JPH1029930A - Production of closed vesicle - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To prepare a closed vesicle, used for a medicine such as an antitumor agent or an agent, etc., for diagnosis and having high safety by rehydrating a closed vesicle comprising a dehydrated micellar particle or a dehydrated amphiphilic micellar double layer under specific conditions. SOLUTION: This closed vesicle is prepared by rehydrating a closed vesicle comprising a dehydrated micellar particle or a dehydrated amphiphilic micellar double layer under low-temperature conditions, especially 10-0 deg.C when rehydrating the closed vesicle with a rehydrating solution. The closed vesicle can be applied to the one in which a medicine or an agent for diagnosis is introduced. The closed vesicle can especially be applied to an antitumor agent such as adriamycin, daunomycin or vinblastine and a pharmaceutically permissible salt and a derivative thereof as a medicine. A liposome can be cited as the closed vesicle. Furthermore, the liposome to which an antibody or a polyethylene glycol or both are applied is preferred.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は脱水ミセル粒子又は
脱水両親媒性ミセル二重層からなる閉鎖小胞を特定の条
件で再水和する工程を含む閉鎖小胞の製造方法および該
方法を用いて得られる閉鎖小胞に関する。The present invention relates to a method for producing closed vesicles, which comprises a step of rehydrating closed vesicles comprising dehydrated micelle particles or a bilayer of dehydrated amphiphilic micelles under specific conditions, and using the method. It relates to the obtained closed vesicles.

【０００２】[0002]

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】リポソ
ームは脂質ミセル二重層からなる閉鎖小胞である。この
脂質相に脂溶性物質を、内部水相に水溶性物質を封入で
き、低分子化合物のみならず蛋白質などの高分子物質ま
で担持できること、さらに生体適合性が高いことから、
薬物、タンパク質、核酸などのドラッグ・デリバリー・
システム（ＤＤＳ）用キャリアーとして数多くの研究が
なされている。近年、薬剤の封入による毒性低減、血中
滞留性の改変に加え、リポソーム表面修飾によるターゲ
ティング機能等が付与されたリポソームの実用化研究も
進展している。BACKGROUND OF THE INVENTION Liposomes are closed vesicles composed of lipid micelle bilayers. This lipid phase can contain fat-soluble substances and the internal aqueous phase can contain water-soluble substances, can carry not only low molecular weight compounds but also high molecular weight substances such as proteins, and because it has high biocompatibility,
Drug delivery of drugs, proteins, nucleic acids, etc.
Numerous studies have been made as carriers for system (DDS). In recent years, research on practical use of liposomes provided with a targeting function or the like by modifying the surface of liposomes, in addition to reducing toxicity and altering blood retention properties by encapsulating drugs, has been progressing.

【０００３】しかしながら、本来リポソームのミセル構
造は熱力学的に安定性が高いとはいいがたく、実用化に
際して長期保存法の確立が不可欠である。長期安定性確
保を目的としてエヴァンスらは特開昭５３−１４２５１
４号公報でリポソーム溶液から水を除去し安定な乾燥脂
質状態とした後、必要に応じて水溶液を加える（再水和
する）ことでリポソームを再生する「脱水法」を開示し
た。これにより乾燥粉末形態で長期保管の可能性が示さ
れたが、さらに脱水に伴うリポソームの凝集融合、内封
物の漏れを低減化すべくその後の改良検討がなされてき
た。However, the micelle structure of liposomes is not necessarily said to have high thermodynamic stability, and it is essential to establish a long-term storage method for practical use. For the purpose of ensuring long-term stability, Evans et al.
No. 4 discloses a "dehydration method" in which liposomes are regenerated by removing water from the liposome solution to obtain a stable dry lipid state and then adding (rehydrating) an aqueous solution as needed. This has shown the possibility of long-term storage in the form of a dry powder, but further improvements have been studied to reduce the aggregation and fusion of liposomes due to dehydration and the leakage of enclosed material.

【０００４】例えば、脱水時の保護剤の観点からは、特
公昭６１−２１４４９号公報でデキストラン、アラビア
ゴム等、親水性化合物をリポソーム溶液に添加し凍結乾
燥する方法、特表昭６２−５０１６３１号公報にはトレ
ハロース、シュークロース等の２糖類を含有するリポソ
ーム溶液の凍結乾燥法が開示されている。さらに特開平
７−１４５０４１号公報で抗腫瘍剤を内部に封入したリ
ポソームについて凍結乾燥法以外の方法で脱水されたリ
ポソームが、特開平７−１４５０４３号公報では前凍結
なしに脱水し、かつ残存水分量を２〜５％にする方法が
開示されている。For example, from the viewpoint of a protective agent at the time of dehydration, a method of adding a hydrophilic compound such as dextran or gum arabic to a liposome solution and freeze-drying it in Japanese Patent Publication No. 61-21449, Japanese Patent Publication No. Sho 62-501631 The publication discloses a freeze-drying method of a liposome solution containing a disaccharide such as trehalose and sucrose. Further, the liposome in which the antitumor agent is encapsulated in JP-A-7-145041 is dehydrated by a method other than the freeze-drying method. Methods for reducing the amount to 2-5% are disclosed.

【０００５】また、再水和溶液については特開昭５３−
１４２５１４号公報では凍結乾燥リポソームを５０℃〜
７０℃で加温分散した例が記載されている。しかしなが
ら、これらの方法では脂質組成、内封物によって数十％
から１０％程度の漏出（リーク）が認められ、リポソー
ムの安定性は必ずしも十分でなかった。A rehydration solution is disclosed in
No. 142514 discloses freeze-dried liposomes at 50 ° C.
An example in which the dispersion is heated at 70 ° C. is described. However, in these methods, several tens of
From about 10%, and the stability of the liposome was not always sufficient.

【０００６】このような内封物のリークは、特に内封物
のリークによる影響が大きいアッセイ用リポソーム、生
理活性の高い抗腫瘍剤のごとき薬剤を封入したリポソー
ムでは影響が大きい。抗腫瘍剤封入リポソームを臨床応
用する場合、リポソーム化によりなされた副作用の低減
化が妨げられること、ターゲティング等の効果の低下が
考えられ、たとえ１０〜３０％程度の量であっても重要
な問題であった。[0006] Such leakage of the enclosed matter is particularly large in assay liposomes, which are largely affected by the leakage of the enclosed matter, and in liposomes containing a drug such as an antitumor agent having high physiological activity. In clinical application of antitumor agent-encapsulated liposomes, reduction of side effects caused by liposome formation may be hindered, and effects such as targeting may decrease. Even if the amount is about 10 to 30%, it is an important problem. Met.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者等は、かかる従
来の問題点を解決すべく検討した結果、従来検討されて
きた方法に加え、むしろ再水和条件が重要であること、
特に再水和時の分散液の温度が影響大であることを見い
だした。驚くべきことに、従来示されていたリポソーム
溶液をはじめとする閉鎖小胞の加温とは逆に再水和時に
冷却することにより内封物のリークが極めて抑制される
こと、さらに一旦低温環境で再水和した閉鎖小胞は常温
に戻したのちも安定性が大きく向上していることを見い
だした。本発明はこの知見を基にして完成されたもので
ある。Means for Solving the Problems The present inventors have studied to solve such conventional problems, and as a result, in addition to the methods conventionally studied, the importance of rehydration conditions is rather important.
In particular, it has been found that the temperature of the dispersion during rehydration has a significant effect. Surprisingly, contrary to the conventional heating of closed vesicles such as a liposome solution, by cooling at the time of rehydration, the leakage of the encapsulated substance is extremely suppressed, and further, once the temperature is low, The closed vesicles rehydrated in the above were found to have greatly improved stability even after returning to room temperature. The present invention has been completed based on this finding.

【０００８】すなわち本発明は、脱水ミセル粒子または
脱水両親媒性ミセル二重層からなる閉鎖小胞を再水和溶
液で再水和するにあたり、再水和を低温条件下で行うこ
とを特徴とする閉鎖小胞の製造方法を提供するものであ
る。That is, the present invention is characterized in that when rehydrating closed vesicles comprising dehydrated micelle particles or a bilayer of dehydrated amphiphilic micelles with a rehydration solution, rehydration is carried out under low temperature conditions. It is intended to provide a method for producing closed vesicles.

【０００９】上記発明の好ましい態様によれば、低温条
件が１０℃〜０℃の範囲内の温度である上記方法；閉鎖
小胞が医薬品または診断用薬剤が導入された閉鎖小胞で
ある上記方法；医薬品が抗腫瘍剤である上記方法；抗腫
瘍剤がアドリアマイシン、ダウノマイシン、ビンブラス
チン並びにそれらの薬学的に許容し得る塩および誘導体
から選ばれる抗腫瘍剤である上記方法；薬学的に許容し
得る塩が多価陰イオン性物質と形成される塩である上記
方法；多価陰イオン性物質がクエン酸、酒石酸およびグ
ルタミン酸から選ばれる物質である上記方法；閉鎖小胞
がリポソームである上記方法；リポソームが糖類を含む
リポソームを凍結乾燥または噴霧乾燥して得られるリポ
ソームである上記方法；リポソームが抗体および／また
はポリエチレングリコールを付与されてなるリポソーム
である上記方法；再水和溶液が中性領域のｐＨを有する
水溶液である上記方法が提供される。According to a preferred embodiment of the present invention, the above method, wherein the low temperature condition is a temperature in the range of 10 ° C. to 0 ° C .; The above method, wherein the closed vesicle is a closed vesicle into which a drug or a diagnostic agent has been introduced. The above method, wherein the pharmaceutical is an antitumor agent; the above method, wherein the antitumor agent is an antitumor agent selected from adriamycin, daunomycin, vinblastine, and pharmaceutically acceptable salts and derivatives thereof; Is a salt formed with a polyanionic substance; the above method is a polyanionic substance selected from citric acid, tartaric acid and glutamic acid; the above method, wherein the closed vesicle is a liposome; Is a liposome obtained by freeze-drying or spray-drying a liposome containing a saccharide; It said method call a liposome comprising been granted; the method rehydration solution is an aqueous solution having a neutral pH region is provided.

【００１０】また、本発明の別の態様により、上記製造
方法により得られる閉鎖小胞；該閉鎖小胞を含有する医
薬組成物が提供される。さらに、本発明の別の態様によ
り、閉鎖小胞を含有する乾燥製剤および該閉鎖小胞を再
水和するための再水和溶液からなることを特徴とする医
薬品キットであって、該乾燥製剤および再水和溶液のい
ずれか一方又は両者が低温であることを特徴とする医薬
品キット；閉鎖小胞を含有する乾燥製剤および該閉鎖小
胞を再水和するための再水和溶液からなることを特徴と
する診断薬キットであって、該乾燥製剤および再水和溶
液のいずれか一方又は両者が低温であることを特徴とす
る診断薬キットが提供される。[0010] According to another aspect of the present invention, there are provided closed vesicles obtained by the above-mentioned production method; and a pharmaceutical composition containing the closed vesicles. Further, according to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical kit comprising a dry preparation containing closed vesicles and a rehydration solution for rehydrating the closed vesicles, wherein the dry preparation comprises And a pharmaceutical kit characterized in that one or both of the rehydration solution and the rehydration solution are at a low temperature; a dry preparation containing closed vesicles and a rehydration solution for rehydrating the closed vesicles A diagnostic kit is provided, wherein one or both of the dried preparation and the rehydration solution are at a low temperature.

【００１１】[0011]

【発明の実施の形態】本明細書において、ミセル粒子又
はミセルとは、分子中に親水部分及び疎水部分を含む両
親媒性分子の凝集によって得られる水溶性粒子を意味す
る。このようなミセル粒子又はミセルは、小球、楕円体
又は長い円筒形の形態をとり得、また、後述する両親媒
性分子の二つの平行な層から成る二重層、すなわち両親
媒性ミセル二重層でもあり得る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present specification, micelle particles or micelles mean water-soluble particles obtained by agglomeration of amphipathic molecules containing a hydrophilic part and a hydrophobic part in the molecule. Such micelle particles or micelles may take the form of small spheres, ellipsoids or long cylinders, and may also comprise a bilayer consisting of two parallel layers of amphipathic molecules as described below, i.e. an amphiphilic micelle bilayer. But it is possible.

【００１２】本明細書において、閉鎖小胞とは、上記ミ
セル粒子又はミセルより構成される閉鎖構造物を意味す
るものであり、例えば、細胞、ウィルス等の天然閉鎖小
胞、リポソーム、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌ．１，ｐ１４２
（１９９３）に記載されているｎｏｖａｓｏｍｅ（商品
名、Ｍｉｃｒｏ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．）、同書ｐ１５７に記載されている非イオ
ン性界面活性ベシクル（ｎｏｎｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａ
ｃｔａｎｃ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、高分子マイクロスフ
ェアー等の人工閉鎖小胞を包含するものである。これら
の中で、本発明において好適に用いられる閉鎖小胞はリ
ポソームである。ミセル粒子又はミセルを構成する両親
媒性分子としては、親水部分及び疎水部分を含み、それ
自体既知の通常用いられる方法によりミセル粒子又はミ
セルを形成し得るものであれば如何なるものであっても
よく、それらの中で、好適な両親媒性分子としては脂質
を挙げることができる。In the present specification, the closed vesicle means a closed structure composed of the above-mentioned micelle particles or micelles. For example, natural closed vesicles such as cells and viruses, liposomes, Liposome Technolo
gy 2nd edition vol. 1, p142
Novasome (trade name, Micro Vesicular System) described in (1993)
s, Inc. ), Nonionic surface active vesicles (nonionic surfactant) described in p.
and artificial closed vesicles such as polymer microspheres. Among these, closed vesicles suitably used in the present invention are liposomes. The amphipathic molecule constituting the micelle particles or micelles may be any as long as it contains a hydrophilic portion and a hydrophobic portion, and can form micelle particles or micelles by a commonly used method known per se. Among them, suitable amphiphilic molecules include lipids.

【００１３】本発明に係る閉鎖小胞を構成し得る脂質と
しては、例えば、天然レシチン（例えば、卵黄レシチ
ン、大豆レシチン等）やジパルミトイルフォスファチジ
ルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジ
ルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジ
ルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジル
コリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジル
エタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルフォス
ファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイル
フォスファチジン酸（ＤＭＰＡ）等のリン脂質、スフィ
ンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質等の糖脂質、脂肪酸、両親
媒性ジアルキルジメチルアンモニウム（ｄｉａｌｋｙｌ
ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ａｍｐｈｉｐｈｉ
ｌｅｓ）、ポリグリセロールアルキルエーテル（ｐｏｌ
ｙｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｌｋｙｌｅｔｈｅｒｓ）、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔ
ｈｙｌｅｎｅ ａｌｋｙｌ ｅｔｈｅｒｓ）等（Ｌｉｐ
ｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄｉｔ
ｉｏｎ ｖｏｌ．１ １４１（１９９３））、アルキル
クリコシド（ａｌｋｙｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）、ア
ルキルメチルグルカミド（ａｌｋｙｌ ｍｅｔｈｙｌ
ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、アルキルスクローエステル（ａ
ｌｋｙｌ ｓｕｃｒｏｓｅ ｅｓｔｅｒｓ）、ジアルキ
ルポリオキシエチレンエーテル（ｄｉａｌｋｙｌ ｐｏ
ｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｅｔｈｅｒｓ）、ジアル
キルポリグリセロールエーテル（ｄｉａｌｋｙｌ ｐｏ
ｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ ｅｔｈｅｒｓ）等（Ｌｉｐｏｓ
ｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ
ｖｏｌ．１ １５７（１９９３））、ポリオキシエチ
レン−ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体等（特表
平６−５０８８３１号公報）を挙げることができる。こ
れらの脂質は単独又は二種以上、或いはこれらとコレス
テロール等の非極性物質と組合せて用いられる。Examples of lipids that can constitute closed vesicles according to the present invention include natural lecithin (eg, egg yolk lecithin, soy lecithin), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), and dimyristoyl phosphatidylcholine (DPPC). DMPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), dimyristoylphosphatidine Phospholipids such as acid (DMPA), glycolipids such as glycosphingolipids, glycolipids such as glyceroglycol, fatty acids, amphiphilic dialkyldimethylammonium (dialkyl)
dimethylammonium amphiphi
les), polyglycerol alkyl ether (pol
ylglycerol alkylethers), polyoxyethylene alkyl ether (polyoxyet)
hyrene alkyl ethers) (Lip
osome Technology 2nd edit
ion vol. 1 141 (1993)), alkyl glycosides, alkyl methyl glucamide (alkyl methyl)
glucamide), alkyl sucrose ester (a
alkyl sucrose esters), dialkyl polyoxyethylene ether (dialky po
lyoxyethylene ethers, dialkyl polyglycerol ether (dialkyl po)
lyglycerol ethers) (Lipos
ome Technology2nd edition
vol. 1157 (1993)) and amphiphilic block copolymers such as polyoxyethylene-polylactic acid (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-508831). These lipids may be used alone or in combination of two or more, or in combination with a nonpolar substance such as cholesterol.

【００１４】さらに、閉鎖小胞がリポソームである場合
には、ステアリルアミン、ジセチルフォスフェートなど
の荷電性物質、ポリエチレングリコール等の水溶性高分
子部分を有するリン脂質誘導体やマレイミド基を有する
リン脂質誘導体を含んでも良い。また、例えば特開平４
−３４６９１８号公報にあるようにこれら脂質誘導体を
介し、抗体や水溶性高分子を結合したものであってもよ
い。また、融合リポソームとして知られるリポソームと
センダイウィルスを融合したリポソームのごとき、ウィ
ルスの一部または全部を組み込んだものであってもよ
い。Further, when the closed vesicle is a liposome, a charged substance such as stearylamine or dicetyl phosphate, a phospholipid derivative having a water-soluble polymer portion such as polyethylene glycol or a phospholipid having a maleimide group is used. Derivatives may be included. In addition, for example,
As described in JP-A-346918, an antibody or a water-soluble polymer may be bound via these lipid derivatives. Further, a liposome obtained by fusing a liposome known as a fusion liposome with a Sendai virus may be one in which a part or all of the virus is incorporated.

【００１５】閉鎖小胞は天然由来のものをそのまま用い
ても良く、いかなる方法で製造されたものでも良いが、
例えば閉鎖小胞がリポソームである場合は上記した素材
を用いてそれ自体既知の通常用いられる製造技術を用い
て製造できる。例えば、ガラス壁に付着させた脂質薄膜
に水溶液を加え機械的振盪を加え形成するマルチラメラ
リポソーム（ＭＬＶ）や、超音波処理法、エタノール注
入法、フレンチプレス法により得られるスモールユニラ
メラリポソーム（ＳＵＶ）、界面活性剤除去法、逆相蒸
発法（リポソーム 砂本順三ら 南江堂 １９８８）、
ＭＬＶを均一ポア径を有するメンブランを加圧して押し
出すイクストゥルージョン法等から得られるラージユニ
ラメラリポソーム（ＬＵＶ）を用いることができる（Ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１
２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。As the closed vesicle, a naturally-occurring vesicle may be used as it is, or may be produced by any method.
For example, when the closed vesicle is a liposome, the vesicle can be produced by using the above-mentioned materials and using a commonly used production technique known per se. For example, a multilamellar liposome (MLV) formed by adding an aqueous solution to a lipid thin film adhered to a glass wall and subjecting to mechanical shaking, or a small unilamellar liposome (SUV) obtained by a sonication method, an ethanol injection method, or a French press method ), Surfactant removal method, reverse-phase evaporation method (liposomes Junzo Sunamoto et al. Nanedo 1988),
A large unilamellar liposome (LUV) obtained by an extrusion method or the like in which MLV is extruded by pressing a membrane having a uniform pore size can be used (L
Iposome Technology, Vol. 1
2nd Edition).

【００１６】閉鎖小胞に導入し得る医薬品としては、ア
ドリアマイシン、ダウノマイシン、ビンブラスチン、シ
スプラチン、５−ＦＵ（フルオロウラシル）等の抗腫瘍
剤、チモロール等のアドレナリン遮断剤、クロニジン等
の高血圧剤、プロカイアミド等の制吐剤、クロロキニー
ネ等の抗マラリア剤、並びにそれらの薬学的に許容し得
る塩及び誘導体；リシンＡやジフテリアトキシン等の毒
素蛋白およびそれをコードするＤＮＡ、ＴＮＦ等サイト
カインの遺伝子をコードするＤＮＡがあげられる。Pharmaceuticals that can be introduced into the closed vesicles include antitumor agents such as adriamycin, daunomycin, vinblastine, cisplatin, 5-FU (fluorouracil), adrenaline blockers such as timolol, hypertensive agents such as clonidine, and procaamide. Antimalarial agents such as antiemetic agents, chloroquinine and the like, and pharmaceutically acceptable salts and derivatives thereof; toxin proteins such as ricin A and diphtheria toxin and DNAs encoding the same, and DNAs encoding cytokine genes such as TNF. can give.

【００１７】上記抗腫瘍剤等の薬学的に許容し得る塩と
しては、薬学的に許容し得る多価陰イオン性物質との
塩、例えばクエン酸塩、酒石酸塩、グルタミン酸塩、及
びそれらの誘導体との塩が好ましい。これら閉鎖小胞に
導入し得る医薬品の中で、抗腫瘍剤を用いるのが好まし
い。閉鎖小胞に導入し得る診断用薬剤としては、放射性
元素、例えばインジウム、テクネシューム等のイメージ
ング薬剤；ヨード、ガドリニウム等の造影剤；ホースラ
デイッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクロシダーゼ等の酵素；ユーロピウム誘導
体等の蛍光体；Ｎ−メチルアクリジウム誘導体等の発光
体等が挙げられる。The pharmaceutically acceptable salts of the above-mentioned antitumor agents and the like include salts with pharmaceutically acceptable polyvalent anionic substances, such as citrate, tartrate, glutamate and derivatives thereof. Are preferred. Among the drugs that can be introduced into these closed vesicles, it is preferable to use an antitumor agent. Examples of diagnostic agents that can be introduced into closed vesicles include radioactive elements, such as imaging agents such as indium and technesium; contrast agents such as iodine and gadolinium; enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and β-galaclosidase; Phosphors such as europium derivatives; luminous bodies such as N-methylacridium derivatives;

【００１８】これら医薬品及び診断用薬剤の閉鎖小胞へ
の導入は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うこ
とができる。例えば、閉鎖小胞がリポソームである場合
は、リポソーム形成時に水溶液として添加し封入しても
良く、またリポソーム形成後ベシクル内外にｐＨ勾配等
の濃度勾配を形成させ、このポテンシャルを駆動力とし
てイオン化可能な薬剤を取り込ませる方法（Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．４９ ５９２２（１９８９），ＢＢＡ ４
５５，２６９（１９７６））を用いても良い。The introduction of these drugs and diagnostic agents into the closed vesicles can be carried out by a commonly used method known per se. For example, if the closed vesicle is a liposome, it may be added as an aqueous solution when forming the liposome and encapsulated.Also, after the liposome is formed, a concentration gradient such as a pH gradient is formed inside and outside the vesicle, and this potential can be used as a driving force for ionization. Method of Incorporating Various Drugs (Cance
r Res. 49 5922 (1989), BBA 4
55 , 269 (1976)).

【００１９】閉鎖小胞の脱水は、凍結乾燥または噴霧乾
燥等の公知の方法を用いることができるが、好ましくは
凍結乾燥である。さらに凍結乾燥助剤として糖類、例え
ばシュークロース、トレハロース等を添加することがで
きる。糖類は、リポソーム脱水時少なくとも外水相に添
加して用いることができる。外水相に添加し得る糖類の
濃度は、通常５〜４０％、好ましくは５〜２０％が適当
である。For dehydration of the closed vesicles, known methods such as freeze-drying or spray-drying can be used, but freeze-drying is preferred. Furthermore, sugars such as sucrose and trehalose can be added as a freeze-drying aid. The saccharide can be used by adding it to at least the outer aqueous phase during liposome dehydration. The concentration of the saccharide that can be added to the outer aqueous phase is usually 5 to 40%, preferably 5 to 20%.

【００２０】再水和溶液は、生理食塩水等の塩類を含ん
だ水溶液、リン酸緩衝液等の中性緩衝液、ブドウ糖等の
糖溶液あるいはそれらの混合物を用いることができる。
再水和溶液のｐＨは６から８程度の中性領域が好まし
く、さらに好ましくはｐＨ６．５からｐＨ７．５程度で
ある。ｐＨ緩衝剤は、再水和溶液に加えて用いることも
できるが、リポソーム凍結乾燥時点でリポソーム側に含
有するか、あるいは再水和溶液と凍結乾燥リポソームの
両方に含有していても良く、再水和時に閉鎖小胞を含有
する水溶液が中性領域のｐＨを呈していれば如何なる方
法で加えても良い。ｐＨ緩衝剤の濃度は、通常１〜１０
０ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭが適当である。As the rehydration solution, an aqueous solution containing salts such as physiological saline, a neutral buffer such as a phosphate buffer, a sugar solution such as glucose, or a mixture thereof can be used.
The pH of the rehydration solution is preferably in the neutral range of about 6 to 8, and more preferably about 6.5 to 7.5. The pH buffer may be used in addition to the rehydration solution, but may be contained in the liposome at the time of lyophilization of the liposome, or may be contained in both the rehydration solution and the lyophilized liposome. Any method may be used as long as the aqueous solution containing closed vesicles exhibits a pH in the neutral region during hydration. The concentration of the pH buffer is usually 1 to 10
0 mM, preferably 5-50 mM is suitable.

【００２１】上記閉鎖小胞及び再水和溶液は、好ましく
は、適当な水性媒体に懸濁された閉鎖小胞及び再水和溶
液を、それぞれ滅菌濾過し次に適当なバイアル又はアン
プル等の薬剤容器に無菌的に充填し、再水和溶液はその
まま、閉鎖小胞は凍結乾燥等により脱水して密封され
る。The closed vesicles and rehydration solution are preferably prepared by filtering sterilized vesicles and rehydration solution, respectively, suspended in a suitable aqueous medium, and then filtering the vesicles and rehydration solution with a suitable vial or ampoule. The container is aseptically filled, the rehydrated solution is left as it is, and the closed vesicles are dehydrated by freeze-drying or the like and sealed.

【００２２】再水和は、低温条件下で、上記再水和溶液
に脱水閉鎖小胞を分散させることにより行うことができ
る。ここで、低温条件とは室温よりも低い温度、通常約
２０℃程度以下、すなわち、約２０℃程度から再水和溶
液が凍結せずに溶液状態として存在し得る程度の温度範
囲をいい、約１０℃〜０℃程度の温度範囲が好ましい。Rehydration can be carried out by dispersing the dehydrated closed vesicles in the above rehydration solution under low temperature conditions. Here, the low temperature condition refers to a temperature range lower than room temperature, usually about 20 ° C. or lower, that is, a temperature range from about 20 ° C. to a level where the rehydration solution can exist as a solution state without freezing. A temperature range of about 10 ° C to 0 ° C is preferable.

【００２３】再水和時の低温条件は、上記温度範囲であ
れば如何なる方法で惹起されたものであっても良い。例
えば、脱水閉鎖小胞が入ったバイアル等の薬剤容器及び
再水和溶液のいずれか一方又は両者を予め低温に冷却し
ておいても良いし、或いは再水和時に、適当な冷媒で低
温条件に冷却しながら再水和溶液に脱水閉鎖小胞を分散
させても良い。The low-temperature condition at the time of rehydration may be set by any method within the above-mentioned temperature range. For example, one or both of a drug container such as a vial containing a dehydrated closed vesicle and a rehydration solution may be cooled to a low temperature in advance, or at the time of rehydration, a suitable refrigerant may be used at a low temperature. The dehydrated closed vesicles may be dispersed in the rehydration solution while cooling.

【００２４】再水和時間は、閉鎖小胞が再水和溶液に均
一に分散可能な時間であれば特に制限はなく、用いる容
器の大きさ及び攪拌速度等によっても異なるが、通常は
１分間程度以内である。この間上記低温条件に保てば、
導入物のリークが少く、安定に脱水閉鎖小胞の再水和が
できる。The rehydration time is not particularly limited as long as the closed vesicles can be uniformly dispersed in the rehydration solution. The rehydration time varies depending on the size of the vessel used, the stirring speed, and the like. It is within the extent. If you keep the above low temperature condition during this time,
There is little leakage of the introduced substance, and the dehydrated closed vesicles can be rehydrated stably.

【００２５】上記の如く再水和して得られた閉鎖小胞を
含有する組成物、例えば医薬品が導入されたリポソーム
を含有する医薬組成物は、癌等の各種疾患に対して血管
内投与法や膀胱内、腹腔内投与、局所投与法で用いるこ
とができる。投与量は封入薬剤により適宜調整できる
が、アドリアマイシン封入体を例にとればアドリアマイ
シンとして、１０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは５ｍｇ／
ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以下で用いることが
できる。A composition containing closed vesicles obtained by rehydration as described above, for example, a pharmaceutical composition containing liposomes into which a drug has been introduced, can be used for intravascular administration for various diseases such as cancer. And intravesical, intraperitoneal, and topical administration methods. The dose can be appropriately adjusted depending on the encapsulated drug. In the case of an adriamycin inclusion body, for example, adriamycin is 10 mg / kg or less, preferably 5 mg / kg or less.
kg, more preferably 1 mg / kg or less.

【００２６】本発明においては、医薬品及び診断用薬剤
が導入された脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤および該
閉鎖小胞を再水和するための再水和溶液からなる、２本
セットの医薬品及び診断薬キットの他、医薬品及び診断
用薬剤を含有する凍結乾燥製剤と脱水閉鎖小胞を含有す
る乾燥製剤が、別の薬剤容器に充填され、それらと、再
水和溶液からなる、３本セットの医薬品及び診断薬キッ
トも、その範囲に含まれる。３本セットのキットの場合
は、脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤を、上記で記載し
たような方法で（低温条件下に）再水和し、この再水和
小胞溶液に、あらかじめ適当な溶媒で溶かした医薬品又
は、診断用薬剤を添加すると、上記で記載したベシクル
内外のポテンシャルにより、閉鎖小胞内に医薬品又は診
断用薬剤を取り込ませることが可能である。In the present invention, a two-pack drug product comprising a dry preparation containing dehydrated closed vesicles into which a drug and a diagnostic agent have been introduced, and a rehydration solution for rehydrating the closed vesicles A lyophilized preparation containing a drug and a diagnostic agent, and a dry preparation containing a dehydrated closed vesicle, in addition to a kit for a diagnostic reagent and a dry reagent containing a dehydrated closed vesicle, are filled in a separate drug container, and are composed of a rehydration solution. A set of pharmaceutical and diagnostic kits are also included in the scope. In the case of a set of three kits, the dried preparation containing the dehydrated closed vesicles is rehydrated (under low temperature conditions) by the method described above, and the rehydrated vesicle solution is previously added to the appropriate solution. When a drug or a diagnostic agent dissolved in a suitable solvent is added, the drug or the diagnostic agent can be incorporated into the closed vesicles by the potential inside and outside the vesicle described above.

【００２７】[0027]

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細な
説明をするが、本発明の範囲はこれらに限定されるもの
ではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.

【００２８】実施例１ ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
コレステロール（ｃｈｏｌ）、ε−マレイミドカプロイ
ルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンを
モル比１８／１０／０．５でクロロホルムに溶解し、ロ
ータリーエヴァポレーターで減圧乾燥した。さらに真空
ポンプで減圧し残存溶媒を除去した。得られた脂質フィ
ルム１００ｍｇに対し１ｍｌの割合で０．３Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ４．０）を加え６０℃で加温しボルテック
スミキサーで振盪乳化することでＭＬＶを作製した。こ
のＭＬＶをイクストゥルーダー法により整粒した。すな
わち０．２μｍヌクレオポアメンブランを装着したイク
ストゥルーダー（日油リポソーム社製）、さらに０．１
μｍのヌクレオポアメンブランに順次通すことでＬＵＶ
リポソームを作製した。リポソーム外水相を１Ｎの水酸
化ナトリウム溶液で中和し、６０℃に加温しつつ２０ｍ
ｇ／ｍｌのアドリアマイシン（ＡＤＭ）水溶液を脂質１
００ｍｇに対し１０ｍｇの割合で添加した。９５％以上
のＡＤＭはリポソーム内外のｐＨ勾配によりリポソーム
に装填された。さらに、未封入ＡＤＭをゲル濾過で除
き、リポソーム外液を１０％シュクロースに調整したの
ち凍結乾燥により脱水リポソームとした。 Example 1 Dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC)
Cholesterol (chol) and ε-maleimidocaproyl dipalmitoyl phosphatidylethanolamine were dissolved in chloroform at a molar ratio of 18/10 / 0.5 in chloroform and dried under reduced pressure with a rotary evaporator. The pressure was further reduced by a vacuum pump to remove the residual solvent. 0.3 M citrate buffer (pH 4.0) was added at a ratio of 1 ml to 100 mg of the obtained lipid film, heated at 60 ° C, and emulsified by shaking with a vortex mixer to prepare an MLV. This MLV was sized by the extruder method. That is, Extruder (manufactured by NOF Liposomes) equipped with a 0.2 μm nucleopore membrane, and 0.1 μm
LUV by sequentially passing through a μm nucleopore membrane
Liposomes were made. The aqueous phase outside the liposome is neutralized with a 1N sodium hydroxide solution, and heated to 60 ° C. for 20 m.
g / ml adriamycin (ADM) aqueous solution
It was added at a ratio of 10 mg to 00 mg. More than 95% of the ADM was loaded on the liposome by the pH gradient inside and outside the liposome. Further, unencapsulated ADM was removed by gel filtration, and the liposome external solution was adjusted to 10% sucrose, followed by freeze-drying to obtain dehydrated liposomes.

【００２９】凍結乾燥リポソームに対して、氷冷した５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を凍結乾燥前の容量
になるよう添加しバイアルを振盪し再水和した（再水和
時の温度０℃）。[0029] The freeze-dried liposomes were
0 mM phosphate buffer (pH 7.5) was added to the volume before freeze-drying, and the vial was shaken to rehydrate (temperature at rehydration 0 ° C.).

【００３０】その一部をＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１
０（ファルマシア製）カラムでゲル濾過することでリポ
ソーム封入ＡＤＭおよびリークしたＡＤＭを分離した。NAP-1 part of which was equilibrated with PBS
A liposome-encapsulated ADM and a leaked ADM were separated by gel filtration with a 0 (manufactured by Pharmacia) column.

【００３１】リポソーム中のＡＤＭは０．３Ｍ塩酸／５
０％エタノールを加え６０℃で抽出、５００ｎｍの吸光
度により定量した。遊離ＡＤＭはそのまま５００ｎｍの
吸光度から定量した。その結果、リーク量は３％以下で
あり単に凍結融解したリポソームと同程度であった。ま
た、凝集等も認められなかった。The ADM in the liposome is 0.3 M hydrochloric acid / 5
0% ethanol was added, and the mixture was extracted at 60 ° C. and quantified by absorbance at 500 nm. Free ADM was directly quantified from the absorbance at 500 nm. As a result, the leak amount was 3% or less, which was almost the same as that of the liposome simply freeze-thawed. No aggregation was observed.

【００３２】比較例１ 再水和液を室温（２５℃）の蒸留水に代えること以外は
実施例１と同様にリポソームを調製、再水和した。凝集
等は認められなかったが、１５％から２５％程度のＡＤ
Ｍのリークが認められた。 Comparative Example 1 Liposomes were prepared and rehydrated in the same manner as in Example 1, except that the rehydration solution was replaced with distilled water at room temperature (25 ° C.). Aggregation and the like were not observed, but AD of about 15% to 25%
M leak was observed.

【００３３】実施例２ 特開平５−３０４９８７号公報に記載のＧＡＨ抗体（胃
癌反応性モノクロナール抗体）にイミノチオランを反応
させることでチオール基を有する抗体をＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，１２，３２０６（１９７３）に記載の方法
で調製した。また、２，４−ビス（ポリエチレングリコ
ール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンにシスチンを反応
後還元して、チオール基を有するポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を調製した。 Example 2 An antibody having a thiol group was obtained by reacting a GAH antibody (a gastric cancer-reactive monoclonal antibody) described in JP-A-5-304987 with iminothiolane to obtain a Biochem.
prepared in accordance with the method described in Istry, 12 , 3206 (1973). In addition, 2,4-bis (polyethylene glycol) -6-chloro-s-triazine was reacted with cystine and then reduced to prepare polyethylene glycol (PEG) having a thiol group.

【００３４】さらに、実施例１と同様に調製したリポソ
ームと、チオール化抗体およびチオール化ＰＥＧを順次
反応させることで、抗体とＰＥＧを結合したリポソーム
を作製した。外水相を１０％シュクロースとし凍結乾燥
した。凍結乾燥したリポソームに０℃〜３０℃の５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加、分散後、同様に
ＡＤＭリーク量を測定した。その結果、図１に示す様に
再水和溶液の温度に依存したリークの増加が認められ
た。Further, the liposome prepared in the same manner as in Example 1 was sequentially reacted with a thiolated antibody and a thiolated PEG to prepare a liposome in which the antibody and the PEG were bound. The outer aqueous phase was made 10% sucrose and freeze-dried. Freeze-dried liposomes with 50m
After adding and dispersing M phosphate buffer (pH 7.5), the amount of ADM leak was measured in the same manner. As a result, as shown in FIG. 1, an increase in leak depending on the temperature of the rehydration solution was observed.

【００３５】実施例３ 実施例２と同様に作製した凍結乾燥リポソームに０℃の
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加、分散後、
ゲル濾過カラム（ＮＡＰ−１０、ファルマシア社製）に
添加し再水和過程で生じたＡＤＭを除去した。さらに３
７℃の水浴で１時間加温したのち、新たに生じたＡＤＭ
のリークを測定したところほぼ全量が保持されており、
一旦低温で再水和された後は加温しても安定であった。 Example 3 A 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) at 0 ° C. was added to the freeze-dried liposome prepared in the same manner as in Example 2, and dispersed.
It was added to a gel filtration column (NAP-10, manufactured by Pharmacia) to remove ADM generated during the rehydration process. 3 more
After heating for 1 hour in a 7 ° C. water bath, the newly formed ADM
When the leak was measured, almost the entire amount was retained.
Once rehydrated at low temperature, it was stable even when heated.

【００３６】比較例２ 再水和溶液を室温（２５℃）の生理食塩水にする以外は
実施例３と同様にして再水和以降のリークを測定したと
ころ、３７℃、１時間の加温で約６％のＡＤＭのリーク
が新たに生じていた。 Comparative Example 2 Leakage after rehydration was measured in the same manner as in Example 3 except that the rehydration solution was changed to physiological saline at room temperature (25 ° C.). , A new ADM leak of about 6% occurred.

【００３７】実施例４ ヒト胃癌組織から樹立した胃癌細胞株Ｂ３７（実施例２
で用いたＧＡＨ抗体と反応性を有する）を用い実施例２
の抗腫瘍抗体およびＰＥＧを結合したＡＤＭ封入リポソ
ームのｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果を確認した。 Example 4 Gastric cancer cell line B37 established from human gastric cancer tissue (Example 2)
Example 2 which has reactivity with the GAH antibody used in Example 2)
The anti-tumor effect of ADM-encapsulated liposome bound with anti-tumor antibody and PEG was confirmed in vitro.

【００３８】培養用９６穴プレートに細胞を播種、翌日
細胞がプレートに付着したところで、脱水（凍結乾燥）
後−２０℃で５ヶ月間保管し、低温（０℃）の５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で再水和したリポソームお
よび１０％シュクロースで５ヶ月間凍結保管後に融解し
たリポソームを添加した。３７℃で１時間反応後、リポ
ソームを除き１０％血清培地を添加し培養した。５日
後、生細胞率をＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，６５，５５（１９８３））により測定し効果
を比較した。The cells are seeded on a 96-well plate for culture, and the next day when the cells adhere to the plate, they are dehydrated (lyophilized).
After that, store at −20 ° C. for 5 months, and cool to 50 mM at 0 ° C.
Liposomes rehydrated with phosphate buffer (pH 7.5) and liposomes thawed after 5 months of cryopreservation with 10% sucrose were added. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, liposomes were removed, and a 10% serum medium was added, followed by culturing. Five days later, the viable cell rate was determined by the MTT method (J. Immunol. Met).
hods, 65 , 55 (1983)).

【００３９】その結果、図２に示すように、凍結乾燥／
低温再水和リポソームは、凍結保存リポソームと同等の
抗腫瘍活性を保持していた。As a result, as shown in FIG.
The cold rehydrated liposomes retained the same antitumor activity as the cryopreserved liposomes.

【００４０】[0040]

【発明の効果】本発明によれば、脱水閉鎖小胞、例えば
脱水リポソームから閉鎖小胞を再生する過程で生じる導
入物のリーク量を極めて低減化することができ、また再
水和後の安定性も高い閉鎖小胞を得ることができる。According to the present invention, it is possible to significantly reduce the amount of leak of the introduced substance generated during the process of regenerating closed vesicles from dehydrated closed vesicles, for example, dehydrated liposomes, and to stabilize after rehydration. It is possible to obtain closed vesicles having high properties.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】アドリアマイシンのリークに及ぼす再水和溶液
の温度の影響を示す図である。図中、横軸は再水和溶液
の温度を示し、縦軸はアドリアマイシンのリーク量を示
す。FIG. 1 shows the effect of rehydration solution temperature on adriamycin leak. In the figure, the horizontal axis indicates the temperature of the rehydration solution, and the vertical axis indicates the leak amount of adriamycin.

【図２】アドリアマイシンが封入された、凍結乾燥低温
再水和リポソームと凍結保存リポソームの抗腫瘍活性を
示す図である。図中、横軸はリポソーム量をアドリアマ
イシン換算量として示し、縦軸は生細胞率を示す。FIG. 2 shows the antitumor activity of freeze-dried low-temperature rehydrated liposomes and cryopreserved liposomes in which adriamycin is encapsulated. In the figure, the horizontal axis shows the amount of liposome as the amount of adriamycin, and the vertical axis shows the viable cell rate.

Claims (17)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 脱水ミセル粒子または脱水両親媒性ミセ
ル二重層からなる閉鎖小胞を再水和溶液で再水和するに
あたり、再水和を低温条件下で行うことを特徴とする閉
鎖小胞の製造方法。1. Reclosed vesicles comprising dehydrated micellar particles or a bilayer of dehydrated amphipathic micelles are rehydrated with a rehydration solution under low-temperature conditions. Manufacturing method. 【請求項２】 低温条件が１０℃〜０℃程度の温度範囲
内であることを特徴とする請求項１記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the low temperature condition is within a temperature range of about 10 ° C. to 0 ° C. 【請求項３】 閉鎖小胞が医薬品または診断用薬剤が導
入された閉鎖小胞であることを特徴とする請求項１記載
の製造方法。3. The method according to claim 1, wherein the closed vesicle is a closed vesicle into which a drug or a diagnostic agent has been introduced. 【請求項４】 医薬品が抗腫瘍剤であることを特徴とす
る請求項３記載の製造方法。4. The method according to claim 3, wherein the drug is an antitumor agent. 【請求項５】 抗腫瘍剤がアドリアマイシン、ダウノマ
イシン、ビンブラスチン並びにそれらの薬学的に許容し
得る塩および誘導体から選ばれることを特徴とする請求
項４に記載の製造方法。5. The method according to claim 4, wherein the antitumor agent is selected from adriamycin, daunomycin, vinblastine, and pharmaceutically acceptable salts and derivatives thereof. 【請求項６】 薬学的に許容し得る塩が多価陰イオン性
物質と形成される塩であることを特徴とする請求項４記
載の製造方法。6. The method according to claim 4, wherein the pharmaceutically acceptable salt is a salt formed with a polyvalent anionic substance. 【請求項７】 多価陰イオン性物質がクエン酸、酒石酸
およびグルタミン酸から選ばれることを特徴とする請求
項６記載の製造方法。7. The method according to claim 6, wherein the polyanionic substance is selected from citric acid, tartaric acid and glutamic acid. 【請求項８】 閉鎖小胞がリポソームであることを特徴
とする請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。8. The production method according to claim 1, wherein the closed vesicle is a liposome. 【請求項９】 リポソームが、糖類を含むリポソームを
凍結乾燥または噴霧乾燥して得られることを特徴とする
請求項８に記載の製造方法。9. The method according to claim 8, wherein the liposome is obtained by freeze-drying or spray-drying a liposome containing a saccharide. 【請求項１０】 リポソームに抗体および／またはポリ
エチレングリコールが付与されていることを特徴とする
請求項８または９に記載の製造方法。10. The method according to claim 8, wherein the liposome is provided with an antibody and / or polyethylene glycol. 【請求項１１】 再水和溶液が中性領域のｐＨを有する
溶液であることを特徴とする請求項１から１０のいずれ
かに記載の製造方法。11. The production method according to claim 1, wherein the rehydration solution is a solution having a pH in a neutral region. 【請求項１２】 請求項１から１１のいずれかに記載の
製造方法により得られる閉鎖小胞。12. A closed vesicle obtained by the method according to any one of claims 1 to 11. 【請求項１３】 請求項１２に記載の閉鎖小胞を含有す
る医薬組成物。13. A pharmaceutical composition comprising the closed vesicle according to claim 12. 【請求項１４】 脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤およ
び該閉鎖小胞を再水和するための再水和溶液からなるこ
とを特徴とする医薬品キットであって、該乾燥製剤およ
び再水和溶液のいずれか一方又は両者が低温であること
を特徴とする医薬品キット。14. A pharmaceutical kit comprising a dry preparation containing dehydrated closed vesicles and a rehydration solution for rehydrating the closed vesicles, wherein the dry preparation and rehydration are provided. A pharmaceutical kit, wherein one or both of the solutions are at a low temperature. 【請求項１５】 脱水閉鎖小胞が、医薬品が導入された
脱水閉鎖小胞であることを特徴とする請求項１４記載の
医薬品キット。15. The pharmaceutical kit according to claim 14, wherein the dehydrated closed vesicle is a dehydrated closed vesicle into which a drug has been introduced. 【請求項１６】 脱水閉鎖小胞を含有する乾燥製剤およ
び該閉鎖小胞を再水和するための再水和溶液からなるこ
とを特徴とする診断薬キットであって、該乾燥製剤およ
び再水和溶液のいずれか一方又は両者が低温であること
を特徴とする診断薬キット。16. A diagnostic kit comprising a dry preparation containing dehydrated closed vesicles and a rehydration solution for rehydrating the closed vesicles, wherein the dry preparation and re-water A diagnostic kit, wherein one or both of the sum solution is at a low temperature. 【請求項１７】 脱水閉鎖小胞が、診断用薬剤が導入さ
れた脱水閉鎖小胞であることを特徴とする請求項１６記
載の診断薬キット。17. The diagnostic reagent kit according to claim 16, wherein the dehydrated closed vesicle is a dehydrated closed vesicle into which a diagnostic agent has been introduced.