JPH10267834A

JPH10267834A - 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法

Info

Publication number: JPH10267834A
Application number: JP9073645A
Authority: JP
Inventors: Ryohei Nagata; 良平永田; Hiroyuki Nakamura; 洋之中村
Original assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Current assignee: Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 1998-10-09

Abstract

(57)【要約】【解決手段】透明基板、該透明基板上に配置される金
属膜、及び該金属膜上に配置される有機ケイ素膜を備え
ていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用測定チップ及びその製造方法。【効果】製造が容易であり、また、固定化する生理活
性物質が少量であっても、良好な感度で測定対象物質を
測定することのできる表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は表面プラズモン共鳴
バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】現在、臨床検査等で免疫反応を利用した
測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や
標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすること
なく、リガンドの変化を高感度に検出することのできる
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した免疫センサー
が使用されている。

【０００３】このような表面プラズモン共鳴を利用した
測定装置（表面プラズモン共鳴バイオセンサー）で一般
的に使用される測定チップは、図２に示すような構造を
有する。即ち、ガラス基板１'上に成膜された金属膜２'
の上に、多孔性材料５が形成されており、この多孔性材
料５の表面及び内部に酵素、抗体等の生理活性物質が担
持又は固定されている。この多孔性材料５としては、例
えば合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織物、編
物、不織布や、多孔性の無機又は有機材料などが使用さ
れる（特開平3-164195号公報参照）。また、市販品（BI
Acore 2000用，ファルマシアバイオセンサー社製）で
は、この多孔性材料５としてカルボキシメチルデキスト
ランが用いられている。

【０００４】しかしながら、測定対象物と実質的にかつ
効率的に相互作用する生理活性物質は、多孔性材料５の
表面に存在するものだけであるため、多孔性材料５の内
部に担持又は固定されている生理活性物質は有効に機能
せず、その分感度が低下することとなる。

【０００５】また、生理活性物質を金属膜２'に固定す
る方法として、ＬＢ（Langmuir-Blodgett ）法が用いら
れる場合もあるが（特開平5-288672号公報参照）、ＬＢ
膜と金属膜との結合が弱く、ＬＢ膜が生理活性物質と共
に脱落するという問題がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、固定
化する生理活性物質が少量であっても、良好な感度が得
られ、かつ製造が容易な表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用の測定チップを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者は、金属膜上に有機ケイ素膜を形成
し、該有機ケイ素膜に生理活性物質を固定化すれば、使
用する生理活性物質が少量であっても良好な感度が得ら
れることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、及び
該金属膜上に配置される有機ケイ素膜を備えていること
を特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップである。

【０００８】また、本発明は、透明基板上に金属膜を配
置した後、該金属膜の上に有機ケイ素膜を配置すること
を特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップの製造方法である。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ（以下、単に「測定チップ」という）とは、表
面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチップで
あって、該センサーより照射された光を透過及び反射す
る部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部
材をいい、該センサーの本体に固着されるものであって
もよく、また脱着可能なものであってもよい。

【００１０】本発明の測定チップは、透明基板、該透明
基板上に配置される金属膜、及び該金属膜上に配置され
る有機ケイ素膜を備えている。ここで、「透明基板上に
配置される金属膜」とは、金属膜が直接接して透明基板
上に配置されている場合のほか、金属膜が透明基板に直
接接することなく、他の層を介して配置されている場合
をも含む意である。「金属膜上に配置される有機ケイ素
膜」も上記と同様の意味である。

【００１１】本発明の一例による測定チップの断面概略
図を図１に示す。本実施例による測定チップは、透明基
板１と、透明基板１上に形成された金属膜２と、金属膜
２の上に形成された有機ケイ素膜３とを有する。透明基
板１としては、通常表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用の測定チップに使用されるものであればどのようなも
のでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタ
レート、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透
明な材料からなるものが使用でき、偏光に対して異方性
を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましく、その厚さ
は0.1 〜20mm程度である。

【００１２】金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が
生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金
属膜２に使用することのできる金属の種類としては、
金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それら
を単独で又は組み合わせて使用することができる。ま
た、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１
と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層
を設けてもよい。

【００１３】金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるの
が好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。30
00Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出
することができない。また、クロム等からなる介在層を
設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが
好ましい。

【００１４】金属膜２の形成は常法によって行えばよ
く、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティン
グ法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこ
とができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いる
のが好ましい。

【００１５】有機ケイ素膜３とは、Ｓｉ−Ｏ及びＳｉ−
Ｃ結合を分子内に含む高分子からなる膜をいう。該有機
ケイ素膜３は、例えば、シランカップリング剤を用いて
形成させることができる。シランカップリング剤とは、
その分子中にビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカ
プト基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、
メトキシ基、エトキシ基のような無機材料と親和性のあ
る加水分解基を有する有機ケイ素化合物のことをいう。
シランカップリング剤中の加水分解基は、金属膜２中の
金属原子と結合し、有機官能基は生理活性物質と結合す
る。これにより金属膜２、有機ケイ素膜３及び生理活性
物質の三者は強固に固定される。本発明に使用できるシ
ランカップリング剤は、上記定義に該当するものであれ
ばいかなるものでもよく、３−アミノプロピルトリエト
キシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２
−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、
３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメ
チルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラ
ン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシラン
などを単独又は組み合わせて使用することができる。

【００１６】有機ケイ素膜３は、ケイ素原子が上下方向
に重ならない単分子層膜であることが好ましい。単分子
層膜にすることにより、生理活性物質と相互作用する測
定対象物と、入射した光が反射する面との距離を短くす
ることができ、良好な感度が得られるとともに、使用す
るシランカップリング剤の量を必要最小限に抑え、コス
トの低減化を図ることができる。

【００１７】また、有機ケイ素膜３は、細密充填構造を
とるのが好ましい。細密充填構造とは、有機ケイ素膜３
を構成するＳｉ及びＯの網目構造中に他の分子が貫入す
る余地のないほど、網目構造が緻密であることをいう。
細密充填構造をとることにより、生理活性物質を高い密
度で均等に固定化することができ、測定感度を向上させ
ることができる。有機ケイ素膜３が細密充填構造をとる
かどうかは、以下の方法により確認することができる。

【００１８】プロピルエトキシシラン（シランカップリ
ング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシランの
アミノ基を水素原子で置換した化合物）を用いて金属膜
２上に有機ケイ素膜３を形成させる。プロピルエトキシ
シランは、強い疎水性を有する化合物なので、有機ケイ
素膜２の表面の濡れ程度により、プロピルエトキシシラ
ンの密度（即ち、有機ケイ素膜３の細密充填の程度）を
知ることができる。即ち、シリンジにより蒸留水を滴下
した際に表面が一様に水滴を弾くのであれば有機ケイ素
膜３は細密充填構造をとっており、表面が部分的にしか
水を弾かないのであれば、細密充填構造をとっておら
ず、Ｓｉ及びＯの網目構造に空隙が存在することが推測
される。

【００１９】有機ケイ素膜３は、例えば、シランカップ
リング剤を用いることにより形成させることができる。
具体的には、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属
膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカ
ップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬す
る方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピン
コーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラ
ビア法）などにより成膜することができる。本発明にお
いては、これらのいずれの方法を用いてもよいが、細密
充填構造をとる単分子層膜を形成させるためには、飽和
蒸気法を用いるのが好ましい。

【００２０】飽和蒸気法においては、暴露時の温度、湿
度なども単分子層構造及び細密充填構造の形成に影響を
与えるが、暴露時間が最も重要な要素である。暴露時間
が長すぎると単分子層構造が得られず、また、暴露時間
が短すぎると細密充填構造が得られない。暴露時間は、
通常、１〜600 分とするのが好ましく、15〜90分とする
のが更に好ましい。

【００２１】本発明における有機ケイ素膜３は、以下の
ような利点を有する。生理活性物質を金属膜２に極めて近い位置に固定す
ることができるので、従来の測定チップを使用する場合
よりも大幅に測定感度を向上させることができる。成膜が容易であり、また、一度に大量の成膜処理が
できる。シランカップリング剤の種類を変えることにより、
膜厚だけでなく、表面改質、官能基導入などの化学修飾
が可能となる。本発明の測定チップは、有機ケイ素膜３に、直接又は水
溶性二価性試薬を介して、生理活性物質を固定して使用
する。

【００２２】生理活性物質としては、測定対象物と相互
作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白
質、酵素、微生物、核酸等が挙げられる。免疫蛋白質と
しては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを
例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロ
ブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ
を使用することができる。具体的には、測定対象物がヒ
ト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アル
ブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫
剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、
コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合に
は、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗
メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ
抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用
することができる。

【００２３】酵素としては、測定対象物又は測定対象物
から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、
特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元
酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素
等を使用することができる。具体的には、測定対象物が
グルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定
対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキ
シダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫
剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、
コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場
合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示
す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールア
ミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ド
ーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができ
る。

【００２４】微生物としては、特に限定されることな
く、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用すること
ができる。核酸としては、測定の対象とする核酸と相補
的にハイブリダイズするものを使用することができる。
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも使用できる。

【００２５】生理活性物質として抗体４を用いた場合、
通常は抗体４のＦｃフラグメントが有機ケイ素膜３の表
面のみに固定化され、抗体４は単分子層状態に形成され
る。但し、抗体４のＦａｂフラグメントが有機ケイ素膜
３から離れる程、感度や反応速度が低下するため、図３
に示すようにＦａｂフラグメント（図３(a) ）又はＦ
(ａｂ')₂ フラグメント（図３(b) ）を直接有機ケイ素
膜３に固定化して、感度や反応速度を向上させてもよ
い。

【００２６】生理活性物質の厚さは、使用する生理活性
物質自体の大きさにもよるが、100〜3000Åであるのが
好ましく、特に100 〜1000Åであるのが好ましい。生理
活性物質の固定化方法は常法によって行えばよく、例え
ば、所定量の生理活性物質を有機ケイ素膜３に所定時間
接触させることにより固定化することができる。また、
フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに測
定チップを設置して一定流量の生理活性物質を所定時間
（所定量）流すことによっても固定化できる。

【００２７】生理活性物質として抗体４を用いた場合で
あって、抗体４のＦａｂフラグメントを直接有機ケイ素
膜３に固定化する場合には、パパインを用いて抗体４を
部分分解した後、同様の処理を行えばよい。一方、抗体
４のＦ(ａｂ')₂ フラグメントを直接有機ケイ素膜３に
固定化する場合には、ペプシンを用いて抗体４を部分分
解した後、同様の処理を行えばよい。

【００２８】水溶性二価性試薬は、生理活性物質を共有
結合的に強固に固定化できるものであれば、特に限定さ
れない。そのような水溶性二価性試薬としては、例えば
グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェ
ニレンジマレイミド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート、Ｎ−スクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシ
ニミジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−
６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル
−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン
酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香
酸、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスクシ
ンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロ
イロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−
（８−マレイミドカプリロキシ）スルホスクシンイミド
・ナトリウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロ
キシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ［２−
（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸等が
挙げられ、それぞれ単独で又は組み合わせて使用するこ
とができる。これらの中でも、汎用性が高く、取扱いの
容易なグルタルアルデヒドが好ましい。

【００２９】このように水溶性二価試薬を介して生理活
性物質を強固に固定化することにより、当該測定チップ
を洗浄しても生理活性物質の固定化を維持できるため、
繰り返し測定に使用することができるという利点が得ら
れる。水溶性二価試薬は、有機ケイ素膜３に接触させる
ことにより固定化できる。この水溶性二価値試薬に生理
活性物質を固定化する方法は、有機ケイ素膜３に生理活
性物質を固定化する場合と同様にして行うことができ
る。

【００３０】本発明の測定チップは、例えば、図４に示
されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用
することができる。この表面プラズモン共鳴バイオセン
サーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器
９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測
定チップ６を設置して使用する。測定チップ６は、透明
基板が上になるように設置する。カートリッジブロック
７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測
定チップ６とで測定セル71が構成される。測定セル71
は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に
連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流
れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出さ
れる。

【００３１】光源８からは、測定チップ６の透明基板に
向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ６
の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、
検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を
検出することができる。

【００３２】上記のような構造によって、ある入射角θ
に対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる（図９
参照）。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン
共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ６の透明
基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバ
ネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜に
も表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つ
の表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネル
ギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用さ
れ、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモン
の波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の
影響を受けるため、測定対象物質と生理活性物質との相
互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモ
ン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強
度曲線の谷のずれによって、測定対象物質の濃度の変化
を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグ
ナルといわれ、10^-4°の変化を１RUとして表す。

【００３３】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。〔実施例１〕本実施例では、図１に示されるような構成
を有する測定チップを作製した。

【００３４】透明基板としては、18mm×18mm、厚さ0.17
mmのカバーグラス（松浪硝子工業社製）を使用した。こ
の透明基板上に、スパッタリングによりクロムからなる
層、次いで金からなる層を形成した。スパッタリング
は、クロムについては100 Ｗ，30秒間、金については10
0 Ｗ，150 秒間で行った。得られたクロム層の厚さは3
2.2Åであり、金層の厚さは474 Åであった。

【００３５】上記の金属膜を有する透明基板を、シラン
カップリング剤の飽和蒸気中に暴露し、金属膜上に有機
ケイ素膜を形成させた。まず、10mlサンプルびんに原液
のままのγ−アミノプロピルエトキシシラン（H₂N-(C
H₂)₃Si(OEt)₃、東芝シリコーン（株）TSL 8331 ）を50
0 μl 入れ、室温で24時間放置し、びん内部をγ−アミ
ノプロピルエトキシシランの飽和蒸気で満たした。次
に、上記で作成した透明基板を、金属膜部分が露出する
ようにＰＥＴ製のマスク（支持具）の中央部に固定し、
このマスクをサンプルびんの開口部に載せ、15分又は90
分間放置し、カバーグラスの金属膜上に有機ケイ素膜を
形成させ、測定チップを作製した。

【００３６】この測定チップを、市販の表面プラズモン
共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社
製、BIAcore2000 ）のカートリッジブロック上に設置し
た。このセンサーは図４に示すような構造を有する。こ
のセンサーの測定セルに５％グルタルアルデヒドを流速
１μl/分で20分間流し込み、次いで、１mg/ml の抗ヒト
血清アルブミン抗体を流速１μl/分で10時間流し込み、
有機ケイ素膜の表面に抗ヒト血清アルブミン抗体を固定
化した。ここで、固定されていない余分な抗体を洗い流
すために、0.1 Ｎの塩酸５μl を流速５μl/min で測定
セルに流し込んだ。

【００３７】抗体を固定化した測定チップを設置した測
定セルに、0.01、10、又は100 μg/mlに希釈したヒト血
清アルブミン（ＨＳＡ）を流速５μl/分で10分間流しな
がら光強度を測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。ま
た、対照としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を流した
場合の共鳴シグナルも求めた。この結果を図５に示す。
図中、●はシランカップリング剤に90分暴露して作製し
たチップでＨＳＡを測定した場合であり、○はシランカ
ップリング剤に15分暴露して作製したチップでＨＳＡを
測定した場合であり、■はシランカップリング剤に90分
暴露して作製したチップでＢＳＡを測定した場合であ
り、□はシランカップリング剤に15分暴露して作製した
チップでＢＳＡを測定した場合である。

【００３８】図５に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、ＨＳＡを
流した場合には、試料濃度と共鳴シグナルに正比例に類
似した関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起
因するものであるものと推測される。これより、本実施
例による測定チップを用いれば、共鳴シグナルの値を測
定することにより抗原を定量することができる。

【００３９】また、シランカップリング剤に長時間暴露
して作製したチップを使用した場合の方が共鳴シグナル
が高かった。これは、長時間暴露することにより、それ
だけ多くのアミノ基が金属膜上に導入され、その結果固
定化される抗体の数も増加したためと推測される。

【００４０】（実施例２）実施例１と同様にして作成し
た測定チップを、実施例１で使用したバイオセンサーの
カートリッジブロック上に設置し、測定セルに５％グル
タルアルデヒドを流速１μl/分で20分間流し込み、次い
で、0.5 mg/ml の抗アトラジン抗体を流速１μl/分で60
0 分間流し込み、有機ケイ素膜に抗アトラジン抗体を固
定した。固定されていない余分な抗体は、実施例１と同
様にして除去した。

【００４１】抗体を固定した測定チップを設置した測定
セルに、0.01、0.1 、１、10、又は100 ppm に希釈した
アトラジンを流速５μl/分で10分間流しながら光強度を
測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。アトラジンは分
子量が小さいため（MW:215.5）、単独で流すと共鳴シグ
ナルが通常の抗原を用いた場合の１／５程度しか観測で
きない。そこで、アトラジンを西洋ワサビ由来ペルオキ
シダーゼで標識して流した。また、対照としてＢＳＡを
流した場合の共鳴シグナルも求めた。この結果を図６に
示す。図中、▲はシランカップリング剤に90分暴露して
作製したチップでアトラジンを測定した場合であり、△
はシランカップリング剤に15分暴露して作製したチップ
でアトラジンを測定した場合であり、■はシランカップ
リング剤に90分暴露して作製したチップでＢＳＡを測定
した場合であり、□はシランカップリング剤に15分暴露
して作製したチップでＢＳＡを測定した場合である。

【００４２】図６に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、アトラジ
ンを流した場合（90分暴露チップ）には、試料濃度と共
鳴シグナルの間にほぼ正比例の関係がみられた。これ
は、抗体の特異的反応に起因するものであるものと推測
される。これより、本実施例による測定チップを用いれ
ば、共鳴シグナルの値を測定することにより抗原を定量
することができる。なお、15分暴露チップでは、試料濃
度と共鳴シグナルの間に正比例関係がみられなかった
が、これは試料濃度１ppm 程度で抗アトラジンが飽和し
てしまったためと推測される。

【００４３】（比較例１）実施例１で使用したバイオセ
ンサーに、該センサー用の市販の測定チップをカートリ
ッジブロックに設置した。この測定チップは、図７に示
されるような構造を有する。

【００４４】この測定チップが有する多孔性材料（カル
ボキシメチルデキストラン）を活性化するために、１−
エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド（400 mM／H₂O ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（100 mM／H₂O ）との混合物35μl を流速５μl/min で
測定セルに流し込んだ。次いで、50μg/mlの抗ヒト血清
アルブミン抗体35μl を流速５μl/min で測定セルに流
し込み、カルボキシメチルデキストランに抗ヒト血清ア
ルブミン抗体を固定化した。その後、固定化した抗体を
ブロッキングするためにエタノールアミン35μl を流速
５μl/min で測定セルに流し込み、次いで固定されてい
ない余分な抗体を洗い流すために、0.1 Ｎの塩酸５μl
を流速５μl/min で測定セルに流し込んだ。

【００４５】抗体を固定化した測定チップを設置した測
定セルに、実施例１と同様にしてＨＳＡを流しながら光
強度を測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。また、対
照としてＢＳＡを流した場合の共鳴シグナルも求めた。
この結果を図８に示す。図中、×がＨＳＡを流した場合
であり、＋がＢＳＡを流した場合である。

【００４６】図８に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、ＨＳＡを
流した場合には、試料濃度と共鳴シグナルの間にほぼ正
比例の関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起
因するものであるものと推測される。

【００４７】〔実施例３〕実施例１と同様にして測定チ
ップを作製し、抗ヒト血清アルブミン抗体を固定した
後、1 、10、又は100 μg/mlに希釈したＨＳＡを流速５
μl/分で10分間流しながら光強度を測定し、共鳴シグナ
ル（RU）を求めた。また、対照としてＢＳＡを流した場
合の共鳴シグナルも求めた。この結果を図８に示す。図
中、●はシランカップリング剤に90分暴露して作製した
チップでＨＳＡを測定した場合であり、○はシランカッ
プリング剤に15分暴露して作製したチップでＨＳＡを測
定した場合であり、■はシランカップリング剤に90分暴
露して作製したチップでＢＳＡを測定した場合であり、
□はシランカップリング剤に15分暴露して作製したチッ
プでＢＳＡを測定した場合である。

【００４８】図８において、比較例１の測定チップを使
用した場合と実施例３の測定チップを使用した場合の共
鳴シグナルを比較すると、実施例３の測定チップを使用
した場合には、比較例１の測定チップを使用した場合の
ほぼ２倍の共鳴シグナル（RU）が計測された。従って、
実施例３の測定チップを使用することにより、約２倍の
感度で抗原等の定量が可能である。

【００４９】〔試験例１〕実施例１で作成した金属膜を
有する透明基板を、実施例１で使用したバイオセンサー
のカートリッジ上に設置し、入射角θに対応する反射光
の強度を測定した。この結果を図９に示す。また、対照
として、金層のみを有し、クロム層を有しない基板につ
いても反射光強度を測定した。図中の−□−が金層及び
クロム層を有する透明基板の反射光強度曲線であり、─
── が金層のみを有する透明基板の反射光強度曲線で
ある。図９に示すように、金層とクロム層を設けた場合
でも、金層のみを設けた場合でも、表面プラズモン共鳴
が生じることがわかる。

【００５０】

【発明の効果】本発明の測定チップは、製造が容易であ
り、また、固定化する生理活性物質が少量であっても、
良好な感度で測定対象物質を測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一例による測定チップの概略断面図で
ある。

【図２】従来の測定チップの概略断面図である。

【図３】抗体を固定した測定チップの概略断面図であ
る。(a) は抗体のＦａｂフラグメントを固定化した例、
(b) は抗体のＦ(ａｂ')₂ フラグメントを固定化した例
を示す図である。

【図４】本発明の測定チップに使用する表面プラズモン
共鳴バイオセンサーの概念図である。

【図５】実施例１で得られた、ＨＳＡ濃度と共鳴シグナ
ルとの関係を示すグラフである。

【図６】実施例２で得られた、アトラジン濃度と共鳴シ
グナルとの関係を示すグラフである。

【図７】比較例１で使用した測定チップの概略断面図で
ある。

【図８】実施例３及び比較例１で得られた、ＨＳＡ濃度
と共鳴シグナルとの関係を示すグラフである。

【図９】金属膜を形成した基板の反射光強度曲線を示す
グラフである。

【符号の説明】

１，１'…透明基板２…金属膜２'…金属膜３…有機ケイ素膜４…抗体５…多孔性材料６…測定チップ７…カートリッジブロック 71…測定セル 72，73…流路８…光源 80…入射光９…検出器 90…反射光

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】透明基板、該透明基板上に配置される金
属膜、及び該金属膜上に配置される有機ケイ素膜を備え
ていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用測定チップ。
【請求項２】前記有機ケイ素膜がシランカップリング
剤により形成された膜であることを特徴とする、請求項
１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チッ
プ。
【請求項３】前記シランカップリング剤が３−アミノ
プロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチル
シラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリ
メトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピ
ル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピル
トリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプトプ
ロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とする、請求項２記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。
【請求項４】透明基板上に金属膜を配置した後、該金
属膜の上に有機ケイ素膜を配置することを特徴とする、
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造
方法。
【請求項５】前記有機ケイ素膜をシランカップリング
剤を用いて形成させることを特徴とする、請求項４記載
の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製
造方法。
【請求項６】シランカップリング剤が、３−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメ
トキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシ
ラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメ
トキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピ
ル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピル
トリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプトプ
ロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とする、請求項５記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。