JP2007312700A - Method for identifying base polymorphism - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting a polymorphism in a nucleic acid sequence clearly and in a good reproducibility and a reagent for the same. <P>SOLUTION: This method for identifying the base polymorphism is provided by detecting whether a first ligand and second ligand co-exist or not in a complex (P) of an extended product of at least 1 kind of an oligonucleotide primer (A) for judging the base, bonded with the first ligand and containing a base site (X) desired to be judged, with at least 1 kind of an oligonucleotide probe (D) for detection, bonded with the second ligand and also complemental to the part of the extended product by using at least one kind of a physiologically active substance capable of bonding with the second ligand and also labeled, and a first ligand-capturing agent. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、固相担体として通液性フィルターを用いた塩基多型の同定方法に関するものである。本発明は、遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に有用である。   The present invention relates to a method for identifying a base polymorphism using a liquid-permeable filter as a solid phase carrier. The present invention is particularly useful for diagnosis of genetic diseases, nucleotide polymorphism analysis, and the like.

本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（非特許文献１、非特許文献２）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。   In the present invention, the nucleotide polymorphism means having a nucleotide sequence different from the wild type. The nucleotide polymorphism of a gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism, and is also known as a cause of individual differences such as basic metabolism known as constitution. In addition, they also serve as genetic markers for a number of diseases. Therefore, elucidation of these mutations is clinically important, and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical studies (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2). In addition, a nucleic acid sequence analysis method for detecting each genotype following identification of the causative mutant gene is desired.

従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。   As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, for example, there is a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Nucleic acid sequencing can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences, but requires a great deal of effort to prepare template nucleic acids, DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, analysis of nucleic acid sequences, etc. And time is needed. Further, labor can be saved by using a recent automatic sequencer, but there is a problem that an expensive apparatus is required.

一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。   On the other hand, there are various known genetic diseases caused by point mutations in genes, and some of them know which part of the gene and how point mutations cause genetic diseases. Not a few.

このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（例えば、特許文献１及び２参照）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。増幅された遺伝子断片に対し、特定の核酸配列を切断する制限酵素により処理し、生じるフラグメントの大きさで判断する方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法が用いられている。同じくＰＣＲ法を用いた検出方法としては、使用するプライマーの特異性を利用したAlelle specific amplification法が用いられる。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオ チドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。   As a method for detecting such a predicted point mutation, detection of a point mutation of a gene using a gene amplification method such as a PCR (polymerase chain reaction) method (see, for example, Patent Documents 1 and 2) has been conventionally performed. The method is known. The amplified gene fragment is treated with a restriction enzyme that cleaves a specific nucleic acid sequence, and a method of judging based on the size of the resulting fragment (PCR-RFLP) is used. Similarly, as a detection method using the PCR method, the Alelle specific amplification method using the specificity of the primer to be used is used. In this method, as one of the pair of oligonucleotides used in the gene amplification method, a wild-type oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the wild-type gene amplification region and the mutant-type gene amplification Use a mutant oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the region. Mutant oligonucleotides have nucleotides complementary to the predicted point mutation at the 3 'end. Such wild-type and mutant-type oligonucleotides are separately used to subject the sample gene to the gene amplification method.

試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅が起きたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出できる。また他の様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した捕捉プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。   If the sample gene is wild-type, nucleic acid amplification occurs when a wild-type oligonucleotide is used, but if a mutant-type oligonucleotide is used, the 3 ′ end of the oligonucleotide corresponds to the sample gene. Since it is not complementary to the nucleotide (mismatch), no extension reaction occurs, and no nucleic acid amplification occurs. On the other hand, if the sample gene is a mutant type, conversely, amplification does not occur when the wild-type oligonucleotide is used, and amplification occurs when the mutant-type oligonucleotide is used. Therefore, by examining whether amplification occurs when using each oligonucleotide, it is possible to determine whether the sample gene is a wild type or a mutant type, thereby identifying a point mutation in the sample gene. Can do. As a method to check whether amplification has occurred at this time, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, stained with a nucleic acid-specific binding fluorescent reagent such as ethidium bromide, and then irradiated with UV to detect the presence of amplified nucleic acid. it can. Other methods include Southern blotting, in which amplified nucleic acid is immobilized on a nylon membrane and detected using a labeled probe, sandwich hybridization in which a detection probe is used after capturing with a capture probe immobilized on an individual carrier. Laws have been developed.

上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、迅速かつ大量の試料を解析するためには、多大な労力を要するか大規模なラボオートメーションシステムを構築する必要がある。   Although it seems that the amplified nucleic acid can be detected by the method as described above and the polymorphism can be easily identified, in practice, the operation is complicated, and in order to analyze a large amount of samples quickly, Requires labor or needs to build a large lab automation system.

例えば電気泳動法によれば野生型及び変異型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。   For example, according to the electrophoresis method, it is necessary to separately detect the wild type and the mutant type, and it is difficult to accurately quantify the amount of nucleic acid from the electrophoretic image. Further, Southern blotting and sandwich hybridization require a hybridization reaction with a probe, and the conditions must be strictly adjusted. Furthermore, a process for removing excess probes is required, and the operation is very complicated.

また、過去においてガラス繊維で構成されたフィルターを用いて抗原−抗体反応などの生物学的特異反応を検出する試みがなされている（例えば、特許文献３参照）。塩基多型の同定方法への応用が検討された事例もある（例えば、特許文献４参照）。
特公平４−６７９６０号公報 特公平４−６７９５７号公報 特開平４−３１８４６２号公報 特開２００６−２０５１２号公報 GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 第８７〜９６頁（１９９０年） Balantら、Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第５５１〜５５４頁、（１９８９年） In the past, attempts have been made to detect biologically specific reactions such as an antigen-antibody reaction using a filter composed of glass fibers (see, for example, Patent Document 3). There are cases where application to a method for identifying nucleotide polymorphisms has been studied (see, for example, Patent Document 4).
Japanese Examined Patent Publication No. 4-67960 Japanese Patent Publication No. 4-67957 JP-A-4-318462 JP 2006-20512 A Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 87-96 (1990) Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-554, (1989)

本発明の目的は、上記のような問題点を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method and a reagent therefor that can solve the above-mentioned problems and detect a polymorphism in a nucleic acid sequence clearly and reproducibly.

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、本発明を完成させるに至った。 In view of the above circumstances, the present inventors have completed the present invention as a result of intensive studies.

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．試料溶液中に含まれる標的核酸配列上の塩基部位を判定する方法において、少なくとも以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする塩基判定方法。
（１）第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)と、を用いて標的核酸配列から増幅反応を行う第一工程、
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉する第三工程、
（４）該複合体（Ｐ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する第四工程。
２．第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする１の塩基判定方法。
３．第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１又は２の塩基判定方法。
４．第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１又は２の塩基判定方法。
５．工程（４）の前に、固相上に捕捉されなかった未反応の第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる生理活性物質を除去する工程を含むことを特徴とする１〜４のいずれかに記載の塩基判定方法。
６．固相が通液性フィルターであり、固相上に捕捉されなかった未反応の第一のリガンドに結合できかつ標識されてなる生理活性物質が、該通液性フィルターを通過することを特徴とする５の塩基判定方法。
７．第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１〜６のいずれかの塩基判定方法。
８．生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１〜７のいずれかの塩基判定方法。
９．生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１〜８のいずれかの塩基判定方法。
１０．プライマー（Ａ）の３’末端より２番目の塩基が判定したい塩基部位（Ｘ）の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする１〜９のいずれかの塩基判定方法。
１１．プライマー（Ａ）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする１〜１０のいずれかの塩基判定方法。
１２．少なくとも以下の（１）〜（５）を含むことを特徴とする塩基判定用キット。
（１）第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）、
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)、
（３）第二のリガンドが結合しておりかつ該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）、
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質、
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相。
１３．固相が通液性フィルターであることを特徴とする１２の塩基判定用キット。
１４．第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１２又は１３の塩基判定用キット。
１５．第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１２又は１３の塩基判定用キット。
１６．第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１２〜１５のいずれかの塩基判定用キット。
１７．生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１２〜１６のいずれかの塩基判定用キット。
１８．生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする１２〜１７のいずれかの塩基判定用キット。 That is, the present invention has the following configuration.
1. A method for determining a base site on a target nucleic acid sequence contained in a sample solution, comprising at least the following steps (1) to (4):
(1) Complementary to at least one base determination oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and containing the base site (X) to be determined, and a part of the extension product of the primer (A) A first step of performing an amplification reaction from the target nucleic acid sequence using at least one kind of oligonucleotide primer (B),
(2) For detection of at least one kind of primer (A) extension product that can be obtained in the first step and the second ligand bound and complementary to part of the primer (A) extension product A second step of hybridizing the oligonucleotide probe (D) to form a complex (P);
(3) Capture at least one type of physiologically active substance capable of binding to the second ligand and labeled on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (P). Three steps,
(4) A fourth step of detecting the label of the physiologically active substance captured on the solid phase via the complex (P).
2. The base determination method according to 1, wherein an oligonucleotide probe (D) is present in the first step.
3. 1 or 2 base determination methods, wherein the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
4). The method for determining one or two bases, wherein the second ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
5). Any one of 1 to 4 characterized by including before the step (4), a step of removing a physiologically active substance that can be bound to and labeled with an unreacted second ligand that has not been captured on the solid phase. The base determination method of crab.
6). The solid phase is a liquid-permeable filter, and a physiologically active substance that can bind to and is labeled with an unreacted first ligand not captured on the solid phase passes through the liquid-permeable filter. 5 base judging method.
7). The base determination method according to any one of 1 to 6, wherein the capture agent for the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance and avidin .
8). The base determination method according to any one of 1 to 7, wherein the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of antibodies, oligonucleotides, receptors, nucleic acid-specific binding substances, and avidin.
9. The label bonded to the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance and a conductive substance. The base determination method in any one of -8.
10. The base determination according to any one of 1 to 9, wherein the second base from the 3 ′ end of the primer (A) is the same or a complementary base as the predicted base of the base site (X) to be determined Method.
11. Any one of bases 1 to 10, wherein at least one base from 3 to 5 from the 3 'end of primer (A) is substituted with a base that is not complementary or homologous to the nucleic acid sequence used as a template Judgment method.
12 A kit for base determination, comprising at least the following (1) to (5).
(1) at least one base determination oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and which includes the base site (X) to be determined;
(2) at least one oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A),
(3) at least one kind of detection oligonucleotide probe (D) to which a second ligand is bound and which is complementary to a part of the extension product of the primer (A),
(4) at least one physiologically active substance capable of binding to the second ligand and labeled;
(5) A solid phase to which a capture agent for the first ligand is bound.
13. A twelve base determination kit, wherein the solid phase is a liquid-permeable filter.
14 12. The kit for determining a base according to 12 or 13, wherein the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
15. The 12 or 13 base determination kit, wherein the second ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
16. For base determination according to any one of 12 to 15, wherein the capture agent for the first ligand is at least one selected from the group consisting of antibodies, oligonucleotides, receptors, nucleic acid-specific binding substances, and avidin kit.
17. The base determination kit according to any one of 12 to 16, wherein the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of antibodies, oligonucleotides, receptors, nucleic acid-specific binding substances, and avidin.
18. The label bound to the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance and a conductive substance. The kit for base determination in any one of -17.

本発明により、試料核酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られる。   The present invention provides a method capable of clearly and easily detecting a base polymorphism in a sample nucleic acid. Since the method of the present invention does not require a complicated operation as in the conventional methods, results with good reproducibility can be obtained quickly and easily.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において「試料溶液」とは、標的核酸配列すなわち解析の対象となる塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸を含む溶液を指し、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。該試料溶液の調製法は特に限定されないが、例えば、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the “sample solution” refers to a solution containing a nucleic acid having a sequence complementary to a target nucleic acid sequence, that is, a chromosome containing a nucleotide polymorphism site to be analyzed or a fragment thereof, for example, bacteria, animals or plants. It can be prepared from any material such as tissue, lysates from individual cells. The method for preparing the sample solution is not particularly limited. For example, it may be prepared from a patient's blood or tissue by a known method. Typical examples include phenol / chloroform extraction method (Biochimica et Biophysica acta 72, 619-629, 1963), alkaline SDS method (Nucleic Acid Research 7th, 1513-1523, 1979). There is a method of performing in the liquid phase. Further, as a system using a nucleic acid binding carrier for nucleic acid isolation, a method using glass particles and a sodium iodide solution (Proc. Natl. Acad. USA, Vol. 76-2, 615-619, 1979). ) And a method using hydroxyapatite (Japanese Patent Laid-Open No. 63-263093). Examples of other methods include a method using silica particles and chaotropic ions (J. Clinical Microbiology Vol. 28-3, 495-503, 1990, JP-A-2-289596).

本発明において「標的核酸配列」とは、標的核酸すなわち解析の対象となる塩基多型部位を含む核酸の配列を指す。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、リボゾーム遺伝子、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、薬物代謝に関連する遺伝子としてＣＹＰ２Ｃ１９ （Cytochrome P450 2C19）遺伝子が挙げられる。 In the present invention, the “target nucleic acid sequence” refers to a target nucleic acid, that is, a nucleic acid sequence containing a nucleotide polymorphism site to be analyzed. Examples of the target nucleic acid include an Alu sequence, a ribosomal gene, an exon, intron, and promoter of a gene encoding a protein. More specifically, genes related to various diseases including genetic diseases, drug metabolism, lifestyle-related diseases (hypertension, diabetes, etc.) can be mentioned. For example, the CYP2C19 (Cytochrome P450 2C19) gene can be mentioned as a gene related to drug metabolism.

本発明において「塩基多型」とは、核酸が野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。野生型の塩基配列を有する野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、該野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸、すなわち変異型核酸について、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されてきている。また、このような塩基多型により体質等が異なっていることも解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法であり、「塩基多型（Ｘ）」とは、該塩基多型のうち検査の対象として判定しようとする塩基部位を示す。 In the present invention, the “base polymorphism” means that the nucleic acid has a base sequence different from that of the wild type. At least one of wild-type nucleic acids having a wild-type base sequence, preferably one nucleotide is point-mutated and replaced with another nucleotide, or inserted or deleted in a part of the wild-type nucleic acid It has been elucidated which part of the nucleotide is mutated in a nucleic acid containing a sequence, that is, a mutant nucleic acid. In addition, it has been elucidated that the constitution is different depending on such base polymorphism, and the method of the present invention examines whether or not the nucleic acid in the sample has such an expected mutation. This is a method, and “base polymorphism (X)” indicates a base site to be determined as a test target in the base polymorphism.

本発明において、第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）とは、対象となる塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、既知の増幅方法であるＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＵＣＡＮ法に使用できるものであれば特に限定されるものではない。   In the present invention, at least one type of base determination oligonucleotide primer (A) to which a first ligand is bound and which includes a base site (X) to be determined is a chromosome containing a target base polymorphism site or Any oligonucleotide that has a sequence complementary to the fragment and can be used for known amplification methods such as PCR, NASBA, LCR, SDA, RCA, TMA, LAMP, ICAN, and UCAN is particularly limited. It is not a thing.

第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）は、３’末端より1番目または２番目の塩基が、判定したい塩基の位置に相当するように設計するのがよい。好ましくは、２番目の塩基が、判定したい塩基の位置に相当するように設計するのがよい。また、本発明の効果を損なわないように、３’末端より３番目や３番目以降の塩基を判定したい塩基の位置に相当するように設計してもよい。さらに、３’末端より３から５番目の少なくとも1つの塩基が、鋳型となる核酸配列と相補的でない塩基に置換させることによって、判定したい塩基が存在した場合、より選択的に増幅できるプライマーにしてもよい。プライマー鎖長は、９〜３５塩基であればよく、好ましくは、１１〜３０塩基である。 The first or second base oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and which contains the base site (X) to be judged is the base to be judged from the first or second base from the 3 ′ end. It is better to design so as to correspond to the position of Preferably, the second base is designed so as to correspond to the position of the base to be determined. In order not to impair the effects of the present invention, the third or third base from the 3 'end may be designed to correspond to the position of the base to be determined. Furthermore, by replacing at least one base from the 3rd to 5th from the 3 ′ end with a base that is not complementary to the template nucleic acid sequence, a primer that can be amplified more selectively when the base to be determined is present. Also good. The primer chain length may be 9 to 35 bases, and preferably 11 to 30 bases.

プライマー（Ａ）は判定したい塩基部位（Ｘ）に応じて、複数混在していても良い。例えば、野生型を検出するためのプライマー（Ａ）と、多型を検出するためのプライマー（Ａ）を混合して用いてもよい。プライマー（Ａ）を混合して用いる場合、第一のリガンドの種類を変えても良い。 A plurality of primers (A) may be present depending on the base site (X) to be determined. For example, a primer (A) for detecting a wild type and a primer (A) for detecting a polymorphism may be mixed and used. When mixing and using the primer (A), the type of the first ligand may be changed.

プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)は、核酸増幅のために一般的に利用される特性を有していれば良く、必要に応じて修飾されていても良い。通常、プライマー（Ａ）がセンスプライマー（フォワードプライマーともいう）のときプライマー（Ｂ）はアンチセンスプライマー（リバースプライマーともいう）として設定すればよい。逆に、プライマー（Ａ）がアンチセンスプライマーのときプライマー（Ｂ）はセンスプライマーとして設定すればよい。プライマー鎖長は、９〜３５塩基であればよく、好ましくは、１１〜３０塩基である。これらのプライマーを用いた増幅方法は特に限定はされない。既知の増幅方法を用いればよい。既知の増幅方法としては、例えば、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＵＣＡＮ法などがある。 The at least one oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A) only needs to have a property generally used for nucleic acid amplification, and if necessary It may be modified. Usually, when the primer (A) is a sense primer (also referred to as a forward primer), the primer (B) may be set as an antisense primer (also referred to as a reverse primer). Conversely, when primer (A) is an antisense primer, primer (B) may be set as a sense primer. The primer chain length may be 9 to 35 bases, and preferably 11 to 30 bases. The amplification method using these primers is not particularly limited. A known amplification method may be used. Known amplification methods include, for example, PCR, NASBA, LCR, SDA, RCA, TMA, LAMP, ICAN, and UCAN methods.

本発明において、第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）の伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを共に、作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）が伸長する。   In the present invention, the extension method of at least one base determination oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and containing the base site (X) to be determined is basically a conventional method. Can be used. Usually, a target nucleic acid is used as a template by allowing four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTP) and DNA polymerase to act on a chromosome or fragment thereof containing a specific nucleotide polymorphism site denatured into a single strand. The oligonucleotide primer (A) is extended.

該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition （Sambrookら、第８章、第８．１〜８．１２６頁、２００１年）に記載の方法に従って行うことができる。また、該オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）が伸長されたか否かによって塩基多型を検出する方法において、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、予め前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。   The extension reaction can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition (Sambrook et al., Chapter 8, 8.1-8.126, 2001). In addition, in the method for detecting a base polymorphism depending on whether or not the oligonucleotide primer (A) is extended, if the target nucleic acid does not contain an amount sufficient for detection, a nucleic acid containing the polymorphic sequence in advance. It is also possible to amplify the fragment by the amplification reaction shown below.

本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を作用させることで、標的核酸を鋳型として用いたオリゴヌクレオチドプライマー間の配列が増幅される。   In the present invention, a method for amplifying a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, and usually a specific nucleotide polymorphism denatured into a single strand. Oligonucleotide primer using target nucleic acid as template by allowing 4 types of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), DNA polymerase and oligonucleotide primers (A) and (B) to act on the chromosome containing the site or fragment thereof The sequence between is amplified.

核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Nature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method：J Clin Microbiol. 第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：Kekkaku. 第７８巻、第５３３頁（２００３年））などが挙げられる。   Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature 350, 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, JP-A-2-2934), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research, Volume 16, 1691 (1992)), RCA (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcription mediated amplification method; J. Clin. Microbiol. Volume 31, 3270 (1993)), LAMP (loop-mediated isothermal amplification method: J Clin Microbiol. 42: 1,956 (2004)), ICAN (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids: Kekkaku. 78, 533 (2003)).

なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドプライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドプライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。   In particular, the PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a heat-resistant DNA polymerase, whereby the above paired In this method, the region of the sample nucleic acid sandwiched between the oligonucleotide primers is exponentially amplified. That is, the nucleic acid of the sample is denatured in the denaturation step, each oligonucleotide primer is hybridized with a region on the single-stranded sample nucleic acid complementary to each in the subsequent annealing step, and each oligonucleotide primer is then synthesized in the subsequent extension step. The DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of DNA polymerase from the starting point to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of oligonucleotide primers is theoretically amplified to 2 n times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, if a gene amplification method is used, it is possible to detect even a very small amount of sample nucleic acid that could not be detected in the past (one molecule is acceptable), which is a very widely used technique recently. .

本発明に用いられる「第二のリガンドが結合しておりかつ該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）」は、好適には該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたもの、より好適には、オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いて増幅した核酸断片のうちの該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いることができ、オリゴヌクレオチドにリガンドが結合する部位は特に限定されない。また、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）は、オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いた増幅反応を阻害しないように設計するのがよい。その一例として、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のＴｍ値を該プライマー（Ａ，Ｂ）のＴｍ値より低くなるように設計すればよい。   The “at least one detection oligonucleotide probe (D) to which a second ligand is bound and complementary to a part of the extension product of the primer (A)” used in the present invention is preferably the above-mentioned One in which a ligand is bound to an oligonucleotide complementary to a part of the extension product of primer (A), more preferably, the nucleic acid fragment amplified using oligonucleotide primers (A) and (B) A ligand bound to an oligonucleotide complementary to a part of the extension product of primer (A) can be used, and the site where the ligand binds to the oligonucleotide is not particularly limited. The oligonucleotide probe (D) is preferably designed so as not to inhibit the amplification reaction using the oligonucleotide primers (A) and (B). As an example, the Tm value of the oligonucleotide probe (D) may be designed to be lower than the Tm value of the primer (A, B).

オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ値は、ハイブリッドを形成した２本鎖ＤＮＡ分子の５０％が乖離する温度のことであり、その計算方法としては、既知の方法であれば特に限定されないが、Ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法のいずれかにより求められたもので、本発明の特性を満たしていることが必要である。なお、特に好ましいＴｍ値はＮｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄで計算されたものである。該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）および該プライマー（Ａ，Ｂ）におけるＴｍ値の差は０．５℃以上であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１℃以上である。 The Tm value of the oligonucleotide primer is a temperature at which 50% of the double-stranded DNA molecules forming the hybrid are separated from each other, and the calculation method is not particularly limited as long as it is a known method, but the Neighbor Neighbor method, It is obtained by either the Wallace method or the GC% method and needs to satisfy the characteristics of the present invention. Note that a particularly preferable Tm value is calculated by the Nearest neighbor method. The difference in Tm value between the oligonucleotide probe (D) and the primer (A, B) is not particularly limited as long as it is 0.5 ° C. or higher, but is preferably 1 ° C. or higher.

本発明においては、第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と第二のリガンドが結合しておりかつ該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）は、別々、又は同時に作用させることが可能である。   In the present invention, the first ligand is bound and the second ligand is bound to at least one base judgment oligonucleotide primer (A) containing the base site (X) to be judged and the primer. At least one kind of detection oligonucleotide probe (D) complementary to a part of the extension product of (A) can be allowed to act separately or simultaneously.

別々に作用させる場合には、一例として、上記オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いて増幅反応を行った後に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を加え、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。 When acting separately, as an example, after performing an amplification reaction using the oligonucleotide primers (A) and (B), the oligonucleotide probe (D) is added, followed by heat denaturation at 98 ° C. for 3 minutes. The temperature can be gradually lowered to near room temperature after the operation.

同時に作用させる場合には、一例として、上記オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）、（Ｂ）および該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を混合した状態で増幅反応を行い、増幅反応に引き続いて９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。 When acting simultaneously, as an example, an amplification reaction is performed in a state where the oligonucleotide primers (A), (B) and the oligonucleotide probe (D) are mixed, and the amplification reaction is followed by 98 ° C. for 3 minutes. After heat denaturation, the temperature can be gradually lowered to near room temperature.

上記のような核酸増幅法を利用した方法では、反応後に、試料中に含まれる鋳型配列が野生型配列の場合は野生型配列を特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）によって増幅された核酸断片と第二のリガンドが結合したプローブ（Ｄ）を含む複合体（Ｐ）を形成し、試料中に含まれる鋳型配列が変異型配列の場合は変異型配列を特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）によって増幅された核酸断片と第二のリガンドが結合した複合体（Ｐ）を形成する。   In the method using the nucleic acid amplification method as described above, after the reaction, when the template sequence contained in the sample is a wild type sequence, it was amplified by an oligonucleotide primer (A) capable of specifically amplifying the wild type sequence. An oligo capable of specifically amplifying the mutant sequence when a complex sequence (P) including a probe (D) in which the nucleic acid fragment and the second ligand are bound is formed and the template sequence contained in the sample is a mutant sequence; A complex (P) in which the nucleic acid fragment amplified by the nucleotide primer (A) and the second ligand are bound is formed.

使用される第一リガンドと第二のリガンドは核酸配列の検出を妨げるものでないのであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗原、抗体、蛍光物質、発光団、および酵素、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンからなる群から選ぶことができる。好ましくは、抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが良く、特に好ましくは抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンが良い。本発明を実施するにあたって、第一リガンドと第二のリガンドが異なっていることが好ましい。例えば、第一リガンドにビオチン、第二のリガンドにＦＩＴＣを用いてもよい。   The first and second ligands used are not particularly limited as long as they do not interfere with the detection of the nucleic acid sequence, but are preferably antigens, antibodies, fluorescent substances, luminophores, enzymes, and avidin , Biotin, and digokesigenin. Antigens, fluorescent substances, biotin, digoxigenin, and the like are preferable, and antigens, fluorescent substances, biotin, and digoxigenin are particularly preferable. In practicing the present invention, the first ligand and the second ligand are preferably different. For example, biotin may be used as the first ligand and FITC may be used as the second ligand.

本発明では、形成された複合体（Ｐ）中に、第一リガンドと第二のリガンドが共存することを確認できればよい。例えば、第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉し、その複合体（Ｐ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出しても良い。   In the present invention, it is only necessary to confirm that the first ligand and the second ligand coexist in the formed complex (P). For example, at least one physiologically active substance that can bind to and be labeled with the second ligand is captured on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (P), The label of the physiologically active substance captured on the solid phase via the complex (P) may be detected.

固相としては金属板、木片、プラスチック板、ガラス板、ゴム板、発泡スチロール、フィルム、膜、通液性フィルター、ゲルなどを使用してもよい。好ましくは膜、通液性フィルターがよく、特に好ましくは通液性フィルターがよい。 As the solid phase, a metal plate, a piece of wood, a plastic plate, a glass plate, a rubber plate, a polystyrene foam, a film, a membrane, a liquid-permeable filter, a gel, or the like may be used. A membrane and a liquid-permeable filter are preferable, and a liquid-permeable filter is particularly preferable.

例えば、通液性フィルターを用いる場合、形成された複合体（Ｐ）を、第一のリガンドの捕捉剤が結合された通液性フィルターに滴下し通液性上に該複合体（Ｐ）を捕捉する。第一のリガンドの捕捉剤としては、抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンより適宜選択することが可能である。好ましくは抗体、アビジンがよく、特に好ましくはアビジンがよい。例えば、第一のリガンドがビオチンの場合、第一のリガンドの捕捉剤はアビジンであればよい。   For example, when a liquid-permeable filter is used, the formed complex (P) is dropped on the liquid-permeable filter to which the first ligand capture agent is bound, and the complex (P) is added to the liquid-permeable filter. To capture. The capture agent for the first ligand can be appropriately selected from antibodies, oligonucleotides, receptors, nucleic acid-specific binding substances, avidin, biotin, and digokesigenin. An antibody and avidin are preferable, and avidin is particularly preferable. For example, when the first ligand is biotin, the capture agent for the first ligand may be avidin.

通液性フィルター上に捕捉された複合体（Ｐ）に対し、第二のリガンドと結合する標識された生理活性物質を滴下し、通液性フィルター上に複合体（Ｐ）を介して標識生理活性物質を結合させる方法において、予め該複合体（Ｐ）と混合させておくことも可能であり、該複合体を通液性フィルター上に捕捉した後、滴下することも可能である。
通液性フィルター上に添加することにより、余分な液はフィルターを通して下に落ち、被検出物はフィルター上およびフィルター上部の孔部分に結合され、検出感度も向上される。 A labeled physiologically active substance that binds to the second ligand is dropped onto the complex (P) captured on the liquid-permeable filter, and the labeled physiology is labeled on the liquid-permeable filter via the complex (P). In the method of binding the active substance, it can be mixed with the complex (P) in advance, or the complex can be dropped on the liquid filter and then dropped.
By adding on the liquid-permeable filter, the excess liquid falls down through the filter, and the detection target is bound to the pores on the filter and the upper part of the filter, so that the detection sensitivity is improved.

用いられる生理活性物質は第二のリガンドに親和性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンよりなる群より選ぶことができる。好ましくは抗体、アビジンがよく、特に好ましくは抗体がよい。例えば、第二のリガンドがＦＩＴＣの場合、生理活性物質は抗ＦＩＴＣ抗体であればよい。   The physiologically active substance to be used is not particularly limited as long as it has an affinity for the second ligand, but is preferably an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance, avidin, biotin, digokesigenin. You can choose from a group consisting of: An antibody and avidin are preferable, and an antibody is particularly preferable. For example, when the second ligand is FITC, the physiologically active substance may be an anti-FITC antibody.

第一リガンド、第二のリガンド、第一のリガンドの捕捉剤及び第二のリガンドに結合する生理活性物質を選択する場合、第二リガンドと第二のリガンドに結合する生理活性物質は結合でき、第二リガンドと第一のリガンドの捕捉剤は結合できないように選択するのがよい。また、第一のリガンドと第一のリガンドの捕捉剤は結合でき、第一のリガンドと第二のリガンドに結合する生理活性物質は結合できないように選択するのがよい。   When selecting a first ligand, a second ligand, a capture agent for the first ligand, and a bioactive substance that binds to the second ligand, the second ligand and the bioactive substance that binds to the second ligand can bind, The second ligand and the first ligand capture agent should be selected so that they cannot bind. It is preferable that the first ligand and the capture agent for the first ligand can be bound, and that the physiologically active substance that binds to the first ligand and the second ligand cannot be bound.

生理活性物質に結合される標識としては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群より選ぶことができる。好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、発光団、酵素、導電性物質がよく、さらに好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、酵素がよく、特に好ましくは酵素がよい。この標識は、第一のリガンド、第二のリガンド、第一のリガンドの捕捉剤及び第二のリガンドに結合する生理活性物質のいずれとも結合しない物質が好ましい。   The label bonded to the physiologically active substance can be selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance, and a conductive substance. Preferred are fluorescent chemical substances, fluorescent proteins, luminophores, enzymes and conductive substances, more preferred are fluorescent chemical substances, fluorescent proteins and enzymes, and particularly preferred are enzymes. This label is preferably a substance that does not bind to any of the first ligand, the second ligand, the capture agent for the first ligand, and the physiologically active substance that binds to the second ligand.

本発明では、形成された複合体（Ｐ）中に、第一リガンドと第二のリガンドが共存することを確認する操作において、例えば、第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉し、その複合体（Ｐ）を介して固相上に捕捉された生理活性物質の標識を検出しても良い。このとき、固相上に捕捉されなかった未反応の標識は取り除くのがよい。 In the present invention, in the operation of confirming the coexistence of the first ligand and the second ligand in the formed complex (P), for example, at least one kind that can bind to and be labeled with the second ligand Is captured on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (P), and the physiological activity captured on the solid phase via the complex (P). The label of the substance may be detected. At this time, unreacted label that has not been captured on the solid phase should be removed.

例えば、通液性フィルターを用いる場合、通液性フィルター上に複合体を介して結合された標識と未反応の標識は、上部より洗浄液を滴下することによって、容易にさらに高精度で分離することが可能である。   For example, when using a liquid-permeable filter, the label bound to the liquid-permeable filter via a complex and the unreacted label can be easily separated with higher accuracy by dropping a washing solution from above. Is possible.

通液性フィルターとしては、液をフィルターに滴下した際に、液がフィルター表層を通過していくものであればどのような形態でも良く、織布、不織布、多孔質体が挙げられる。フィルターの素材としては、ガラス、セラミック、金属、プラスチックなどが挙げられ、プラスチックとしては、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアリレート、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリパラメチルスチレン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルブチラール、ポリビニルホルマール、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリメ チルペンテン、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂、キシレン樹脂、グアナミン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、ビニルエステル樹脂、フェノール樹 脂、不飽和ポリエステル樹脂、フラン樹脂、ポリイミド、ポリ−ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ポリウレタン、マレイン酸樹脂、メラミン樹脂およびユリア樹脂樹脂 などが例示される。
具体的には、ガラス繊維織布、ガラス繊維不織布、多孔質ガラス、多孔質セラミック（セラミック焼結体）、金属焼結体、独立気泡型の発泡樹脂、各種繊維の織布、不織布が挙げられる。
これらの中でも好ましくはガラス繊維フィルターであり、繊維の平均直径が０．３〜２．０μｍのものが好ましく、平均繊維長は０．５〜２ｍｍのものが好ましい。好ましいガラス繊維フィルターの具体例は特開平４−３１８４６２号公報に記載されており、これをそのまま用いることができる。また、用いられうるプラスチック製のフィルターの例としては特開２０００−６５８３２号公報に詳細が記載されており、この技術をそのまま用いることができる。 The liquid-permeable filter may have any form as long as the liquid passes through the filter surface layer when the liquid is dropped on the filter, and examples thereof include woven fabric, non-woven fabric, and porous material. Examples of the material of the filter include glass, ceramic, metal, plastic, and the plastic includes polyamide, polyamideimide, polyarylate, polyimide, polyetherimide, polyetheretherketone, polyethylene, polyethylene oxide, polyester, polycarbonate, Polystyrene, polysulfone, polyethersulfone, polyparamethylstyrene, polyallylamine, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyvinyl butyral, polyvinyl formal, polyphenylene ether, polyphenylene sulfide, polybutylene terephthalate, polypropylene, polymethylpentene, acrylic resin, methacrylic resin, Epoxy resin, xylene resin, guanamine resin, diallyl phthalate tree Examples thereof include fat, vinyl ester resin, phenol resin, unsaturated polyester resin, furan resin, polyimide, poly-p-hydroxybenzoic acid, polyurethane, maleic resin, melamine resin, and urea resin resin.
Specific examples include glass fiber woven fabrics, glass fiber nonwoven fabrics, porous glass, porous ceramics (ceramic sintered bodies), metal sintered bodies, closed cell foamed resins, various fiber woven fabrics and nonwoven fabrics. .
Among these, glass fiber filters are preferred, those having an average fiber diameter of 0.3 to 2.0 μm are preferred, and those having an average fiber length of 0.5 to 2 mm are preferred. Specific examples of preferable glass fiber filters are described in JP-A-4-318462, and can be used as they are. Further, details of an example of a plastic filter that can be used are described in JP-A No. 2000-65832, and this technique can be used as it is.

なお、フィルターは容器に収納して使用することができる。容器は、液体不透過性の材料で構成されており、試薬を適用する範囲を限定するための開口部を有し ている。多孔性担体は開口部の下部に設置される。そしてフィルターの下部に、フィルターを通過した試薬を吸収する吸収層が設けられている。必要に応じて、多孔性担体と吸収層の間に逆流防止層を設け、吸収層に収納された試薬が多孔性担体に逆流するのを防ぐ場合もある。液体不透過性の材料としては、液体を透過させない物質であればよく、例えばポリエチレン、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリアミド樹脂、ポリプロピレン、ポリカーボネート等の樹脂が液体不透過性、成形の容易さ等の点で好ましい。吸収層としては、液体を吸収し得るものであれば特に限定されないが、例えば液体の吸収性が高いセルロース、またはセルロース誘導体を主成分とする紙の重層物などが挙げられる。また、上記逆流防止層としては、疎水性の不繊布シート、ウェーブ材などが例示される。なお、この技術は特開２００４−１５６９８５号公報に具体的に記載されている。
また、このようなフィルターを使用することにより、自動検出にも容易に展開が可能である。 The filter can be used in a container. The container is made of a liquid-impermeable material and has an opening for limiting the range to which the reagent is applied. The porous carrier is placed below the opening. And the absorption layer which absorbs the reagent which passed the filter is provided in the lower part of the filter. If necessary, a backflow prevention layer may be provided between the porous carrier and the absorption layer to prevent the reagent contained in the absorption layer from flowing back to the porous carrier. The liquid-impermeable material may be any substance that does not allow liquid to permeate. For example, resins such as polyethylene, polystyrene, ABS resin, vinyl chloride resin, polyamide resin, polypropylene, and polycarbonate are liquid-impermeable and easy to mold. Etc. are preferable. The absorbent layer is not particularly limited as long as it can absorb a liquid. Examples of the absorbent layer include cellulose having a high liquid absorbency, and a paper multi-layered body mainly composed of a cellulose derivative. Examples of the backflow prevention layer include a hydrophobic non-woven cloth sheet and a wave material. This technique is specifically described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-156985.
In addition, by using such a filter, it is possible to easily develop automatic detection.

通液性フィルター上に複合体（Ｐ）を介して結合された標識の検出は既知の方法であれば特に限定されるものではないが、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、ＡＭＰＰＤ、ＤＤＡＯｐｈｏｓｐａｔｅ、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ等の組み合わせ、パーオキシダーゼとＴＭＢ、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、ＳＡＴ−１（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとＮＴＢ等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応性生物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質、電流値を検出することによって測定が可能である。   The detection of the label bound through the complex (P) on the liquid-permeable filter is not particularly limited as long as it is a known method. However, when the label is a fluorescent chemical substance or a fluorescent protein, a specific wavelength is detected. It is possible to measure the amount of fluorescence of a specific wavelength generated when light is irradiated to excite a fluorescent chemical substance or a fluorescent protein and converted to a ground state. Examples of the fluorescent chemical substance used in these include FITC, FAM, TAMRA, Texas Red, VIC, Cy3, Cy5, HEX, and the like, and examples of the fluorescent protein include GFP, YFP, and RFP. When the label is an enzyme, it can be measured by detecting the reaction product produced by adding the enzyme substrate. The combinations of enzyme and substrate used in these include alkaline phosphatase and paranitrophenyl phosphate, CDP-star, AMPPD, DDAOphosphate, BCIP-NBT, etc., peroxidase and TMB, Lumi-Light (Roche Diagnostics) ), Combinations of SAT-1 (Dojindo), combinations of diaphorase and NTB, various oxidases and substrates, combinations of various dehydrogenases and substrates, etc. It can be used without any problems. When the label is a magnetic substance, measurement can be performed by detecting magnetism. The label can be measured by detecting a conductive substance and a current value.

試料中に含まれる核酸の配列が野生型である場合、野生型配列を特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）によって増幅された核酸断片と第二のリガンドが結合したプローブ（Ｄ）を含む複合体（Ｐ）が形成され、該複合体（Ｐ）を通液性フィルター上で検出することによって、容易に野生型配列であると判定することが可能である。試料中に含まれる核酸配列が変異型である場合も同様に、変異型配列を特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）によって増幅された核酸断片と第二のリガンドが結合したプローブ（Ｄ）を含む複合体（Ｐ）を検出することが可能である。   When the sequence of the nucleic acid contained in the sample is a wild type, a probe (D) in which a nucleic acid fragment amplified by an oligonucleotide primer (A) capable of specifically amplifying the wild type sequence and a second ligand is bound. It is possible to easily determine that it is a wild type sequence by forming a complex (P) containing it and detecting the complex (P) on a liquid filter. Similarly, when the nucleic acid sequence contained in the sample is a mutant type, a probe (D) in which the nucleic acid fragment amplified by the oligonucleotide primer (A) capable of specifically amplifying the mutant sequence and the second ligand are combined (D ) -Containing complex (P) can be detected.

例えば、一つの試料を二つに分け、一方は野生型配列を特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）を用いて核酸増幅を行い、他方は変異型配列を特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅プライマー（Ａ）を行い、それぞれ増幅された核酸断片と第二のリガンドが結合したプローブ（Ｄ）を含む複合体（Ｐ）を検出することにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。   For example, one sample is divided into two, one performs nucleic acid amplification using an oligonucleotide primer (A) capable of specifically amplifying the wild type sequence, and the other is an oligo capable of specifically amplifying the mutant type sequence. A nucleic acid amplification primer (A) is performed using nucleotides, and a complex (P) containing a probe (D) in which each amplified nucleic acid fragment and a second ligand are bound is detected. You can clearly see if it is a variant or a variant.

特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、これら方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型と変異型の両方で検出される。   In particular, humans and other higher organisms have one gene each derived from a father and one from a mother, but according to these methods, whether a sample gene is a wild-type homolog or not. It is also possible to distinguish between mutant homozygous or both heterozygous. That is, in the case of heterogeneity, both wild type and mutant types are detected because both wild type genes and mutant genes exist.

キット
本発明において、少なくとも以下の（１）〜（５）を含むことを特徴とする塩基判定用キットである。
（１）第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）、
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)、
（３）第二のリガンドが結合しておりかつ該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）、
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質、
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相。 Kit In this invention, it is a kit for base determination characterized by including at least the following (1)-(5).
(1) at least one base determination oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and which includes the base site (X) to be determined;
(2) at least one oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A),
(3) at least one kind of detection oligonucleotide probe (D) to which a second ligand is bound and which is complementary to a part of the extension product of the primer (A),
(4) at least one physiologically active substance capable of binding to the second ligand and labeled;
(5) A solid phase to which a capture agent for the first ligand is bound.

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.

実施例１
Cytochrome P450 2C19（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の塩基多型 （６３６Ｇ→Ａ）の検出
（１）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の６３６番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼した。
オリゴ１がセンス鎖でありオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)であり、アンチセンス鎖のオリゴ２またはオリゴ３と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ２は野生型増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）であり、オリゴ３は変異型増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）である。また、オリゴ４は検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）である。オリゴ２、３は５’末端をビオチンにより標識され、オリゴ４は３’末端をＦＩＴＣにより標識されている。オリゴ４の３’末端をＦＩＴＣにより標識することで、オリゴ４からの伸長反応を抑制している。 Example 1
Detection of nucleotide polymorphism (636G → A) of Cytochrome P450 2C19 (CYP2C19) gene (1) Synthesis of oligonucleotide to detect 636th polymorphism of CYP2C19 gene By the method, oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 (hereinafter referred to as oligos 1 to 4) were synthesized. The synthesis was performed according to the manual, and the deprotection of each oligonucleotide was carried out overnight at 55 ° C. with ammonia water. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer OPC column. Alternatively, DNA commissioned companies (Nippon Bioservice, Sigma-Aldrich Japan, Operon Biotechnology, etc.) were requested.
Oligo 1 is the sense strand and oligonucleotide primer (B), and is used as an oligonucleotide for the amplification reaction in combination with oligo 2 or oligo 3 of the antisense strand. Oligo 2 is a wild-type amplification oligonucleotide primer (A), and oligo 3 is a mutation-type amplification oligonucleotide primer (A). Oligo 4 is a detection oligonucleotide probe (D). Oligos 2 and 3 are labeled with biotin at the 5 ′ end, and oligo 4 is labeled with FITC at the 3 ′ end. By labeling the 3 ′ end of oligo 4 with FITC, the extension reaction from oligo 4 is suppressed.

（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子多型の解析
ＰＣＲ法による増幅反応ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の塩基多型 （６３６Ｇ→Ａ）を解析した。 (2) Analysis of CYP2C19 gene polymorphism by PCR method Amplification reaction by PCR method Using a DNA solution extracted from human leukocytes by phenol-chloroform method as a sample, the following reagents were added, and human CYP2C19 gene was The nucleotide polymorphism (636G → A) was analyzed.

試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ２またはオリゴ３（５’末端をビオチンにより標識） ５ｐｍｏｌ、
オリゴ４（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ １．５μｌ、
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．３Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ Reagents A 25 μl solution containing the following reagents was prepared.
Taq DNA polymerase reaction solution Oligo 1 5 pmol,
Oligo 2 or oligo 3 (5 ′ end labeled with biotin) 5 pmol,
Oligo 4 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
X10 buffer 2.5 μl,
2.5 μl of 2 mM dNTP,
1.5 μl of 25 mM MgCl ₂ ,
Taq DNA polymerase 1.3U,
Extracted DNA solution 100ng

増幅条件
９５℃・５分
９５℃・３０秒、
６０℃・３０秒、
７２℃・３０秒（３５サイクル）
９８℃・３分、
６５℃・１分、
５５℃・１分、
４５℃・１分、
３５℃・１分、
２５℃・１５分。 Amplification conditions 95 ° C, 5 minutes 95 ° C, 30 seconds,
60 ° C for 30 seconds,
72 ° C, 30 seconds (35 cycles)
98 ℃, 3 minutes,
65 ° C for 1 minute,
55 ° C for 1 minute,
45 ° C for 1 minute,
35 ° C for 1 minute,
25 ° C for 15 minutes.

（３）通液性フィルターを用いた検出
増幅反応液１５μｌをＰＯＤ標識抗ＦＩＴＣ抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ製）の溶液３０μｌに加えて、室温にて５分間反応させた。これによって、増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片に結合したＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドにＰＯＤ標識抗ＦＩＴＣ抗体が結合する。この反応液をアビジンの結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上に増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片が捕捉される。次に、上部より洗浄液およびＰＯＤ基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を目視によって確認した。表１に、試料Ｎｏ．１〜７で示すサンプルおよび試料なしの場合について、明らかに発色を確認できたものを「＋」、明らかに発色が見られなかったものを「−」として示す。 (3) Detection using liquid-permeable filter 15 μl of the amplification reaction solution was added to 30 μl of a solution of POD-labeled anti-FITC antibody (manufactured by DAKO Cytomation) and reacted at room temperature for 5 minutes. As a result, the POD-labeled anti-FITC antibody binds to the FITC-labeled oligonucleotide bound to the amplified CYP2C19 gene fragment. When this reaction solution is added to a liquid-permeable filter to which avidin is bound, the amplified CYP2C19 gene fragment is captured on the filter. Next, after sequentially adding a cleaning solution and a POD substrate solution from the top, color development on the filter surface was visually confirmed. In Table 1, Sample No. In the case of the samples 1 to 7 and the case without the sample, “+” indicates that the color was clearly confirmed, and “−” indicates that the color was not clearly observed.

上記のように、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。   As described above, the genotype could be clearly determined easily and quickly.

本発明により、試料核酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出が可能となり、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせず、迅速で容易に再現性の良い結果が得られることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。 According to the present invention, it is possible to clearly and easily detect a base polymorphism in a sample nucleic acid, and it is possible to quickly and easily obtain a reproducible result without requiring a complicated operation as in the conventional method. Therefore, it is expected to greatly contribute to the industry.

Claims (18)

試料溶液中に含まれる標的核酸配列上の塩基部位を判定する方法において、少なくとも以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする塩基判定方法。
（１）第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)と、を用いて標的核酸配列から増幅反応を行う第一工程、
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉する第三工程、
（４）該複合体（Ｐ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する第四工程。 A method for determining a base site on a target nucleic acid sequence contained in a sample solution, comprising at least the following steps (1) to (4):
(1) Complementary to at least one base determination oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and containing the base site (X) to be determined, and a part of the extension product of the primer (A) A first step of performing an amplification reaction from the target nucleic acid sequence using at least one kind of oligonucleotide primer (B),
(2) For detection of at least one kind of primer (A) extension product that can be obtained in the first step and the second ligand bound and complementary to part of the primer (A) extension product A second step of hybridizing the oligonucleotide probe (D) to form a complex (P);
(3) Capture at least one type of physiologically active substance capable of binding to the second ligand and labeled on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (P). Three steps,
(4) A fourth step of detecting the label of the physiologically active substance captured on the solid phase via the complex (P). 第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする請求項１に記載の塩基判定方法。 The base determination method according to claim 1, wherein an oligonucleotide probe (D) is present in the first step. 第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の塩基判定方法。 The base determination method according to claim 1 or 2, wherein the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme. 第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の塩基判定方法。 The base determination method according to claim 1 or 2, wherein the second ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme. 工程（４）の前に、固相上に捕捉されなかった未反応の第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる生理活性物質を除去する工程を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の塩基判定方法。 The step (4) includes a step of removing a physiologically active substance that can bind to and is labeled with an unreacted second ligand that has not been captured on the solid phase. The base determination method according to any one of the above. 固相が通液性フィルターであり、固相上に捕捉されなかった未反応の第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる生理活性物質が、該通液性フィルターを通過することを特徴とする請求項５に記載の塩基判定方法。 The solid phase is a liquid-permeable filter, and a physiologically active substance that can bind to and is labeled with an unreacted second ligand not captured on the solid phase passes through the liquid-permeable filter. The base determination method according to claim 5. 第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の塩基判定方法。   The capture agent for the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance and avidin. Base determination method. 生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の塩基判定方法。   The base determination method according to claim 1, wherein the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance, and avidin. . 生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の塩基判定方法。   The label bound to the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance and a conductive substance. Item 9. The base determination method according to any one of Items 1 to 8. プライマー（Ａ）の３’末端より２番目の塩基が判定したい塩基部位（Ｘ）の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の塩基判定方法。 The base according to any one of claims 1 to 9, wherein the second base from the 3 'end of the primer (A) is the same as or a complementary base to the expected base of the base site (X) to be determined. The base determination method as described. プライマー（Ａ）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の塩基判定方法。 11. The base according to any one of claims 1 to 10, wherein at least one base from 3 to 5 from the 3 'end of the primer (A) is substituted with a base that is not complementary or homologous to the nucleic acid sequence used as a template. The base determination method according to. 少なくとも以下の（１）〜（５）を含むことを特徴とする塩基判定用キット。
（１）第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）を含む少なくとも１種類の塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）、
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)、
（３）第二のリガンドが結合しておりかつ該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）、
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質、
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相。 A kit for base determination, comprising at least the following (1) to (5).
(1) at least one base determination oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and which includes the base site (X) to be determined;
(2) at least one oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A),
(3) at least one kind of detection oligonucleotide probe (D) to which a second ligand is bound and which is complementary to a part of the extension product of the primer (A),
(4) at least one physiologically active substance capable of binding to the second ligand and labeled;
(5) A solid phase to which a capture agent for the first ligand is bound. 固相が通液性フィルターであることを特徴とする請求項１２に記載の塩基判定用キット。 The base determination kit according to claim 12, wherein the solid phase is a liquid-permeable filter. 第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の塩基判定用キット。 The base determination kit according to claim 12 or 13, wherein the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme. 第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の塩基判定用キット。 14. The base determination kit according to claim 12 or 13, wherein the second ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme. 第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載の塩基判定用キット。   The capture agent for the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance, and avidin, according to any one of claims 12 to 15. Kit for base determination. 生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の塩基判定用キット。   The base determination according to any one of claims 12 to 16, wherein the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of antibodies, oligonucleotides, receptors, nucleic acid-specific binding substances and avidin. kit. 生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれかに記載の塩基判定用キット。   The label bound to the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance and a conductive substance. Item 18. A kit for base determination according to any one of Items 12 to 17.