JPH10267834A - Measurement chip for surface plasmon resonance biosensor and its manufacture - Google Patents
Measurement chip for surface plasmon resonance biosensor and its manufactureInfo
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- JPH10267834A JPH10267834A JP9073645A JP7364597A JPH10267834A JP H10267834 A JPH10267834 A JP H10267834A JP 9073645 A JP9073645 A JP 9073645A JP 7364597 A JP7364597 A JP 7364597A JP H10267834 A JPH10267834 A JP H10267834A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は表面プラズモン共鳴
バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法に関す
る。The present invention relates to a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor and a method for manufacturing the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】現在、臨床検査等で免疫反応を利用した
測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や
標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすること
なく、リガンドの変化を高感度に検出することのできる
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した免疫センサー
が使用されている。2. Description of the Related Art At present, many measurements using an immunological reaction are performed in clinical examinations and the like. However, the conventional method requires complicated operations and a labeling substance. An immunosensor using surface plasmon resonance (SPR) capable of detecting a change in the sensitivity with high sensitivity is used.
【０００３】このような表面プラズモン共鳴を利用した
測定装置（表面プラズモン共鳴バイオセンサー）で一般
的に使用される測定チップは、図２に示すような構造を
有する。即ち、ガラス基板１'上に成膜された金属膜２'
の上に、多孔性材料５が形成されており、この多孔性材
料５の表面及び内部に酵素、抗体等の生理活性物質が担
持又は固定されている。この多孔性材料５としては、例
えば合成繊維、天然繊維、無機繊維等からなる織物、編
物、不織布や、多孔性の無機又は有機材料などが使用さ
れる（特開平3-164195号公報参照）。また、市販品（BI
Acore 2000用，ファルマシアバイオセンサー社製）で
は、この多孔性材料５としてカルボキシメチルデキスト
ランが用いられている。A measuring chip generally used in such a measuring apparatus utilizing surface plasmon resonance (surface plasmon resonance biosensor) has a structure as shown in FIG. That is, the metal film 2 ′ formed on the glass substrate 1 ′
A porous material 5 is formed thereon, and a physiologically active substance such as an enzyme or an antibody is carried or fixed on the surface and inside of the porous material 5. As the porous material 5, for example, a woven fabric, a knitted fabric, a nonwoven fabric, or a porous inorganic or organic material made of synthetic fiber, natural fiber, inorganic fiber, or the like is used (see JP-A-3-164195). In addition, commercial products (BI
For Acore 2000, manufactured by Pharmacia Biosensor), carboxymethyl dextran is used as the porous material 5.
【０００４】しかしながら、測定対象物と実質的にかつ
効率的に相互作用する生理活性物質は、多孔性材料５の
表面に存在するものだけであるため、多孔性材料５の内
部に担持又は固定されている生理活性物質は有効に機能
せず、その分感度が低下することとなる。However, since the physiologically active substance that substantially and efficiently interacts with the object to be measured exists only on the surface of the porous material 5, it is carried or fixed inside the porous material 5. The physiologically active substance does not function effectively, and the sensitivity is reduced accordingly.
【０００５】また、生理活性物質を金属膜２'に固定す
る方法として、ＬＢ（Langmuir-Blodgett ）法が用いら
れる場合もあるが（特開平5-288672号公報参照）、ＬＢ
膜と金属膜との結合が弱く、ＬＢ膜が生理活性物質と共
に脱落するという問題がある。In some cases, the LB (Langmuir-Blodgett) method is used as a method for fixing a physiologically active substance to the metal film 2 '(see Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-288672).
There is a problem that the bond between the film and the metal film is weak, and the LB film falls off together with the physiologically active substance.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、固定
化する生理活性物質が少量であっても、良好な感度が得
られ、かつ製造が容易な表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用の測定チップを提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor which can obtain good sensitivity and can be easily manufactured even if a small amount of a physiologically active substance is immobilized. To provide.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者は、金属膜上に有機ケイ素膜を形成
し、該有機ケイ素膜に生理活性物質を固定化すれば、使
用する生理活性物質が少量であっても良好な感度が得ら
れることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、透明基板、該透明基板上に配置される金属膜、及び
該金属膜上に配置される有機ケイ素膜を備えていること
を特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップである。Means for Solving the Problems In view of the above-mentioned problems, as a result of intensive studies, the present inventor has found that an organic silicon film is formed on a metal film, and a bioactive substance is immobilized on the organic silicon film. The present inventors have found that good sensitivity can be obtained even with a small amount of a physiologically active substance, and completed the present invention. That is, the present invention provides a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor, comprising a transparent substrate, a metal film disposed on the transparent substrate, and an organosilicon film disposed on the metal film. is there.
【０００８】また、本発明は、透明基板上に金属膜を配
置した後、該金属膜の上に有機ケイ素膜を配置すること
を特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップの製造方法である。Further, the present invention provides a method for manufacturing a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor, which comprises disposing a metal film on a transparent substrate and then disposing an organic silicon film on the metal film. is there.
【０００９】[0009]
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ（以下、単に「測定チップ」という）とは、表
面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチップで
あって、該センサーより照射された光を透過及び反射す
る部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部
材をいい、該センサーの本体に固着されるものであって
もよく、また脱着可能なものであってもよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor in the present invention (hereinafter, simply referred to as “measurement chip”) is a chip used for a surface plasmon resonance biosensor, and transmits and reflects light emitted from the sensor. Refers to a member including a portion and a portion for fixing a physiologically active substance, which may be fixed to the main body of the sensor or may be removable.
【００１０】本発明の測定チップは、透明基板、該透明
基板上に配置される金属膜、及び該金属膜上に配置され
る有機ケイ素膜を備えている。ここで、「透明基板上に
配置される金属膜」とは、金属膜が直接接して透明基板
上に配置されている場合のほか、金属膜が透明基板に直
接接することなく、他の層を介して配置されている場合
をも含む意である。「金属膜上に配置される有機ケイ素
膜」も上記と同様の意味である。[0010] The measurement chip of the present invention includes a transparent substrate, a metal film disposed on the transparent substrate, and an organic silicon film disposed on the metal film. Here, the `` metal film disposed on the transparent substrate '' refers to not only the case where the metal film is directly in contact with the transparent substrate but also the other layer without the metal film directly contacting the transparent substrate. It is intended to include the case where they are arranged through the intermediary. The “organic silicon film disposed on the metal film” has the same meaning as described above.
【００１１】本発明の一例による測定チップの断面概略
図を図１に示す。本実施例による測定チップは、透明基
板１と、透明基板１上に形成された金属膜２と、金属膜
２の上に形成された有機ケイ素膜３とを有する。透明基
板１としては、通常表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用の測定チップに使用されるものであればどのようなも
のでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタ
レート、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透
明な材料からなるものが使用でき、偏光に対して異方性
を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましく、その厚さ
は0.1 〜20mm程度である。FIG. 1 is a schematic sectional view of a measuring chip according to an example of the present invention. The measurement chip according to the present embodiment has a transparent substrate 1, a metal film 2 formed on the transparent substrate 1, and an organic silicon film 3 formed on the metal film 2. The transparent substrate 1 may be any substrate as long as it is generally used for a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor, and is generally transparent to laser light such as glass, polyethylene terephthalate, and polycarbonate. A material made of a material can be used, and a material which does not show anisotropy with respect to polarized light and has excellent workability is desirable, and its thickness is about 0.1 to 20 mm.
【００１２】金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が
生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金
属膜２に使用することのできる金属の種類としては、
金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それら
を単独で又は組み合わせて使用することができる。ま
た、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１
と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層
を設けてもよい。The metal film 2 is not particularly limited as long as it can generate surface plasmon resonance. The types of metals that can be used for the metal film 2 include:
Gold, silver, copper, aluminum, platinum and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination. Further, in consideration of the adhesion to the transparent substrate 1, the transparent substrate 1
An intervening layer made of chromium or the like may be provided between the layer and the layer made of gold, silver, or the like.
【００１３】金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるの
が好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。30
00Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出
することができない。また、クロム等からなる介在層を
設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが
好ましい。The thickness of the metal film 2 is preferably 100 to 2000 °, more preferably 200 to 600 °. 30
If it exceeds 00 °, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. When an intervening layer made of chromium or the like is provided, the thickness of the intervening layer is preferably 5 to 50 °.
【００１４】金属膜２の形成は常法によって行えばよ
く、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティン
グ法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこ
とができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いる
のが好ましい。The metal film 2 may be formed by a conventional method, for example, a sputtering method, a vapor deposition method, an ion plating method, an electroplating method, an electroless plating method, or the like. Among these methods, it is preferable to use the sputtering method.
【００１５】有機ケイ素膜３とは、Ｓｉ−Ｏ及びＳｉ−
Ｃ結合を分子内に含む高分子からなる膜をいう。該有機
ケイ素膜３は、例えば、シランカップリング剤を用いて
形成させることができる。シランカップリング剤とは、
その分子中にビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカ
プト基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、
メトキシ基、エトキシ基のような無機材料と親和性のあ
る加水分解基を有する有機ケイ素化合物のことをいう。
シランカップリング剤中の加水分解基は、金属膜２中の
金属原子と結合し、有機官能基は生理活性物質と結合す
る。これにより金属膜２、有機ケイ素膜３及び生理活性
物質の三者は強固に固定される。本発明に使用できるシ
ランカップリング剤は、上記定義に該当するものであれ
ばいかなるものでもよく、３−アミノプロピルトリエト
キシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２
−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、
３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメ
チルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラ
ン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシラン
などを単独又は組み合わせて使用することができる。The organic silicon film 3 is composed of Si—O and Si—
Refers to a film made of a polymer containing a C bond in the molecule. The organic silicon film 3 can be formed using, for example, a silane coupling agent. What is a silane coupling agent?
Organic functional groups having affinity for organic materials such as vinyl group, epoxy group, amino group, mercapto group in the molecule,
It refers to an organosilicon compound having a hydrolyzable group having an affinity for an inorganic material such as a methoxy group and an ethoxy group.
The hydrolyzable group in the silane coupling agent bonds to a metal atom in the metal film 2, and the organic functional group bonds to a physiologically active substance. Thereby, the metal film 2, the organic silicon film 3, and the physiologically active substance are firmly fixed. The silane coupling agent that can be used in the present invention may be any one as long as it satisfies the above definition, such as 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane,
3-aminopropyldiethoxymethylsilane, 3- (2
-Aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane,
3- (2-aminoethylaminopropyl) dimethoxymethylsilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, dimethoxy-3-mercaptopropylmethylsilane and the like can be used alone or in combination.
【００１６】有機ケイ素膜３は、ケイ素原子が上下方向
に重ならない単分子層膜であることが好ましい。単分子
層膜にすることにより、生理活性物質と相互作用する測
定対象物と、入射した光が反射する面との距離を短くす
ることができ、良好な感度が得られるとともに、使用す
るシランカップリング剤の量を必要最小限に抑え、コス
トの低減化を図ることができる。The organic silicon film 3 is preferably a monolayer film in which silicon atoms do not overlap in the vertical direction. By forming a monolayer film, the distance between the measurement target that interacts with the physiologically active substance and the surface from which the incident light is reflected can be shortened, and good sensitivity can be obtained. The amount of the ring agent can be minimized, and the cost can be reduced.
【００１７】また、有機ケイ素膜３は、細密充填構造を
とるのが好ましい。細密充填構造とは、有機ケイ素膜３
を構成するＳｉ及びＯの網目構造中に他の分子が貫入す
る余地のないほど、網目構造が緻密であることをいう。
細密充填構造をとることにより、生理活性物質を高い密
度で均等に固定化することができ、測定感度を向上させ
ることができる。有機ケイ素膜３が細密充填構造をとる
かどうかは、以下の方法により確認することができる。It is preferable that the organic silicon film 3 has a close-packed structure. The close-packed structure means that the organic silicon film 3
Means that the network structure is so dense that there is no room for other molecules to penetrate into the network structure of Si and O.
By adopting a close-packed structure, a physiologically active substance can be uniformly immobilized at a high density, and the measurement sensitivity can be improved. Whether or not the organic silicon film 3 has a close-packed structure can be confirmed by the following method.
【００１８】プロピルエトキシシラン（シランカップリ
ング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシランの
アミノ基を水素原子で置換した化合物）を用いて金属膜
２上に有機ケイ素膜３を形成させる。プロピルエトキシ
シランは、強い疎水性を有する化合物なので、有機ケイ
素膜２の表面の濡れ程度により、プロピルエトキシシラ
ンの密度（即ち、有機ケイ素膜３の細密充填の程度）を
知ることができる。即ち、シリンジにより蒸留水を滴下
した際に表面が一様に水滴を弾くのであれば有機ケイ素
膜３は細密充填構造をとっており、表面が部分的にしか
水を弾かないのであれば、細密充填構造をとっておら
ず、Ｓｉ及びＯの網目構造に空隙が存在することが推測
される。An organosilicon film 3 is formed on the metal film 2 using propylethoxysilane (a compound in which the amino group of 3-aminopropyltriethoxysilane, which is a silane coupling agent, is substituted with a hydrogen atom). Since propylethoxysilane is a compound having strong hydrophobicity, the density of propylethoxysilane (that is, the degree of close packing of the organic silicon film 3) can be known from the degree of wetting of the surface of the organic silicon film 2. That is, if the surface repels water droplets uniformly when distilled water is dropped with a syringe, the organosilicon film 3 has a finely packed structure, and if the surface only partially repels water, It is presumed that voids are present in the network structure of Si and O without a filled structure.
【００１９】有機ケイ素膜３は、例えば、シランカップ
リング剤を用いることにより形成させることができる。
具体的には、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属
膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカ
ップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬す
る方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピン
コーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラ
ビア法）などにより成膜することができる。本発明にお
いては、これらのいずれの方法を用いてもよいが、細密
充填構造をとる単分子層膜を形成させるためには、飽和
蒸気法を用いるのが好ましい。The organic silicon film 3 can be formed by using, for example, a silane coupling agent.
Specifically, a method of exposing the metal film 2 to a saturated vapor of the silane coupling agent for a predetermined time (saturated vapor method), and a method of immersing the metal film 2 in a solution containing the silane coupling agent for a predetermined time (immersion method) ), A method using a spin coater (spin coating method), a method using a gravure printing machine (gravure method), and the like. In the present invention, any of these methods may be used, but it is preferable to use a saturated vapor method in order to form a monolayer film having a finely packed structure.
【００２０】飽和蒸気法においては、暴露時の温度、湿
度なども単分子層構造及び細密充填構造の形成に影響を
与えるが、暴露時間が最も重要な要素である。暴露時間
が長すぎると単分子層構造が得られず、また、暴露時間
が短すぎると細密充填構造が得られない。暴露時間は、
通常、１〜600 分とするのが好ましく、15〜90分とする
のが更に好ましい。In the saturated vapor method, the temperature, humidity and the like at the time of exposure also affect the formation of the monolayer structure and the close-packed structure, but the exposure time is the most important factor. If the exposure time is too long, a monolayer structure cannot be obtained, and if the exposure time is too short, a finely packed structure cannot be obtained. Exposure time is
Usually, it is preferably from 1 to 600 minutes, more preferably from 15 to 90 minutes.
【００２１】本発明における有機ケイ素膜３は、以下の
ような利点を有する。 生理活性物質を金属膜２に極めて近い位置に固定す
ることができるので、従来の測定チップを使用する場合
よりも大幅に測定感度を向上させることができる。 成膜が容易であり、また、一度に大量の成膜処理が
できる。 シランカップリング剤の種類を変えることにより、
膜厚だけでなく、表面改質、官能基導入などの化学修飾
が可能となる。 本発明の測定チップは、有機ケイ素膜３に、直接又は水
溶性二価性試薬を介して、生理活性物質を固定して使用
する。The organosilicon film 3 of the present invention has the following advantages. Since the physiologically active substance can be fixed at a position very close to the metal film 2, the measurement sensitivity can be greatly improved as compared with the case where a conventional measurement chip is used. Film formation is easy, and a large amount of film formation processing can be performed at once. By changing the type of silane coupling agent,
In addition to film thickness, chemical modification such as surface modification and functional group introduction becomes possible. The measurement chip of the present invention is used by immobilizing a physiologically active substance on the organosilicon film 3 directly or via a water-soluble bivalent reagent.
【００２２】生理活性物質としては、測定対象物と相互
作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白
質、酵素、微生物、核酸等が挙げられる。免疫蛋白質と
しては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを
例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロ
ブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ
を使用することができる。具体的には、測定対象物がヒ
ト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アル
ブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫
剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、
コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合に
は、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗
メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ
抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用
することができる。The physiologically active substance is not particularly limited as long as it interacts with the object to be measured, and includes, for example, immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids and the like. Examples of the immunity protein include an antibody and a hapten having a measurement target as an antigen. Antibodies include various immunoglobulins, ie, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
Can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. Also, pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics,
When ***e, heroin, crack, etc. are used as antigens, for example, anti-atrazine antibody, anti-kanamycin antibody, anti-methamphetamine antibody, or O.
Antibodies against the antigens 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.
【００２３】酵素としては、測定対象物又は測定対象物
から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、
特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元
酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素
等を使用することができる。具体的には、測定対象物が
グルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定
対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキ
シダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫
剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、
コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場
合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示
す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールア
ミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ド
ーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができ
る。[0023] As the enzyme, any enzyme can be used as long as it has an activity on an object to be measured or a substance metabolized from the object to be measured.
Without limitation, various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase, lyase, and synthase can be used. Specifically, when the measurement target is glucose, glucose oxidase can be used, and when the measurement target is cholesterol, cholesterol oxidase can be used. Also, pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics,
When ***e, heroin, cracks and the like are to be measured, an enzyme such as acetylcholinesterase, catecholamine esterase, noradrenaline esterase, and dopamine esterase that shows a specific reaction with a substance metabolized from them can be used. .
【００２４】微生物としては、特に限定されることな
く、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用すること
ができる。核酸としては、測定の対象とする核酸と相補
的にハイブリダイズするものを使用することができる。
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも使用できる。The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used. As the nucleic acid, a nucleic acid that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used.
As the nucleic acid, any of DNA and RNA can be used.
【００２５】生理活性物質として抗体４を用いた場合、
通常は抗体４のＦｃフラグメントが有機ケイ素膜３の表
面のみに固定化され、抗体４は単分子層状態に形成され
る。但し、抗体４のＦａｂフラグメントが有機ケイ素膜
３から離れる程、感度や反応速度が低下するため、図３
に示すようにＦａｂフラグメント（図３(a) ）又はＦ
(ａｂ')2 フラグメント（図３(b) ）を直接有機ケイ素
膜３に固定化して、感度や反応速度を向上させてもよ
い。When antibody 4 is used as a physiologically active substance,
Usually, the Fc fragment of the antibody 4 is immobilized only on the surface of the organic silicon film 3, and the antibody 4 is formed in a monolayer state. However, as the Fab fragment of the antibody 4 moves away from the organosilicon film 3, the sensitivity and the reaction rate decrease.
The Fab fragment (FIG. 3 (a)) or F
The (ab ') 2 fragment (FIG. 3 (b)) may be directly immobilized on the organosilicon film 3 to improve the sensitivity and the reaction rate.
【００２６】生理活性物質の厚さは、使用する生理活性
物質自体の大きさにもよるが、100〜3000Åであるのが
好ましく、特に100 〜1000Åであるのが好ましい。生理
活性物質の固定化方法は常法によって行えばよく、例え
ば、所定量の生理活性物質を有機ケイ素膜３に所定時間
接触させることにより固定化することができる。また、
フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに測
定チップを設置して一定流量の生理活性物質を所定時間
（所定量）流すことによっても固定化できる。The thickness of the physiologically active substance depends on the size of the physiologically active substance used, but is preferably from 100 to 3000 °, more preferably from 100 to 1000 °. The physiologically active substance may be immobilized by a conventional method, for example, by bringing a predetermined amount of the physiologically active substance into contact with the organosilicon film 3 for a predetermined time. Also,
It can also be immobilized by installing a measurement chip on a flow cell type surface plasmon resonance biosensor and flowing a constant flow of a physiologically active substance for a predetermined time (a predetermined amount).
【００２７】生理活性物質として抗体４を用いた場合で
あって、抗体４のＦａｂフラグメントを直接有機ケイ素
膜３に固定化する場合には、パパインを用いて抗体４を
部分分解した後、同様の処理を行えばよい。一方、抗体
４のＦ(ａｂ')2 フラグメントを直接有機ケイ素膜３に
固定化する場合には、ペプシンを用いて抗体４を部分分
解した後、同様の処理を行えばよい。When the antibody 4 is used as a physiologically active substance and the Fab fragment of the antibody 4 is directly immobilized on the organosilicon film 3, the antibody 4 is partially decomposed with papain, and Processing may be performed. On the other hand, when the F (ab ′) 2 fragment of the antibody 4 is directly immobilized on the organosilicon film 3, the same treatment may be performed after the antibody 4 is partially decomposed using pepsin.
【００２８】水溶性二価性試薬は、生理活性物質を共有
結合的に強固に固定化できるものであれば、特に限定さ
れない。そのような水溶性二価性試薬としては、例えば
グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェ
ニレンジマレイミド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート、Ｎ−スクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシ
ニミジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−
６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル
−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン
酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香
酸、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスクシ
ンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロ
イロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−
（８−マレイミドカプリロキシ）スルホスクシンイミド
・ナトリウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロ
キシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ［２−
（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸等が
挙げられ、それぞれ単独で又は組み合わせて使用するこ
とができる。これらの中でも、汎用性が高く、取扱いの
容易なグルタルアルデヒドが好ましい。The water-soluble divalent reagent is not particularly limited as long as it can firmly immobilize a physiologically active substance covalently. Examples of such a water-soluble bivalent reagent include glutaraldehyde, periodic acid, N, N'-o-phenylenedimaleimide, N-succinimidyl-4- (N-
(Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, N-succinimidylmaleimidoacetic acid, N-succinimidyl-4-maleimidobutyric acid, N-succinimidyl-
6-maleimidohexanoic acid, N-sulfosuccinimidyl-4-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylic acid, N-sulfosuccinimidyl-3-maleimidobenzoic acid, N- (4-maleimidobutyryloxy) sulfosuccinimide Sodium salt, N- (6-maleimidocaproyloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N-
(8-maleimidocapryloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N- (11-maleimidoundecanoyloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N [2-
(1-piperazinyl) ethyl] maleimide / dihydrochloride, etc., and these can be used alone or in combination. Among these, glutaraldehyde which is highly versatile and easy to handle is preferable.
【００２９】このように水溶性二価試薬を介して生理活
性物質を強固に固定化することにより、当該測定チップ
を洗浄しても生理活性物質の固定化を維持できるため、
繰り返し測定に使用することができるという利点が得ら
れる。水溶性二価試薬は、有機ケイ素膜３に接触させる
ことにより固定化できる。この水溶性二価値試薬に生理
活性物質を固定化する方法は、有機ケイ素膜３に生理活
性物質を固定化する場合と同様にして行うことができ
る。Since the physiologically active substance is firmly immobilized via the water-soluble bivalent reagent as described above, the immobilization of the physiologically active substance can be maintained even when the measuring chip is washed.
The advantage is that it can be used for repeated measurements. The water-soluble bivalent reagent can be immobilized by contacting the organosilicon film 3. The method for immobilizing the physiologically active substance on the water-soluble bivalent reagent can be performed in the same manner as the method for immobilizing the physiologically active substance on the organosilicon film 3.
【００３０】本発明の測定チップは、例えば、図４に示
されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用
することができる。この表面プラズモン共鳴バイオセン
サーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器
９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測
定チップ６を設置して使用する。測定チップ６は、透明
基板が上になるように設置する。カートリッジブロック
７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測
定チップ６とで測定セル71が構成される。測定セル71
は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に
連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流
れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出さ
れる。The measurement chip of the present invention can be used, for example, for a surface plasmon resonance biosensor as shown in FIG. This surface plasmon resonance biosensor has a cartridge block 7, a light source 8, and a detector 9, and is used by mounting the measurement chip 6 of the present invention on the cartridge block 7. The measurement chip 6 is set so that the transparent substrate faces upward. A concave portion is provided on the upper surface of the cartridge block 7, and the concave portion and the measuring chip 6 constitute a measuring cell 71. Measurement cell 71
Is connected to the outside of the cartridge block 7 by the flow paths 72 and 73, and the sample flows into the measurement cell 71 through the flow path 72, and is discharged outside through the flow path 73 after being subjected to the measurement.
【００３１】光源８からは、測定チップ６の透明基板に
向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ６
の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、
検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を
検出することができる。The light source 8 irradiates monochromatic light toward the transparent substrate of the measuring chip 6 (incident light 80), and the measuring chip 6
The reflected light 90 reflected by the metal film provided on the back of
Light enters the detector 9. The detector 9 can detect the intensity of the reflected light 90.
【００３２】上記のような構造によって、ある入射角θ
に対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる（図９
参照）。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン
共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ６の透明
基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバ
ネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜に
も表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つ
の表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネル
ギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用さ
れ、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモン
の波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の
影響を受けるため、測定対象物質と生理活性物質との相
互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモ
ン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強
度曲線の谷のずれによって、測定対象物質の濃度の変化
を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグ
ナルといわれ、10-4°の変化を１RUとして表す。With the above structure, a certain incident angle θ
A reflected light intensity curve that forms a valley with respect to
reference). The valley in the reflected light intensity curve is due to surface plasmon resonance. That is, when light is totally reflected at the interface between the transparent substrate and the outside of the measurement chip 6, a surface wave called an evanescent wave is generated at the interface, and a surface wave called a surface plasmon is also generated on the metal film. When the wave numbers of the two surface waves match, resonance occurs, and part of the light energy is used to excite surface plasmons, and the intensity of the reflected light decreases. Here, the wave number of the surface plasmon is affected by the refractive index of the medium very close to the surface of the metal film. Is generated, the incident angle θ changes. Therefore, it is possible to detect a change in the concentration of the measurement target substance due to the shift of the valley of the reflected light intensity curve. The change amount of the incident angle θ is called a resonance signal, and a change of 10 −4 ° is represented as 1 RU.
【００３３】[0033]
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 〔実施例１〕本実施例では、図１に示されるような構成
を有する測定チップを作製した。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples. Example 1 In this example, a measurement chip having a configuration as shown in FIG. 1 was manufactured.
【００３４】透明基板としては、18mm×18mm、厚さ0.17
mmのカバーグラス（松浪硝子工業社製）を使用した。こ
の透明基板上に、スパッタリングによりクロムからなる
層、次いで金からなる層を形成した。スパッタリング
は、クロムについては100 Ｗ，30秒間、金については10
0 Ｗ，150 秒間で行った。得られたクロム層の厚さは3
2.2Åであり、金層の厚さは474 Åであった。As a transparent substrate, 18 mm × 18 mm, thickness 0.17
mm cover glass (Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) was used. On this transparent substrate, a layer made of chromium and then a layer made of gold were formed by sputtering. Sputtering is 100 W for 30 seconds for chromium and 10 W for gold.
The test was performed at 0 W for 150 seconds. The thickness of the obtained chrome layer is 3
2.2 mm and the thickness of the gold layer was 474 mm.
【００３５】上記の金属膜を有する透明基板を、シラン
カップリング剤の飽和蒸気中に暴露し、金属膜上に有機
ケイ素膜を形成させた。まず、10mlサンプルびんに原液
のままのγ−アミノプロピルエトキシシラン（H2N-(C
H2)3Si(OEt)3、東芝シリコーン（株）TSL 8331 ）を50
0 μl 入れ、室温で24時間放置し、びん内部をγ−アミ
ノプロピルエトキシシランの飽和蒸気で満たした。次
に、上記で作成した透明基板を、金属膜部分が露出する
ようにＰＥＴ製のマスク（支持具）の中央部に固定し、
このマスクをサンプルびんの開口部に載せ、15分又は90
分間放置し、カバーグラスの金属膜上に有機ケイ素膜を
形成させ、測定チップを作製した。The transparent substrate having the above metal film was exposed to a saturated vapor of a silane coupling agent to form an organosilicon film on the metal film. First, undiluted γ-aminopropylethoxysilane (H 2 N- (C 2
H 2 ) 3 Si (OEt) 3 , Toshiba Silicone Co., Ltd. TSL 8331) 50
0 μl of the mixture was left at room temperature for 24 hours, and the inside of the bottle was filled with saturated vapor of γ-aminopropylethoxysilane. Next, the transparent substrate created above is fixed to the center of a PET mask (support) so that the metal film portion is exposed,
Place the mask on the opening of the sample bottle and allow 15 minutes or 90 minutes.
After leaving it to stand for a minute, an organosilicon film was formed on the metal film of the cover glass to prepare a measurement chip.
【００３６】この測定チップを、市販の表面プラズモン
共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社
製、BIAcore2000 ）のカートリッジブロック上に設置し
た。このセンサーは図４に示すような構造を有する。こ
のセンサーの測定セルに５％グルタルアルデヒドを流速
１μl/分で20分間流し込み、次いで、１mg/ml の抗ヒト
血清アルブミン抗体を流速１μl/分で10時間流し込み、
有機ケイ素膜の表面に抗ヒト血清アルブミン抗体を固定
化した。ここで、固定されていない余分な抗体を洗い流
すために、0.1 Ｎの塩酸５μl を流速５μl/min で測定
セルに流し込んだ。The measurement chip was mounted on a cartridge block of a commercially available surface plasmon resonance biosensor (Pharmacia Biosensor, BIAcore2000). This sensor has a structure as shown in FIG. 5% glutaraldehyde was flowed into the measuring cell of this sensor at a flow rate of 1 μl / min for 20 minutes, and then 1 mg / ml anti-human serum albumin antibody was flowed at a flow rate of 1 μl / min for 10 hours.
An anti-human serum albumin antibody was immobilized on the surface of the organosilicon film. Here, 5 μl of 0.1 N hydrochloric acid was poured into the measurement cell at a flow rate of 5 μl / min in order to wash away unfixed excess antibody.
【００３７】抗体を固定化した測定チップを設置した測
定セルに、0.01、10、又は100 μg/mlに希釈したヒト血
清アルブミン（ＨＳＡ）を流速５μl/分で10分間流しな
がら光強度を測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。ま
た、対照としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を流した
場合の共鳴シグナルも求めた。この結果を図５に示す。
図中、●はシランカップリング剤に90分暴露して作製し
たチップでＨＳＡを測定した場合であり、○はシランカ
ップリング剤に15分暴露して作製したチップでＨＳＡを
測定した場合であり、■はシランカップリング剤に90分
暴露して作製したチップでＢＳＡを測定した場合であ
り、□はシランカップリング剤に15分暴露して作製した
チップでＢＳＡを測定した場合である。Light intensity was measured while flowing human serum albumin (HSA) diluted to 0.01, 10, or 100 μg / ml at a flow rate of 5 μl / min for 10 minutes into a measurement cell provided with a measurement chip on which the antibody was immobilized. And the resonance signal (RU) was determined. In addition, the resonance signal when bovine serum albumin (BSA) was flowed as a control was also determined. The result is shown in FIG.
In the figure, ● indicates the case where HSA was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 90 minutes, and ○ indicates the case where HSA was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 15 minutes. And ■ indicate the case where BSA was measured on a chip manufactured by exposing to a silane coupling agent for 90 minutes, and □ indicates the case where BSA was measured on a chip manufactured by exposing to a silane coupling agent for 15 minutes.
【００３８】図５に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、ＨＳＡを
流した場合には、試料濃度と共鳴シグナルに正比例に類
似した関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起
因するものであるものと推測される。これより、本実施
例による測定チップを用いれば、共鳴シグナルの値を測
定することにより抗原を定量することができる。As shown in FIG. 5, when BSA was passed, no change was observed in the resonance signal, but when HSA was passed, the relationship between the sample concentration and the resonance signal was directly proportional. Was done. This is presumed to be due to the specific reaction of the antibody. Thus, by using the measurement chip according to the present embodiment, the antigen can be quantified by measuring the value of the resonance signal.
【００３９】また、シランカップリング剤に長時間暴露
して作製したチップを使用した場合の方が共鳴シグナル
が高かった。これは、長時間暴露することにより、それ
だけ多くのアミノ基が金属膜上に導入され、その結果固
定化される抗体の数も増加したためと推測される。Further, the resonance signal was higher when a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for a long time was used. This is presumed to be due to the fact that as a result of prolonged exposure, more amino groups were introduced onto the metal film, and as a result, the number of immobilized antibodies also increased.
【００４０】（実施例２）実施例１と同様にして作成し
た測定チップを、実施例１で使用したバイオセンサーの
カートリッジブロック上に設置し、測定セルに５％グル
タルアルデヒドを流速１μl/分で20分間流し込み、次い
で、0.5 mg/ml の抗アトラジン抗体を流速１μl/分で60
0 分間流し込み、有機ケイ素膜に抗アトラジン抗体を固
定した。固定されていない余分な抗体は、実施例１と同
様にして除去した。(Example 2) A measurement chip prepared in the same manner as in Example 1 was placed on the cartridge block of the biosensor used in Example 1, and 5% glutaraldehyde was supplied to the measurement cell at a flow rate of 1 μl / min. Pour for 20 minutes, then add 0.5 mg / ml anti-atrazine antibody at a flow rate of 1 μl / min for 60 minutes.
After pouring for 0 minutes, the anti-atrazine antibody was immobilized on the organosilicon film. Excess antibody not fixed was removed in the same manner as in Example 1.
【００４１】抗体を固定した測定チップを設置した測定
セルに、0.01、0.1 、１、10、又は100 ppm に希釈した
アトラジンを流速５μl/分で10分間流しながら光強度を
測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。アトラジンは分
子量が小さいため（MW:215.5）、単独で流すと共鳴シグ
ナルが通常の抗原を用いた場合の１／５程度しか観測で
きない。そこで、アトラジンを西洋ワサビ由来ペルオキ
シダーゼで標識して流した。また、対照としてＢＳＡを
流した場合の共鳴シグナルも求めた。この結果を図６に
示す。図中、▲はシランカップリング剤に90分暴露して
作製したチップでアトラジンを測定した場合であり、△
はシランカップリング剤に15分暴露して作製したチップ
でアトラジンを測定した場合であり、■はシランカップ
リング剤に90分暴露して作製したチップでＢＳＡを測定
した場合であり、□はシランカップリング剤に15分暴露
して作製したチップでＢＳＡを測定した場合である。The light intensity was measured while flowing atrazine diluted to 0.01, 0.1, 1, 10, or 100 ppm at a flow rate of 5 μl / min for 10 minutes into the measurement cell on which the measurement chip on which the antibody was immobilized was placed. RU). Since atrazine has a small molecular weight (MW: 215.5), resonance signal can be observed only about 1/5 of that when a normal antigen is used when flown alone. Therefore, atrazine was labeled with horseradish peroxidase and allowed to flow. In addition, a resonance signal when BSA was passed as a control was also determined. The result is shown in FIG. In the figure, ▲ indicates a case where atrazine was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 90 minutes.
Indicates a case where atrazine was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 15 minutes, ■ indicates a case where BSA was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 90 minutes, and □ indicates a silane. This is a case where BSA was measured using a chip prepared by exposing to a coupling agent for 15 minutes.
【００４２】図６に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、アトラジ
ンを流した場合（90分暴露チップ）には、試料濃度と共
鳴シグナルの間にほぼ正比例の関係がみられた。これ
は、抗体の特異的反応に起因するものであるものと推測
される。これより、本実施例による測定チップを用いれ
ば、共鳴シグナルの値を測定することにより抗原を定量
することができる。なお、15分暴露チップでは、試料濃
度と共鳴シグナルの間に正比例関係がみられなかった
が、これは試料濃度１ppm 程度で抗アトラジンが飽和し
てしまったためと推測される。As shown in FIG. 6, when BSA was flowed, no change was observed in the resonance signal. However, when atrazine was flowed (tip exposed for 90 minutes), the resonance signal was not changed. A nearly directly proportional relationship was observed. This is presumed to be due to the specific reaction of the antibody. Thus, by using the measurement chip according to the present embodiment, the antigen can be quantified by measuring the value of the resonance signal. In the case of the chip exposed to 15 minutes, there was no direct proportional relationship between the sample concentration and the resonance signal, which is presumed to be due to the saturation of the anti-atrazine at the sample concentration of about 1 ppm.
【００４３】（比較例１）実施例１で使用したバイオセ
ンサーに、該センサー用の市販の測定チップをカートリ
ッジブロックに設置した。この測定チップは、図７に示
されるような構造を有する。Comparative Example 1 A commercially available measuring chip for the biosensor used in Example 1 was installed in a cartridge block. This measurement chip has a structure as shown in FIG.
【００４４】この測定チップが有する多孔性材料（カル
ボキシメチルデキストラン）を活性化するために、１−
エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド（400 mM／H2O ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（100 mM／H2O ）との混合物35μl を流速５μl/min で
測定セルに流し込んだ。次いで、50μg/mlの抗ヒト血清
アルブミン抗体35μl を流速５μl/min で測定セルに流
し込み、カルボキシメチルデキストランに抗ヒト血清ア
ルブミン抗体を固定化した。その後、固定化した抗体を
ブロッキングするためにエタノールアミン35μl を流速
５μl/min で測定セルに流し込み、次いで固定されてい
ない余分な抗体を洗い流すために、0.1 Ｎの塩酸５μl
を流速５μl/min で測定セルに流し込んだ。In order to activate the porous material (carboxymethyl dextran) of the measurement chip, 1-
35 μl of a mixture of ethyl-2,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (400 mM / H 2 O) and N-hydroxysuccinimide (100 mM / H 2 O) was poured into the measuring cell at a flow rate of 5 μl / min. Next, 35 μl of 50 μg / ml anti-human serum albumin antibody was poured into the measurement cell at a flow rate of 5 μl / min, and the anti-human serum albumin antibody was immobilized on carboxymethyl dextran. Thereafter, 35 μl of ethanolamine was poured into the measuring cell at a flow rate of 5 μl / min to block the immobilized antibody, and then 5 μl of 0.1 N hydrochloric acid was washed to wash away the unfixed excess antibody.
Was poured into the measurement cell at a flow rate of 5 μl / min.
【００４５】抗体を固定化した測定チップを設置した測
定セルに、実施例１と同様にしてＨＳＡを流しながら光
強度を測定し、共鳴シグナル（RU）を求めた。また、対
照としてＢＳＡを流した場合の共鳴シグナルも求めた。
この結果を図８に示す。図中、×がＨＳＡを流した場合
であり、＋がＢＳＡを流した場合である。In the same manner as in Example 1, the light intensity was measured while flowing HSA into the measurement cell in which the measurement chip on which the antibody was immobilized was set, and the resonance signal (RU) was obtained. In addition, a resonance signal when BSA was passed as a control was also determined.
The result is shown in FIG. In the figure, x indicates a case where HSA was flown, and + indicates a case where BSA was flown.
【００４６】図８に示すように、ＢＳＡを流した場合に
は、共鳴シグナルに変化はみられなかったが、ＨＳＡを
流した場合には、試料濃度と共鳴シグナルの間にほぼ正
比例の関係がみられた。これは、抗体の特異的反応に起
因するものであるものと推測される。As shown in FIG. 8, when BSA was flowed, no change was observed in the resonance signal. However, when HSA was flowed, the relationship between the sample concentration and the resonance signal was almost directly proportional. Was seen. This is presumed to be due to the specific reaction of the antibody.
【００４７】〔実施例３〕実施例１と同様にして測定チ
ップを作製し、抗ヒト血清アルブミン抗体を固定した
後、1 、10、又は100 μg/mlに希釈したＨＳＡを流速５
μl/分で10分間流しながら光強度を測定し、共鳴シグナ
ル（RU）を求めた。また、対照としてＢＳＡを流した場
合の共鳴シグナルも求めた。この結果を図８に示す。図
中、●はシランカップリング剤に90分暴露して作製した
チップでＨＳＡを測定した場合であり、○はシランカッ
プリング剤に15分暴露して作製したチップでＨＳＡを測
定した場合であり、■はシランカップリング剤に90分暴
露して作製したチップでＢＳＡを測定した場合であり、
□はシランカップリング剤に15分暴露して作製したチッ
プでＢＳＡを測定した場合である。Example 3 A measurement chip was prepared in the same manner as in Example 1 and an anti-human serum albumin antibody was immobilized. Then, HSA diluted to 1, 10, or 100 μg / ml was flowed at a flow rate of 5 μg / ml.
The light intensity was measured while flowing at 10 μl / min for 10 minutes, and the resonance signal (RU) was determined. In addition, a resonance signal when BSA was passed as a control was also determined. The result is shown in FIG. In the figure, ● indicates the case where HSA was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 90 minutes, and ○ indicates the case where HSA was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 15 minutes. And ■, BSA was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 90 minutes,
□ indicates a case where BSA was measured on a chip prepared by exposing to a silane coupling agent for 15 minutes.
【００４８】図８において、比較例１の測定チップを使
用した場合と実施例３の測定チップを使用した場合の共
鳴シグナルを比較すると、実施例３の測定チップを使用
した場合には、比較例１の測定チップを使用した場合の
ほぼ２倍の共鳴シグナル（RU）が計測された。従って、
実施例３の測定チップを使用することにより、約２倍の
感度で抗原等の定量が可能である。FIG. 8 shows a comparison between the resonance signal obtained when the measurement chip of Comparative Example 1 was used and the resonance signal obtained when the measurement chip of Example 3 was used. A resonance signal (RU) almost twice as large as that obtained when one measurement chip was used was measured. Therefore,
By using the measurement chip of Example 3, it is possible to quantify antigens and the like with about twice the sensitivity.
【００４９】〔試験例１〕実施例１で作成した金属膜を
有する透明基板を、実施例１で使用したバイオセンサー
のカートリッジ上に設置し、入射角θに対応する反射光
の強度を測定した。この結果を図９に示す。また、対照
として、金層のみを有し、クロム層を有しない基板につ
いても反射光強度を測定した。図中の−□−が金層及び
クロム層を有する透明基板の反射光強度曲線であり、─
── が金層のみを有する透明基板の反射光強度曲線で
ある。図９に示すように、金層とクロム層を設けた場合
でも、金層のみを設けた場合でも、表面プラズモン共鳴
が生じることがわかる。Test Example 1 The transparent substrate having a metal film prepared in Example 1 was placed on the cartridge of the biosensor used in Example 1, and the intensity of reflected light corresponding to the incident angle θ was measured. . The result is shown in FIG. As a control, the reflected light intensity was measured for a substrate having only a gold layer and no chromium layer. -□-in the figure is a reflected light intensity curve of a transparent substrate having a gold layer and a chromium layer, and Δ
── is a reflected light intensity curve of the transparent substrate having only the gold layer. As shown in FIG. 9, it can be seen that surface plasmon resonance occurs regardless of whether a gold layer and a chromium layer are provided or only a gold layer is provided.
【００５０】[0050]
【発明の効果】本発明の測定チップは、製造が容易であ
り、また、固定化する生理活性物質が少量であっても、
良好な感度で測定対象物質を測定することができる。The measurement chip of the present invention is easy to manufacture, and even when a small amount of a physiologically active substance is immobilized,
The substance to be measured can be measured with good sensitivity.
【図１】本発明の一例による測定チップの概略断面図で
ある。FIG. 1 is a schematic sectional view of a measuring chip according to an example of the present invention.
【図２】従来の測定チップの概略断面図である。FIG. 2 is a schematic sectional view of a conventional measuring chip.
【図３】抗体を固定した測定チップの概略断面図であ
る。(a) は抗体のＦａｂフラグメントを固定化した例、
(b) は抗体のＦ(ａｂ')2 フラグメントを固定化した例
を示す図である。FIG. 3 is a schematic sectional view of a measurement chip on which an antibody is immobilized. (a) is an example of immobilizing an antibody Fab fragment,
(b) is a diagram showing an example in which an F (ab ') 2 fragment of an antibody is immobilized.
【図４】本発明の測定チップに使用する表面プラズモン
共鳴バイオセンサーの概念図である。FIG. 4 is a conceptual diagram of a surface plasmon resonance biosensor used for the measurement chip of the present invention.
【図５】実施例１で得られた、ＨＳＡ濃度と共鳴シグナ
ルとの関係を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the relationship between the HSA concentration and the resonance signal obtained in Example 1.
【図６】実施例２で得られた、アトラジン濃度と共鳴シ
グナルとの関係を示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing the relationship between the concentration of atrazine and the resonance signal obtained in Example 2.
【図７】比較例１で使用した測定チップの概略断面図で
ある。FIG. 7 is a schematic sectional view of a measurement chip used in Comparative Example 1.
【図８】実施例３及び比較例１で得られた、ＨＳＡ濃度
と共鳴シグナルとの関係を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the relationship between the HSA concentration and the resonance signal obtained in Example 3 and Comparative Example 1.
【図９】金属膜を形成した基板の反射光強度曲線を示す
グラフである。FIG. 9 is a graph showing a reflected light intensity curve of a substrate on which a metal film is formed.
１，１'…透明基板 ２…金属膜 ２'…金属膜 ３…有機ケイ素膜 ４…抗体 ５…多孔性材料 ６…測定チップ ７…カートリッジブロック 71…測定セル 72，73…流路 ８…光源 80…入射光 ９…検出器 90…反射光 1, 1 '... transparent substrate 2 ... metal film 2' ... metal film 3 ... organosilicon film 4 ... antibody 5 ... porous material 6 ... measurement chip 7 ... cartridge block 71 ... measurement cells 72, 73 ... flow path 8 ... light source 80: incident light 9: detector 90: reflected light
Claims (6)
属膜、及び該金属膜上に配置される有機ケイ素膜を備え
ていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用測定チップ。1. A measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor, comprising a transparent substrate, a metal film disposed on the transparent substrate, and an organic silicon film disposed on the metal film.
剤により形成された膜であることを特徴とする、請求項
１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チッ
プ。2. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 1, wherein the organosilicon film is a film formed by a silane coupling agent.
プロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチル
シラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリ
メトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピ
ル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピル
トリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプトプ
ロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とする、請求項２記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。3. The method according to claim 1, wherein the silane coupling agent is 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyldiethoxymethylsilane, 3- (2-aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane, It is at least one selected from the group consisting of 3- (2-aminoethylaminopropyl) dimethoxymethylsilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, and dimethoxy-3-mercaptopropylmethylsilane. 2. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to 2.
属膜の上に有機ケイ素膜を配置することを特徴とする、
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造
方法。4. After disposing a metal film on a transparent substrate, an organic silicon film is disposed on the metal film.
A method for manufacturing a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor.
剤を用いて形成させることを特徴とする、請求項４記載
の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製
造方法。5. The method for producing a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 4, wherein the organosilicon film is formed using a silane coupling agent.
ロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメ
トキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシ
ラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメ
トキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピ
ル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピル
トリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプトプ
ロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とする、請求項５記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。6. A silane coupling agent comprising 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyldiethoxymethylsilane, 3- (2-aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane, It is at least one selected from the group consisting of 3- (2-aminoethylaminopropyl) dimethoxymethylsilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, and dimethoxy-3-mercaptopropylmethylsilane. 6. The method for producing a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to 5 above.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9073645A JPH10267834A (en) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | Measurement chip for surface plasmon resonance biosensor and its manufacture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP9073645A JPH10267834A (en) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | Measurement chip for surface plasmon resonance biosensor and its manufacture |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10267834A true JPH10267834A (en) | 1998-10-09 |
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ID=13524241
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9073645A Pending JPH10267834A (en) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | Measurement chip for surface plasmon resonance biosensor and its manufacture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10267834A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000162124A (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-16 | Nippon Laser Denshi Kk | Sensor chip for surface plasmon resonance angle detecting device |
| WO2000042433A1 (en) * | 1999-01-12 | 2000-07-20 | Ebara Corporation | Method and biosensor for detecting antigen |
| WO2004079367A1 (en) * | 2003-01-15 | 2004-09-16 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Bioarray |
| EP1681369A1 (en) * | 2003-09-30 | 2006-07-19 | Japan Science and Technology Agency | Metal thin film chip production method and metal thin film chip production device |
| WO2023123142A1 (en) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 北京建工环境修复股份有限公司 | Surface plasma resonance sensing chip, and preparation method therefor and use thereof |
-
1997
- 1997-03-26 JP JP9073645A patent/JPH10267834A/en active Pending
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