JPH10197480A - 電気泳動装置及び方法 - Google Patents
電気泳動装置及び方法Info
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- JPH10197480A JPH10197480A JP9003591A JP359197A JPH10197480A JP H10197480 A JPH10197480 A JP H10197480A JP 9003591 A JP9003591 A JP 9003591A JP 359197 A JP359197 A JP 359197A JP H10197480 A JPH10197480 A JP H10197480A
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- capillary
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- dna
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ＤＮＡ塩基配列決定の際の反応工程に要求され
る試料量及び試薬量を低減させ、ランニングコストを抑
える。 【解決手段】キャピラリの両端に高電圧を印加し、キャ
ピラリに導入した試料を分離する電気泳動装置におい
て、同一のキャピラリ内で、反応工程及び分離・検出工
程を行わせる。
る試料量及び試薬量を低減させ、ランニングコストを抑
える。 【解決手段】キャピラリの両端に高電圧を印加し、キャ
ピラリに導入した試料を分離する電気泳動装置におい
て、同一のキャピラリ内で、反応工程及び分離・検出工
程を行わせる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は電気泳動装置及び方
法に関する。
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡ塩基配列決定装置の従来例はパー
キンエルマ社のPRISMTM377等が報告されている。また、
そのための反応装置はパーキンエルマ社のCATALYSTTM80
0やAmersham社のＤＮＡラボステーション６２５等が報
告されている。ＤＮＡ塩基配列決定装置は、試料をＤＮ
Ａポリメラーゼ，蛍光プライマ，デオキシヌクレオシド
三リン酸，ジデオキシヌクレオシド三リン酸からなる試
薬と反応させた後に、スラブゲル内に電気泳動させ蛍光
検出によりＤＮＡ塩基配列を決定させるものである。
キンエルマ社のPRISMTM377等が報告されている。また、
そのための反応装置はパーキンエルマ社のCATALYSTTM80
0やAmersham社のＤＮＡラボステーション６２５等が報
告されている。ＤＮＡ塩基配列決定装置は、試料をＤＮ
Ａポリメラーゼ，蛍光プライマ，デオキシヌクレオシド
三リン酸，ジデオキシヌクレオシド三リン酸からなる試
薬と反応させた後に、スラブゲル内に電気泳動させ蛍光
検出によりＤＮＡ塩基配列を決定させるものである。
【０００３】従来例を含め通例は、試料と試薬との反応
をマイクロチューブ内で行わせており、これに費やす試
料量として２μｌ，試薬としても２μｌ程度が必要であ
る。一方、ルーチンで分析する際の課題として、すなわ
ち、ランニングコストの低減が挙げられる。消費試薬量
の低減が強く要求されている。
をマイクロチューブ内で行わせており、これに費やす試
料量として２μｌ，試薬としても２μｌ程度が必要であ
る。一方、ルーチンで分析する際の課題として、すなわ
ち、ランニングコストの低減が挙げられる。消費試薬量
の低減が強く要求されている。
【０００４】近年、高スループット化を目的にスラブゲ
ルをゲル充填キャピラリに替えた分離技術も報告されて
いる（特開平6−138037 号公報）。反応等はスラブゲル
のものと同様だが、キャピラリでは使用するゲルの断面
積が小さいので分析する試料の量を約百分の一と大幅に
減らすことができる。しかしながら、分離泳動をキャピ
ラリで行う場合、実際にキャピラリに注入する反応済み
試料量は数ｎｌであっても、マイクロチューブ内での反
応が大きなスケールで行われるので、調整された試料の
殆どは捨てられることになる。
ルをゲル充填キャピラリに替えた分離技術も報告されて
いる（特開平6−138037 号公報）。反応等はスラブゲル
のものと同様だが、キャピラリでは使用するゲルの断面
積が小さいので分析する試料の量を約百分の一と大幅に
減らすことができる。しかしながら、分離泳動をキャピ
ラリで行う場合、実際にキャピラリに注入する反応済み
試料量は数ｎｌであっても、マイクロチューブ内での反
応が大きなスケールで行われるので、調整された試料の
殆どは捨てられることになる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡ塩基
配列決定の際の反応工程に要求される試料量及び試薬量
を低減させ、ランニングコストを抑えることが課題であ
る。
配列決定の際の反応工程に要求される試料量及び試薬量
を低減させ、ランニングコストを抑えることが課題であ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、ＤＮＡ試料と試薬との反応を微細なキャピラリ管内
で行わせ、その後同一キャピラリで分離・検出工程を行
わせる。キャピラリの内径は７５〜１００μであるから
実際に注入・泳動される試料・試薬はナノリットルオー
ダである。しかし、キャピラリへの注入前に、試料・試
薬の反応をマイクロチューブで行わせる場合の必要量は
２〜４マイクロリットル必要である。よって、反応をキ
ャピラリ内で行わせることで試料量及び反応試薬量の大
幅な低減ができる。
に、ＤＮＡ試料と試薬との反応を微細なキャピラリ管内
で行わせ、その後同一キャピラリで分離・検出工程を行
わせる。キャピラリの内径は７５〜１００μであるから
実際に注入・泳動される試料・試薬はナノリットルオー
ダである。しかし、キャピラリへの注入前に、試料・試
薬の反応をマイクロチューブで行わせる場合の必要量は
２〜４マイクロリットル必要である。よって、反応をキ
ャピラリ内で行わせることで試料量及び反応試薬量の大
幅な低減ができる。
【０００７】具体的には、試料分離部としてゲル充填キ
ャピラリを用い、キャピラリ両端に電圧を印加できるよ
うにした電気泳動装置及び方法において、（１）キャピ
ラリの試料注入側に試料及び試薬を注入できるような電
圧印加機構を設け、（２）キャピラリの注入側にＤＮＡ
ポリメラーゼ反応可能な温度制御機構を設け、（３）反
応終了後に試料が分離用キャピラリ中を泳動できるよう
に試料注入側キャピラリを泳動用陰極電界槽に浸けて電
圧印加する機構を設け、（４）分離用キャピラリの注入
側でない側でレーザ光を照射して発生する蛍光をフォト
マルチプライア（光電子増倍管）やフォトダイオードア
レイ，ＣＣＤカメラ等の検出器で時間毎の蛍光を検出す
る。この結果に基づき試料の塩基配列を決定する。
ャピラリを用い、キャピラリ両端に電圧を印加できるよ
うにした電気泳動装置及び方法において、（１）キャピ
ラリの試料注入側に試料及び試薬を注入できるような電
圧印加機構を設け、（２）キャピラリの注入側にＤＮＡ
ポリメラーゼ反応可能な温度制御機構を設け、（３）反
応終了後に試料が分離用キャピラリ中を泳動できるよう
に試料注入側キャピラリを泳動用陰極電界槽に浸けて電
圧印加する機構を設け、（４）分離用キャピラリの注入
側でない側でレーザ光を照射して発生する蛍光をフォト
マルチプライア（光電子増倍管）やフォトダイオードア
レイ，ＣＣＤカメラ等の検出器で時間毎の蛍光を検出す
る。この結果に基づき試料の塩基配列を決定する。
【０００８】尚、（１）において、試薬及び試料は全て
負電荷を持つので、分離用キャピラリ両端に注入側が低
くなるような高電圧を掛ければ試薬・試料がキャピラリ
に注入できる。分離用キャピラリの試料注入側は、時間
ごとに、試料槽，試薬槽、更に泳動用陰極電極槽に浸け
替えられる構造にするのが良い。分離用キャピラリが試
薬，試料及び泳動用陰極電極槽間を順次移動できるよう
にベルトコンベアやターンテーブルを設けても良い。試
薬に含まれる蛍光標識プライマは１色分のプライマを用
いても良いし、４色分が各々異なる蛍光となるターミネ
ータを用いても良い。また、試料と試薬の混合は、注入
前に予め混合しておいても良いし、試料，試薬順に注
入、もしくは試薬，試料順に注入しても良く、混合せず
に注入した場合キャピラリ内で自然混合させても良い
し、注入後キャピラリに逆電圧を短時間かけて混合させ
ても良い。また、用いる分離用キャピラリの本数は１本
でも複数本でも良く、好ましくは試薬・試料の反応が起
きやすいように、分離用キャピラリ注入側にはゲルを充
填しないようにしておく。
負電荷を持つので、分離用キャピラリ両端に注入側が低
くなるような高電圧を掛ければ試薬・試料がキャピラリ
に注入できる。分離用キャピラリの試料注入側は、時間
ごとに、試料槽，試薬槽、更に泳動用陰極電極槽に浸け
替えられる構造にするのが良い。分離用キャピラリが試
薬，試料及び泳動用陰極電極槽間を順次移動できるよう
にベルトコンベアやターンテーブルを設けても良い。試
薬に含まれる蛍光標識プライマは１色分のプライマを用
いても良いし、４色分が各々異なる蛍光となるターミネ
ータを用いても良い。また、試料と試薬の混合は、注入
前に予め混合しておいても良いし、試料，試薬順に注
入、もしくは試薬，試料順に注入しても良く、混合せず
に注入した場合キャピラリ内で自然混合させても良い
し、注入後キャピラリに逆電圧を短時間かけて混合させ
ても良い。また、用いる分離用キャピラリの本数は１本
でも複数本でも良く、好ましくは試薬・試料の反応が起
きやすいように、分離用キャピラリ注入側にはゲルを充
填しないようにしておく。
【０００９】（２）については、サンガー等のジデオキ
シ法、つまり、鋳型ＤＮＡを基に相補性ＤＮＡを合成さ
せるＤＮＡポリメラーゼ反応を利用する。ここで、相補
性について説明する。ＤＮＡの塩基は、アデニン
（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ），グアニン
（Ｇ）の４種類があり、これらの塩基はアデニンとチミ
ン，シトシンとグアニンがそれぞれ対になる性質を持
つ。これが塩基の相補性である。次に、ＤＮＡポリメラ
ーゼ反応について説明する。ＤＮＡの基本構造は、リン
酸，塩基、及び五炭糖を一単位とし、この一単位がつな
がってＤＮＡ鎖となり、更にこのＤＮＡ鎖と相補性の鎖
の計２本のＤＮＡ鎖が二重螺旋状になっている。ＤＮＡ
ポリメラーゼ反応とは、二重螺旋のＤＮＡ鎖を加熱処理
等で一本鎖とし、相補性ＤＮＡ鎖を合成して再び二重螺
旋ＤＮＡ鎖とするものである。すなわち、鋳型ＤＮＡと
試薬を混合してＤＮＡポリメラーゼ反応させると、鋳型
ＤＮＡのアデニンを持つ単位にはチミンを持つ単位が、
チミンを持つ単位にはアデニンを持つ単位が、シトシン
を持つ単位にはグアニンを持つ単位が、グアニンを持つ
単位にはシトシンを持つ単位がそれぞれ合成される。具
体的には、まず、加熱して１本鎖とした鋳型ＤＮＡにポ
リメラーゼ反応開始部分となるプライマを付ける。プラ
イマとは、鋳型ＤＮＡの一部分と相補性を示すＤＮＡ断
片である。次に、DNAポリメラーゼの活動により、デオ
キシヌクレオシド三リン酸を用いて相補性DNAが合成さ
れる。ここで、デオキシヌクレオシド三リン酸の代わり
にジデオキシヌクレオシド三リン酸が用いられるとそこ
で反応が停止する。ジデオキシヌクレオシド三リン酸は
３′水酸基を欠くため、ＤＮＡポリメラーゼがデオキシ
ヌクレオシド三リン酸を取り込むと、次のリン酸エステ
ル結合に必要な３′水酸基が水素に置き換わっているた
めである。例えば、鋳型ＤＮＡのアデニン塩基を持つ単
位に、チミンを持つデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄ
ＴＴＰ）が用いられれば反応してチミン塩基を持つ単位
が作られ反応が継続するが、チミンを持つジデオキシヌ
クレオシド三リン酸（ｄｄＴＴＰ）が使われるとチミン
塩基を持つ単位が作られた時点で反応が終了する。ここ
で、鋳型となるＤＮＡ断片は、複製された相当数を用い
ており、鋳型ＤＮＡのどの塩基部分で反応が止まるかは
ほぼ同確率である。すなわち、あらゆる塩基部分で反応
が止まった相補性ＤＮＡが合成される、言い換えれば、
あらゆる塩基長の相補性ＤＮＡが合成されることとな
る。
シ法、つまり、鋳型ＤＮＡを基に相補性ＤＮＡを合成さ
せるＤＮＡポリメラーゼ反応を利用する。ここで、相補
性について説明する。ＤＮＡの塩基は、アデニン
（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ），グアニン
（Ｇ）の４種類があり、これらの塩基はアデニンとチミ
ン，シトシンとグアニンがそれぞれ対になる性質を持
つ。これが塩基の相補性である。次に、ＤＮＡポリメラ
ーゼ反応について説明する。ＤＮＡの基本構造は、リン
酸，塩基、及び五炭糖を一単位とし、この一単位がつな
がってＤＮＡ鎖となり、更にこのＤＮＡ鎖と相補性の鎖
の計２本のＤＮＡ鎖が二重螺旋状になっている。ＤＮＡ
ポリメラーゼ反応とは、二重螺旋のＤＮＡ鎖を加熱処理
等で一本鎖とし、相補性ＤＮＡ鎖を合成して再び二重螺
旋ＤＮＡ鎖とするものである。すなわち、鋳型ＤＮＡと
試薬を混合してＤＮＡポリメラーゼ反応させると、鋳型
ＤＮＡのアデニンを持つ単位にはチミンを持つ単位が、
チミンを持つ単位にはアデニンを持つ単位が、シトシン
を持つ単位にはグアニンを持つ単位が、グアニンを持つ
単位にはシトシンを持つ単位がそれぞれ合成される。具
体的には、まず、加熱して１本鎖とした鋳型ＤＮＡにポ
リメラーゼ反応開始部分となるプライマを付ける。プラ
イマとは、鋳型ＤＮＡの一部分と相補性を示すＤＮＡ断
片である。次に、DNAポリメラーゼの活動により、デオ
キシヌクレオシド三リン酸を用いて相補性DNAが合成さ
れる。ここで、デオキシヌクレオシド三リン酸の代わり
にジデオキシヌクレオシド三リン酸が用いられるとそこ
で反応が停止する。ジデオキシヌクレオシド三リン酸は
３′水酸基を欠くため、ＤＮＡポリメラーゼがデオキシ
ヌクレオシド三リン酸を取り込むと、次のリン酸エステ
ル結合に必要な３′水酸基が水素に置き換わっているた
めである。例えば、鋳型ＤＮＡのアデニン塩基を持つ単
位に、チミンを持つデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄ
ＴＴＰ）が用いられれば反応してチミン塩基を持つ単位
が作られ反応が継続するが、チミンを持つジデオキシヌ
クレオシド三リン酸（ｄｄＴＴＰ）が使われるとチミン
塩基を持つ単位が作られた時点で反応が終了する。ここ
で、鋳型となるＤＮＡ断片は、複製された相当数を用い
ており、鋳型ＤＮＡのどの塩基部分で反応が止まるかは
ほぼ同確率である。すなわち、あらゆる塩基部分で反応
が止まった相補性ＤＮＡが合成される、言い換えれば、
あらゆる塩基長の相補性ＤＮＡが合成されることとな
る。
【００１０】この反応であらゆる塩基数の相補性ＤＮＡ
が合成されることを説明した。合成されたＤＮＡは後に
分離用に電気泳動され、塩基数の少ない断片順に検出さ
れる。ここで、合成されたＤＮＡの末端塩基ごとに波長
の異なる蛍光色素を付けておけば、合成ＤＮＡの塩基配
列がわかり、合成ＤＮＡと鋳型ＤＮＡは相補性であるた
め、鋳型ＤＮＡの塩基配列が決定できる。例えば、蛍光
体としてフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）を用いる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸の塩基
毎に異なる波長となるよう４種の蛍光色素を選定し、ジ
デオキシヌクレオシド三リン酸に付けておく。これで、
種々の長さで末端塩基毎に異なる蛍光波長を出すＤＮＡ
断片が合成される。反応を温度精度の良い状態で行わせ
るため、制御部周辺に断熱材を設けても良いし、キャピ
ラリ内の試料及び試薬への熱伝導を上げるためにキャピ
ラリをアルミブロック等の熱伝導体で覆っても良い。加
熱及び冷却を行うプログラムを利用しても良い。
が合成されることを説明した。合成されたＤＮＡは後に
分離用に電気泳動され、塩基数の少ない断片順に検出さ
れる。ここで、合成されたＤＮＡの末端塩基ごとに波長
の異なる蛍光色素を付けておけば、合成ＤＮＡの塩基配
列がわかり、合成ＤＮＡと鋳型ＤＮＡは相補性であるた
め、鋳型ＤＮＡの塩基配列が決定できる。例えば、蛍光
体としてフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）を用いる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸の塩基
毎に異なる波長となるよう４種の蛍光色素を選定し、ジ
デオキシヌクレオシド三リン酸に付けておく。これで、
種々の長さで末端塩基毎に異なる蛍光波長を出すＤＮＡ
断片が合成される。反応を温度精度の良い状態で行わせ
るため、制御部周辺に断熱材を設けても良いし、キャピ
ラリ内の試料及び試薬への熱伝導を上げるためにキャピ
ラリをアルミブロック等の熱伝導体で覆っても良い。加
熱及び冷却を行うプログラムを利用しても良い。
【００１１】
（実施例１）本実施例では、試料を分離用キャピラリ内
で蛍光標識し、電気泳動により分子量分離し、蛍光検出
により塩基配列決定する。
で蛍光標識し、電気泳動により分子量分離し、蛍光検出
により塩基配列決定する。
【００１２】さて、図１に本発明の主要構成図を示す。
試料分離キャピラリとして１本のシリカ製キャピラリ１
を使用する。これらは、内径１００μ，外径３７５μ，
長さ４０cmのシリカ製キャピラリである。キャピラリの
外壁はポリイミド樹脂でコーティングされ柔軟性が付与
されている。キャピラリの内部を洗浄し、シランカップ
リング処理をする。次いで、脱気した３.８４％のアク
リルアミド，０.１６％のビスアクリルアミド，７Ｍの
尿素，２ｍＭのＥＤＴＡを含むトリス，ほう酸緩衝液に
テトラメチルエチルジアミン，過硫酸アンモニウム溶液
を加えてキャピラリに注入して重合させ、アクリルアミ
ドゲルを作製する。キャピラリはシランカップリング処
理されているため、アクリルアミドゲルとキャピラリは
化学的に結合しており、泳動時にキャピラリからゲルが
出ることがない。尚、分離用キャピラリ１の検出部２は
レーザ光３が入射できるよう外壁の樹脂を除去してお
く。方法は、ゲル充填前に除去部分を加熱し水で濡らし
た紙等で拭けば容易に除去できる。また、注入側の外壁
は、試薬槽４，試料槽５、及び陰極電界槽６と結合する
ため、洗浄を十分に行っておく。更に、分離用キャピラ
リ１の注入側は、注入後に試料と試薬とを混合し反応さ
せるので、望ましくは、ゲルがなくＴＢＥ緩衝液のみが
充填された状態となるようにする。ここで、ＴＢＥ緩衝
液とは、トリス，ほう酸，ＥＤＴＡを含む緩衝液を示し
ている。
試料分離キャピラリとして１本のシリカ製キャピラリ１
を使用する。これらは、内径１００μ，外径３７５μ，
長さ４０cmのシリカ製キャピラリである。キャピラリの
外壁はポリイミド樹脂でコーティングされ柔軟性が付与
されている。キャピラリの内部を洗浄し、シランカップ
リング処理をする。次いで、脱気した３.８４％のアク
リルアミド，０.１６％のビスアクリルアミド，７Ｍの
尿素，２ｍＭのＥＤＴＡを含むトリス，ほう酸緩衝液に
テトラメチルエチルジアミン，過硫酸アンモニウム溶液
を加えてキャピラリに注入して重合させ、アクリルアミ
ドゲルを作製する。キャピラリはシランカップリング処
理されているため、アクリルアミドゲルとキャピラリは
化学的に結合しており、泳動時にキャピラリからゲルが
出ることがない。尚、分離用キャピラリ１の検出部２は
レーザ光３が入射できるよう外壁の樹脂を除去してお
く。方法は、ゲル充填前に除去部分を加熱し水で濡らし
た紙等で拭けば容易に除去できる。また、注入側の外壁
は、試薬槽４，試料槽５、及び陰極電界槽６と結合する
ため、洗浄を十分に行っておく。更に、分離用キャピラ
リ１の注入側は、注入後に試料と試薬とを混合し反応さ
せるので、望ましくは、ゲルがなくＴＢＥ緩衝液のみが
充填された状態となるようにする。ここで、ＴＢＥ緩衝
液とは、トリス，ほう酸，ＥＤＴＡを含む緩衝液を示し
ている。
【００１３】次に、キャピラリへの試薬の注入について
図１を用いて説明する。試薬槽４には、ＤＮＡポリメラ
ーゼ，プライマ，４種のデオキシヌクレオシド三リン酸
（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ），４種毎
に異なる波長の蛍光色素が結合されたジデオキシヌクレ
オシド三リン酸（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴ
Ｐ，ｄｄＧＴＰ）を入れておく。分離用キャピラリ１を
試薬槽４に挿入し、陰極電極７を試薬槽４側に付け、分
離用キャピラリ１の他端を陽極電界槽８に挿入し、高圧
電源９を接続して分離用キャピラリ１の両端に高圧をか
けて試薬槽４中の試薬を分離用キャピラリ１に注入する
（図１(ａ)）。
図１を用いて説明する。試薬槽４には、ＤＮＡポリメラ
ーゼ，プライマ，４種のデオキシヌクレオシド三リン酸
（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ），４種毎
に異なる波長の蛍光色素が結合されたジデオキシヌクレ
オシド三リン酸（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴ
Ｐ，ｄｄＧＴＰ）を入れておく。分離用キャピラリ１を
試薬槽４に挿入し、陰極電極７を試薬槽４側に付け、分
離用キャピラリ１の他端を陽極電界槽８に挿入し、高圧
電源９を接続して分離用キャピラリ１の両端に高圧をか
けて試薬槽４中の試薬を分離用キャピラリ１に注入する
（図１(ａ)）。
【００１４】更に、試料となるＤＮＡ断片を注入する。
分離用キャピラリ１を試料槽５に挿入する。試料槽５に
は試料が入っている。試料槽５に設置した陰極電極７と
陽極電界槽８との間に高圧電源９により印加電圧をか
け、試料を分離用キャピラリ１に注入する（図１
(ｂ)）。
分離用キャピラリ１を試料槽５に挿入する。試料槽５に
は試料が入っている。試料槽５に設置した陰極電極７と
陽極電界槽８との間に高圧電源９により印加電圧をか
け、試料を分離用キャピラリ１に注入する（図１
(ｂ)）。
【００１５】この状態で、分離用キャピラリ１の注入側
には試薬と試料が注入されている。数分間静置して試薬
と試料を拡散混合させた後（図１(ｃ)）、試薬と試料を
反応させる。分離用キャピラリ１の注入側に、温度制御
機構１０によりポリメラーゼ反応させる温度をかける。
試薬は、合成されたＤＮＡ断片の末端ごとに異なる波長
の蛍光が出せるように設計されているので、反応によ
り、種々の長さで末端塩基毎に異なる蛍光波長を出すＤ
ＮＡ断片が合成される（図１(ｂ)）。蛍光は反応後速や
かに出る必要はなく、検出部でレーザ光により励起され
た時に発すれば良い。
には試薬と試料が注入されている。数分間静置して試薬
と試料を拡散混合させた後（図１(ｃ)）、試薬と試料を
反応させる。分離用キャピラリ１の注入側に、温度制御
機構１０によりポリメラーゼ反応させる温度をかける。
試薬は、合成されたＤＮＡ断片の末端ごとに異なる波長
の蛍光が出せるように設計されているので、反応によ
り、種々の長さで末端塩基毎に異なる蛍光波長を出すＤ
ＮＡ断片が合成される（図１(ｂ)）。蛍光は反応後速や
かに出る必要はなく、検出部でレーザ光により励起され
た時に発すれば良い。
【００１６】更に、陰極電極槽６に分離用キャピラリ１
の注入側及び陰極電極７を入れ、陰極電極槽６と陽極電
界槽８との間に高圧電源９により泳動電圧を印加すれ
ば、試料は分離用キャピラリ１中を分子量の少ない順に
泳動される。分離用キャピラリ１の検出部２にレーザ光
３を照射し標識ターミネータを励起して蛍光を発光さ
せ、検出器１１で泳動順に読み取ることにより各塩基の
試料中における位置を計測する。読み取り結果はデータ
処理ユニット１２で解析され、ＤＮＡの塩基配列を決定
することができる。ここで、陽極電界槽８に満たされて
いるのはＴＢＥ緩衝液であり、ＴＢＥ緩衝液は試薬槽４
中、試料槽５、及び陰極電界槽６中にも含まれて溶媒及
び電解液となっている。また、分離用キャピラリ１を試
薬槽４，試料槽５、及び陰極電界槽６に順次浸けるため
に、試薬槽４，試料槽５、及び陰極電界槽６をターンテ
ーブル１３上に乗せ、分離用キャピラリ１を横方向に移
動させずに別の槽に入れられるようにしてある。
の注入側及び陰極電極７を入れ、陰極電極槽６と陽極電
界槽８との間に高圧電源９により泳動電圧を印加すれ
ば、試料は分離用キャピラリ１中を分子量の少ない順に
泳動される。分離用キャピラリ１の検出部２にレーザ光
３を照射し標識ターミネータを励起して蛍光を発光さ
せ、検出器１１で泳動順に読み取ることにより各塩基の
試料中における位置を計測する。読み取り結果はデータ
処理ユニット１２で解析され、ＤＮＡの塩基配列を決定
することができる。ここで、陽極電界槽８に満たされて
いるのはＴＢＥ緩衝液であり、ＴＢＥ緩衝液は試薬槽４
中、試料槽５、及び陰極電界槽６中にも含まれて溶媒及
び電解液となっている。また、分離用キャピラリ１を試
薬槽４，試料槽５、及び陰極電界槽６に順次浸けるため
に、試薬槽４，試料槽５、及び陰極電界槽６をターンテ
ーブル１３上に乗せ、分離用キャピラリ１を横方向に移
動させずに別の槽に入れられるようにしてある。
【００１７】１回目の測定終了後、次回の測定では試薬
槽４中に残った試薬を再度使用できる。試料については
試料槽５を洗浄して新たな試料を入れても良いし、試料
槽５ごと交換しても良い。但し、試料のコンタミネーシ
ョンを防止するために、分離用キャピラリの外壁は十分
に洗浄しておく必要がある。また、測定器の機内温度上
昇による試薬劣化を防ぐ目的で、試薬注入後は試薬槽４
を一時装置から取り外して冷蔵設備１４を用いて冷蔵保
存してもよい。このようにして、試薬槽４内の試薬は複
数回使用することができ、１回の使用量は分離用キャピ
ラリに注入される量及び分離用キャピラリの外壁に付着
する量で済むため、従来の使用量の約１／１００に低減
できる。
槽４中に残った試薬を再度使用できる。試料については
試料槽５を洗浄して新たな試料を入れても良いし、試料
槽５ごと交換しても良い。但し、試料のコンタミネーシ
ョンを防止するために、分離用キャピラリの外壁は十分
に洗浄しておく必要がある。また、測定器の機内温度上
昇による試薬劣化を防ぐ目的で、試薬注入後は試薬槽４
を一時装置から取り外して冷蔵設備１４を用いて冷蔵保
存してもよい。このようにして、試薬槽４内の試薬は複
数回使用することができ、１回の使用量は分離用キャピ
ラリに注入される量及び分離用キャピラリの外壁に付着
する量で済むため、従来の使用量の約１／１００に低減
できる。
【００１８】（実施例２）実施例１では、分離用キャピ
ラリ１への注入は、試薬、次に試料となる試料の順であ
ったが、実施例２では試料，試薬の順とする。分離用キ
ャピラリ１に試料槽５から試料の注入を行い、分離用キ
ャピラリの外壁を吸水シート１５で拭き取った後に、試
薬槽４に分離用キャピラリ１を挿入し試薬の注入を行
う。注入法は実施例１と同様であり、その後の解析法も
実施例１と同様である。
ラリ１への注入は、試薬、次に試料となる試料の順であ
ったが、実施例２では試料，試薬の順とする。分離用キ
ャピラリ１に試料槽５から試料の注入を行い、分離用キ
ャピラリの外壁を吸水シート１５で拭き取った後に、試
薬槽４に分離用キャピラリ１を挿入し試薬の注入を行
う。注入法は実施例１と同様であり、その後の解析法も
実施例１と同様である。
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば、試料の塩基配列決定に
おいて、試料と反応する試薬使用量を従来の使用量の約
１／１００に低減できる。
おいて、試料と反応する試薬使用量を従来の使用量の約
１／１００に低減できる。
【図１】キャピラリ内反応の説明図。
【図２】本発明の一実施例の説明図。
【図３】分離用キャピラリの説明図。
１…分離用キャピラリ、２…検出部、３…レーザ光、４
…試薬槽、５…試料槽、６…陰極電界槽、７…陰極電
極、８…陽極電界槽、９…高圧電源、１０…温度制御機
構、１１…検出器、１２…データ処理ユニット、１３…
ターンテーブル、１４…冷蔵設備、１５…吸水シート。
…試薬槽、５…試料槽、６…陰極電界槽、７…陰極電
極、８…陽極電界槽、９…高圧電源、１０…温度制御機
構、１１…検出器、１２…データ処理ユニット、１３…
ターンテーブル、１４…冷蔵設備、１５…吸水シート。
Claims (8)
- 【請求項１】キャピラリの両端に高電圧を印加し、上記
キャピラリに導入した試料を分離する電気泳動装置にお
いて、同一の上記キャピラリ内で、反応工程及び分離・
検出工程を行わせることを特徴とする電気泳動方法。 - 【請求項２】請求項１において、上記試料を注入する上
記キャピラリの一端に上記試料と反応する少なくとも１
種類の試薬を導入し、上記試料と反応させてから分離泳
動させる電気泳動方法。 - 【請求項３】請求項２において、上記キャピラリ中で上
記試料を反応させるための温度制御機構を設ける電気泳
動装置。 - 【請求項４】請求項２において、該試薬の導入を、試料
注入の前、または試料注入の後に行う電気泳動方法。 - 【請求項５】請求項２に記載の上記試薬が、ＤＮＡポリ
メラーゼ，プライマ，デオキシヌクレオシド三リン酸，
ジデオキシヌクレオシド三リン酸である電気泳動方法。 - 【請求項６】請求項５に記載の上記プライマが蛍光色素
で標識されている電気泳動方法。 - 【請求項７】請求項５に記載の上記ジデオキシヌクレオ
シド三リン酸が蛍光色素で標識されている電気泳動方
法。 - 【請求項８】請求項２において、試料及び試薬のキャピ
ラリへの注入手段として、電圧印加を用いる電気泳動方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9003591A JPH10197480A (ja) | 1997-01-13 | 1997-01-13 | 電気泳動装置及び方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9003591A JPH10197480A (ja) | 1997-01-13 | 1997-01-13 | 電気泳動装置及び方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10197480A true JPH10197480A (ja) | 1998-07-31 |
Family
ID=11561719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9003591A Pending JPH10197480A (ja) | 1997-01-13 | 1997-01-13 | 電気泳動装置及び方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10197480A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108780061A (zh) * | 2016-01-13 | 2018-11-09 | 普诺森公司 | 用于毛细管电泳、等电点和分子量分析的***和方法 |
-
1997
- 1997-01-13 JP JP9003591A patent/JPH10197480A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108780061A (zh) * | 2016-01-13 | 2018-11-09 | 普诺森公司 | 用于毛细管电泳、等电点和分子量分析的***和方法 |
| US10794860B2 (en) * | 2016-01-13 | 2020-10-06 | ProteinSimple | Systems and methods for capillary electrophoresis, isoelectric point, and molecular weight analysis |
| US11726058B2 (en) | 2016-01-13 | 2023-08-15 | ProteinSimple | Systems and methods for capillary electrophoresis, isoelectric point, and molecular weight analysis |
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