JPH10227793A - カルバミル化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
カルバミル化ヘモグロビンの測定方法Info
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- JPH10227793A JPH10227793A JP3022297A JP3022297A JPH10227793A JP H10227793 A JPH10227793 A JP H10227793A JP 3022297 A JP3022297 A JP 3022297A JP 3022297 A JP3022297 A JP 3022297A JP H10227793 A JPH10227793 A JP H10227793A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 カルバミル化ヘモグロビンを高精度にかつ簡
便に測定する方法を提供する。 【解決手段】 固相（例、マイクロタイタープレート）
にカルバミル化ヘモグロビンを含む検体を反応させた
後、抗カルバミル化ヘモグロビン抗体を反応させ、前記
カルバミル化ヘモグロビンを介して固相に結合された抗
カルバミル化ヘモグロビン抗体を測定することからなる
ことを特徴とするカルバミル化ヘモグロビンの測定方
法。
便に測定する方法を提供する。 【解決手段】 固相（例、マイクロタイタープレート）
にカルバミル化ヘモグロビンを含む検体を反応させた
後、抗カルバミル化ヘモグロビン抗体を反応させ、前記
カルバミル化ヘモグロビンを介して固相に結合された抗
カルバミル化ヘモグロビン抗体を測定することからなる
ことを特徴とするカルバミル化ヘモグロビンの測定方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、カルバミル化ヘモ
グロビンの測定方法に関する。
グロビンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖化ヘモグロビンは血液中の糖がその濃
度に比例して赤血球に入った後に、ヘモグロビンと結合
して生成したものであり、その濃度は過去１〜２カ月間
の血液中の平均的な糖濃度を反映すると言われている。
そして血糖値や尿糖値に比べ生理的要因に左右されにく
いので、血液中の糖化ヘモグロビンの濃度は、糖尿病の
診断又は糖尿病患者の経過観察の最適な指標として使用
されている。このため、臨床検査分野において液体クロ
マトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測定が広く行
われている。
度に比例して赤血球に入った後に、ヘモグロビンと結合
して生成したものであり、その濃度は過去１〜２カ月間
の血液中の平均的な糖濃度を反映すると言われている。
そして血糖値や尿糖値に比べ生理的要因に左右されにく
いので、血液中の糖化ヘモグロビンの濃度は、糖尿病の
診断又は糖尿病患者の経過観察の最適な指標として使用
されている。このため、臨床検査分野において液体クロ
マトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測定が広く行
われている。
【０００３】カルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂ
という）は、血漿中の尿素由来のシアン酸イオンから生
じたイソシアン酸がヘモグロビンのＮ末端に反応して生
成される。血液中のＣＨｂは、腎不全患者において増加
することが知られている。
という）は、血漿中の尿素由来のシアン酸イオンから生
じたイソシアン酸がヘモグロビンのＮ末端に反応して生
成される。血液中のＣＨｂは、腎不全患者において増加
することが知られている。
【０００４】ＣＨｂの測定方法としては、Clinical Che
mistry,Vol.36,No.4,607-610(1990)に、酸加水分解によ
り、カルバミル化したヘモグロビンのＮ末端バリン（カ
ルバミル化バリン）を分離し、さらに生成するバリンヒ
ダントインを高速液体クロマトグラフィーで測定する方
法が開示されている。また、Clinical Chemistry,Vol.3
9,No.12,2514-2518(1993) では、カチオン交換液体クロ
マトグラフィーにより、ＣＨｂを糖化ヘモグロビンＡ１
ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）から分離している。
mistry,Vol.36,No.4,607-610(1990)に、酸加水分解によ
り、カルバミル化したヘモグロビンのＮ末端バリン（カ
ルバミル化バリン）を分離し、さらに生成するバリンヒ
ダントインを高速液体クロマトグラフィーで測定する方
法が開示されている。また、Clinical Chemistry,Vol.3
9,No.12,2514-2518(1993) では、カチオン交換液体クロ
マトグラフィーにより、ＣＨｂを糖化ヘモグロビンＡ１
ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）から分離している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前者の方法は、加水分
解処理後の回収率が７０％以下と低く、特異性に問題が
残っている。また、後者の方法は、ＨｂＡ１ｃピークに
ＣＨｂピークが重ならないので、ＨｂＡ１ｃの定量性向
上については記載されているが、ＣＨｂ自体の定量性に
ついては記載されていない。また、記載のクロマトグラ
ムによれば、ＣＨｂピークはヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ
０）ピークに重なっているため、ＣＨｂ定量には精度が
不十分であるものと予測される。従って、従来技術にお
いては、ＣＨｂを高精度にかつ簡便に測定する方法は確
立していなかった。
解処理後の回収率が７０％以下と低く、特異性に問題が
残っている。また、後者の方法は、ＨｂＡ１ｃピークに
ＣＨｂピークが重ならないので、ＨｂＡ１ｃの定量性向
上については記載されているが、ＣＨｂ自体の定量性に
ついては記載されていない。また、記載のクロマトグラ
ムによれば、ＣＨｂピークはヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ
０）ピークに重なっているため、ＣＨｂ定量には精度が
不十分であるものと予測される。従って、従来技術にお
いては、ＣＨｂを高精度にかつ簡便に測定する方法は確
立していなかった。
【０００６】本発明は上記問題点に鑑みてなされたもの
であり、その目的はカルバミル化ヘモグロビンを高精度
にかつ簡便に測定する方法を提供することにある。
であり、その目的はカルバミル化ヘモグロビンを高精度
にかつ簡便に測定する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明のカルバミル化ヘ
モグロビンの測定方法は、固相にカルバミル化ヘモグロ
ビンを含む検体を反応させた後、抗カルバミル化ヘモグ
ロビン抗体を反応させ、前記カルバミル化ヘモグロビン
を介して固相に結合された抗カルバミル化ヘモグロビン
抗体を測定することからなることを特徴とする。
モグロビンの測定方法は、固相にカルバミル化ヘモグロ
ビンを含む検体を反応させた後、抗カルバミル化ヘモグ
ロビン抗体を反応させ、前記カルバミル化ヘモグロビン
を介して固相に結合された抗カルバミル化ヘモグロビン
抗体を測定することからなることを特徴とする。
【０００８】本発明で用いられる固相としては、従来、
免疫分析の分野で用いられてきた固相であれば、特に限
定されず、いずれも使用可能である。具体的には、例え
ば、プレート、高分子の微粒子等が挙げられる。上記プ
レートとしては、例えば、プラスチック製マイクロタイ
タープレートが挙げられる。上記高分子の微粒子として
は、ポリスチレン、ポリアクリレートなどの合成高分子
微粒子；ポリアミノ酸、高分子量多糖類などの天然高分
子微粒子が挙げられる。上記高分子の微粒子としては、
とくにラテックス粒子が好ましい。微粒子の粒径として
は、０．０１〜１０μｍが好ましい。
免疫分析の分野で用いられてきた固相であれば、特に限
定されず、いずれも使用可能である。具体的には、例え
ば、プレート、高分子の微粒子等が挙げられる。上記プ
レートとしては、例えば、プラスチック製マイクロタイ
タープレートが挙げられる。上記高分子の微粒子として
は、ポリスチレン、ポリアクリレートなどの合成高分子
微粒子；ポリアミノ酸、高分子量多糖類などの天然高分
子微粒子が挙げられる。上記高分子の微粒子としては、
とくにラテックス粒子が好ましい。微粒子の粒径として
は、０．０１〜１０μｍが好ましい。
【０００９】上記固相には、その表面に予め抗ヘモグロ
ビン抗体が固定化されていてもよいし、なにも固定化さ
れていなくてもよい。
ビン抗体が固定化されていてもよいし、なにも固定化さ
れていなくてもよい。
【００１０】上記固相に予め抗ヘモグロビン抗体が固定
化される場合には、抗ヘモグロビン抗体としては、公知
の抗ヘモグロビン抗体であれば特に限定されず、モノク
ローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよい。抗ヘ
モグロビン抗体としては、抗ヒトヘモグロビン抗体が特
に好ましい。固相に抗ヘモグロビン抗体を固定化する方
法は、公知の方法でよく、例えば、１μｇ／ｍｌ程度の
濃度の抗体溶液に固相を添加し、４℃で一晩放置するこ
とにより固定化できる。通常、上記の固定化処理の後
に、固相表面の抗体が吸着せずに残った蛋白質吸着部位
に蛋白質を吸着させるために、例えば、牛血清アルブミ
ン等のような蛋白質溶液を固相に接触させる（固相の使
用時に蛋白質などの非特異吸着を防ぐために行う、いわ
ゆる、ブロッキング処理）。
化される場合には、抗ヘモグロビン抗体としては、公知
の抗ヘモグロビン抗体であれば特に限定されず、モノク
ローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよい。抗ヘ
モグロビン抗体としては、抗ヒトヘモグロビン抗体が特
に好ましい。固相に抗ヘモグロビン抗体を固定化する方
法は、公知の方法でよく、例えば、１μｇ／ｍｌ程度の
濃度の抗体溶液に固相を添加し、４℃で一晩放置するこ
とにより固定化できる。通常、上記の固定化処理の後
に、固相表面の抗体が吸着せずに残った蛋白質吸着部位
に蛋白質を吸着させるために、例えば、牛血清アルブミ
ン等のような蛋白質溶液を固相に接触させる（固相の使
用時に蛋白質などの非特異吸着を防ぐために行う、いわ
ゆる、ブロッキング処理）。
【００１１】本発明で使用される抗ＣＨｂ抗体は、モノ
クローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよいが、
測定精度向上のためには、モノクローナル抗体の方が好
ましい。抗ＣＨｂモノクローナル抗体は、公知の細胞融
合技術を用いて得ることができ、具体的には、例えば、
ＣＨｂで免疫したマウスの脾臓のリンパ球とミエローマ
細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマの培養
により得ることができる。
クローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよいが、
測定精度向上のためには、モノクローナル抗体の方が好
ましい。抗ＣＨｂモノクローナル抗体は、公知の細胞融
合技術を用いて得ることができ、具体的には、例えば、
ＣＨｂで免疫したマウスの脾臓のリンパ球とミエローマ
細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマの培養
により得ることができる。
【００１２】本発明で用いられるＣＨｂを含む検体とし
ては、溶血された血液であり、例えば、血液抗凝固剤
（例えば、フッ化ナトリウムなど）が収容された採血管
により採血された全血血液を、溶血剤（トリトンＸ−１
００、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を含む緩衝液な
ど）で１０〜３００倍程度に溶血・希釈したものが挙げ
られる。
ては、溶血された血液であり、例えば、血液抗凝固剤
（例えば、フッ化ナトリウムなど）が収容された採血管
により採血された全血血液を、溶血剤（トリトンＸ−１
００、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を含む緩衝液な
ど）で１０〜３００倍程度に溶血・希釈したものが挙げ
られる。
【００１３】本発明の具体的測定方法の一例として、マ
イクロタイタープレートを固相として用いた方法を以下
説明する。
イクロタイタープレートを固相として用いた方法を以下
説明する。
【００１４】（１）まず、前述の方法で、マイクロタイ
タープレートに抗ヘモグロビン抗体を固定化後、ブロッ
キング処理したものを固相として用意する。 （２）上記固相と検体とを混合することにより、固相上
の抗ヘモグロビン抗体と検体中のＣＨｂを反応させる。
この反応条件は１０〜４０℃で０．５〜５時間、例え
ば、室温で２時間程度が好ましい。 （３）反応終了後、洗浄し未反応の検体などを除去す
る。
タープレートに抗ヘモグロビン抗体を固定化後、ブロッ
キング処理したものを固相として用意する。 （２）上記固相と検体とを混合することにより、固相上
の抗ヘモグロビン抗体と検体中のＣＨｂを反応させる。
この反応条件は１０〜４０℃で０．５〜５時間、例え
ば、室温で２時間程度が好ましい。 （３）反応終了後、洗浄し未反応の検体などを除去す
る。
【００１５】（４）抗ＣＨｂ抗体を反応させる。この反
応条件は、上記（２）に述べた反応条件と同様である。 （５）反応終了後、洗浄し未反応の抗ＣＨｂ抗体を除去
する。 （６）抗ＣＨｂ抗体の定量：ＣＨｂを介して固相に結合
された抗ＣＨｂ抗体を定量する。この定量法としては、
従来から免疫分析の分野において用いられてきた公知の
方法が利用される。例えば、上記の（４）で用いられる
抗ＣＨｂ抗体を予め、酵素（通常、ＥＬＩＳＡ法とい
う）、蛍光色素または放射性物質などで標識しておき、
該標識を測定する方法；上記の（４）で用いられる抗Ｃ
Ｈｂ抗体に予めビオチンを結合しておき、該ビオチンを
標識化アビジンと反応させて該標識を測定するする方
法；抗ＣＨｂ抗体に特異的に反応する標識化抗体を更に
反応させ、該標識を測定する方法などが挙げられる。
応条件は、上記（２）に述べた反応条件と同様である。 （５）反応終了後、洗浄し未反応の抗ＣＨｂ抗体を除去
する。 （６）抗ＣＨｂ抗体の定量：ＣＨｂを介して固相に結合
された抗ＣＨｂ抗体を定量する。この定量法としては、
従来から免疫分析の分野において用いられてきた公知の
方法が利用される。例えば、上記の（４）で用いられる
抗ＣＨｂ抗体を予め、酵素（通常、ＥＬＩＳＡ法とい
う）、蛍光色素または放射性物質などで標識しておき、
該標識を測定する方法；上記の（４）で用いられる抗Ｃ
Ｈｂ抗体に予めビオチンを結合しておき、該ビオチンを
標識化アビジンと反応させて該標識を測定するする方
法；抗ＣＨｂ抗体に特異的に反応する標識化抗体を更に
反応させ、該標識を測定する方法などが挙げられる。
【００１６】（７）予め、検体中のＣＨｂ量と、反応し
た抗ＣＨｂ抗体の量を反映する標識の活性量との間で検
量線を作成しておき、該検量線にあてはめて検体中のＣ
Ｈｂ量を測定する。
た抗ＣＨｂ抗体の量を反映する標識の活性量との間で検
量線を作成しておき、該検量線にあてはめて検体中のＣ
Ｈｂ量を測定する。
【００１７】本発明の具体的測定方法の他の例として、
ラテックス粒子を固相として用いた方法を以下説明す
る。
ラテックス粒子を固相として用いた方法を以下説明す
る。
【００１８】（１）まず、ラテックス粒子と検体とを混
合することにより、ラテックス粒子に検体中のＣＨｂを
吸着させる。 （２）反応終了後、洗浄し未反応の検体などを除去す
る。
合することにより、ラテックス粒子に検体中のＣＨｂを
吸着させる。 （２）反応終了後、洗浄し未反応の検体などを除去す
る。
【００１９】（３）抗ＣＨｂ抗体を反応させる。これに
より、ラテックス粒子に吸着したＣＨｂと抗ＣＨｂ抗体
が結合する。この反応条件は１０〜４０℃で０．５〜５
時間、例えば、室温で２時間程度が好ましい。 （４）反応終了後、洗浄し未反応の抗ＣＨｂ抗体を除去
する。 （５）抗ＣＨｂ抗体の定量：ＣＨｂを介して固相に結合
された抗ＣＨｂ抗体を定量する。この定量法としては、
抗ＣＨｂ抗体におけるＣＨｂと反応する部位以外の部位
に特異的に反応する抗体、例えば、抗ＩｇＧ抗体を添加
する方法が挙げられる。この場合は、抗ＩｇＧ抗体は、
ＣＨｂを介して固相に結合された抗ＣＨｂ抗体に結合す
ることにより、固相同士を凝集させる。従って、この凝
集の度合いを、例えば、吸光度の増加などで測定するこ
とにより、抗ＣＨｂ抗体量を測定することができ、それ
により、固相に結合していたＣＨｂ量を測定することが
できる。 （６）予め、検体中のＣＨｂ量と凝集の度合いとの間で
検量線を作成しておき、該検量線にあてはめて検体中の
ＣＨｂ量を測定する。
より、ラテックス粒子に吸着したＣＨｂと抗ＣＨｂ抗体
が結合する。この反応条件は１０〜４０℃で０．５〜５
時間、例えば、室温で２時間程度が好ましい。 （４）反応終了後、洗浄し未反応の抗ＣＨｂ抗体を除去
する。 （５）抗ＣＨｂ抗体の定量：ＣＨｂを介して固相に結合
された抗ＣＨｂ抗体を定量する。この定量法としては、
抗ＣＨｂ抗体におけるＣＨｂと反応する部位以外の部位
に特異的に反応する抗体、例えば、抗ＩｇＧ抗体を添加
する方法が挙げられる。この場合は、抗ＩｇＧ抗体は、
ＣＨｂを介して固相に結合された抗ＣＨｂ抗体に結合す
ることにより、固相同士を凝集させる。従って、この凝
集の度合いを、例えば、吸光度の増加などで測定するこ
とにより、抗ＣＨｂ抗体量を測定することができ、それ
により、固相に結合していたＣＨｂ量を測定することが
できる。 （６）予め、検体中のＣＨｂ量と凝集の度合いとの間で
検量線を作成しておき、該検量線にあてはめて検体中の
ＣＨｂ量を測定する。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を挙げるこ
とにより、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに
限定されるものではない。
とにより、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに
限定されるものではない。
【００２１】参考例１ 抗ＣＨｂモノクローナル抗体の
調製 （１）ヒトＣＨｂをフロイントコンプリートアジュバン
トに十分分散する。 （２）上記（１）で得られた、分散物の１００μｌをＢ
ａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、２週間おきに４回注射し
て免疫した。 （３）該免疫マウスを屠殺し、脾臓を摘出してリンパ球
１０6 個を得た。 （４）該リンパ球とマウスミエローマ細胞を、ポリエチ
レングリコール存在下で細胞融合し、培養を行った。 （５）増殖細胞の上清を採取した。
調製 （１）ヒトＣＨｂをフロイントコンプリートアジュバン
トに十分分散する。 （２）上記（１）で得られた、分散物の１００μｌをＢ
ａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、２週間おきに４回注射し
て免疫した。 （３）該免疫マウスを屠殺し、脾臓を摘出してリンパ球
１０6 個を得た。 （４）該リンパ球とマウスミエローマ細胞を、ポリエチ
レングリコール存在下で細胞融合し、培養を行った。 （５）増殖細胞の上清を採取した。
【００２２】（６）該上清をＥＬＩＳＡ法によって、抗
ヒトＣＨｂ抗体の有無を調べた。 （７）上記（６）で陽性となった細胞について、限界希
釈法により希釈して培養し、その培養液中の抗ヒトＣＨ
ｂ抗体の存在をＥＬＩＳＡ法によって確認し、抗ヒトＣ
Ｈｂ抗体を産生している細胞を単離した。 （８）得られた抗ヒトＣＨｂマウスモノクローナル抗体
産生細胞（ハイブリドーマ細胞）を大量培養した。 （９）得られた培養細胞をマウス腹腔内に接種した。 （１０）接種から２週間後より３日おきに腹水を採取
し、抗ヒトＣＨｂマウスモノクローナル抗体を得た。こ
の抗体を以下の実施例１において用いた。
ヒトＣＨｂ抗体の有無を調べた。 （７）上記（６）で陽性となった細胞について、限界希
釈法により希釈して培養し、その培養液中の抗ヒトＣＨ
ｂ抗体の存在をＥＬＩＳＡ法によって確認し、抗ヒトＣ
Ｈｂ抗体を産生している細胞を単離した。 （８）得られた抗ヒトＣＨｂマウスモノクローナル抗体
産生細胞（ハイブリドーマ細胞）を大量培養した。 （９）得られた培養細胞をマウス腹腔内に接種した。 （１０）接種から２週間後より３日おきに腹水を採取
し、抗ヒトＣＨｂマウスモノクローナル抗体を得た。こ
の抗体を以下の実施例１において用いた。
【００２３】実施例１ ＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＨｂ
の測定 （１）１．０μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＨｂウサギ抗体
１．０μｇ／ｍｌを、９６穴マイクロタイタープレート
のウエルに各５０μｌずつ分注した。 （２）４℃で１２時間放置した。 （３）該ウエルを牛血清アルブミンを２重量％の濃度
で、及びＴｗｅｅｎ２０を０．０２重量％の濃度で含有
するリン酸緩衝化生理食塩水で５回洗浄した後、同液２
００μｌをウエルに加え、４℃で１２時間放置した。
の測定 （１）１．０μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＨｂウサギ抗体
１．０μｇ／ｍｌを、９６穴マイクロタイタープレート
のウエルに各５０μｌずつ分注した。 （２）４℃で１２時間放置した。 （３）該ウエルを牛血清アルブミンを２重量％の濃度
で、及びＴｗｅｅｎ２０を０．０２重量％の濃度で含有
するリン酸緩衝化生理食塩水で５回洗浄した後、同液２
００μｌをウエルに加え、４℃で１２時間放置した。
【００２４】（４）ウエル内の上清を除去し、総ヘモグ
ロビン（ＣＨｂ＋糖化ヘモグロビン＋非糖化ヘモグロビ
ン）中にＣＨｂを、０、１、３、６、９、１２、１５ま
たは１８％となるように含有する検体〔この検体は、以
下のようにして得た。すなわち、健常人新鮮血液５００
μｌに、５００μｌのシアン酸塩の生理的食塩水溶液
（シアン酸ナトリウムの濃度が０．２ｍｇ／ｄｌになる
ように溶解された、０．９重量％塩化ナトリウム水溶
液）を添加し、４０℃の恒温水槽に入れ加温した。一定
時間毎にサンプリングし、溶血剤（０．０５重量％の濃
度でＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
７．４）にて２０倍に溶血・希釈し、本発明者らが先に
出願した特願平８−１６１８６０号に記載された液体ク
ロマトグラフィー法にてＣＨｂ、糖化ヘモグロビン及び
非糖化ヘモグロビンを分離し、そのピーク面積から上記
のＣＨｂ濃度を決定した。なお、ＣＨｂ濃度０％の検体
は、シアン酸塩の生理的食塩水溶液の代わりに、生理的
食塩水溶液のみを用いて、上記と同様に操作することに
より調製した。なお、上記の特願平８−１６１８６０号
に記載された液体クロマトグラフィー法の装置および測
定方法は、以下の通りである。送液ポンプ：島津製作所
社製、ＬＣ−９Ａ、試料導入装置：積水化学工業社製、
ＡＳＵ−４２０、検出器：紫外可視吸光度計、島津製作
所社製、ＳＰＤ−６ＡＶとし、検出は、波長４１５ｎｍ
の吸光度を測定した。溶離液としては、リン酸緩衝液
（Ａ）（０．１Ｍ、ｐＨ６）とリン酸緩衝液（Ｂ）
（０．３Ｍ、ｐＨ７．２）を用い、リン酸緩衝液（Ａ）
を送液した後、リン酸緩衝液（Ｂ）を送液した。分離カ
ラムとしては、カチオン交換体が充填されたカラムであ
る、積水化学工業社製、商品名「Ｍｉｃｒｏｎｅｘ Ａ
１ｃ ＨＳ−II」を用いた。〕１５０μｌを滴下して、
室温で２時間放置した。 （５）反応終了後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０２重量％の
濃度で含有する生理食塩水で４回洗浄した。 （６）次に、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＣ
Ｈｂマウスモノクローナル抗体（濃度５００ｎｇ／ｍ
ｌ）を１５０μｌ加え、室温で２時間放置した。
ロビン（ＣＨｂ＋糖化ヘモグロビン＋非糖化ヘモグロビ
ン）中にＣＨｂを、０、１、３、６、９、１２、１５ま
たは１８％となるように含有する検体〔この検体は、以
下のようにして得た。すなわち、健常人新鮮血液５００
μｌに、５００μｌのシアン酸塩の生理的食塩水溶液
（シアン酸ナトリウムの濃度が０．２ｍｇ／ｄｌになる
ように溶解された、０．９重量％塩化ナトリウム水溶
液）を添加し、４０℃の恒温水槽に入れ加温した。一定
時間毎にサンプリングし、溶血剤（０．０５重量％の濃
度でＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
７．４）にて２０倍に溶血・希釈し、本発明者らが先に
出願した特願平８−１６１８６０号に記載された液体ク
ロマトグラフィー法にてＣＨｂ、糖化ヘモグロビン及び
非糖化ヘモグロビンを分離し、そのピーク面積から上記
のＣＨｂ濃度を決定した。なお、ＣＨｂ濃度０％の検体
は、シアン酸塩の生理的食塩水溶液の代わりに、生理的
食塩水溶液のみを用いて、上記と同様に操作することに
より調製した。なお、上記の特願平８−１６１８６０号
に記載された液体クロマトグラフィー法の装置および測
定方法は、以下の通りである。送液ポンプ：島津製作所
社製、ＬＣ−９Ａ、試料導入装置：積水化学工業社製、
ＡＳＵ−４２０、検出器：紫外可視吸光度計、島津製作
所社製、ＳＰＤ−６ＡＶとし、検出は、波長４１５ｎｍ
の吸光度を測定した。溶離液としては、リン酸緩衝液
（Ａ）（０．１Ｍ、ｐＨ６）とリン酸緩衝液（Ｂ）
（０．３Ｍ、ｐＨ７．２）を用い、リン酸緩衝液（Ａ）
を送液した後、リン酸緩衝液（Ｂ）を送液した。分離カ
ラムとしては、カチオン交換体が充填されたカラムであ
る、積水化学工業社製、商品名「Ｍｉｃｒｏｎｅｘ Ａ
１ｃ ＨＳ−II」を用いた。〕１５０μｌを滴下して、
室温で２時間放置した。 （５）反応終了後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０２重量％の
濃度で含有する生理食塩水で４回洗浄した。 （６）次に、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＣ
Ｈｂマウスモノクローナル抗体（濃度５００ｎｇ／ｍ
ｌ）を１５０μｌ加え、室温で２時間放置した。
【００２５】（７）反応終了後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．
０２重量％の濃度で含有する生理食塩水で４回洗浄し
た。 （８）次に、０．１重量％の濃度でＡＢＴＳ〔２，２’
−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔ
ｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉ
ｄ）〕を含む０．００５重量％のＨ2 Ｏ2 溶液を２００
μｌ添加し、室温で３０分放置した。 （９）反応終了後、発色を比色測定した。測定は、４１
５ｎｍおよび４９２ｎｍにおける吸光度を測定すること
により行ない、その吸光度比（４１５ｎｍ／４９２ｎ
ｍ）を算出し結果を表１に示した。
０２重量％の濃度で含有する生理食塩水で４回洗浄し
た。 （８）次に、０．１重量％の濃度でＡＢＴＳ〔２，２’
−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔ
ｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉ
ｄ）〕を含む０．００５重量％のＨ2 Ｏ2 溶液を２００
μｌ添加し、室温で３０分放置した。 （９）反応終了後、発色を比色測定した。測定は、４１
５ｎｍおよび４９２ｎｍにおける吸光度を測定すること
により行ない、その吸光度比（４１５ｎｍ／４９２ｎ
ｍ）を算出し結果を表１に示した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【発明の効果】本発明のカルバミル化ヘモグロビンの測
定方法の構成は上記の通りであり、本発明を用いると、
カルバミル化ヘモグロビンを高精度にかつ簡便に測定す
ることができる。また、一度に大量の検体を測定するこ
ともできる。
定方法の構成は上記の通りであり、本発明を用いると、
カルバミル化ヘモグロビンを高精度にかつ簡便に測定す
ることができる。また、一度に大量の検体を測定するこ
ともできる。
Claims (1)
- 【請求項１】 固相にカルバミル化ヘモグロビンを含む
検体を反応させた後、抗カルバミル化ヘモグロビン抗体
を反応させ、前記カルバミル化ヘモグロビンを介して固
相に結合された抗カルバミル化ヘモグロビン抗体を測定
することからなることを特徴とするカルバミル化ヘモグ
ロビンの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3022297A JPH10227793A (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | カルバミル化ヘモグロビンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3022297A JPH10227793A (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | カルバミル化ヘモグロビンの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10227793A true JPH10227793A (ja) | 1998-08-25 |
Family
ID=12297702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3022297A Withdrawn JPH10227793A (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | カルバミル化ヘモグロビンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10227793A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014505884A (ja) * | 2011-02-02 | 2014-03-06 | アカデミス ズィーケンハイス レイデン ハー．オー．デー．エン． エルユーエムセー | 抗カルバミル化タンパク質抗体及び関節炎リスク |
| USD880437S1 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Asm Ip Holding B.V. | Gas supply plate for semiconductor manufacturing apparatus |
-
1997
- 1997-02-14 JP JP3022297A patent/JPH10227793A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014505884A (ja) * | 2011-02-02 | 2014-03-06 | アカデミス ズィーケンハイス レイデン ハー．オー．デー．エン． エルユーエムセー | 抗カルバミル化タンパク質抗体及び関節炎リスク |
| USD880437S1 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Asm Ip Holding B.V. | Gas supply plate for semiconductor manufacturing apparatus |
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|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20050304 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20050309 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20050509 |