JPH10257887A - Gene analyzer and analysis - Google Patents
Gene analyzer and analysisInfo
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- JPH10257887A JPH10257887A JP8340867A JP34086796A JPH10257887A JP H10257887 A JPH10257887 A JP H10257887A JP 8340867 A JP8340867 A JP 8340867A JP 34086796 A JP34086796 A JP 34086796A JP H10257887 A JPH10257887 A JP H10257887A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、一度に多数の遺伝
子の構造・機能を解析できる遺伝子解析装置および方法
に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a gene analyzing apparatus and a method for analyzing the structure and function of a large number of genes at once.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、遺伝子工学の顕著な進展のもと、
ヒトをはじめ多くの生物のゲノムの塩基配列が明らかと
なりつつあり、現時点で酵母ゲノムの全塩基配列の解読
が完了し、ヒトゲノムも近い将来全塩基配列が解読され
ることが期待されている。しかしながら塩基配列を解読
したのみでは生命情報を解読したとはいえず、解読され
た塩基配列の情報をもとに個々の遺伝子の解析を行うこ
とが生命科学分野において非常に重要な課題となってい
る。2. Description of the Related Art In recent years, with the remarkable progress of genetic engineering,
The nucleotide sequences of the genomes of many organisms, including humans, are being elucidated. At this point, the decoding of the entire nucleotide sequence of the yeast genome has been completed, and it is expected that the entire nucleotide sequence of the human genome will be decoded in the near future. However, simply deciphering the base sequence does not mean that the life information has been deciphered, and analyzing each gene based on the deciphered base sequence information is a very important issue in the life science field. I have.
【０００３】また、臨床検査の分野では現在でもクラミ
ジア等の微生物、ＨＩＶ、ＨＣＶ等のウイルス感染の有
無を検出する際にＤＮＡ検査が行われており、将来的に
はゲノム中の遺伝子を調べることによって、遺伝病・ガ
ン等の遺伝子由来の病気についてそれらが発病する前に
予測診断を行うことが現行の体液検査に変わり増加する
と予測されている。[0003] In the field of clinical testing, DNA testing is still carried out to detect the presence or absence of microorganisms such as chlamydia and viruses such as HIV and HCV. In the future, it will be necessary to examine genes in the genome. Accordingly, it is predicted that performing a predictive diagnosis of a genetic disease such as a genetic disease or cancer before the onset of the disease will replace current body fluid testing and increase it.
【０００４】遺伝子解析においては、解析しようとする
未知の遺伝子、または機能・配列が既知の遺伝子をアガ
ロースゲル上で電気泳動させ、ニトロセルロースやナイ
ロン膜等の多孔質膜に塩濃度勾配により転写固定させる
か（サザンブロッティング・ノーザンブロッティン
グ）、または遺伝子を含む溶液を直接滴下して膜上に固
定させ（ドットブロッティング）、その後放射性物質で
標識した既知の遺伝子、または未知の遺伝子を供与し、
膜に固定された遺伝子と標識遺伝子との間でハイブリダ
イゼーションを行い、ハイブリッド形成をオートラジオ
グラフィー等で検出することが行われている。しかしな
がら、現在使用されているブロッティング方法で遺伝子
を固定し、ハイブリダイゼーションを行った場合、処理
できる試料数は多くても96穴マイクロタイタープレート
をベースとした96サンプルであり、ゲノム解析のように
一度に5000〜50000 程度の試料数を処理することができ
ないという問題を有している。In gene analysis, an unknown gene to be analyzed or a gene having a known function and sequence is electrophoresed on an agarose gel, and transcribed and immobilized on a porous membrane such as nitrocellulose or nylon membrane by a salt concentration gradient. (Southern blotting / Northern blotting), or directly dropping a solution containing the gene onto the membrane (dot blotting), and then donating a known or unknown gene labeled with a radioactive substance,
Hybridization is performed between a gene fixed on a membrane and a labeled gene, and hybridization is detected by autoradiography or the like. However, when genes are fixed and hybridized using the currently used blotting method, the number of samples that can be processed is at most 96 samples based on a 96-well microtiter plate. However, there is a problem that about 5,000 to 50,000 samples cannot be processed.
【０００５】また、通常遺伝子は市販の試薬の形態で供
給される場合もあるが、多くの場合、大腸菌等をベース
とした宿主−ベクター系で供給され、またＰＣＲにより
増幅・精製された後に解析に供される。通常これらの操
作はマイクロチューブ、マイクロタイタープレートによ
り行われ、多数の試料を処理することができないという
問題を有している。[0005] The gene is usually supplied in the form of a commercially available reagent. In many cases, the gene is supplied in a host-vector system based on Escherichia coli or the like, and is analyzed after being amplified and purified by PCR. To be served. Usually, these operations are performed using a microtube or a microtiter plate, and have a problem that a large number of samples cannot be processed.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、遺伝
子の増幅・精製、多孔質膜への固定操作、ハイブリダイ
ゼーションを同一反応場中で行うことにより、一度に多
数の試料を処理できる遺伝子解析装置および方法を提供
することにある。An object of the present invention is to provide a gene capable of treating a large number of samples at a time by performing amplification / purification of a gene, fixation to a porous membrane, and hybridization in the same reaction field. An object of the present invention is to provide an analyzing device and a method.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、積層された複数の
多孔質膜により形成される底部と、多孔質膜の上部に設
けられた隔壁とにより形成される複数の反応槽からなる
遺伝子解析装置中で遺伝子を含む細胞を培養し、遺伝子
を増幅・精製した後、遺伝子を多孔質膜に固定し、該固
定した遺伝子と相補性のある遺伝子との間でハイブリダ
イゼーションを行い、ハイブリッド形成を検出すること
により、一度に多数の遺伝子の構造・機能を解析できる
ことを見いだし、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have formed a bottom portion formed by a plurality of stacked porous films and an upper portion formed on the porous film. After culturing cells containing the gene in a gene analyzer consisting of a plurality of reaction vessels formed by the formed partition walls, amplifying and purifying the gene, fixing the gene to a porous membrane, and complementing the fixed gene It has been found that the structure and function of a large number of genes can be analyzed at a time by performing hybridization with a potential gene and detecting hybridization, thereby completing the present invention.
【０００８】即ち、本発明は、積層された複数の多孔質
膜により形成される底部と、多孔質膜の上部に設けられ
た隔壁とにより形成される複数の反応槽よりなる遺伝子
解析装置である。[0008] That is, the present invention is a gene analysis apparatus comprising a plurality of reaction vessels formed by a bottom formed by a plurality of stacked porous membranes and a partition provided on the top of the porous membrane. .
【０００９】本発明はまた、積層された複数の多孔質膜
により形成される底部と、多孔質膜の上部に設けられた
隔壁とにより形成される複数の反応槽よりなる遺伝子解
析装置の反応槽内に、遺伝子を有するベクターを保持し
た宿主細胞を接種し、該細胞を培養して遺伝子の増幅・
精製を行った後、多孔質膜に遺伝子を固定し、該固定し
た遺伝子と相補性のある遺伝子との間でハイブリダイゼ
ーションを行い、ハイブリッド形成を検出することを含
む遺伝子解析方法である。[0009] The present invention also provides a reaction vessel of a gene analysis apparatus comprising a plurality of reaction vessels formed by a bottom formed by a plurality of laminated porous membranes and a partition provided on the porous membrane. Inside, a host cell holding a vector having a gene is inoculated, and the cell is cultured to amplify the gene.
This is a gene analysis method comprising immobilizing a gene on a porous membrane after purification, performing hybridization between the immobilized gene and a complementary gene, and detecting hybridization.
【００１０】本発明はさらに、反応槽内での細胞培養
後、各反応槽に対応するよう位置決めされた棒状の突起
が集合した植菌用治具に各反応槽中の細胞を付着させ、
新たな多孔質膜を設置した他の装置に移植することによ
り、遺伝子固定膜を複製する上記遺伝子解析方法であ
る。Further, the present invention further comprises, after culturing the cells in the reaction tanks, adhering the cells in each reaction tank to an inoculation jig in which rod-shaped projections positioned so as to correspond to each reaction tank are assembled;
This is the above-described gene analysis method in which a gene-immobilized membrane is replicated by transplanting the gene-immobilized membrane into another apparatus provided with a new porous membrane.
【００１１】本発明はさらにまた、積層された複数の多
孔質膜により形成される底部と、多孔質膜の上部に設け
られた隔壁とにより形成される複数の反応槽よりなる遺
伝子解析装置の反応槽内に、遺伝子を有するベクターを
保持した宿主細胞を接種し、該細胞を培養して遺伝子の
増幅・精製を行った後、多孔質膜に遺伝子を固定化する
ことを特徴とする遺伝子固定膜の製造方法である。以
下、本発明を更に詳しく説明する。[0011] The present invention further provides a reaction of a gene analysis apparatus comprising a plurality of reaction vessels formed by a bottom formed by a plurality of laminated porous membranes and a partition provided on the top of the porous membrane. A gene-immobilized membrane comprising inoculating a host cell holding a vector having a gene in a tank, culturing the cell, amplifying and purifying the gene, and immobilizing the gene on a porous membrane. It is a manufacturing method of. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
【００１２】[0012]
〔１〕遺伝子解析装置 図１は、本発明の遺伝子解析装置を示すものであり、防
水膜１およびそれに積層された２層の多孔質膜（多孔質
膜上層２ａ，多孔質膜下層２ｂ）により形成される底部
３と、多孔質膜の上部に設けられた隔壁４とにより形成
される複数の反応槽５の集合体である。[1] Gene Analysis Device FIG. 1 shows a gene analysis device according to the present invention, which comprises a waterproof film 1 and two porous films (a porous film upper layer 2a and a porous film lower layer 2b) laminated thereon. It is an aggregate of a plurality of reaction tanks 5 formed by a bottom 3 formed and a partition 4 provided on the porous membrane.
【００１３】本発明の遺伝子解析装置の底部３は、防水
膜１を最下層とし、その上に孔径・材質の異なる少なく
とも２層以上の多孔質膜２が積層して形成される。多孔
質膜は通常、多孔質膜上層２ａ、多孔質膜下層２ｂより
成る。多孔質膜の材質として、多孔質膜上層２ａはフィ
ルター膜として機能し、細胞を透過せず、遺伝子および
蛋白質を透過することができ、また多孔質膜下層２ｂは
核酸固定膜として機能し、遺伝子を透過せず、かつ層上
に遺伝子を固定することのできるものであれば特に限定
されない。多孔質膜上層２ａの反応槽同士の境界部分
は、隣合う反応槽中のＤＮＡが多孔質膜を介して混入し
ないために多孔質体の孔をフィラー等で充填して閉塞す
る、あるいは熱融着または溶剤により多孔質体を部分的
に融解せしめ、孔を消滅させるのが望ましい。防水膜１
の材質としては、溶液を透過しなければ特に限定されな
い。防水膜１は操作環境が湿潤で底部からの乾燥が防止
できる場合、あるいは多孔質膜下層２ｂのＤＮＡ固定容
量が充分であり、底部から吸着されなかったＤＮＡがリ
ークしないような場合は必要としない。The bottom portion 3 of the gene analyzer of the present invention is formed by laminating a waterproof membrane 1 as a lowermost layer, on which at least two or more porous membranes 2 having different pore diameters and materials are laminated. The porous film usually comprises a porous film upper layer 2a and a porous film lower layer 2b. As a material of the porous membrane, the upper layer 2a of the porous membrane functions as a filter membrane, and does not transmit cells, but can transmit genes and proteins. The lower layer 2b of the porous membrane functions as a nucleic acid immobilizing membrane, Is not particularly limited as long as it does not pass through and can fix the gene on the layer. The boundary between the reaction tanks in the upper layer 2a of the porous membrane is closed by filling the pores of the porous body with a filler or the like because the DNA in the adjacent reaction tank does not mix through the porous membrane, or heat fusion. It is desirable that the porous body be partially melted by deposition or a solvent to eliminate pores. Waterproof membrane 1
Is not particularly limited as long as it does not permeate the solution. The waterproof membrane 1 is not required when the operating environment is wet and drying from the bottom can be prevented, or when the DNA fixing capacity of the lower layer 2b of the porous membrane is sufficient and DNA not adsorbed from the bottom does not leak. .
【００１４】多孔質膜の材質としては、具体的には、上
層はガラスフィルター、セルロース濾紙、セルロースア
セテート濾紙、ポリカーボネートメンブレン、セルロー
スアセテートメンブレン等が、下層はニトロセルロース
メンブレン、ナイロンメンブレン、DEAEセルロース濾
紙、DEAEセルロースメンブレン、PVDFメンブレン等が例
示される。防水膜の材質としては、具体的には、ポリエ
チレン、ポリプロピレン等のポリオレフィンフィルム、
PET フィルム、ポリ塩化ビニルフィルム等の高分子フィ
ルム等が例示される。As the material of the porous membrane, specifically, the upper layer includes a glass filter, a cellulose filter paper, a cellulose acetate filter paper, a polycarbonate membrane, a cellulose acetate membrane, and the like, and the lower layer includes a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, a DEAE cellulose filter paper, and the like. DEAE cellulose membrane, PVDF membrane and the like are exemplified. As the material of the waterproof membrane, specifically, polyolefin films such as polyethylene and polypropylene,
Examples include polymer films such as PET films and polyvinyl chloride films.
【００１５】本発明の遺伝子解析装置において、反応槽
５は所望の形状で所望の数だけ形成される。予めシート
状に反応槽の集合体を形成しておき、解析に供する試料
数だけ切り取って使用してもよい。In the gene analyzer of the present invention, a desired number of reaction vessels 5 are formed in a desired shape. An assembly of the reaction tanks may be formed in a sheet shape in advance, and cut and used for the number of samples to be analyzed.
【００１６】反応槽５のサイズは、0.001 ×0.001mm 〜
10×10mm（縦×横方向）、深さ0.001 〜10mm程度とする
ことが例示され、好ましくは 2×2 mm（縦×横方向）、
深さ0.1 〜10mmとすればよい。反応槽５の容積は１plか
ら形成可能であるが、0.001ml 〜0.2ml が好ましい。The size of the reaction tank 5 is 0.001 × 0.001 mm to
Examples are 10 × 10 mm (vertical × horizontal direction) and a depth of about 0.001 to 10 mm, preferably 2 × 2 mm (vertical × horizontal direction).
The depth may be 0.1 to 10 mm. The volume of the reaction tank 5 can be formed from 1 pl, but is preferably 0.001 ml to 0.2 ml.
【００１７】隔壁４は各反応槽５を仕切り、隣り合う反
応槽中の成分が相互に混ざらないように多孔質膜２の上
部に設けられる。隔壁の材質としてはＤＮＡ，タンパク
質を吸着せず、反応系を阻害しないようなものであれば
特に限定されないが、例えばポリオレフィン、ポリエチ
レン等の高分子材料、金属材料、シリコン等の無機材料
が挙げられる。The partition walls 4 partition the respective reaction tanks 5 and are provided above the porous membrane 2 so that components in adjacent reaction tanks do not mix with each other. The material of the partition walls is not particularly limited as long as it does not adsorb DNA or protein and does not inhibit the reaction system, and examples thereof include polymer materials such as polyolefin and polyethylene, metal materials, and inorganic materials such as silicon. .
【００１８】隔壁の形成方法としては、あらかじめ隔壁
のみを形成し、熱融着、接着、粘着、または成型品によ
る凹凸嵌合のいずれかの手段で多孔質膜上に設置する方
法、あるいは多孔質膜にある程度の膜圧のあるパターン
塗布を行うことにより形成する方法がある。パターン塗
布は、スクリーン印刷、ロールコーティング、電着、無
電解めっき等により行うことができる。As a method of forming the partition, only the partition is formed in advance, and the partition is formed on the porous film by any one of heat fusion, adhesion, adhesion, and uneven fitting by a molded product. There is a method of forming a film by applying a pattern with a certain film pressure to the film. The pattern application can be performed by screen printing, roll coating, electrodeposition, electroless plating, or the like.
【００１９】底部を構成する多孔質膜は各層のうちのひ
とつまたは全てが独立して隔壁より脱着するようにでき
る。このためには例えば多孔質膜各層のうちのひとつま
たは全てに、隔壁の部位に沿って粘着剤をパターン塗布
したり、凹凸嵌合を設置する。In the porous membrane constituting the bottom, one or all of the layers can be detached from the partition independently. For this purpose, for example, one or all of the layers of the porous film are applied with a pattern of an adhesive along the portions of the partition walls, or irregularities are fitted.
【００２０】〔２〕遺伝子解析方法 本発明の遺伝子解析方法は、上記装置の反応槽内に遺伝
子を有するベクターを保持した微生物等の宿主細胞を接
種し、該細胞を培養して遺伝子の増幅・精製を行った
後、多孔質膜に遺伝子を固定し、固定した遺伝子と相補
性のある遺伝子との間でハイブリダイゼーションを行
い、ハイブリッド形成の有無を標識物質等にて検出す
る。標識物質としては、放射性物質、蛍光物質、インタ
ーカレートする蛍光試薬等を挙げることができる。[2] Gene Analysis Method The gene analysis method of the present invention comprises the steps of inoculating host cells such as microorganisms holding a vector having a gene in a reaction tank of the above-described apparatus, culturing the cells, and amplifying the gene. After purification, the gene is immobilized on the porous membrane, hybridization is performed between the immobilized gene and a complementary gene, and the presence or absence of hybridization is detected with a labeling substance or the like. Examples of the labeling substance include a radioactive substance, a fluorescent substance, a fluorescent reagent for intercalating, and the like.
【００２１】本発明の遺伝子解析方法において、多孔質
膜に固定する遺伝子は、解析の対象となる配列・機能の
全部または一部が未知の遺伝子（未知遺伝子）であって
も、また配列・機能既知の遺伝子（既知遺伝子）であっ
てもよい。また固定した遺伝子と相補性のある遺伝子と
は、固定した遺伝子にハイブリダイズできるものであっ
て、固定する遺伝子が未知遺伝子の場合は既知遺伝子
を、また固定する遺伝子が既知遺伝子の場合は未知遺伝
子を用いる。固定した遺伝子と相補性ある遺伝子との間
のハイブリッド形成は、両遺伝子のいずれかに付された
標識を検出することにより行う。In the gene analysis method of the present invention, the gene immobilized on the porous membrane may be a gene or unknown whose sequence or function to be analyzed is entirely or partially unknown (unknown gene). It may be a known gene (known gene). A gene complementary to a fixed gene is one that can hybridize to the fixed gene, and a known gene if the gene to be fixed is an unknown gene, or an unknown gene if the gene to be fixed is a known gene. Is used. Hybridization between the fixed gene and the complementary gene is performed by detecting a label attached to either of the two genes.
【００２２】宿主細胞の反応槽への供与は多連ディスペ
ンサロボットあるいは植菌治具等で供給される。宿主細
胞・ベクター系は遺伝子の種類と解析目的に応じて使い
分けられるが、特に精製処理の点で一本鎖のベクターを
菌体外に放出する、大腸菌・Ｍ13ファージが望ましい。The host cells are supplied to the reaction tank by a multiple dispenser robot or an inoculation jig. The host cell / vector system can be properly used depending on the type of gene and the purpose of analysis, but Escherichia coli / M13 phage, which releases a single-stranded vector out of the cell, is particularly desirable in terms of purification treatment.
【００２３】ここで、宿主細胞を反応槽中で培養するこ
とにより、遺伝子を増幅・精製することができる。ま
た、当該遺伝子を多孔質膜下層に固定するには、真空吸
引、電圧付加、遠心分離等により行う。これにより、多
孔質膜上層に菌体を残したまま多孔質膜下層に目的遺伝
子を挿入したＭ13ファージが固定され、遺伝子固定膜が
作成される。この膜は必要に応じて洗浄処理、ブロッキ
ング、熱処理が可能である。Here, the gene can be amplified and purified by culturing the host cell in a reaction vessel. In order to fix the gene in the lower layer of the porous membrane, vacuum suction, voltage application, centrifugation and the like are performed. As a result, the M13 phage into which the target gene has been inserted is fixed to the lower layer of the porous membrane while the cells remain on the upper layer of the porous membrane, and a gene-immobilized membrane is prepared. This film can be subjected to washing, blocking, and heat treatment as necessary.
【００２４】このようにして作成した遺伝子固定膜は、
ハイブリダイゼーション解析あるいは後述する遺伝子増
幅用に使用される。また、作成した遺伝子固定膜をオリ
ジナルプレートとして、複製することもできる。まず、
反応槽内での細胞培養後、各反応槽に対応するよう位置
決めされた棒状の突起が集合した植菌用治具に各反応槽
中の細胞を付着させ、新たな多孔質膜（複製しようとす
るプレート）を設置した他の装置に移植する（図２）。The gene immobilized membrane thus prepared is
It is used for hybridization analysis or gene amplification described below. Further, the prepared gene immobilization membrane can be copied as an original plate. First,
After culturing the cells in the reaction tank, the cells in each reaction tank are attached to an inoculation jig in which rod-shaped projections positioned to correspond to each reaction tank are assembled, and a new porous membrane (to replicate) (A plate to be used) is transplanted to another device (FIG. 2).
【００２５】その後、同様にして該細胞を培養して遺伝
子の増幅・精製を行った後、多孔質膜に遺伝子を固定す
ればよい。さらに、作製した遺伝子固定膜を取り出し、
隔壁を再設置したものをプライマー、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ
ポリメラーゼを含む溶液を入れた反応槽に入れ、ＰＣＲ
反応により増幅することができる（図３）。ＰＣＲに用
いるプライマーは、ベクターに挿入する遺伝子の両末端
に予め既知配列（ＰＣＲ用共通配列）を導入しておき、
該配列に基づいて設計すればよい。Thereafter, after culturing the cells and amplifying and purifying the gene in the same manner, the gene may be immobilized on the porous membrane. Furthermore, take out the prepared gene immobilization membrane,
After re-installing the partition, the primer, dNTP, Taq
Place in a reaction vessel containing a solution containing polymerase,
It can be amplified by the reaction (FIG. 3). Primers used for PCR are prepared by introducing a known sequence (common sequence for PCR) into both ends of a gene to be inserted into a vector in advance,
What is necessary is just to design based on this arrangement | sequence.
【００２６】宿主細胞の培養、遺伝子の増殖・精製等の
各行程における反応液の供給は、一般には上部より行う
が、最下層（防水膜）を除いた後に底部の多孔質膜を介
しても可能である。また、吸水性素材を反応槽や多孔質
膜に充填することによって反応液供給の効率を上げるこ
とも可能である。The supply of the reaction solution in each step such as culture of host cells and propagation / purification of genes is generally carried out from the top, but also via the bottom porous membrane after removing the bottom layer (waterproof membrane). It is possible. Further, the efficiency of the supply of the reaction liquid can be increased by filling the water absorbing material into the reaction tank or the porous membrane.
【００２７】[0027]
〔実施例１〕図４は、本発明の遺伝子解析装置の一実施
例を示すものであり、防水膜１を最下層とし、その上に
孔径・材質の異なる２層の多孔質膜（２ａ，２ｂ）が積
層して形成される底部３と、多孔質膜の上部に設けられ
た隔壁４とにより形成される複数の反応槽５よりなる。[Embodiment 1] FIG. 4 shows an embodiment of the gene analysis apparatus of the present invention, in which a waterproof membrane 1 is used as a lowermost layer, and two porous membranes (2a, 2a, 2b) is composed of a plurality of reaction tanks 5 formed by a bottom 3 formed by lamination and a partition 4 provided on the porous membrane.
【００２８】各反応槽に、培養液（大腸菌培養用培地）
６、大腸菌菌体７（大腸菌Ｋ12株）、各種の遺伝子を組
み込んだＭ13ファージ８（Ｍ13mp18) を加え、37℃一晩
保温する。反応槽内では、Ｍ１３ファージにより感染し
た大腸菌の培養により、ファージが増殖し、遺伝子が増
幅・精製される。In each reaction vessel, a culture solution (a medium for culturing E. coli)
6. Add Escherichia coli cells 7 (Escherichia coli K12 strain) and M13 phage 8 (M13mp18) incorporating various genes, and incubate at 37 ° C. overnight. In the reaction tank, the phage proliferates and the gene is amplified and purified by culturing Escherichia coli infected with the M13 phage.
【００２９】培養後、最下層の防水膜１を剥がし、吸水
性濾紙９を重層した後、他方の解放面から加圧または吸
水性濾紙９の下部から吸引する。これにより、培養液は
重層した吸水性濾紙９に移行するが、その際、大腸菌は
多孔質膜上層２ａ上に残り、Ｍ13ファージは多孔質膜下
層２ｂ上に吸着される。 続いて、下層２ｂを剥がし、
Ｍ13ファージＤＮＡの固定処理を行い、32−Ｐで標識し
た未知または既知の遺伝子をプローブ遺伝子として、ハ
イブリダイゼーション（相補性試験）を行う。膜上のＭ
13ファージＤＮＡと相補的に結合した標識プローブ量
を、オートラジオグラフィー及びBAS1000 (Fuji)を用い
て定量化する。After the culture, the lowermost waterproof membrane 1 is peeled off, and the water-absorbing filter paper 9 is overlaid. As a result, the culture solution is transferred to the laminated water-absorbing filter paper 9, but at this time, Escherichia coli remains on the porous membrane upper layer 2a, and M13 phage is adsorbed on the porous membrane lower layer 2b. Subsequently, the lower layer 2b is peeled off,
The M13 phage DNA is fixed, and hybridization (complementation test) is performed using an unknown or known gene labeled with 32- P as a probe gene. M on membrane
13 The amount of the labeled probe that complementarily binds to the phage DNA is quantified using autoradiography and BAS1000 (Fuji).
【００３０】〔実施例２〕図５は、本発明の遺伝子解析
装置の一実施例を示すものであり、孔径・材質の異なる
２層の多孔質膜（多孔質膜上層２ａ，多孔質膜下層２
ｂ）が積層して形成される底部３と、多孔質膜の上部に
設けられた隔壁４とにより形成される複数の反応槽５よ
りなる。[Embodiment 2] FIG. 5 shows an embodiment of the gene analysis apparatus of the present invention, in which two porous membranes (porous membrane upper layer 2a, porous membrane lower layer, 2
b) comprises a plurality of reaction vessels 5 formed by a bottom 3 formed by lamination and a partition 4 provided above the porous membrane.
【００３１】この遺伝子解析装置の各反応槽にＭ13ファ
ージにより感染した大腸菌を植菌したものを、当該装置
を設置した時に隔壁の高さを越えない水位に培養液を入
れたバットに入れて培養を行う。培養後、装置を取り出
し、真空吸引装置により下方から残った培養液を吸引す
るとともにＭ13ファージを多孔質膜下層２ｂに吸着・固
定する。培養液は多孔質膜下層２ｂを通過して吸引さ
れ、大腸菌は多孔質膜上層２ａに残される。次に、下層
２ｂを剥がし、Ｍ13ファージＤＮＡの固定化処理を行い
32P で標識した未知または既知の遺伝子をプローブ遺伝
子としてハイブリダイゼーション（相補性試験）を行
う。膜上のＭ13ファージＤＮＡと相補的に結合した標識
プローブ量をオートラジオグラフィー及びBAS1000(Fuj
i) を用いて定量化する。Each of the reaction vessels of this gene analyzer was inoculated with Escherichia coli infected with M13 phage and placed in a vat filled with a culture solution at a water level not exceeding the height of the partition when the apparatus was installed. I do. After the culture, the device is taken out, the remaining culture solution is sucked from below by a vacuum suction device, and the M13 phage is adsorbed and fixed on the lower layer 2b of the porous membrane. The culture solution is aspirated through the lower porous membrane layer 2b, and the E. coli is left in the upper porous membrane layer 2a. Next, the lower layer 2b was peeled off, and M13 phage DNA was immobilized.
Hybridization (complementation test) is performed using an unknown or known gene labeled with 32 P as a probe gene. The amount of labeled probe complementary to the M13 phage DNA on the membrane was determined by autoradiography and BAS1000 (Fuj
Quantify using i).
【００３２】[0032]
【発明の効果】本発明により、遺伝子の増幅・精製、多
孔質膜への固定操作、ハイブリダイゼーションを同一反
応場中で行うことにより、一度に多数の遺伝子の解析を
行うことができる遺伝子解析装置および方法が提供され
る。また、本発明の遺伝子解析装置は、その反応槽に対
応する植菌用治具により、培養細胞を他の装置に接種す
ることにより複製可能である。According to the present invention, a gene analyzing apparatus capable of analyzing a large number of genes at once by performing amplification / purification of genes, fixation to a porous membrane, and hybridization in the same reaction field. And a method are provided. In addition, the gene analysis device of the present invention can be replicated by inoculating cultured cells into another device by using an inoculation jig corresponding to the reaction tank.
【図１】本発明の遺伝子解析装置を示す。FIG. 1 shows a gene analysis apparatus of the present invention.
【図２】遺伝子固定膜を複製する工程を示す。FIG. 2 shows a step of replicating a gene immobilization membrane.
【図３】多孔質膜上に固定された遺伝子をＰＣＲによっ
て増幅する工程を示す。FIG. 3 shows a step of amplifying a gene immobilized on a porous membrane by PCR.
【図４】増幅した遺伝子を多孔質膜下層に固定する工程
を示す。FIG. 4 shows a step of fixing the amplified gene to a lower layer of a porous membrane.
【図５】増幅した遺伝子を多孔質膜下層に固定する工程
を示す。FIG. 5 shows a step of fixing the amplified gene to a lower layer of a porous membrane.
１…防水膜、２…多孔質膜、２ａ…多孔質膜上層、２ｂ
…多孔質膜下層、３…底部、４…隔壁、５…反応槽、６
…培養液、７…大腸菌菌体、８…Ｍ13ファージ、９…吸
水性濾紙、10…バットDESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Waterproof membrane, 2 ... Porous membrane, 2a ... Upper layer of porous membrane, 2b
... Lower layer of porous membrane, 3 ... Bottom part, 4 ... Partition wall, 5 ... Reaction tank, 6
... Culture, 7 ... Escherichia coli, 8 ... M13 phage, 9 ... Water-absorbing filter paper, 10 ... Vat
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｍ 1/14 Ｃ１２Ｍ 1/14 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 中川 美和 東京都新宿区市谷加賀町一丁目１番１号 大日本印刷株式会社内 (72)発明者 岡 素裕 東京都新宿区市谷加賀町一丁目１番１号 大日本印刷株式会社内──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12M 1/14 C12M 1/14 C12N 1/21 C12N 1/21 C12Q 1/68 C12Q 1/68 A // (C12N 1/21 (C12R 1:19) (72) Inventor Miwa Nakagawa 1-1-1, Ichigaya Kagacho, Shinjuku-ku, Tokyo Inside Dai Nippon Printing Co., Ltd. (72) Inventor Motohiro Oka 1-1-1, Ichigaga-cho, Shinjuku-ku, Tokyo No. Dai Nippon Printing Co., Ltd.
Claims (11)
れる底部と、多孔質膜の上部に設けられた隔壁とにより
形成される複数の反応槽からなる遺伝子解析装置。1. A gene analysis apparatus comprising a plurality of reaction tanks formed by a bottom formed by a plurality of stacked porous membranes and a partition provided on an upper portion of the porous membrane.
子および蛋白質を透過することのできる請求項１記載の
遺伝子解析装置。2. The gene analysis apparatus according to claim 1, wherein the upper layer of the porous membrane does not permeate cells, but can permeate genes and proteins.
つ層上に遺伝子を固定することのできる請求項１記載の
遺伝子解析装置。3. The gene analyzer according to claim 1, wherein the lower layer of the porous membrane does not transmit the gene, and the gene can be fixed on the layer.
可能な請求項１記載の装置。4. The apparatus according to claim 1, wherein the porous film constituting the bottom is detachable from the partition.
装置。5. The device according to claim 1, further comprising a waterproof film on the lowermost layer.
れる底部と、多孔質膜の上部に設けられた隔壁とにより
形成される複数の反応槽よりなる遺伝子解析装置の反応
槽内に、遺伝子を有するベクターを保持した宿主細胞を
接種し、該細胞を培養して遺伝子の増幅・精製を行った
後、多孔質膜に遺伝子を固定し、該固定した遺伝子と相
補性のある遺伝子との間でハイブリダイゼーションを行
い、ハイブリッド形成を検出することを含む遺伝子解析
方法。6. A reaction vessel of a gene analyzer comprising a plurality of reaction vessels formed by a bottom formed by a plurality of laminated porous membranes and a partition provided on an upper portion of the porous membrane, After inoculating a host cell holding a vector having a gene, culturing the cell and amplifying and purifying the gene, fixing the gene to a porous membrane, and then synthesizing the gene with a gene complementary to the fixed gene. A method for gene analysis, comprising: performing hybridization between cells and detecting hybridization.
Ｒ増幅を行う請求項６記載の遺伝子解析方法。7. After fixing the gene on the porous membrane, the PC
The gene analysis method according to claim 6, wherein R amplification is performed.
の両末端に既知の共通配列を配置した請求項６記載の遺
伝子解析方法。8. The gene analysis method according to claim 6, wherein a known common sequence is arranged at both ends of the gene inserted into each vector.
ファージとする請求項６記載の遺伝子解析方法。9. The host cell is E. coli, and the vector is M13.
7. The method according to claim 6, wherein the method is a phage.
対応するよう位置決めされた棒状の突起が集合した植菌
用治具に各反応槽中の細胞を付着させ、新たな多孔質膜
を設置した他の装置に移植することにより、遺伝子固定
膜を複製する請求項６記載の遺伝子解析方法。10. After culturing cells in the reaction tank, the cells in each reaction tank are attached to an inoculation jig in which rod-shaped projections positioned so as to correspond to each reaction tank are assembled, and a new porous material is added. The gene analysis method according to claim 6, wherein the gene immobilization membrane is duplicated by transplanting the gene immobilization membrane to another device provided with the membrane.
される底部と、多孔質膜の上部に設けられた隔壁とによ
り形成される複数の反応槽よりなる遺伝子解析装置の反
応槽内に、遺伝子を有するベクターを保持した宿主細胞
を接種し、該細胞を培養して遺伝子の増幅・精製を行っ
た後、多孔質膜に遺伝子を固定化することを特徴とする
遺伝子固定膜の製造方法。11. A reaction vessel of a gene analyzer comprising a plurality of reaction vessels formed by a bottom formed by a plurality of laminated porous membranes and a partition provided on an upper portion of the porous membrane, A method for producing a gene-immobilized membrane, comprising inoculating a host cell holding a vector having a gene, culturing the cell, amplifying and purifying the gene, and immobilizing the gene on a porous membrane.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8340867A JPH10257887A (en) | 1996-09-30 | 1996-12-20 | Gene analyzer and analysis |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25835796 | 1996-09-30 | ||
| JP8-258357 | 1996-09-30 | ||
| JP8340867A JPH10257887A (en) | 1996-09-30 | 1996-12-20 | Gene analyzer and analysis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10257887A true JPH10257887A (en) | 1998-09-29 |
Family
ID=26543657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8340867A Pending JPH10257887A (en) | 1996-09-30 | 1996-12-20 | Gene analyzer and analysis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10257887A (en) |
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1996
- 1996-12-20 JP JP8340867A patent/JPH10257887A/en active Pending
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070109 |