JPH10201470A

JPH10201470A - 細胞分離方法及び細胞浮遊液

Info

Publication number: JPH10201470A
Application number: JP2451797A
Authority: JP
Inventors: Masaya Sumida; 政哉澄田; Shuji Terajima; 修司寺嶋
Original assignee: Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1997-01-24
Filing date: 1997-01-24
Publication date: 1998-08-04
Anticipated expiration: 2017-01-24
Also published as: JP4412621B2

Abstract

(57)【要約】【課題】簡便な操作且つ短時間で、必要細胞と不要細
胞の混合物から必要細胞を高率に回収する方法と該方法
により得られた細胞浮遊液を提供する。【解決手段】少なくとも回収必要細胞と除去対象細胞
を含む細胞集団を、少なくとも該回収必要細胞を捕捉
し、該除去対象細胞は実質的に通過する手段に導入し、
次に該手段に２ｍＰａ・ｓ以上１０００ｍＰａ・ｓ以下
の粘度を有する液体を導入して、該手段に捕捉されてい
る該回収必要細胞を該手段より剥離し、該回収必要細胞
を回収することを特徴とする細胞分離方法。少なくとも
回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞集団を、少なく
とも該回収必要細胞を捕捉し、該除去対象細胞は実質的
に通過する手段に導入し、次に該手段に２ｍＰａ・ｓ以
上１０００ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有する液体を導入し
て、剥離回収して得られた該回収必要細胞と該液体から
なる細胞浮遊液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する利用分野】本発明は、細胞集団から特定
の細胞を分離するための分離方法と該分離方法により得
られた細胞浮遊液に関する。

【０００２】

【従来の技術】白血病などの造血器腫瘍及び固形癌の化
学療法における副作用である造血障害に対して、骨髄移
植療法が広く施行されている。骨髄移植療法とは、移植
骨髄による致死的造血障害の回復法であるため、患者に
とって致死的な大量放射線及び／又は大量化学療法（以
下、大量化学療法と略す）の施行が可能となり、白血病
や固形癌の治癒につながる。また、近年、骨髄と同様に
末梢血中にも、これらの治療に必要な造血幹細胞が含ま
れていることが明らかになった。通常、これらの細胞の
末梢血中での含有率はかなり低値であり、採取して骨髄
移植の代わりに用いることは困難であるが、抗癌剤及び
／又はＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等のサイ
トカインを投与することにより、その含有率が増大する
ことが明らかにされ、骨髄採取と比べると、全身麻酔が
不要で安全なことから、盛んに臨床応用が行われてい
る。更に近年、臍帯血中には末梢血よりもはるかに高濃
度で造血幹細胞が含有されていることが明らかになり、
臨床応用が始まった。ここで、移植法は細胞の提供者
（ドナー）が誰であるかにより同種移植と自家移植に分
けられる。前者は健康な他人（血縁者又は非血縁者）が
提供者になり、後者は患者自身が提供者となるものであ
る。自家移植においては全てが、また同種移植において
は臍帯血を用いる場合はほとんどが移植まで凍結保存が
行われる。凍結保存の前には、通常赤血球の除去が行わ
れる。これは全血で保存した場合、保存スペースや解凍
時の破壊赤血球による副作用が問題となるためである。
従来、赤血球除去は遠心分離器により行われており、よ
り分離効率を上げたい場合には比重液（例えばファルマ
シア社製Ｆｉｃｏｌｌ）を用いる比重遠心法が採用され
ている。本法は比重液に原料細胞を重層させる際に液面
を乱してはならない等、非常に熟練を要する煩雑な操作
である。特開昭６１−８４５７７号公報、特開平２−１
３４５６４号公報等で操作の煩雑さを解決すべく、多く
の試みがなされているが、比重液を用いるという点では
変わらず、抜本的解決には至っていない。ところで、遠
心分離を用いない赤血球除去法の提案も散見されるよう
になった。特開平８−１０４６４３号公報では赤血球と
造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を含む細胞集団を、
実質的に赤血球は通過し、白血球は捕捉するフィルター
に通液した後、前記通液方法とは逆方向の液流を惹起さ
せ、捕捉された白血球を回収することを特徴とする赤血
球の除去方法が提案されている。しかしながら、特定粘
度の回収液を用いると回収率が向上するとの記載は一切
ない。ところで、特開昭５５−１３０９１７号公報には
フィルター、吸着剤充填カラム等に残留する体液を容器
から回収する際の体液押し出し液として粘度２センチ・
ポイズ（ＣＰ）以上の液体を用いる事を特徴とした体液
の回収方法が開示されている。しかしながら、同公報に
よれば、生理食塩水等の低粘度を用いると、フィルター
内に粘着している細胞をも回収してしまい好ましくな
い。そこで、粘着している細胞を回収しないために高粘
度を用いるとしている。即ち、同公報ではほとんどフィ
ルターを通過し、フィルター内にわずかに残存した体液
を回収するための方法であり、本願とは全く異なる技術
思想である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術の問題点
に鑑み、本発明は簡便な操作且つ短時間で、必要細胞と
不要細胞の混合物から必要細胞を高率に回収する方法、
例えば白血球、血小板、赤血球の混合物から白血球を選
択的に高率に回収する方法と該方法により得られた細胞
浮遊液を提供する事を目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたもの
である。即ち、本発明は少なくとも回収必要細胞と除去
対象細胞を含む細胞集団を、少なくとも該回収必要細胞
を捕捉し、該除去対象細胞は実質的に通過する手段に導
入し、次に該手段に２ｍＰａ・ｓ以上１０００ｍＰａ・
ｓ以下の粘度を有する液体を導入して、該手段に捕捉さ
れている該回収必要細胞を該手段より剥離し、該回収必
要細胞を回収することを特徴とする細胞分離方法であ
る。また、上記２ｍＰａ・ｓ以上１０００ｍＰａ・ｓ以
下の粘度を有する液体が、その後の回収必要細胞の保存
工程においても保存剤として使用されものである細胞分
離方法である。更に少なくとも回収必要細胞と除去対象
細胞を含む細胞集団を、少なくとも該回収必要細胞を捕
捉し、該除去対象細胞は実質的に通過する手段に導入
し、次に該手段に２ｍＰａ・ｓ以上１０００ｍＰａ・ｓ
以下の粘度を有する液体を導入して剥離回収して得られ
た該回収必要細胞と該液体からなる細胞浮遊液である。

【０００５】

【作用】本発明の細胞分離方法においては、２ｍＰａ・
ｓ以上１０００ｍＰａ・ｓ以下という特定の粘度を有す
る液体を回収液として使用することにより、捕捉手段に
捕捉されている必要細胞を高い回収率で、しかも簡単な
操作で且つ短時間に剥離回収することができる。更に特
定粘度を有する回収液に凍結保存液を用いることにより
得られた細胞浮遊液は、そのまま凍結保存ができる。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明に用いる捕捉手段として
は、捕捉材を容器に充填したものや成型容器で、容器内
面に細胞捕捉面が存在するものがあげられる。前記捕捉
材としては水不溶性であればいかなる材質でも使用可能
であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で
好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプリロ
ピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリ
エステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポ
リウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、
酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の
天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミ
ナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金
属があげられる。また、これらの捕捉材はこのままでも
用いることができるが、必要に応じ、アミノ酸、ペプチ
ド、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを
含む）といった特定の細胞に親和性のあるリガンドを固
定してもよい。また、捕捉材の形状としては粒状、繊維
塊、織布、不織布、平板、スポンジ状多孔質体等があげ
られるが、体積あたりの表面積が大きいという点で粒
状、繊維塊、織布、不織布が好ましい。また、成型容器
で、容器内面に細胞捕捉面が存在するものとしては、フ
ラスコ、ディッシュ、コニカルチューブ、シリンジ等が
あげられる。本発明における少なくとも回収必要細胞と
除去対象細胞を含む細胞集団の例としては、骨髄、末梢
血、臍帯血あるいはこれらを遠心分離器等により粗分離
したものがあげられる。また、回収必要細胞と除去対象
細胞の組合せの例をいくつか示す。回収必要細胞が白血
球であり、除去対象細胞が赤血球、血小板の場合、白血
球は捕捉手段に捕捉され、赤血球、血小板は通過し、本
発明による特定粘度を有する液体により、捕捉手段に捕
捉されている白血球が回収される。また、回収必要細胞
がリンパ球であり、除去対象細胞が赤血球、血小板、顆
粒球、単球の場合、白血球（顆粒球＋単球＋リンパ球）
は捕捉手段に捕捉され、赤血球、血小板は通過し、本発
明による特定粘度を有する液体により捕捉手段に捕捉さ
れている白血球のうちリンパ球のみが回収される。ま
た、回収必要細胞がＣＤ３４陽性細胞であり、除去対象
細胞が赤血球、血小板、ＣＤ３４陰性細胞である場合、
ＣＤ３４陽性細胞は捕捉手段に捕捉され、赤血球、血小
板、ＣＤ３４陰性細胞は通過し、本発明による特定粘度
を有する液体により捕捉手段に捕捉されているＣＤ３４
陽性細胞が回収される。本発明においては捕捉手段に捕
捉されている細胞を特定粘度を有する液体で回収するも
のであるが、この粘度としては２ｍＰａ・ｓ以上１００
０ｍＰａ・ｓ以下、好ましくは５ｍＰａ・ｓ以上５００
ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上２
００ｍＰａ・ｓ以下である。粘度が２ｍＰａ・ｓ未満で
は回収率は低く、１０００ｍＰａ・ｓを超えるとたとえ
ポンプを用いたとしても、通液が著しく困難となり、作
業性が劣る。また、圧力の上昇が起こりフィルターとチ
ューブ等の接続部がはずれる可能性もあり危険である。
成分としては細胞への悪影響が少ないものが好ましい。
いくつか例示するとポリエチレングリコール、ポリビニ
ルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子溶
液、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルデ
ンプン、デキストラン、キチン誘導体、コラーゲン、フ
ァイブロネクチン、アルブミン、グロブリン等の天然高
分子溶液、グルコース、サッカロース、マルトース、ソ
ルビトール、グリセリン、ジメチルスルホキシド等の有
機物溶液及びこれらの混合物があげられる。また、これ
らを溶かす溶媒としては生理食塩水、Ｄ−ＰＢＳ（ダル
ベッコリン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）など
の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培地があげられる。

【０００７】また、本発明による特定の粘度を有する液
体はこのまま凍結保存または液状保存に用いられるもの
であることがより好ましい。即ち、幹細胞の凍結保存を
例にあげると、通常、前述のＦｉｃｏｌｌ法等により赤
血球が分離された細胞集団を洗浄後、凍結保存剤を添加
して細胞浮遊液を調製し、これを液体窒素中あるいは冷
凍庫内で凍結保存を行うが、本発明においては特定の粘
度を有する液体に凍結保存剤を用いることにより、赤血
球除去後に煩雑な操作を加えることなく、凍結保存用の
細胞浮遊液とすることができる。本発明による特定の粘
度を有する液体を捕捉手段に通液する方法としては、ポ
ンプの利用、シリンジによる注入、液体を貯留したバッ
グを押しつぶしで液流を惹起する方法、落差による方法
があげられる。また、液体流入口と液体流出口が別々の
容器からなる捕捉手段の場合は、原料血液の通液方向と
同一の方向で回収液を通液するか、逆方向で通液するか
に分かれるが、一般的に逆方向の方が回収率が高い傾向
がある。更に、単純に通液するだけでなく、捕捉手段に
振動を加えたり、ストップドフローにしても良い。ま
た、液体流入口と液体流出口が同一の場合、例えばフラ
スコの場合は、フラスコに本発明による特定の粘度を有
する液体をピペット等で導入してから、フラスコ本体を
振る、あるいは機械的・超音波振動を加えることで細胞
を回収する。

【０００８】

【実施例】以下に実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。

【実施例１】細胞分離器の作製容器寸法４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入
口を対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側に
平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布１２枚を、出
口側に平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布２５
枚を充填した。なお、本フィルターの充填密度は０．２
ｇ／ｃｍ³であった。また、このフィルターに血小板通
過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティング
を行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジ
メチルアミノエチルメタクリレート共重合体の１％エタ
ノール溶液を該フィルターの液体流入口から通液した
後、窒素ガスを通して乾燥させた。細胞分離操作で作製した細胞分離器に末梢全血５０ｍｌを液体流入
口から落差（流速約５ｍｌ／分）により通液した後、フ
ィルター内に残存する赤血球、血小板を洗流する目的で
生理食塩水３０ｍｌを通液した。その後、３．５％ポリ
ビニルピロリドン（平均分子量３６万）水溶液３０ｍｌ
を液体流出口からポンプを用いて１００ｍｌ／分で通液
し、液体流入口から細胞を回収した。なお、本回収液の
粘度は２０．３ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作で
の白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞ
れ７５％、９９％、９８％であった。なお、回収率、除
去率の算出方法は以下のとおりである。回収率（％）＝１００×（分離後細胞数／分離前細胞
数）除去率（％）＝１００−１００×（分離後細胞数／分離
前細胞数）

【０００９】

【実施例２】細胞分離器の作製実施例１と同様の細胞分離器を用いた。細胞分離操作３．５％ポリビニルピロリドン水溶液の代わりに４０％
牛血清アルブミン生理食塩水溶液を用いた以外は実施例
１と同様な操作を行った。なお、本回収液の粘度は１
７．２ｍＰａ・ｓであった。本細胞分離操作での白血球
回収率、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ９８
％、９５％、８０％であった。

【００１０】

【実施例３】細胞分離器の作製実施例１と同様の細胞分離器を用いた。細胞分離操作３．５％ポリビニルピロリドン水溶液の代わりに市販の
凍結保存剤（極東製薬製「ＣＰ−１」、ヒドロキシエチ
ルデンプン約１８％、ジメチルスルホキシド約１５％）
を用いる以外は実施例１と同様な操作を行った。なお、
本回収液の粘度は３１．８ｍＰａ・ｓであった。本細胞
分離操作での白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去
率はそれぞれ７５％、９６％、８８％であった。なお、
本回収液で回収された細胞はその後、前述の凍結保存剤
に添付されていたプロトコールにより凍結保存が可能で
あった。

【００１１】

【実施例４】細胞分離器の作製実施例１と同様の細胞分離器を用いた。細胞分離操作３．５％ポリビニルピロリドン水溶液の代わりに市販の
ヒドロキシエチルデンプン生理食塩水溶液（ルセル森下
製「６−ＨＥＳ」）に牛血清アルブミンを２５％になる
ように添加した液体を用いる以外は実施例１と同様な操
作を行った。なお、本回収液の粘度は１７．４ｍＰａ・
ｓであった。本細胞分離操作での白血球回収率、赤血球
除去率、血小板除去率はそれぞれ７４％、９６％、９８
％であった。なお、本回収液で回収された細胞はその
後、実施例３の凍結保存剤に添付されていたプロトコー
ルと同様な操作で凍結保存が可能であった。

【００１２】

【実施例５】細胞分離器の作製容器寸法４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入
口を対角線上にもつポリカーボネート製容器の入口側に
平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布１２枚を、出
口側に平均繊維径２．３μｍのマウス抗ヒトＣＤ３４モ
ノクローナル抗体固定ポリエステル不織布２５枚を充填
した。本フィルターの充填密度は０．２ｇ／ｃｍ³であ
った。なお、マウス抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体
のポリスチレンへの固定は特開平２−２６１８３３号公
報で提案されている公知のハロアセトアミド法にて行っ
た。細胞分離操作で作製した細胞分離器に臍帯全血５０ｍｌを液体流入
口から落差（流速約５ｍｌ／分）で通液した後、フィル
ター内に残存する赤血球、血小板、ＣＤ３４陰性細胞を
洗流する目的で生理食塩水３０ｍｌを通液した。その
後、市販の凍結保存剤（極東製薬製「ＣＰ−１」）に同
凍結保存剤の使用説明書に従い、２５％ヒト血清アルブ
ミン溶液を添加したもの（１２％ヒドロキシエチルデン
プン、１０％ジメチルスルホキシド、８％ヒト血清アル
ブミン）を液体流出口からポンプを用いて１００ｍｌ／
分で通液し、液体流入口から細胞を回収した。なお、本
回収液の粘度は１９．０ｍＰａ・ｓであった。本細胞分
離操作でのＣＤ３４陽性細胞回収率、ＣＤ３４陽性細胞
純度、赤血球除去率、血小板除去率はそれぞれ８０％、
９３％、９８％、９８％であった。なお、本回収液で回
収された細胞は前述の凍結保存剤に添付されていたプロ
トコールにより凍結保存が可能であった。

【００１３】

【比較例１】細胞分離器の作製実施例１と同様の細胞分離器を用いた。細胞分離操作３．５％ポリビニルピロリドン水溶液の代わりに生理食
塩水を用いる以外は実施例１と同様な操作を行った。な
お、本回収液の粘度は１．０ｍＰａ・ｓであった。本細
胞分離操作での白血球回収率、赤血球除去率、血小板除
去率はそれぞれ３１％、９９％、９５％であり、白血球
回収率が低値であった。

【００１４】

【比較例２】細胞分離器の作製実施例５と同様の細胞分離器を用いた。細胞分離操作市販の凍結保存剤にヒト血清アルブミンを添加したもの
の代わりに生理食塩水を用いる以外は実施例５と同様な
操作を行った。なお、本回収液の粘度は１．０ｍＰａ・
ｓであった。本細胞分離操作でのＣＤ３４陽性細胞回収
率、ＣＤ３４陽性細胞純度、赤血球除去率、血小板除去
率はそれぞれ１０％、７３％、９９％、９９％であっ
た。表１に結果のまとめを示す。

【００１５】

【発明の効果】以上示したように、本発明による細胞分
離方法は簡便な操作且つ短時間で、必要細胞と不要細胞
の混合物から必要細胞を高率に回収することができ、ま
た得られた細胞浮遊液はその後の煩雑な細胞浮遊液調製
操作を経ることなく凍結保存が可能なので、造血幹細胞
移植分野や養子免疫療法分野の細胞処理工程における省
力化に貢献するところ大である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも回収必要細胞と除去対象細胞
を含む細胞集団を、少なくとも該回収必要細胞を捕捉
し、該除去対象細胞は実質的に通過する手段に導入し、
次に該手段に２ｍＰａ・ｓ以上１０００ｍＰａ・ｓ以下
の粘度を有する液体を導入して、該手段に捕捉されてい
る該回収必要細胞を該手段より剥離し、該回収必要細胞
を回収することを特徴とする細胞分離方法。
【請求項２】２ｍＰａ・ｓ以上１０００ｍＰａ・ｓ以
下の粘度を有する液体が、該回収必要細胞の保存剤とし
て使用し得るものである請求項１記載の細胞分離方法。
【請求項３】少なくとも回収必要細胞と除去対象細胞
を含む細胞集団を、少なくとも該回収必要細胞を捕捉
し、該除去対象細胞は実質的に通過する手段に導入し、
次に該手段に２ｍＰａ・ｓ以上１０００ｍＰａ・ｓ以下
の粘度を有する液体を導入して、剥離回収して得られた
該回収必要細胞と該液体からなる細胞浮遊液。