JPH10265348A

JPH10265348A - 育毛剤

Info

Publication number: JPH10265348A
Application number: JP9091535A
Authority: JP
Inventors: Eriko Takeoka; 永里子武岡; Chika Hamada; 千加浜田; Jun Suzuki; 順鈴木; Masahiro Tajima; 正裕田島
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 1998-10-06

Abstract

(57)【要約】【課題】毛髪成長期延長効果を有する成分を見出し、こ
れを有効成分とする育毛剤及び毛髪成長期延長剤を提供
すること。【解決手段】チョウセンアサガオ属に属する植物の抽出
物を有効成分とすることにより、所望する毛髪成長期延
長効果を有する育毛剤及び毛髪成長期延長剤が提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、育毛剤及び毛髪成
長期延長剤に関する技術分野に属する発明である。より
詳細には、毛髪伸長の促進をすることによって毛周期に
おける成長期を維持又は延長する育毛剤及び毛髪成長期
延長剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】高齢化社会、ストレス社会といわれる現
代社会では、頭部毛髪が様々な原因により脱毛の危機に
さらされる機会がますます多くなってきている。これに
対応して、より優れた「育毛料」を提供すべく様々な試
みがなされている。育毛料が毛髪に与える効果として主
なものに、発毛誘導効果（発毛促進効果，成長期誘導
効果），毛髪を太くする効果，毛髪成長期延長効
果，５α−レダクターゼ阻害効果，血行促進効果，
殺菌効果，フケ防止効果，保湿効果，抗酸化効
果等の効果が挙げられる。

【０００３】しかしながら、前記のように種々の試みが
なされているにもかかわらず、従来の育毛料では、その
脱毛防止，発毛効果等の育毛作用は必ずしも十分なもの
ではなかった。これはおそらく脱毛の原因がさまざまで
あり、また発毛の機構も非常に複雑であるためと考えら
れている。今まで提供されている「育毛料」は、脱毛を
比較的大雑把な概念、言い換えれば漫然と「脱毛」とい
う現象のみを捉えて開発されており、そのメカニズムに
まで突っ込んで着目して開発されたものは決して多くな
い。

【０００４】その大きな理由が、これらのメカニズムに
着目した育毛効果を簡便に検定することが可能な育毛薬
剤検定方法が十分に提供されていなかったという面を否
定できないことである。特に上記の毛髪成長期延長効
果を検定する育毛薬剤検定方法の確立は難しく、結果と
してこれまで提供されてきた育毛料は、毛周期の成長期
へと毛髪を誘導して育毛する上記発毛誘導効果に着目
したものが多かった。今日、脱毛の原因が少しずつ解明
されるにつれて、この多様な原因に応じた処方の育毛剤
を個別的に用いることが好ましいと考えられ、この点に
おいて特に上記等の効果を有する育毛剤が提供される
ことが求められている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者はin
vitroで行う簡便な上記の毛髪成長期延長効果を検定
する育毛薬剤検定方法を確立し、その育毛薬剤検定方法
を用いて上記の毛髪成長期延長効果を有する成分を有
効成分とする毛髪成長期延長剤を見出すことを目指し
た。

【０００６】本願は、その一連の課題のうち、特に上記
の毛髪成長期延長効果を有する成分を見出し、これを
有効成分とする育毛剤及び毛髪成長期延長剤を提供する
ことをその課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、種々の物質
における上記の毛髪成長期延長効果を有する成分につ
いて、本発明者が見出した育毛薬剤検定方法を用いて鋭
意検討したところ、シロバナチョウセンアサガオ等のチ
ョウセンアサガオ属に属する植物の抽出物に、所望する
毛髪成長期延長効果が認められることを見出し、本発明
を完成した。

【０００８】すなわち本発明は、チョウセンアサガオ属
に属する植物の抽出物を有効成分とする育毛剤及び毛髪
成長期延長剤を提供する発明である。

【０００９】前記したように、本発明において「毛髪成
長期延長剤」は、主に後述する育毛薬剤検定方法によっ
て少なくとも毛包上皮系細胞の***増殖活性を維持又は
促進することで毛髪の成長期を維持又は延長する効果を
有する成分を有効成分として配合した、特に上記の毛
髪成長期延長効果に着目した毛髪関連薬剤であり、いわ
ば「個別効能育毛料」としての特徴を有する。

【００１０】この「毛髪成長期延長剤」は、例えば毛根
近傍における毛包上皮系細胞の増殖が緩徐であること等
により成長期が短くなって、相対的に成長期毛よりも休
止期毛の割合が多くなってしまうことに起因する脱毛症
に特に有効な薬剤である。また、他の個別効能を有する
育毛料と組み合わせて用いることにより、幅広くの脱毛
症においては，総合的かつ相乗的な効果を上げることが
可能である。すなわち、この「毛髪成長期延長剤」は、
前記した〜の効果を包含する概念を有する一般的な
育毛料用途とは一線を画する用途を有するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。本発明育毛剤及び本発明毛髪成長期延長剤
（以下、本発明育毛剤等という）は、ナス科(Solanacea
e)のチョウセンアサガオ属(Datura 属) に属する植物の
抽出物をその有効成分とする毛髪関連薬剤である。この
チョウセンアサガオ属に属する植物としては、例えばシ
ロバナチョウセンアサガオ（ Datura stramonium L.)，
ヨウシュチョウセンアサガオ（ Datura stramonium L.
var. chalybea Koch) 等を挙げることができるが、その
抽出物が後述する毛周期における成長期を延長する作用
を有する限りにおいて、それらの変種，亜種等の他の種
に属するものであってもよい。

【００１２】また、このチョウセンアサガオ属に属する
植物の抽出物は、これらの植物の葉又は種子から有利に
得ることが可能である（これらの抽出物の原料となる部
分を全て総称して，「チョウセンアサガオ属に属する植
物」ということもある。）。

【００１３】チョウセンアサガオ属に属する植物の抽出
物を抽出する際には、植物由来の抽出物を抽出する際に
一般的に用いられる方法で行うことができる。すなわ
ち、前記したチョウセンアサガオ属に属する植物を、生
のまま，又は必要により乾燥した後、そのまま若しくは
粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができ
る。この際用い得る溶媒は、植物からその植物の成分を
抽出する際に用いられる一般的な溶媒を用いることが可
能であり特に限定されず、例えば熱水；メタノール，エ
タノール，イソプロパノール，ｎ−ブタノール等の低級
アルコール；プロピレングリコール、１，３−ブチレン
グリコール等の多価アルコール；これらのアルコール類
の含水物；ｎ−ヘキサン，トルエン等の炭化水素系溶媒
等を挙げることができるが、メタノールやエタノール等
の低級アルコールを抽出溶媒として用いるのが好まし
い。これらの低級アルコールを抽出溶媒として用いる場
合、得られる抽出液をそのまま本発明育毛剤等の有効成
分として配合することができるが、抽出溶媒を一旦留去
し，必要により乾燥後に配合することも可能である。

【００１４】このようにして得られるチョウセンアサガ
オ属に属する植物の抽出物は、少なくともスコポラミ
ン，アトロピン等のトロピン系アルカロイドや油酸，リ
ノール酸等の脂肪油等を一体として含むことが確認され
ている。本発明育毛剤等の有効成分として配合される上
記成分の、後述する毛包上皮系細胞の増殖作用はこれら
のいずれの成分に由来するのかは定かではないが、上述
のように全体として強い毛包上皮系細胞の増殖作用を有
している。

【００１５】本発明育毛剤等における上記成分の配合量
は、本発明育毛剤等の具体的形態等に応じて適宜選択し
得るものであり、特に限定されるべきものではないが、
概ね本剤全体に対して抽出物（アズキ末を含む）の乾燥
物として０．００００５重量％以上，２０．０重量％以
下、好ましくは同０．０１重量％以上，１０．０重量％
以下となるように配合される。

【００１６】本剤全体に対して抽出物の乾燥物として
０．００００５重量％未満の配合量では、本発明の所期
の効果である毛包系細胞増殖作用に基づく毛髪成長期延
長効果が十分に発揮されず好ましくなく、同２０．０重
量％を超えて配合しても、配合量の増加に見合った効果
の増大を見込めないばかりではなく、製剤上支障をきた
す傾向が顕著となり好ましくない。

【００１７】また、上記成分は、それぞれ１種の成分を
本発明育毛剤等の有効成分として配合することも可能で
あるが、適宜２種以上を組み合わせて配合することも可
能である。このようにして、チョウセンアサガオ属に属
する植物の抽出物を有効成分として配合した本発明育毛
剤等は、優れた毛包系細胞増殖作用に基づく毛髪成長期
延長効果を有し、前記したように、例えば毛根近傍にお
ける毛包上皮系細胞の増殖が緩徐であること等により成
長期が短くなって，相対的に成長期毛よりも休止期毛の
割合が多くなってしまうことに起因する脱毛症に特に有
効な薬剤である。

【００１８】また、本発明育毛剤等は、例えば他の個別
効能を有する成分と組み合わせて配合することにより、
脱毛を様々な観点から防止することが可能である。本発
明育毛剤等の主要な効果である毛髪成長期延長効果にお
ける本質的作用である、毛周期における成長期の維持又
は延長作用を特定する手段は、その特定法自体がその作
用を特定するために妥当なものである限り特に限定され
ず、例えばin vitro における特定法も，in vivo にお
ける特定法も用いることができるが、その簡便性と有効
性を考慮すると、in vitro における特定法を用いるこ
とが好ましい。

【００１９】以下、このin vitro における特定法の一
つである、毛包系上皮培養細胞の増殖効果を検討するこ
とを特徴とする特定法について簡単に説明する（より具
体的には、実施例において記載する。）。

【００２０】すなわちこの特定法は、「毛包上皮系培養
細胞に無血清培地中で対象物質を接触させて、その細胞
の増殖活性の有無及び／又は強弱を特定することによ
り、その対象物質の毛周期における成長期を延長する効
果を検定する育毛薬剤検定方法」、すなわち毛髪の伸長
に直接的に関係する毛包上皮系細胞に着目し、この培養
細胞を用いることによって、所望する毛周期における成
長期を延長する効果を特定する、in vitroの育毛薬剤検
定方法である。

【００２１】この育毛薬剤検定方法においては、動物
（ヒトを含む，以下同様である）の毛包上皮系細胞を単
離して得た培養細胞である「毛包上皮系培養細胞」に対
象物質を接触させて、その増殖の有無及び／又は強弱を
特定する。

【００２２】毛包上皮系細胞は、特に毛根近傍の外毛根
鞘細胞とマトリクス細胞とを併せた部分の細胞のことを
指し、内側の毛乳頭細胞とそれを覆う基底膜部分は除外
される。毛根の根幹部分に位置する毛乳頭細胞は、この
毛包上皮系細胞に働きかけてその増殖を促すことで毛の
伸長を促進する。毛周期における成長期は、まさにこの
毛髪が伸長している時期，すなわち毛包上皮細胞が***
して増殖している時期であり、同退行期及び休止期は、
これが鈍化して休止する時期である。

【００２３】つまり、毛周期における成長期を延長させ
る物質は、その投与により毛包上皮系細胞の***及び増
殖活性を維持することによって、毛髪が毛周期における
退行期及び休止期への移行を防ぐ物質、すなわち毛包上
皮系細胞の増殖を促進又は維持し続ける物質であること
が結論付けられる。

【００２４】なお、その他のin vitroの育毛薬剤検定方
法として、例えば対象物質を動物の毛乳頭細胞に作用さ
せて、その増殖促進の効果を判定する方法を用いること
ができる。

【００２５】また、in vivo における特定法としては、
例えば「ヌードマウスに対象物質を投与し，このヌード
マウスの体表の発毛部位の状態を特定して，対象物質の
毛周期における成長期を延長する効果を検定する育毛薬
剤検定方法」、すなわち原則的には無毛であるが、その
体表に経時的にその発毛部位が移動する特徴的な発毛を
するヌードマウスにおける発毛部位の広さと発毛部位の
移動速度を特定することによって、毛周期における成長
期の長さを検定する方法等を挙げることができる。

【００２６】そして、本発明育毛剤等は、他の個別効能
を有する育毛剤と組み合わせて用いることにより、特定
の脱毛症においては相乗的な効果を上げることや、他の
毛髪成長期延長成分と共に配合することも可能である。
以下、このin vitro における特定法の一つである、毛
包系上皮培養細胞の増殖効果を検討することを特徴とす
る特定法について簡単に説明する（より具体的には、実
施例において記載する。）。

【００２７】本発明育毛剤等が採り得る剤型は、外皮に
適用可能な剤型であれば特に限定されず、例えば液状，
乳液，軟膏等を選択可能である。また、本発明育毛剤等
の形態は任意であり、例えばトニック，ヘアークリー
ム，ムース，シャンプー，リンス，クリーム，乳液，化
粧水，パック等の形態を採ることができる。

【００２８】本発明育毛剤等においては、前記の必須成
分に加えて必要に応じて、かつ本発明の所期の効果を損
なわない限りにおいて、化粧品，医薬部外品，医薬品等
において一般的に用いられる各種油性若しくは水性成
分，保湿剤，増粘剤，防腐剤，酸化防止剤，香料，色
剤，各種薬剤等を配合することができる。

【００２９】例えば、高級脂肪酸，固形パラフィン，流
動パラフィン，シリコーン油，スクワラン，モノオレイ
ン酸グリセリル，オリーブ油，イソプロピルミリステー
ト，高級脂肪酸，高級アルコール等の油分；グリセリ
ン，ヒアルロン酸，プロピレングリコール，マルチトー
ル，アテロコラーゲン，乳酸ナトリウム等の保湿剤；マ
ルメロ粘質物，カルボキシビニルポリマー，キサンタン
ガム等の増粘剤；ニコチン酸アミド，ニコチン酸ベンジ
ル，ビタミンＥアセテート，センブリ抽出物，塩化カル
プロニウム，アセチルコリン誘導体等の血管拡張剤；セ
リン，メチオニン，アルギニン等のアミノ酸類；ビタミ
ンＢ₆，ビタミンＥ（若しくはその誘導体），ビオチ
ン，パントテン酸（若しくはその誘導体）等のビタミン
類；ニコチン酸，ニコチン酸メチル，ニコチン酸トコフ
ェロール等のニコチン酸エステル類；セファランチン等
の皮膚機能亢進剤；エストラジオール等の女性ホルモン
剤；グリチルレチン酸（若しくはその誘導体）等の消炎
剤；ヒノキチオール，ヘキサクロロフェン，ベンザルコ
ニウムクロリド，ビチオノール等の抗菌剤；メントール
等の清涼剤；サリチル酸，亜鉛（若しくはその誘導
体），乳酸（若しくはそのアルキルエステル）等；クエ
ン酸等の有機酸類等を配合することができる。本発明育
毛剤等の具体的処方は後述する。

【００３０】

【実施例】以下、実施例等により本発明をさらに具体的
に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲
が限定的に解釈されるべきものではない。なお、以下の
実施例等において「％」と表示され，かつ内容量を示す
ものは、特に断らない限り重量％を意味する。まず、本
実施例等において用いたチョウセンアサガオ属に属する
植物の抽出物の毛髪成長期延長作用を評価するためのin
vitroの細胞増殖試験について説明する。

【００３１】〔試験例１〕毛包上皮系培養細胞を用いた
細胞増殖試験Ａ．ヒト毛包上皮系細胞１．ヒト毛包上皮系細胞の採取外科手術の副産物として得られたヒト男性頭皮から毛周
期における成長期の毛包を実体顕微鏡下で機械的に採取
した。この成長期の毛包を1000 U/ml dispase・0.2 ％
コラゲナーゼを含むダルベッコの改変ＭＥＭ（ＤＭＥ
Ｍ）で３０分間，３７℃で処理し、注射針の先を用いて
dermal sheath やdermal papilla、毛球部上皮組織を除
去して、0.05％トリプシン・0.02％ＥＤＴＡを含むリン
酸緩衝液〔ＰＢＳ（−）：（−）とはカルシウムイオン
やマグネシウムイオンを含まない意味である〕で５分
間，３７℃で処理した。

【００３２】次にコラーゲン（Type I）コーティングし
た培養皿に毛包を静置し、外殖片培養を行った。なおこ
の際の培地は、無血清培地〔Keratinocyte Growth Medi
um（ＫＧＭ）〕を用いた（Keratinocyte Serum Free Me
diumを用いることもできる）。この培養の４〜５日後
に、毛包の培養皿への接着及び細胞の増殖が確認できた
時点で培地を交換し、これ以降２日おきに培地交換を行
った。このようにして増殖させた細胞を、0.05wt％トリ
プシン-0.02 ％ＥＤＴＡで３７℃で５分間処理した後、
等量の0.1 ％トリプシンインヒビターで反応を停止さ
せ、遠心処理(800×g,5 分間) を施して細胞を回収し
た。

【００３３】次に、細胞を上記の無血清培地に浮遊させ
て、5000 cells/cm²の密度でコラーゲンコーティング
（Type I）した培養皿に播種し、細胞がsubconfluentに
なるまで２日おきに培地交換を行い、再び0.05wt％トリ
プシン-0.02 ％ＥＤＴＡで３７℃で５分間処理した後、
等量の0.1 ％トリプシンインヒビターで反応を停止さ
せ、遠心処理(800×g,5 分間) を施して、これにより得
られたヒト毛包上皮系細胞に細胞凍結液（セルバンカ
ー：ダイヤトロン製）を添加し、１．０×１０⁶cell/m
l の濃度に調整して、各凍結チューブに１．０×１０⁶
cellずつ入れ、これを凍結保存した。なお、これらの細
胞数は、血球算定板で算出した。

【００３４】２．対象物質のアッセイ上記工程により得た毛包上皮系細胞の線維芽細胞混入率
（ＦＢ混入率）を測定（３０００倍，５視野）し、その
結果ＦＢ混入率が３％以上のものは、アッセイの対象か
ら除外した。そして、この毛包上皮系細胞を培養フラス
コ中に播種後、これを０．０５％トリプシンと０．０２
％ＥＤＴＡで処理した後、０．１％トリプシンインヒビ
ターで反応を停止後、系を１５００rpm で５分間遠心処
理を施し、上清を除去し、残渣にＫＧＭ培地２０mlを添
加して、細胞懸濁液を調製した。

【００３５】０．２ml/well の割合で、９６well-plate
（Ｉ型コラーゲンコーティングプレート：ファルコン社
製）に播種し（１．０×１０⁴cell/well）、細胞がウエ
ルの底に沈むまで約２０分間室温下で放置した。その
後、３７℃，５％ＣＯ₂で１日間培養を行い、所望する
ヒト毛包上皮系培養細胞を得た。

【００３６】Ｂ．ラット毛包上皮系細胞１．ラット毛包上皮系細胞の採取：（１）毛包の採取新生児（３〜４日令）のラットをエタノールで消毒後、
二酸化炭素で屠殺し、これらのラットの背部皮膚をハサ
ミで採取した。次いで、この採取した背部皮膚を１％Ｐ
ＳＦ含有ＰＢＳ（−）に２枚ずつ浸した。その後、皮膚
脂肪層から下の皮下脂肪や皮膜等を解剖用ハサミで除去
した。次いで、再びこの背部皮膚を１％ＰＳＦ含有Ｐ
ＢＳ（−）に浸し、さらにこれを０．２５％トリプシン
含有ＰＢＳ（−）（０．０２％ＥＤＴＡ含む。以下、同
様である。）中に４℃で一晩浸した。

【００３７】このトリプシン溶液中における浸漬後、背
部皮膚の真皮層と表皮層をピンセットで剥がした後、真
皮層を０．３５％のコラゲナーゼを含有させたＨａｍ'
ｓＦ１２培地〔組成(mg/L)：l-Alanin(8.9),l-Arginine
（HCl:211),l-Asparagine(13.2),l-Asparatic acid(13.
3),l-Cysteine （HCl:31.5),l-Glutamic acid(14.7),l-
Glutamine(146),Glycine(7.5),l-Histidine （HCl:19),
l-Isoleucine(3.9),l-leucine(13.1),l-Lysine(HCl:36.
5),l-Methionine(4.5),l-Phenylalanin(5.0),Proline(3
4.5),l-Serine(10.5),l-Threonine(11.9),l-Tryptophan
e(2.0),l-Tyrosine(5.4),l-Valine(11.7),Biotine(0.00
73),Choline(Cl:14.0),VitaminB12(1.36),葉酸(1.32),I
nositol(18.0),Nicotinamide(0.037),パントテン酸(Ca:
0.477),VitaminB6(HCl:0.062),VitaminB2(0.038),Vitam
inB1(HCl:0.337),CaCl₂(2H₂O:44.0),CuSO₄・5H₂O(0.002
5),FeSO₄・7H₂O(0.834),KCl(224.0),MgCl₂(6H₂O:122)，
"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,53,288(1965)" 以下同様であ
る〕が入った100 mm dish 移し、ハサミで裁断した。こ
の裁断物を含む培地を３７℃で３５分間浸透を行った
（６０rpm ）。浸透後、このコラゲナーゼ反応物中に塊
状のものが見えなくなるまでピペッティングを行い、こ
れを５０ml遠沈管に移し、ＤＮase （10000unit) を含
有させたＨａｍ'ｓＦ１２培地を添加し、５分間放置し
た。

【００３８】放置後、得られた懸濁液をさらにピペッテ
ィングした後、ナイロンメッシュ（Nytex 157 mesh) で
濾過し、これを５０ml遠沈管に移した。懸濁液を半量ず
つに分け、それぞれについてＰＢＳ（−）を容量が３０
mlになるまで懸濁液を希釈し、次いでこの希釈した懸濁
液に遠心処理を施した（４℃，４００rpm ，５分間）。
遠心後、上清を除いて脂肪分を系から除去した。次い
で、残渣にＰＢＳ（−）を２５ml添加して懸濁後、これ
にさらに遠心処理を施した〔（４℃，４００rpm ，５分
間）×３回〕。この遠心操作により得られた残渣が、ラ
ットの背部皮膚における毛包である。

【００３９】（２）毛包上皮系細胞の採取上記操作により得られた毛包に、０．２５％トリプシン
含有ＰＢＳ（−）を５ml添加して、細胞懸濁液を３７℃
で５分間インキュベートした。インキュベート終了後、
５mlの等量の牛胎児血清（ＦＢＳ）とＨａｍ'ｓＦ１２
培地を添加して、細胞懸濁液をセルストレーナー（100
μm Nalgene 社製）で濾過後、５０ml遠沈管に入れて、
この細胞懸濁液に遠心処理を施した（４℃，１５００rp
m ，５分間）。この系から上清を除去して、残渣として
所望する毛包上皮系細胞を得た。

【００４０】この毛包上皮系細胞に細胞凍結液（セルバ
ンカー：ダイヤトロン製）を添加し、１．５×１０⁷ce
ll/ml の濃度に調整して、各凍結チューブに１．５×１
０⁷cellずつ入れ、これを凍結保存した。なお、これら
の細胞数は、血球算定板で算出した。

【００４１】２．毛包上皮系細胞の前培養：系に混入し
ている線維芽細胞を可能な限り系から除去するために、
上記工程により得られた毛包上皮系細胞の前培養を行っ
た。以下、その手順について説明する。３７℃の恒温槽
で、上記工程により得た凍結細胞を融解した。次いでＦ
ＡＤ培地〔Ｈａｍ'ｓＦ１２培地（後述）とＭＥＮ培地
を容量比で３対１で混合したものに、インシュリン(5.0
μg/ml），ハイドロコルチゾン（0.45μg/ml），エピダ
ーマルグロウスファクター(EGF)(10.0ng/ml)，コレラト
キシン(10^-9Ｍ）及びウシ胎児血清(10 ％) を含有させ
た培地、以下同様である〕を１０ml添加し、細胞溶液を
希釈して系に遠心処理を施した（１０℃以下，１５００
rpm ，５分間）。遠心後、上清を除去し、系にＦＡＤ培
地を１０ml添加して、細胞塊が認められなくなるまでピ
ペッティングを繰り返した。

【００４２】得られた細胞数を血球算定板で算出し、Ｆ
ＡＤ培地で２．５×１０⁵cell/mlの濃度になるように
調整した。Ｉ型コラーゲンでコーティングした７５cm³
のフラスコに細胞を播種して、これを３７℃，５％ＣＯ
₂で一晩培養した。培養後、系をＰＢＳ（−）１０mlで
２回洗浄し、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を
２ml添加して、これを３７℃，５％ＣＯ₂で４分間イン
キュベートした。次に、系に牛胎児血清（ＦＢＳ）を２
ml添加して、１回軽くゆすった後で上清を除去して、系
に混入している線維芽細胞を除去した。

【００４３】さらに、系にＫＧＭ培地〔表皮角化細胞基
礎培地(Keratinocyto growth medium)：Keratinocyto b
asal medium （ＫＢＭ培地（改変ＭＣＤＢ１５３培地
（クローネティックス社製）））に，ウシ脳下垂体エキ
ス(BPE)(0.4vol％),インシュリン(0.5μm/ml),ハイドロ
コルチゾン(0.5μm/ml),h-EGF(0.1 ng/ml)を添加した培
地、以下同様である〕を１５ml添加し、３７℃，５％Ｃ
Ｏ₂で３日間培養した。

【００４４】３．対象物質のアッセイ上記工程により得た毛包上皮系細胞を播種した培養フラ
スコの線維芽細胞混入率（ＦＢ混入率）を測定（３００
０倍，５視野）し、その結果ＦＢ混入率が３％以上のも
のは、アッセイの対象から除外した。系をＰＢＳ（−）
１０mlで２回洗浄し、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ
（−）を２ml添加して、これを３７℃で３分間インキュ
ベートした。次いで上皮系細胞と線維芽細胞とのトリプ
シンに対する反応性の違いを利用して，系から線維芽細
胞を除去するために、トリプシンを除去し、再び０．２
５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を２ml添加して、３７
℃，２０rpm で５分間振盪した。

【００４５】次いで、細胞のはがれを顕微鏡下で確認し
た後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を１０ml添加し
て、５０ml遠心チューブ中でピペッティングを行い、系
を１５００rpm で５分間遠心処理を施した。上清を除去
し、ＫＧＭ培地２０mlを添加して、細胞塊がなくなるま
でピペッティングを行った。

【００４６】懸濁液をセルストレーナー（100 μm Nalg
ene 社製）で濾過後、５０ml遠沈管に入れて、懸濁液中
の生細胞数を血球算定板で算出し、系にＫＧＭ培地を添
加して、系の中の細胞濃度が５．０×１０⁴cell/mlにな
るように調整した。次いで、０．２ml/well の割合で、
９６well-plate（Ｉ型コラーゲンコーティングプレー
ト：ファルコン社製）に播種し（１．０×１０⁴cell/we
ll）、細胞がウエルの底に沈むまで約２０分間室温下で
放置した。その後、３７℃，５％ＣＯ₂で１日間培養を
行い、所望するヒト毛包上皮系培養細胞を得た。

【００４７】Ｃ．試験培地の調製：（１）抽出物の調製市販のチョウセンアサガオ（乾燥物）５００g を、７．
５l の７０％メタノールに室温（２３℃）で２４時間の
浸漬を２回行った。抽出液から溶媒を留去し、チョウセ
ンアサガオの７０％メタノール抽出乾燥物５０．０g を
得た。

【００４８】（２）対象物質添加培地の調製上記のチョウセンアサガオ抽出物を約１．５mgスクリュ
ー管に秤量し、有機溶剤（ＤＭＳＯ）で０．２％溶液に
なるように調製した。また、同様に対照として、チャ抽
出物（抽出法：水抽出），バグモンドウエキス（抽出
法：１０％エタノール抽出）の０．２％ＤＭＳＯ溶液を
調製した。

【００４９】次いで、上記の生薬抽出物のＤＭＳＯ溶液
を１０００倍量の上記ＫＢＭ培地（クローネティックス
社製）に添加した〔抽出物濃度：２．０×１０^-4％（Ｄ
ＭＳＯ０．１％）〕。これらの対象物質添加培地０．
２mlを、０．１％ＤＭＳＯ含有ＫＢＭ培地１．８mlに添
加し、対象物質の濃度を２．０×１０^-5％になるように
調製した（１０倍希釈）。

【００５０】（３）コントロール培地の調製・ネガティブコントロール：ＫＢＭ培地２mlに、ＤＭＳ
Ｏを２μl 添加して調製した（ＤＭＳＯ０．１
％）。・ポジティブコントロール：ネガティブコントロール培
地に、インシュリン（５mg/ml)を２μl ，ハイドロコー
チゾン（０．５mg/ml)を２μl 添加して調製した。

【００５１】Ｄ．対象物質培地交換：上記Ａ，Ｂにおい
てヒト毛包上皮系培養細胞及びラット毛包上皮系培養細
胞を調製した９６well-plate中のＫＧＭ培地を上記Ｃに
おいて調製した、対象物質添加培地及びコントロール培
地（２００μl/well）と交換して、交換後３７℃，５％
ＣＯ₂で２日間培養した。

【００５２】なお、この培地の交換はウエル内のＫＧＭ
培地を，底面に付着している細胞を傷つけないように留
意しつつアスピレーターで抜いて、その後速やかに対象
物質添加培地等をウエルの両端から添加することにより
行った。

【００５３】Ｅ．細胞増殖の測定：アラマーブルー(ala
mar blue：アラマーバイオサイエンス社製) を培地量
（容量）に対して、１／１０量を添加して、３７℃（５
％ＣＯ₂）で６時間インキュベートした。インキュベー
ト後、系の５９５nm及び５７０nmでの吸光度をマイクロ
プレートリーダー（Micro plate reader:Bio RAD社製)
を用いて測定し、下記計算式に従って，細胞増殖度を算
出した。

【００５４】

【数１】さらに細胞増殖促進指標を、下記計算式に従って算出し
た。

【００５５】

【数２】

【００５６】Ｆ．結果：判定した上記細胞増殖度は、ラ
ット毛包上皮系培養細胞においては０．７，ヒト毛包上
皮系培養細胞においては０．５であった。この結果よ
り、チョウセンアサガオ属に属する植物の抽出物である
シロバナチョウセンアサガオの抽出物に毛包上皮系培養
細胞の増殖活性が明らかに認められることが判明した。
すなわち、チョウセンアサガオ属に属する植物の抽出物
には、毛髪成長期延長効果が認められることが明らかに
なった。

【００５７】以下、本発明育毛剤等の処方を実施例とし
て示し、さらにこれらの育毛効果の検討を行った。〔実施例１〕液状育毛剤等の調製上述したチョウセンアサガオの７０％メタノール抽出乾
燥物０．１％を、７０％エタノール９０％、オレイン酸
ナトリウム０．１％、ドデシルベンゼンスルホン酸０．
４９％、硬化ヒマシ油エチレンオキシド（４０モル）付
加物０．５％及びイオン交換水（残余）と混合攪拌して
溶解させた。さらにイオン交換水（１０％）を添加混合
して、液状の育毛剤等を得た。この液状の育毛剤等の処
方において、上述したバクモンドウの１０％エタノール
抽出物の乾燥物０．１％を、上記のチョウセンアサガオ
の７０％メタノール抽出乾燥物に代えて調製した液状の
剤を対照として調製した。

【００５８】〔実施例２〕乳液状育毛剤等の調製上述したチョウセンアサガオ抽出物の製造工程におい
て、７０％メタノールに代えてエタノールを用いた抽出
物を得手、これを下記の処方の乳液状育毛剤等において
用いた。配合成分配合量（重量％）（Ａ相）チョウセンアサガオ抽出乾燥物１．０ポリオキシエチレン（６０モル）付加硬化ヒマシ油２．０グリセリン１０．０ジプロピレングリコール１０．０１，３−ブチレングリコール５．０ポリエチレングリコール１５００５．０（Ｂ相）セチルイソオクタネート１０．０スクワラン５．０ワセリン２．０プロピルパラベン２．０（Ｃ相）カルボキシビニルポリマー１％水溶液３０．０ヘキサメタリン酸ソーダ０．０３イオン交換水８．３５（Ｄ相）イオン交換水４．５（Ｅ相）ＫＯＨ０．１２イオン交換水５．０

【００５９】＜製造法＞Ａ相、Ｂ相をそれぞれ６０℃で
加熱溶解し、混合してホモミキサー処理しゲルを調製
し、これにＤ相を徐々に添加してホモミキサーで分散し
た。次にこれに溶解したＣ相を加え、最後に溶解したＥ
相を添加し，ホモミキサーで乳化してＯ／Ｗ乳液型の育
毛剤等を得た。

【００６０】〔実施例３〕クリーム状育毛剤等の調製実施例２と同様に、チョウセンアサガオのエタノール抽
出乾燥物を，以下の処方のクリーム状育毛剤等において
用いた。配合成分配合量（重量％）（Ａ相）流動パラフィン５．０セトステアリルアルコール５．５グリセリルモノステアレート３．０ＥＯ（２０モル）−２−オクチルドデシルエーテル８．０プロピルパラベン０．３香料０．１（Ｂ相）チョウセンアサガオ抽出乾燥物５．０グリセリン８．０ジプロピレングリコール２０．０ポリエチレングリコール４０００５．０ドデシル硫酸ナトリウム０．１ヘキサメタリン酸ソーダ０．００５イオン交換水３９．９９５

【００６１】＜製造法＞Ａ相、Ｂ相をそれぞれ加熱溶解
して混合し、ホモミキサーで乳化してクリーム状育毛剤
等を得た。

【００６２】〔試験例２〕本発明育毛剤等の育毛作用
の検討本発明育毛剤等の脱毛防止、発毛効果等の育毛作用を調
べるために、以下の方法でヒトに対してトリコグラム試
験及び実使用テストを実施した。被験試料及び対照試料
は、実施例１〜３の本発明育毛剤等、比較例１の剤及び
７０％エタノールである。

【００６３】試験方法上記試料の使用前と使用後の抜去毛髪の毛根を顕微鏡下
で観察し、毛根の形態から，成長の止まった毛の毛根で
ある「休止期毛根」数を計数し、その割合の増減によっ
てこれらの試料の育毛作用を比較した。すなわち、被験
試料及び対照試料をそれぞれ男性被験者１０名の頭皮に
１日２回、１回２mlずつ６カ月間連続して塗布し、塗布
直前および６カ月間塗布終了直後に被験者１名につき１
００本ずつ毛髪を抜去し、それぞれの毛根を顕微鏡下で
観察した。また、上記試料の育毛効果が有効か無効かに
関する実使用テストを行った。これらの試験の結果を、
下記第１表に示す。

【００６４】

【表１】

【００６５】

【発明の効果】本発明により、毛周期における成長期を
延長する育毛剤及び毛髪成長期延長剤が提供される。

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【手続補正書】

【提出日】平成１０年１月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３６】Ｂ．ラット毛包上皮系細胞１．ラット毛包上皮系細胞の採取：（１）毛包の採取新生児（３〜４日令）のラットの背部皮膚を採取し、こ
の採取した背部皮膚を１％ＰＳＦ含有ＰＢＳ（−）に２
枚ずつ浸した。その後、皮膚脂肪層から下の皮下脂肪や
皮膜等を解剖用ハサミで除去した。次いで、再びこの背
部皮膚を１％ＰＳＦ含有ＰＢＳ（−）に浸し、さらにこ
れを０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）（０．０２
％ＥＤＴＡ含む。以下、同様である。）中に４℃で一晩
浸した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者田島正裕神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地株式会社資生堂第１リサーチセンター内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】チョウセンアサガオ属に属する植物の抽出
物を有効成分とする育毛剤。
【請求項２】チョウセンアサガオ属に属する植物の抽出
物を有効成分とする毛髪成長期延長剤。