JPH10319011A - 複数の分析物の同時検出デバイス及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 複数の分析物を、同時に短時間で同定・定量
する。 【解決手段】 基体ならびに多数の独立した反応部位を
有して成り、各反応部位は基体に共有結合的に固定され
たリガンドを有し、反応部位間の基体表面は分析物に対
して不活性である複数の分析物のアッセイを実施するた
めの固体状態のデバイス。このデバイスは、基体の表面
を活性化させた後、基体表面の独立した部位に、リガン
ドのアレイを適用する方法により得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は複数、好ましくは多
数の分析物又は分析対象（以下、多重分析物ともいう）
の同時検出のためのデバイスに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、構造的に異なる複数の分析物は、
酵素イムノアッセイ、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、酵素的な方法もし
くは比色法等の特殊な方法によって分析されてきた。こ
れらの方法は、主として、一分析物を、一試験方法で分
析するものである。

【０００３】また、分析のオートメーション化は、バッ
チ式あるいはランダム式アクセスアナライザーに集中し
てきた。それらのアナライザーでは、いくつかに分けた
試験サンプルについてそれぞれ異なる試験方法を逐次利
用して、多重分析がなされる。従って、この方法では、
複数個の試験キットからなるパックを必要とする。加え
て、いくつかの異なるタイプの装置、例えば、臨床化学
アナライザー、ＨＰＬＣ、ＧＣＭＳ（ガスクロマトグラ
フ質量分析計）、自動イムノアッセイ装置、もしくは原
子吸収（又は原子吸光）装置が分析に際して必要とされ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】多重分析物分析システ
ムは、試験サンプルに含まれるいくつかの分析物の同時
分析を行う手段を具備すべきである。そして、かかる分
析は、試験サンプルに含まれる個々の分析物を同定し、
かつ各分析物の定量を可能にする結果を提供すべきであ
る。多重分析物分析の方法は、しばしば提案されるもの
の、一般的に、それらは分析物の同定及び定量について
満足のいく結果を与えないものである。

【０００５】多重分析物分析システムにおいて、典型的
な基体は、それぞれが異なる結合リガンドをもつ個々の
試験反応部位を複数有する。試験サンプルは、各反応ゾ
ーンと接触し、その後、分析物を同定するために所定の
検出技術が実行される。ここで重要なことは、実行され
た検出方法が、各分析物の定量も可能にするものである
ということである。

【０００６】多重分析物用の、生物学的に活性なリガン
ドをもつ空間的に分離したエリアのアレイ（または配
列）を基体上に形成するために、フォトリソグラフィー
（写真平版）技術を利用した方法が最も一般的になされ
てきた。基体は光活性（または光不安定）なリンカーで
覆われる。理論的には、このリンカーは、適当な波長の
光の照射後にのみ、結合リガンドに対して反応的になる
べきである。空間的な分離は、基体に物理的なマスク
（通常はクロムから製造される）を置くことによって可
能となる。マスクの孔のパターンが基体上の結合領域の
パターンを決定する。

【０００７】各々の生物学的なリガンドが固定されるた
めの一般的な手順は、第一の部位へ光を照射する；固定
されるべき第一のリガンドとともに照射した基体をイン
キュベーションする；ゆるく結合したリガンドを除去す
るために洗浄する；光の照射によって活性化した未反応
部位をブロックする；第二の生物学的リガンドが固定さ
れるべき領域へ光を照射する；続いて、第一のリガンド
を固定したのと同じ方法を繰り返すである。空間的な分
離は、光の照射部位の制御、即ちレーザーから得られる
干渉性紫外線光源を用いて照射部位を制御するか、もし
くは多数の物理的マスクと非干渉性光源と用いることに
よって基体上に現れる。この方法によれば、多数の生物
学的リガンドを固定するためには、多くの時間が必要と
なる。フォトリソグラフィ−を利用する方法においても
う一つ不利な点は、高価な物理的マスクあるいはレーザ
ー光源を必要とすることである。さらに、非特異的結合
が高い割合で存在することも挙げられる。

【０００８】例えば、アリールアジド、フルオロアリー
ルアジド及びベンゾフェノンを使用する場合、高い割合
の非特異的結合が伴ってきた。高い割合の非特異的結合
は、アッセイバックグラウンドを高くし、多重分析物ア
ッセイの各々のダイナミックレンジを著しく減少させる
ことに繋がる。非特異的結合は、主として、活性化され
ていない光活性なリンカー表面に、分子がイオン間相互
作用やファンデルワールス力等を通じて消極的（または
受動的）に吸着するために生じるものである。

【０００９】Ｗ０−Ａ−９５１６２０４は、高い割合の
非特異的結合と関連した問題を減少させるフォトリソグ
ラフィー技術を利用した方法について記述している。こ
の方法において、表面にリンクする分子はアビジンであ
り、光活性な分子はフォトビオチンもしくはその誘導体
である。非特異的結合が減少したと記載されている一
方、この技術は依然として上述したような時間を消費す
る一連の処理を必要とする。即ち、各々異なるリガンド
が固定されるために光の照射、結合、ブロッキング、お
よび洗浄ステップが基本的に必要であると仮定すれば、
２０の異なる生物学的リガンドの固定に計８０のステッ
プが必要とされる。

【００１０】空間的な分離は消極的な吸着によっても達
成される。例えば、ＵＳ−Ａ−５４３２０９９は、イオ
ン間相互作用、疎水性相互作用およびファンデルワール
ス力の組合せによる基体表面へのリガンドの結合を開示
している。消極的な吸着プロセスは、温度、イオン強度
及びｐＨの変化ならびに使用される基体の種類に左右さ
れるため、その結合プロセスを制御することはより困難
である。この方法の大きな欠点は、生物学的アッセイの
洗浄ステップ、インキュベーションステップの間に一部
の弱く固定されたリガンドが脱離しやすいことであり、
それによってイントラアッセイおよびインターアッセイ
の精度が低下することである。

【００１１】多くの刊行物で紹介されている架橋剤（cr
oss-linker）またはリンカーはグルタルアルデヒドであ
る。このリンカーは、タンパク質の機能を変えるような
タンパク質間の架橋をするという傾向を含め、多くの欠
点を呈する。さらなる欠点は、結合過程が還元ステップ
を含むことである。そのステップは、時間のかかるもの
であり、かつ、還元剤として例えばナトリウムシアノボ
ロハイドライドを用いた場合には、潜在的に非常に危険
なものとなる。ヘテロ二官能性リンカーはこれまでもず
っと使われてきたが、多くの場合、このリンカーは、結
合されるプロテインにおいて遊離スルフヒドリル基を必
要とする。このことは、固定前にタンパク質の変性を必
要とするものである。

【００１２】多重分析物アッセイにおいては、定性的及
び定量的な結果を提供することが望ましい。多重分析物
アッセイは、例えば抗生物質ついて行われる。これら
は、主として、微生物抑制（または阻害）アッセイに基
づくものである。かかるアッセイでは、サンプル中のあ
る抗生物質がバクテリアの成長を阻害し、サンプル中に
存在する抗生物質の濃度に比例してバクテリアが除去さ
れたゾーン（a zone of clearance）を形成する。し
かしながら、この方法はその抗生物質を同定するための
「標示」を全く提供することができず、また、この方法
では抗生物質の濃度を正確に決定することができない。
微生物抑制方法は、非常に遅く、方法が終了するには数
日要する。

【００１３】高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
もしくはガス／液体クロマトグラフ質量分析（ＧＣＭＳ
／ＬＣＭＳ）のような化学的スクリーニング手法によっ
て、ペニシリン、スルホンアミド、アミノグリコシド、
テトラサイクリン等の各々の抗生物質のグループの構造
的な相違／極性の差に適合しようとする試みもある。加
えて、クロマトグラフ法においては、要求される検出限
界が達成されるようなシグナル対ノイズの比となるため
に、手間を要するサンプル調製を必要とする。

【００１４】市販の多重分析物用デバイスには、Ｔｒｉ
ａｇｅ（Clinical Chemistry 38(9):1678-1684 (199
2)参照）及びＡｄｖｉｓｏｒ（Clinical Chemistry 3
9(9):1889-1903 (1993)参照）が含まれる。これらのデ
バイスは定性分析にのみ適している。

【００１５】Ｔｒｉａｇｅなるデバイスは、人の尿に含
まれている７種の有害薬物を同時検出するパネルであ
る。各デバイスは、一つの尿サンプルを分析することが
できるだけである。分析の終了時に、オペレーターは、
赤いバーの有無により、各薬物を特定するテストゾーン
を視覚的に検査する。アッセイ手順のすべてのステップ
は、オペレーターによって手動で行われる。試験結果の
ハードコピーも得られない。

【００１６】Ａｄｖｉｓｏｒなるデバイスの適用対象
は、Ｔｒｉａｇｅなるデバイスのそれと同様である。Ａ
ｄｖｉｓｏｒなるデバイスは、５種類の異なるクラスの
有害薬物をスクリーンする。このデバイスは凝集アッセ
イ原理を利用してサンプルを分析し、各薬物に対して個
々のチャンネルを用いる。アッセイ手順のすべてのステ
ップは、オペレーターによって実行される。陰性のサン
プルは凝集粒子を含み、陽性薬物サンプルは凝集しない
粒子のパターンを与える。

【００１７】生物学的用途に用いるバイオセンサー／微
細加工されたデバイスの大半には、基体としてシリコン
（silicon）が採用されている。その他のデバイスに
は、ガラスや石英の基体が用いられている。シリコン
は、明確な結晶面をもつ高度に制御された結晶構造を有
する。シリコン基体が均一であるがゆえに、多重分析物
試験デバイスの発展にとって、シリコンの選択は理想的
なものとなっている。

【００１８】しかしながら、シリコンのような色の濃い
基体は、いわゆる黒体効果を与える。蛍光による検出の
場合、発蛍光団は特定の波長の光を用いて励起される
が、色の濃い基体は入射する励起光エネルギーを吸収す
る場合もあり、その結果、発蛍光団から放出される光は
減少することになる。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、複数
（例えば多数）の分析物のアッセイ（または検定）を実
施するデバイスは、基体、複数（例えば多数）の不連続
な（または独立した）反応部位を含み、各反応部位は基
体に共有的に結合したリガンドを有し、反応部位の間の
基体表面は分析物に対して不活性である。従って、本発
明は固体状態の複数の分析物用デバイスを提供し、これ
は非特異的結合を殆どまたは実質的に全く示さない。

【００２０】本発明のデバイスは、適当な基体の表面を
活性化し、基体表面の不連続な部位にリガンドのアレイ
（または配列）を適用、例えば形成することによって製
造される。必要に応じて、その他の活性部位はブロック
してよい。リガンドは水系で適用（または塗布）しても
よく、他の部分は疎水性であることが好ましい。リガン
ドは、リンカー（linker、例えばつなぐ機能を有するも
の）を介して基体に結合されていてもよい。特に、活性
化された表面を、オルガノシラン、二官能性リンカーお
よびリガンドと順に反応させることが好ましい。

【００２１】本発明の一形態として、微細加工されたシ
リコンもしくはセラミックの基体（または基材）に共有
的結合的に固定化されたオルガノシランとの間で、非常
に効率のよいカップリング反応を提供するために、二官
能性リンカー、例えばヘテロ二官能性リンカーが使用さ
れる。その結果、生物学的なリガンドは、多重分析物の
アレイに固定され得る。

【００２２】本発明は、多数の個々の試験試薬キット及
びいくつかの種類の装置を必要とせず、それにより、一
つのサンプルで多重分析物の同時検出が可能となる。本
発明は、広い範囲の化学物質または化学的性質の同時検
出を提供することが可能な一つに統合された分析デバイ
スを提供する。加えて、試験試薬は、特別な分析パネル
を形成するように、組み合わされた形態で提供される。

【００２３】本発明では、化学的に活性化された基体
に、リガンドを含む液体を微量液体ディスペンサーで供
給することによって、複数の生物学的なリガンドが、空
間的な境界が定められたパターンのスポットもしくはラ
インに固定される。生物学的なリガンドは、基体に共有
結合的に付着させられる。生物学的なリガンドのカップ
リング効率によれば、化学反応は数分以内で完了し得
る。この固定処理は、生物学的なリガンドがその生物学
的な活性を、短期間でも長期間でも保持することを確保
できる。

【００２４】本発明は、また、多重分析物の形態におい
て、幅広い分析物を同時検出するための統合された分析
装置システムを提供する。この分析装置システムは多数
の末端使用者にとって便利なように設計され、各試験サ
ンプルから多重分析物の同定と定量を可能にしている。
好ましい分析装置システムは、Ｘ−Ｙ方向の並進台と、
サンプル取り扱い（ハンドリング）ユニット、液体取り
扱い／流れ制御手段、温度が制御される暗箱、ＣＣＤカ
メラ、及び画像処理ソフトウェアの組み合わせからな
る。並進台は、分析処理の各段階において、デバイスを
位置決めするために、１０μmの精度を達成するよう
に、ステッパー電動機と組み合わせて用いられてもよ
い。

【００２５】

【発明の実施の形態】本発明のデバイスで使用される基
体は、例えば、シリコン、石英、ガラスもしくはセラミ
ックからなるものであってもよい。セラミックの基体
（例えば、酸化アルミニウム）は、蛍光的検出及び化学
発光的検出法をともに首尾よく用いることができること
から、シリコンの基体の優れた代替物を提供する。セラ
ミック材料に関する結晶学は、このような基体を直ちに
選択することを示していないので、これらの知見は予期
されなかったものである。

【００２６】セラミックの基体は、所定の範囲の粒状物
寸法、例えば粒径（例えば、１〜３０μm）を有するき
めを与えるように製造されてもよい。本発明で用いられ
るセラミックの基体の好ましい粒子寸法は２０μm以
下、より好ましくは１０μm以下である。この小さな粒
子寸法は、表面の均一性をより向上させ、ひいては、質
の高い生物学的アッセイの実施を可能にする。セラミッ
クの基体のその他の重要な特徴には、表面トポグラフィ
ー（例えば微細構造）公差（surface topographytoler
ance）、多孔度、真空気密、および水のゼロ吸収が含ま
れる。

【００２７】好ましいセラミック材料は、粒子寸法（例
えば粒径）が４〜８μmの範囲にある９４％のアルミナ
（Ａｌ₂Ｏ₃）を含むものである。この材料は、研削した
場合、トポグラフィー公差が０．６〜０．８μmの表面
トポグラフィー（または凹凸）を有する。表面の均一性
は研磨（ポリッシング）処理によって向上させることが
でき、変動量が０．４〜０．５μmの表面が得られる。
更なる改良は、ラップ仕上（lapping）及び研磨処理に
よって達成され、その場合、変動量は０．０５〜０．１
μmとなる。

【００２８】あるセラミックの基体の性能は、粒子寸法
の特色に左右されることが見出された。優れたアッセイ
性能は、８μmまでの粒子寸法、例えば４〜８μmの粒子
寸法のセラミック材料を用いたときに得られることがわ
かった。そして、これより大きな粒子寸法の材料を用い
たアッセイの結果はそれほど満足のいくものではないこ
とがわかった。粒子寸法約１μmのセラミックの基体に
ついても評価したが、４〜８μmの粒子寸法の基体を用
いた場合よりもよい結果は得られなかった。非常に小さ
い粒子で構成されるセラミックの場合、コストがかなり
高いため（約５倍）、その使用はそれほど有利ではな
い。

【００２９】シリコン基体は、例えば１００nmの酸化物
膜の場合は、例えば許容誤差が±２nmであるような正確
な厚みの酸化物膜を用いて製造される。酸化物フィルム
の厚みは、５０〜５００nmであって、好ましくは２００
nm以下、より好ましくは１００nmの範囲であってよい。

【００３０】基体は、微細加工された固体状態のデバイ
スの一部分として形成されてもよく、獣医学的もしくは
臨床的診断へ応用できる広範なパネル試験に用いられ
る。各固体状態の試験デバイスは、反応領域のアレイ
（配列物）を有する。各反応領域は、個々の分析物に対
して特異的である。この反応領域は、スポット(spot)、
チャンネルまたは溝、ディンプルまたはくぼみ、ピッ
ト、ウェルまたは井戸状のもの、チャンバーまたは小室
の形状であってもよい。反応領域は、生物学的な分子を
基体の上に固定することによって形成される。

【００３１】一般に、本発明のデバイスは、面積が１cm
²までである。各反応部位の面積は、一般に１mm²以下で
ある。

【００３２】固体である基体は、ポート（ports）、チ
ャンバー、ウェル、ディンプル等の複雑なネットワーク
を提供するように加工されることが好ましい。チャンネ
ルもしくはウェル内に柱状部（pillar）を形成すること
も好ましいことがある。このような凸凹は、結合した生
物学的なリガンドと試験試薬との間の相互作用する表面
積を最大限にするのに役立ち得、その結果、競合的免疫
学的検定（イムノアッセイ）及びサンドイッチイムノア
ッセイ等のためのインキュベーション時間が大幅に減少
する。

【００３３】シリコンもしくはセラミックの基体にディ
ンプルもしくはチャンネルを設ける代わりに、あるいは
それらに加えて、基体の表面は、ナノリットルからミリ
リットルの混合用チャンバー／リザーバー（貯蔵部）／
チャンネルを設けるために、微細加工されてもよい。例
えば、シリコンの表面は、酸化膜を形成するために、ま
ず酸化される。それから、所望のパターンが形成される
ようにフォトレジストの膜を付着する。酸化膜の上にパ
ターンが形成された後、フォトレジストが取り除かれ
る。それから、例えばフッ化水素を使用して、シリコン
にエッチングが施され、そして酸化膜が取り除かれる。
最後に、シリコンウェハー全体上に酸化フィルムが均一
に形成される。

【００３４】図１において、その過程が例示されてい
る。ステップ（i）では、シリコンウェハー（１）が酸
化され、酸化膜（２）が形成される。；ステップ（ii）
では、フォトレジストの膜（３）が塗布される。；ステ
ップ（iii）では、光が照射されて酸化膜にパターンが
形成される。；ステップ（iv）では、フォトレジストが
取り除かれる。；ステップ（ｖ）では、ウェハー（１）
にエッチング処理が施される。；ステップ（vi）では、
酸化フィルムが取り除かれる。；ステップ（vii）で
は、連続した酸化フィルム（２ａ）が再形成される。

【００３５】生物学的なリガンドは共有結合的に固定さ
れることが好ましい。消極的な吸着相互作用を利用して
もよいが、それは温度、イオン強度及びｐＨの変化に左
右され、また、ある場合には、インキュベーション及び
洗浄ステップの間に弱く結合したリガンドが解離するこ
ともあり得、そのことは、アッセイの再現性低下の原因
となる。固定化された後も、生物学的リガンドは最大限
の活性を有することが当然に望ましい。

【００３６】化学的に活性化させる前に、基体の表面は
十分に洗浄されるべきである。洗浄の最初のステップ
は、アルカリ性洗剤中での超音波処理による表面洗浄を
含むことが好ましく、続いて、二回脱イオン処理された
水で十分に洗浄することが望ましい。その後、基体は、
クロム酸溶液で処理される。クロム酸溶液は表面をさら
に浄化するとともに、図２に示すように表面のエポキシ
ド基（またはエポキシ基）を開環させる役割をも果た
す。エポキシド基は、他の方法によって開環されてもよ
く、例えば１時間の超音波処理によっても開環される。

【００３７】このようにして形成される表面の水酸基
は、その後、派生物の形成（または誘導化）に利用され
る。例えば、図３に示すように、一連の反応では、オル
ガノシラン、次いで二官能性リンカー、例えばヘテロ二
官能性架橋剤Ｚ−Ｒ−Ｙが使用されて高い反応性を有す
る中間体が生成され、最後に官能性を有するリガンドが
使用されてそれが共有結合的に固定される。

【００３８】より詳しくいえば、一般式（ＲＯ）₃Ｓｉ
−（ＣＨ₂）_n−Ｘで表わされるオルガノシランにおい
て、各ＲはＣＨ₃もしくはＣＨ₂ＣＨ₃のようなアルキル
基、炭化水素基またはその他のヒドロカルビル基であ
り、ｎは整数（例えば１〜１８）であり、Ｘはエポキシ
シクロヘキシル基、ＮＨ₂、ＣＨＯ、ＯＨ、ＳＨ、ｐ−
クロロベンジル基、ｍ−クロロベンジル基、Ｂｒ、Ｃ
ｌ、−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂、２，３−エポキシ
プロポキシル基、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓまたはｐ
−クロロスルホニルフェニル基等の官能基である。これ
らのオルガノシランは、生物学的分子とともに共有結合
を形成することが可能な反応性末端基か、またはＮＨ₂
のように反応性がより小さい部分のいずれかを提供す
る。反応性が小さな部分は、適当な末端基を形成させる
ために、二官能性リンカーを用いた活性化処理がさらに
必要とされる。求電子性の末端官能基を有するオルガノ
シランは、二官能性架橋剤を用いた活性化処理を必要と
しない。なぜならば、生物学的なリガンドは、それが有
する求核性基によって共有結合的に固定され得るからで
ある。

【００３９】オルガノシランが求核性基を有する場合に
は、あまたある二官能性架橋剤のいずれもが、生物学的
な分子もしくはリガンドが共有結合的に固定され得るよ
うな非常に反応性の高い化学基を形成するために使用さ
れ得る。本発明には、化学的に活性化された基体を大量
生産する際に用いることが可能で、かつ生物学的な分子
もしくはバインダーリガンドが共有結合的に固定される
前において長期間の保存が可能なほど十分に安定してい
る二官能性リンカーを使用することが含まれる。好まし
いリンカーは、通常の周囲条件（例えば常圧下）では不
活性であると同時に、固定されるべき生物学的なリガン
ドの官能基と極めて短い時間（一般には１０分未満）で
共有結合を形成するほど十分な反応性を有するものであ
る。

【００４０】二官能性リンカーは、例えば、ホスゲン、
チオホスゲン、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボナー
ト（Ｎ，Ｎ−disuccinimidyl carbonate）、キシリレ
ンジアミン、１，６−ジアミノヘキサン、１，１２−ジ
アミノドデカン、１，６−ジイソシアナトヘキサン、
１，１２−ジイソシアナトドデカン、１，４−フェニレ
ンジチオイソシアナート、シアヌル酸クロリド、テレフ
タルアルデヒド、ｐ−ニトロベンゾイルクロリド、スル
ファニル酸、２−フルオロメチルピリジニウムｐ−トル
エンスルホナート、３−アミノフェニルボロン酸、ｐ−
ブロモフェニルボロン酸、ジ炭酸ジエチル（diethyl p
yrocarbonate）、クロロギ酸エチル、ｐ−ブロモアニリ
ン、ｐ−ブロモフェニルヒドラジド、ｐ−ブロモベンズ
アルデヒド、ｐ−ブロモベンズアルデヒドの１，２−エ
チレングリコール、Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾー
ル、テレフタロイルクロリド、エピクロロヒドリン、
１，４−ジヨードベンゼン、１，４−ジブロモベンゼ
ン、もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドの誘導体
（例えば、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ブロモ安息香酸、
ｐ−ブロモフェニル酢酸、ｐ−ブロモエチル安息香酸、
ｐ−ブロモメチル安息香酸、ｐ−ホルミル安息香酸、ｐ
−ヒドロキシメチル安息香酸、ｐ−ホルミル安息香酸の
１，２−エチレングリコール、ｐ−ブロモジヒドロケイ
皮酸またはｐ−ヒドロキシジヒドロケイ皮酸から誘導さ
れるもの、例えばエステル）であればよい。光活性架橋
剤を、求核性もしくは求電子性の末端基を有するオルガ
ノシランと反応させるために用いてもよい。そのような
架橋剤は、例えば、ｐ−アミノベンゾフェノンまたはｐ
−アジド安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、例
えば、ｐ−アジド安息香酸とＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドのエステルである。

【００４１】二官能性リンカーを使用する代わりに、も
しくはそれに加えて、ラテックス粒子の層を共有結合的
に固定することが有利である。ラテックス粒子の直径
は、５００nm以下であることが好ましく、１５０nm以下
であることがより好ましい。ラテックス粒子は、−ＣＨ
₂Ｃｌ、−ＣＨＯ、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−クロロ
スチリル基、−Ｎ＝ＮＨ、−ＮＨ−ＮＨ₂、もしくは−
ＮＨ₂等の官能基を有していてもよい。ラテックス粒子
は、濃度約０．５〜１％ w/vで、適当なオルガノシラ
ンにより変性された基体とともにインキュベーションし
てよい。このとき、先に述べた二官能性リンカーは存在
していてもいなくてもよい。

【００４２】図４は、ラテックスの固定に関する二種の
反応スキームを示したものである。いずれも、ラテック
スの固定後、第二のリンカーでラテックスを活性化して
生物学的分子を固定させてもよいし、あるいは、例えば
抗体を共有的に直接固定させてもよい。

【００４３】ポリスチレンラテックス粒子を使用する代
わりに、シラン化された基体に既に固定されたポリエチ
レングリコールの誘導体に生物学的なリガンドを共有的
に固定してもよい。例えば、エポキシまたはカルボニル
イミダゾールのような求電子的な基を二つ有するポリエ
チレングリコール（以下、ＰＥＧという場合がある）の
誘導体は、選択した基体上の、アミノプロピルトリエト
キシシラン（aminopropyltriethoxysilane:ＡＰＴＥ
Ｓ）のように末端基に−ＮＨ₂を有するシランと反応す
る。適当な一連の反応の一例を図５に示す。

【００４４】また、生物学的なリガンドを直接シラン層
に共有的に固定させることも有利な場合がある。それに
より、シランを高分子材料または二官能性リンカーで活
性化させる必要がなくなる。その場合、オルガノシラン
は、生物学的なリガンドに存在する化学基、例えばＮＨ
₂、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ＝ＮＨ₂等によって求核攻撃を受け
やすいものでなければならない。生物学的なリガンドの
直接的な結合に適したオルガノシランは、ハロゲン化
物、エポキシ、イソシアナト、アルデヒド、トシラート
またはトシルのような官能基を有していてよい。この反
応は、図６に示されている。図６中、Ｅはオルガノシラ
ンに存在する求電子的な基である。Ｅの例としては、Ｂ
ｒ、Ｃｌ、−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂、−ＮＣＯ、−Ｃ
ＨＯ、ｐ−クロロスルホニルフェニルが挙げられる。

【００４５】グリシドキシのような求電子的な基を有す
るオルガノシランはまた、オルガノシランのメトキシも
しくはエトキシの攻撃に利用できる求核性の基が存在し
ないために、シラン化処理の間、重合しにくいという利
点を有する。従って、基体の表面は、重合したオルガノ
シランを含まない。

【００４６】基体表面での化学反応は、表面の化学的な
官能基と、固定されるべき生物学的な分子において立体
的に好ましい位置に存在する適当な化学的な基との間の
共有結合が迅速に形成されるために、空間的な分離を達
成する手段を提供している。生物学的な分子は、微量液
体ディスペンサーによって、一つ一つの小滴の形で、も
しくは、線を形成する連続小滴の形で基体の表面に供給
されることが好ましい。ディスペンサーから取り出され
る液滴の体積は、約１〜１００nlであり、好ましくは５
０nl以下であり、例えば１０nl程度でもよい。共有結合
形成の迅速性は、共有的な固定が、基体の表面に供給さ
れた小滴もしくは小滴で形成された線が蒸発する前に、
数分間で達成されるほどのものである。液体の小滴もし
くは線は、正しい位置に供給されなければならず、その
許容差は±２０μmである。

【００４７】特に、リガンドを水溶液または分散液とし
て供給する場合には、ディスペンサーから供給された液
体の小滴もしくは線の側方拡散を防止するために、表面
を疎水性にすることが望ましい。表面が疎水性であるこ
とは、優秀なスポット品質、また、再現性向上に寄与す
る。また、表面を疎水性にすることにより、共有的に固
定されるべき生物学的な分子の単位表面積あたりのスポ
ット数を多くすることができる。

【００４８】本発明は、紫外線もしくは物理的マスクを
使用せずに、空間的に分離した生物学的なリガンドのス
ポットの形成を可能にしたことで、常用のフォトリソグ
ラフィーに関連する問題を解決したものである。先に述
べたとおり、空間的な分離は、微量液体供給（ディスペ
ンス）技術によって達成される。固定された生物学的な
リガンドの側方拡散を除き空間的に不連続な領域におい
て生物学的なリガンドが高い効率でカップリングするの
を確保するためには、共有的なカップリング反応の迅速
性が重要である。

【００４９】リガンドの結合後、基体上の未反応の化学
的部位は、例えば当業者に知られているブロッキング分
子でブロックされてもよい。ブロックに適した分子に
は、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミン
等のタンパク質、もしくはグリシンやグルタミン等のよ
り小さい分子量のブロッカーが含まれる。

【００５０】光活性リンカーもまた使用され得る。例え
ば、基体の表面のオルガノシランを、暗所で光活性リン
カー（例えば、ベンゾフェノン、アリールアジド等）と
反応させる。それから、表面は生物学的なリガンドで所
望のようにスポットされ、そして短時間の紫外線照射、
もしくはより長い時間の可視光線照射の後で共有的な付
着が達成される。基体の表面に残っている領域は、紫外
線もしくは可視光線の存在下で、先に述べた分子に類似
するブロッカーを用いてブロックされる。

【００５１】基体−固定された生物学的な分子間は、安
定化させてもよく、安定化の方法としては、例えば、ト
レハロースのような糖の溶液中で短時間（例えば、１時
間）インキュベーションし、その後、３７℃で１６時間
乾燥させる方法が挙げられる。続いて、安定化された基
体は、箔製の小袋の中に乾燥剤とともに密封・保存され
る。固定化された生物学的な分子は６〜１２ヶ月以上安
定であり、例えば、２〜８℃で保存された場合には例え
ば２年もしくはそれ以上安定である。

【００５２】デバイスは、試験試薬の混合の効率を制御
する特徴を組み込んだ種々の異なるキャリヤーに配置し
てよい。液体試験試薬の流れは、毛管引力、遠心力、真
空力、電気浸透的な流れによって達成される。電気浸透
的な流れは、バルブを必要とせず、可動機械部品は使用
されない。

【００５３】閉鎖されたチャンネルを、微細加工された
表面にガラス板を接着することによって形成してもよ
い。その場合、生物学的な分子はガラス板を接着する前
に共有的に固定される。例えば陽極接着のように、多く
の接合処理は、生物学的な分子を破壊するかもしれない
温度の上昇を伴う。従って、接着技術は固定された生物
学的な分子を変性させないものでなければならない。一
つの適した方法は間接接着である。間接接着方法の例と
して、ウェハーを例えばエポキシ接着剤のような適当な
接着剤でガラス板に接着する方法が挙げられる。

【００５４】デバイスは、それから適当なキャリヤーに
据え付けてよい。種々の適当なそのようなキャリヤーを
図７及び図８に示す。例えば、図８に示されたキャリヤ
ーの寸法は、４８．６２mm×４８．６２mmであり、この
キャリヤーは内径が１０mm、外形が１２．８２mmのウェ
ルを有する。各ウェルの中心間の距離は１５．３６mmで
ある。

【００５５】デバイスは、試験試薬、サンプル等の混合
をより促進する特徴を有していてもよい。そのようなデ
バイスは図９に示されている。このデバイスでは、試薬
添加部位（１１）、試薬が流れるチャンネル（１２）、
試験反応部位（１３）が含まれている。

【００５６】図１０に示すデバイスは、試薬貯蔵部（２
１）、供給マニホールド（２２）、試薬供給チャンネル
試験部位（２３）及び廃液貯蔵部（２４）を含む。図１
１に示すデバイスは、同様のパーツを有する４−チャン
ネル試験構造のデバイスである。

【００５７】本発明は、広範な分子量の分析物、多様な
構造を有する分析物および極性の異なる分析物を同時に
定量検出するための完全に統合されたシステムを提供す
る。分析物用パネルは臨床／獣医科的診断もしくは薬物
のスクリーニングに適したものである。

【００５８】分析物に応じて、結合リガンドは適宜に選
択される。リガンドは、当該分野の技術及び知見を参照
して選択することができる。本発明においてアッセイす
るのに適した分析物は以下のとおりである。

【００５９】（１）抗生物質：例 テトラサイクリン、
スルホンアミド、イオノホア、アミノグリコシド、ペニ
シリンまたはフルオロキノロン （２）ホルモン：例 黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロ
ラクチン（ＰＬ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ） （３）心臓病の標識（markers of cardiac damag
e）：ミオグロビン、カルボニックアンヒドラーゼ、ト
ロポニンＩ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ、ＣＫ−
ＭＢ（クレアチンキナーゼ ＭＢ サブユニット）、タ
ンパク質結合脂肪酸またはトロポニンＴ （４）伝染病の標識 （５）アレルギーの標識 （６）有害薬物 （７）酵素 （８）ウイルス （９）ヌクレオチド、及び （10）ペプチド

【００６０】例えば、一つのパネルは、スルホンアミド
系抗生物質の検出に用いられる。本発明は、例えば、２
０までの異なるスルホンアミド系抗生物質の同時定量的
同定の方法を提供する。その他の例には、心臓病、妊
性、伝染病パネルが含まれる。

【００６１】本発明は、構造が類似しない場合がある、
例えば２０の分析物を同時に検出することを可能にする
ものである。アッセイされるサンプルの母体は、血清、
血漿、尿、胆汁、便、組織、水、食品、全血及び食物で
ある。アッセイに必要なサンプルの量は極めて少なく、
一般的には一分析物につき１．５μl未満である。酵素
ラベルされた抗体、酵素ラベルされたハプテン、蛍光ラ
ベルされた抗体または蛍光ラベルされたハプテンのよう
な試験試薬は、すべて一つの試薬貯蔵部に含まれていて
もよく、このことは液体取り扱いの必要性を大幅に減少
させる。

【００６２】黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、プ
ロラクチン、甲状腺刺激ホルモン等のサンドイッチアッ
セイにおいて、サンプルは、アッセイ緩衝液と一緒に加
えられ、短い時間、一般に３０分以下、好ましくは１０
分以下インキュベートされる。洗浄ステップの後、ラベ
ルされた検出抗体の混合物が加えられ、一定時間インキ
ュベートされる。この時間は先と同様に、３０分以下、
より好ましくは１０分以下である。続いて、結合されて
いないラベルを取り除くためにデバイスは洗浄され、シ
グナルが定量される

【００６３】あるアッセイのためには、リューマチ因子
干渉のような潜在的な干渉を取り除くために、微細加工
されたデバイスの中に機構または手段を組み込んでもよ
い。リューマチ因子の除去は、例えば、試験サンプルを
反応領域に接触させる前に、これを免疫グロブリンが固
定された領域に接触させることによって達成される。

【００６４】さらに、ヒト−抗マウス−抗体（ＨＡＭ
Ａ）の干渉が例として挙げられる。これらの抗体は、モ
ノクローナルマウス抗体を利用するアッセイを実施する
際に、重大な問題を生じさせる。従来から実施されてい
る解決法は、その問題となる抗体を中和させるために高
価な添加剤を試験試薬に加えることである。本発明では
試験サンプルが反応領域に達する前に、試験サンプル
を、微細加工されたデバイス上に設けられた問題となる
抗体を除去するための領域と接触させることによって、
ＨＡＭＡの干渉を有利に取り除くことができる。

【００６５】より一般的に言えば、不純物質と結合する
リガンドを、デバイス上の一部分に設けてもよい。これ
は、例えばチャンネルのように、デバイスの表面で境界
が定められた領域内で展開が許容される場合に特に有用
である。干渉成分を取り除き得ることは、得られる結果
の正確さを高める。

【００６６】検出ラベルはデンドリマー（dendrimer）
分子の表面に固定されてもよい。デンドリマー分子は本
質的に高分子であり、小さな成分分子（building mole
cules）が繰り返し結合することによって合成されるも
のである。それらは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓによって販売されており、ＮＨ₂またはＣＯＯＨの
ような末端官能基を選択して種々の分子量のものを入手
することが可能である。そして、ヘテロ二官能性リンカ
ーまたは二官能性リンカーは、常用の化学的な結合方法
と組み合わされて使用され、その結果、検出ラベル複合
体が形成される。例えば、β−アゴニスト、アナボリッ
クステロイドもしくは抗生物質等の小さなハプテン分子
の場合、小さなデンドリマー、好ましくは表面基が１６
以下のものを、一般的に表面基が６４以上の大きなデン
ドリマーに結合させることが好ましい。１０００ダルト
ン以下の低分子量のハプテンは小さなデンドリマー上の
化学的な基に結合され、その後、検出ラベルが共有的に
付着する。デンドリマーの複合体は透析もしくはゲル透
過クロマトグラフィーによって精製されてもよい。

【００６７】特定の試験パネルにふさわしいように、試
験試薬は複数の成分を含む。例えば酵素ラベルされた抗
体、蛍光ラベルされた抗体、ラテックスが固定された抗
体、デンドリマー抗体−発蛍光団複合体、デンドリマー
抗体−酵素複合体、酵素ラベルされたハプテン、蛍光ラ
ベルされたハプテン等である。試験パネルは、非常に多
様であり、所定の臨床診断もしくは獣医科的診断に基づ
いて、適当なものを選ぶことができる。例えば、一つの
好ましいパネルは、伝染病を検出するためのものであ
る。ここでいう伝染病とは、例えば、肝炎、ＨＩＶ、梅
毒等である。他のパネルは、妊性ホルモン、心臓病の標
識、アレルギーの標識、タンパク質等の検出に用いられ
る。臨床的なパラメーターと同様に、残留している薬物
を検出することも可能である。

【００６８】本発明によれば、抗生物質のような化合物
を個々に同定することも可能である。例えば、定量的な
結果は、表面面積１ｃｍ²のデバイスにおいて２０まで
の抗生物質について、概して数分の時間枠の中で得られ
る。その感度は、ＨＰＬＣ／ＧＣＭＳ法のそれよりも優
れており、常用の単一パラメーター酵素免疫学的検査の
それに匹敵するものである。この方法は、アナボリック
ステロイド、β−アゴニスト、β−ブロッカー、殺虫
剤、治療用薬物等についても可能である。

【００６９】分析については、化学発光、生物発光、蛍
光の利用することが適当であり得る。蛍光及び化学発光
のどちらも測定するために、検出システムに電荷結合素
子（ＣＣＤ）カメラが備え付けられていることが望まし
い。簡単に言えば、ＣＣＤカメラは、微細加工されたデ
バイスの試験エリアから発せられる光信号を捕集し、こ
れを相対光単位（ＲＬＵｓ、relative light units）
に変換する。

【００７０】蛍光をベースとする検出システムでは、ラ
ベル発蛍光団のための適当な光学的フィルターを使っ
て、直接蛍光を測定してもよい。

【００７１】好ましい化学発光試薬は、ルミノールであ
る。これは、４３３〜４４５nmの波長で分析され得る。
化学発光は、また、１，２−ジオキセタンを用いてアル
カリ性ホスファターゼでラベルした生物学的な分子の検
出に基づいて観察され得る。

【００７２】分析物の検出を容易にするために、本発明
では、ＣＣＤカメラを用いた化学発光検出システムを用
いることが好ましい。化学発光を伴う光反応によって発
せられる光の波長における捕集効率を向上するために、
バックイルミネートカメラ（バック照明カメラ）を用い
ることが好ましい。ルミノールの場合、光の波長は約４
３３〜４４５nmである。

【００７３】システム全体は、パーソナルコンピュータ
ーで操作されてもよい。この場合、特別に設計されたプ
ログラムが、Ｘ−Ｙ方向に動くテーブル、ディスペンサ
ーユニット、試料のハンドリング、温度コントロール、
インキュベーションの時間及びＣＣＤカメラを制御す
る。図１２〜１４は、それらのシステムの構成を示して
いる。

【００７４】図１２は、２つの制御ユニット（３１）
（３２）を有するパーソナルコンピューター（ＰＣ）の
相互作用の概要を示している。ユニット（３１）は、Ｃ
ＣＤ画像システム（３３）との間で情報をやりとりして
いる。ユニット（３２）は、ディスペンサーユニット
（３４）及びサンプルトレイを備えたＸ−Ｙ並進台（３
５）との間で情報をやりとりしている。

【００７５】図１３は、Ｘ−Ｙ方向の並進台の概要を示
したものである。この図は、リニアアクチュエーター
（４２）に据え付けられたサンプル台（４１）を示して
いる。Ｘ−Ｙ方向の移動は、各駆動装置（４５）（４
６）に連結されたステッパー電動機（４３）（４４）の
制御下で行われる。移動は、「ホームポジション」セン
サー（４７）（４８）によって制限される。

【００７６】ラベルされた生物学的な分子及びラベルさ
れていないある生物学的な分子の光に対する感度によっ
ては、アッセイを光が存在しない条件下で行う必要があ
る場合がある。光が存在しないようにするためには、光
が漏れないようにケースを形成するとよい。また、満足
のいくアッセイ精度及びアッセイの正確さを保証するた
めに、光が漏れない環境は、温度制御されることが好ま
しい。温度制御の許容差は、±０．２℃、より好ましく
は±０．１℃である。

【００７７】図１４の（Ａ）は装置の斜視図、図１４の
（Ｂ）は部分平面図、図１４の（Ｃ）は一部破断側面図
である。特に、図１４の（Ａ）は試薬貯蔵容器（５
１）、光を漏らさないドア（５２）、取り外し可能なカ
バー（５４）を備えたカメラ本体（５３）を示してい
る。カメラの大部分は箱のケーシングの外側にあってよ
いが、レンズはケーシングの開口の中にある。

【００７８】図１４の（Ｂ）は、サンプルトレイ（５
５）上のサンプルの概略を示している。この概略では、
廃物を入れるエリア（５６）および画像読み取りエリア
（５７）が示されている。カメラ（５３）は、これらの
エリアの上に位置される。図１４の（Ｃ）は、容器（５
１）に加えて、カメラ（５３）、Ｘ−Ｙ方向に動くテー
ブル（４１）、ステッパー電動機（４３）、ディスペン
サーポンプ（５８）を示している。

【００７９】図１４に示されているシステムの設計は、
３×３のサンプルラックホルダーを基準とするものであ
り、２０のホルダーを同時に保持できるように設計され
ている。このことは、もし、微細加工された各基体１cm
²あたりに２０の個別の反応部位が設けられれば、一つ
のサンプルについて同時に合計３６００の分析が実施さ
れることを意味している。もしくは、１８０のサンプル
が同時に２０の異なる試験パラメーターについて分析さ
れることを意味している。

【００８０】上述のように、分析物はラベルされてもよ
い。リガンドもまたラベルされてもよく、部分的な占有
による分析を可能にしている。以下の実施例は、本発明
を説明するものである。

【００８１】

【実施例】

実施例１ スルホンアミドアッセイ この実施例では、それぞれが一つのスルホンアミドに対
して特異的である１２種類の抗体を、化学的に変性され
た表面を有する平坦な酸化アルミ製セラミック基体の離
れた領域に対する接触相互作用によって、共有結合的に
固定させた。複数の分析物のアッセイは、競合的イムノ
アッセイ方式により実施した。

【００８２】より詳しく説明すると、ここでは１cm×１
cmのセラミック基体を使用した。この基体を、アルカリ
性洗浄剤（ＲＢＳ３５、５％ v/v）を用いて超音波に
よって洗浄し、さらに２回脱イオン処理された水で洗浄
し、それから６Ｍの塩酸の中に１６時間放置した。続い
て、この基体を、クロム酸を入れた超音波浴の中に１時
間置いて洗浄した。

【００８３】それから、この基体を、２回脱イオン処理
した水及びアセトンを用いて十分に洗浄し、１２０℃で
乾燥機内で２時間乾燥させた。この前処理の後、無水ト
ルエンに濃度１０％（v/v）になるように溶解させたＹ
−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（Ｙ−glyc
idoxypropyl trimethoxysilane）、１．２５g/Ｌの４
−ジメチルアミノピリジン及び１％（v/v）のトリエチ
ルアミンを用いて基体をシラン化させた。この混合物
を、４時間還流した後一晩室温にて放置した。次いで、
この基体を、トルエンとアセトンで洗浄した後、１２０
℃で４時間キュアリングした。

【００８４】キュアリングの後、基体を容器に入れ、ス
ルホンアミド抗体をスポッティングする前まで、室温下
で保存した。そして、スルホンアミド抗体を、ＢＩＯＤ
ＯＴＸＹ３０００ディスペンサーを用いてスポットし
た。アッセイされる１２種類のスルホンアミドは、スル
ファドキシン（ＳＤ）、スルファメチゾール（ＳＭ
Ｚ）、スルファクロロピリダジン（ＳＣＰ）、スルファ
メトキシピリダジン（ＳＭＰ）、スルファメラジン（Ｓ
Ｍ）、スルファピリジン（ＳＰ）、スルフイソキサゾー
ル（ＳＳ）、スルファチアゾール（ＳＴ）、スルファメ
タジン（ＳＭＴ）、スルファキノキサリン（ＳＱ）、ス
ルファジメトキシン（ＳＤＭ）及びスルファジアジン
（ＳＺ）である。

【００８５】各スルホンアミド抗体は、約２０nlをディ
スペンスした。１cm²の基体に１２個の不連続なエリア
を形成した１２種のスルホンアミド抗体を、３７℃で２
時間インキュベートした。続いて、基体を２％（w/v）
のカゼインを含むｐＨ７．２のリン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄し、同緩衝溶液中で２〜８℃の温度下で放置
してブロックした。そして、ＰＥＧ３００を０．０５％
（v/v）含むＰＢＳで洗浄した後、デバイスをキャリヤ
ーに置いた。

【００８６】複数のスルホンアミドを含む標準液２００
μlと、スルホンアミド−西洋ワサビペルオキシダーゼ
複合体のカクテル１００μlを各デバイスを含む反応ウ
ェルに適当に加え、室温で１５分間インキュベートし
た。標準液は、１２種類のスルホンアミドを、それぞれ
５、１０、５０、１００ng／ml含んでいた。

【００８７】続いて、複数のスルホンアミドが結合され
たデバイスをＰＢＳ／ＰＥＧ緩衝溶液で洗浄して余分な
試薬を取り除き、１デバイス当たり１．４mＭのルミノ
ールと９．６mＭの過酸化水素尿素を含む３００μlの化
学発光基質を加えた。各デバイスは、ＣＣＤカメラを使
用してイメージ処理された。このときの露光時間は４分
間までであった。その結果、１２種類の各スルホンアミ
ドについて標準曲線を得ることができた。１２種類の各
スルホンアミドについての検量線を図１５に示す。Ｙ軸
にプロットした％ Ｂ／Ｂo値は、スルホンアミドの濃
度がゼロである標準液から得られる相対光単位（ＲＬＵ
ｓ）に対する、Ｘ軸にｌｏｇ₁₀で示される各スルホンア
ミド標準液によりもたらされる阻害割合を％で示したも
のである。

【００８８】実施例２ ホルモンアッセイ この例では、大きな分子量を有する３つのホルモン、す
なわちプロラクチン（ＰＬ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）について多重分析物
アッセイを行った。本実施例は、サンドイッチ型イムノ
アッセイ利用した多重分析物アッセイを示す例である。
なお、これらのホルモンが同じパネルで検出される際、
問題となるような交差反応性はほとんど認められなかっ
た。

【００８９】化学的な前処理及びシラン化処理は実施例
１と同様な方法で行った。ＰＬ、ＦＳＨまたはＬＨの各
モノクローナル抗体を、約２０nlずつ、化学的に変性さ
れた基体表面に、不連続なエリアを形成するように固定
した。複数分析物アッセイは、実施例１で用いたものと
同じエポキシド表面を有するセラミック及びシリコン基
体上で実施した。

【００９０】このアッセイでは、ＬＨ／ＰＬ／ＦＳＨの
血清ベースの標準液１５０μlと希釈アッセイ緩衝液１
５０μlをデバイスに供給し、室温で１５分間インキュ
ベートした。これを洗浄した後、ＬＨ−ＨＲＰＯ（西洋
ワサビペルオキシダーゼ）複合体／ＰＬ−ＨＲＰＯ複合
体／ＦＳＨ−ＨＲＰＯ複合体を含む単一の複合体カクテ
ル３００μlを加え、１５分間インキュベートした。そ
の後、過剰な試薬を取り除くために、デバイスを洗浄
し、１．４mＭのルミノールと９．６mＭの過酸化水素尿
素を含む化学発光試薬を加えた。デバイスは、ＣＣＤカ
メラを使用してイメージ処理した。このときの露光時間
は４分間までであった。イメージ処理後、各ホルモンに
ついて標準曲線を得ることができた。

【００９１】実施例３ スルホンアミドアッセイ 実施例１と異なり、本実施例では、微細溝（マイクロチ
ャンネル）を使って複数のスルホンアミドのアッセイを
行った。デバイスは図１１に示されるものである。本実
施例では、タテ×ヨコが２mm×２mm、深さが３００μm
である容積１．２μlの試薬添加保持器（２１）と、そ
れぞれ長さが５mm、幅が２００μm、深さが１００μmで
ある容積１００nlの溝（２３）と、タテ×ヨコが１．９
mm×８．６mm、深さが３００μmである容積４．９μlの
保持器（２４）とで構成されている。

【００９２】基体表面の化学的な変性は、実施例１と同
じように行った。そして、抗体を各溝に供給し、３７℃
で２時間インキュベートした。それから、実施例１と同
じ方法で基体をブロックし、洗浄した。

【００９３】複数のスルホンアミドを含む標準液２００
μlとスルホンアミド−西洋ワサビペルオキシダーゼ複
合体１００μlを混合した。この混合液を１μlずつ、４
つの保持器にピペットで注ぎ入れ、各スルホンアミドに
対して抗体を被覆させた溝に供給した。標準液は、各ス
ルホンアミドの濃度が１０ng／mlのものと、各スルホン
アミドの濃度が１００ng／mlのものの二種類を用意し
た。

【００９４】サンプルは、毛管作用によって流れた。２
分間のインキュベーションの後、ＰＢＳ／ＰＥＧを用い
てデバイスを５回洗浄し、１．４mＭのルミノールと
９．６mＭの過酸化水素尿素を含む化学発光試薬を加え
た。

【００９５】デバイスは、ＣＣＤカメラを使用してイメ
ージ処理された。このときの露光時間は４分間までであ
った。４つのスルホンアミドについて得られた％ Ｂ／
Ｂｏの値を表１に示す。

【００９６】

【表１】

【００９７】フォトリソグラフィ−と比較した場合の本
発明の有用性は、ベンゾフェノンで処理された光活性な
基体上における生物学的分子の非特異的吸着の程度によ
って示される。その結果を表２に示す。

【００９８】

【表２】

【００９９】ここでは、抗マウス−ＨＲＰＯ複合体を使
用し、ＣＣＤカメラを用いて化学発光を検出することに
より、マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を検出した。
光が存在しない条件で反応させると、光活性なリンカー
であるベンゾフェノンを固定したシリコンもしくはセラ
ミック基体はマウスＩｇＧを結合しない。しかしなが
ら、非特異的な結合は生じている。なぜならば、紫外線
下でマウスＩｇＧ結合が行われたときに得られるグレイ
ミーン（grey mean）ＲＬＵの約８０％が消極的なな結
合相互作用に由来するといえるからである。本発明の共
有的な相互作用によって固定された生物学的な分子のア
レイは、従来の技術と明らかに異なるものである。

【０１００】共有的な付着を立証するための証拠は、以
下で説明される実施例において提供される。最初の例に
おいて、セラミック基体はＡＰＴＥＳでシラン化された
後、ビオチン−ＬＣ−スルホ−ＮＨＳと反応させた。こ
こで、ＬＣは長鎖（long-chain）を、ＮＨＳはＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドを意味する。比較のために、ＡＰ
ＴＥＳで処理していないセラミック基体を用意した。こ
の比較基体には、求核的な末端−ＮＨ₂基がないため、
ビオチンの誘導体であるスクシンイミドエステルと反応
することができない。本実施例では、これらの基体を、
アビジン−フルオレスセインイソチオシアネート（fluo
rescein isothiocyanate; ＦＩＴＣ）複合体と反応さ
せ、ＣＣＤカメラで蛍光を測定した。その結果を表３に
示す。表中、ＮＳは蛍光信号が検出されなかったことを
示している。

【０１０１】

【表３】

【０１０２】この結果は、ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳの特
異的な結合を明らかに証明している。なお、ビオチン−
ＬＣ−ＮＨＳの濃度が５００μg／mlであるときのＲＬ
Ｕ値が増加していないことから、基体に結合され得るビ
オチン−ＬＣ−ＮＨＳの最大濃度は１００μg／mlであ
るといえる。

【０１０３】さらに、ＡＰＴＥＳでシラン化されたセラ
ミック基体をジヒドラジドリンカーと反応させた例を示
す。ここでは、スルホンアミド抗体を過ヨウ素酸ナトリ
ウムで処理し、ヒドラジドリンカーに対する反応性を付
与した。比較のために、ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム緩
衝液と接触させて透析処理しただけのスルホンアミド抗
体を用意した。過ヨウ素酸ナトリウムで処理していない
ものについてのＲＬＵ値を表４に、過ヨウ素酸ナトリウ
ムで処理したものについてのＲＬＵ値を表５に示す。

【０１０４】

【表４】

【０１０５】

【表５】

【０１０６】この結果は、ヒドラジドリンカーがセラミ
ック基体表面に首尾よく結合したことを示している。過
ヨウ素酸塩で活性化させなかった比較抗体の測定結果
は、共有的に固定されたスルホンアミド抗体と比較し
て、不十分な標準曲線しか与えなかった。

【０１０７】共有的相互作用もしくは消極的相互作用に
帰する結合のパーセンテージを、表６及び表７にて比較
する。表６及び表７中、共有的相互作用はスルホンアミ
ド抗体をグリシドキシシラン表面に直接スポットしたこ
とによるものであり、消極的相互作用は抗体を、ジクロ
ロジメチルシランでシラン化された基体表面に直接スポ
ットしたことによるものである。共有的相互作用の全体
の結合に対する割合は平均８１．８％であり、スルホン
アミド抗体が共有結合していることを明らかに示してい
た。

【０１０８】

【表６】

【０１０９】

【表７】

【０１１０】これから明らかなとおり、共有結合的手法
は、消極的結合手法よりも優れた結果を与える。消極的
結合手法により得られる結果は、スルホンアミド抗体を
酸前処理することで約２倍向上させ得るが、それでもな
お共有結合的手法よりも劣っている。

【０１１１】化学的に変性されたシリコン基体及びセラ
ミック基体をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）により確認的
に分析した。各基体サンプルにつき２つの任意のエリア
からのサーベイスペクトルを記録し、これより各基体表
面の化学組成を決定した。その結果を表８に示す。表８
は、各原子の存在割合をパーセンテージ（原子％）で示
している。

【０１１２】

【表８】

【０１１３】原子組成の結果から、母体となるシリコン
及びセラミック基体はＡＰＴＥＳによってかなり良好に
変換されているといえる。また、各サンプルの２つのエ
リアにおける表面組成の良好な再現性も示されている。
ＦＩＴＣによりラベルした基体は、シリコンについては
７０％、セラミックについては７７％のラベリングを示
した。

【０１１４】次に、ダーク・シリコン基体における蛍光
測定の定量方法を、白色セラミック（酸化アルミニウ
ム）基体におけるそれと比較した例を示す。フックらが
ラングミュア（Langmuir）１９９１、Vol ７、１４２
〜１５１で示した方法によって蛍光分子（ＦＩＴＣ）を
取り除いた後、各基体に共有的に結合している蛍光分子
（ＦＩＴＣ）についてのＣＣＤ測定からＲＬＵ結果を定
量方法について比較した。その結果を表９に示す。

【０１１５】

【表９】

【０１１６】基体からＦＩＴＣラベルを取り除いた後、
ＣＣＤカメラで信号を検出するという手法を用いて得た
蛍光ラベルの定量分析の結果は、セラミック基体から検
出される信号がシリコン基体のそれの１０００倍である
にもかかわらず、シリコン基体上にはセラミック基体よ
りも明らかに多くのＦＩＴＣが存在しているということ
を示している。

【０１１７】この現象は、別の実施例によっても認めら
れた。この実施例では、シグナルを検出するためにプロ
ラクチン検出抗体に蛍光ラテックス粒子を結合したシリ
コン及びセラミック基体上でプロラクチンのアッセイを
行った。アッセイの結果、得られたＲＬＵ値を表１０に
示す。いずれも、露光時間は２０秒間である。

【０１１８】

【表１０】

【０１１９】この測定結果も、蛍光検出法を用いた場合
には、セラミック基体がシリコン基体よりも優れた結果
を与えることを示している。さらに言うなれば、蛍光検
出で問題となるシリコンのダークボディ効果（dark bo
dy effect）は、検出方法に化学発光を利用することで
解決され得る。例えば、シリコン基体及びセラミック基
体の両方において、化学発光を利用してＦＳＨをアッセ
イしたとき、シリコン基体の露光時間をセラミック基体
の露光時間の２倍にすると、シリコン基体から検出され
るＲＬＵ値はセラミック基体から検出される値と同じに
なった。

【０１２０】

【発明の効果】本発明によれば、構造が異なる複数の分
析物を、高い精度で、同時にしかも短時間で、同定・定
量することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 一様でない基体の表面を形成する過程を示す
ものである。

【図２】 基体の表面で基が活性化される過程を示すも
のである。

【図３】 基体の表面にリガンドが共有的に固定される
過程を示すものである。

【図４】 基体の表面におけるラテックスの使用の過程
を示すものである。

【図５】 基体の表面にポリエチレングリコールの誘導
体を介してリガンドが共有的に固定される過程を示すも
のである。

【図６】 基体の表面にリガンドが共有的に固定される
過程を示すものである。

【図７】 本発明のデバイスのキャリヤーの一例を示す
ものである。

【図８】 本発明のデバイスのキャリヤーの一例を示す
ものである。

【図９】 本発明のデバイスの一例を示すものである。

【図１０】 本発明のデバイスの一例を示すものであ
る。

【図１１】 本発明のデバイスの一例を示すものであ
る。

【図１２】 本発明のデバイスを分析するのに適当なシ
ステムの構成の一例を模式的に示すものである。

【図１３】 本発明のデバイスを分析するのに適当なシ
ステムの構成の一例を模式的に示すのものである。

【図１４】 本発明のデバイスを分析するのに適当なシ
ステムの構成の一例を示すものである。

【図１５】 実施例１で得た１２種類のスルホンアミド
の検量線である。

【符号の説明】

１．．．シリコンウェハー、２．．．酸化膜、２
ａ．．．酸化フィルム、３．．．フォトレジストの膜、
１１．．．試薬添加部位、１２．．．チャンネル、１
３．．．試験反応部位、２１．．．試薬貯蔵部、２
２．．．供給マニホールド、２３、試薬供給チャンネル
試験部位、２４．．．廃液貯蔵部、３１、３２．．．制
御ユニット、３３．．．ＣＣＤ画像システム、３
４．．．ディスペンサーユニット、３５．．．Ｘ−Ｙ並
進台、４１．．．サンプル台、４２．．．リニアアクチ
ュエーター、４３、４４．．．ステッパー電動機、４
５、４６．．．駆動装置、４７，４８．．．ホームポジ
ションセンター、５１．．．試薬貯蔵容器、５２．．．
光を漏らさないドア、５３．．．カメラ、５４．．．取
り外し可能なカバー、５５．．．サンプルトレイ、５
６．．．廃物を入れるエリア、５７．．．画像読み取り
エリア、５８．．．ディスペンサーポンプ。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/551 Ｇ０１Ｎ 33/551 33/552 33/552 33/68 ＺＮＡ 33/68 ＺＮＡ 33/74 33/74 (72)発明者 スティーブン・ピーター・フィッツジェラ ルド イギリス、ノーザン・アイルランド、ビー ティ29・４キューワイ、カウンティ・アン トリム、クラムリン、ダイヤモンド・ロー ド、アードモア、ランドックス・ラボラト リーズ・リミテッド内 (72)発明者 ジョン・ビクター・ラモント イギリス、ノーザン・アイルランド、ビー ティ29・４キューワイ、カウンティ・アン トリム、クラムリン、ダイヤモンド・ロー ド、アードモア、ランドックス・ラボラト リーズ・リミテッド内 (72)発明者 ロバート・イバン・マッコネル イギリス、ノーザン・アイルランド、ビー ティ29・４キューワイ、カウンティ・アン トリム、クラムリン、ダイヤモンド・ロー ド、アードモア、ランドックス・ラボラト リーズ・リミテッド内 (72)発明者 エル・オアード・ベンチク イギリス、ノーザン・アイルランド、ビー ティ29・４キューワイ、カウンティ・アン トリム、クラムリン、ダイヤモンド・ロー ド、アードモア、ランドックス・ラボラト リーズ・リミテッド内

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 基体ならびに複数の独立した反応部位を
   有して成り、各反応部位は基体に共有的に結合したリガ
   ンドを有し、反応部位間の基体表面は分析物に対して不
   活性である、複数の分析物のアッセイを実施するための
   固体状態のデバイス。
2. 【請求項２】 基体の表面が一様でなく、そのことによ
   って、リガンド−分析物の相互作用から増幅した信号を
   得ることが可能である請求項１に記載のデバイス。
3. 【請求項３】 反応のためのチャンネル、畝状部、柱状
   部、スポット、チャンバー、ディンプル、ウェルまたは
   ピットのアレイを有して成る請求項２に記載のデバイ
   ス。
4. 【請求項４】 基体がセラミック、ガラス、石英もしく
   はシリコンでできている請求項１〜３のいずれか一項に
   記載のデバイス。
5. 【請求項５】 面積が１cm²以下である請求項１〜４の
   いずれか一項に記載のデバイス。
6. 【請求項６】 各反応部位の面積が１mm²以下である請
   求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス。
7. 【請求項７】 基体の表面を活性化し、基体表面の独立
   した部位に、リガンドのアレイを適用する方法により得
   られる請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
8. 【請求項８】 方法は、他の活性領域をブロックする過
   程を更に含む請求項７に記載のデバイス。
9. 【請求項９】 他の領域を疎水性にすることを方法は含
   み、リガンドを水において適用する請求項７もしくは請
   求項８に記載のデバイス。
10. 【請求項１０】 リガンドの適用は、活性化された表面
    にオルガノシランを接触させる第一の過程を含む請求項
    ７〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
11. 【請求項１１】 オルガノシランが、一般式（ＲＯ）₃
    Ｓｉ−（ＣＨ₂）_n−Ｘ（Ｒ：炭化水素基、ｎ：整数、
    Ｘ：官能基）で表わされるものである請求項１０に記載
    のデバイス。
12. 【請求項１２】 オルガノシランへの生物学的リガンド
    の共有的な付着を容易にするために二官能性架橋剤の使
    用を方法は含む請求項１０もしくは請求項１１に記載の
    デバイス。
13. 【請求項１３】 求核性もしくは求電子性末端基をもつ
    オルガノシランと反応させるために、光活性架橋剤を使
    用する請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のデバイ
    ス。
14. 【請求項１４】 ポリスチレンラテックス粒子、デンド
    リマーもしくはポリエチレングリコール等、リガンドの
    共有的な付着を促進する基を含む高分子により誘導され
    る表面にリガンドを固定化することによって得られる請
    求項１〜１３のいずれか一項に記載のデバイス。
15. 【請求項１５】 存在が分析物のアッセイを阻害する物
    質を結合するリガンドをさらに含む請求項１〜１４のい
    ずれか一項に記載のデバイス。
16. 【請求項１６】 複数の分析物のアッセイのための、請
    求項１〜１５のいずれか一項に記載のデバイスの使用。
17. 【請求項１７】 分析物が結合している及び／又は結合
    していない部位のアレイを観察し、その情報とリガンド
    を相関することを含む請求項１６に記載の使用。
18. 【請求項１８】 検出される光の波長が４５０nm以下で
    ある化学発光明反応で発光した光の検出に適したバック
    イルミネートタイプの電荷結合素子でイメージを得るこ
    とを含む請求項１６もしくは請求項１７に記載の使用。
19. 【請求項１９】 分析物が、抗生物質、ホルモン、心臓
    病の標識、伝染病の標識、アレルギーの標識、薬物、酵
    素、ウイルス、ヌクレオチド及びペプチドから選ばれる
    請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の使用。
20. 【請求項２０】 分析物が、全血、血清、血漿、尿、
    便、胆汁、組織または食物の試料中に存在する請求項１
    ６〜１９のいずれか一項に記載の使用。
21. 【請求項２１】 請求項１〜１５のいずれかに記載のデ
    バイスと、並進台、試料ハンドリングシステム、液体試
    薬供給システム、温度が制御された暗箱、ＣＣＤカメ
    ラ、及び画像処理装置を有して成る複数の分析物の分析
    用システム。