JP2886628B2 - Method for producing monoacylglycerophospholipid - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はモノアシルグリセロリン脂質の製造方法に関
し、詳しくは、グリセロリン酸又はその塩又はその誘導
体と、脂肪酸エステルとに、1,3位位置特異性リパーゼ
を作用させモノアシルグリセロリン脂質を製造する方法
に関するものである。The present invention relates to a method for producing a monoacylglycerophospholipid, and more specifically, a method for producing a monoacylglycerophospholipid, a salt or a derivative thereof, and a fatty acid ester, using a 1,3-position specificity. The present invention relates to a method for producing a monoacylglycerophospholipid by acting a sex lipase.

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕[Problems to be solved by conventional technology and invention]

従来、モノアシルリン脂質（リゾレシチン）の製造方
法としては、天然の動植物起源のリン脂質を、溶剤分
別、珪酸カラム分離などの方法により抽出し、リパーゼ
又はホスホリパーゼA_zにより加水分解し、モノアシルリ
ン脂質を得る方法（特開昭63−279753号公報）が一般に
行われている。Conventionally, as a method for producing Monoashirurin lipid (lysolecithin), a method of the phospholipids of native flora and fauna origin, solvent fractionation, and extracted by a method such as silicic acid column separation, hydrolyzed by a lipase or phospholipase A _z, obtain Monoashirurin lipid (JP-A-63-279753) is generally used.

ホスホリパーゼA_zを用いる場合は、sn−２位のアシル
基を加水分解することによりリゾレシチンを製造でき
る。また、リパーゼはトリグリセリド、ジグリセリド、
モノグリセリド等のエステル結合を加水分解する以外
に、リン脂質のsn−１位のエステル結合を1,3位位置特
異性リパーゼが加水分解すること、またsn−１−２位の
エステル結合に付いては位置特異性の無いリパーゼによ
り加水分解されることが報告されている。そこでこのリ
パーゼを利用しリン脂質の分解反応について検討されて
きている。しかし、これらの酵素反応ではジアシルグリ
セロリン脂質を完全に除去し、リゾレシチンだけにする
ことや、モノアシルリン脂質のアルキル基を均一に、も
しくは要求にあった脂肪酸組成のリン脂質にすることは
できなかった。また天然のリン脂質を原料とすると共存
する糖脂質、スフィンゴ脂質、色素、油脂などの除去が
難しく、特に純粋な製品を得ようとすると溶剤分別、カ
ラム精製など煩雑な操作を必要とした。When phospholipase _Az is used, lysolecithin can be produced by hydrolyzing the acyl group at the sn-2 position. In addition, lipase is triglyceride, diglyceride,
In addition to hydrolyzing ester bonds such as monoglycerides, the ester bond at the sn-1 position of phospholipids is hydrolyzed by the 1,3-position-specific lipase, and Has been reported to be hydrolyzed by lipases without regiospecificity. Therefore, the decomposition reaction of phospholipids using this lipase has been studied. However, in these enzyme reactions, diacylglycerophospholipids could not be completely removed and only lysolecithin could be used, or the alkyl group of monoacylphospholipids could not be made uniform or a phospholipid having a fatty acid composition as required. In addition, when natural phospholipids are used as raw materials, it is difficult to remove coexisting glycolipids, sphingolipids, pigments, fats and oils, etc. In particular, to obtain pure products, complicated operations such as solvent separation and column purification were required.

また、従来のリパーゼによるジアシルグリセロリン脂
質からモノアシルグリセロリン脂質へのエステルの加水
分解を利用した改質の利点として、低温で高度不飽和脂
肪酸の劣化なしに加水分解できること、また酵素の加水
分解位置選択性の差によりsn−１とsn−２のモノアシル
グリセロリン脂質が製造できることが挙げられる。しか
し、欠点として、加水分解反応を完全に進行させるこ
とが難しくモノアシルリン脂質のみを得ること（ジアシ
ルリン脂質のない）ができない、天然由来のレシチン
からリゾホスファチジルコリンのみといった単一種類の
モノアシルリン脂質のみを製造できないこと、モノア
シルリン脂質の脂肪酸組成が自由にならないことといっ
た点が挙げられる。In addition, as an advantage of the modification using hydrolysis of an ester from a diacylglycerophospholipid to a monoacylglycerophospholipid by a conventional lipase, hydrolysis can be performed at a low temperature without deterioration of a polyunsaturated fatty acid. It is mentioned that monoacylglycerophospholipids of sn-1 and sn-2 can be produced depending on the sex difference. However, as a disadvantage, it is difficult to completely advance the hydrolysis reaction, and it is not possible to obtain only a monoacylphospholipid (no diacylphospholipid), and it is not possible to produce only a single kind of monoacylphospholipid such as lysophosphatidylcholine only from naturally occurring lecithin. And the fact that the fatty acid composition of the monoacyl phospholipid does not become free.

また、グリセロホスホリルコリンのようなグリセロリ
ン酸と脂肪酸から酸無水物法、酸クロリド法等の化学反
応によりモノアシルリン脂質を製造する方法も知られて
いる。Also known is a method for producing monoacylphospholipids from glycerophosphoric acid such as glycerophosphorylcholine and a fatty acid by a chemical reaction such as an acid anhydride method or an acid chloride method.

しかしこのようなリン脂質の化学反応による合成反応
では、縮合剤などによる脂肪酸の劣化が起こるという問
題点や、選択的にモノアシルリン脂質のみを製造する反
応方法が煩雑かつコスト高となる等の点から殆ど検討さ
れていない。However, in such a synthesis reaction by the phospholipid chemical reaction, fatty acids are degraded by a condensing agent or the like, and the reaction method for selectively producing only monoacyl phospholipids becomes complicated and expensive. Little has been considered.

〔課題を解決するための手段〕[Means for solving the problem]

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究の結
果、本発明を完成するに到った。The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, completed the present invention.

即ち、本発明は、グリセロリン酸又はその塩類又はそ
の誘導体と脂肪酸エステルとを、1,3位位置特異性リパ
ーゼの存在下、エステル交換反応させ、sn−１位にアシ
ル基を導入することを特徴とするモノアシルグリセロリ
ン脂質の製造方法を提供するものである。That is, the present invention is characterized in that glycerophosphate or a salt or derivative thereof and a fatty acid ester are subjected to a transesterification reaction in the presence of a 1,3-position-specific lipase to introduce an acyl group at the sn-1 position. And a method for producing a monoacylglycerophospholipid.

本発明で用いられるグリセロリン酸の塩としてはグリ
セロリン酸の金属塩またはアンモニウム塩などがあり、
例えばグリセロリン酸２ナトリウム塩、グリセロリン酸
カルシウム塩等が挙げられる。また、グリセロリン酸の
誘導体としてはグリセロホスホリルコリン、グリセロホ
スホリルエタノールアミンのほか、以下の式（Ｉ）で示
されるような誘導体が挙げられる。Examples of the glycerophosphate salt used in the present invention include a metal salt or an ammonium salt of glycerophosphate,
For example, glycerophosphate disodium salt, glycerophosphate calcium salt and the like can be mentioned. Examples of the glycerophosphoric acid derivative include glycerophosphorylcholine, glycerophosphorylethanolamine, and a derivative represented by the following formula (I).

（式中、Ｘは置換基を有してもよい炭素数１〜24のアル
キル基或いはアルケニル基、多価アルコール残基、糖残
基、又はアルキレンオキサイド重合体残基を示す。） 式（Ｉ）で表される誘導体の具体例としては次の式で
表される誘導体が挙げられる。 (In the formula, X represents an alkyl or alkenyl group having 1 to 24 carbon atoms which may have a substituent, a polyhydric alcohol residue, a sugar residue, or an alkylene oxide polymer residue.) Specific examples of the derivative represented by the formula (1) include a derivative represented by the following formula.

（１） Ｘが置換基を有してもよい炭素数１〜24のアル
キル基或いはアルケニル基である例 （式中、Ｒは置換基を有してもよい炭素数１〜24のアル
ケニル基或いはアルケニル基を示す。） （２） Ｘが多価アルコール残基である例 （Ｘがグリセリン残基の場合） （Ｘがプロピレングリコール残基の場合） （３） Ｘが糖残基である例 （式中、Ｒ′はグルコース、フルクトース、ガラクトー
ス、シュークロース等の残基である。） （４） Ｘがアルキレンオキサイド重合体残基である例 本発明において脂肪酸エステルとしては、脂肪酸の低
級アルコールエステルが好ましく、炭素数が６〜24程度
の直避飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、高度不飽和脂肪酸、
分岐脂肪酸等の脂肪酸と炭素数１〜６の直鎖一価アルコ
ールのエステル化合物が特に好ましく用いられる。(1) Examples in which X is an optionally substituted alkyl or alkenyl group having 1 to 24 carbon atoms (In the formula, R represents an alkenyl group having 1 to 24 carbon atoms which may have a substituent or an alkenyl group.) (2) Example in which X is a polyhydric alcohol residue (When X is a glycerin residue) (When X is a propylene glycol residue) (3) Example in which X is a sugar residue (In the formula, R 'is a residue of glucose, fructose, galactose, sucrose, etc.) (4) Example in which X is an alkylene oxide polymer residue In the present invention, as the fatty acid ester, a lower alcohol ester of a fatty acid is preferable, and a straight-chain saturated fatty acid having about 6 to 24 carbon atoms, an unsaturated fatty acid, a highly unsaturated fatty acid,
An ester compound of a fatty acid such as a branched fatty acid and a linear monohydric alcohol having 1 to 6 carbon atoms is particularly preferably used.

本発明のモノアシルグリセロリン脂質の製造に使用で
きる1,3位位置特異性リパーゼは、微生物の生産する酵
素に限らず動植物起源のものであっても良い。例えば、
リゾプス属、ムコール属、アスペルギルス属、クロモバ
クテリウム属、ペニシリウム属、及び豚すい臓リパーゼ
などが挙げられる。The 1,3-position-specific lipase that can be used for producing the monoacylglycerophospholipid of the present invention is not limited to an enzyme produced by a microorganism but may be of animal or plant origin. For example,
Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Chromobacterium, Penicillium, and pig pancreatic lipase.

本発明においては、水及び有機溶剤に不溶性の担体上
に固定化したリパーゼを使用することが必要である。用
いられる担体としては、脱水条件下でも高活性を保つよ
うな固定化酵素が得られるものが好ましく、特に多孔性
の水酸基を持つ樹脂が好ましい。In the present invention, it is necessary to use a lipase immobilized on a carrier insoluble in water and an organic solvent. As the carrier to be used, those capable of obtaining an immobilized enzyme that maintains high activity even under dehydration conditions are preferable, and a resin having a porous hydroxyl group is particularly preferable.

本発明の反応系としては、全反応のまたはその反応途
中より生成物の１つである水または低級アルコールを系
外に除くことにより、モノアシルグリセロリン脂質の合
成を行うことが好ましい。水または低級アルコールを系
外へ除く方法としては、反応後期または全反応にわた
り、減圧条件下または窒素等の不活性ガス気流下で反応
を行う方法や、モレキュラーシーブや脱水剤の添加によ
る反応などが挙げられる。In the reaction system of the present invention, it is preferable to synthesize monoacylglycerophospholipids by removing water or a lower alcohol, which is one of the products, out of the system during or after the entire reaction. Examples of the method for removing water or lower alcohol from the system include a method in which the reaction is carried out under a reduced pressure or under an inert gas stream such as nitrogen, or a reaction by adding a molecular sieve or a dehydrating agent over the latter part of the reaction or the whole reaction. No.

また、グリセロリン酸又はその塩又はその誘導体を粉
末状のまま脂肪酸エステルと反応させても良いが、グリ
セロリン酸又はその塩又はその誘導体の水溶液として反
応させても良い。また溶媒として脂肪酸エステルを溶解
する溶媒を用いて反応を行っても良い。尚、溶媒を用い
て反応を行う場合には、反応途中から減圧下で溶媒も除
去する等の方法を取る必要がある。より具体的には、グ
リセロリン酸又はその塩又はその誘導体の水溶液のpHは
２〜10、好ましくは５〜８であり、濃度は10％以上好ま
しくは飽和溶液に近いほど良い。グリセロリン酸又はそ
の塩又はその誘導体と脂肪酸エステルとの反応比率は、
モル比で１倍以上あれば良いが、脂肪酸エステルを分散
媒として使用する場合や、より反応を進めるためにその
比率を上げることは問題が無い。尚、生成したグリセロ
リン脂質を溶剤分別（アセトン沈澱）などで回収する場
合には、分散媒として使用する脂肪酸エステルを10倍程
度に抑えることが好ましい。また分散媒として、反応に
使用する脂肪酸種が低融点のものである場合、同種の脂
肪酸組成のトリグリセリドを使用する方法が好ましい
が、脂肪酸エステルを溶解分散させ、リパーゼを失活さ
せない溶媒なら特に規定はしない。例えば無極性のヘキ
サン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等や、クロ
ロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化物も使用でき
る。In addition, glycerophosphoric acid or a salt or derivative thereof may be reacted with a fatty acid ester in a powder state, or may be reacted as an aqueous solution of glycerophosphoric acid or a salt or derivative thereof. The reaction may be performed using a solvent that dissolves the fatty acid ester as a solvent. When the reaction is carried out using a solvent, it is necessary to take a method such as removing the solvent under reduced pressure during the reaction. More specifically, the pH of the aqueous solution of glycerophosphoric acid or a salt or derivative thereof is 2 to 10, preferably 5 to 8, and the concentration is 10% or more, preferably as close to a saturated solution as possible. The reaction ratio between glycerophosphoric acid or a salt or a derivative thereof and a fatty acid ester,
It is sufficient that the molar ratio is 1 or more, but there is no problem in using a fatty acid ester as a dispersion medium or increasing the ratio in order to further promote the reaction. When the generated glycerophospholipid is recovered by solvent separation (acetone precipitation) or the like, it is preferable to reduce the number of fatty acid esters used as a dispersion medium to about 10 times. When the fatty acid species used in the reaction has a low melting point as the dispersion medium, a method using triglycerides having the same fatty acid composition is preferred. Do not. For example, nonpolar hexane, cyclohexane, benzene, toluene and the like, and halides such as chloroform and dichloroethane can be used.

反応温度については特に限定はしないが20〜100℃で
酵素の失活しない温度であれば良い。酵素反応の初期に
水分が多く存在する場合は35℃以下の穏和な条件で酵素
失活を抑えることが好ましく、逆に水及び低級アルコー
ルを反応系内から除く場合には、できるだけ高温で反応
することが望ましい。尚、グリセロリン脂質に導入する
脂肪酸エステルが、高度不飽和脂肪酸エステルである場
合は反応温度は70℃以下で、できるだけ抗酸化剤（例え
ばトコフェノール）などを添加することも好ましい。一
般的には、フリーの酵素や菌体粉末などを使用する場合
は20〜50℃で、固定化酵素や耐熱性の酵素を使用する場
合は40〜100℃で使用すると良い。The reaction temperature is not particularly limited, but may be any temperature at 20 to 100 ° C. that does not inactivate the enzyme. When a large amount of water is present at the beginning of the enzymatic reaction, it is preferable to suppress the inactivation of the enzyme under mild conditions of 35 ° C or less. Conversely, when water and lower alcohols are removed from the reaction system, the reaction is performed at as high a temperature as possible. It is desirable. When the fatty acid ester to be introduced into the glycerophospholipid is a highly unsaturated fatty acid ester, the reaction temperature is preferably 70 ° C. or lower, and it is also preferable to add an antioxidant (eg, tocophenol) as much as possible. Generally, it is preferable to use the enzyme at 20 to 50 ° C. when using a free enzyme or cell powder, and at 40 to 100 ° C. when using an immobilized enzyme or a heat-resistant enzyme.

〔実施例〕〔Example〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail by examples,
The present invention is not limited to these examples.

参考例１ グリセロリン酸２ナトリウム６水和物（関東化学
（株）製10gを水7mlに溶解後、オレイン酸エチルエステ
ル（東京化成（株）製）32gを窒素気流下で撹拌混合
後、リゾプス・ジャポニカス由来の酵素（大阪細研製、
オリパーゼ4S）1000 Uを添加し40℃で24時間反応した。Reference Example 1 Disodium glycerophosphate hexahydrate (10 g, manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) was dissolved in 7 ml of water, and 32 g of ethyl oleate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was stirred and mixed under a nitrogen stream. Enzymes derived from Japonicas (Osaka Hoken,
(Olipase 4S) 1000 U was added and reacted at 40 ° C. for 24 hours.

反応後は、ヘキサン100mlを添加し、反応終了品を濾
別しヘキサン相を回収した。そのヘキサン相をエタノー
ル30mlと水20mlの混合溶媒で洗浄後、ヘキサン相を減圧
除去した。After the reaction, 100 ml of hexane was added, the reaction-terminated product was separated by filtration, and the hexane phase was recovered. After washing the hexane phase with a mixed solvent of 30 ml of ethanol and 20 ml of water, the hexane phase was removed under reduced pressure.

この反応終了品から未反応の脂肪酸を除去するため冷
アセトン中で撹拌後、遠心分離し沈澱を回収した。回収
した生成物は2.7gであった。この一部を取り高速液体ク
ロマトグラフィー（ガスクロ工業（株）製:Unisil Q NH
₂、溶離条件アセトニトリル：エタノール:10mMリン酸２
水素アンモニウム溶液＝40:50:10）にて分析を行った。
結果は、ホスファチジン酸０％、リゾホスファチジン酸
100％であった。After stirring in cold acetone to remove unreacted fatty acids from the reaction-completed product, the precipitate was collected by centrifugation. The recovered product weighed 2.7 g. A part of this is taken and high performance liquid chromatography (Gascro Industry Co., Ltd .: Unisil Q NH
_2. Elution conditions acetonitrile: ethanol: 10 mM phosphoric acid 2
The analysis was performed with ammonium hydrogen solution = 40: 50: 10).
The results were 0% phosphatidic acid, lysophosphatidic acid
100%.

実施例１ 固定化酵素の効果を見るためにリゾブス・ジャポニカ
ス由来の酵素（大阪細研製、サイケン100）を多孔性ア
ニオン樹脂に固定化した固定化酵素1000Uを用いて、基
質は、グリセロリン酸２ナトリウム塩と、オレイン酸エ
チルエステルを用い、参考例１と同様に反応を行った。Example 1 In order to see the effect of the immobilized enzyme, an enzyme derived from Rhizobus japonicas (manufactured by Osaka Seiken, Saiken 100) was immobilized on a porous anion resin using 1000 U of an immobilized enzyme. The reaction was carried out in the same manner as in Reference Example 1 using sodium salt and oleic acid ethyl ester.

回収した生成物は3.4gであり、分析によりホスファチ
ジン酸０％、リゾホスファチジン酸100％であった。The recovered product weighed 3.4 g and was analyzed to be 0% phosphatidic acid and 100% lysophosphatidic acid.

比較例 参考例１において、オレイン酸エチルエステルに代え
てオレイン酸を用いた他は同じ条件で反応せしめ、参考
例１の方法に従って後処理、分析を行った。Comparative Example A reaction was performed under the same conditions as in Reference Example 1 except that oleic acid was used instead of oleic acid ethyl ester, and post-treatment and analysis were performed according to the method of Reference Example 1.

回収した生成物は1.3gであり、ホスファチジン酸０
％、リゾホスファチジン酸100％であった。The recovered product weighed 1.3 g and contained 0 phosphatidic acid.
% And lysophosphatidic acid 100%.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

本発明の方法により、不純物の無いモノアシルグリセ
ロリン脂質を低温かつ穏和な条件で製造することが可能
となった。そのため、高度不飽和アルキル基の導入され
たグリセロリン脂質を任意に得ることや、一定のアルキ
ル組成を持つモノアシルグリセロリン脂質の入手が容易
に行えるようになった。According to the method of the present invention, it has become possible to produce a monoacylglycerophospholipid having no impurities under low temperature and mild conditions. Therefore, it has become possible to easily obtain a glycerophospholipid into which a highly unsaturated alkyl group is introduced, and to easily obtain a monoacylglycerophospholipid having a fixed alkyl composition.

以上のことにより、いままで食品、化粧品等の乳化剤
として使用する場合に、その着色、臭い、糖脂質等の不
純物により使用濃度、範囲が制限されていたが、このよ
うな制限に縛られることなく使用できるようになった。
また、リポソーム等により医薬品や皮膚透過剤としての
リン脂質が使用されてきているが、本発明により天然に
ないリン脂質や自由な脂肪酸組成を有するリン脂質を入
手することができ、安定性の調節や皮膚透過活性の高い
モノアシルグリセロリン脂質を自由に得ることが可能と
なった。By the above, when used as an emulsifier for foods, cosmetics, etc., its concentration, use concentration and range were limited by its coloring, odor, impurities such as glycolipids, but without being restricted by such restrictions Now available.
Also, phospholipids as pharmaceuticals and skin permeants have been used by liposomes and the like, but phospholipids that are not naturally occurring or phospholipids having a free fatty acid composition can be obtained according to the present invention, and stability can be controlled. And monoacylglycerophospholipids having high skin permeation activity can be freely obtained.

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】グリセロリン酸又はその塩類又はその誘導
体と脂肪酸エステルとを、水及び有機溶剤に不溶性の担
体上に固定化した1,3位位置特異性リパーゼの存在下、
エステル交換反応させ、sn−１位にアシル基を導入する
ことを特徴とするモノアシルグリセロリン脂質の製造方
法。(1) A glycerophosphoric acid or a salt or derivative thereof and a fatty acid ester are immobilized on a carrier insoluble in water and an organic solvent in the presence of a 1,3-position specific lipase.
A method for producing a monoacylglycerophospholipid, comprising subjecting a transesterification reaction to introduce an acyl group at the sn-1 position. 【請求項２】反応生成物の水又は低級アルコールを反応
系外に除くことを特徴とする請求項１記載の製造方法。2. The method according to claim 1, wherein water or lower alcohol as a reaction product is removed outside the reaction system.