JPH10182627A - New compound s-15183a and s-15183b - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject new compound separated from a cultured product of a specific microorganism belonging to the genus Zopfiella, having excellent sphingosine kinase inhibiting action and useful as an antiarteriosclerotic agent, carcinostatic agent, antiallergic agent, etc. SOLUTION: This compound is 7-octanoyloxy-3-heptyl-7-methyl-6,8-dioxo-2- oxa-2,6,7,8-tetrahydronaphthalene of the formula. The compound can be produced by culturing Zopfiella inermis Cailleux Malloch et Cain SANK 15183 strain belonging to the genus Zopfiella by liquid cultivation, especially submerged cultivation at 1.8-24 deg.C under aerobic condition, extracting the bacterial cell in the cultured liquid or the supernatant and purifying the extract. The compound is preferably administered at a daily dose of 10-1,000 mg for adult in the form of oral drug, injection, etc.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、スフィンゴシンキ
ナーゼ阻害剤として有用な新規化合物 S-15183aおよび
S-15183b 並びにその製造法に関する。The present invention relates to a novel compound S-15183a useful as a sphingosine kinase inhibitor and
It relates to S-15183b and its production method.

【０００２】[0002]

【従来の技術】スフィンゴ脂質は従来、グリセロリン脂
質およびコレステロールとならぶ細胞膜の主要な構成成
分の一つと考えられてきた。グリセロリン脂質は細胞膜
構造の維持だけでなく、その代謝産物として多くの生理
活性物質を産生させることが知られてきた。しかし、ス
フィンゴ脂質についてはその代謝産物の生理活性につい
ては最近までほとんど知られていなかった。近年、セラ
ミドなどのさまざまなスフィンゴ脂質の代謝産物にアポ
トーシスの誘導や細胞増殖刺激作用などの生理活性が知
られる様になり、スフィンゴ脂質の代謝酵素が生理的反
応や種々の病態の原因に密接に関連する可能性が示唆さ
れるようになった（Hannun Y. A. and Obeid L. M., (1
995) TIBS, 20, 73-77参照）。2. Description of the Related Art Sphingolipids have heretofore been considered as one of the major constituents of cell membranes along with glycerophospholipids and cholesterol. Glycerophospholipids have been known not only to maintain the cell membrane structure but also to produce many physiologically active substances as metabolites thereof. However, about sphingolipids, little was known about the physiological activity of its metabolites until recently. In recent years, various metabolites of sphingolipids such as ceramide have been known to have physiological activities such as induction of apoptosis and stimulation of cell growth, and metabolic enzymes of sphingolipids are closely related to physiological reactions and the causes of various disease states. The possibility of association has been suggested (Hannun YA and Obeid LM, (1
995) TIBS, 20, 73-77).

【０００３】スフィンゴ脂質の代謝酵素には、細胞膜の
主要な構成成分であるスフィンゴミエリンを中心とし
て、その生合成に働くもの、分解に働くもの、さらにガ
ングリオシドなどの糖脂質の合成、分解に働くものな
ど、さまざまな酵素が知られている。スフィンゴシンキ
ナーゼは、スフィンゴ脂質の分解系に作用する酵素であ
り、スフィンゴシンをリン酸化し スフィンゴシン-1-
リン酸を生成させる酵素である。本酵素の基質や生成物
であるスフィンゴシンやスフィンゴシン-1- リン酸につ
いてもまた、最近多くの生理活性が報告されるようにな
った。[0003] The metabolic enzymes of sphingolipids include sphingomyelin, which is a major component of cell membranes, and those that act on biosynthesis and degradation, and those that act on the synthesis and degradation of glycolipids such as gangliosides. Various enzymes are known. Sphingosine kinase is an enzyme that acts on the sphingolipid degradation system, phosphorylating sphingosine and sphingosine-1-.
It is an enzyme that produces phosphate. Recently, sphingosine and sphingosine-1-phosphate, which are substrates and products of this enzyme, have also been reported to have many physiological activities.

【０００４】基質であるスフィンゴシンについてはプロ
テインキナーゼＣ（以下、「ＰＫＣ」という。）を阻害
することが知られており、ＰＫＣの活性化剤であるホル
ボールエステルの作用を多くの細胞系で打ち消すことが
明らかになっている。たとえば、ホルボールエステルに
より引き起こされた血小板凝集や、好中球の活性化、白
血病細胞の分化などがスフィンゴシンにより抑制される
（Hannun Y. A. and Corinne M. L., (1993) Biochimic
a et Biophysica Acta, 1154, 223-236 参照）。[0004] It is known that sphingosine as a substrate inhibits protein kinase C (hereinafter referred to as "PKC"), and counteracts the action of phorbol ester, an activator of PKC, in many cell lines. It is clear that For example, sphingosine suppresses platelet aggregation, neutrophil activation, and differentiation of leukemia cells caused by phorbol ester (Hannun YA and Corinne ML, (1993) Biochimic
a et Biophysica Acta, 1154, 223-236).

【０００５】またスフィンゴシンはその他種々の情報伝
達経路に対して作用することも知られている（Hannun
Y. A. and Corinne M. L., (1993) Biochimica et Biop
hysica Acta, 1154, 223-236 参照）。これらの情報伝
達経路は癌の進展、免疫、炎症、糖代謝、血液凝固など
の反応に密接に関連することが知られている。[0005] It is also known that sphingosine acts on various other signal transduction pathways (Hannun).
YA and Corinne ML, (1993) Biochimica et Biop
hysica Acta, 1154, 223-236). It is known that these signaling pathways are closely related to reactions such as cancer progression, immunity, inflammation, glucose metabolism, and blood coagulation.

【０００６】また、ある種の白血病細胞においては、網
膜芽腫遺伝子産物 (retinoblastomagene product)を介
する増殖抑制経路を、スフィンゴシンが活性化すること
が知られている。スフィンゴシンのこの作用はＰＫＣの
阻害作用とは無関係であり、網膜芽腫遺伝子産物を脱燐
酸化して活性化し、細胞を細胞周期のG0/G1 期に留める
ことにより、白血病細胞の増殖を抑制する（Hannun Y.
A. and Corinne M. L., (1993) Biochimica et Biophys
ica Acta, 1154, 223-236 参照）。[0006] In certain leukemia cells, sphingosine is known to activate a growth inhibition pathway mediated by a retinoblastoma gene product. This effect of sphingosine is independent of the inhibitory effect of PKC and suppresses the growth of leukemic cells by dephosphorylating and activating the retinoblastoma gene product and retaining the cells in the G0 / G1 phase of the cell cycle ( Hannun Y.
A. and Corinne ML, (1993) Biochimica et Biophys
ica Acta, 1154, 223-236).

【０００７】一方、スフィンゴシン-1- リン酸には、繊
維芽細胞に対して増殖刺激作用が認められる。血小板増
殖因子（以下「PDGF」という）や血清の繊維芽細胞増殖
刺激作用は、セカンドメッセンジャーとしてのスフィン
ゴシン-1- リン酸の作用を介したものであることが最近
明らかになった（Olivera A. and Spiegel S., (1993)
Nature , 365, 557-560 およびSpiegel S. et al, (199
4) Breast Cancer Research and Treatment 31, 337-34
8 参照）。本作用もＰＫＣの阻害作用とは無関係と考え
られている。繊維芽細胞以外の細胞では平滑筋細胞にお
いて、スフィンゴシンが細胞増殖作用を示すことが知ら
れており（Yacobs L. S. and Kester M., (1993) Am.
J. Physiol., 265, C740-C747 参照）、繊維芽細胞と同
様の作用機作で細胞増殖が調節されていることが示唆さ
れる。On the other hand, sphingosine-1-phosphate has a growth stimulating effect on fibroblasts. It has recently been shown that the action of platelet growth factor (hereinafter referred to as "PDGF") or serum to stimulate fibroblast proliferation is mediated by the action of sphingosine-1-phosphate as a second messenger (Olivera A. and Spiegel S., (1993)
Nature, 365, 557-560 and Spiegel S. et al, (199
4) Breast Cancer Research and Treatment 31, 337-34
8). This effect is also considered to be unrelated to the PKC inhibitory effect. In cells other than fibroblasts, sphingosine is known to exhibit a cell growth effect in smooth muscle cells (Yacobs LS and Kester M., (1993) Am.
J. Physiol., 265, C740-C747), suggesting that cell growth is regulated by a mode of action similar to that of fibroblasts.

【０００８】またスフィンゴシン-1- リン酸は、ヒト血
小板中に多く含まれ、トロンビンやコラーゲン刺激によ
る血小板活性化の際に血小板外に放出され、血小板の凝
集反応をさらに活性化することが最近になって明らかと
なった（Yatomi Y. et al.,(1995) Blood, 86, 193-202
参照）。Further, sphingosine-1-phosphate is abundantly contained in human platelets, and is released outside of platelets upon activation of platelets by thrombin or collagen stimulation, and has recently been shown to further activate platelet aggregation. (Yatomi Y. et al., (1995) Blood, 86, 193-202
reference).

【０００９】スフィンゴシン-1- リン酸のその他の作用
としては、ホスホリパーゼ D の活性化、細胞内カルシ
ウムイオンプールからのカルシウムイオン放出の促進
（Spiegel S. et al, (1994) Breast Cancer Research
and Treatment 31, 337-348参照）、癌細胞の細胞運動
とファゴキネシス(phagokinesis)の抑制（Hannun Y.
A. and Corinne M. L., (1993) Biochimica et Biophys
ica Acta, 1154, 223-236 参照）などが知られている。Other effects of sphingosine-1-phosphate include activation of phospholipase D and promotion of calcium ion release from the intracellular calcium ion pool (Spiegel S. et al, (1994) Breast Cancer Research
and Treatment 31, 337-348), suppression of cancer cell movement and phagokinesis (Hannun Y.
A. and Corinne ML, (1993) Biochimica et Biophys
ica Acta, 1154, 223-236).

【００１０】以上のごとく、スフィンゴシンやスフィン
ゴシン-1- リン酸は確かにさまざまな生理作用を有して
おり、多くの病態において細胞レベルでのスフィンゴシ
ン−１−リン酸量を調節をする物質には有用な薬理作用
を有することが期待される。たとえばPDGFは、血管平滑
筋細胞の増殖と遊走を刺激することを介して血管病変の
進展に重要な役割を果たすと考えられているが、該作用
機作においてスフィンゴシン-1- リン酸がセカンドメッ
センジャーとして働くと考えられている。従って、その
シグナルを遮断すれば、高脂血症における動脈硬化症、
糖尿病性血管障害、経皮的冠動脈形成術（以下、「PTC
A」という。) 後の再狭窄等の予防または治療に有用と
考えられる。[0010] As described above, sphingosine and sphingosine-1-phosphate certainly have various physiological actions, and substances that regulate the sphingosine-1-phosphate level at the cellular level in many disease states include: It is expected to have useful pharmacological effects. For example, PDGF is thought to play an important role in the development of vascular lesions by stimulating the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells, and sphingosine-1-phosphate is a second messenger in the mechanism of action. It is thought to work as. Therefore, if the signal is blocked, arteriosclerosis in hyperlipidemia,
Diabetic vascular disease, percutaneous coronary angioplasty (hereinafter “PTC
A ". ) It is considered to be useful for prevention or treatment of later restenosis.

【００１１】また、スフィンゴシン-1- リン酸に血小板
活性化作用が報告されていることから、その生成を妨げ
れば心疾患など血栓形成を原因とするさまざまな疾患の
予防または治療に有用と考えられる。Further, since sphingosine-1-phosphate has been reported to have a platelet activating effect, it is considered that preventing its production is useful for preventing or treating various diseases caused by thrombus formation such as heart disease. Can be

【００１２】さらに、最近、セリンパルミトイルトラン
スフェラーゼ(serine palmitoyl transferase)に対する
微生物由来の阻害剤がスフィンゴシンに良く似た構造を
持ち、しかも強力な免疫抑制作用を持つことが報告され
た（Sasaki S. et al, (1994) J Antibiotics, 47, 42
0-433 およびMiyake Y. et al., (1995) Biochem. Bio
phys. Res. Comm., 211, 396-403 参照）。スフィンゴ
シンもセリンパルミトイルトランスフェラーゼのダウン
レギュレーション作用を有する（Hannun Y. A.and Cori
nne M. L., (1993) Biochimica et Biophysica Acta, 1
154, 223-236参照）ことから、スフィンゴシンキナーゼ
の阻害剤は新たな免疫抑制剤のターゲットになる可能性
も考えられる。Furthermore, recently, it has been reported that a microbial inhibitor of serine palmitoyl transferase has a structure very similar to sphingosine and also has a strong immunosuppressive effect (Sasaki S. et al.). , (1994) J Antibiotics, 47, 42
0-433 and Miyake Y. et al., (1995) Biochem. Bio
phys. Res. Comm., 211, 396-403). Sphingosine also has a down-regulating effect on serine palmitoyltransferase (Hannun YAand Cori
nne ML, (1993) Biochimica et Biophysica Acta, 1
154, 223-236), it is possible that sphingosine kinase inhibitors may be targets for new immunosuppressants.

【００１３】スフィンゴシンやスフィンゴシン-1- リン
酸は各種癌細胞に対して、その増殖や遊走に作用するこ
とが報告されている（Spiegel S. et al, (1994) Brea
st Cancer Research and Treatment 31, 337-348参
照）。癌細胞の種類や条件によって成績はさまざまでは
あるが、癌の種類によってはスフィンゴシンキナーゼの
阻害剤が制癌や転移の阻止に働く可能性も考えられる。It has been reported that sphingosine and sphingosine-1-phosphate act on the growth and migration of various cancer cells (Spiegel S. et al, (1994) Brea
st Cancer Research and Treatment 31, 337-348). The results vary depending on the type and condition of the cancer cell, but it is also possible that an inhibitor of sphingosine kinase may work to suppress cancer and prevent metastasis depending on the type of cancer.

【００１４】最近、マスト細胞における免疫グロブリン
E (IgE) のシグナル伝達にスフィンゴシンキナーゼが関
与することが明らかになりつつある。具体的には、マス
ト細胞上にあるIgE のFcフラグメントに対するレセプタ
ー(Fc εRI) を介する細胞内カルシウムイオン濃度([Ca
²⁺])の上昇に、スフィンゴシンキナーゼの活性化が深く
関与することが報告された（ Choi O. H., et al, (199
6) Nature, 380, 634-636 参照）。従って、スフィンゴ
シンキナーゼの阻害剤は、抗アレルギー作用を持つこと
も考えられる。Recently, immunoglobulins in mast cells
It is becoming clear that sphingosine kinase is involved in E (IgE) signaling. Specifically, the intracellular calcium ion concentration via the receptor (FcεRI) for the Fc fragment of IgE on mast cells ([Ca
It has been reported that sphingosine kinase activation is deeply involved in the rise of [ ²⁺ ]) (Choi OH, et al, (199).
6) See Nature, 380, 634-636). Therefore, sphingosine kinase inhibitors may have anti-allergic effects.

【００１５】以上のことから、スフィンゴシンキナーゼ
に対する特異的な阻害剤は、抗動脈硬化剤、抗糖尿病
剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、制癌剤、癌転移
抑制剤、抗アレルギー剤、経皮的冠動脈形成術(PTCA)後
の再狭窄等の予防または治療剤としての開発が有望視さ
れる。From the above, specific inhibitors for sphingosine kinase include anti-atherosclerotic agents, anti-diabetic agents, anti-thrombotic agents, anti-inflammatory agents, immunosuppressants, anticancer agents, cancer metastasis inhibitors, antiallergic agents, It is promising for its development as a prophylactic or therapeutic agent for restenosis after percutaneous coronary angioplasty (PTCA).

【００１６】現在、スフィンゴシンキナーゼの阻害剤と
して知られている物質には、スフィンゴシンの構造類似
物質であるジヒドロスフィンゴシンやジメチルスフィン
ゴシンなどが知られているがその阻害に必要な濃度はそ
れぞれ20μM 、50μM であり（Bornfeldt K. E., et a
l, (1995) J Cell Biol., 130, 193-206 および Spiege
l S. et al, (1994) Breast Cancer Research and Tre
atment 31, 337-348 参照）、また細胞内で代謝される
ことも十分考えられるため、強力かつ特異的な阻害剤と
はいいがたい。また、薬剤としての体内への吸収性や血
中での安定性においても問題点が多いと考えられる。こ
のような観点から、スフィンゴシンキナーゼに対して特
異的な阻害を示し、かつ新規構造を有する生理活性物質
が望まれている。At present, as substances known as inhibitors of sphingosine kinase, sphingosine structural analogs such as dihydrosphingosine and dimethylsphingosine are known, but the concentrations required for the inhibition are 20 μM and 50 μM, respectively. Yes (Bornfeldt KE, et a
l, (1995) J Cell Biol., 130, 193-206 and Spiege
l S. et al, (1994) Breast Cancer Research and Tre
atment 31, 337-348), and it is unlikely to be a potent and specific inhibitor because it is also likely to be metabolized in cells. In addition, it is considered that there are many problems in the absorbability into the body as a drug and the stability in blood. From such a viewpoint, a bioactive substance having specific inhibition to sphingosine kinase and having a novel structure has been desired.

【００１７】[0017]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、微生物
二次代謝産物中よりスフィンゴシンキナーゼ阻害作用を
もつ物質を検索し、ゾフィエラ・イネルミス・ケイリュ
ー・マロック・エト・ケインＳＡＮＫ１５１８３株（Zo
pfiella inermis (Cailleux) Malloch et Cain SANK 15
183 ：以下、単に「ＳＡＮＫ１５１８３株」という。）
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７３７）の培養物から、スフィン
ゴシンキナーゼに対する阻害作用を有する新規化合物 S
-15183 a および S-15183 bが生産されることを見出
し、本発明を完成した。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors have searched for substances having a sphingosine kinase inhibitory activity from secondary metabolites of microorganisms, and have found a substance having an inhibitory effect on sphingosine kinase.
pfiella inermis (Cailleux) Malloch et Cain SANK 15
183: Hereinafter, simply referred to as “SANK15183 strain”. )
From a culture of (FERM BP-5737), a novel compound S having an inhibitory effect on sphingosine kinase S
The inventors have found that -15183a and S-15183b are produced, and completed the present invention.

【００１８】[0018]

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）下記式
(I) で表される新規化合物 S-15183a ：The present invention provides (1) the following formula:
New compound S-15183a represented by (I):

【００１９】[0019]

【化３】 Embedded image

【００２０】（２）下記式(II)で表される新規化合物 S
-15183b ：(2) Novel compound S represented by the following formula (II)
-15183b:

【００２１】[0021]

【化４】 Embedded image

【００２２】（３）ゾフィエラ属に属する S-15183a 及
び／又は S-15183b 生産菌を培養し、その培養物より S
-15183a 及び／又は S-15183b を採取することを特徴と
する S-15183a 及び／又は S-15183b の製造法、（４）
S-15183a 及び／又は S-15183b 生産菌がゾフィエラ・
イネルミス種に属することを特徴とする（３）記載の製
造法、（５） S-15183a 及び／又は S-15183b生産菌
が、ゾフィエラ・イネルミス・ケイリュー・マロック・
エト・ケイン（ Zopfiella inermis (Cailleux) Malloc
het Cain ）ＳＡＮＫ１５１８３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５７３７）である、（３）または（４）記載の製造法、
（６）ゾフィエラ・イネルミス・ケイリュー・マロック
・エト・ケイン（ Zopfiella inermis (Cailleux) Mall
och et Cain ）ＳＡＮＫ１５１８３株（ＦＥＲＭＢＰ−
５７３７）、に関する。(3) S-15183a and / or S-15183b-producing bacteria belonging to the genus Zophieera are cultured, and S-
(4) A method for producing S-15183a and / or S-15183b, characterized in that S-15183a and / or S-15183b is collected.
S-15183a and / or S-15183b-producing bacteria are
(3) The method according to (3), wherein the microorganism producing S-15183a and / or S-15183b is Sofiaella inermis C. cereulis maloc.
Eto Kane (Zopfiella inermis (Cailleux) Malloc
het Cain) SANK15183 strain (FERM BP-
5737), the production method according to (3) or (4),
(6) Zopfiella inermis (Cailleux) Mall
och et Cain) SANK15183 strain (FERMBP-
5737).

【００２３】本発明のS-15183aおよびS-15183bは下記の
物理化学的性状を有する。The S-15183a and S-15183b of the present invention have the following physicochemical properties.

【００２４】I. S-15183a 1) 性質； 黄色油状物質 2) 溶解性；メタノール、酢酸エチル、クロロホルム、
ジメチルスルホキシド（DMSO）などの有機溶媒に可溶 3) 呈色試験；50% 硫酸、ヨウ素などで陽性 4) 分子式； C₂₅H₃₆O₅ 5) 分子量；416 （高分解能FAB-MS法により 観測値：
[M+H]⁺ 417.2652 ） （計算値：417.2641） 6) 紫外線吸収スペクトル；（メタノール中） 220 nm (ε 17100), 320 nm (ε 22500), 455 nm ( ε
800) 7) ¹H-核磁気共鳴スペクトル；( 重クロロホルム中 : p
pm, テトラメチルシラン基準) 7.88(1H, d, J=1.1Hz), 6.09(1H, s ), 5.52(1H, d, J=
1.1Hz), 2.48-2.38(4H, m), 1.69-1.58(4H, m), 1.52(3
H, s), 1.43-1.23(16H, m), 0.96-0.84(6H, m) 8) ¹³C- 核磁気共鳴スペクトル；( 重クロロホルム中 :
ppm, 重クロロホルム基準) 193.5(s),192.9(s),173.1(s),162.4(s),154.0(d),142.7
(s),115.2(s),108.6(d),106.8(d),84.1(s),33.2(t),33.
1(t),31.6(t),28.9(t),26.5(t),24.6(t),22.6(t),22.2
(q),14.1(q) （31.6、28.9、22.6、14.1 ppm のシグナルに炭素２ま
たは３個分の重なりがあると考えられる。） 9) 高速液体クロマトグラフグラフィー 保持時間 : 5.0分 カラム : ナカライテスク社製 COSMOSIL 5C18AR, 4.
6 φX150mm 溶媒 : アセトニトリル - 水 9:1 流速 : 1ml／分 検出 : UV 210nm 10) 比旋光度；[ α ]_D ²⁵ = -220 (c 0.2,メタノール) II.S-15183b 1) 性質；黄色油状物質 2) 溶解性；メタノール、酢酸エチル、クロロホルム、
ジメチルスルホキシド（DMSO）などの有機溶媒に可溶 3) 呈色試験；50% 硫酸、ヨウ素などで陽性 4) 分子式； C₂₇H₄₀O₅ 5) 分子量；444 （高分解能FAB-MS法により 観測値：
[M+H]⁺ 445.2959 ） （計算値：445.2954） 6) 紫外線吸収スペクトル；（メタノール中） 220 nm (ε 16900), 320 nm ( ε 21600), 455 nm ( ε
1200) 7) ¹H-核磁気共鳴スペクトル；( 重クロロホルム中 : p
pm, テトラメチルシラン基準) 7.87(1H, d, J=1.1Hz), 6.08(1H, s ), 5.51(1H, d, J=
1.1Hz), 2.48-2.38(4H, m), 1.74-1.55(4H, m), 1.52(3
H, s), 1.43-1.23(20H, m), 0.95-0.83(6H, m) 8) ¹³C- 核磁気共鳴スペクトル；( 重クロロホルム中 :
ppm, 重クロロホルム基準) 193.5(s),192.9(s),173.1(s),162.4(s),154.0(d),142.7
(s),115.2(s),108.6(d),106.8(d),84.1(s),33.3(t),33.
1(t),31.9(t),31.6(t),29.4(t),29.3(t),29.0(t),28.9
(t),26.6(t),24.7(t),22.7(t),22.6(t),22.2(q),14.1
(q),14.05(q) （ 29ppm 付近のメチレン炭素シグナルに重なりがある
と考えられる。） 9) 高速液体クロマトグラフグラフィー 保持時間 : 8分 カラム :ナカライテスク社製 COSMOSIL 5C18AR, 4.6
φX150mm 溶媒 : アセトニトリル - 水 9:1 流速 : 1ml／分 検出 : UV 210nm 10) 比旋光度；[ α ]_D ²⁵ = -227 (c 0.3,メタノール） S-15183 a およびS-15183 b の生産菌の性状 本発明で用いられるSANK 15183株の形態学的、生理学的
性状および化学分類学的性状は以下に示す通りである。I. S-15183a 1) Properties; yellow oily substance 2) Solubility; methanol, ethyl acetate, chloroform,
Soluble in organic solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO) 3) Color test; 50% sulfuric acid, iodine, etc. 4) Molecular formula; C ₂₅ H ₃₆ O ₅ 5) Molecular weight; 416 (observed by high-resolution FAB-MS method) value:
[M + H] ⁺ 417.2652) (calculated: 417.2641) 6) Ultraviolet absorption spectrum; (in methanol) 220 nm (ε 17100), 320 nm (ε 22500), 455 nm (ε
800) 7) ¹ H-nuclear magnetic resonance spectrum; (in deuterated chloroform: p
pm, based on tetramethylsilane) 7.88 (1H, d, J = 1.1Hz), 6.09 (1H, s), 5.52 (1H, d, J =
1.1Hz), 2.48-2.38 (4H, m), 1.69-1.58 (4H, m), 1.52 (3
H, s), 1.43-1.23 (16H, m), 0.96-0.84 (6H, m) 8) ¹³ C-nuclear magnetic resonance spectrum; (in deuterated chloroform:
ppm, based on deuterated chloroform) 193.5 (s), 192.9 (s), 173.1 (s), 162.4 (s), 154.0 (d), 142.7
(s), 115.2 (s), 108.6 (d), 106.8 (d), 84.1 (s), 33.2 (t), 33.
1 (t), 31.6 (t), 28.9 (t), 26.5 (t), 24.6 (t), 22.6 (t), 22.2
(q), 14.1 (q) (It is considered that the signal of 31.6, 28.9, 22.6, 14.1 ppm has an overlap of 2 or 3 carbon atoms.) 9) High-performance liquid chromatography Retention time: 5.0 minutes Column: Nakarai Tesque COSMOSIL 5C18AR, 4.
6 φX150mm Solvent: Acetonitrile-water 9: 1 Flow rate: 1ml / min Detection: UV 210nm 10) Specific rotation: [α] _D ²⁵ = -220 (c 0.2, methanol) II.S-15183b 1) Properties; yellow oil Substance 2) Solubility; methanol, ethyl acetate, chloroform,
Soluble in organic solvents such as dimethylsulfoxide (DMSO) 3) Color test; 50% sulfuric acid, iodine, etc. 4) Molecular formula; C ₂₇ H ₄₀ O ₅ 5) Molecular weight: 444 (observed by high resolution FAB-MS method) value:
[M + H] ⁺ 445.2959) (Calculated: 445.2954) 6) Ultraviolet absorption spectrum; (in methanol) 220 nm (ε 16900), 320 nm (ε 21600), 455 nm (ε
1200) 7) ¹ H-nuclear magnetic resonance spectrum; (in deuterated chloroform: p
7.87 (1H, d, J = 1.1Hz), 6.08 (1H, s), 5.51 (1H, d, J =
1.1Hz), 2.48-2.38 (4H, m), 1.74-1.55 (4H, m), 1.52 (3
H, s), 1.43-1.23 (20H, m), 0.95-0.83 (6H, m) 8) ¹³ C-nuclear magnetic resonance spectrum; (in deuterated chloroform:
ppm, based on deuterated chloroform) 193.5 (s), 192.9 (s), 173.1 (s), 162.4 (s), 154.0 (d), 142.7
(s), 115.2 (s), 108.6 (d), 106.8 (d), 84.1 (s), 33.3 (t), 33.
1 (t), 31.9 (t), 31.6 (t), 29.4 (t), 29.3 (t), 29.0 (t), 28.9
(t), 26.6 (t), 24.7 (t), 22.7 (t), 22.6 (t), 22.2 (q), 14.1
(q), 14.05 (q) (It is considered that the methylene carbon signal around 29 ppm is overlapped.) 9) High performance liquid chromatography Retention time: 8 minutes Column: COSMOSIL 5C18AR, 4.6 manufactured by Nacalai Tesque, Inc.
φX150mm Solvent: Acetonitrile-water 9: 1 Flow rate: 1ml / min Detection: UV 210nm 10) Specific rotation: [α] _D ²⁵ = -227 (c 0.3, methanol) S-15183a and S-15183b producing bacteria Properties The morphological, physiological and chemotaxonomic properties of the SANK 15183 strain used in the present invention are as follows.

【００２５】PDA 上23℃での生育は速やかで、1 週間目
のコロニーの直径は80mmに達する。コロニーは平たんで
薄く、栄養菌糸は表在的または潜在的に発達する。表面
は綿毛状で中心部が明褐色で縁辺部に向けて灰橙色とな
る。裏面は中心部が褐色で縁辺部に向かって淡色とな
り、縁辺部ではほぼ白色を呈する。裏面と同系色の可溶
性色素の分泌が認められる。WSH 上23℃での生育は速や
かで1 週間目のコロニーの直径は78mmに達する。コロニ
ーは平たんで薄く、栄養菌糸は表在的または潜在的に発
達する。表面は綿毛状で灰橙色となる。多量の子のう殻
を寒天表面または基質中に形成する。裏面は縁辺部が薄
黄色で中心に向かって明褐色になる。表面と同系色の可
溶性色素の分泌が認められる。なお、培地の組成は以下
の通りである。閉子のう殻は散在性で灰色から灰褐色を
呈する。閉子のう殻は直径126-267 μm の球形で、無色
から淡黄褐色の半透明の薄い膜質の殻壁でおおわれる。
子のうは8 胞子を含み、幅の広い根棒状で、64-103×19
-50 μm の大きさである。先端構造は見られず、下部で
細くなる。子のう胞子は複列で最初は無色で楕円形であ
るが、後に基部近くに横断状の隔壁を生じ2 細胞にな
る。子のう胞子の全長は31.4-38.3 μm である。上部細
胞はオリーブ褐色から暗褐色、またはほとんど黒色の幅
広い楕円形で、大きさは26.6-31.1 ×19.3-21.7 μm で
あり、表面は平滑となる。先端に直径最大で1.6 μm の
円形の発芽孔を生じる。下部細胞は4.8-9.74.0-8.1 μm
で、無色の薄壁の乳首状から三角錐構造で、しばしば
つぶれている。表面は平滑でゼラチン被膜は存在しな
い。菌糸は無色から淡黄褐色で分枝し、隔壁を持つ。ア
ナモルフは形成されない。The growth at 23 ° C. on PDA is rapid, and the diameter of the colony at the first week reaches 80 mm. Colonies are flat and thin, and vegetative mycelia develop superficially or potentially. The surface is fluffy, light brown at the center and grey-orange toward the edges. The back surface is brown at the center and pale toward the edges, and is almost white at the edges. Secretion of a soluble pigment similar in color to the back side is observed. Growth at 23 ° C on the WSH is rapid, with colonies 1 week in diameter reaching 78 mm in diameter. Colonies are flat and thin, and vegetative mycelia develop superficially or potentially. The surface is fluffy and grey-orange. A large amount of ascocarcass forms on the agar surface or substrate. The back side is light yellow at the edge and becomes light brown toward the center. Secretion of a soluble pigment similar in color to the surface is observed. The composition of the medium is as follows. Closed cysts are sporadic and gray to grayish brown. The mitocysts are spherical, 126-267 μm in diameter, and are covered with a translucent thin translucent shell wall of colorless to pale tan.
Ascomils contain 8 spores, are wide root sticks, 64-103 × 19
The size is -50 μm. The tip structure is not seen and it is thinner at the bottom. Ascospores are double-rowed, initially colorless and oval, but later form a transverse septum near the base to form two cells. The total length of ascospores is 31.4-38.3 μm. The upper cells are broad oval from olive brown to dark brown or almost black, measuring 26.6-31.1 x 19.3-21.7 μm, with a smooth surface. A circular germination hole with a maximum diameter of 1.6 μm is formed at the tip. 4.8-9.74.0-8.1 μm for lower cells
It is a colorless thin-walled nipple to triangular pyramid, often crushed. The surface is smooth and there is no gelatin coating. Hyphae are colorless to pale yellowish-branched and have septum. No anamorph is formed.

【００２６】培地組成 PDA （ポテト・デキストロース・アガー：以下「PDA 」
とする。）培地 39g PDA（ニッスイ製薬（株）製）を水で１リットルと
する。Medium composition PDA (Potato dextrose agar: hereinafter "PDA")
And ) Medium 39 g PDA (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) is made up to 1 liter with water.

【００２７】WSH （ワイツマン・シルヴァ・フトナー：
Weitzman Silva-Hutner 、以下、「WSH 」とする。）培
地 10g のオートミール、 1g の硫酸マグネシウム・７水和
物、 1g のリン酸２水素カリウム、 1g の硝酸ナトリウ
ム、 1g の寒天を水で１リットルとする（pH無調整）。WSH (Weitzman Silva Futner:
Weitzman Silva-Hutner, hereinafter “WSH”. ) Medium 10 g of oatmeal, 1 g of magnesium sulfate heptahydrate, 1 g of potassium dihydrogen phosphate, 1 g of sodium nitrate, and 1 g of agar are made up to 1 liter with water (no pH adjustment).

【００２８】以上の菌学的性状より、本菌に該当するも
のを検索したところ、Cailleux (1970) およびMalloch
and Cain(1971)の報告しているゾフィエラ・イネルミス
（Zopfiella inermis ）の記載と一致した（参考文献は
以下に記載する。）。よって、本菌をゾフィエラ・イネ
ルミス・ケイリュー・マロック・エト・ケイン（Zopfie
lla inermis (Cailleux) Malloch et Cain） SANK 1518
3 と同定した。From the above mycological properties, a search was made for a substance corresponding to this bacterium. Cailleux (1970) and Malloch
and Cain (1971) as described in Zopfiella inermis (references are described below). Therefore, the bacterium was replaced with Zofiera Inermis, Keiryu, Maroc et Kane (Zopfie
lla inermis (Cailleux) Malloch et Cain) SANK 1518
3 was identified.

【００２９】（参考文献） Cailleux, R. 1970. Champignons stercoraux de Repub
lique Centrafricaine IV. Tripterospora. Cah. La Maboke 8:5-16 Malloch, C. and Cain, R. F. 1971. New cleistothec
ial Sordariaceae and anew family, Coniochaetaceae.
Can. J. Bot. 49:869-880 SANK 15183株は工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM BP-5737として寄託されている( 原寄託日：平成 8年
11月 1日) 。(Reference) Cailleux, R. 1970. Champignons stercoraux de Repub
lique Centrafricaine IV. Tripterospora. Cah. La Maboke 8: 5-16 Malloch, C. and Cain, RF 1971. New cleistothec
ial Sordariaceae and anew family, Coniochaetaceae.
Can. J. Bot. 49: 869-880 SANK 15183 shares FE with Institute of Biotechnology and Industrial Technology
Deposited as RM BP-5737 (Original deposit date: 1996
November 1).

【００３０】[0030]

【発明の実施の形態】BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

培養法及び精製法 本発明の新菌株を分離するのに際し使用される分離培地
としては炭素源、窒素源、無機イオン及び有機栄養源よ
り選択されたものを適宜含有する培地であれば合成また
は天然培地の何れでも使用可能である。S-15183a およ
びS-15183bはSANK-15183株を適当な培地で培養し、それ
から採取することによって得られる。栄養源としては、
従来真菌類や放線菌類の菌株の培養に利用されている公
知のものが利用できる。例えば、炭素源としては、グル
コース、シュークロース、澱粉、グリセリン、水飴、糖
蜜、大豆油などが使用できる。また、窒素源としては大
豆粉、コーンスチープリカー、生イースト、ジャガイ
モ、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどを使用しう
る。このほか必要に応じて炭酸カルシウム、リン酸塩等
の無機塩類を添加するほか、菌株の発育を助け、S-1518
3aおよびS-15183bの生産を促進するような有機及び無機
物を適当に添加することができる。Culturing method and purification method The separation medium used for isolating the new strain of the present invention may be a synthetic medium or a natural medium as long as the medium appropriately contains one selected from a carbon source, a nitrogen source, an inorganic ion and an organic nutrient source. Any medium can be used. S-15183a and S-15183b can be obtained by culturing the SANK-15183 strain in a suitable medium and collecting from it. As a nutrient source,
Known ones conventionally used for culture of fungi and actinomycetes can be used. For example, as a carbon source, glucose, sucrose, starch, glycerin, starch syrup, molasses, soybean oil and the like can be used. Further, as the nitrogen source, soybean flour, corn steep liquor, raw yeast, potato, ammonium sulfate, sodium nitrate and the like can be used. In addition, if necessary, inorganic salts such as calcium carbonate and phosphate are added.
Organic and inorganic substances that promote the production of 3a and S-15183b can be suitably added.

【００３１】培養法としては、一般の抗生物質を生産す
る方法と同じく液体培養法、特に深部培養法が適してい
る。培養は好気的条件で行われ、培養に適当な温度は、
18-24 ℃であるが、多くの場合20℃付近で培養する。S-
15183a およびS-15183bの生産は、振とう培養で通常10
-12 日で最高値に達する。As a culture method, a liquid culture method, particularly a submerged culture method, is suitable as in the method for producing general antibiotics. The culture is performed under aerobic conditions, and the appropriate temperature for the culture is
Culture at 18-24 ° C, but often around 20 ° C. S-
Production of 15183a and S-15183b is typically 10
It reaches its maximum in 12 days.

【００３２】培養終了後、培養液中の菌体あるいは上清
中に存在する S-15183 a およびS-15183bを培養液の容
量程度のアセトンあるいはアセトニトリルのような有機
溶媒を添加し混合することにより抽出する。抽出物中に
存在する固形部分を珪藻土をろ過操作助剤とするろ過操
作または遠心分離によって分別し、そのろ液または上清
中に存在する S-15183 a および S-15183 bを、スフィ
ンゴシンキナーゼ活性を指標にして、その物理的性状を
利用し抽出精製する。例えば、この抽出液中に存在する
S-15183 a および S-15183 bは、まず濃縮操作で混在
する有機溶媒を除去した後にpH3 程度の酸性条件下で水
と混和しない有機溶剤、例えばn-ブタノール、メチルエ
チルケトン、酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチレ
ン、塩化メチレンなどの単独または、それらの組み合わ
せにより抽出精製することができる。あるいは吸着剤と
して、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバーラ
イトXAD-2 、XAD-4 （ローム アンド ハース社製）な
どや、ダイヤイオンHP-10、HP-20 、CHP-20P 、HP-50
（三菱化成（株）製）などを使用することができる。 S
-15183 a および S-15183 bを含む液を上記のごとき吸
着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、
または S-15183 a および S-15183 bを吸着させた後、
メタノール水、アセトン水、n-ブタノール水などを用い
て溶出させることにより得られる。このようにして得ら
れた S-15183 a および S-15183 bは、更にシリカゲ
ル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマ
トグラフィー、セファデックスLH-20 （ファルマシア社
製）などを用いた分配カラムクロマトグラフィー、セフ
ァデックスG-25（ファルマシア社製）などを用いたゲル
ろ過クロマトグラフィー、及び順相、逆相カラムを用い
た高速液体クロマトグラフィーで精製することができ
る。After completion of the culture, S-15183a and S-15183b present in the cells in the culture solution or in the supernatant are mixed with an organic solvent such as acetone or acetonitrile, which is about the volume of the culture solution. Extract. The solid portion present in the extract is separated by filtration or centrifugation using diatomaceous earth as a filtration aid, and S-15183a and S-15183b present in the filtrate or supernatant are converted to sphingosine kinase activity. Is used as an index to extract and purify using its physical properties. For example, in this extract
S-15183a and S-15183b are prepared by first removing contaminating organic solvents by a concentration operation and then immiscible with water under acidic conditions of about pH 3, such as n-butanol, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, chloroform, and chloride. Extraction and purification can be performed using ethylene or methylene chloride alone or in combination. Alternatively, as an adsorbent, for example, activated carbon or an adsorption resin such as Amberlite XAD-2 or XAD-4 (manufactured by Rohm and Haas), Diaion HP-10, HP-20, CHP-20P or HP-50
(Manufactured by Mitsubishi Kasei Corporation) or the like can be used. S
The liquid containing -15183a and S-15183b is passed through a layer of the adsorbent as described above to adsorb and remove impurities,
Or after adsorbing S-15183a and S-15183b,
It is obtained by eluting with methanol water, acetone water, n-butanol water and the like. The thus obtained S-15183a and S-15183b can be further subjected to adsorption column chromatography using a carrier such as silica gel or florisil, or to a distribution column using Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia). Purification can be performed by chromatography, gel filtration chromatography using Sephadex G-25 (manufactured by Pharmacia), or high-performance liquid chromatography using a normal phase or reverse phase column.

【００３３】本発明のS-15183 a またはS-15183bを動脈
硬化症、糖尿病、血栓症、炎症性疾患、自己免疫疾患、
癌の進展や転移、経皮的冠動脈形成術(PTCA)後の再狭窄
などの予防または治療剤として用いる場合、いろいろな
形態で投与される。その投与形態としては例えば錠剤、
カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投
与または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）などをあげる
ことが出来る。これらの各種製剤は、常法に従って主薬
に賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、溶解剤、矯味矯
臭、コーティング剤等既知の医薬製剤分野において通常
使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができ
る。その使用量は症状、年齢、体重、投与方法および剤
形等によって異なるが通常は成人に対して一日１０ｍｇ
乃至１０００ｍｇを投与することができる。The S-15183a or S-15183b of the present invention may be used for treating arteriosclerosis, diabetes, thrombosis, inflammatory disease, autoimmune disease,
When used as a preventive or therapeutic agent for cancer progression or metastasis, restenosis after percutaneous coronary angioplasty (PTCA), etc., it is administered in various forms. Examples of the dosage form include tablets,
Oral administration by capsules, powders, granules, syrups and the like or injections (intravenous, intramuscular, subcutaneous) and the like can be mentioned. These various preparations are prepared by using known auxiliaries which can be usually used in the field of known pharmaceutical preparations such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, dissolving agents, flavoring agents, coating agents, etc. It can be formulated. The amount used depends on the symptoms, age, body weight, administration method and dosage form, but is usually 10 mg daily for adults.
~ 1000 mg can be administered.

【００３４】本発明の化合物S-15183 a およびS-15183b
のスフィンゴシンキナーゼ阻害活性を測定する方法は以
下の通りである（Schroepfer J. R. et al., (1970) J
Biol. Chem. 245, 3084-3090 参照）。Compounds S-15183a and S-15183b of the present invention
The method for measuring the sphingosine kinase inhibitory activity of is as follows (Schroepfer JR et al., (1970) J
Biol. Chem. 245, 3084-3090).

【００３５】即ち、まず、酵素溶液としてウイスターイ
マミチ系雄性ラットの細胞質可溶性画分を調製する。酵
素溶液と、アデノシン三リン酸（以下「ATP 」とい
う）、塩化マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸（以
下「EDTA] という）、メルカプトエタノールを含むリン
酸カリウム緩衝液(pH7.4) 、検体溶液、およびプロピレ
ングリコールに溶解した基質（[3-³H]-D- エリスロ- ス
フィンゴシン (NEN 社製)を混合し、37℃で保温するこ
とによりスフィンゴシンキナーゼ反応を行う。次に、濃
アンモニア水を加えることにより反応を停止させ、クロ
ロホルム：メタノール（２：１、vol/vol ）を加えて抽
出操作を施し、得られた上層の放射活性を液体シンチレ
ーションカウンターで測定する。スフィンゴシンキナー
ゼ活性の算出は、上層に移行した放射活性の割合で示す
ことができる。即ち、基質の³H- スフィンゴシンが³H-
スフィンゴシン-1- リン酸になり、有機層より水層に移
行した割合を測定し、酵素活性を算出する。That is, first, a cytoplasmic soluble fraction of Wistar Imamichi male rat is prepared as an enzyme solution. Enzyme solution, potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing adenosine triphosphate (hereinafter referred to as "ATP"), magnesium chloride, ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter referred to as "EDTA"), mercaptoethanol, sample solution, and propylene A sphingosine kinase reaction is carried out by mixing a substrate ([3- ³ H] -D-erythro-sphingosine (NEN)) dissolved in glycol and keeping the mixture at 37 ° C. The reaction is stopped, chloroform: methanol (2: 1, vol / vol) is added, extraction is performed, and the radioactivity of the obtained upper layer is measured with a liquid scintillation counter. it can be shown by the proportion of radioactivity. that is, a substrate of ³ H- sphingosine ³ H-
The ratio of sphingosine-1-phosphate converted to the aqueous layer from the organic layer is measured, and the enzyme activity is calculated.

【００３６】なお、スフィンゴシンキナーゼの活性測定
は上記以外の方法として基質に放射性の³²P-ATP を用い
るシュピーゲルらの方法（Olivera A. and Spiegel S.,
(1993) Nature , Vol. 365, 557-560 ）などいかなる
方法を用いても良い。The activity of sphingosine kinase is measured by a method other than the above described by Spiegel et al. (Olivera A. and Spiegel S., using radioactive ³² P-ATP as a substrate).
(1993) Nature, Vol. 365, 557-560).

【００３７】[0037]

【実施例】次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれに限定されない。EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

【００３８】実施例1. S-15183 a および S-15183 bの
生産 (1) 生産菌の培養 SANK 15183株を、後述する組成の滅菌した培養培地80ml
を含む500ml の三角フラスコに無菌的に接種した。次い
でこれを８日間、23℃で210rpmのロータリー振とう機で
（前培養抜きの直接本培養による）培養を行なった。Example 1 Production of S-15183a and S-15183b (1) Culture of Produced Bacteria The SANK 15183 strain was transformed into 80 ml of a sterilized culture medium having the composition described below.
Was inoculated aseptically into a 500 ml Erlenmeyer flask containing Then, this was cultured for 8 days at 23 ° C. on a rotary shaker at 210 rpm (direct main culture without pre-culture).

【００３９】培地組成 グリセロール 30 g グルコース 30 g 大豆粉 10 g イースト・エキストラクト 2.5 g 可溶性澱粉 20 g ゼラチン 2.5 g 硝酸アンモニウム 2.5 g 消泡剤 (CB-422: 日本油脂（株）社製） 0.2 mg ──────────────────── イオン交換水で 1000 ml とした。Medium composition Glycerol 30 g Glucose 30 g Soybean flour 10 g Yeast extract 2.5 g Soluble starch 20 g Gelatin 2.5 g Ammonium nitrate 2.5 g Antifoam (CB-422: manufactured by NOF CORPORATION) 0.2 mgと し た Make up to 1000 ml with ion exchanged water.

【００４０】（滅菌前のpH 6.5） (2) 単離 三角フラスコ 10 本分の培養液約 1L に等量のアセトン
を加え 2 時間よく撹袢した。これを pH 3 に調製し、
2L の酢酸エチルで3 回抽出した。酢酸エチル層を飽和
食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃
縮して褐色油状物質 1.2g を得た。これを少量のヘキサ
ンー酢酸エチル、5:1 の溶媒に溶解し、同じ溶媒で平衡
化した100ml のシリカゲルカラムに供与したした。この
カラムを1 Lのヘキサンー酢酸エチル、5:1 の溶媒で溶
出し分画した。酵素阻害活性の認められた分画を濃縮し
たところ、210mg の橙色物質を得た。これを少量のメタ
ノールに溶解し、以下のように調製用 HPLC で精製し
た。すなわち、約 20mg ずつ、アセトニトリル - 水
9:1 の溶液で平衡化した HPLC カラム（Senshu Pak,PE
GASIL 20φX 60 mm ）にチャージし、同じ溶媒で、6 ml
/ 分の流速で展開した。210 nm の吸収を検出し、約 8
分に溶出されるピーク ( S-15183a に相当する。) 、約
13 分に溶出されるピーク ( S-15183b に相当する。)
をそれぞれ分取した。分取した溶液を減圧濃縮して溶媒
を留去したところ、S-15183aおよび S-15183b をそれぞ
れ 140mg、20 mg 得た。(PH 6.5 before sterilization) (2) Isolation An equal volume of acetone was added to about 1 L of the culture solution of 10 Erlenmeyer flasks, and the mixture was stirred well for 2 hours. Adjust this to pH 3 and
Extracted three times with 2 L of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with a saturated saline solution, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to obtain 1.2 g of a brown oily substance. This was dissolved in a small amount of 5: 1 hexane-ethyl acetate solvent and applied to a 100 ml silica gel column equilibrated with the same solvent. The column was eluted with 1 L of hexane-ethyl acetate, 5: 1 solvent and fractionated. The fraction having the enzyme inhibitory activity was concentrated to obtain 210 mg of an orange substance. This was dissolved in a small amount of methanol and purified by preparative HPLC as follows. That is, about 20 mg each of acetonitrile-water
HPLC column equilibrated with 9: 1 solution (Senshu Pak, PE
GASIL 20φX 60 mm) and use the same solvent for 6 ml
Deployed at a flow rate of / min. Detect absorbance at 210 nm, approx. 8
Peak (equivalent to S-15183a)
Peak eluted at 13 minutes (corresponding to S-15183b)
Were separately collected. The fractionated solution was concentrated under reduced pressure and the solvent was distilled off, thereby obtaining 140 mg and 20 mg of S-15183a and S-15183b, respectively.

【００４１】試験例. スフィンゴシンキナーゼ阻害活
性の測定 （1 ）酵素液の調製 スフィンゴシンキナーゼの酵素源としてラット肝臓を用
い、まず以下のようにその細胞質可溶性画分を調製し
た。4 匹のウイスターイマミチ系雄性ラット（12週令）
を頚動脈放血後、肝臓を摘出した。摘出した肝臓を0.15
M の塩化ナトリウム水溶液で軽く濯ぎ、細かくスライス
した後、予め4 ℃に冷却した0.1 Ｍのリン酸バッファー
(pH7.4)80ml を加え、4 ℃条件下、ポッターのホモジナ
イザーを用いて肝細胞の破砕を行った。次に、得られた
細胞破砕液を4 ℃条件下、500xg 、15分の遠心分離を行
い、上清を更に、4 ℃条件下、10,000xgで30分間の遠心
分離を行った。得られた上清を4 ℃条件下、105,000xg
で60分間の超遠心分離を行った。その上清を用いて更に
硫安分画を行い、25％飽和から55％飽和の間で沈澱する
画分を回収した。得られた沈澱を予め4 ℃に冷却したバ
ッファーA （1mM EDTA、1mM メルカプトエタノール、20
％グリセロール、0.1M リン酸カリウム緩衝液、pH7.4
）20mlに溶解した。その溶液をバッファーA 中で一晩
透析し、得られた溶液を酵素溶液とした。この酵素溶液
はスフィンゴシンキナーゼの活性測定時まで-80 ℃にて
凍結保存し、使用時にバッファーA で蛋白質濃度0.5mg/
mlになる様に調製した。Test Example. Measurement of Sphingosine Kinase Inhibitory Activity (1) Preparation of Enzyme Solution Rat liver was used as a sphingosine kinase enzyme source, and its cytoplasmic soluble fraction was prepared as follows. 4 Wistar Imamichi male rats (12 weeks old)
After exsanguinating the carotid artery, the liver was removed. 0.15 excised liver
M sodium chloride solution, lightly rinsed, sliced into small pieces, and then cooled to 4 ° C in 0.1 M phosphate buffer
(pH 7.4), and hepatocytes were crushed using a potter homogenizer at 4 ° C. Next, the obtained cell lysate was centrifuged at 500 × g for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was further centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes at 4 ° C. 105,000xg of the resulting supernatant at 4 ° C
Ultracentrifugation for 60 minutes. Ammonium sulfate fractionation was further performed using the supernatant, and a fraction that precipitated between 25% saturation and 55% saturation was collected. Buffer A (1 mM EDTA, 1 mM mercaptoethanol, 20 mM
% Glycerol, 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4
) Dissolved in 20 ml. The solution was dialyzed overnight in buffer A, and the obtained solution was used as an enzyme solution. This enzyme solution was stored frozen at -80 ° C until the sphingosine kinase activity was measured.
It was prepared to be ml.

【００４２】（2 ）酵素阻害活性の測定 スフィンゴシンキナーゼの阻害活性の測定は、シェファ
ーらの方法（Schroepfer J. R. et al, (1970) J Biol.
Chem. 245, 3084-3090 参照）に準じて、ラット肝臓細
胞質可溶性画分を酵素源に、[3-³H]-D- エリスロ- スフ
ィンゴシン(NEN社製) を基質に用いて行った。即ち、先
ず、酵素溶液（蛋白質濃度0.5 μg/ml）100mul、バッフ
ァーB （10mM ATP、20mM 塩化マグネシウム、1mM EDT
A、1mM メルカプトエタノール、0.1M リン酸カリウム
緩衝液、pH7.4 ）100 μl 、微生物より抽出した検体10
μl 並びにプロピレングリコールに溶解した基質(3-³H-
スフィンゴシン)10 μl を混合し、37℃で20分、インキ
ュベートすることによりスフィンゴシンキナーゼ反応を
行った。次に、濃アンモニア水50μl を加えることによ
り反応を停止させ、クロロホルム：メタノール（２：
１、vol/vol ）を750μl 加えて抽出操作を施し、得ら
れた上層70 μl を96穴プレート（ルーマプレート：パ
ッカード社製）に加えて一晩放置し乾燥させた後、96穴
プレート用液体シンチレーションカウンター（トップカ
ウント：パッカード社製）にて放射活性を測定した。ス
フィンゴシンキナーゼ活性の算出は、上層に移行した放
射活性の割合で示した。即ち、基質の³H- スフィンゴシ
ンが³H- スフィンゴシン-1- リン酸になり、有機層より
水層に移行した割合を測定し、酵素活性を算出した。な
お、系に加えた基質は一定であるので、上層のみの放射
活性を測定することにより酵素活性は算出される。(2) Measurement of enzyme inhibitory activity The inhibitory activity of sphingosine kinase was measured by the method of Scheffer et al. (Schroepfer JR et al, (1970) J Biol.
Chem. 245, 3084-3090), using a soluble fraction of rat liver cytoplasm as an enzyme source and [3- ³ H] -D-erythro-sphingosine (NEN) as a substrate. First, 100 mul of enzyme solution (protein concentration 0.5 μg / ml), buffer B (10 mM ATP, 20 mM magnesium chloride, 1 mM EDT
A, 1 mM mercaptoethanol, 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4) 100 μl, sample 10 extracted from microorganism
μl and the substrate dissolved in propylene glycol (3- ³ H-
(Sphingosine) was mixed and incubated at 37 ° C. for 20 minutes to perform a sphingosine kinase reaction. Next, the reaction was stopped by adding 50 μl of concentrated aqueous ammonia, and chloroform: methanol (2:
1, vol / vol) was added to 750 μl for extraction, 70 μl of the obtained upper layer was added to a 96-well plate (Luma Plate: manufactured by Packard), allowed to stand overnight and dried, and then the liquid for 96-well plate was added. Radioactivity was measured with a scintillation counter (Topcount: manufactured by Packard). The sphingosine kinase activity was calculated by the ratio of the radioactivity transferred to the upper layer. That is, substrate ³ H- sphingosine becomes ³ H- sphingosine-1-phosphate, and measure the percentage of transferred into the aqueous layer from the organic layer, was calculated enzymatic activity. Since the substrate added to the system is constant, the enzyme activity is calculated by measuring the radioactivity of only the upper layer.

【００４３】この方法で測定した、スフィンゴシンキナ
ーゼ反応を50％阻害するのに必要なS-15183 a および
S-15183 bの濃度はそれぞれ3.0 μg/ml, 2.0 μg/mlで
ある。The S-15183a required to inhibit the sphingosine kinase reaction by 50% and the S-15183a and
The concentrations of S-15183b are 3.0 μg / ml and 2.0 μg / ml, respectively.

【００４４】 剤例 １．カプセル剤 処方 S-15183a 100 mg 乳糖 １００ ｍｇ トウモロコシ澱粉 １４８．８ ｍｇ ステアリン酸マグネシウム 1.2 mg 全量 350 mgExamples of Agents Capsule Formulation S-15183a 100 mg Lactose 100 mg Corn starch 148.8 mg Magnesium stearate 1.2 mg Total 350 mg

【００４５】[0045]

【発明の効果】本発明のS-15183 a およびS-15183bおよ
びその塩は、動脈硬化症、糖尿病、血栓症、炎症性疾
患、自己免疫疾患、癌の進展や転移、経皮的冠動脈形成
術(PTCA)後の再狭窄などの予防または治療剤として用い
ることができる。EFFECT OF THE INVENTION S-15183a, S-15183b and salts thereof of the present invention can be used for arteriosclerosis, diabetes, thrombosis, inflammatory diseases, autoimmune diseases, cancer progression and metastasis, percutaneous coronary angioplasty. It can be used as a prophylactic or therapeutic agent for restenosis after (PTCA).

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/35 ＡＢＸ Ａ６１Ｋ 31/35 ＡＢＸ ＡＣＢ ＡＣＢ ＡＤＰ ＡＤＰ ＡＤＵ ＡＤＵ ＡＥＤ ＡＥＤ Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｐ 17/06 //(Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI A61K 31/35 ABX A61K 31/35 ABX ACB ACB ADP ADP ADU ADU AED AED AED C12P 17/06 C12P 17/06 // (C12P 17/06 C12R 1 : 01)

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】下記式(I) で表される新規化合物 S-15183
a ： 【化１】 1. A novel compound S-15183 represented by the following formula (I):
a: 【請求項２】下記式(II)で表される新規化合物 S-15183
b ： 【化２】 2. A novel compound represented by the following formula (II): S-15183
b: embedded image 【請求項３】ゾフィエラ属に属する S-15183a 及び／又
は S-15183b 生産菌を培養し、その培養物より S-15183
a 及び／又は S-15183b を採取することを特徴とする S
-15183a 及び／又は S-15183b の製造法。3. A method for culturing S-15183a and / or S-15183b-producing bacteria belonging to the genus Zofiella and culturing S-15183a from the culture.
a and / or S-15183b
Production method of -15183a and / or S-15183b. 【請求項４】 S-15183a 及び／又は S-15183b 生産菌が
ゾフィエラ・イネルミス種に属することを特徴とする請
求項３記載の製造法。4. The method according to claim 3, wherein the S-15183a and / or S-15183b-producing bacterium belongs to the species Zofiella inermis. 【請求項５】 S-15183a 及び／又は S-15183b 生産菌
が、ゾフィエラ・イネルミス・ケイリュー・マロック・
エト・ケイン（ Zopfiella inermis (Cailleux) Malloc
h et Cain ）ＳＡＮＫ１５１８３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５７３７）である、請求項３または４記載の製造法。5. The method according to claim 5, wherein the S-15183a and / or S-15183b-producing bacterium is Zofiella inermis C. cereulis maloc.
Eto Kane (Zopfiella inermis (Cailleux) Malloc
Het Cain) SANK15183 strain (FERM BP-
5737). 【請求項６】ゾフィエラ・イネルミス・ケイリュー・マ
ロック・エト・ケイン（Zopfiella inermis (Cailleux)
Malloch et Cain ）ＳＡＮＫ１５１８３株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５７３７）。6. Zopfiella inermis (Cailleux)
Malloch et Cain) SANK15183 strain (FERM)
BP-5737).