acid.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9134192A JPH10324693A (en) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | Purification of fructose-2,6-bisphosphate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9134192A JPH10324693A (en) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | Purification of fructose-2,6-bisphosphate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10324693A true JPH10324693A (en) | 1998-12-08 |
Family
ID=15122594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9134192A Pending JPH10324693A (en) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | Purification of fructose-2,6-bisphosphate |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10324693A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100395252C (en) * | 2006-06-12 | 2008-06-18 | 南京工业大学 | Method for continuous separation of fructose-1,6-diphosphate |
-
1997
- 1997-05-23 JP JP9134192A patent/JPH10324693A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100395252C (en) * | 2006-06-12 | 2008-06-18 | 南京工业大学 | Method for continuous separation of fructose-1,6-diphosphate |
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