JPH10237081A - Chromanol derivative, its production and antioxidant - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To produce a new chromanol derivative comprising the chromanol derivative obtained by allowing a phospholipase C to act on a phosphatidylchromanol derivative, capable of inhibiting the formation of a lipid peroxide, and used as an antioxidant, etc., for a food, a cosmetic and a drug. SOLUTION: This chromanol derivative is the new one of formula I [(n) is an integer of 1-5; X is a monovalent cation], e.g. 2-(2',5',7',8'-tetramethyl1-6'- hydroxychroman) ethyl; phosphate, having activities inhibiting the formation of a lipid peroxide. The chromanol derivative is useful; as an antioxidant, etc., used for a food, a cosmetic, a drug, etc., because having excellent antioxidative activities. The compound is obtained by allowing phospholipase C to act on a phosphatidylchromanyol derivative of formula II (R1 and R2 are each H or a 2-24C saturated or unsaturated fatty acid residue).

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なクロマノー
ル誘導体、その製造方法並びにこのものを有効成分とす
る抗酸化剤に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel chromanol derivative, a method for producing the same, and an antioxidant containing the same as an active ingredient.

【０００２】[0002]

【従来の技術】過酸化脂質の生成は食品の品質劣化原因
として古くから知られていたが、最近では生体において
も過酸化脂質の生成が種々の障害をもたらす原因として
注目されている。生体において活性酸素やフリーラジカ
ルにより生体に障害が生じ、それが種々の疾病をはじめ
発癌、さらには老化にもつながることがしだいに明らか
になるにつれ、フリーラジカルによる生体の障害を防御
することが広い分野から注目されている。このような観
点から、過酸化脂質の生成を抑制する抗酸化剤の開発
が、食品、化粧品、医薬品などの分野で盛んに行われて
いる。2. Description of the Related Art The production of lipid peroxides has long been known as a cause of food quality degradation, but recently, the production of lipid peroxides has also attracted attention in living organisms as a cause of various obstacles. As active organisms and free radicals cause damage to living organisms in the living body, which lead to various diseases, carcinogenesis, and even aging, it is increasingly clear that free radicals can protect the living body from damage. Attention has been drawn from the field. From such a viewpoint, the development of antioxidants that suppress the production of lipid peroxide has been actively performed in the fields of food, cosmetics, pharmaceuticals, and the like.

【０００３】一方、ビタミンＥ（α−トコフェロール）
は、脂溶性のラジカル捕捉型抗酸化物質として、極めて
有効なものである。その抗酸化作用は、クロマン環上６
位のＯＨ基の水素の反応性が極めて高く、速やかにラジ
カルを捕捉して安定化することによる。このことから、
ビタミンＥは、天然のすぐれた抗酸化剤として広く食
品、化粧品、医薬品などに用いられているが、その抗酸
化活性は必ずしも十分なものではない。例えば、「フリ
ー・ラジカル・リサーチ」（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２４巻，第１２３頁（１９９
６）に記載されているとおり、ヒト低比重リポタンパク
質の脂質過酸化反応に対するビタミンＥの抑制活性は低
く、さらには、「アーカイブズ・インターナショナル・
ファーマコダイナミクス」（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉ
ｃｓ），２７２巻，第２８３頁（１９８４）に記載され
ているとおり、ビタミンＥは、ラット脳ホモジネートの
自動酸化反応も十分に抑制することはできない。また、
ビタミンＥの水溶性誘導体である６−ヒドロキシ−２，
５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸
（以下、単にトロロックスという）もラット脳ホモジネ
ートの自動酸化反応を完全に抑制することができないこ
とが「ビタミンＥ研究の進歩（ＶＩ）」，第３８頁（１
９９５，共立出版）に記載されている。このように、ビ
タミンＥやその誘導体の抗酸化活性は必ずしも満足すべ
きものではなく、より優れた抗酸化剤の開発が望まれて
いる。On the other hand, vitamin E (α-tocopherol)
Is extremely effective as a fat-soluble radical-trapping antioxidant. Its antioxidant action is 6 on the chroman ring.
This is because the reactivity of hydrogen at the OH group is extremely high, and radicals are quickly captured and stabilized. From this,
Vitamin E is widely used as a natural excellent antioxidant in foods, cosmetics, pharmaceuticals, and the like, but its antioxidant activity is not always sufficient. For example, "Free Radical Research" (Free Radical Research)
Research), vol. 24, p. 123 (199)
As described in 6), the inhibitory activity of vitamin E on the lipid peroxidation reaction of human low-density lipoprotein is low.
Pharmacodynamics ”(Archives int
international Pharmacodynami
cs), vol. 272, p. 283 (1984), vitamin E cannot sufficiently suppress the autoxidation reaction of rat brain homogenate. Also,
6-hydroxy-2, a water-soluble derivative of vitamin E,
5,7,8-Tetramethylchroman-2-carboxylic acid (hereinafter simply referred to as trolox) cannot completely suppress the autoxidation reaction of rat brain homogenate. , Page 38 (1
995, Kyoritsu Shuppan). Thus, the antioxidant activity of vitamin E and its derivatives is not always satisfactory, and the development of a better antioxidant is desired.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の抗酸
化剤よりも顕著にすぐれた抗酸化作用を有する新規化合
物及びその製造方法並びにその化合物を有効成分とする
抗酸化剤を提供することを目的としてなされたものであ
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a novel compound having an antioxidant effect which is remarkably superior to conventional antioxidants, a process for producing the same, and an antioxidant containing the compound as an active ingredient. It was made for the purpose of.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、本発明者の一
人が抗酸化剤、乳化剤として先に特開平６−２２８１７
０公報で開示したホスファチジルクロマノール誘導体
に、ホスフォリパーゼＣを作用させて得られた新規なク
ロマノール誘導体が、極めてすぐれた抗酸化作用を有す
ることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成
するに至った。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted intensive studies in order to achieve the above object, and as a result, one of the present inventors has previously disclosed as an antioxidant and an emulsifier in JP-A-6-22817.
The present inventors have found that a novel chromanol derivative obtained by allowing phospholipase C to act on the phosphatidyl chromanol derivative disclosed in Japanese Patent Publication No. I came to.

【０００６】すなわち、本発明は、（１）一般式（Ｉ）That is, the present invention relates to (1) a compound represented by the general formula (I):

【化３】 （ただし式中のｎは１〜５の整数であり、またＸは１価
の陽イオンである）で表わされるクロマノール誘導体、
（２）一般式（ＩＩ）Embedded image (Where n is an integer of 1 to 5, and X is a monovalent cation)
(2) General formula (II)

【化４】 （式中のＲ₁、Ｒ₂は水素原子又は炭素数２〜２４の飽和
若しくは不飽和脂肪酸残基であり、それぞれ同一であっ
てもよいし、異なっていてもよく、またｎは１〜５の整
数、Ｘは１価の陽イオンである）で表わされるホスファ
チジルクロマノール誘導体に、ホスフォリパーゼＣを作
用させて得ることを特徴とする、前記（１）に記載のク
ロマノール誘導体の製造方法、（３）前記（１）記載の
クロマノール誘導体の少なくとも１種を有効成分とする
ことを特徴とする抗酸化剤、である。以下、本発明につ
いて詳細に説明する。Embedded image (Wherein R ₁ and R ₂ are a hydrogen atom or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 2 to 24 carbon atoms, which may be the same or different, and n is 1 to 5 Wherein X is a monovalent cation), which is obtained by reacting phospholipase C with a phosphatidylchromanol derivative represented by the formula (1): (3) An antioxidant characterized by comprising at least one of the chromanol derivatives according to (1) as an active ingredient. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】先ず、本発明の新規なクロマノー
ル誘導体（以下、本発明誘導体ということがある）は、
クロマン環上２位にアルキル基を介してリン酸が結合し
た、前記一般式（Ｉ）で表わされる新規なクロマノール
誘導体である。前記一般式（Ｉ）において、ｎは１〜５
の整数であり、本発明誘導体の製造原料である後述する
ホスファチジルクロマノール誘導体の入手が容易な点か
ら、好ましくはｎが１〜２の整数であり、またＸは１価
の陽イオンであって、例えば水素原子、カリウム、ナト
リウムなどのアルカリ金属イオン、アンモニア、トリエ
タノールアミンなどの有機アミン、リジン、アルギニン
などの塩基性アミノ酸などが挙げられる。そして、本発
明誘導体の具体例としては、前記一般式（Ｉ）におい
て、ｎ＝１、Ｘ＝Ｈである２−（２’，５’，７’，
８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシクロマン）メチ
ル ホスフェート、ｎ＝２、Ｘ＝Ｈである２−（２’，
５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシク
ロマン）エチルホスフェート、ｎ＝３、Ｘ＝Ｈである２
−（２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒ
ドロキシクロマン）プロピル ホスフェート、ｎ＝４、
Ｘ＝Ｈである２−（２’，５’，７’，８’−テトラメ
チル−６’−ヒドロキシクロマン）ブチル ホスフェー
ト、ｎ＝５、Ｘ＝Ｈである２−（２’，５’，７’，
８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシクロマン）ペン
チル ホスフェートなどを挙げられる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION First, a novel chromanol derivative of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the derivative of the present invention)
A novel chromanol derivative represented by the general formula (I), wherein phosphoric acid is bonded to the 2-position on the chroman ring via an alkyl group. In the general formula (I), n is 1 to 5
Is preferably an integer of 1-2, and X is a monovalent cation from the viewpoint of easily obtaining a phosphatidylchromanol derivative described below, which is a raw material for producing the derivative of the present invention. Examples thereof include a hydrogen atom, alkali metal ions such as potassium and sodium, ammonia, organic amines such as triethanolamine, and basic amino acids such as lysine and arginine. As specific examples of the derivative of the present invention, in the general formula (I), 2- (2 ′, 5 ′, 7 ′,
8'-tetramethyl-6'-hydroxychroman) methyl phosphate, 2- (2 ', n = 2, X = H
5 ', 7', 8'-tetramethyl-6'-hydroxychroman) ethyl phosphate, n = 3, X = H 2
-(2 ', 5', 7 ', 8'-tetramethyl-6'-hydroxychroman) propyl phosphate, n = 4,
2- (2 ', 5', 7 ', 8'-tetramethyl-6'-hydroxychroman) butyl phosphate where X = H, n = 5, 2- (2', 5 ', X = H 7 ',
8'-tetramethyl-6'-hydroxychroman) pentyl phosphate.

【０００８】次に、本発明誘導体の製造方法としては、
例えば化学的方法、酵素的方法などのいずれでもよい
が、特に本発明者の一人が抗酸化剤、乳化剤として先に
特開平６−２２８１７０公報で開示した、ホスファチジ
ルクロマノール誘導体にホスホリパーゼＣを作用させる
酵素的方法が好ましい。すなわち、一般式（ＩＩ）で表
わされるホスファチジルクロマノール誘導体に、ホスホ
リパーゼＣを作用させて酵素反応を行えば、温和な条件
下で、しかも高い変換率で本発明の目的物質を簡便に製
造することができる。Next, the method for producing the derivative of the present invention includes:
For example, any of a chemical method and an enzymatic method may be used. In particular, one of the present inventors makes phospholipase C act on a phosphatidylchromanol derivative disclosed in JP-A-6-228170 as an antioxidant and an emulsifier. Enzymatic methods are preferred. That is, if the enzymatic reaction is carried out by allowing phospholipase C to act on the phosphatidylchromanol derivative represented by the general formula (II), the target substance of the present invention can be easily produced under mild conditions and at a high conversion rate. Can be.

【０００９】本発明誘導体の製造に用いるホスファチジ
ルクロマノール誘導体は、前記一般式（ＩＩ）におい
て、Ｒ₁、Ｒ₂は水素原子、又は入手が容易な炭素数２〜
２４の飽和若しくは不飽和脂肪酸残基であり、それらは
それぞれ同一であってもよいし、また互いに異なってい
てもよく、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、パルミ
トオレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール
酸、リノレン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、
ドコサヘキサエン酸などの炭素数１０〜２２の脂肪酸残
基が好ましい。さらにまた、前記一般式（ＩＩ）におい
て、Ｘは１価の陽イオンであって、例えば水素原子、カ
リウム、ナトリウムなどのアルカリ金属イオン、アンモ
ニア、トリエタノールアミンなどの有機アミン、リジ
ン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸などが挙げられ
る。また、ｎは１〜５、好ましくは入手のし易さから１
〜２の整数である。The phosphatidyl chromanol derivative used in the production of the derivative of the present invention is a compound represented by the formula (II), wherein R ₁ and R ₂ are each a hydrogen atom or an easily available carbon number of 2 to 2.
24 saturated or unsaturated fatty acid residues, which may be the same or different from each other, for example, myristic acid, palmitic acid, palmitooleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid Acid, linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid,
A fatty acid residue having 10 to 22 carbon atoms such as docosahexaenoic acid is preferred. Further, in the general formula (II), X is a monovalent cation, for example, a hydrogen atom, an alkali metal ion such as potassium or sodium, an organic amine such as ammonia or triethanolamine, a lysine, an arginine or the like. And basic amino acids. Also, n is 1 to 5, preferably 1 due to the availability.
整数 2.

【００１０】そして、本発明の製造に用いられるホスフ
ァチジルクロマノール誘導体の具体例としては、ｎが１
のものとして、例えば次の様なものが例示される。な
お、以下の例示化合物名において、「−ＧＰＭＣ」は
「−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメ
チル−２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−
ヒドロキシ−クロマン」を意味する。すなわち、１，２
−ジラウロリル−ＧＰＭＣ、１，２−ジミリストイル−
ＧＰＭＣ、１，２−ジパルミトイル−ＧＰＭＣ、１，２
−ジステアロイル−ＧＰＭＣ、１，２−ジアラキドニル
−ＧＰＭＣ、１−ミリストイル−２−パルミトイル−Ｇ
ＰＭＣ、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ＧＰＭ
Ｃ、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ＧＰＭＣ、
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ＧＰＭＣ、１−
ステアロイル−２−ミリストイル−ＧＰＭＣ、１−ステ
アロイル−２−パルミトイル−ＧＰＭＣ、及びこれらの
塩などである。また、ｎが２のものとしては、前記の各
例示化合物名の「ＧＰＭＣ」を、「−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチル−２’，５’，
７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマ
ン」（以下、「−ＧＰＥＣ」と略す）と置き換えた化合
物が具体例として挙げられる。[0010] As a specific example of the phosphatidylchromanol derivative used in the production of the present invention, n is 1
For example, the following are exemplified. In the following exemplified compound names, "-GPMC" is replaced with "-sn-glycero-3-phospho-2'-hydroxymethyl-2 ', 5', 7 ', 8'-tetramethyl-6'-
"Hydroxy-chroman". That is, 1, 2,
-Dilaurolyl-GPMC, 1,2-dimyristoyl-
GPMC, 1,2-dipalmitoyl-GPMC, 1,2
-Distearoyl-GPMC, 1,2-diarachidonyl-GPMC, 1-myristoyl-2-palmitoyl-G
PMC, 1-myristoyl-2-stearoyl-GPM
C, 1-palmitoyl-2-myristoyl-GPMC,
1-palmitoyl-2-stearoyl-GPMC, 1-
Stearoyl-2-myristoyl-GPMC, 1-stearoyl-2-palmitoyl-GPMC, and salts thereof. In the case where n is 2, “GPMC” of each of the above-mentioned exemplified compounds is replaced with “-sn-glycero-
3-phospho-2'-hydroxyethyl-2 ', 5',
A specific example is a compound substituted with "7 ', 8'-tetramethyl-6'-hydroxy-chroman" (hereinafter abbreviated as "-GPEC").

【００１１】前記のホスファチジルクロマノール誘導体
は、化学的方法、酵素的方法などいずれの方法で製造し
たものでも良いが、例えば以下に例示するようなホスホ
リパーゼＤによる酵素的方法（特開平６−２２８１７０
公報参照）を用いることにより、温和な条件で、しかも
高い収率で簡便に合成することができる。先ず、基質と
してリン脂質及び２，５，７，８−テトラメチル−６−
ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−クロマン若しくは
２，５，７，８−テトラメチル−６−ヒドロキシ−２−
ヒドロキシエチル−クロマンを、モル比として１：１〜
１：１０の割合で溶剤に溶解若しくは懸濁させ、これに
ホスホリパーゼＤを０．１〜１００単位／ｍｌ（反応
液）となるように添加し、攪拌しながら、適当な条件下
でホスファチジル基の転移反応（リン酸エステル結合反
応）を行わせて、目的物質を含む反応物を得る。The above-mentioned phosphatidylchromanol derivative may be produced by any method such as a chemical method and an enzymatic method. For example, an enzymatic method using phospholipase D as exemplified below (JP-A-6-228170)
By using the method disclosed in the gazette, the compound can be easily synthesized under mild conditions and with a high yield. First, phospholipid and 2,5,7,8-tetramethyl-6-
Hydroxy-2-hydroxymethyl-chroman or 2,5,7,8-tetramethyl-6-hydroxy-2-
Hydroxyethyl-chroman is used in a molar ratio of 1: 1 to 1
It is dissolved or suspended in a solvent at a ratio of 1:10, and phospholipase D is added thereto at a concentration of 0.1 to 100 units / ml (reaction solution), and while stirring, the phosphatidyl group is added under appropriate conditions. A transfer reaction (phosphate ester bond reaction) is performed to obtain a reactant containing the target substance.

【００１２】前記した酵素反応を実施する際の反応系
は、水系、有機溶媒系あるいはこれらの混合系などのい
ずれでもよい。また、この反応に用いられる有機溶媒と
しては、リン脂質を溶解若しくは懸濁させるもので、酵
素活性を著しく低下させないものであればいずれでもよ
く、例えばｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ジエチルエ
ーテル、クロロホルム、酢酸エチル、アセトニトリル、
ｔｅｒｔ−ブタノール、またはこれらの任意の混合溶媒
などが好適なものとして挙げられるが、特にジエチルエ
ーテル、酢酸エチルが好ましい。また、酵素反応条件
は、ホスホリパーゼＤが作用する条件であれば特に制限
されず、勿論、用いるホスホリパーゼＤの好適作用条件
が採用されるが、通常、例えばｐＨ２〜１０、好ましく
はｐＨ４〜７、温度５〜８０℃、好ましくは１０〜５０
℃で１０分〜１００時間、好ましくは３０分〜６０時間
である。そして、例えばホスホリパーゼＤとして「ホス
ホリパーゼＤ Ｔｙｐｅ ＶＩＩ」（シグマ社製）を用
いたときの酵素反応条件は、ｐＨ３〜８、好ましくはｐ
Ｈ５〜６、温度１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃
で１５分〜４８時間、好ましくは１〜１０時間が適用さ
れる。The reaction system for carrying out the above-mentioned enzyme reaction may be any of an aqueous system, an organic solvent system or a mixture thereof. The organic solvent used for this reaction may be any one that dissolves or suspends the phospholipid and does not significantly reduce the enzyme activity, such as n-hexane, cyclohexane, diethyl ether, chloroform, and acetic acid. Ethyl, acetonitrile,
Suitable examples include tert-butanol and a mixed solvent thereof, and diethyl ether and ethyl acetate are particularly preferable. The enzyme reaction conditions are not particularly limited as long as the conditions allow phospholipase D to act. Of course, suitable conditions for the use of phospholipase D are employed, but usually, for example, pH 2 to 10, preferably pH 4 to 7, and temperature 5 to 80 ° C, preferably 10 to 50
C. for 10 minutes to 100 hours, preferably 30 minutes to 60 hours. For example, the enzyme reaction conditions when “phospholipase D Type VII” (manufactured by Sigma) is used as the phospholipase D are pH 3 to 8, preferably p
H5-6, temperature 10-50 ° C, preferably 20-40 ° C
For 15 minutes to 48 hours, preferably 1 to 10 hours.

【００１３】前記の酵素反応終了後、反応物から本発明
に用いるホスファチジルクロマノール誘導体を精製する
には、その精製法は特に限定されず、適宜の方法が採用
される。その例としては、先ず反応物に、抽出溶媒、例
えばクロロホルム：メタノール混液、ヘキサンなどを加
えて目的物質を抽出し、さらにこの抽出物にクロマトグ
ラフィ、溶媒分画法などの単独又は組合せによる精製法
を施すことにより、高純度の目的物質を得ることができ
る。前記のクロマトグラフィとしては、例えばカラムク
ロマトグラフィ、薄層クロマトグラフィなどが用いられ
る。また、カラムクロマトグラフィを採用する場合に
は、その担体としては疎水性のものであればよく、例え
ばシリカゲルなどが好適である。本発明誘導体の製造に
用いられるホスファチジルクロマノール誘導体の製造方
法の参考例を以下に示す。After completion of the enzymatic reaction, the method for purifying the phosphatidylchromanol derivative used in the present invention from the reaction product is not particularly limited, and an appropriate method is employed. As an example, first, an extraction solvent, for example, a mixed solvent of chloroform: methanol, hexane, etc., is added to the reaction product to extract the target substance, and then the extract is subjected to a single or combination purification method such as chromatography and solvent fractionation. By applying, a high-purity target substance can be obtained. As the above-mentioned chromatography, for example, column chromatography, thin-layer chromatography and the like are used. When column chromatography is employed, the carrier may be any hydrophobic one, and for example, silica gel is suitable. Reference examples of a method for producing a phosphatidylchromanol derivative used for producing the derivative of the present invention are shown below.

【００１４】参考例１ （１，２−ジミリストイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） 市販のジミリストイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン
（シグマ社製）１０ｇと２，５，７，８−テトラメチル
−６−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−クロマン
（株式会社クラレ製）４ｇにジエチルエーテル２００ｍ
ｌを加えて懸濁させ、これにＣａＣｌ₂ ０．０１Ｍを
含む０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）４８００
ｍｌを加えて３７℃に保温したのち、市販のホスホリパ
ーゼＤ（「ホスホリパーゼＤ Ｔｙｐｅ ＶＩＩ」 シ
グマ社製）６０００単位を含む酵素液２００ｍｌを加え
て撹拌しながら３７℃で２時間反応させた。この反応物
につき、高速液体クロマトグラフィにより分析した結
果、目的物質への変換率（用いたリン脂質に対する生成
目的物質の割合）は９５％と高率であった。得られた反
応物をクロロホルム：メタノール（２：１）で抽出処理
したのち、ケイ酸カラムに吸着させ、さらにクロロホル
ム：メタノール（９５：５）で溶出後、減圧乾固して目
的物質７ｇを得た。この物質を薄層クロマトグラフィに
より、シリカゲルのプレート（ＳＩＬＩＣＡ ＧＥＬ
６０、メルク社製、以下同じ）、展開溶媒としてクロロ
ホルム：メタノール＝８０：２０を用いて展開した結
果、塩化第二鉄−バソフェナントロリン試薬による発色
法で赤色を呈し（クロマン環の存在を示す）、かつディ
ットマー試薬による発色法で青色を呈する（リンの存在
を示す）単一のスポット（Ｒｆ＝０．４３）が検出され
た。このことから、同一分子中にリン脂質とクロマン環
を有する物質の生成が確認された。Reference Example 1 (1,2-dimyristoyl-s)
n-glycero-3-phospho-2'-hydroxymethyl-
Production of 2 ′, 5 ′, 7 ′, 8′-Tetramethyl-6′-hydroxy-chroman) 10 g of commercially available dimyristoyl-L-α-phosphatidylcholine (manufactured by Sigma) and 2,5,7,8-tetramer 200 g of diethyl ether was added to 4 g of methyl-6-hydroxy-2-hydroxymethyl-chroman (manufactured by Kuraray Co., Ltd.).
and then suspended therein, and 4800 of 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) containing 0.01 M of CaCl _2.
Then, 200 ml of an enzyme solution containing 6000 units of commercially available phospholipase D ("Phospholipase D Type VII", manufactured by Sigma) was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 2 hours with stirring. The reaction product was analyzed by high performance liquid chromatography, and as a result, the conversion rate to the target substance (the ratio of the target substance to the phospholipid used) was as high as 95%. The obtained reaction product was extracted with chloroform: methanol (2: 1), adsorbed on a silica column, eluted with chloroform: methanol (95: 5), and dried under reduced pressure to obtain 7 g of the target substance. Was. This substance was subjected to thin layer chromatography by silica gel plate (SILICA GEL).
60, manufactured by Merck Ltd .; the same applies hereinafter). As a result of developing using chloroform: methanol = 80: 20 as a developing solvent, the color developing method using a ferric chloride-vasophenanthroline reagent gave a red color (indicating the presence of a chroman ring). And a single spot (indicating the presence of phosphorous) of blue color (Rf = 0.43) was detected by the color development method using the Dittmer reagent. This confirmed the formation of a substance having a phospholipid and a chroman ring in the same molecule.

【００１５】機器分析の結果、ホスホリパーゼＤによる
酵素反応で得られた前記物質は、リン脂質のリン酸と前
記クロマン誘導体のアルコール性水酸基とのリン酸エス
テル結合物（ホスファチジル基の転移反応物）であるこ
とが確認され、そしてこの物質は前記一般式（ＩＩ）に
おいて、Ｒ₁、Ｒ₂が共にミリスチン酸残基で、ｎが１、
ＸがＨである１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−２’，５’，
７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマ
ンであることが確認された。As a result of the instrumental analysis, the substance obtained by the enzymatic reaction with phospholipase D is a phosphoric ester bond (phosphatidyl group transfer reaction) between the phospholipid phosphoric acid and the alcoholic hydroxyl group of the chroman derivative. This substance was identified as having the general formula (II), wherein R ₁ and R ₂ were both myristic acid residues and n was 1,
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-2′-hydroxymethyl-2 ′, 5 ′, wherein X is H,
It was confirmed to be 7 ', 8'-tetramethyl-6'-hydroxy-chroman.

【００１６】参考例２ （１，２−ジミリストイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） ２，５，７，８−テトラメチル−６−ヒドロキシ−２−
ヒドロキシメチル−クロマンの代わりに、２，５，７，
８−テトラメチル−６−ヒドロキシ−２−ヒドロキシエ
チル−クロマン（株式会社クラレ製）４ｇを用いた以外
は参考例１と同様にして目的物質７ｇを得た。なお、精
製前の反応物につき、高速液体クロマトグラフィにより
分析した結果、目的物質への変換率は９５％と高率であ
った。この物質を薄層クロマトグラフィにより、シリカ
ゲルのプレート、展開溶媒としてクロロホルム：メタノ
ール＝８０：２０を用いて展開した結果、塩化第二鉄−
バソフェナントロリン試薬による発色法で赤色を呈し、
かつディットマー試薬による発色法で青色を呈する単一
のスポット（Ｒｆ＝０．４８）が検出された。このこと
から、同一分子中にリン脂質とクロマン環を有する物質
の生成が確認された。Reference Example 2 (1,2-dimyristoyl-s)
n-glycero-3-phospho-2'-hydroxyethyl-
Production of 2 ', 5', 7 ', 8'-tetramethyl-6'-hydroxy-chroman) 2,5,7,8-tetramethyl-6-hydroxy-2-
Instead of hydroxymethyl-chroman, 2,5,7,
7 g of the target substance was obtained in the same manner as in Reference Example 1 except that 4 g of 8-tetramethyl-6-hydroxy-2-hydroxyethyl-chroman (manufactured by Kuraray Co., Ltd.) was used. The reaction product before purification was analyzed by high performance liquid chromatography, and as a result, the conversion to the target substance was as high as 95%. The substance was developed by thin-layer chromatography using a silica gel plate and chloroform: methanol = 80: 20 as a developing solvent.
Shows red color by the coloration method using bathophenanthroline reagent,
In addition, a single spot (Rf = 0.48) exhibiting blue was detected by the color development method using the Dittmer reagent. This confirmed the formation of a substance having a phospholipid and a chroman ring in the same molecule.

【００１７】機器分析の結果、ホスホリパーゼＤによる
酵素反応で得られた前記物質は、リン脂質のリン酸と前
記クロマン誘導体のアルコール性水酸基とのリン酸エス
テル結合物（ホスファチジル基の転移反応物）であるこ
とが確認され、そしてこの物質は前記一般式（ＩＩ）に
おいて、Ｒ₁、Ｒ₂が共にミリスチン酸残基で、ｎが２、
ＸがＨである１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホ−２’−ヒドロキシエチル−２’，５’，
７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマ
ンであることが確認された。As a result of the instrumental analysis, the substance obtained by the enzymatic reaction with phospholipase D is a phosphate ester bond (phosphatidyl group transfer reaction product) between the phospholipid phosphoric acid and the alcoholic hydroxyl group of the chroman derivative. This substance was identified as having the general formula (II) wherein R ₁ and R ₂ were both myristic acid residues and n was 2,
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-2'-hydroxyethyl-2 ', 5', wherein X is H,
It was confirmed to be 7 ', 8'-tetramethyl-6'-hydroxy-chroman.

【００１８】参考例３ （１，２−ジパルミトイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−
２’，５’，７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロ
キシ−クロマンの製造） ジミリストイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン（シグ
マ社製）の代わりに、市販のジパルミトイル−Ｌ−α−
ホスファチジルコリン（シグマ社製）１０ｇを用いた以
外は参考例１と同様にして目的物質６ｇを得た。なお、
精製前の反応物につき、高速液体クロマトグラフィによ
り分析した結果、目的物質への変換率は９５％と高率で
あった。この物質を薄層クロマトグラフィにより、シリ
カゲルのプレート、展開溶媒としてクロロホルム：メタ
ノール＝８０：２０を用いて展開した結果、塩化第二鉄
−バソフェナントロリン試薬による発色法で赤色を呈
し、かつディットマー試薬による発色法で青色を呈する
単一のスポット（Ｒｆ＝０．４３）が検出された。この
ことから、同一分子中にリン脂質とクロマン環を有する
物質の生成が確認された。Reference Example 3 (1,2-dipalmitoyl-s)
n-glycero-3-phospho-2'-hydroxymethyl-
Production of 2 ′, 5 ′, 7 ′, 8′-Tetramethyl-6′-hydroxy-chroman) Instead of dimyristoyl-L-α-phosphatidylcholine (manufactured by Sigma), commercially available dipalmitoyl-L-α-
6 g of the target substance was obtained in the same manner as in Reference Example 1, except that 10 g of phosphatidylcholine (manufactured by Sigma) was used. In addition,
As a result of analyzing the reaction product before purification by high performance liquid chromatography, the conversion rate to the target substance was as high as 95%. The substance was developed by thin-layer chromatography using a silica gel plate and chloroform: methanol = 80: 20 as a developing solvent. As a result, the substance developed a red color using a ferric chloride-vasophenanthroline reagent and developed a color using a Dittmer reagent. A single spot with a blue color (Rf = 0.43) was detected by the method. This confirmed the formation of a substance having a phospholipid and a chroman ring in the same molecule.

【００１９】機器分析の結果、ホスホリパーゼＤによる
酵素反応で得られた前記物質は、リン脂質のリン酸と前
記クロマン誘導体のアルコール性水酸基とのリン酸エス
テル結合物（ホスファチジル基の転移反応物）であるこ
とが確認され、そしてこの物質は前記一般式（ＩＩ）に
おいて、Ｒ₁、Ｒ₂が共にパルミチン酸残基で、ｎが１、
ＸがＨである１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホ−２’−ヒドロキシメチル−２’，５’，
７’，８’−テトラメチル−６’−ヒドロキシ−クロマ
ンであることが確認された。As a result of the instrumental analysis, the substance obtained by the enzymatic reaction with phospholipase D is a phosphoric ester bond (phosphatidyl group transfer reaction) between phosphoric acid of phospholipid and alcoholic hydroxyl group of the chroman derivative. It was confirmed that both R ₁ and R ₂ were palmitic acid residues, n was 1,
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-2'-hydroxymethyl-2 ', 5', wherein X is H,
It was confirmed to be 7 ', 8'-tetramethyl-6'-hydroxy-chroman.

【００２０】次に、このようにして得られたホスファチ
ジルクロマノール誘導体から、一般式（Ｉ）で表わされ
る、本発明の目的物質であるクロマノール誘導体を酵素
的に製造する方法について説明する。まず、酵素反応を
実施する際の反応系は水系、有機溶媒系あるいはこれら
の混合系などのいずれでもよい。そして、前記一般式
（ＩＩ）で表わされるホスファチジルクロマノール誘導
体を反応液に溶解若しくは懸濁させ、これにホスホリパ
ーゼＣを０．１〜１００単位／ｍｌ（反応液）となるよ
うに添加し、攪拌しながら、適当な条件下で酵素反応を
行わせて、目的物質を含む反応物を得る。前記のホスホ
リパーゼＣとしては、例えばバチルス・セレウス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）由来のもの（シグマ社
製）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来のもの
（シグマ社製）などが挙げられる。また、この反応に用
いられる有機溶媒としては、リン脂質を溶解若しくは懸
濁させるもので、酵素活性を著しく低下させないもので
あればいずれでもよく、例えばｎ−ヘキサン、シクロヘ
キサン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチ
ル、アセトニトリル、ｔｅｒｔ−ブタノール、またはこ
れらの任意の混合溶媒などが好適なものとして挙げられ
る。そして、酵素反応条件としてはホスホリパーゼＣが
作用する条件であれば特に制限されず、勿論、用いるホ
スホリパーゼＣの好適作用条件が採用されるが、通常、
例えばｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ５〜８、温度５〜
８０℃、好ましくは１０〜５０℃で１０分〜１００時
間、好ましくは３０分〜６０時間である。そして、例え
ばホスホリパーゼＣとして、「ホスホリパーゼＣ Ｔｙ
ｐｅ ＩＩＩ」（シグマ社製）を用いたときの酵素反応
条件は、ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ７〜８、温度１０
〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で３０分〜６０時
間、好ましくは１０〜５０時間である。以上のごとくす
ることにより、本発明の新規なクロマノール誘導体を含
む反応物を、温和な条件下で、しかも高い変換率で得る
ことができる。Next, a method for enzymatically producing the chromanol derivative represented by the general formula (I), which is the target substance of the present invention, from the phosphatidyl chromanol derivative thus obtained will be described. First, the reaction system for carrying out the enzymatic reaction may be any of an aqueous system, an organic solvent system, and a mixed system thereof. Then, the phosphatidylchromanol derivative represented by the general formula (II) is dissolved or suspended in the reaction solution, and phospholipase C is added thereto at a concentration of 0.1 to 100 units / ml (reaction solution). Meanwhile, an enzymatic reaction is performed under appropriate conditions to obtain a reaction product containing the target substance. Examples of the phospholipase C include Bacillus cereus (Ba)
C. cereus (manufactured by Sigma), Clostridium perfringens (Clos)
and those derived from Tridium perfringens (Sigma). The organic solvent used for this reaction may be any one that dissolves or suspends the phospholipid and does not significantly reduce the enzyme activity, such as n-hexane, cyclohexane, diethyl ether, chloroform, and acetic acid. Suitable examples include ethyl, acetonitrile, tert-butanol, and a mixed solvent thereof. The enzyme reaction conditions are not particularly limited as long as the conditions allow phospholipase C to act, and of course, preferred conditions for the use of phospholipase C are employed.
For example, pH 2-10, preferably pH 5-8, temperature 5
The temperature is 80 ° C., preferably 10 to 50 ° C., for 10 minutes to 100 hours, preferably 30 minutes to 60 hours. Then, for example, as phospholipase C, “phospholipase C Ty
The enzyme reaction conditions when using “pe III” (manufactured by Sigma) are as follows: pH 4-9, preferably pH 7-8, temperature 10
The temperature is 30 minutes to 60 hours, preferably 10 to 50 hours at -50 ° C, preferably 20-40 ° C. By doing as described above, a reaction product containing the novel chromanol derivative of the present invention can be obtained under mild conditions and at a high conversion.

【００２１】ついで、前記の酵素反応終了後、反応物か
ら本発明の目的物質である新規なクロマノール誘導体を
精製して得るのであるが、その精製法は特に限定され
ず、適宜の方法が採用される。その例としては、先ず抽
出溶媒、例えばクロロホルム：メタノール混液、ヘキサ
ン、酢酸エチル、ジエチルエーテルなどを用いて該目的
物質を抽出し、さらにこの抽出物に、クロマトグラフ
ィ、溶媒分画法などの単独又は組合せによる精製法を施
すことにより、高純度の目的物質を得ることができる。
前記したクロマトグラフィとしては、例えばカラムクロ
マトグラフィ、薄層クロマトグラフィなどが挙げられ
る。After completion of the enzymatic reaction, a novel chromanol derivative, which is the target substance of the present invention, is obtained from the reaction product. The purification method is not particularly limited, and an appropriate method is employed. You. As an example, first, the target substance is extracted using an extraction solvent such as a chloroform: methanol mixture, hexane, ethyl acetate, diethyl ether, and the like, and the extract is further used alone or in combination with chromatography, solvent fractionation, and the like. , A high-purity target substance can be obtained.
Examples of the above-mentioned chromatography include column chromatography and thin-layer chromatography.

【００２２】このようにして得られた本発明誘導体は、
水溶性であって、抗酸化活性が極めて高いという特性を
有している。すなわち、従来知られている脂溶性である
ビタミンＥ、あるいはビタミンＥの水溶性誘導体である
トロロックスの抗酸化活性よりも顕著にすぐれたもので
ある。また、本発明誘導体は、クロマン環をもっている
ことにより、様々な活性酸素の消去能も有している。さ
らには、本発明誘導体は、その分子中のリン酸により金
属イオンをキレートして金属イオンが触媒するラジカル
産生反応を抑制する能力をも有している。したがつて、
本発明の目的物質である新規なクロマノール誘導体は、
このものの１種、又はその混合物を有効成分とすれば、
優れた抗酸化剤として極めて有用であり、使用対象、使
用方法などに制限はないが、例えば食品、化粧品、医薬
品などに効果的に使用することができ、殊に水溶性の抗
酸化剤として、例えば動脈硬化、老化、癌など様々な疾
病に対して有効に利用することができる。The derivative of the present invention thus obtained is
It is water-soluble and has the property of having extremely high antioxidant activity. In other words, the antioxidant activity of vitamin E which is fat-soluble or the water-soluble derivative of vitamin E known as Trolox is remarkably superior. In addition, the derivative of the present invention has an ability to scavenge various active oxygens by having a chroman ring. Further, the derivative of the present invention also has the ability to chelate metal ions by phosphoric acid in the molecule and suppress a radical production reaction catalyzed by the metal ions. Therefore,
The novel chromanol derivative which is the target substance of the present invention is:
If one of these or a mixture thereof is the active ingredient,
It is extremely useful as an excellent antioxidant, and there are no particular restrictions on its use, its use, etc., for example, it can be used effectively in foods, cosmetics, pharmaceuticals, etc., especially as a water-soluble antioxidant, For example, it can be effectively used for various diseases such as arteriosclerosis, aging, and cancer.

【００２３】本発明のクロマノール誘導体を用いた抗酸
化剤は、本発明誘導体を有効成分として調製され、この
ときの添加量は、例えば０．００１〜１０％（ｗ／
ｗ）、好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｗ）である。本
発明の抗酸化剤の有効成分としては、本発明誘導体の粗
製物あるいはその精製物のいずれをも用いられ、そのま
まの状態で抗酸化剤とすることもできる。また、本発明
の抗酸化剤の形態としては、本発明誘導体に、適当な溶
剤、例えば水、メタノール、エタノールなどを加えて溶
解又は懸濁させた溶液、さらには常法により賦形剤、例
えば糖類などを添加するか又はしないで乾燥、粉末化な
どして得た固形物など、いずれでもよい。The antioxidant using the chromanol derivative of the present invention is prepared using the derivative of the present invention as an active ingredient, and the amount added at this time is, for example, 0.001 to 10% (w /
w), preferably 0.01 to 1% (w / w). As the active ingredient of the antioxidant of the present invention, either a crude product of the derivative of the present invention or a purified product thereof is used, and the antioxidant can be used as it is. As the form of the antioxidant of the present invention, a solution of the derivative of the present invention dissolved or suspended by adding an appropriate solvent such as water, methanol, ethanol and the like, and further excipients by a conventional method, such as Any of solids obtained by drying, pulverizing or the like with or without the addition of saccharides and the like may be used.

【００２４】[0024]

【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこれらの例によってなんら制限される
ものではない。 実施例１（２−（２’５’７’８’−テトラメチル−
６’−ヒドロシキクロマン）エチル ホスフェートの製
造） 前記参考例２に示した方法により合成した１，２−ジミ
リストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−２’−ヒド
ロキシエチル−２’，５’，７’，８’−テトラメチル
−６’−ヒドロキシ−クロマン（ＤＭ−ＧＰＥＣ）１０
０ｍｇにジエチルエーテル５ｍｌを加えて懸濁させたの
ち、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３０ｍ
ｌ加え、５分間超音波で分散させた。これを３５℃に保
温したのち、市販のホスホリパーゼＣ（「ホスホリパー
ゼＣ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ」 シグマ社製）１０００単位
を含む酵素液１ｍｌを加えて振盪しながら３５℃で４０
時間反応させた。この反応液を１５分間煮沸処理してホ
スホリパーゼＣを失活させた後、３０００ｒｐｍで５分
間遠心分離し、その上清にジエチルエーテル３０ｍｌを
加え抽出処理した。５分間静置後２相に分離した抽出液
の緩衝液相を回収し、そこへさらに３０ｍｌのジエチル
エーテルを加えて同様の抽出操作を３回繰り返した。抽
出後の緩衝液相に酢酸エチル３０ｍｌを加えて混合した
後、酢酸エチル相を回収して減圧式エバポレーターで溶
媒を留去することにより高純度の本発明のクロマノール
誘導体（前記一般式（Ｉ）において、ｎ＝２、Ｘ＝Ｈ）
である、２−（２’５’７’８’−テトラメチル−６’
−ヒドロシキクロマン）エチル ホスフェートを約１０
ｍｇ得た。Next, the present invention will be described in more detail by way of examples, which should not be construed as limiting the present invention. Example 1 (2- (2'5'7'8'-tetramethyl-
Production of 6′-hydroxychroman) ethyl phosphate) 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-2′-hydroxyethyl-2 ′, 5 ′, synthesized by the method described in Reference Example 2 above. 7 ', 8'-Tetramethyl-6'-hydroxy-chroman (DM-GPEC) 10
After 0 mg was suspended by adding 5 ml of diethyl ether, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added for 30 m.
l, and dispersed by ultrasonic waves for 5 minutes. After keeping this at 35 ° C., 1 ml of an enzyme solution containing 1000 units of commercially available phospholipase C (“Phospholipase C Type III” manufactured by Sigma) is added, and the mixture is shaken at 35 ° C. at 40 ° C.
Allowed to react for hours. The reaction solution was boiled for 15 minutes to deactivate phospholipase C, followed by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes, and 30 ml of diethyl ether was added to the supernatant for extraction. After standing for 5 minutes, the buffer phase of the extract separated into two phases was recovered, and 30 ml of diethyl ether was further added thereto, and the same extraction operation was repeated three times. After adding and mixing 30 ml of ethyl acetate to the buffer solution phase after the extraction, the ethyl acetate phase is recovered, and the solvent is distilled off with a reduced-pressure evaporator to obtain a highly pure chromanol derivative of the present invention (the above-mentioned general formula (I)). , N = 2, X = H)
2- (2'5'7'8'-tetramethyl-6 '
-Hydroxychroman) ethyl phosphate to about 10
mg.

【００２５】得られた２−（２’５’７’８’−テトラ
メチル−６’−ヒドロシキクロマン）エチル ホスフェ
ートの元素分析、¹Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲスペクトル及び質
量分析の結果は以下のとおりである。 ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：［ＤＭＳＯ、内部標準ＴＭ
Ｓ］：δ（ｐｐｍ）１．２０（３Ｈ，ｓ），１．７５
（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５７），１．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ
＝７．２１），１．９８（３Ｈ，ｓ），２．０１（３
Ｈ，ｓ），２．０５（ｓ），２．５１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝
６．８４），３．９０−４．０６（２Ｈ，ｍ），７．２
９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ） ＩＲスペクトル（ＫＢｒ ｄｉｓｋ）（ｃｍ^-1）：１４
５７、１２４６、１０２７ 質量スペクトル（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ３３０（分子イオン
ピーク）The results of elemental analysis, ¹ H-NMR, IR spectrum and mass analysis of the obtained 2- (2'5'7'8'-tetramethyl-6'-hydroxycycloman) ethyl phosphate are as follows. It is. ¹ H-NMR spectrum: [DMSO, internal standard TM
S]: δ (ppm) 1.20 (3H, s), 1.75
(2H, t, J = 7.57), 1.86 (2H, t, J)
= 7.21), 1.98 (3H, s), 2.01 (3
H, s), 2.05 (s), 2.51 (2H, t, J =
6.84), 3.90-4.06 (2H, m), 7.2
9 (1H, br.s) IR spectrum (KBr disk) (cm ^-1 ): 14
57, 1246, 1027 Mass spectrum (FAB): m / z 330 (molecular ion peak)

【００２６】実施例２（ラジカル消去活性の測定） 実施例１で得られた本発明のクロマノール誘導体（２−
（２’５’７’８’−テトラメチル−６’−ヒドロシキ
クロマン）エチル ホスフェート）のラジカル消去活性
を、リノール酸メチルのラジカル連鎖反応の抑制により
評価した。すなわち、１１０ｍＭのリノール酸メチル
と、０．１１ｍＭの前記クロマノール誘導体または０．
１１ｍＭのα−トコフェロールを含むかあるいは抗酸化
剤を含まないｎ−ヘキサン：イソプロパノール（７：
３，ｖ／ｖ）溶液１ｍｌを遮光下、３７℃で振盪しなが
ら５分間保温した。ここに同溶媒に溶解した１１０ｍＭ
脂溶性ラジカル発生剤（２，２’−アゾビス（２，４
−ジメチルバレロニトリル））を１００μｌ加え、３７
℃で振盪しながら２４０分間酸化反応を行った。この
間、一定時間経過毎に前記の反応液をサンプリングし、
高速液体クロマトグラフィーでそれぞれのリノール酸メ
チルヒドロペルオキシドの生成量（ｍＭ）を測定した。
その結果を図１に示す。図１からわかるように、本発明
の前記クロマノール誘導体の有機溶媒中におけるラジカ
ル捕捉能は、α−トコフェロールと同等であり、本発明
誘導体がラジカル消去活性を有することがわかる。Example 2 (Measurement of Radical Scavenging Activity) The chromanol derivative of the present invention obtained in Example 1 (2-
The radical scavenging activity of (2'5'7'8'-tetramethyl-6'-hydroxycycloman) ethyl phosphate) was evaluated by inhibiting the radical chain reaction of methyl linoleate. That is, 110 mM methyl linoleate and 0.11 mM of the above chromanol derivative or 0.1 mM.
N-Hexane: isopropanol containing 11 mM α-tocopherol or no antioxidant (7:
(3, v / v) 1 ml of the solution was incubated for 5 minutes while shaking at 37 ° C. in the dark. Here, 110 mM dissolved in the same solvent
Fat-soluble radical generator (2,2′-azobis (2,4
-Dimethylvaleronitrile)) and add
The oxidation reaction was performed for 240 minutes while shaking at ℃. During this time, the reaction solution is sampled every certain time,
The production amount (mM) of each methyl linoleate hydroperoxide was measured by high performance liquid chromatography.
The result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 1, the radical scavenging ability of the chromanol derivative of the present invention in an organic solvent is equivalent to that of α-tocopherol, indicating that the derivative of the present invention has radical scavenging activity.

【００２７】実施例３（抗酸化活性の測定：１） 実施例１で得られた本発明のクロマノール誘導体の抗酸
化活性を、魚油エマルションの鉄−ビタミンＣ誘導性酸
化反応の抑制により評価した。すなわち、１０ｍＭのマ
イワシ油（平均分子量８７０、抗酸化剤無添加）と、
０．０５ｍＭの前記クロマノール誘導体または０．０５
ｍＭのα−トコフェロールを含むかあるいは抗酸化剤を
含まない１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１
０ｍＭの胆汁酸ナトリウムを加えて乳化したエマルショ
ン液１ｍｌを遮光下、３７℃で振盪しながら５分間保温
した。ここに同緩衝液に溶解した２．２ｍＭ硝酸第二鉄
と２２ｍＭビタミンＣをそれぞれ５０μｌずつ添加し
て、３７℃で振盪しながら１８０分間酸化反応を行っ
た。この間、一定時間経過毎に前記反応液をサンプリン
グし、「アナリティカル・バイオケミストリー」（Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），８６
巻、第２７１頁（１９７８年）に記載のＴＢＡ反応法に
よって、それぞれの過酸化脂質の生成量（ＴＢＡＲＳ，
μＭ）を測定した。その結果を図２に示す。図２からわ
かるように、本発明のクロマノール誘導体は、α−トコ
フェロールよりも明らかに強い抗酸化活性を示し、優れ
た抗酸化剤として有用であることがわかる。Example 3 (Measurement of Antioxidant Activity: 1) The antioxidant activity of the chromanol derivative of the present invention obtained in Example 1 was evaluated by suppressing the iron-vitamin C-induced oxidation reaction of a fish oil emulsion. That is, 10 mM sardine oil (average molecular weight 870, no antioxidant added),
0.05 mM of said chromanol derivative or 0.05
1 mM in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing mM α-tocopherol or no antioxidant
One milliliter of the emulsion solution emulsified by adding 0 mM sodium bile acid was kept under shaking at 37 ° C. for 5 minutes under shading. 50 μl of each of 2.2 mM ferric nitrate and 22 mM vitamin C dissolved in the same buffer were added thereto, and an oxidation reaction was performed at 37 ° C. with shaking for 180 minutes. During this time, the reaction solution is sampled every elapse of a certain period of time, and the “analytical biochemistry” (An
alkaline Biochemistry), 86
Volume, page 271 (1978), the amount of each lipid peroxide produced (TBARS,
μM) was measured. The result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 2, the chromanol derivative of the present invention shows a significantly stronger antioxidant activity than α-tocopherol, and is useful as an excellent antioxidant.

【００２８】実施例４（抗酸化活性の測定：２） 実施例１で得られた本発明のクロマノール誘導体の抗酸
化活性を、ヒト低比重リポタンパク（ＬＤＬ）の銅イオ
ン誘導性酸化反応の抑制により評価した。すなわち、ヒ
ト血漿より、「クリニカル・ケミストリー」（Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３８巻，第２０６６頁
（１９９２年）に記載の方法で調製したＬＤＬ０．５ｍ
ｇタンパク／ｍｌと、０．０１ｍＭの前記クロマノール
誘導体または０．０１ｍＭのα−トコフェロールを含む
かあるいは抗酸化剤を含まない生理食塩水１ｍｌを遮光
下、３７℃で振盪しながら５分間保温した。ここに同緩
衝液に溶解した０．２５ｍＭの硫酸銅（ＩＩ）２０μｌ
添加して、３７℃で振盪しながら１８０分間酸化反応を
行った。この間、一定時間経過毎に前記反応液をサンプ
リングし、高速液体クロマトグラフィーでそれぞれのコ
レステロールエステルヒドロペルオキシドの生成量（μ
Ｍ）を測定した。その結果を図３に示す。図３から、本
発明の前記クロマノール誘導体は、α−トコフェロール
よりも明らかに強い抗酸化活性を示し、優れた抗酸化剤
であることがわかる。Example 4 (Measurement of antioxidant activity: 2) The antioxidant activity of the chromanol derivative of the present invention obtained in Example 1 was evaluated by suppressing the copper ion-induced oxidation reaction of human low density lipoprotein (LDL). Was evaluated. That is, "Clinical chemistry" (Clin
LDL 0.5m prepared by the method described in Ichal Chemistry, vol. 38, p. 2066 (1992).
g protein / ml and 1 ml of a physiological saline solution containing 0.01 mM of the above-mentioned chromanol derivative or 0.01 mM α-tocopherol or containing no antioxidant were incubated at 37 ° C. for 5 minutes while shaking under light shielding. 20 μl of 0.25 mM copper (II) sulfate dissolved in the same buffer
After the addition, the reaction was oxidized for 180 minutes while shaking at 37 ° C. During this time, the reaction solution was sampled at regular intervals, and the amount of each cholesterol ester hydroperoxide (μ
M) was measured. The result is shown in FIG. From FIG. 3, it can be seen that the chromanol derivative of the present invention shows a significantly stronger antioxidant activity than α-tocopherol and is an excellent antioxidant.

【００２９】実施例５（抗酸化活性の測定：３） 実施例１で得られた本発明のクロマノール誘導体の抗酸
化活性を、ラット脳ホモジネートの自動酸化反応の抑制
により評価した。すなわち、通常に飼育した７週令の雄
ウィスターラットよりネンブタール麻酔下で摘出した脳
を洗浄後、０．１３５Ｍ ＫＣｌを含む０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を脳１ｇ当り６ｍｌ加えてホ
モジナイザー（ポリトロン社製）でホモジナイズしたの
ち、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を同緩
衝液で５倍に希釈した。この希釈液１ｍｌに、１ｍＭの
前記クロマノール誘導体、１ｍＭのα−トコフェロール
または１ｍＭのトロロックスを含むかあるいは抗酸化剤
を含まないジメチルスルホキシド０．０５ｍｌを加え、
遮光下で３７℃で振盪しながら２４０分間自動酸化反応
を行った。この間、一定時間経過毎に前記反応液をサン
プリングし、「アナリティカル・バイオケミストリー」
（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ），８６巻、第２７１頁（１９７８年）に記載のＴＢ
Ａ反応法で、過酸化脂質の生成量（ＴＢＡＲＳ，μＭ）
を測定した。その結果を図４に示す。図４から、α−ト
コフェロールあるいはトロロックスを加えても試料の酸
化は徐々に進行するのに対し、本発明のクロマノール誘
導体を加えた場合には、試料中の酸化は起こらないこと
がわかる。すなわち、本発明のクロマノール誘導体は、
α−トコフェロールあるいはトロロックスよりも明らか
に強い抗酸化活性を示し、極めて優れた抗酸化剤として
有用であることがわかる。Example 5 (Measurement of antioxidant activity: 3) The antioxidant activity of the chromanol derivative of the present invention obtained in Example 1 was evaluated by inhibiting the autooxidation reaction of rat brain homogenate. That is, after the brain extracted from a 7-week-old male Wistar rat bred normally under Nembutal anesthesia was washed, 6 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.135 M KCl was added per 1 g of brain. After homogenizing with a homogenizer (manufactured by Polytron), the supernatant obtained by centrifugation at 3500 rpm for 10 minutes was diluted 5-fold with the same buffer. To 1 ml of the diluted solution, 0.05 ml of dimethyl sulfoxide containing 1 mM of the chromanol derivative, 1 mM α-tocopherol or 1 mM trolox or containing no antioxidant was added,
The autoxidation reaction was performed for 240 minutes while shaking at 37 ° C under light shielding. During this time, the reaction solution was sampled at regular intervals, and the "analytical biochemistry"
(Analytical Biochemistr
y), vol. 86, p. 271 (1978).
A production amount of lipid peroxide by reaction method (TBARS, μM)
Was measured. FIG. 4 shows the results. FIG. 4 shows that the oxidation of the sample gradually progresses even when α-tocopherol or Trolox is added, whereas no oxidation occurs in the sample when the chromanol derivative of the present invention is added. That is, the chromanol derivative of the present invention is:
It shows clearly stronger antioxidant activity than α-tocopherol or Trolox, indicating that it is useful as an extremely excellent antioxidant.

【００３０】[0030]

【発明の効果】本発明によれば、顕著に優れた抗酸化作
用を有する水溶性の新規なクロマノール誘導体を、温和
な条件下で、高い変換率で効率よく簡便に製造すること
ができる。また、そのクロマノール誘導体の少なくとも
１種を有効成分として含有させた抗酸化剤は、優れた抗
酸化作用を有することから、食品、化粧品、医薬品など
に用いることができ、極めて有用である。According to the present invention, a novel water-soluble chromanol derivative having a remarkably excellent antioxidant action can be efficiently and easily produced at a high conversion rate under mild conditions. Further, an antioxidant containing at least one of the chromanol derivatives as an active ingredient has excellent antioxidant activity, and thus can be used in foods, cosmetics, pharmaceuticals, and the like, and is extremely useful.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 実施例２における、リノール酸メチルの酸化
反応に対する各抗酸化剤の抑制効果を示すグラフ。FIG. 1 is a graph showing the inhibitory effect of each antioxidant on the oxidation reaction of methyl linoleate in Example 2.

【図２】 実施例３における、魚油エマルションの酸化
反応に対する各抗酸化剤の抑制効果を示すグラフ。FIG. 2 is a graph showing the inhibitory effect of each antioxidant on the oxidation reaction of a fish oil emulsion in Example 3.

【図３】 実施例４における、ヒト−ＬＤＬの酸化反応
に対する各抗酸化剤の抑制効果を示すグラフ。FIG. 3 is a graph showing the inhibitory effect of each antioxidant on the oxidation reaction of human-LDL in Example 4.

【図４】 実施例５における、ラット脳ホモジネートの
自動酸化反応に対する各抗酸化剤の抑制効果を示すグラ
フ。FIG. 4 is a graph showing the inhibitory effect of each antioxidant on the autoxidation reaction of rat brain homogenate in Example 5.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 一般式 【化１】 （ただし式中のｎは１〜５の整数であり、またＸは１価
の陽イオンである）で表わされるクロマノール誘導体。1. A compound of the general formula (Where n in the formula is an integer of 1 to 5, and X is a monovalent cation). 【請求項２】 前記請求項１の一般式中のｎが１又は２
である請求項１記載のクロマノール誘導体。2. In the general formula of claim 1, n is 1 or 2.
The chromanol derivative according to claim 1, which is: 【請求項３】 一般式 【化２】 （式中のＲ₁、Ｒ₂は水素原子又は炭素数２〜２４の飽和
若しくは不飽和脂肪酸残基であり、それぞれ同一であっ
てもよいし、異なっていてもよく、またｎは１〜５の整
数、Ｘは１価の陽イオンである）で表わされるホスファ
チジルクロマノール誘導体に、ホスフォリパーゼＣを作
用させて得ることを特徴とする、請求項１記載のクロマ
ノール誘導体の製造方法。3. A compound of the general formula (Wherein R ₁ and R ₂ are a hydrogen atom or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 2 to 24 carbon atoms, which may be the same or different, and n is 1 to 5 And X is a monovalent cation.) A method for producing a chromanol derivative according to claim 1, wherein the phosphatidylchromanol derivative is represented by the following formula: 【請求項４】 請求項１記載のクロマノール誘導体の少
なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする抗酸化
剤。4. An antioxidant comprising at least one chromanol derivative according to claim 1 as an active ingredient.