JPH10108681A - カテプシンｋ遺伝子 - Google Patents

カテプシンｋ遺伝子

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JPH10108681A
JPH10108681A JP9170867A JP17086797A JPH10108681A JP H10108681 A JPH10108681 A JP H10108681A JP 9170867 A JP9170867 A JP 9170867A JP 17086797 A JP17086797 A JP 17086797A JP H10108681 A JPH10108681 A JP H10108681A
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polynucleotide
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cathepsin
seq
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マーク・ディ・アダムス
Judith A Blake
ジュディス・エイ・ブレイク
Christine M Debouck
クリスティーヌ・エム・デブーク
Fred H Drake
フレッド・エイチ・ドレイク
Lisa M Fitzgerald
リサ・エム・フィッツジェラルド
Claire M Fraser
クレア・エム・フレイザー
Maxine Gowen
マキシン・ゴーウェン
Gregg A Hastings
グレッグ・エイ・ヘイスティングス
Wen F Kirkness
イーウェン・エフ・カークネス
Norman H Lee
ノーマン・エイチ・リー
Julie Rood
ジュリー・ロッド
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 結合組織の生理学的および病理学的分解にて
機能を発揮するプロテアーゼである、カテプシンについ
て新しく産生等することが望まれている。 【解決手段】 本発明はカテプシンＫポリペプチド、そ
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に該
ポリヌクレオチドを発現することによるポリペプチドの
産生方法、並びにポリペプチドのアゴニストおよびアン
タゴニストを提供するものである。本発明はさらに、研
究、診断および臨床分野に関連する、このようなポリヌ
クレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴ
ニストの利用方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一つの態様として、
新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド；ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異型およ
び誘導体；ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およ
びそれらの変異型および誘導体の製造方法；ポリペプチ
ドのアゴニストおよびアンタゴニスト；並びにポリヌク
レオチド、ポリペプチド、変異型、誘導体、アゴニスト
およびアンタゴニストの使用に関するものである。とり
わけ、これらのおよびその他の点に関して、本発明はヒ
トカテプシンＫのポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チド、特にカテプシンＫのゲノム配列、とりわけプロモ
ータおよびイントロン配列に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】骨の
吸収は細胞外マトリックスの無機および有機成分の両方
が同時に除去されて起こる。これは主に、破骨細胞の波
状の辺縁で覆われた、酸性の食胞融解小体様細胞外部分
で起こる。Barronら、J.Cell Biol.，101:2210-2222（1
985）。破骨細胞は骨吸収において主要な役割を果たす
多核巨細胞である。破骨細胞は、骨表面に付着して、破
骨細胞と骨マトリックスとの間で酸性の微小環境を創り
出す。この酸性の微小環境は骨の無機および有機成分を
可溶化する。有機成分主にＩ型コラーゲンはプロテアー
ゼ消化により可溶化されると考えられている。システイ
ンプロテイナーゼは骨の有機成分の分解において重要な
役割を果たしうるという証拠がある。システインプロテ
イナーゼの中では、カテプシンＢ、Ｌ、ＨおよびＳが酸
性条件下でＩ型コラーゲンを分解できる。Etherington,
D.J.、Biochem.J.,127,685-692（1972）。カテプシンＬ
は、アゾカゼイン、エラスチンおよびコラーゲンの加水
分解能に関して、最も活性なライソソームシステインプ
ロテアーゼである。
【０００３】カテプシンは、結合組織において、正常な
生理学的および病理学的分解に機能するプロテアーゼで
ある。カテプシンは細胞内のタンパク質分解およびター
ンオーバー、骨の再形成、およびプロホルモンの活性化
において主要な役割を果たす。Marix,J.L.，Science，2
35:285-286（1987）。カテプシンＢ、Ｈ、ＬおよびＳ
は、パパインのスーパーファミリーである偏在性の発現
をするライソソームシステインプロテイナーゼである。
これらはヒトの腎臓、肝臓、肺および脾臓などの多くの
組織に構成成分のレベルで見出される。カテプシンは、
糸球体腎炎、関節炎および癌転移の誘起に病理学的な役
割を果たすこともある。Sloan,B.F.およびHonn,K.V.，C
ancer Metastasis Rev.，3:249-263（1984）。腫瘍細胞
では、カテプシンＬおよびＢ ｍＲＮＡ並びにタンパク
質のレベルが非常に上昇しているのが認められる。カテ
プシンＬｍＲＮＡはまた、腫瘍促進物質および成長因子
で処理した繊維芽細胞においても誘起される。Kane,S.
E.およびGottesman,M.M.，Cancer Biology,1:127-136
（1990）。
【０００４】アルツハイマー病の脳における非システイ
ンプロテアーゼ、カテプシンＤの遺伝子発現および細胞
成分は、エンドソームのライソソーム系に初期上向制御
（アップレギュレーション）するのが明白である。Cata
ldo,A.M.ら、Neuron，14(3),671-680（1995）。骨吸収
に関するインビトロ研究において、カテプシンＬおよび
Ｂがこの組織の再形成を引き起こし得ることが示されて
いる。これらのライソソームシステインプロテアーゼ
は、酸性条件下で、エラスチン、ラミニンおよびI型コ
ラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質を消化す
る。骨芽細胞により成就される骨再発生に先立ち、有機
マトリックスを分解するために、破骨細胞にはこの作用
が必要である。システインプロテイナーゼの天然および
合成阻害物質には、このマトリックスの分解の阻害に有
効であるものもある。カテプシンの単離およびそれらの
骨吸収における役割が、熱心な研究対象となっている。
最近、ＯＣ−２がウサギの骨の純粋な破骨細胞から単離
された。ＯＣ−２は、構造的にカテプシンＬおよびＳに
関連する、システインプロテイナーゼと成り得るものを
コードすることが解っている。Tezuka,K.ら，J.Biol.Ch
em.,269:1106-1109（1994）。
【０００５】システインプロテイナーゼおよびコラゲナ
ーゼの阻害物質、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＣＨＮ2の、単
離破骨細胞の吸収活性に及ぼす影響が研究され、ぞうげ
質における吸収ピットを阻害することが見出されてい
る。Delaisse,J.M.ら，Bone，8:305-313（1987）。また
インビトロでの骨吸収に及ぼすヒト組換えシスタイン
Ｃ、システインプロテイナーゼ阻害物質の影響も評価さ
れており、上皮小体ホルモンにより刺激された骨再吸収
を著明に阻害することが示されている。Lerner,U.H.お
よびGrubb Anders，Journal of Bone and Mineral Rese
arch，7:433-439（1989）。さらに、ヒトシステインプ
ロテアーゼカテプシンＬをコードするｃＤＮＡクローン
は、大腸菌（E.coli）においてＴ７発現系で高レベルで
組換えにより製造および発現されている。組換えヒトプ
ロカテプシンＬは、うまく高レベルで発現され、プロカ
テプシンＬおよび活性なプロセッシングしたカテプシン
Ｌ体の両方の形で精製された。カテプシンＬの折り畳み
および／またはプロセッシングにおけるペプチドの可能
な機能に関する情報、およびプロテアーゼ活性のための
酵素の軽鎖の必要性に関する情報が、これらの領域に構
造的な改変を担う突然変異酵素の発現および精製により
得られた。Smith,S.M.およびGottesman,M.M.，J.Bio Ch
em.,264:20487-20495（1989）。これらは機能的なヒト
カテプシンＳのビール酵母菌（Saccharomyces cerevisi
ae）における発現および組換え酵素の特性化についても
報告している。Bromme,D.ら,J.Biol.Chem.,268:4832-48
38（1993）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記およびその他の課題
に対し、本発明の目的は、ポリペプチドとりわけ図２６
および２７に示すアミノ酸配列とその他のタンパク質の
既知アミノ酸配列、例えばウサギＯＣ−２とヒトカテプ
シンＯｃＤＮＡとの相同性により新規カテプシンＫとし
て同定したものを提供することにある。Tezuka,K.ら,J.
Biol.Chem.,269:1106-1109（1994）。さらに本発明の目
的は、カテプシンＫ、特に本明細書においてカテプシン
Ｋと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供することにある。
【０００７】本発明のとりわけ好ましい態様において、
ポリヌクレオチドは、図１−９［配列番号：１］または
ＡＴＣＣ寄託番号９８０３５（本明細書では寄託クロー
ンと称する）のゲノムＤＮＡ（本明細書では「ｇＤＮ
Ａ」と示す）に示す配列におけるヒトカテプシンＫをコ
ードする領域を包含する。本発明の態様に準じて、ヒト
カテプシンＫを、本発明のさらなる態様において、生物
学的、診断学的、臨床的または治療的に有用なそれらの
変異型、類似体もしくは誘導体、または変異型、類似体
または誘導体の断片等のそれらの断片をコードする単離
核酸分子、例えばｍＲＮＡ類、ｃＤＮＡ類、ゲノムＤＮ
Ａ類等を提供する。本発明のとりわけ好ましい態様は、
ヒトカテプシンＫの天然発生のアレル変異型である。
【０００８】本発明の更なる目的は、カテプシンＫポリ
ペプチド、とりわけ例えば骨粗鬆症、パジェット病、ゴ
ーチャーズ病、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、上皮小
体亢進症、骨分解、転移性腫瘍、リウマチ性関節症、変
形性関節症、歯周病および骨インプラントおよび骨プロ
シーゼス（protheses）とりわけ歯科インプラントの分
解などを引き起こすまたはこれらに関与するヒトカテプ
シンＫポリペプチドを提供することにある。本発明の態
様に準じ、本明細書にてカテプシンＫおよび生物学的、
診断学的、または治療的に有用な断片、それらの変異型
および誘導体、その断片の変異型および誘導体並びに前
掲の類似体と称される、ヒト由来の新規ポリペプチドを
提供する。
【０００９】本発明のとりわけ好ましい態様は、ヒトカ
テプシンＫ遺伝子の天然発生のアレルによりコードされ
るヒトカテプシンＫの変異型である。本発明のもう一つ
の目的は、前述のポリペプチド、ポリペプチド断片、変
異型および誘導体、変異型および誘導体の断片、並びに
前掲の類似体の製造方法を提供することにある。本発明
のとりわけ好ましい態様は、外因性のヒトカテプシンＫ
をコードするポリヌクレオチドを、発現可能な様に挿入
した宿主細胞を宿主においてヒトカテプシンＫを発現す
るような条件下で培養し、発現したポリペプチドを回収
することを含む、前掲のカテプシンＫポリペプチドの製
造方法を提供する。
【００１０】さらに本発明のもう一つの目的は、カテプ
シンＫ遺伝子を欠損する、または欠損が疑われる個体の
薬物の反応性を測定する方法を提供することである。さ
らに本発明のもう一つの目的は、とりわけ生物学的、臨
床的および治療的目的での研究のために前掲のポリペプ
チドおよびポリヌクレオチドを利用する産生物、組成
物、過程および方法を提供することである。本発明の特
定の好ましい態様において、産生物、組成物および方
法、なかでも：細胞をカテプシンＫポリペプチド、ポリ
ヌクレオチドまたは本明細書に開示する抗体に曝露する
ことによりインビトロ、エクソビボまたはインビボでカ
テプシンＫをコードするｍＲＮＡまたはｈｎＲＮＡから
のカテプシンＫポリペプチドを測定することによりカテ
プシンＫの細胞中の発現を評価する方法；カテプシンＫ
ポリヌクレオチドにおける遺伝子変異および異常、例え
ば遺伝子および遺伝子制御配列の欠損を検定する方法；
およびカテプシンＫ機能を増強するために、またはカテ
プシンＫ機能障害を治療するために、生体にカテプシン
Ｋポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与する方法
を提供する。
【００１１】本発明の特定の好ましい態様において、ヒ
トカテプシンＫ配列に特異的にハイブリダイズするプロ
ーブを提供する。本発明のさらに好ましい態様におい
て、カテプシンＫポリペプチドに対する抗体を提供す
る。この点に関して特に好ましい態様では、その抗体は
ヒトカテプシンＫに対して高選択的である。本発明の他
の態様では、カテプシンＫアゴニストを提供する。とり
わけ好ましいアゴニストは、カテプシンＫ結合分子、ま
たは受容体分子に結合する、およびカテプシンＫ誘起反
応を引き出すまたは増強するカテプシンＫ擬似分子であ
る。また、とりわけ好ましいアゴニストは、カテプシン
ＫもしくはカテプシンＫポリペプチド、またはその他の
カテプシンＫ活性制御物質と相互作用し、それによりカ
テプシンＫの効果またはカテプシンＫの効果以上の効果
を可能にするかまたは増強する分子である。
【００１２】本発明のさらに別の態様において、カテプ
シンＫアンタゴニストを提供する。とりわけ好ましいア
ンタゴニストは、カテプシンＫ受容体または結合分子に
結合するが、一つまたは一つ以上のカテプシンＫ誘起反
応を引き出さないようなカテプシンＫ擬似分子である。
また、とりわけ好ましいアンタゴニストは、、カテプシ
ンＫの一つまたは一つ以上の効果を阻害するするため
に、カテプシンＫと結合または相互作用する。アゴニス
トおよびアンタゴニストは、カテプシンＫポリペプチド
の作用を擬似、増強または阻害するために使用できる。
これらは、例えば、骨粗鬆症、パジェット病、ゴーチャ
ーズ病、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、上皮小体亢進
症、骨分解、転移性腫瘍、および骨インプラントおよび
骨プロシーゼス（protheses）とりわけ歯科インプラン
トの分解の処置に用いることができる。このようなアン
タゴニストは、とりわけ骨粗鬆症、パジェット病、ゴー
チャーズ病、アルツハイマー病、上皮小体亢進症、骨分
解、転移性腫瘍、ＣＮＳ炎症、リウマチ性関節症、変形
性関節症、歯周病および骨インプラントおよび骨プロシ
ーゼス（protheses）とりわけ歯科インプラントの分解
の処置に有用である。
【００１３】本発明の更なる態様は、インビトロで細胞
に、エクソビボで細胞におよびインビボで細胞に、また
は多細胞生体に投与するための、カテプシンＫポリヌク
レオチドまたはカテプシンＫポリペプチドを含む組成物
を提供する。本発明の特に好ましい態様において、その
組成物は、疾患の処置のために宿主生体においてカテプ
シンＫポリペプチドを発現するためのカテプシンＫポリ
ヌクレオチドを含む。この点に関して、特に好ましい態
様は、内因性カテプシンＫの異常活性に関連する機能不
全の処置のための、または治療用に提供するための、ヒ
ト患者における発現である。
【００１４】本発明のその他の目的、特徴、優越点およ
び見解は、以下の記載より当業者には明白であろう。し
かしながら、以下の記載および具体的な実施例は本発明
の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示
すものであることを理解されたい。開示した本発明の意
図および範囲内での種々の変化および改変は、以下の記
載および本明細書のその他の部分の知識により、当業者
に容易に明らかとなろう。
【００１５】定義 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される幾つかの用語の理解を容易くするために示すもの
である。説明は便宜上示すものであり、本発明を限定す
るものではない。「ＤＮＡ消化」とは、ＤＮＡの特定の
配列でのみ作用する制限酵素による、ＤＮＡの触媒的切
断を意味する。本明細書における種々の制限酵素は、市
販により入手可能であり、反応条件、コファクターおよ
びそのたの使用に必要なものは、当業者に周知であり、
通常的に用いられるものである。分析の目的では、典型
的なものではプラスミドまたはＤＮＡ断片１μｇを、反
応緩衝液約２０ｍｌ中酵素約２単位で消化する。プラス
ミド構築用に、ＤＮＡ断片を単離する目的では、典型的
なものではＤＮＡ５〜５０μｇを、酵素約２０〜２５０
単位で、相対的に高容量中で消化する。
【００１６】特定の制限酵素のための適当な緩衝液およ
び基質量は、以下に引用するような標準的な実験マニュ
アルに記載されており、それらは商業的供給者により規
定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション
時間は、通常用いられるものであるが、標準的な方法、
供給者の指示書および反応の特色に応じて変更できる。
消化後、当業者に通常的な周知の方法により、反応物を
分析し、寒天またはポリアクリルアミドゲルの電気泳動
により断片を精製できる。
【００１７】「遺伝的要素」とは、一般的にポリペプチ
ドをコードする領域もしくは転写もしくは翻訳、もしく
は宿主細胞においてポリペプチドを発現するのに重要な
その他の過程を制御する領域を含むポリヌクレオチド、
またはポリペプチドをコードする領域、およびそれらに
機能的に連結した発現を制御する領域の両方を含むポリ
ヌクレオチドを意味する。
【００１８】遺伝的要素は、エピソーム要素即ち宿主細
胞ゲノムと物理的に独立した分子として複製するベクタ
ー内に含まれる得る。これらは真核細胞におけるメソト
レキセート選別によりトランスフェクトしたＤＮＡの増
幅中に現れるようなミニ染色体の中に含まれ得る。遺伝
的要素はまた、天然の状態ではなく、むしろ単離、クロ
ーニングおよび宿主細胞への導入のような操作の後に、
精製ＤＮＡの形態で宿主細胞ゲノム内またはとりわけベ
クター内にも含まれ得る。
【００１９】「同一性」とは、ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチド配列の２本の鎖の間の適合の同一性により
決定できるような、二つのポリペプチドまたは二つのポ
リヌクレオチド配列間の配列相関性の程度を意味する。
同一性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチドま
たはポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多
くあるが、「同一性」なる用語は、当業者に周知である
（Computational Molecular Biology、Lesk,A.M.編、オ
ックスフォードユニバーシティープレス、ニューヨー
ク、1988年；Biocomputing：Informatics and Genome P
rojects、Smith,D.W.編、アカデミックプレス、ニュー
ヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequence Dat
a、第一部、Grifin,A.M.およびGrifin,H.G.編、ヒュー
マンプレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Ana
lysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、アカデ
ミックプレス、1987年；およびSequence Analysis Prim
er、Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン
プレス、ニューヨーク、1991年）。二つの配列を同一性
を測定するのに用いる一般的な方法には、Guide to Hug
e Computers、Martin,J.Bishop編、アカデミックプレ
ス、サンディエゴ、1994年並びにCarillo,H.およびLipm
an,D.、SIAM J.Applied Math.,48：1073（1988）に開示
されているもの等があるが、これらに限定するものでは
ない。同一性を測定するための好ましい方法は、試験す
る二つの配列間のの最も大きな適合部分を得るように設
計したものである。このような方法は、コンピューター
プログラムに組み立てられている。二つの配列間の同一
性を測定するための好ましいコンピュータープログラム
法には、これらに限定するものではないが、ＧＣＧプロ
グラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Res
earch，12(1):387（1984））、BLASTP、BLASTN、FASTA
（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403（1990））等
がある。
【００２０】「単離」とは、「人工的に」天然の状態か
ら変化させられた、すなわち、それが天然に存在する場
合、元来の環境から変化させるもしくは取り出す、また
はその両方を行ったことを意味する。例えば天然発生の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で
生存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、
同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に
共存する物質の幾つかまたは全てから分離されている場
合は、本明細書に用いる用語である、「単離」がなされ
ている。単離の一部として、または単離に引き続いて、
このようなポリヌクレオチドは、ＤＮＡの様なその他の
ポリヌクレオチドに結合して突然変異を誘発し、融合タ
ンパク質を形成し、例えば宿主中で伸長または発現する
ことができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、または
ベクターの様なその他のポリヌクレオチドと結合して、
培養物中または全生物体中の宿主細胞に導入できる。培
養物中または全生物体中の宿主細胞に導入されたＤＮＡ
も本明細書に用いる用語である、単離をしたといえる。
というのはこれらは天然発生の形態または環境にはない
からである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、培地製剤例えば細胞にポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドを導入するための溶液、化学的または酵素
的反応のための組成物または溶液等の組成物にも生じる
ことができ、これらは天然には存在しない組成物であ
り、本明細書に用いる用語の単離されたポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの範疇である。
【００２１】「ライゲーション」とは、最も多くは２本
鎖ＤＮＡである、２個またはそれ以上のポリヌクレオチ
ド間のホスホジエステル結合を形成する工程を意味す
る。ライゲーション技術は当業界に周知であり、ライゲ
ーションプロトコールは標準的な実験マニュアルおよび
参考文献、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A L
aboratory Manual、第２版；コールドスプリングハーバ
ー・ラボラトリープレス、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク（1989）およびManiastisら、（以下
に引用）146頁に記載されている。
【００２２】「（複数の）オリゴヌクレオチド」とは、
比較的短いポリヌクレオチドを意味する。この用語はし
ばしば一本鎖デオキシリボヌクレオチドを意味するが、
同様に一本鎖、二本鎖または三本鎖リボヌクレオチド、
アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブ
リッドおよびとりわけ二本鎖ＤＮＡを意味することがで
きる。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプロー
ブオリゴヌクレオチドは、しばしば自動オリゴヌクレオ
チド合成器にかける等の化学的方法により合成される。
しかしながら、オリゴヌクレオチドはインビトロ組換え
ＤＮＡ媒介法および細胞および生体におけるＤＮＡの発
現によるなどの種々のその他の方法により作ることがで
きる。
【００２３】最初、化学合成したＤＮＡは、典型的なも
のでは５’リン酸塩なしで得られる。このようなオリゴ
ヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子を形成す
るのに通常使用されるＤＮＡリガーゼを用いるライゲー
ション反応によるホスホジエステル結合形成のための基
質ではない。このようなオリゴヌクレオチドのライゲー
ションが望まれる場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いる
ような標準法により、リン酸塩を添加できる。化学合成
したオリゴヌクレオチドの３’末端は、通常遊離の水酸
基を有し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼの存在下、
容易に別のオリゴヌクレオチドのような別のポリヌクレ
オチドの５’リン酸塩とホスホジエステル結合を形成す
る。周知のように、この反応は、望む場合、ライゲーシ
ョンの前にその他の（複数の）ポリヌクレオチドの５’
リン酸塩を除去することにより、選択的に防御できる。
【００２４】「プラスミド」は、本明細書では通常前に
小文字のｐを付し、および／または続いて大文字および
／または数字で示し、当業者に周知の標準命名法に準じ
る。本明細書に開示する出発プラスミドは、制約を受け
ずに市販により、公に入手可能であるかまたは、周知の
確立された技法を通常的に適用することにより、入手可
能なプラスミドから構築することができる。本発明に準
じて使用できる多くのプラスミド並びにその他のクロー
ニングおよび発現ベクターは、周知であり、当業者に容
易に入手できる。さらに、当業者は本発明の使用に適し
たその他のプラスミドをいくらでも容易に構築すること
ができる。本発明におけるこのようなプラスミドおよび
その他のベクターの特性、構築および使用は、本明細書
より当業者に容易に理解され得る。
【００２５】「（複数の）ポリヌクレオチド」とは、通
常改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変
されたＲＮＡもしくはＤＮＡになり得る任意のポリリボ
ヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意
味する。従って、例えば本明細書で用いるポリヌクレオ
チドは、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖お
よび二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二
本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖および二本鎖領域の混合物で
あるＲＮＡ、一本鎖もしくはより通常的には二本鎖、ま
たは一本鎖および二本鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよ
びＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味する。さらに、
本明細書で用いいるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしく
はＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域
を意味する。そのような領域における鎖は同一の分子ま
たは異なる分子からのものでよい。この領域は一つまた
はそれ以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には
分子の一部の領域のみを含む。三重らせんの分子の一つ
は、しばしばオリゴヌクレオチドである。
【００２６】本明細書で用いるポリヌクレオチドなる用
語には、一つまたはそれ以上の改変した塩基を含有す
る、上述のＤＮＡまたはＲＮＡ等が含まれる。このよう
に、安定性またはその他の理由で改変した骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で意図する用語である
「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシン等の通
常的でない塩基、またはトリチル化塩基等の改変塩基を
含むＤＮＡまたはＲＮＡは（二つの例だけをを示す）、
本明細書で用いられる用語である、ポリヌクレオチドで
ある。当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮ
ＡおよびＲＮＡに、非常に多くの改変がなされているこ
とは、明らかであろう。本明細書で用いられるポリヌク
レオチドなる用語は、ポリヌクレオチドのこのような化
学的、酵素的または代謝的に改変した形態、およびとり
わけウイルスおよび単細胞および複合細胞等の細胞に特
徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００２７】本明細書で用いる「ポリペプチド」には、
以下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペ
プチドの基本的な構造は周知であり、非常に多くの参考
書およびその他の当業界の発行物に記載されている。こ
れに鑑み、本明細書で用いるこの用語は、ペプチド結合
により直鎖で互いに結合している2個またはそれ以上の
アミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味
する。本明細書で用いるこの用語は、当業界で通常例え
ばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマー、とも称
する両方の短鎖、および多くの型がある当業界で一般的
にタンパク質と称する長鎖を意味する。
【００２８】ポリペプチドはしばしば通常２０個の天然
発生アミノ酸と称される２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含有し、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プ
ロセッシングおよびその他の翻訳後改変のような天然の
工程によるのみならず、また当業者に周知の化学的改変
技術によっても、上記のポリペプチドを改変できること
は理解されよう。ポリペプチドに天然に起こる通常的な
改変は余りにも多いので、余すところなく掲示すること
はできないが、基礎的な参考書およびさらに詳細な論文
並びに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これ
らは当業者に周知である。本発明のポリペプチドに施す
ことができる既知の改変には、説明のために幾つか示す
と、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体への共有結合、脂質
または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトー
ルへの共有結合、交差架橋、環状化、ジスルフィド結合
形成、ジメチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形
成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマー−カ
ルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水
酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タ
ンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル
化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化の
ようなトランスファーＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミ
ノ酸の添加、およびユビキチネーション（ubiquitinati
on）などがある。
【００２９】このような改変は当業者に周知であり、科
学文献に非常に詳細に記載されている。幾つかのとりわ
け通常的な改変、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸
化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化、水酸
化およびＡＤＰリボシル化等が最も基礎的な参考書、例
えばProteins-Structure and Molecular Properties、
第2版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニ
ューヨーク（1993）に記載されている。多くの詳細な論
文例えば、Posttranslational Covalent Modification
of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、ニ
ューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Prot
ein Modifications ：Perspective andProspects、1〜1
2頁；Seifterら、Analysis for Protein Modifications
and nonprotein cofactors、Meth.Enzymol.182:626-64
6（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttr
anslational Modification and Aging，Ann.N.Y.Acad.S
ci.663:48-62（1992）の記載が、本主題に利用できる。
【００３０】ポリペプチドはいつも完全に直鎖であると
は限らないということは周知であり、上述の通りである
と理解されよう。例えばポリペプチドはユビキチネーシ
ョンの結果分岐でき、一般的には、天然のプロセッシン
グなどの翻訳後の事象および天然では起こり得ない人為
的操作によりもたらされる事象の結果、分岐のある、ま
たは分岐のない環状にできる。環状、分岐および分岐し
た環状ポリペプチドは、非翻訳天然の工程により、およ
び同様に全く合成的な方法で、合成できる。改変はペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ
ル末端など、ポリペプチドの至る所で起こりうる。実
際、共有結合の改変による、ポリペプチドのアミノまた
はカルボキシル基またはその両方の遮断は、天然に起こ
り、合成ポリペプチドおよびこのような改変は同様に本
発明のポリペプチドに存在し得る。例えば、大腸菌（E.
coli.）で作られるポリペプチドのアミノ末端残基は、
タンパク質溶解のプロセッシングの前に殆ど必ずＮ−ホ
ルミルメチオニンになる。
【００３１】ポリペプチドに起こる改変はしばしばそれ
の作り方に影響される。例えば宿主のクローン遺伝子の
発現により作られるポリペプチドでは、大部分の改変の
特性および程度は宿主細胞の翻訳後改変能力およびポリ
ペプチドのアミノ酸配列に存在する改変信号により決定
される。例えば、周知のように、グリコシル化はしばし
ば大腸菌のような細菌宿主では起こらない。従って、グ
リコシル化が望まれる場合、ポリペプチドはグリコシル
化宿主、一般的には真核細胞に発現すべきである。昆虫
細胞がしばしば哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化
に用いられ、この理由で昆虫細胞発現系が、とりわけグ
リコシル化の本来のパターンを有する哺乳動物タンパク
質を効率よく発現するように改造されている。同様の考
察がその他の改変にも適用される。
【００３２】改変の同一の型は、上記ポリペプチドの幾
つかの部分で同じまたは異なる程度で存在しうると理解
されよう。また、上記ポリペプチドには改変の多くの型
が存在できる。一般的に、本明細書で用いる用語である
ポリペプチドは、このような全ての改変特に宿主細胞に
おいてポリヌクレオチドを発現することにより合成した
ポリペプチドに存在する改変を包含する。
【００３３】本明細書で用いるポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの「（複数の）変異型」なる用語は、参照
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なるポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味で
の変異型は、本明細書の以下およびその他の部分でより
詳細に記載する。 （１） 別の配列、参照ポリヌクレオチドとはヌクレオ
チド配列が異なるポリヌクレオチド。一般的に差異はヌ
クレオチドの参照配列および変異型が、全体的に非常に
類似しており、多くの領域で同等であるように限定され
る。以下に記すように、変異型におけるヌクレオチドの
配列の変化はサイレントでよい。すなわち、ポリヌクレ
オチドによりコードされるアミノ酸には変化がなくてよ
い。変化がこの型のサイレント変化はに限定される場
合、変異型は、参照体と同一のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードするであろう。また以下に記すよう
に、変異型のヌクレオチド配列における変化が、参照ポ
リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列を変化させ得る。このようなヌクレオチドの変
化は、以下に論じるように、参照配列によりコードされ
るポリペプチドにおけるアミノ酸置換、添加、欠損、融
合およびトランケーションを招く。
【００３４】（２） アミノ酸配列が他すなわち参照ポ
リペプチドとは異なるポリペプチド。一般的に差異は、
参照体および変異型の配列が、全体的に非常に類似して
おり、多くの領域で同等であるように限定される。変異
型および参照ポリペプチドは、１またはそれ以上の置
換、添加、欠損、融合およびトランケーションが任意の
組み合わせで起こることにより、アミノ酸配列が変化し
うる。
【００３５】本明細書で用いる「受容体分子」とは、本
発明のカテプシンＫポリペプチドと特異的に結合または
相互作用する分子であり、古典的な受容体および酵素基
質（両者共に好ましい）のみならず本発明のポリペプチ
ドと特異的に結合または相互作用するその他の分子（各
々「結合分子」「相互作用分子」、並びに「カテプシン
Ｋ結合分子」および「カテプシンＫ相互作用分子」とも
称する）も含まれる。これらの、カテプシンＫ結合分子
はまた例えばカテプシンＫ基質類似体をも含む。本発明
のポリペプチドおよびこのような分子、例えば受容体ま
たは結合もしくは相互作用分子等との結合は、本発明の
ポリペプチドに対して独占的にでき、これは非常に好ま
しいことであり、または本発明のポリペプチドに非常に
特異的にでき、これは非常に好ましいことであり、また
は本発明のポリペプチドを含むタンパク質群に非常に特
異的にでき、これは非常に好ましいことであり、または
本発明のポリペプチドを少なくとも一つ含むタンパク質
群の幾つかに非常に特異的にできる。受容体、例えば本
発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体
由来物質もまた非天然発生である。
【００３６】
【発明の実施の形態】本発明はとりわけ以下により詳細
に記載する、新規カテプシンＫポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドに関する。具体的には、本発明は、ウサギ
ＯＣ−２およびヒトカテプシンＯｃＤＮＡに対してアミ
ノ酸配列相同性という点で関連している新規ヒトカテプ
シンＫのポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関す
る。Tezuka,K.ら、J.Biol.Chem.、269:1106-1109（199
4）。本発明は特に図１−９［配列番号：１］に示すヌ
クレオチド配列を有するカテプシンＫ、および本明細書
において「寄託クローン」または「寄託クローンのｇＤ
ＮＡ」と称するＡＴＣＣ寄託番号９８０３５のｇＤＮＡ
のカテプシンＫヌクレオチド配列に関する。図１−９
［配列番号：１］に示すヌクレオチド配列は、本明細書
の別の部分でさらに具体的に示すように、寄託クローン
のｇＤＮＡをシークエンシングすることにより入手した
ことは理解されよう。従って、寄託クローンの配列は、
二者間の任意の不一致に関しては、寄託クローンの配列
に従うものとする。
【００３７】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様に準じて、図１０および１１［配列
番号：２０］の誘導アミノ酸配列（誘導アミノ酸配列に
関しては図２８をも参照）を有するカテプシンＫポリペ
プチドをコードする単離ポリヌクレオチド、または寄託
クローンのｇＤＮＡによりコードされるカテプシンＫポ
リペプチドを提供する。本明細書に提供する情報を用い
て、図１−９［配列番号：１］に示すポリヌクレオチド
配列のようなヒトカテプシンＫポリペプチドをコードす
る本発明のポリヌクレオチドは、出発物質としてヒトの
細胞からのＤＮＡを用いて、ｇＤＮＡをクローニングす
るような標準的なクローニングおよびスクリーニングの
手法を用いて得ることができる。本発明の実例となる図
１−９［配列番号：１］に示すポリヌクレオチドは、実
施例１に記載するヒトｇＤＮＡライブラリーで見出され
た。
【００３８】寄託クローンのヒトカテプシンＫをコード
するｇＤＮＡシークエンシングの結果に示されるよう
に、本発明のヒトカテプシンＫはカテプシンファミリー
のその他のタンパク質に構造的に相関する。このように
得られたｇＤＮＡ配列を図１−９［配列番号：１］に示
す。これはイントロンは除去するが、エキソンは全て含
む、約３２９個のアミノ酸基のタンパク質をコードする
非近接的なオープンリーディングフレームを含有する。
本発明のポリヌクレオチドは、クローニングにより得る
か、もしくは化学合成技術により産生するか、またはそ
れらを組み合わせて得られた、ｍＲＮＡまたはｈｎＲＮ
ＡなどのＲＮＡの形態で、または例えばｃＤＮＡおよび
ｇＤＮＡなどのＤＮＡの形態でよい。ＤＮＡは三本鎖、
二本鎖または一本鎖でよい。一本鎖ＤＮＡは有意（セン
ス）鎖として知られているコード鎖でよく、またアンチ
センス鎖とも称する非コード鎖でもよい。ポリペプチド
をコードするコード配列は、図１−９［配列番号：１］
に示すポリヌクレオチドまたは寄託クローンのポリヌク
レオチドのエキソン配列に同等にできる。ポリヌクレオ
チドは、また、遺伝子コードの冗長性（退化）の結果、
図１０および１１［配列番号：２０］のＤＮＡまたは寄
託ｇＤＮＡのポリペプチドをコードする異なる配列を有
するポリペプチド、例えばこれらに限定するものではな
いが、このようなｇＤＮＡから転写したスプライス変異
型等でもよい。
【００３９】図１−９［配列番号：１］のポリペプチド
または寄託ｇＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
コードする本発明のポリヌクレオチドには、限定するも
のではないが、単独の成熟ポリペプチドのコード配列；
成熟ポリペプチドをコードする配列および付加コード配
列、例えばプレ、プロ、プレプロタンパク質配列等のリ
ーダーまたは分泌配列をコードするコード配列；限定す
るものではないが、例えば転写、例えばスプライシング
およびポリアデニル化信号等のｍＲＮＡプロセッシン
グ、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性において役
割を担う、転写された非翻訳配列等のイントロン並びに
非コード５’および３’配列等の、付加非コード配列と
共に、前述の付加コード配列を伴うかまたは伴わない成
熟ポリペプチドのコード配列；付加機能性を付与するよ
うな付加アミノ酸をコードする付加コード配列等があ
る。このように、例えばポリペプチドはペプチドのよう
な誘導ポリペプチドの精製を促すマーカー配列例えばペ
プチドを融合できる。本発明のある好ましい態様におい
て、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例え
ば、とりわけベクターｐＱＥ−９に提供されるタグであ
り、多くが市販により入手可能である。例えばGentz
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク
質の精製に便宜的に提供される。ＨＡタグはインフルエ
ンザヘマググルチニンタンパク質由来のエピトープに対
応し、これについては例えばWilsonら、Cell，37:767
（1984）に記載されている。
【００４０】前述に準じ、本明細書で用いる「ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本発
明のポリペプチド、とりわけ図１０および１１［配列番
号：２０］に示すアミノ酸配列を有するヒトカテプシン
Ｋ、または寄託クローンのｇＤＮＡによりコードされる
ヒトカテプシンＫのアミノ酸配列をコードする配列など
のポリヌクレオチドを包含する。この用語は、（例えば
イントロンに干渉される）ポリペプチドをコードする単
一の連続領域または不連続領域を付加領域と共に含み、
コードおよび／または非コード配列をも含有し得るポリ
ヌクレオチドを包含する。
【００４１】本発明はさらに、図１０および１１［配列
番号：２０］の誘導アミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、または寄託クローンのｇＤＮＡのエキソンによりコ
ードされるポリペプチドの断片、類似体および誘導体を
コードする、上述のポリヌクレオチドの変異型に関し、
これに限定するものではないが、このようなｇＤＮＡか
ら転写したスプライス変異型等がある。ポリヌクレオチ
ドの変異型には天然発生アレル変異型またはスプライス
変異型のような天然発生変異型でよく、または天然に発
生することが知られていない変異型でもよい。このよう
な非天然発生のポリヌクレオチドの変異型は、ポリヌク
レオチド、細胞または生体等に突然変異誘発技法を施し
たりすることにより作ることができる。このようなポリ
ヌクレオチドの非天然発生変異型は、スプライス受体、
供与体および／または分岐部位を改変することにより、
またはｇＤＮＡを天然には発現しない細胞またはこのよ
うな細胞から作った細胞抽出物中にｇＤＮＡを発現する
ことにより作ることができる。この観点における変異型
は、前述のヌクレオチド置換、欠損または付加によるポ
リヌクレオチドとは異なる。置換、欠損または付加は１
またはそれ以上のヌクレオチドに起こる。変異型はコー
ドもしくは非コード領域またはその両方において変化し
得る。コード領域における変化は保存的または非保存的
アミノ酸置換、欠損または付加を産み出す。
【００４２】この点に関する本発明の特に好ましい態様
は、図１−９［配列番号：１］に示すカテプシンＫのポ
リヌクレオチド配列、または寄託クローンのｇＤＮＡの
カテプシンＫのポリヌクレオチド配列；それらの変異
型、類似体、誘導体および断片、並びに変異型、類似体
および誘導体の断片である。この点に関する本発明の特
に好ましい態様は、カテプシンＫ変異型、類似体、誘導
体および断片、並びにその断片の変異型、類似体および
誘導体の断片をコードするポリヌクレオチドであり、図
１０および１１［配列番号：２０］のまたは寄託物のカ
テプシンＫポリペプチドのアミノ酸配列に幾つか、少し
の、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個のア
ミノ酸残基を置換、欠損または付加を任意の組み合わせ
で施したアミノ酸配列を有する。中でもとりわけ好まし
いものは、サイレント置換、付加および欠損であり、カ
テプシンＫの特性および活性を変化しない。また、この
点に関してとりわけ好ましいものは、保存置換である。
最も好ましいものは、置換を施さない、図１０および１
１［配列番号：２０］の、または寄託物のアミノ酸配列
を有するポリペプチドである。
【００４３】本発明のさらに好ましい態様は、図１０お
よび１１［配列番号：２０］に示すアミノ酸配列を有す
るカテプシンＫをコードするポリヌクレオチド、または
上述のそれらの変異型、正確な相同体、誘導体および類
似体、並びにこのようなポリヌクレオチドに相補的なポ
リヌクレオチドに、少なくとも７０％の同一性を有する
ポリヌクレオチドである。また別に、最も好ましいポリ
ヌクレオチドは寄託クローンのｇＤＮＡのカテプシンＫ
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそ
れらに相補的なポリヌクレオチドに少なくとも８０％の
同一性を有する領域を含むポリヌクレオチドである。こ
の点に関して、とりわけ好ましいポリヌクレオチドは少
なくとも９０％の同一性を有するものであり、特に好ま
しいのは少なくとも９５％の同一性を有するものであ
る。さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中
でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも
少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特
に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好
ましい。
【００４４】本発明のさらに好ましい態様は、カテプシ
ンＫイントロンポリヌクレオチド配列を包含するポリヌ
クレオチド、特にイントロン１［配列番号：４］、２
［配列番号：６］、３［配列番号：８］、４［配列番
号：１０］、５［配列番号：１２］、６［配列番号：１
４］または７［配列番号：１６］を包含し、図１−９
［配列番号：１］および１２−２４［配列番号：２−１
９］に示す配列を有するポリヌクレオチド、または上述
のそれらの変異型、正確な相同体、誘導体および類似
体、並びにこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチドである。本発明のその他の好ましい態様
は、カテプシンＫイントロン１［配列番号：４］、２
［配列番号：６］、３［配列番号：８］、４［配列番
号：１０］、５［配列番号：１２］、６［配列番号：１
４］または７［配列番号：１６］を包含し、カテプシン
Ｋ以外の遺伝子のエキソンに効果的に連結された、また
はカテプシンＫエキソンおよびその他の遺伝子のエキソ
ンを結合したポリヌクレオチドである。
【００４５】また本発明のその他の好ましい態様は、カ
テプシンＫエキソンポリヌクレオチド配列を含むポリヌ
クレオチド、特に、エキソン１［配列番号：３］、２
［配列番号：５］、３［配列番号：７］、４［配列番
号：９］、５［配列番号：１１］、６［配列番号：１
３］、７［配列番号：１５］または８［配列番号：１
７］を包含し、図１−９［配列番号：１］および１２−
２４［配列番号：２−１９］に示すエキソンポリヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチド、または上述のそ
れらの変異型、正確な相同体、誘導体および類似体、並
びにこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチドである。本発明のその他の好ましい態様は、カテ
プシンＫエキソン１［配列番号：３］、２［配列番号：
５］、３［配列番号：７］、４［配列番号：９］、５
［配列番号：１１］、６［配列番号：１３］、７［配列
番号：１５］または８［配列番号：１７］を包含し、カ
テプシンＫ以外の遺伝子のイントロンに効果的に連結さ
れたポリヌクレオチドである。
【００４６】本発明のさらに好ましい態様は、特異的に
スプライスしたポリヌクレオチド、特に以下のエキソン
−エキソンペア：1−3、1−4、1−5、1−6、1−7、1−
8、2−4、2−5、2−6、2−7、2−8、3−4、3−5、3−
6、3−7、3−8、4−5、4−6、4−7、4−8、5−7、5−8
または６−８を何れか一つまたはそれ以上含むポリヌク
レオチドである。本発明の特に好ましい態様は、細胞内
で機能するポリペプチド、特にカテプシンＫの生物学的
活性を有するポリペプチド、とりわけヒト細胞に発現す
るポリペプチドをコードする特異的にスプライスしたポ
リヌクレオチドである。
【００４７】エキソン−エキソンペアを含むポリヌクレ
オチドは、天然発生のスプライス変異型のような天然発
生の変異型でよく、または天然に発生すると知られてい
ない変異型でよい。このようなポリヌクレオチドの非天
然発生の変異型は突然変異誘発技術をこれらをポリヌク
レオチド、細胞または生体に適用したりして作ることが
できる。このようなポリヌクレオチドの非天然発生の変
異型は、スプライス受体、供与体および／または分岐部
位を改変することにより、または天然にはｇＤＮＡを発
現しない細胞またはこのような細胞から作った細胞抽出
物中でｇＤＮＡを発現させることにより作ることができ
る。エキソン−エキソンペアは完全に融合したエキソン
か、またはエキソンの断片を、存在するスプライス結合
部で融合できる。エキソン断片を含む好ましいエキソン
−エキソンペアは、一つが機能的なスプライス供与体部
位を含み、他方が機能的なスプライス受体部位を含み、
両者がイントロンにより機能的に連結している、少なく
とも2つのエキソンから作ることができる。
【００４８】この点に関するとりわけ好ましい態様は、
図１０および１１［配列番号：２０］のｃＤＮＡまたは
寄託クローンのｇＤＮＡにコードされる成熟ポリペプチ
ドと実質的に同一の生物学的機能または活性を保持する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本
発明はさらに本明細書上述の配列にハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに関する。この点に関して、本発明は
特にストリンジェント状態で本明細書上述のポリヌクレ
オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で用いる「ストリンジェント状態」なる用
語は、配列間の同一性が少なくとも９５％、好ましくは
少なくとも９７％である場合のみに起こるハイブリダイ
ゼーションを意味する。
【００４９】本発明のポリヌクレオチド検定に関してこ
こでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌクレ
オチドは、カテプシンＫをコードするｃＤＮＡ全長およ
びゲノムクローンを単離するため、およびヒトカテプシ
ンＫ遺伝子に高度な配列類似性を有するその他の遺伝子
のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するためのｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用することができる。このようなプローブ
は通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこのよう
なプローブは少なくとも30塩基を有し、少なくとも50塩
基を有することができる。とりわけ好ましいプローブは
少なくとも30塩基を有し、50塩基以下である。例えばカ
テプシンＫ遺伝子のコード領域は、既知ＤＮＡ配列を用
いてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、スクリーニ
ングすることにより単離できる。本発明の遺伝子の配列
に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、次
に、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライ
ブラリーのスクリーニングに用い、プローブがハイブリ
ダイズするライブラリーのメンバーを決定する。
【００５０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒト疾患の処置法および診断法の発見のために
研究物質および材料として使用でき、とりわけポリヌク
レオチド検定に関連して本明細書でさらに論じる。本発
明のポリヌクレオチドは付加アミノ酸またはカルボキシ
ル末端アミノ酸を加えた成熟タンパク質、または成熟タ
ンパク質に内在するアミノ酸である（例えば成熟形態が
一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチド
をコードできる。このような配列は前駆体から成熟形態
へのタンパク質のプロセッシングに役割を担い、タンパ
ク質のトラフィッキング（trafficking）を促進し、タ
ンパク質の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわ
け検定もしくは産生のためのタンパク質の操作を容易に
することができる。一般的には本来、付加アミノ酸は、
細胞酵素によりプロセッシングされ、成熟タンパク質か
ら取り除かれる。
【００５１】１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態にできる。プロ配列が除去される
と、このような不活性前駆体が通常活性化される。プロ
配列のいくつかまたは全ては、活性化の前に除去でき
る。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称され
る。要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパ
ク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質（プレタン
パク質と称することができる）、プレタンパク質のリー
ダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する
成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および１
またはそれ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の前
駆体であるプレプロタンパク質であり、プロ配列は通常
ポリペプチドの活性および成熟形態を産み出すプロセッ
シング段階で除去される。
【００５２】寄託物 ヒトカテプシンＫｇＤＮＡを含有する寄託物は、上述の
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
した。また上述のとおり、ｇＤＮＡ寄託物は本明細書で
は「寄託クローン」または「寄託クローンのｇＤＮＡ」
と称する。寄託クローンは、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション、１２３０１パークローンドライ
ブ、ロックビル、メリーランド２０８５２，米国に1996
年４月26日に寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号98035を付与さ
れた。寄託物は、カテプシンＫｇＤＮＡの全長を含有す
るＰ１コスミドであり、寄託時に「Ｐ１ＳａｃＢ２Ｃａ
ｔＫ／Ｐ１２９」と称される。
【００５３】寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際
承認に関するブダペスト条約の条件下で為されている。
特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終
的には分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提
供され、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求される
ような、寄託が実施可能要件であることを承認するもの
ではない。本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾す
る事象は、寄託物に含まれるポリヌクレオチド配列およ
びそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
に従う。寄託物を製造、使用または販売するためにはラ
イセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここ
では賦与されていない。
【００５４】ポリペプチド 本発明はさらに図１０および１１［配列番号：２０］の
誘導アミノ酸配列を有するヒトカテプシンＫポリペプチ
ドに関し、これは図１−９［配列番号：１］の配列から
転写した、スプライスしていないかまたは特異的にスプ
ライスしたｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡによりコードされ
るか、または寄託クローンによりコードされるアミノ酸
配列を有する。また、ミスセンスまたはノンセンス突然
変異を含むカテプシンＫｇＤＮＡによりコードされるポ
リペプチド、または少なくとも一つのイントロンをさら
に含む、非スプライスまたは部分的にスプライスしたｈ
ｎＲＮＡによりコードされれるこれらのポリペプチド、
とりわけ天然に細胞、特にヒトの細胞に見出されるこれ
らのポリペプチドをも提供する。フレームシフト突然変
異は疾患と関連することが示されている（Hol,FA.ら、J
ournal of MedicalGenetics，32(1)52-56（1995））。
【００５５】本発明が提供する好ましいポリペプチド
は、特異的にスプライスしたポリヌクレオチドによりコ
ードされ、とりわけ以下のエキソン−エキソンペア：1
−3、1−4、1−5、1−6、1−7、1−8、2−4、2−5、2−
6、2−7、2−8、3−4、3−5、3−6、3−7、3−8、4−
5、4−6、4−7、4−8、5−7、5−8または６−８を何れ
か一つまたはそれ以上含むポリヌクレオチドにコードさ
れるポリペプチドである。本発明の特に好ましい態様
は、特異的にスプライスしたポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドであり、ポリペプチドが細胞内
で機能し、特にカテプシンＫの生物学的活性を有し、さ
らにはヒト細胞内に発現するポリペプチドである。
【００５６】本発明のさらに好ましい態様は、エキソン
ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、特にカ
テプシンＫエキソン１［配列番号：３］、２［配列番
号：５］、３［配列番号：７］、４［配列番号：９］、
５［配列番号：１１］、６［配列番号：１３］、７［配
列番号：１５］または８［配列番号：１７］を包含し、
図１−９［配列番号：１］および１２−２４［配列番
号：２−１９］に示すエキソンポリヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチド、または上述のそれらの変異
型、正確な相同体、誘導体および類似体、並びにこのよ
うなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドによ
りコードされるポリペプチドである。本発明のその他の
好ましい態様は、カテプシンＫエキソン、エキソン１
［配列番号：３］、２［配列番号：５］、３［配列番
号：７］、４［配列番号：９］、５［配列番号：１
１］、６［配列番号：１３］、７［配列番号：１５］ま
たは８［配列番号：１７］を包含し、カテプシンＫ以外
の遺伝子のイントロンに機能的に連結したまたは他の遺
伝子のエキソンに結合したポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチドである。
【００５７】本発明はまたこれらのポリペプチドの断
片、類似体および誘導体にも関する。「断片」、「誘導
体」および「類似体」なる用語は図１０および１１［配
列番号：２０］のポリペプチド、図１−９［配列番号：
１］の配列から転写される、スプライスされないまたは
特異的にスプライスされたｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡに
よりコードされるポリペプチド、または寄託ｇＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドを称していう場合、この
ようなポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能また
は活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、類
似体にはプロタンパク質部分が切断されて活性成熟ポリ
ペプチドを産生して活性化できるプロタンパク質等があ
る。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然
ポリペプチドまたは合成ポリペプチドでよい。特定の好
ましい態様では、これは組換えポリペプチドである。
【００５８】図１０および１１［配列番号：２０］のポ
リペプチド、または図１−９［配列番号：１］の配列か
ら転写される、非スプライスまたは特異的にスプライス
されたｈｎＲＮＡもしくはｍＲＮＡによりコードされる
ポリペプチド、または寄託クローンのｇＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチドの断片、誘導体もしくは類似体
は、（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存また
は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）
により置換されており、このような置換アミノ酸残基は
遺伝的コードによりコードされたポリペプチドかコード
されていないポリペプチド、（ii）１またはそれ以上の
アミノ酸残基が置換基を含むポリペプチド、または（ii
i）成熟ポリペプチドがその他の化合物例えばポリペプ
チドの半減期を伸ばす化合物（例えばポリエチレングリ
コール）と融合したポリペプチド、または（iv）付加ア
ミノ酸が成熟ポリペプチド、例えばリーダーもしくは分
泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク
質配列の精製に用いられる配列と融合するポリペプチド
でよい。このような断片、誘導体および類似体は本明細
書の教示より当業者の範疇であると考えられる。
【００５９】この点に関するとりわけ好ましい態様は、
図１０および１１［配列番号：２０］に示すカテプシン
Ｋのアミノ酸配列を有するポリペプチド、それらの変異
型、類似体、誘導体および断片、並びにその断片の変異
型、類似体および誘導体である。また別に、この点に関
するとりわけ好ましい態様は、寄託クローンのｇＤＮＡ
のカテプシンＫのアミノ酸配列を有するポリペプチド、
それらの変異型、類似体、誘導体および断片、並びにそ
の断片の変異型、類似体および誘導体である。
【００６０】とりわけ好ましい変異型は、保存アミノ酸
置換により参照とは異なる変異型である。このような置
換体は、ポリペプチドの上記アミノ酸を特性の類似した
別のアミノ酸で置換したものである。典型的なもので
は、保存置換でみられるのは脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｌ
ｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置き換え；水酸基Ｓｅｒ
およびＴｈｒの交換、酸性基ＡｓｐおよびＧｌｕの取り
替え、アミド基ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性
基ＬｙｓおよびＡｒｇの取り替えおよび芳香性基Ｐｈ
ｅ、Ｔｙｒ間での置き換えである。
【００６１】この点に関するさらに好ましい態様は、図
１０および１１［配列番号：２０］のカテプシンＫポリ
ペプチドのアミノ酸配列または寄託クローンのｇＤＮＡ
のアミノ酸配列を有し、幾つか、少しの、５〜１０、１
〜５、１〜３、２、１または０個のアミノ酸残基を置
換、欠損または付加を任意に組み合わせて施した変異
型、類似体、誘導体および断片、並びにその断片の変異
型、類似体および誘導体である。これらの中でもとりわ
け好ましいのは、カテプシンＫの特性および活性を変化
させないサイレント置換、付加および欠損である。また
この点に関するとりわけ好ましい態様は、保存置換であ
る。最も好ましいのは、置換していない図１０および１
１［配列番号：２０］または寄託クローンのアミノ酸配
列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチド
およびポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好
ましく、均質になるまで精製するのが好ましい。
【００６２】本発明のポリペプチドには、配列番号：
３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列
番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５または配
列番号：１７のエキソンの少なくとも一つのエキソンに
よりコードされるポリペプチド（とりわけ成熟ポリペプ
チド）、および配列番号：３、配列番号：５、配列番
号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１
３、配列番号：１５または配列番号：１７のエキソンの
少なくとも一つのエキソンにコードされるポリペプチド
に少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７
０％の同一性）を有するポリペプチド、さらに好ましく
は配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番
号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：
１５または配列番号：１７のエキソンの少なくとも一つ
のエキソンにコードされるポリペプチドに少なくとも９
０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０％の同
一性）を有するポリペプチド、なおさらに好ましくは配
列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：
９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５
または配列番号：１７のエキソンの少なくとも一つのエ
キソンにコードされるポリペプチドに少なくとも９５％
の類似性（なおさらに好ましくは少なくとも９５％の同
一性）を有するポリペプチドなどがあり、また通常少な
くとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも
５０個のアミノ酸を含むこのようなポリペプチド部分を
有するこのようなポリペプチド部分などもある。
【００６３】当業界に周知であるように、二つのポリペ
プチド間の「類似性」は一つのポリペプチドのアミノ酸
配列およびそれの保存アミノ酸置換体を二つ目のポリペ
プチドの配列と比較して決定する。本発明のポリペプチ
ドの断片または部分は、ペプチド合成により対応するポ
リペプチド全長を産生するのに用いることができる：従
って、断片はポリペプチドの全長を産生するための媒介
物質として用いることができる。本発明のポリヌクレオ
チドの断片または部分は本発明のポリヌクレオチド全長
を合成するために用いることができる。
【００６４】断片 また本発明の好ましい態様には、カテプシンＫの断片、
特に図１−９［配列番号：１］に示すエキソンによりコ
ードされるアミノ酸、または寄託クローンのカテプシン
Ｋのエキソン配列によりコードされるアミノ酸を有する
カテプシンＫの断片、および図１−９［配列番号：１］
または寄託クローンのカテプシンＫのエキソン断片また
は変異型および誘導体等がある。この点に関して、断片
は前述のカテプシンＫポリペプチドおよびそれらの変異
型または誘導体の全てではなく一部が全く同一であるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００６５】このような断片は「フリースタンディン
グ」すなわちその他のアミノ酸またはポリペプチド、例
えばエキソンの一部かそれに融合したものではなく、一
部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれてもよい。より大きなポリペプチド内に含まれる
場合、本明細書で論じる断片は単一の連続した領域を形
成するのが最も好ましい。しかしながら、幾つかの断片
は単一の、より大きなポリペプチド内に含まれ得る。例
えば、特定の好ましい態様は、カテプシンＫ断片のアミ
ノ末端に融合した異型のプレおよびプロポリペプチド領
域、および断片のカルボキシル末端に融合した付加領域
を有する、宿主中に発現するように設計した前駆体ポリ
ペプチドに含まれる本発明のカテプシンＫポリペプチド
の断片に関する。従って、本明細書の意図する一つの態
様における断片は、カテプシンＫ由来の融合ポリペプチ
ドまたは融合タンパク質の一つのまたは複数の部分を意
味する。
【００６６】本発明のポリペプチド断片の代表的な例と
しては、各々図１−９［配列番号：１］および１２−２
４［配列番号：２−１９］に示すエキソンまたはイント
ロン１、２、３、４、５、６または７ポリヌクレオチド
配列を有する、カテプシンＫエキソン１、２、３、４、
５、６、７または８を含むポリヌクレオチド配列により
コードされる上述のポリペプチド断片、または上述のそ
れらの変異型、正確な相同体、誘導体および類似体、並
びにこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドでよい。これに
関連して、どちらかの末端または両方の末端の幾つか
の、少しの、５、４、３、２または１個のアミノ酸によ
り特に記載した、より大きいまたはより小さい範囲およ
び複数の範囲を含める。例えば、これに関連して、約６
５〜９０個のアミノ酸は、６５プラスまたはマイナス幾
つかの、少しの、５、４、３、２または1個のアミノ
酸、から９０プラスまたはマイナス幾つかの、少しの、
５、４、３、２または1個のアミノ酸、すなわち広くは
６５マイナス幾つかのアミノ酸から９０プラス幾つかの
アミノ酸、狭くは６５プラス幾つかのアミノ酸から９０
マイナス幾つかのアミノ酸の範囲にできることを意味す
る。
【００６７】この点に関して、より好ましくは、どちら
かまたは両方の末端で5個ほどのアミノ酸をプラスまた
はマイナスした上述の範囲である。とりわけ好ましく
は、上述の末端のどちらかまたは両方で３個ほどのアミ
ノ酸をプラスまたはマイナスした上述の範囲である。と
りわけ好ましくは、どちらかまたは両方の末端で１個の
アミノ酸をプラスまたはマイナスした範囲、または付加
または欠損のない上述の範囲である。この点に関して、
とりわけ最も好ましくは、カテプシンＫのエキソンの各
々によりコードされる断片である。
【００６８】本発明のとりわけ好ましい断片は、カテプ
シンＫのトランケーション突然変異である。トランケー
ション突然変異体には、アミノ末端を含む残基の一連の
連続（すなわち連続領域、部分または部位）もしくはカ
ルボキシル末端を含む残基の一連の連続の欠損、または
二重トランケーション突然変異のように二つの残基の一
連の連続（一つはアミノ末端を含み、一つはカルボキシ
ル末端を含む）の欠損を除いた、図１−９［配列番号：
１］または寄託クローンのエキソンによりコードされる
アミノ酸配列を有するカテプシンＫポリペプチド、また
はそれらの変異型もしくは誘導体などがある。提示した
大きさの範囲の断片もまたトランケーション断片の好ま
しい態様であり、これは通常の断片の中でもとりわけ好
ましい。
【００６９】また本発明の好ましい態様は、カテプシン
Ｋの構造的または機能的属性により特徴づけられた断片
である。この点に関する本発明の好ましい態様には、カ
テプシンＫのアルファーヘリックスおよびアルファーヘ
リックス形成領域（「アルファー領域」）、ベータシー
トおよびベータシート形成領域（「ベータ領域」）、タ
ーンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイル
およびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領
域、疎水性領域、アルファー両極性領域、ベータ両極性
領域、可変領域、表面形成領域および高抗原性指標領域
を含む断片などがある。
【００７０】特定の好ましい領域には、ガルニアー−ロ
ブソンアルファー領域、ベータ領域、ターン領域および
コイル領域、チョウ−ファスマンアルファー領域、ベー
タ領域およびターン領域、カイト−デューリトル親水性
領域および疎水性領域、アイゼンベルグアルファーおよ
びベーター両極性領域、カルプラス−シュルツ可変領
域、エミニ表面形成領域並びにジェームソン−ウルフ高
抗原性指標領域などがある。
【００７１】この点に関する非常に好ましい断片は、上
述の幾つかの様相のような幾つかの構造的様相をくみあ
わせたカテプシンＫの領域を含む断片である。この点に
関して、図１−９［配列番号：１］のエキソン配列は、
全てターン領域、親水性領域、可変領域、表面形成領域
および高抗原性指標領域に非常に特徴的なアミノ酸組成
物をコードする特性があり、特に好ましい領域である。
このような領域は、大きなポリペプチドないに包含され
得、単独で上述の本発明の好ましい断片と成りうる。こ
のパラグラフで用いる「約」なる用語は、上述の断片に
関して示す一般的な意味である。
【００７２】さらに好ましい領域は、カテプシンＫの活
性を媒介する領域である。この点に関して最も好ましく
は、カテプシンＫの化学的、生物学的、抗原的またはそ
の他の活性を有する断片であり、同様の活性もしくは改
善された活性のある、または望ましくない活性を減じた
断片である。本発明はまたとりわけ前述の断片をコード
するポリヌクレオチド、その断片をコードするポリヌク
レオチドにハイブリダイズしたポリヌクレオチド、特に
ストリンジェント状態でハイブリダイズするポリヌクレ
オチド、およびその断片をコードするポリヌクレオチド
を増幅するＰＣＲプライマーのようなポリヌクレオチド
に関する。この点に関して、好ましいポリヌクレオチド
は、上述の様に、好ましい断片に対応するポリヌクレオ
チドである。
【００７３】その他の好ましいポリヌクレオチドは、カ
テプシンＫの遺伝的要素であり、ポリアデニル化領域、
エンハンサー、プロモーター、キャップ部位イントロ
ン、エキソンおよびスプライス部位等（これらの事象を
記載する参照文献には以下のものがある；Darnel.J.，
ら、Molecular Cell Biolology、第2版、W.H.Freeman、
ニューヨーク（1990）；Watson,J.D.ら、Molecular Bio
logy of the Gene，Benjamin/Cummings Pub.、メンロパ
ーク、カイフォルニア州（1987））があるが、これらに
限定するものではない。
【００７４】非翻訳領域には、遺伝子発現を制御するの
に重要な多くの要素を含む。これらの領域の突然変異お
よびマーカーは疾患にも関連している（Ozawa T.ら、Eu
ropean Journal of Immunogenetics，APR，22(2)163-16
9（1995））。本発明の好ましい態様は、５’ＵＴＲ、
とりわけ図１２（Ａ）［配列番号：２］に示す配列であ
る。５’ＵＴＲにおける突然変異およびマーカーは疾患
に関与している（Carlock,L.ら、Human Genetics,APR，
93(4)457-459（1994））。とりわけ好ましいポリヌクレ
オチドはカテプシンＫｇＤＮＡの５’ＵＴＲ領域におけ
るエンハンサーおよびプロモーターである。エンハンサ
ーはしばしば５’ＵＴＲ領域に見出され、遺伝子発現を
上方制御する（プロモーターに関する一般的な参照文献
としてはMillerら、Biotechniques７：980-990（1989）
参照）。本発明のエンハンサーは異型遺伝子に遺伝子発
現を上向制御（アップレギュレーション）するように機
能的に融合できる。エンハンサープロモーターは組織特
異性遺伝子発現を制御すると考えられ、とりわけ遺伝子
発現に有用と考えられるものは破骨細胞および白血球、
とりわけマクロファージ細胞である。特に好ましいポリ
ヌクレオチドは図１２（Ａ）［配列番号：２］の前述の
配列を有するエンハンサープロモーターである。転写因
子はしばしばエンハンサーおよびプロモーターと関与
し、これらの領域の機能およびこれらの因子の結合部位
を変調する作用については以下に記載されている（Fais
st,SteffenおよびMeyer,Silke、Nucleic Acids Researc
h，20(1)3-26（1991）；Smale,Stephen T.、Transcript
ion：Mechanisms and Regulation，ラーベンプレスリミ
テッド63-81頁（1994））。これらの部位は、例えば転
写開始に関与するＳｐ１、Ａｐ１およびＡｐ３ような因
子に結合する（Faisst,SteffenおよびMeyer,Silke、Nuc
leic Acids Research，20(1)3-26（1991））。転写因子
の標準的な結合部位は、図２３−２４（Ｓ）［配列番
号：２］の下線を付したところである。図２３−２４
（Ｓ）［配列番号：２］のＰｕボックスは、マクロファ
ージすなわち遺伝子カテプシンＫもまた見出される細胞
に存在することが記載されている（Zhang,Dong-Er,Nol.
and Cell.Biol.14(1)373-381（1994））。本発明はとり
わけ破骨細胞および白血球、特にマクロファージにおけ
る組織特異的発現の媒介に有用なプロモーター領域を提
供する。エンハンサーおよびプロモーター領域に存在す
るＰｕボックス（ＡＧＧＡＡ）もまたマクロファージセ
ルライン（ＴＨＰ１）において観察される。本発明の配
列におけるＰｕボックスを提供する。これらのＰｕボッ
クスはマクロファージ中のカテプシンＫ遺伝子中で活性
であると考えられる。ＴＨＰ１細胞において行われるＲ
Ｔ−ＰＣＲは、プローブとしてカテプシンＫ配列を用
い、発現させる。プロモーターはカテプシンＫ遺伝子発
現の制御の研究に、とりわけ疾患の診断のためのプロー
ブとする領域として特に有用である。ビタミンＤ応答要
素は、既知遺伝子の５’ＵＴＲに見出された（Kahlen,J
ean-Pierre，およびCarlberg,Carsten、Biochemimal &
Biophysical Research Communications，202(3)1366-13
72（1994）；Darwish,HishamおよびDeLuca,Hector、Cri
tical Reviews in Eukaryotic Gene Expression，3
(2)：89-116（1993）；Carlberg,Carsten，Eur.J.Bioch
em.，231:517-524（1995）；Ohyama,Yoshihiko、J.Bio
l.Chem.，269(14):10545-10550（1994））。ビタミンＤ
反応要素（「ｖＤハーフサイト」）およびカルシウムイ
オン（「Ｃａハーフペア」）反応要素の部分は図２３−
２４（Ｓ）［配列番号：２］に示す３’ＵＴＲ配列に存
在する。このような部位は以下に記載されている：Kat
z,Ronald,W.，Subauste,Jose,S.およびKoenig,Ronald
J.、J.Biol.Chem.，270(10):5238-5242（1995）。図１
２（Ａ）および図２３−２４（Ｓ）［配列番号：２］に
示す５’ＵＴＲ配列に存在するその他のハーフサイトに
は、オステオポンチン／上皮小体ホルモン反応要素、カ
ルシトロール反応要素およびオステオカルシンハーフサ
イト等がある（例えばJuge-Aubry,Christianaら、J.Bio
l.Chem.，270(30):18117-18122（1995）参照）。プロモ
ーターおよびエンハンサー領域に見出され、本発明に提
供されるプロモーター因子結合部位もまたもまたカテプ
シンＫイントロンに見出される。エストローゲン反応要
素もまたカテプシンＫ５’ＵＴＲに存在すると推定され
る。当業者は本明細書に提供される方法を用いて、これ
らの要素を容易に見出すことができる。
【００７５】さらに好ましいポリヌクレオチドは(図１
０および１１)に示す配列のＡＴＧ出発コドンの上方49
塩基対に位置するキャップサイト（cap site）である。
本発明のさらに好ましい態様は、カテプシンＫのプロモ
ーター領域（図１２（Ａ）および図２３−２４（Ｓ）
［配列番号：２］）である。機能的なプロモーター領域
配列については記載されている（Corden,J.ら、Scienc
e,209:1406-1414（1990））。図１２（Ａ）［配列番
号：２］および図２３−２４（Ｓ）［配列番号：２］に
示すカテプシンＫ配列における非標準プロモーター領域
には、出発コドンＡＴＧの上方１９−２７塩基対のＡ−
Ｔに富む配列を含む。プロモーターのＴＡＴＡボックス
領域の突然変異は疾患と関連していることが示されてい
る(Peltoketo,H.ら、Genomics，23(1):250-252（199
4）)。
【００７６】カテプシンＫの３’非翻訳領域は、本発明
の好ましいポリヌクレオチドであり、とりわけ図２２
（Ｑ）［配列番号：１８］に示すポリヌクレオチド、特
に図２２（Ｒ）［配列番号：１９］に示す領域が好まし
い。３’ＵＴＲにおける突然変異は疾患と関連がある
（Saito,A.ら、Journal of the American Society of N
ephrology，4(9):1649-1653（1994）；Payne,SJ.ら、Hu
man Molecular Genetics，3(2):390（1994））。図２２
（Ｑ）［配列番号：１８］に示すポリアデニル化領域
は、また好ましい３’ＵＴＲのポリヌクレオチド配列で
ある。ポリアデニル化領域は標準的なポリアデニル化ヘ
キサヌクレオチドＡＡＴＡＡＡの二つのコピーを包含す
る。ポリアデニル化領域は、例えば発現ベクター中にｍ
ＲＮＡ３’末端形成を媒介するために用いることができ
る（例えばGil,A.ら、Nature、312:473-474（ロンド
ン）（1984））。
【００７７】本発明のその他のとりわけ好ましいポリヌ
クレオチドは、スプライス供与体、スプライス受体およ
びスプライス分岐点などのスプライス部位であるが、こ
れらに限定するものではない。スプライス接合部形成は
オープンリーディングフレームを適切に作るのに不可欠
である（Mount,Stephen,M.,Department of MolecularBi
ophysics and Biochemistry，エール大学、スターリン
グホールオブメディスン、ニューヘブン、コネチカット
州、米国、ＩＲＬプレスリミテッド、ロンドン459-472
頁（1981））。スプライス接合の不適切な形成に関連す
る疾患が知られている。とりわけ好ましいスプライス接
合ポリヌクレオチドは図２５に示す。
【００７８】イントロンは遺伝子発現および成熟ｍＲＮ
Ａの形成に重要な要素を含む。イントロンの突然変異お
よびマーカーは疾患に関連することが示されている（Pe
ral,G,ら、Human Molecular Genetics，ＡＰＲ4(4):569
-574（1995）；Chrysogelos,S.A.，Nucleic Acids Rese
arch，21(24):5736-5741（1993）；Ameis,D.，Journal
of Lipid Research，36(2):241-250（1995））。スプラ
イス接合もまた疾患に関連することが示されている（Am
eis、D.ら、Journal of Lipid Research，36(2):241-25
0（1995年2月）；Petrini,JHJ,ら、Journal of Immunol
ogy，152(1):176-183（1994）；Kleiman,FEら、Human G
enetics，94(3):279-282（1994））。また別にスプライ
シングおよび未解明のスプライス部位選別もまた疾患に
関連することが示されている（Arakawa,H.ら、Human Mo
lecular Genetics3(4):565-568（1994）；Tieu,PTら、H
uman Mutation，3(3):333-336（1994）；Reale,MAら、C
ancer Research，54(16):4493-4501（1994））。イント
ロンはまたこれらの配列の一部としてエンハンサー要素
を含むことができる。本発明の好ましい態様は、カテプ
シンＫイントロンとりわけ図１３−２１（Ｃ、Ｅ、Ｇ、
Ｉ、Ｋ、ＭおよびＯ）［配列番号：４、６、８、１０、
１４および１６］に示す配列を有するカテプシンＫイン
トロンである。イントロンの多形性は連鎖分析後に疾患
のマーカーとして提供できる。さらに本明細書に記載す
る遺伝的分析は、疾患に関連したおよび／または疾患の
原因となるイントロンにおける突然変異を示すために用
いることができる。
【００７９】その他の好ましい態様はカテプシンＫイン
トロンエンハンサーである。イントロン３はスプライス
接合ＧＴ／ＡＧ則に一致しない。このイントロン／エキ
ソン境界はＰ１クローンおよびゲノムＤＮＡのシークエ
ンシングにより証明された。ＧＣ／ＡＧスプライス接合
は一般的ではないが、以下に記載されている；Mount,St
ephen,M.，Department of Molecular Biophysics and B
iochemistry，エール大学、スターリングホールオブメ
ディスン、ニューヘブン、コネチカット州、米国、ＩＲ
Ｌプレスリミテッド、ロンドン459-472頁（1981）。本
発明のさらに好ましい態様は、カテプシンＫエキソンと
りわけ図１３−２１（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎおよ
びＰ）［各々配列番号：３、５、７、９、１１、１３、
１５および１７］に示す配列を有するこれらのエキソン
である。エキソンの多形性は連鎖分析後の疾患のマーカ
ーとして提供できる。さらに本明細書に記載する遺伝的
分析は、疾患に関連するおよび／または疾患の原因とな
るエキソンにおける突然変異を示すために用いることが
できる。
【００８０】本発明のポリヌクレオチド断片は、カテプ
シンＫ遺伝子の発現を阻害するリボザイム（ribozyme）
を作るのに用いることができる。リボザイム構築のため
の一般的構築法は当業界で周知である（Stram,Y.および
Molad,T.，Virus Genes，9(2):155-159（1995））。当
業者は本発明の新規断片を用いるこれらの方法を容易に
適用し、新規リボザイムを構築するために、容易に適用
することができる。好ましいリボザイム構築物にはカテ
プシンＫ遺伝子の転写された制御要素に相補的な配列、
とりわけ５’非翻訳領域、スプライス接合部および３’
非翻訳領域、とりわけポリアデニル化領域に相補的なポ
リヌクレオチドを含む。
【００８１】本発明の断片、とりわけ非翻訳領域におけ
る領域、プロモーターおよびイントロンは、疾患とりわ
け骨疾患例えば骨粗鬆症、および例えばパジェット病、
ゴーチャーズ病、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、上皮
小体亢進症、骨分解、転移性腫瘍、リウマチ性関節症、
変形性関節症、歯周病および骨インプラントおよび骨プ
ロシーゼス（protheses）とりわけ歯科インプラントの
分解に診断プローブとして有用である。さらに、疾患の
マーカーは、本発明の診断法に有用である、カテプシン
遺伝子の領域、とりわけ非翻訳領域において示すことが
できる。
【００８２】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明のベクターで遺伝子操作する宿主細胞および
組換え技法による本発明のポリペプチドの産生にも関す
る。宿主細胞は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを
挿入し、本発明のポリペプチドを発現することができ
る。例えば感染、形質導入、トランスフェクション、ト
ランスベクションおよび形質転換の周知の技法を用い
て、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入できる。ポリヌ
クレオチドは単独でまたは他のポリヌクレオチドと共に
導入できる。このような他のポリヌクレオチドは別個に
導入、同時導入または本発明のポリヌクレオチドに結合
させて導入できる。従って、例えば哺乳動物細胞で同時
トランスフェクションおよび選別するための標準的な技
法を用いて、選別マーカーをコードする別の離れたポリ
ヌクレオチドコードと共に、本発明のポリヌクレオチド
を宿主細胞にトランスフェクトできる。この場合、ポリ
ヌクレオチドは通常遺伝子的に安定して宿主細胞ゲノム
に挿入される。
【００８３】また別に、ポリヌクレオチドは宿主細胞に
おける伸長のための選別マーカーを含有するベクターに
結合できる。ベクター構築は上述の技法により、宿主細
胞に導入できる。一般的に、プラスミドベクターは沈殿
例えばリン酸カルシウム沈殿中、または荷電脂質との複
合体中ＤＮＡとして導入する。ポリヌクレオチドを宿主
に導入するために、電気泳動をも用いることができる。
ベクターがウイルスである場合、インビトロでパッケー
ジングまたはパッケージング細胞に導入でき、パッケー
ジングウイルスを細胞に形質導入できる。本発明の態様
に準じた、ポリヌクレオチドの製造および細胞へのポリ
ヌクレオチドの導入に適した種々の技法は、当業者に周
知であり、日常的に用いられるものである。このような
技法は上述のSambrookらに詳細に報告されており、これ
らの技法を詳細に説明する多くの実験マニュアルの説明
となるものである。
【００８４】本発明のこの態様に準じたベクターは、例
えばプラスミドベクター、一本または二本鎖ファージベ
クター、一本または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス
ベクターなどでよい。このようなベクターはポリヌクレ
オチド、好ましくはＤＮＡとして、ＤＮＡおよびＲＮＡ
の細胞への導入のための周知の技術により細胞に導入で
きる。ベクターがファージおよびウイルスベクターであ
る場合もまた、感染および形質導入のため周知の技術に
より、パッケージ化または包膜化したウイルスとして細
胞に導入でき、これは好ましいことである。ウイルスベ
クターは複製能力があるかまたは複製能力を欠損してい
てよい。後者の場合のウイルスの増殖は通常宿主細胞を
完全化する場合にのみ起こる。中でも好ましいベクター
は、ある観点では、本発明のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチを発現するベクターである。一般に、このよう
なべクターは、発現させるポリヌクレオチドに機能的に
連鎖した宿主における発現に有効なシス作用制御領域を
含む。適当なトランス作用因子は宿主により供給され
る、完全化ベクターにより供給される、または宿主への
導入時にベクター自身により供給されるかのいずれかで
ある。
【００８５】この点に関するある態様では、ベクターは
特異的発現を提供する。このような特異的発現は、誘導
可能な発現もしくは特定の型の細胞においてのみ発現す
るか、または誘導可能および細胞特異性の両方でよい。
誘導可能なベクターのうちとりわけ好ましいベクター
は、温度および栄養添加物など操作が容易である環境因
子により発現を誘導できるベクターである。本発明のこ
の態様に適した種々ベクターには原核および真核宿主で
用いられる構成および誘導可能な発現ベクター等があ
り、当業者に周知であり、通常的に用いられている。操
作した宿主細胞は、従来の栄養培地で培養でき、とりわ
け活性化プロモーター、選別形質転換体または増幅遺伝
子に適当なように改変できる。発現のために選別した宿
主で以前に用いた培養条件例えば温度、ｐＨ等は、当業
者に明白であるように、通常本発明のポリペプチドの発
現に適している。
【００８６】非常に多くの種類のベクターが、本発明の
ポリペプチドを発現するために使用できる。このような
ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来
のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオフ
ァージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体要素由
来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えば
ＳＶ４０、ワクシナウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウ
イルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等の
ウイルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせた
物に由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテ
リオファージ遺伝的要素由来のベクター、例えばコスミ
ドおよびファージミド（phagemids）等があり、全て本
発明の態様に準じた発現に用いることができる。通常宿
主中にポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチド
を保持、伸長または発現するのに適した任意のベクター
が、この点に関して発現に使用できる。
【００８７】周知のおよび日常的な種々の任意の技術に
より、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入できる。一般
に、１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼでＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを切断し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて制限断片を結合することにより、発現のため
のＤＮＡ配列を発現ベクターに結合する。この目標のた
めに用いることができる制限およびライゲーション方法
は、当業者に周知であり、日常的に用いられているもの
である。この点に関して、および別法を用いた構築発現
ベクターのための適切な方法もまた、当業者に周知であ
り、日常的に用いられているものであり、本明細書に引
用したSambrookら、に非常に詳細に記載されている。
【００８８】発現ベクターのＤＮＡ配列は、適当な（複
数の）発現制御配列、例えばｍＲＮＡ転写を指示するプ
ロモーター等に機能的に連結する。このようなプロモー
ターの代表的なものとしては、幾つか周知のプロモータ
ーの名前を挙げると、ファージラムダＰＬプロモータ
ー、大腸菌（E.coli）ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロ
モーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター並びに
レトロウイルスＬＴＲのプロモーター等がある。本発明
の態様に用いるのに適した、記載していない多くのプロ
モーターが周知であり、本明細書の記載および実施例に
説明する方法で当業者に容易に用いることができるとい
うことは、理解されよう。
【００８９】一般に、発現構築物は転写開始および終了
部位を含み、転写された領域では翻訳のためのリボソー
ム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写物
のコード部分には、翻訳されるポリペプチドの末端に適
当に位置する開始および終了コドンで翻訳開始ＡＵＧを
含む。さらに構築物は、発現を制御および引き起こす制
御領域を含有してよい。通常、多くの一般的な慣習的な
方法に準じて、このような領域は制御転写例えばとりわ
けレプレッサー結合部位およびエンハンサーにより操作
される。
【００９０】伸長および発現のためのベクターは通常選
別可能なマーカーを含有する。このようなマーカーはま
た増幅にも適してよいか、またはベクターがこの目的の
ために更なるマーカーを含有できる。この点に関して、
発現ベクターは、形質転換した宿主細胞の選別のための
表現型特性を提供する、１またはそれ以上の選別マーカ
ーを含有する。好ましいマーカーにはジヒドロフォレー
トリダクターゼまたは真核細胞培養用ネオマイシン抵
抗、大腸菌およびその他の細菌の培養用テトラサイクリ
ン、カナマイシン、およびアンピシリン抵抗遺伝子等が
ある。
【００９１】本明細書記載の適当なＤＮＡ配列を含有す
るベクター、および適当なプロモーター、およびその他
の適当な制御配列は、望ましいポリペプチドをそこに発
現するのに適した種々の周知の技術を用いて適当な宿主
に導入できる。適当な宿主の代表的な例としては、細菌
細胞例えば大腸菌、ストレプトミセスおよびネズミチフ
ス菌（Salmonella typhimurium）細胞；真菌細胞例えば
酵母細胞；昆虫細胞例えばドロソフィラＳ２（Drosophi
la S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）
細胞；動物細胞例えばＣＨＯ，ＣＯＳおよびボウズ（Bo
ws）黒色腫細胞；並びに植物細胞等がある。非常に多様
な発現構築のための宿主が周知であり、本明細書の開示
により、本発明の態様に準じたポリペプチドを発現する
ための宿主の選択が、当業者に容易になる。
【００９２】さらに、本発明はまた上述の配列を１また
はそれ以上含む、組換え構築物例えば発現構築物をも含
む。構築物には、本発明のこのような配列が挿入されて
いるベクター、例えばプラスミドまたはウイルスプラス
ミド等も含まれる。この配列は正または逆配向で挿入で
きる。この点に関して、ある好ましい態様において、構
築物には、さらにその配列に機能的に連結した制御配列
例えばプロモーター等がある。非常に多くの適当なベク
ターおよびプロモーターが当業者に周知であり、本発明
の使用に適した多くのベクターが市販により入手可能で
ある。
【００９３】市販されている以下のベクターを実施例と
して提供する。細菌中で使用するのに好ましいベクター
には、キアゲンより入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０
およびｐＱＥ−９；ストラッタジーンより入手可能なｐ
ＢＳベクター、ファジェスクリプト（Phagescript）ベ
クター、ブルースクリプト（Bluescript）ベクター、ｐ
ＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ＡおよびｐＮＨ４
６Ａ；並びにファルマシアより入手可能なｐｔｃ９９
ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４
０、ｐＲＩＴ５等がある。真核細胞ベクターで好ましい
ものは、ストラッタジーンより入手可能なｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳ
Ｇ；並びにファルマシアより入手可能なｐＳＶＫ３、ｐ
ＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ等がある。これらのベ
クターは単に多くの市販のベクターの説明のために列挙
しており、本発明の態様に準じた使用のために、当業者
に入手可能なベクターである。宿主内で本発明のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドを例えば導入、保持、伸
長または発現するのに適した任意のその他のプラスミド
またはベクターが、本発明のこの態様において使用でき
ることは理解されよう。
【００９４】プロモーター領域は、プロモーター領域を
欠いたリポーター転写ユニット、例えばクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写
ユニットを、制限部位または志願プロモーター（candid
ate promoter）断片すなわちプロモーターを含み得る断
片を導入する部位の下方に含有するベクターを用いて、
任意の望ましい遺伝子から選別できる。周知の様に、ｃ
ａｔ遺伝子の上方の制限部位でプロモター含有断片をベ
クターに導入すると、標準的なＣＡＴ検定により検出で
きるＣＡＴ活性の産生を引き起こす。この目標に適した
ベクターは周知であり、容易に入手可能である。２個の
このようなベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７
である。このように本発明のポリヌクレオチドの発現の
ためのプロモーターには、周知で容易に入手できるプロ
モーターのみならず、リポーター遺伝子を用いて前述の
技術により容易に得ることができるプロモーターもあ
る。
【００９５】本発明の好ましい態様は、プロモーターと
して機能するカテプシンＫプロモーター配列を含む発現
ベクターである。このようなベクター構築物は、カテプ
シンＫプロモーターを利用する細胞例えば破骨細胞およ
びマクロファージ中の標的遺伝子発現に用いることがで
きる。目的の任意の遺伝子はカテプシンＫプロモーター
に発現可能なように連結し、カテプシンＫプロモーター
を利用するこのような細胞中に発現できる。この方法で
初代真核細胞例えばＳＶ４０Ｔ−抗原を不滅化する遺伝
子を、カテプシンＫプロモーターに発現可能なように連
結でき、細胞例えば破骨細胞およびマクロファージ等の
骨細胞を不滅化できる。特定の好ましいベクターは毒素
遺伝子例えばリシンに発現可能なように連結したカテプ
シンＫプロモーターを含み、遺伝子発現にカテプシンＫ
プロモーターを利用する細胞群を標的にして死滅させる
方法に有用である。その他の好ましいベクターは、抗カ
テプシンＫリボザイムまたはアンチセンスポリヌクレオ
チドに発現可能なように連結したカテプシンＫプロモー
ターを含み、このような標的化死滅方法に有用である。
【００９６】本発明に準じたポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの発現に適した、周知のの細菌性プロモータ
ーには、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、
Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラ
ムダＰＲ、ＰＬプロモーター並びにｔｒｐプロモーター
等がある。この点に関して適当な周知の真核細胞プロモ
ーターには、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶチミジ
ンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロ
モーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例え
ばラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のプロモーター並
びにメタロチオネインプロモーター例えばマウスメタロ
チオネイン−Ｉプロモーター等がある。宿主細胞におけ
る発現のための適当なベクターおよびプロモーターの選
別は周知の方法であり、発現ベクター構築、宿主へのベ
クターの導入および宿主中での発現に必要な技術は当業
者に通常的に用いられるものである。
【００９７】本発明はまた上述の構築物を含有する宿主
細胞にも関する。宿主細胞は高等な真核細胞、例えば哺
乳動物細胞もしくは昆虫細胞、もしくは下等な真核細
胞、例えば酵母細胞でよく、または宿主細胞は原核細胞
例えば細菌細胞でもよい。構築物の宿主細胞への導入は
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、カチオン脂質媒
介トランスフェクション、電気泳動、形質導入、感染ま
たはその他の方法により影響を受け得る。このような方
法は多くの標準的な実験マニュアル、例えばDavisら、B
asic Methods in Molecular Biology，（1986）に記載
されている。
【００９８】宿主内の構築物は通常の方法で用いて、組
換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生すること
ができる。また別に、本発明のポリペプチドは通常のペ
プチド合成により合成的に産生できる。成熟タンパク質
は哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞に、適
当なプロモーターの制御下で発現できる。細胞フリーの
翻訳系は本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用い
たこのようなタンパク質の産生にも用いることができ
る。原核および真核細胞宿主での使用に適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cl
oning ：A Laboratory Manual，第二編、コールドスプ
リングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリン
グハーバー、ニューヨーク州（1989）に記載されてい
る。
【００９９】一般的に、酵母の組換え発現ベクターは複
製源、下方の構造配列の転写を指示する高度に発現した
遺伝子由来のプロモーターおよびベクターに曝露した後
の細胞を含有するベクターの単離を可能にする選別マー
カーなどを含む。なかでも適切なプロモーターには、グ
ルコース分解酵素例えば、とりわけ３−ホスホグリセレ
ートキナーゼ（「ＰＧＫ」）ａ−因子、酸ホスファター
ゼおよび熱ショックタンパク質等をコードする遺伝子に
由来するプロモーター等がある。選別マーカーには、大
腸菌のアンピシリン抵抗遺伝子およびビール酵母菌のｔ
ｒｐ１遺伝子等がある。高等真核細胞による本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー
配列をベクターに挿入することにより増強させることが
できる。エンハンサーは、与えられた宿主細胞型におけ
るプロモーターの転写活性を増強するように作用する、
通常約１０〜３００塩基対（bp）のＤＮＡのシス作用要
素である。エンハンサーの例としては、１００〜２７０
塩基対での複製起源の後位置に位置するＳＶ４０エンハ
ンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハ
ンサー、複製起源の後位置のポリオーマエンハンサー、
およびアデノウイルスエンハンサー等がある。
【０１００】本発明のポリペプチドの異型の構造配列を
コードする本発明のポリヌクレオチドは、通常標準法を
用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能的
に連結する。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボ
ソーム結合部位の５’に適当に存在するように位置決定
する。リボソーム結合部位は発現すべきポリペプチドの
翻訳を開始するＡＵＧの５’である。通常、開始コド
ン、通常ＡＵＧで始まるオープンリーディングフレーム
は他になく、リボソーム結合部位および開始ＡＵＧの間
にある。また、通常、ポリペプチドの末端に翻訳停止コ
ドンがあり、転写された領域の３’末端に適当に配置さ
れたポリアデニル化信号および転写終了信号がある。
【０１０１】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラ
スミックスペースまたは細胞外環境へ分泌するために、
適当な分泌信号を発現したポリペプチドに挿入すること
ができる。信号はポリペプチドに対して内因性でよく、
または異型性の信号でもよい。ポリペプチドは改変した
形態、例えば融合タンパク質の形態で発現でき、分泌信
号のみならず付加的な異型性機能的領域をも含み得る。
このように、例えば付加アミノ酸とりわけ荷電アミノ酸
領域は、ポリペプチドのＮ−末端に付加し、精製中また
はそれに続く操作および保存中の、宿主細胞内での安定
性および持続性を改善する。また、その領域はポリペプ
チドに付加して精製を容易にできる。このような領域は
ポリペプチドの最終的な調製の前に除去できる。ペプチ
ド部分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または
***を引き起こし、安定性を改善し、および精製を容易
にするのは、当業界でよくあることであり、通常的な技
術である。
【０１０２】本発明に準じたポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの伸長、保持または発現に適した原核細胞宿
主には、大腸菌（Escherichia coli），枯草菌（Bacill
us subtilis）およびネズミチフス菌（Salmonella typh
imurium）等がある。シュードモナス属、ストレプトミ
セス属、およびブドウ球菌属は、この点に関して、適切
な宿主である。さらに、多くのその他の宿主も当業者に
周知であり、使用できる。細菌使用のための有用な発現
ベクターの代表的なものとして、周知のクローニングベ
クターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的要
素を含む市販されているプラスミド由来選別マーカーお
よび細菌の複製起源等があるが、これに限定するもので
はない。このような市販されているベクターには、例え
ばｐＫＫ２２３３（ファルマシアファインケミカルズ、
ウプサラ、スゥエーデン）およびＧＥＭ１（プロメガバ
イオテック、メディソン、ウイスコンシン州、米国）等
がある。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は適当なプ
ロモーターおよび構造配列と結合して発現される。
【０１０３】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の成長に続いて、選択したプロモータ
ーが誘導可能な場合、適当な手段（例えば温度シフトま
たは化学的インデューサーへの曝露）によりそのプロモ
ーターを誘導し、細胞は更なる期間培養する。通常、次
に細胞を遠心により収穫し、物理学的または化学的手段
により分解し、得られた粗抽出物をさらなる精製用に保
持する。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は、凍結
−融解サイクル、ソニケーション、機械的分解または細
胞溶解物質の使用等の、任意の通常的な方法により分解
でき、このような方法は当業者に周知である。
【０１０４】種々の哺乳動物細胞系も同様に発現に用い
ることができる。哺乳動物発現系の例としては、サル腎
繊維芽細胞ＣＯＳ−７ライン等があり、Gluzmanら、Cel
l，23:175（1981）に記載されている。適合するベクタ
ーを発現できるその他のセルラインには、例えばＣ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎２９３およびＢ
ＨＫセルライン等がある。哺乳動物発現ベクターには、
複製起源、適当なプロモーターおよびエンハンサー等が
あり、また発現に必要な、任意の必須リボソーム結合部
位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受
容部位、転写終止配列および５’フランキング非転写配
列などもある。この点に関する好ましい態様において、
ＳＶ４０スプライス部位およびＳＶ４０ポリアデニル化
部位由来のＤＮＡ配列はこれらの型の獲得非転写遺伝要
素に用いられる。
【０１０５】カテプシンＫポリペプチドは硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用性クロマトグラフィ
ー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー
等の周知の方法により、組換え細胞培養物から回収およ
び精製できる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラ
フィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。ポリペプチド
が単離および／または精製中に変性した場合、再び活性
な立体配座にするために再折り畳みタンパク質のための
周知の技術を用いることができる。
【０１０６】本発明のポリペプチドには、天然に精製さ
れた産物、化学合成法の産物および組換え法により原核
または真核宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫お
よび哺乳動物細胞から産生した産物等がある。組換え産
生法において用いる宿主に応じて、本発明のポリペプチ
ドはグリコシル化または非グリコシル化してよい。さら
に、本発明のポリペプチドはまた、ある場合は宿主媒介
工程の結果として、開始改変メチオニン残基をも含有で
きる場合もある。
【０１０７】本発明の好ましい態様の更なる説明 カテプシンＫポリヌクレオチドおよびポリペプチドは本
発明に準じて、種々の適用とりわけカテプシンＫの化学
的および生物学的特性を利用する適用のために使用でき
る。なかでも、とりわけ骨粗鬆症等の骨疾患、並びに例
えばパジェット病、ゴーチャーズ病、ＣＮＳ炎症、アル
ツハイマー病、上皮小体亢進症、骨分解、転移性腫瘍、
リウマチ性関節症、変形性関節症、歯周病および骨イン
プラントおよび骨プロシーゼス（protheses）とりわけ
歯科インプラントの分解等の疾患の検出および処置に適
用される。さらに細胞、組織および器官の障害の診断お
よび処置にも適用される。これらの本発明の態様は、さ
らに以下の記載により説明する。
【０１０８】ポリヌクレオチド検定 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌク
レオチドを検出するためのカテプシンＫエキソン、イン
トロン、プロモーターおよびポリヌクレオチドの使用に
関する。機能不全に関与するカテプシンＫの突然変異型
の検出は、例えば骨粗鬆症、歯周病、パジェット病、ゴ
ーチャーズ病、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、上皮小
体亢進症、および骨分解、転移性腫瘍、並びに骨インプ
ラントおよび骨プロシーゼス、とりわけ歯科インプラン
トの分解等のカテプシンＫの発現不足、過剰発現または
変化した発現の結果起こる疾患または疾患に対する感受
性を付与できる、または明確にできる診断方法を提供す
る。
【０１０９】ヒトカテプシン遺伝子の突然変異を担うも
のは種々の技術によりＤＮＡレベルで検出できる。診断
用の核酸は患者の細胞例えば血液、尿、唾液、組織生検
および剖検材料より得ることができる。ゲノムＤＮＡは
直接的に検出するのに使用できるか、または分析の前に
ＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅できる（Saiki
ら、Nature，324:163-166（1986））。ライゲーション
媒介増幅もまた増幅に用いることができる（Vollach,V.
ら、Nucl.Acids Res.，22:2507（1994））。ＲＮＡまた
はｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。例と
しては、カテプシンＫをコードする核酸に相補的なＰＣ
ＲプライマーはカテプシンＫ発現および突然変異の同定
および分析に用いることができる。例えば、欠損および
挿入は正常の遺伝子型に比較して増幅産物の大きさの変
化により検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを放射
性標識化カテプシンＫ ＲＮＡに、また別に放射性標識
化カテプシンＫアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイ
ズすることにより同定できる。完全にマッチした配列は
ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差により、ミ
スマッチ二重らせんから区別できる。
【０１１０】参照遺伝子および突然変異を有する遺伝子
の配列の違いはまた、直接的なＤＮＡシークエンシング
により表すこともできる。さらに、クローン化ＤＮＡ部
分は特異的ＤＮＡ部分を検出するためのプローブとして
用いることができる。このような方法の感度はＰＣＲを
適当に使用することにより、または別の増幅方法により
非常に増強させることができる。例えば、シークエンシ
ングプライマーは二本鎖ＰＣＲ産物または改変ＰＣＲに
より生じる一本鎖鋳型分子と共に用いられる。配列決定
は、放射性標識化ヌクレオチドを用いる通常の方法によ
り、または蛍光タグを用いる自動シークエンシング法に
より行うことができる。
【０１１１】ＤＮＡ配列の差に基づく遺伝的試験は、変
性物質を伴うまたは伴わないゲル中のＤＮＡ断片の電気
泳動の可動性の変化を検出することにより達成できる。
小さな配列の欠損および挿入は高分析能ゲル電気泳動に
より可視化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は、異なる
ＤＮＡ断片の可動性がゲル中特異的融解または部分的融
解温度に準じて異なる位置で遅延する、変性ホルムアミ
ドグラジエントゲル上で区別できる（例えばMeyersら、
Science，230:1242（1985）参照）。
【０１１２】特異的な位置での配列の変化はまた、ヌク
レアーゼ保護検定例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護また
は化学的切断法によっても表すことができる（例えばCo
ttonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,米国，85:4397-4401（19
85））。このように、特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直
接的ＤＮＡシークエンシングまたは制限酵素の使用（例
えば制限断片長多形性（「ＲＦＬＰ」））、ＳＳＣＰお
よびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングにより達成で
きる。通常のゲル電気泳動およびＤＮＡシークエンシン
グに加えて、突然変異もまた従来の分析により検出でき
る。
【０１１３】染色体検定 本発明の配列はまた染色体同定にも有用である。この配
列は個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化
し、ハイブリダイズできる。さらに、染色体上の特定の
部位を同定する必要性が現在ある。今のところ染色***
置をマークできる、実際の配列データー（繰り返し多形
性）に基づく染色体マーキング試薬は少ししかない。本
発明に準じた染色体に対するＤＮＡのマッピングは、こ
れらの配列を疾患に関与する遺伝子と関連付けるのに重
要な最初の段階である。
【０１１４】この点に関する好ましい態様において、本
明細書に開示するｇＤＮＡは、カテプシンＫ遺伝子のゲ
ノムＤＮＡをクローンするのに用いられる。これは種々
の周知の技術および通常市販されているライブラリーを
用いて達成できる。次にゲノムＤＮＡを、この目的のた
めの周知の技術を用いて、従来の染色体マッピングに使
用する。染色体マッピングのための通常的な方法に準じ
て、典型的なものでは、従来の良好なハイブリダイゼー
ション信号を提供するゲノムプローブを同定するための
幾つかの試行錯誤が必要である。
【０１１５】さらに、ｇＤＮＡからのＰＣＲプライマー
（好ましくは１５〜２５塩基対）を調製することにより
配列が染色体にマッピングされ得る場合もある。遺伝子
の３’非翻訳領域のコンピューター分析は、増幅法を複
雑化する、ゲノムＤＮＡにおいて1以上のエキソンを延
ばさないプライマーを速やかに選別するために使用す
る。これらのプライマーは次に個々のヒト染色体を含有
する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用
される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこ
れらのハイブリッドのみが増幅断片を生じる。
【０１１６】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てるための迅
速な方法である。同一のオリゴヌクレオチドプライマー
を用いる本発明を使用して、類似の方法で特異的染色体
（例えば放射ハイブリッドパネル）または大きなゲノム
クローンのプールからの、断片のパネルで亜局在化（su
blocalize）できる。その染色体にマッピングするため
に使用できるその他のマッピング方法には、従来ののハ
ブリダイゼーション、標識化流動分類染色体でのプレス
クリーニングおよび構築染色体特異的ｃＤＮＡライブラ
リーに対するハイブリダイズによるプレ選別等がある。
【０１１７】***中期染色体分散に対する、ｃＤＮＡク
ローンの従来の蛍光ハイブリダイゼーション（「ＦＩＳ
Ｈ」）は、１段階における正確な染色***置を提供する
ために使用できる。この技術は５０から６００の長さの
ｇＤＮＡで用いることができる。この技術に関する文献
に関しては、Vermaら、Human Chromosomes：A Manualof
Basic Techniques、ペルガモンプレス、ニューヨーク
（1988）を参照されたい。一度配列を正確な染色***置
にマッピングすると、染色体上の配列の物理学的な位置
が遺伝地図データーで補正できる。このようなデーター
は例えば、ジョーンズホプキンス大学、ウェルチメディ
カルライブラリーを介したオンラインで利用できるV,.M
cKusick，Mendelian Inheritance in Manに見出すこと
ができる。同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子
および疾患との関係は、次いで連鎖分析（物理的に近接
した遺伝子の共同遺伝（coinheritance））により同定
される。
【０１１８】次に、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列に
おける影響を受けた個体および受けていない個体との差
を決定する必要がある。影響を受けた個体の幾つかまた
は全てで突然変異が観察されるが、任意の正常の個体で
は突然変異が観察されない場合、突然変異は疾患の原因
物質になり得る。物理的マッピングおよび遺伝的マッピ
ング技術の現在の解析により、疾患に関与する染色体領
域に正確に位置するｇＤＮＡは５０〜５００の強力原因
遺伝子のｇＤＮＡであろう。（これは１メガ塩基マッピ
ング解析および２０キロ塩基あたり１遺伝子とみな
す）。
【０１１９】ポリペプチド検定 本発明はまたポリペプチドの正常および異常レベルの決
定を含む、細胞、組織および体液中のカテプシンＫタン
パク質のレベルの検出のための定量、診断検定等の診断
検定にも関する。本発明の診断法に有用な体液には、例
えば滑液、脳脊髄液、尿、血清、歯肉液およびリンパ液
等がある。このように、例えば本発明に準じた、正常対
照組織試料と比較したカテプシンＫの過剰発現を検出す
る診断検定は、疾患例えば骨粗鬆症、パジェット病、ゴ
ーチャーズ病、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、上皮小
体亢進症、骨分解、転移性腫瘍、リウマチ性関節症、変
形性関節症、歯周病並びに骨インプラントおよび骨プロ
シーゼスとりわけ歯科インプラントの分解等の存在を検
出するために用いることができる。宿主由来の試料中の
タンパク質のレベルを測定するために用いることができ
る検定技術、例えば本発明のカテプシンＫタンパク質の
イムノアッセイは当業者に周知である。このような検定
方法にはラジオイムノアッセイ、競合結合検定、ウエス
タンブロット分析およびＥＬＩＳＡ検定等がある。この
うちＥＬＩＳＡが頻繁に好ましく用いられる。ＥＬＩＳ
Ａ検定ではまず、カテプシンＫに特異的な抗体、好まし
くはモノクローナル抗体を調製する。さらにモノクロー
ナル抗体に結合するリポーター抗体を通常調製する。リ
ポーター抗体は放射性、蛍光または酵素試薬、この例に
おいては西洋ワサビペルオキシダーゼ等の検出可能な試
薬に結合する。
【０１２０】ＥＬＩＳＡを実施するために、試料を宿主
から取り出し、試料中のタンパク質と結合する固体支持
体例えばポリスチレン皿上でインキュベートする。皿上
の任意のフリーのタンパク質結合部位をウシ血清アルブ
ミンのような非特異的タンパク質とインキュベートする
ことにより被覆する。次に、モノクローナル抗体がポリ
スチレン皿に付着した任意のカテプシンＫタンパク質に
付着する時間、モノクローナル抗体を皿の中でインキュ
ベートする。非結合モノクローナル抗体は緩衝液で洗い
出す。西洋ワサビペルオキシダーゼに連結したリポータ
ー抗体は皿に載せ、リポーター抗体をカテプシンＫに結
合した任意のモノクローナル抗体に結合させる。非付着
リポーター抗体を次いで洗い出す。比色基質等のペルオ
キシダーゼ活性のための試薬を次いで皿に加える。１次
および２次抗体により、カテプシンＫに連結した固定化
ペルオキシダーゼは呈色した反応産物を産生する。規定
の時間内に増加した色の量は試料中に存在するカテプシ
ンＫタンパク質の量を示す。一般に定量結果は標準曲線
との比較により得られる。競合検定を用いることがで
き、この検定では、カテプシンＫ特異的抗体を固体支持
体および標識化カテプシンＫに付着させ、宿主由来の試
料を固体支持体を通過させ、固体支持体に付着した検出
される標識量は、試料中のカテプシンＫ量に相関する。
【０１２１】抗体 ポリペプチド、それらの断片もしくはその他の誘導体、
またはそれらの類似体、またはそれらを発現する細胞
は、それらの抗体を産生する免疫原として用いることが
できる。これらの抗体は例えばポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体でよい。本発明はまたキメラ、一本鎖
およびヒト化抗体、およびＦａｂ断片またはＦａｂ発現
ライブラリーの産物等を含む。当業界に周知の種々の方
法は、このような抗体および断片の産生に使用できる。
本発明の配列に対応するポリペプチドに抗して生じる抗
体は、ポリペプチドを好ましくはヒトはでない動物に直
接注射するかまたは動物にポリペプチドを投与すること
により得ることができる。このようにして得られた抗体
は次いでポリペプチド自身に結合する。この方法でポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえももとの全ポ
リペプチドに結合する抗体の産生に用いることができ
る。このような抗体はポリペプチドをポリペプチドを発
現する組織から単離するのにもちいることができる。
【０１２２】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的なクローンのセルライン培養により産生される抗体を
提供する任意の技術を用いることができる。実例として
は、ハイブリドーマ法（Kohler，G.およびMilstein,
C.，Nature，256:495-497（1975））、トリオーマ法、
ヒトＢセルハイブリドーマ法（Kozborら、Immunology T
oday，4:72（1983））およびヒトモノクローナル抗体を
産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、Mo
noclonal Antibodies and Cancer Therapy，アランＲリ
スインコーポレーティッド、77-96頁（1985））等があ
る。一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特
許第４９４６７７８号）は本発明の免疫原ポリペプチド
産物に対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウスまたはその他の生物例え
ばその他の哺乳動物は、例えば本発明の免疫原ポリペプ
チド産物に抗するヒト化抗体等の抗体を発現するのに用
いることができる。
【０１２３】従って、とりわけこのような抗体は、突然
変異カテプシンＫまたは異常カテプシンＫレベルに引き
起こされるまたはこれらが関与する疾患、例えば骨粗鬆
症、歯周病、パジェット病、ゴーチャーズ病、ＣＮＳ炎
症、アルツハイマー病、上皮小体亢進症、骨分解、転移
性腫瘍、並びに骨インプラントおよび骨プロシーゼス
（protheses）とりわけ歯科インプラントの分解等の検
出および処置に用いることができる。本発明のポリヌク
レオチドを用いた免疫化は、カテプシンＫ特異的免疫応
答を生じる周知の反応を用いて実施できる。
【０１２４】臨床ゲノム学（Clinical Genomics） 本発明はカテプシンＫ遺伝子突然変異またはカテプシン
Ｋ遺伝子発現異常を有するまたはそれらの恐れのある個
体の薬物反応性を測定する方法を提供し、またこのよう
な方法を実施する試薬をも提供する。個体は、カテプシ
ンＫ遺伝子の突然変異またはカテプシンＫ遺伝子発現に
より引き起こされるまたはそれらに関与する疾患の処置
のために用いられる規定の化合物、とりわけ薬物に対す
る反応性によりグループ分けできる。このような個体は
異なる遺伝子突然変異または遺伝子発現レベル変異型を
検出することによりさらにグループ分けできる。このよ
うに、特異的遺伝子突然変異および遺伝子発現変異型は
ある程度個々の化合物に対する反応性と容易に関連付け
ることができる。本明細書で提供する方法および試薬
は、カテプシンＫ遺伝子突然変異およびカテプシンＫ遺
伝子発現変異型を検出することにより化合物反応性をグ
ループ分けするために用いることができる。化合物反応
性による個体のグループ分けのその他の方法は、当業者
に周知であり、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドの使用に適用できる。本発明はまた、装置と組み
合わせて有用な、または組成物として具体化したアルゴ
リズムを提供し、これはカテプシンＫまたはそれらの突
然変異もしくは変異型に引き起こされるまたはそれらに
関与する疾患の診断に有用である。好ましいアルゴリズ
ムは疾患の階層化および段階化のために提供される。
【０１２５】カテプシンＫ結合分子および検定 本発明はまた、本発明のカテプシンＫまたはカテプシン
Ｋ断片に結合する受容体分子のような分子の同定方法を
も提供する。カテプシンＫに結合するタンパク質例えば
受容体タンパク質をコードする遺伝子は当業者に周知の
多くの方法、例えばリガンドパニングおよびＦＡＣＳ分
類により同定できる。このような方法は多くの実験マニ
ュアル、例えばColiganら、Current Protocols イン Immu
nology、1(2):第5章（1991）に記載されている。
【０１２６】例えば発現クローニングはこの目的で用い
ることができる。この目的のためのポリアデニル化ＲＮ
Ａは、カテプシンＫに反応する細胞から調製し、ｃＤＮ
ＡライブラリーはこのＲＮＡから作り、ライブラリーは
プールに分割し、プールはカテプシンＫに反応しない細
胞に個々にトランスフェクトする。トランスフェクトし
た細胞を次に標識化カテプシンＫに曝露する。（カテプ
シンＫは放射性ヨー素化またはプロテインキナーゼ特異
的部位の認識部位の封入標準法等の種々周知の技術によ
り標識化できる。）曝露した後、細胞を固定し、カテプ
シン結合またはカテプシンＫに結合する分子を測定す
る。これらの方法は便宜上ガラススライド上で実施す
る。
【０１２７】プールはカテプシンＫ結合細胞を産生する
ｃＤＮＡを同定する。サブプールは上述のように宿主細
胞にトランスフェクトし、スクリーニングしたこれらの
陽物質から調製する。サブプール化および再スクリーニ
ング工程を繰り返し、推定される結合分子または基質例
えば細胞マトリックス、骨マトリックスまたは受容体分
子をコードする１またはそれ以上の単一のクローン、お
よび同様のものはどれも単離できる。また別に、標識化
リガンドは細胞抽出物例えばリガンドが結合する分子例
えば受容体分子を発現する細胞から調製した膜または膜
抽出物に連結した光親和物にできる。交差架橋物質はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により
解析し、Ｘ腺フィルムに曝露する。リガンド受容体を含
有する標識化複合体は切り取り、ペプチド断片を分解
し、タンパク質のマイクロシークエンシングに供するこ
とができる。マイクロシークエンシングにより得られた
アミノ酸配列は、推定される受容体分子をコードする遺
伝子を同定するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
する、独特なまたは同義性オリゴヌクレオチドプローブ
の設計に用いることができる。本発明のポリペプチドは
また、細胞中のまたは細胞不含調製物中の、カテプシン
Ｋ結合分子、例えば受容体分子のカテプシンＫ結合能力
を評価するために用いることができる。
【０１２８】アゴニストおよびアンタゴニスト−検定お
よび分子 本発明はまた細胞中または上のカテプシンＫの作用、例
えばカテプシンＫ結合分子例えば受容体および酵素基質
分子とカテプシンＫの相互作用を増強または阻止する化
合物を同定するための、化合物のスクリーニング方法を
も提供する。アゴニストはカテプシンＫの天然の生物学
的機能を増強する化合物であり、一方アンタゴニストは
このような機能を低下または排除する化合物である。例
えば、細胞の区画例えば膜、空胞、封入物またはそれら
の任意の調製物例えば膜調製物は、カテプシンＫに結合
する分子、例えばカテプシンＫにより調節される信号化
または制御経路の分子を発現する細胞から調製できる。
その調製物を、カテプシンＫアゴニストまたはアンタゴ
ニストに成り得る候補分子の存在下または不在下で、標
識化カテプシンＫと共にインキュベートする。候補分子
が基質等の結合分子に結合する能力は、標識化リガンド
の結合の低下の影響を受ける。結合しても影響を及ぼさ
ない分子、すなわちカテプシンＫ結合分子の結合にカテ
プシンＫの影響を誘起しない分子は、最も良好なアンタ
ゴニストに成るであろう。結合性が良好で、カテプシン
Ｋと同一のまたは非常に関連した効果を引き出す分子
は、アゴニストである。
【０１２９】有効なアゴニストおよびアンタゴニストの
カテプシンＫ様効果は、例えば候補分子の細胞または適
当な細胞調製物との相互作用に続く２次メッセンジャー
システムの活性を決定し、効果をカテプシンＫの効果と
またはカテプシンＫと同一の効果を引き出す分子の効果
と比較することにより測定できる。この点に関して有用
に成り得る２次メッセンジャーシステムには、ＡＭＰグ
アニレートサイクラーゼ、イオンチャネル、ホスホイノ
シタイド加水分解２次メッセンジャーシステム、または
カテプシンＫの強力なアゴニストおよびアンタゴニス
ト、またはそれの基質の結合を信号化する化合物等があ
るが、これらに限定するものではない。
【０１３０】カテプシンＫアンタゴニストの検定の他の
例は競合検定であり、競合阻害検定に適当な条件下で、
カテプシンＫおよび強力なアンタゴニストを酵素基質ま
たは基質類似体に結合させる。カテプシンＫを例えば放
射活性により標識化し、受容体分子に結合するカテプシ
ンＫ分子の数を正確に決定し、有効なアンタゴニストの
効果を評価できる。
【０１３１】有効なアンタゴニストには、本発明のポリ
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消
失させる小さい有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよ
び抗体等がある。有効なアンタゴニストにはまた、結合
分子例えば受容体分子の同一の部位で結合する、カテプ
シンＫ誘起活性を誘起せず、それによりカテプシンＫを
結合から排除することによりカテプシンＫの作用を防御
する小さい有機分子、ペプチド、ポリペプチド、例えば
非常に相関したタンパク質または抗体等がある。有効な
アンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合
し、結合部位を占領し、それにより細胞結合分子例えば
受容体分子への結合を防御し、正常の生物学的活性を防
御する、小さい分子等がある。小さい分子の例として
は、小さい有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子な
どがあるが、これらに限定するものではない。
【０１３２】その他の有効なアンタゴニストにはアンチ
センス分子等がある。アンチセンス技術はアンチセンス
ＤＮＡまたはＲＮＡによる、または三重らせん形成によ
る制御遺伝子発現に用いることができる。アンチセンス
技術については、例えばOkano,J.，Neurochem.56:560
（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhib
itors of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラー
トン、フロリダ州（1988）に記載されている。三重らせ
ん形成については例えばLeeら、Nucleic Acids Researc
h6:3073（1979）；Cooneyら、Science241:456（198
8）；およびDervanら、Science251:1360（1991）に記載
されている。この方法は、ポリヌクレオチドの相補的Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。例えば本発
明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの
５’コード部分は、約１０〜４０塩基対の長さのアンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに用いる
ことができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、カテプシ
ンＫの転写および産生を防御する転写に係わる遺伝子領
域に相補的になるように設計される。アンチセンスＲＮ
ＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリ
ダイズし、ｍＲＮＡ分子のカテプシンＫポリペプチドへ
の翻訳を阻止する。上述のオリゴヌクレオチドはまた、
アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現し、
カテプシンＫの産生を阻害するように細胞に運ぶことも
できる。
【０１３３】このアンタゴニストは、例えば本明細書の
以下に記載するような、医薬的に許容され得る担体と共
に組成物として用いることができる。このアンタゴニス
トは、例えば突然変異カテプシンＫまたは異常カテプシ
ンＫレベルにより引き起こされるまたはこれらに関与す
る疾患、例えば骨粗鬆症、パジェット病、ゴーチャーズ
病、ＣＮＳ炎症、アルツハイマー病、上皮小体亢進症、
骨分解、転移性腫瘍、リウマチ性関節症、変形性関節
症、歯周病および骨インプラントおよび骨プロシーゼス
とりわけ歯科インプラントの分解等の処置に用いること
ができる。
【０１３４】組成物 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含む
組成物にも関する。従って、本発明のポリペプチドは非
無菌もしくは無菌担体と、または細胞、組織もしくは生
物に用いられる担体、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と組み合わせて用いることができる。このような
組成物には例えば媒体添加物または本発明のポリペプチ
ドの治療的有効量、および医薬的に許容できる担体また
は賦形剤を含む。このような担体には生理食塩水、デキ
ストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれ
らの組み合わせ等でよいが、これらに限定するものでは
ない。製剤は投与法に適した物にすべきである。
【０１３５】キット 本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分を1または
それ以上を充填した１またはそれ以上の容器を含む医薬
的パックおよびキットにも関する。このような（複数
の）容器と一緒に、医薬または生物学的産物の製造、使
用または販売を統制する政府機関により処方された形態
の注意書であって、ヒトへの投与用の製品の製造、使用
または販売に関する該政府機関の承認を示す注意書が添
付されることがある。
【０１３６】投与 本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独で
または治療用化合物等のその他の化合物と組み合わせて
用いることができる。医薬組成物は任意の有効な、利便
的な方法例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈内、
腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、関節内または皮膚内
の経路で投与できる。医薬組成物は、通常具体的な適応
症または複数の適応症の処置または予防に有効量投与す
る。一般に、この組成物は少なくとも約１０ｍｇ／体重
の量で投与する。好ましくは、たいての場合、投与量は
１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重であ
る。至適投与量は、適応、その重篤度、投与経路、合併
症の状態等を考慮に入れて、各々の処置様式および適応
のための標準法により決定されることは理解されよう。
【０１３７】遺伝子治療 カテプシンＫポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペ
プチドであるアゴニストおよびアンタゴニストは、本発
明に準じて、インビボでこのようなポリペプチドを発現
することにより、しばしば「遺伝子治療」と称せられる
治療様式に用いることができる。このように、例えば患
者の細胞をエクソビボでポリペプチドをコードするＤＮ
ＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドで操作でき、
次いで操作した細胞をポリペプチドで処置すべき患者に
提供できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクター
を使用することにより、細胞をエクソビボで操作でき
る。このような方法は当業界で周知であり、本発明にお
ける使用は、本明細書の教示より明白である。
【０１３８】またポリヌクレオチド例えば構築されたリ
ボザイムで、周知の方法を用いて患者の細胞を操作し、
カテプシンＫの発現を阻害することができる。その他の
構築物はまた、周知の方法を用いて、患者の細胞に操作
し、カテプシンＫのアンチセンス配列を含有させること
ができる。このようなアンチセンス構築物は患者のカテ
プシンＫ発現を阻害する。
【０１３９】同様に、細胞を当業界に周知の方法により
インビボで操作し、インビボでポリペプチドを発現させ
ることができる。例えば本発明のポリヌクレオチドは上
述のように複製不能レトロウイルスベクター中に発現す
るように操作できる。レトロウイルス発現構築物を、次
いで単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導
入されたパッケージング細胞に導入し、パッケージング
細胞が目的遺伝子を含有する感染性のウイルス粒子を産
生するようにすることができる。これらの産生細胞は患
者に投与し、インビボで細胞操作し、インビボでポリペ
プチドを発現することができる。このような方法で本発
明のポリペプチドを患者に投与するためのこれらのまた
はその他の方法は、本明細書の教示から当業者に明らか
であるはずである。
【０１４０】上述のレトロウイルスプラスミドベクター
は、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイル
ス、レトロウイルス例えばラウス肉腫ウイルス、ハーヴ
ェイ肉腫ウイルス、鳥白血症ウイルス、テナガザル白血
病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、
骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび哺乳動物腫瘍ウイルス等
に由来するが、これらに限定するものではない。一つの
態様では、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニ
ーネズミ白血病ウイルスに由来する。このようなベクタ
ーは、ポリペプチド発現のためのプロモーターを１また
はそれ以上含む。用いることができる適当なプロモータ
ーには、カテプシンＫプロモーター、レトロウイルスＬ
ＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、およびヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Millerら、Biotechn
iques7:980-990（1989）に記載されている）、またはそ
の他の任意のプロモーター（例えばヒストン、ＲＮＡポ
リメラーゼＩＩＩおよびアルファーアクチンプロモータ
ー等の真核細胞プロモーターのような細胞性プロモータ
ーなどがあるが、これらに限定するものではない）等が
あるが、それらに限定するものではない。用いることが
できるその他のウイルス性プロモーターには、アデノウ
イルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモ
ーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーター等が
あるが、これらに限定するものではない。適当なプロモ
ーターの選別は、本明細書の教示より、当業者に明白で
あろう。
【０１４１】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適当なプロモーターの制御下に置かれる。用いるこ
とができる適当なプロモーターには、アデノウイルスプ
ロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモータ
ー；または異型性プロモーター例えばサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）プロモーター；誘導プロモーター例えばＭＭＴプ
ロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショッ
クプロモーター；アルブミンプロモーター；アポＡＩプ
ロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；ウイルス性
チミジンキナーゼプロモーター例えば単純ヘルペスチミ
ジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（上
述の改変レトロウイルスＬＴＲを含む）；アルファーア
クチンプロモーター；ヒト成長ホルモンプロモーター等
があるが、これらに限定するものではない。プロモータ
ーはまたポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天
然プロモーターでもよい。
【０１４２】レトロウイルスプラスミドベクターはパッ
ケージングセルラインに形質導入し、産生セルラインを
形成するのに用いることができる。トランスフェクトさ
れ得るパッケージング細胞の例としては、ＰＥ５０１、
ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ−１９−
１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩ
Ｐ、ＧＰ+Ｅ−８６、ＧＰ+ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ
セルライン（Miller,A.，Human Gene Therapy1:5-14（1
990）に記載されている）等があるが、これらに限定す
るものではない。ベクターは当業界で周知の任意の方法
により、パッケージング細胞に形質導入できる。このよ
うな方法には、電気泳動、リポソームの使用、およびＣ
ａＰＯ4沈殿などがあるが、これらに限定するものでは
ない。また別に、レトロウイルスプラスミドベクターは
リポソームでカプセル化するか、または脂質と結合さ
せ、次いで宿主に投与することができる。
【０１４３】産生セルラインは感染性レトロウイルスベ
クター粒子を生じ、これはポリペプチドをコードする
（複数の）核酸配列を含む。このようなレトロウイルス
ベクター粒子は次いでインビトロまたはインビボのどち
らかで真核細胞に形質導入するのに用いることができ
る。形質導入した真核細胞は、ポリペプチドをコードす
る（複数の）核酸配列を発現する。形質導入された真核
細胞はには、胚幹細胞、胚癌細胞およびヘモポイエチン
幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイ
ト、内皮細胞および気管支上皮細胞等があるが、これら
に限定するものではない。
【０１４４】
【実施例】本発明はまた以下の実施例によりさらに記載
する。この実施例は単に本発明の説明のために具体的な
態様の参考に提供するものである。これらの例示は本発
明の特定の具体的な態様を説明するものであるが、開示
する発明の範囲の限定または制限を表すものではない。
本明細書で用いる特定の用語は、前述の定義で説明す
る。本明細書で用いるヌクレオチド配列におけるＮは、
未知の一個のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを
意味する。
【０１４５】全ての実施例は、他に詳細に記載するもの
以外は、標準的な技術を用いて実施した、または実施で
き、これは当業者に周知で通常的である。以下の実施例
の通常的な分子生物学的技術は、標準的な実験マニュア
ル、例えば本明細書で”Sambrook”と称する、Sambrook
ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2
編；コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、
コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（1989）
に記載されるように実施できる。以下の実施例で示す全
ての部分または量は、特に限定しない限り、重量で示
す。
【０１４６】以下の実施例における断片のサイズ分離に
ついて、他に記載しない場合、Sambrookおよび多くのそ
の他の参考文献例えばGoeddelら、Nucleic Acids Res.
8:4057（1980）に記載される、寒天およびポリアクリル
アミドゲル電気泳動（”ＰＡＧＥ”）の標準技法を用い
て実施した。他に記載しない場合、ライゲーションは標
準的な緩衝液、インキュベーション温度および時間、ラ
イゲートすべきＤＮＡ断片の約等モル濃度の量で、ＤＮ
Ａ０.５μｇあたり約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて行った。
【０１４７】実施例１ ヒトカテプシンＫゲノムクローンの単離およびシークエ
ンシング 以下の方法に準じて、米国特許第５５０１９６９号に開
示されるｃＤＮＡを、ｇＤＮＡライブラリー（クロンテ
ック）からｇＤＮＡクローンを単離するのに用いた。近
接するエキソン（７エキソンの６）のプライマーを調製
した。これらのプライマーの配列は図１０および１１で
下線を付している。ＰＣＲは当業界で周知の標準法を用
いて実施した。増幅断片はＴＡベクター（クロンテッ
ク）にクローン化し、正および逆方向シークエンシング
プライマーを用いて当業界に周知の確立された方法によ
り、自動シークエンサー（応用型バイオシステムモデル
３７３）でクローンを配列決定した。すべての内在イン
トロンの配列を得た。５’および３’末端イントロン配
列は以下のようにして得た。最初のイントロンのための
配列（図１０および１１の下線を付したプライマーを参
照）を得るように、５’末端プライマーを設計し、これ
らのプライマーを用いて２Ｐ１クローンを得た（ゲノム
システムズインコーポレーティッド）。両方のクローン
は全長である。内部のイントロン−エキソン境界接合部
の配列を確認するためにＰＣＲを使用した（実施例２参
照）。Ｐ１クローンの５’末端の配列に由来するプライ
マーは、当業界周知の通常的な方法により、各配列決定
段階での新規のプライマーを用いて、段階的な方法で
「ウォーク（walk）」し、クローンに沿った配列決定を
するために使用することができる。Ｐ１クローンの精製
は、実施例１（ｄ）に示す様に実施した。”ウォーキン
グ”および配列決定は両方向で実施し、カテプシンＫｇ
ＤＮＡ配列を確認した。校正Ｔａｑポリメラーゼ（ＰＣ
Ｒウルチマ、ペルキンエルマー）を用いて再びＰＣＲを
実施した。転写開始部位は、５’ＲＡＣＥキット（ギブ
コＢＲＬ）およびそこから供給されたプロトコールを用
いて得た。この部位はまたＲＮアーゼ保護検定キット
（ハイブスピード、ＲＰＡアンビオン）を用いても確認
した。実施例１（ａ）−（ｄ）はカテプシンＫのクロー
ニングおよびシークエンシングに関してさらに具体的に
記載している。
【０１４８】（ａ） イントロン−エキソン境界のＤＮ
Ａシークエンシングイントロン− エキソン境界 イントロン１ エキソン１から２のＰＣＲに設計され得るプライマーの
５’ＵＴＲ配列を決定する５’ＲＡＣＥ（ギブコＢＲ
Ｌ）を利用して、イントロン１を同定した。（イントロ
ン１はＡＴＧの前に出発するので、ＰＣＲは可能なｃＤ
ＮＡ配列に基づいて容易には用いることができない）イ
ントロン１はヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック）でＰＣ
Ｒにより増幅し、ＰＣＲＩＩベクターにクローン化し、
実施例１に記載されるように配列決定した。イントロン２ イントロン２はヒトゲノムＤＮＡで、エキソン２からエ
キソン３に設計したプライマーから、ＰＣＲにより同定
した。ＰＣＲ産物は標準法を用いてクローン化および配
列決定した。イントロン３ イントロン３はヒトゲノムＤＮＡで、エキソン３からエ
キソン４に設計したプライマーから、ＰＣＲにより同定
した。ＰＣＲ産物は標準法を用いてクローン化および配
列決定した。イントロン４ イントロン４はヒトゲノムＤＮＡで、エキソン４からエ
キソン５に設計したプライマーから、ＰＣＲにより同定
した。ＰＣＲ産物は標準法を用いてクローン化および配
列決定した。イントロン５＆６ イントロン５および６はヒトゲノムＤＮＡで、エキソン
５からエキソン７に設計したプライマーから、ＰＣＲに
より同定した。ＰＣＲ産物は標準法を用いてクローン化
および配列決定し、両イントロンの存在を確認した。イントロン７ イントロン７はヒトゲノムＤＮＡで、エキソン７からエ
キソン８に設計したプライマーから、ＰＣＲにより同定
した。ＰＣＲ産物は標準法を用いてクローン化および配
列決定した。ヒトゲノムＤＮＡでＰＣＲにより同定した
全てのイントロンは、Ｐ１クローンＡ（以下の（ｂ）参
照）クローン（ゲノムシステムズインコーポレーティッ
ド）の同一の領域のＰＣＲにより確認した。
【０１４９】（ｂ） ５’および３’非翻訳領域（ＵＴ
Ｒ）のＤＮＡシークエンシング ５’および３’非翻訳領域は単一のＰ１クローン（ゲノ
ムシステムズインコーポレーティッド）から単離した。
このＰ１クローンは本明細書では”Ｐ１クローンＡ”と
同定した。標準法を用いて確認したｃＤＮＡ配列に由来
する遺伝子特異的プライマーで、Ｐ１クローンの直接的
に配列をウォーキングアップおよびダウンすることによ
り配列決定した。これらの領域を次にＰＣＲによりクロ
ーン化し、標準法を用いて配列分析により確認した。製
造者指示書に準拠して、校正Ｔａｑポリメラーゼウルチ
マを用いて、ＰＣＲにより５’ＵＴＲをさらに増幅し、
クローン化し配列の不明瞭性を排除した。５’および
３’ＵＴＲはさらに標準法を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ
上でＰＣＲにより確認した。
【０１５０】（ｃ） ｍＲＮＡキャップ部位のＤＮＡシ
ークエンシングおよびエキソン１の大きさ ｍＲＮＡキャップ部位は、５’ＲＡＣＥシークエンシン
グに基づき、出発コドンの約４８塩基対上方にあると決
定された。リボヌクレアーゼ保護検定は転写からの出発
部位がＡＴＧ（出発コドン）の約４８塩基対上方にある
ということを示唆する、約４８塩基対の大きさの保護断
片を確認した。推定される転写因子は、データベース転
写因子配列情報で配列分析して同定し、これらは図２３
−２４（Ｓ）［配列番号：２］に示す。１.１キロ塩基
の５’ＵＴＲ断片はｐＣＡＴ発現ベクターにクローン化
し、さらにプロモーター配列領域を分析した。
【０１５１】（ｄ） Ｐ１ ＤＮＡ調製 カナマイシンＬＢプレート上でＰ１クローンＡコロニー
を筋付けした。単一のコロニーを採り、２５μｇ／ｍｌ
のカナマイシンと共に２０ｍｌ中でＯ／Ｎ成長させた。
Ｏ／Ｎ培養物１６ｍｌを培地５００ｍｌ（カナマイシン
２５μｇ／ｍｌ）に接種し、１０時間成長させた。細胞
は遠心によりペッレト化し、キアゲンＰ１溶液１０ｍｌ
に再懸濁した。キアゲンＰ２溶液１０ｍｌを加え、室温
で5分間インキュベートした。キアゲンＰ３溶液１０ｍ
ｌを加え、混合物を15分間氷上で放置した。試料を１０
０００ｇで15分間回転させた。上澄を除去し、フェノー
ルで抽出した。上澄を次にクロロホルムで再抽出した。
ＮａＯＡｃ ｐＨ５.２およびイソプロパノール1.１容量
を加えてＤＮＡを沈殿させた。１００００ｇで15分間遠
心して、ＤＮＡをペレット化し、７０％エタノールで洗
浄した。シークエンシング用にＤＮＡを清浄するため
に、ＤＮＡ２５０μｌ（約５０μｇ）を1.５ＭのＮａＣ
ｌ中３０％ＰＥＧ６５μｌに加えた。３Ｍ ＮａＣｌ
８.５μｌを加え、混合物を氷上で30分間インキュベー
トした。試料を１２０００ｇで１０分間回転させた。上
澄を捨て、ペレットを２００μｌの蒸留水に溶解した。
ＤＮＡを次にクロロホルムで抽出し、旋回し１００００
ｇで1分間回転させた。水層を除去し、ＤＮＡを４０μ
ｌのＮａＯＡｃｐＨ５.２および１ｍｌのエタノールで
沈殿させた。試料を１２０００ｇで30分間回転させた。
ＤＮＡを７０％エタノール１ｍｌで洗浄し、蒸留水に再
懸濁した。シークエンシングの前にＤＮＡを２Ｍ Ｎａ
ＯＨ０.１容量および２ｍＭＥＤＴＡで変性し、３７℃
で３０分間インキュベートした。混合物を３Ｍ ＮａＯ
Ａｃ ｐＨ５.２、０.１容量で中和し、エタノール２．
５容量で沈殿させた。変性ＤＮＡを蒸留水中１μｇ／μ
ｌ、６μｇ／μｌの濃度で再懸濁し、ＴａｑＦＳを用い
る各々のシークエンシング反応（ＡＢＩ）で使用した。
【０１５２】実施例２ カテプシンＫの染色体マッピング 精製Ｐ１ ＤＮＡを具体的な染色体にマッピングするた
めに、ＦＩＳＨ分析（ゲノムシステムズインコーポレー
ティッド）に用いた。２ＰＣＲ体細胞ハイブリッドパネ
ルの使用により、先に得られた結果は、染色体１へマッ
ピングした遺伝子を示した。ＦＩＳＨ分析により、染色
体１へのマッピングおよびさらに１ｑ２１にマッピング
した遺伝子を確認した。これはカテプシンＳとして知ら
れている座と同一の座である。
【０１５３】実施例３ ＣＯＳ細胞におけるカテプシンＫの発現 ＣＡＴ検定 ＣＡＴリポーター遺伝子の上方に１１００塩基対の推定
ＣａｔＫプロモーターを含有するｐＣＡＴ−ＣａｔＫ
は、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ細胞にトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションは１００ｍｍ
皿中ＣＯＳ細胞に施し、５μｇのＤＮＡを用いた。対照
として、プロモーターまたはエンハンサーを含まないｐ
ＣＡＴベーシックおよびＳＶ４０プロモーターおよびエ
ンハンサーを含むｐＣＡＴコントロールをまた別々に移
した。トランスフェクションの７２時間後、凍結融解に
より抽出物を作り、抽出タンパク質の等量を1時間およ
び一晩の両方のＣＡＴ検定に用いた。非トランスフェク
トＣＯＳ細胞では活性は検出されなかった。ｐＣＡＴ−
ＣａｔＫは、非トランスフェクト細胞からのバックグラ
ンドを減じた後、ｐＣＡＴベーシックに相対的なＣＡＴ
発現の１．４〜１．６倍の増加を示した。種々のインデ
ューサーの存在下高レベルの活性化を得ることが可能で
あるので、外因性１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３の
添加によりＣａｔＫプロモーターの活性化が起こると考
えられる。ビタミンＤは他の研究によりオステオカルシ
ン、オステオポンチン、カルシトニンおよびＰ４５０プ
ロモーターの転写を、ビタミンＤ受容体およびこれらの
種々プロモーターに見出される（複数の）ビタミンＤ反
応要素との相互作用により活性化することが示されてい
る。ビタミンＤがこれらのプロモーターの活性化移動す
る能力は骨形成および再吸収の制御において役割を果た
していると考えられる。エストローゲン反応性を評価す
るために、類似した実験を行い、これもまた骨形成およ
び再吸収の制御にいおいて役割を果たしていると考えら
れる。
【０１５４】実施例４ ヒトカテプシンＫの遺伝子治療的発現 皮膚生検により対象から繊維芽細胞を得た。得られた組
織を組織培養培地に載せ、小片に分割する。組織の小さ
い固まりを組織培養フラスコの湿った表面上に載せ、約
１０片を各フラスコに載せる。フラスコを上下逆に置
き、きっちり締めて一晩室温で放置する。室温で24時間
後、組織の固まりはフラスコの底に付着して残るように
してフラスコを逆さにし、新鮮な培地を加える（例えば
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
加えたＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）。組織を次いで３７℃
で約1週間インキュベートする。この時、新鮮培地を加
え、続いて数日毎に変える。更なる2週間の培養の後、
繊維芽細胞の単層が生じる。その単層をトリプシン処理
し、大きなフラスコに剥ぎおとす。遺伝子治療のための
ベクターは、発現させる断片をクローニングするために
制限酵素で消化した。消化したベクターを仔ウシ腸管ホ
スファターゼで処理し、自身のライゲーションを防御す
る。脱リン酸化した直線ベクターは寒天ゲル上で分画化
し、精製する。
【０１５５】活性カテプシンＫを発現する能力のあるカ
テプシンＫｇＤＮＡを単離する。好ましい構築物は、細
胞型特異性遺伝子発現のためにカテプシンＫプロモータ
ーを用いる。断片の末端は、必要な場合、ベクターにク
ローニングするために改変する。例えば、５’張り出し
はＤＮＡポリメラーゼで処理して平板な末端にできる。
３’張り出しはＳ１ヌクレアーゼを用いて除去できる。
リンカーはＴ４ＤＮＡリガーゼで平板末端にライゲート
できる。モロニーネズミ白血病ウイルスの直線的な骨格
およびカテプシンＫ断片の等容量を混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合した。ライゲーション混合物は、
大腸菌を形質転換するために用い、細菌を次いでカナマ
イシン含有寒天上に載せる。カナマイシン表現型および
制限分析でベクターが遺伝子を適切に挿入したことを確
認する。１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよび
ストレプトマイシン含有デュルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中、全面成長するまでパッケージング細胞
を組織培養で成長させる。カテプシンＫ遺伝子を含有す
るベクターを標準法によりパッケージング細胞に導入す
る。カテプシンＫ遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子
をパッケージング細胞から回収し、これを産生細胞と称
する。
【０１５６】新鮮な培地を産生細胞に加え、適当なイン
キュベーション時間の後、全面成長した産生細胞のプレ
ートから培地を収穫する。感染ウイルス粒子を含有する
培地をミリポアーフィルターを通してろ過し、剥がれた
産生細胞を除去する。ろ過した培地を次に繊維芽細胞に
感染させるために使用する。培地を繊維芽細胞の副全面
成長プレート（sub-confluent plate）から除去し、す
ぐにろ過した培地と入れ替える。ポリブレーン（アルド
リッヒ）は培地中に含まれ、形質導入を促進できる。適
当なインキュベーションの後、培地を除去し、新鮮な培
地と入れ替える。ウイルスの力価が高い場合、実質的に
全ての繊維芽細胞が感染し、選別の必要はない。力価が
低い場合、ネオまたはヒズのような選別マーカーを有す
るレトロウイルスベクターを用いる必要があり、発展さ
せるための形質導入細胞を選別する。次いで操作した繊
維芽細胞を、単独でまたはマイクロキャリヤービーズ例
えばサイトデックス３ビーズに全面成長させた後、ヒト
または動物例えばラットおよびマウスに注入できる。注
入した繊維芽細胞はカテプシンＫを産生し、タンパク質
の生物学的作用を宿主に伝達する。
【０１５７】本発明は、前述の説明および実施例に特に
記載した以外も、実行できることは明らかである。上述
の教示に鑑みて、本発明の多くの改変および変形が可能
であり、従ってそれらも添付の請求の範囲の範疇であ
る。
【０１５８】
【配列表】
（１）一般的情報： （i）出願人：デヴーク，クリスティーヌ、ドレイク，
フレッド、ゴーウェン，マキシン、ロッド，ジュリー、
ヘイスティングス，グレッグ、アダムス，マーク、フレ
イザー，クレア、リー，ノーマン、カークネス，イーウ
ェン、ブレイク，ジュディス、フィッツジェラルド，リ
サ （ii）発明の名称： カテプシンＫ遺伝子 （iii）配列の数：３２ （iv）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−２７９９ （v）コンピューター読取り可能な形態： （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＦastＳＥＱ Ｖersion １.５ （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年５月７日 （Ｃ）分類： （vii）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０１９,９４２ （Ｂ）出願日：１９９６年６月１４日 （vii）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０２０,２７３ （Ｂ）出願日：１９９６年６月１７日 （vii）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０２６,２７３ （Ｂ）出願日：１９９６年８月２６日 （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ハン，ウィリアム・テイ （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５０００６−
２ （ix）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：
【０１５９】（２） 配列番号：１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３６７４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１： GCTTTGGCTC CCAAAGGCCT GGGATTACAG GCGTGAACCA CTGCGCCTAG CCTGTTAGCA 60 GCTCTTAAAA TCCAGAGGCA TAAGCCTGTA TTTTTGAGGG TTTATGCATG GAATCCAGCT 120 AGAAACTGAG TCTATTACAG ATCCCATTTA TTATCCTTTC TATTCCAAGA AGCCTTTTTT 180 TCTCCTTCCC CACATCTGTT TATGGAAGAA AATGAAGTTT GGGGTGTGGT TTGAGGAATC 240 AGCTAGATTC TTATGATCTG TCACATGCTT GGATGTTGGG GAAGCATTTG GAGAAGCTCA 300 TGTGACTTGT CCTAGATTGG GGATTTTAAT TGAGACAGAT GATGTTTATC GGGCATCCCA 360 CCACCTGAGA GTTTTAGCAA CAGAGTCACA TGTGAGTCCA TCAGAACTTA CGGCATTGAT 420 TCAAGTGCTG TCATAAATAA CCAGGACTGC TGTTTTTGGT TACTTTTAAA GACAGTTTCA 480 TCTGGACTTT CTGGGCATAT CCTCCTTCAG CAAAACCACA TTAGGCTGGG AAAACTATTC 540 TGCCTGGAAG TAATGACAAC TTGCAACCAA CAAGCTTATA AAAATACAAA GAATTCTGGA 600 GCCTATGGCT TCCATTACAT TATTCTTTTA TAGCCTTTTA TGTTCATTAC CGCATCCCAG 660 AGGTGAGAGT CAGACACAAA TATGAAAATA GGTTTCAATG TTGGAGAGGT AAATCCTAAC 720 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【０１６０】（２） 配列番号：２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１０８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２： GCTTTGGCTC CCAAAGGCCT GGGATTACAG GCGTGAACCA CTGCGCCTAG CCTGTTAGCA 60 GCTCTTAAAA TCCAGAGGCA TAAGCCTGTA TTTTTGAGGG TTTATGCATG GAATCCAGCT 120 AGAAACTGAG TCTATTACAG ATCCCATTTA TTATCCTTTC TATTCCAAGA AGCCTTTTTT 180 TCTCCTTCCC CACATCTGTT TATGGAAGAA AATGAAGTTT GGGGTGTGGT TTGAGGAATC 240 AGCTAGATTC TTATGATCTG TCACATGCTT GGATGTTGGG GAAGCATTTG GAGAAGCTCA 300 TGTGACTTGT CCTAGATTGG GGATTTTAAT TGAGACAGAT GATGTTTATC GGGCATCCCA 360 CCACCTGAGA GTTTTAGCAA CAGAGTCACA TGTGAGTCCA TCAGAACTTA CGGCATTGAT 420 TCAAGTGCTG TCATAAATAA CCAGGACTGC TGTTTTTGGT TACTTTTAAA GACAGTTTCA 480 TCTGGACTTT CTGGGCATAT CCTCCTTCAG CAAAACCACA TTAGGCTGGG AAAACTATTC 540 TGCCTGGAAG TAATGACAAC TTGCAACCAA CAAGCTTATA AAAATACAAA GAATTCTGGA 600 GCCTATGGCT TCCATTACAT TATTCTTTTA TAGCCTTTTA TGTTCATTAC CGCATCCCAG 660 AGGTGAGAGT CAGACACAAA TATGAAAATA GGTTTCAATG TTGGAGAGGT AAATCCTAAC 720 AGGAAAGGGG TAGGAAAAGA TATAATCCCC CAATATTAAA ATAAAGATAT TGAAGAAGAA 780 GGATGGGAGA GACTAGGGCT GTGTCCTTCC TTTTACTCAC CAAAAGAGAA AGTAAGCTCC 840 TATTTGAGTC AATAGATATT GAGGTCTTGT TATTTGCCAC CAAAGACAGT CTTGTGAGAC 900 TAAATAGCTA GTAATTCCCT ACCCTGGCAC ACATGCTGCA TACACACAGA AACACTGCAA 960 ATCCACTGCC TCCTTCCCTC CTCCCTACCC TTCCTTCTCT CAGCATTTCT ATCCCCGCCT 1020 CCTCCTCTTA CCCAAATTTT CCAGCCGATC ACTGGAGCTG ACTTCCGCAA TCCCGATGGA 1080 ATAAATCTAG CACCCCTGAT GGTGTGCC 1108
【０１６１】（２） 配列番号：３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：３： CACACTTTGC TGCCGAAACG AAGCCAGACA ACAGATTTCC ATCAGCAG 48
【０１６２】（２） 配列番号：４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：４： GTAACGTTTG CAACTTCCTA GATCTTTTAG CTTTTCATTC CTGTCAATTC TCTGAGTATT 60 AGGGATGTAG TGACTTGAGG ATCACAATAA ACTTTTAGCC TCTGCAGATG AAAACAGAGA 120 TGCACTTCTT AGGTCATTCC CTGGCTAAAT AAAATCTGCC TGGAAATCTG TAGAATTCCT 180 TGTATGATTT ATATATATAC ATACATGATT GTTAGTAAAA GCAAAGTATA TAGGGAATCA 240 TTTCCCCATC CTTCAAGAGT GGCCTTTCTG CAGTGTTTTC TACTTTGGCC AACAAGGATC 300 AAAACGGTTA ACTCCTTAGT GAGGAGGAGG AGAGTGGTAT GGGGAGGTAG TAGCTCAGTG 360 CTTCCTGTTC ACTGAGACAT CTCAAAGCCC TTAACACTCT AGTTTTTAAA TGTCCTACTG 420 GACATTTTGC CAGTTTGCAA AATTACATGT AAATGGACTA TAAGCAATTG TGTAAGCCAT 480 ATGTCATGCT GCAGGCTGCA AATTGTTCTT AAAATGGAGG ATTTGTAATT AAGAAAGCCA 540 ATGCAAGAAA TGAGTGAAGC TAACTAGAGT AAACTTATGA AAAGCTGTGA ATTTCATCAT 600 CATAGAACAT TGCTTTTCAG TCTGAACATT CTTCTAACAA ACCTTGGATC TGAGGCTTCT 660 TGTCCTTTGC GGCAGCCACA GTGGGTTTTT GTTGTTAGGG GAAAATAAAA AACCTTGCCC 720 GCAGCATCTG GTTAAGATTA GGGCAGTTTC CTGCCTAAGG AGGGAAGGGA GAGAAAAAGG 780 AAGAAGAAAT GCATAAGGAG AATGAGGAGA TATACAATGT CTCAGAAAAC AGGAAACATT 840 GTCCTATTTT CCCTTGTCCT CTTCTGACAA GATCTGGGAA AGTACCAGAA TTTAGGCACG 900 AAAGAGAAGA ACGCCTCGAA GAAATGATCA GGAAGCAAAA CTTAGACGGA AATCTCTCCT 960 TTGTGTATTC TGAACCCCAC TACCACCTTG CTATTTGTCT GTCTCCAAGC CTGCTAGGGA 1020 CCCTGGAGGA AACGCACTGA GCCCATTCTG ATTGTCCAGT TTCTATCCCC CATTTCTGGT 1080 TGTGTACGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGAGAGAGAG 1140 AGAGACAGAG AGAGAAACAG AGAGAGTGTG TGTTGCCTAA ATCTCCCGAG AGAGAGAGAG 1200 AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAAAA GAGAGAAATG GCTAAATCCC CCTAGATCAA 1260 AGTCCTTGGA ACCAGATGTA CCAGCATCCT ATCTAAACAC AGGCCCCTCC TGACTATCAT 1320 TGTTTTATCA CCCTTTTTCC GTCTACCTTT CTCTTCCTCA TAAAGCCTAG TTTTCCTCTG 1380 TTTCCCTGCC AAATGGAAGA GTTTTCCCTA ACTACATTCT TCTGCAG 1427
【０１６３】（２） 配列番号：５の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：５： GATGTGGGGG CTCAAGGTTC TGCTGCTACC TGTGGTGAGC TTTGCTCTGT ACCCTGAGGA 60 GATACTGGAC ACCCACTGGG AGCTATGGAA GAAGACCCAC AGGAAGCAAT ATAACAACAA 120 G 121
【０１６４】（２） 配列番号：６の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４６２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：６： GTGCCTGGGG TCCTGGAGGG GGCATGGCAG GAAGGCTGAG ACCTGAGCTC TCTCATCTTA 60 GCTTCCAGAC TCCCTTCTTC AATCCAAATG CTTTATTCCA AGCAAATCAG TCCCTCTTCC 120 CTAACTCATG TTAACATACG GTTTTCATTC CTATGCTTCA ATCATCCTCT TGTCAAACTT 180 GTATTCCTTC CCTTTGGTTT TATAAGTGTG TAACATTCCT CTTTTGGGAA GAGTCCCAAG 240 ATTAATGCTG TTAATCCATA AGCAATTTTT CTGTCTCTCC AGAGCTTGTG TGGTTGTTTA 300 CATATTATCT CTCTTCTTGC AGGCTCTTAA TTCCATGGTT AGTTCCCCAA CTAAACTGTA 360 AACTTTTATG ATTGTGAGTT TCCTTTATTC TCCTAAAACC CTTCACAATA TTACATATGA 420 ACTGTAGACA GTCTATACAA GTACTGACTA TGCTTTGTTT AG 462
【０１６５】（２） 配列番号：７の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：７： GTGGATGAAA TCTCTCGGCG TTTAATTTGG GAAAAAAACC TGAAGTATAT TTCCATCCAT 60 AACCTTGAGG CTTCTCTTGG TGTCCATACA TATGAACTGG CTATGAACCA CCTGGGGGAC 120 ATG 123
【０１６６】（２） 配列番号：８の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：８： GCAAGTATAG CTTCAGCTCC TGTCCCACCT GCACCATTTG CTTTAGTTCC CTGCTGATGC 60 CTGGCCTCTT TCTTCTTTGT CTTAG 85
【０１６７】（２） 配列番号：９の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：９： ACCAGTGAAG AGGTGGTTCA GAAGATGACT GGACTCAAAG TACCCCTGTC TCATTCCCGC 60 AGTAATGACA CCCTTTATAT CCCAGAATGG GAAGGTAGAG CCCCAGACTC TGTCGACTAT 120 CGAAAGAAAG GATATGTTAC TCCTGTCAAA AATCAG 156
【０１６８】（２） 配列番号：１０の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１０： GTACTCTCCT TTCTTCTGGG TGTGCATATG TAATCTGGCA TGACCTTTTC CTTTTTCTGC 60 TGCTTTGTTC TTGAGGTGAA AGGGCACCAG GAAAAGAGGG CAAGGAATTA AGGTACATCT 120 CCCCATTCCC ATTCTGTTAT TTAACCTCAT TTGTTTCTGT ACATTTGGGT TGTTTCTGGT 180 TTTTCTTTTT CTTTTCCCTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT GAGATAGAGT CTCACTCTGT 240 CGCCCAGGAT GGAGTGCAGT GGTGCAATCT TGGCTCACTG CAACCTACAC CTCCCGGGTT 300 CAAGCGATTC TCCTGCCTCA GCCTCCTGAG TAGCTGAGAT TACAGGCACG CGCCACTACG 360 CCTGGCTAAT TTTTCTATTT TTATAGAGAT GCGTTTTCAC CATGTTGGCC AGGCTGGTCT 420 TGAACTGACC TCAGGTGATC CACCTGCCTC AGCCTCCCAA AGTGCTGGGA TTAGAGTCAT 480 GAGCCATCGC GGCCTGGTTT TTCTTTATTA CAAATAGTGT TGCAATAAGC ACCCTTGTGC 540 ATATGTTTTT GTGCACATGT ACAAATATTT ATGCAAAATA AGTCCTAAAA TTGGAATTGT 600 TAGGTCACAA ATAATCCTTT CCCCCCCCCC AAATTTTTTT TTTTTTTTTG AGACAGCGTC 660 TCTGTCACCC AGGCTGGAGT CCAGTGGCGC AATCATGGCT CACTGCAGCC TCAACGTCTC 720 AGGCTCAAGT GATTCTCCAA CCTCAGCCTC CCTAGTAGCT GGGAATTAGA AGCACATGCC 780 ACCACACCCA GCTAATTTTA AAAAATTTTT TGTTAGAGAC AGGGTTTTGC CATGCTACCC 840 AAGCTGGTCT CAAATTCCTG GGCTCAAGCA ATCTGCCCGC TTCGGCCTCC CAAAGTGCTA 900 GGATTACAGA CATGAGCCAC CATGCCCAGC CCAAAAAAGT TTTTGCAATC TTACATTCTT 960 ACTAGCATGA GAATGTCAGT TTTTTCACAA CCCAAACAAC ACAGGATTGT ATCAGCAAGA 1020 TAAACAATTG ATTTAACGTT CATTTAACAA ACACTTTTTG ACCCCCAGAA CCTACCAGAT 1080 GCAGTGTTAG GCAGCAGAGA CTCAAGATGA CTAAGACACA ACCTGTGTCC TCAGGAAATC 1140 TCAATCTAAA AAAATAGAAC AGGAAAGAAA GAAAAATCTA CAATCTAGCT GCACAAACAA 1200 TAATAGCTAA TACTTTTTGA GATTTTATTG TTTGTCAGGA ACTTCTTAAC TCTTTACATG 1260 AGTTTAAATA TTTAATCCCT TATAACAATA TTTTATGCAT AGAGAAACTG AGACACAGGC 1320 AAATTTAGTA ACTTACCCGG GGTCACATAG CTACTGGGTG GCAAAGTCAG GGTTAGCTCC 1380 CAGGACAAAT GCCTCCACAG CTGGTACTGT GCTCTGCTTT ACTGTAGCTA ATAGTAAAAA 1440 TGGTAGCAAA AATCAATAGC AGTAGAACAG TGCAACAGAT ATTAAGCGGA AGAGGAAGAC 1500 TCACAACAAT GACAACATTT GTGCTGAAAT TTTTAAGAAC ACATGGAATT TCCTTCAGCC 1560 GGGTAGAGAG AAGATATAGA AATGTAAACA CCAAAGATTC ATAGTTTCTC TGTATCCCTT 1620 TCAG 1624
【０１６９】（２） 配列番号：１１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１１： GGTCAGTGTG GTTCCTGTTG GGCTTTTAGC TCTGTGGGTG CCCTGGAGGG CCAACTCAAG 60 AAGAAAACTG GCAAACTCTT AAATCTGAGT CCCCAGAACC TAGTGGATTG TGTGTCTGAG 120 AATGATGGCT GTGGAGGGGG CTACATGACC AATGCCTTCC AATATGTGCA GAAGAACCGG 180 GGTATTGACT CTGAAGATGC CTACCCATAT GTGGGACAG 219
【０１７０】（２） 配列番号：１２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４３２６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１２： GTGAGATTGC TCCACACAAT TATACAGCTC TGTTGGCTCC TCCTTCCCCA GCATGATGTT 60 TTGTACTGGA AACAATTCCA GAAATACTGT TTTCTGTTAT CCTATCCTGC TTTCTTGATG 120 GAATAATTTC CCACAGAAGG CCAAGAAGAT TTCCACAATC TGGGGGAATT TAGGGAGCTT 180 AAGCTACTAT AGCTCCTATT TGCATCTCTG CCATGGAGAG AAAACAGAGG CTAGGCTACC 240 TACCCCATAG ACTTCCGAGC TGGGTTCTAT AACCCTCTGC TCAATTCCTC ACTCCCACAA 300 CAAACCCACA AACCCACCAT GCTATTTTCA CAAATTGTGT GGCTTTATTT TATATGATCT 360 CAGTGTGAGT TTTCAGAACA TTTCAGCAAA TTATGTAAGT TTACATGCTA ACATCTATAA 420 AATGAGAGAA AAAACAAGTT GCTTCATATA AGAGATAAGG GATTAACTCA GTTCCTCCTG 480 CATGATCCTC TAGTCATAGG AAGGAAATCA TATCTGAAAG GGAGGCAACC TGAGGGGTTT 540 TTTATACACA TAGGGCTGGG TCTGATAGAC AATATAATGT AGGGCCTTCA CAACAGAAAC 600 CTCTGAAACA GGGACAGCAA GTTTGAGAAT AAAAATGATG GCTACTGTGT TCTAAGCCGT 660 GTCCTTAGTG CATTTTTTCT TTTTCTTTTT TTCATTTAAT CTCATAACAA CTCTGTTAGG 720 TAGACTTATC TTGAATGTAT AGGTGAGGAA ATGGACACTT AAGGAGATAA GACAGTATAA 780 TTCATACCAC TAGTATGTAA CAATGTAAGA TGTATCTACC AGGGATGTTT ATCTTCTGCA 840 AACATTCCTA GGTATATCTC CCATGCACAT GTGCAAGAAT TTCTTACTAG GATATAATGC 900 CTTGGAACTG AATTGTCTGG GTCTTAGGGT ATGTCTGTCT TCAACTTTAC TACACAATGT 960 CAAATTGTTT GCCAAAATAT TTGGAAAAAT TTATACCTGC AATGTGTAAG AAATCCCCTT 1020 CAATCACCTT TTTATCAGTA TGTTTATCTG GCCATTTGCA TTTCTTCTTC AGTGAATTAA 1080 CTGTTTTTAT CTCTTGCTCA TTTGTTTTTC TTTTTATTTT TTTGAAATAG GGTCTTACTC 1140 TGTTGCCCAA GGCTGGAGTG TGGTGATACA GTCATAGCTC ACTGCAGCCT CCACTTCCGG 1200 GCTCAAGCAA TCCTCTCGCC TCAGCCTCCC AAATAGCTAG GATATAGGTG CATGCCATCA 1260 TGCCCACCAA TTTCAAAAAA CCTTTGAAAT TTTTTTTTTG TAAAAGCTAG GCATGGTGGC 1320 TCATGCCTGT AATCCCAGCA CTTTGGGAGG CTGAGGTGGG AGGATCGCTT GAGCCCAGGA 1380 ATTGGAGGTC GGCCTGATAC AACATAGCAA GACCTCATCT CTACAGAAAA AATTTTTAAA 1440 AGTAGCCAGG TATGATGGCG TGCATAGTTC TAGCTACTCC GGAAGCTGGT TGGGAGGACA 1500 ACTTGAGCCT GGGAGTTCAA GGCTGCTGTG AACTGTGATC ATGTCACTGC TCTCTAGCCT 1560 GGGTGACAGA GTGAGACCCT GTCCCCAAAA ACAACAACCG TTTTTTTTGG TAGAGACATT 1620 GTCTCGCTAT GTTGCCAAGG CTAGTCTCAA ACTCCTGGGC TCAAGCAATC CTCCCACCTC 1680 CCAAAGTGCT GGGATTATAG ATGTAAGCCA CCATGCCTGG CCTACCCTTT TTTTTTTTTT 1740 TTGAAATGGA AGTTTTGCTT TTGTCACCTA GGCTTGAGTG CAGTGGCGCG ATCTTGGCTC 1800 ACTGCAACCT CCACCTCCTG GATTCAAGCA ATTCTCCTGC CTCAGCCTCC TGAATAGCTG 1860 GGATTATAGG CACCCGCAAC CACGCCCGGC TAGTTTTTGT ATTTTTAGTA CAGACAGGGT 1920 TTCACCATGT TGGCCAGCTG GTCTTGAACC CCTGACCTCA GGTGGTCCGC CCGCCTCGGC 1980 CTCCCAAAAT GCTGGGATTA AAAGTGTGAG CCACCATGCC CCACCCCTTA CTCATTTTTA 2040 ATTGGATTGT TTTTTCTCTT TCTTAGCGAT TCTTAAAAGT TTAAAGAGAA TATTTGGATA 2100 CAATACTATG TATTTAAAAG TTGAGGTCTG TCTTTCCATT CTTCTCACGA TGTCTTTCAA 2160 TCTAGAAAAG TTAATTTTAA TAGGCCTGGC GCGGTGGCTC ACGCTTGTAA TCCCAGCACT 2220 TTGGGAGGCT GAGATGGGTG GATCACAAGG TCAGGAGATG AAGACCATCC TGGCTAACAT 2280 GGGTGAAACC CTGTTTCTAC TAAAAATACA AAAAAATTAG CTGGGCGTGG TGGCAGGTGC 2340 CTGTAGTTCC AGCTACTCGG GAGGCTGAGG CAGGAGAATG GCGTGAACCC GGGAGGTGGA 2400 GCTTGCAGTG AGCCGAGATT GCACCACTGC ACTCCAGCCT GGGCAACTGA GCAAGACTGC 2460 GTTTCAAAAA AAAAAAAAGT TAATTTTAAT ATAGTAAAAT TAGTAAAAGG ATTAATTTTC 2520 CCTTTGCAAT TTTTGTAATG TGTTTTATTC GTTTATGAAT GGAGAAAGGT AAGAAAAAAT 2580 AAAATTTAAA AAAGAAGAGA TGTGGCCAGG TACGGTGGCT CACACCTATA ATCCCAGTAG 2640 TTTGGGAGGC TGAGGCAGGC AGATCACTTG AGGTCAGGAG TTTGAGACCA GCTGGGATAA 2700 CATGGTGAAA CCCCATCTCT ACTAAAAATA CAAAAATTAG CCAGGTGTGA TTGCGCACGC 2760 TTGTAATCCC AGCAGGCTGA GGCAGGAGAA TTGCTCGAAC TCAGGAGGCA GAGGTTGCAG 2820 TGAGCCAAGA TCATGCCATT GCACTCCAGC CTGGGTAACA GAGACTCTGT TTCAAAAAAA 2880 TAAAAAGATA AAAAAGGAAG AGATCTGATA GGGCGGCCAG ATAAACATTT TAAAGGGGAT 2940 GGTATTATAA GTTTGTTCCC AGCATAATGC CAGGTTATTC TGACTTTAAA GTATCATCAC 3000 ATAATATCTT TTTGAGTCAA TTTCCAAGAT ATTCTGTTTC ACTTGTAATT CTGTGTAATT 3060 TTTGGCACCA GGAGGCATCA GGGATTTGGA GCACATGGCA GAAACAAAGG CATCTTGAAA 3120 AATATCAAGG CAGTAGACCA CTGTAATCTT AAAATGGCAT ATCAAATGCT GCTATTGCTG 3180 TTAATATTTA GATAATGTTA GATAATGTAT TTTTTTAGAG GGTATCTCAC TATCTTGCAC 3240 AGGCTGGAGT AGAGTGGCTA TTCACAGCAT GATCACAGTA CACTAAAGGC TCAAACTCCT 3300 GGGCACAAAC AATCCTCCTG CCTCAGCCTG CTGAGTAGTA GATAATAAGT TCTTGTGGAT 3360 GCAACCTTAG GGTTCTGAAG GGGTAGTCTG TAGGAAAATG AATTGCTGAA AAGAATACAC 3420 CACCTTAACA TGGGCTATTA TTCGATTCCA TAATTGTGGC TTGCCAATGA AACATTGCTA 3480 ACTACCTGTA AAATATAGTG TTGGAAGTCA TAGGCTAAAT TGCTAAGTTC TTTAATCTAT 3540 TTTAGTGTCT TGTTATGTAC TTTTATATTT TGTCTTTGAT GAGAGCACAA GGATCACACC 3600 AGTTCCCCTG ATATAGGTGC AGAGGGCCCA GGTCTTCCCT CTAGCTAAGC CTTGGCCTTG 3660 GCCTCCTACC CACACAGCAG CTGGTGCCTT CCTGCCCCCT GAGGCTAATA CATACTATGT 3720 GGCCAGAAGA TGGTTTATGC TTTTTAAAAA AATCTTATTT CAGAAATCTT TCCCTACTGT 3780 TTTCCTCCCA CATTTATGTC TTAAAACACC TGTAGGGGAT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 3840 TGAGATGGAG TCTCGCTCTC GCCCAGGCTG GAGTGCAATG GCGCGATCTT GGCTCACTGC 3900 AAGGTCTGCC TCCCAGGTTC ACGCCATTCT CCTGCCTCAG CCTCCCCAGT AGCTGGGACT 3960 ACAGGCGCCC GCTACCACGC CTGGCTAATT TTTTTGCATT TTTAGTAGAG ACAGGGTTTC 4020 ACTGTTAGCC AGGATGGTCT CGATCTCCTG ACCTCGTGAT CCACCCTCCT CAGCCTCCAA 4080 AGTGCTGGGA TTAACAGGCA TGGAGCCCCA CCGCACTGGC CTGTATTTGT GAGGAAGAAC 4140 AGACCCTCTT TAGAAGCCCT AGACTGCTGC CTCTGTTAGT TCACTGGCAT CACTCAAAAT 4200 ATTGGTTGAG TTTCTTACTC ACTGAGTTGG TTTTTATGTG TGGTGGAAGG CGGGAATCCT 4260 CTTTTCATAT TCGTTCTCAT TGCCTATTGC TTTGTCCTAG TCCTATTACA ATCTTGTTTC 4320 TTCCAG 4326
【０１７１】（２） 配列番号：１３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１３： GAAGAGAGTT GTATGTACAA CCCAACAGGC AAGGCAGCTA AATGCAGAGG GTACAGAGAG 60 ATCCCCGAGG GGAATGAGAA AGCCCTGAAG AGGGCAGTGG CCCGAGTGGG ACCTGTCTCT 120 GTGGCCATTG ATGCAAGCCT GACCTCCTTC CAGTTTTACA GCAAAG 166
【０１７２】（２） 配列番号：１４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１４： GTAAGAAGCT GCTGATCCTA TACAGCACTG TCTTTTATGA TACAAACTTG ATGGTTTCTC 60 GAAGGACCTT GGGTATTTTC AGTACTTAGT TTTTGTATTC ACATGGAGGT GGCCAGAGAG 120 AAATTAACAA CTGCTGCAGT ATGGAGCAGC ATCTCTGTGG TAAACCCTCC TGACACGGAT 180 GGAATTCTTC AAACAGTCTC CTAGACTGGG AGATCCCACA GGGTGACCCT TGGATTGCAT 240 AGAGCCTCAC GCTGGTAGTT TGTATTCTAG 270
【０１７３】（２） 配列番号：１５の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１５： GTGTGTATTA TGATGAAAGC TGCAATAGCG ATAATCTGAA CCATGCGGTT TTGGCAGTGG 60 GATATGGAAT CCAGAAGGGA AACAAGCACT GGATAATTAA AAACAG 106
【０１７４】（２） 配列番号：１６の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２７０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１６： GTAATGATGG GAACACTACT TTTGTTATTC AGTCACCCTT TTAACACTCA ACCTCACCTC 60 CAGCTTCCCG ATATTCCTTT CTCTGTCCCA AATCAAGAAA AAATTATCTC AGAGTTCTCA 120 CTTCTATCTT CTCAGTCAGA GGCTCTTAAT TCTCAGTCTG ACACTTAATG GCCAGTGTGT 180 TAGTCCATTT TGCATTGCCA CAAAAGAATA CCCGAGACTG GGTAGTTTAT AAAGAAACGA 240 GGTTTGTTTG GCTATACAAA GCGTGGCACT AGTATCTGCT CAGCCTCTGA TGAGGCCTCA 300 GAGCTTTTAC TCATGGCAGA AGGCAAAAGA GGGAGCAGGC ATGTCACATA GTGAGAGAGG 360 GAGCAAGAGA GAGAGGGAGG TGCCGACTCT TTAAAGAACC AGCTCTTGCA TGAACTAATA 420 GAGTGAGAAC TCACTCATCA CCAAGGCGAT GGCACCAAGC CATTCCATGA GGAATCCACT 480 CTCATAACCC AAACACCTCC CACTATGCCC CACCTCCCAC ATTGGGGATC ACATTTCAGC 540 ATGAGACTGG GAGGGGACAC ACATCCAAAC CATATCCGCC AGACAATAGT GCTCAATTAT 600 GTGCTGGGCA GATGCTCCCT GTGTGCAAGG TGCTTAGTGA CATACATAAA CCAACGAGCA 660 GATGACACCT TCAGTGAGCT CAGAGCCCAA TAAGACAGAC CTAACTAACC ATGAGATAAA 720 GCAGTACAAA GAACCAGCAG GAGCTTTGGA ATTACGTATT TTTACTTTCT TTTGTCTCTA 780 ATGTGATCAG TTTCTTAGAT GGTTTCCATT AGCAATCTGT CTTTAACAGT AGGGGAGCAG 840 CGTTAAAGGT TTAATATTCC TTTTGAACAG TTTTTTTCCT TCAAAATACA CTTAAGATAC 900 ACGTATATAA GAACTTGCCA AAGATTGTGA AGAGAAACAT TTTTTAGAAA TAAGATATAA 960 ACAAAAAAAG TTAGTGTTAC TTTCCTATGT TGGGGAACAA AGAAAACTCC AGGGTACCTT 1020 GCTTCCCATT TCTCTTTAGC ACCTTGTGAC TTTTGGGGAG GGGCAGATTG ATAACAATTA 1080 TAGTTTTCCT TTCCTGGCTG ATCACCATTA ACCTGGCAGC AGCACTGGCT AAATCTCCTG 1140 TCCTTAGTGC CCTCCAAGGA GCAGGAGCCC TAGACTCTGG GTCGCTGACA GACTCACGCA 1200 GTGGTGTTGT TCAAACCTGA AGCAACTTTT TATATCACAG TTCCAACTCA AGGTGAACCT 1260 GAGCATCTTC CCAAGTCTCC CACAGCTTCT GTCCTGTGTT GTCCCTTCTC TTGACTCCCA 1320 GGTCCAAGCA CTTACCCTGT TCTTTCATGA TCAGGTACCA TGTGTGGAGA TAGCTTCCAA 1380 GAGAGCTGGG AGGAAGAAAG GACACACCCG GGCAGGATCA GGAACACTGG GGGCCCCTGG 1440 AGAAGGGGAG AGTGGGGGAG GGTACAGGTT TTAAATAAAA TGTGTTGGTA ATTAGAGAAT 1500 TGCTGGTTGG GGAAAGAGGT CTGAAAACAA TTCAGGAAGA TAAACAAGAC AATCTCTCCT 1560 CTCTCCTCTT TCTCACGTCG TCTCTCTTGT CTTCTAGTCT CGCTACTCAT TTCCTTAGTA 1620 ATCTCATCCA CTCTCATAGT TTCATCCATC TCTCCTATGG GGTTTACCCC CAAATCAAGA 1680 TCACCAGCTT CAGCCTCCTT CTTATGCTCT AAACTCACAT TTTCAAGATT AATATTCCCC 1740 AAATACAGCT CTGATCATAT CACTCTCCCA CTCAAAATCC CTCACTGGCT CCTCACGATG 1800 ATGGGTCACA GAGTAAAGGT GAAGCTTTTT AACCTTGCAG TAAAGGTAAT TCAACCTGAT 1860 CTCAATCTGC CTTTCCAGAC ATCTCTCCCA CTACACCCTG TTAGGCACAC TGCTTTTCAG 1920 CTACATGATC CTAACAGTGC CCCACACTTT CCTGCCTCTG TTGTTCATTT CACACCCTTC 1980 CACTGGCATC CCCTTCCCAC AGGTCGAAAT TCTACTTAGC CTTTTGGCTC AGCTCAAATG 2040 CCACCTCTTA CATCAAGCCT CTAAGATTCT CTTGATCAGA AGGAATCTTT CCCTCCTTTG 2100 ATACCTACAG TATTATGCCT TCTCCCTATT TCTTGACTTT AAACTCTTTA AAGTTAAAAA 2160 ACATCATATT CATTTTTGTG TACCATCAGT ACCTCGCACA ATACTCAGTA AATATTTTAA 2220 TGAATAAATA AACTGAGAGT ACTAAGTATT TTTCTTGATT GGTCTTACAG 2270
【０１７５】（２） 配列番号：１７の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１７ CTGGGGAGAA AACTGGGGAA ACAAAGGATA TATCCTCATG GCTCGAAATA AGAACAACGC 60 CTGTGGCATT GCCAACCTGG CCAGCTTCCC CAAGATG 97
【０１７６】（２） 配列番号：１８の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５９８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１８： TGACTCCAGC CAGCCCAAAT CCATCCTGCT CTTCCATTTC CTTCCACGAT GGTGCAGTGT 60 AACGATGCAC TTTGGAAGGG AGTTGGTGTG CTATTTTTGA AGCAGATGTG GTGATACTGA 120 GATTGTCTGT TCAGTTTCCC CATTTGTTTG TGCTTCAAAT GATCCTTCCT ACTTTGCTTC 180 TCTCCACCCA TGACCTTTTT CCACTGTGGC CATCAGGACT TTCCCCTGAC AGCTGTGTAC 240 TCTTAGGCTA AGAGATGTGA CTACAGCCTG CCCCTGACTG TGTTGTCCCA GGGCTGATGC 300 TGTACAGGTA CAGGCTGGAG ATTTTCACAT AGGTTAGATT CTCATTCACG GGACTAGTTA 360 GCTTTAAGCA CCCTAGAGGA CTAGGGTAAT CTGACTTCTC ACTTCCTAAG TTCCCTTCTA 420 TATCCTCAAG GTAGAAATGT CTATGTTTTC TACTCCAATT CATAAATCTA TTCATAAGTC 480 TTTGGTACAA GTTTACATGA TAAAAAGAAA TGTGATTTGT CTTCCCTTCT TTGCACTTTT 540 GAAATAAAGT ATTTATCTCC TGTCTACAGT TTAATAAATA GCATCTAGTA CACATTCA 598
【０１７７】（２） 配列番号：１９の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４５９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：１９： TTTTGTGTTG GATACTGTGT TAGGTGCTGG AGGAAAAAAG ATGAATAGAA CATCTTCTAT 60 GTACTTCATG CGCTCACAGT CTGGTTGTAG AGACTGTCAC ATAAACATTT CATCCCAATT 120 CATTTATTTG TTCATTCCTT CAGCCAATAT ATATTGAGTT CTTACTCTGT GCCAAGAACT 180 GTACTACATT TCTGGGATTA AGTGGATATA AGGAGATCTC AGTGTTTAAT CTGCCTGAGG 240 GGAGACTAAA TTAAGTGACA TGGAAACTTG GGTCTTGAAA AACATTTTAA GGTTATTTTT 300 TCTTTTCTCT CTCTCTCGCT CTGTCTTTCT CTCTCTTTCG TCAGGGTCTC CCTCTGTTGC 360 CCAGGCTGGA GTCAGTGGCA CTCATAGCTC ACTGCAGCCT TGATCTCCTG GGCTCAAGAG 420 TTCTTCCCAC CTCAGTCTCC TAAGTAGCTT GGACTACGG 459
【０１７８】（２） 配列番号：２０の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３２９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：蛋白質 （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型：Ｎ−末端 （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２０： Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr His Trp Glu Leu Trp Lys Lys Thr 20 25 30 His Arg Lys Gln Tyr Asn Asn Lys Val Asp Glu Ile Ser Arg Arg Leu 35 40 45 Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Tyr Ile Ser Ile His Asn Leu Glu Ala 50 55 60 Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ala Met Asn His Leu Gly Asp 65 70 75 80 Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met Thr Gly Leu Lys Val Pro 85 90 95 Leu Ser His Ser Arg Ser Asn Asp Thr Leu Tyr Ile Pro Glu Trp Glu 100 105 110 Gly Arg Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr 115 120 125 Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser 130 135 140 Val Gly Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Leu Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Asp Gly 165 170 175 Cys Gly Gly Gly Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Lys Asn 180 185 190 Arg Gly Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Glu Glu 195 200 205 Ser Cys Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr 210 215 220 Arg Glu Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala 225 230 235 240 Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala Ser Leu Thr Ser Phe 245 250 255 Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Ser Cys Asn Ser Asp 260 265 270 Asn Leu Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Ile Gln Lys Gly 275 280 285 Asn Lys His Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp Gly Glu Asn Trp Gly Asn 290 295 300 Lys Gly Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys Asn Asn Ala Cys Gly Ile 305 310 315 320 Ala Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met 325
【０１７９】（２） 配列番号：２１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２１： CCGAAACGAA GCCAGACAAC 20
【０１８０】（２） 配列番号：２２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２２： GCTCACCACA GGTAGCAGCA G 21
【０１８１】（２） 配列番号：２３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２３： CTGCTGCTAC CTGTGGTGAG C 21
【０１８２】（２） 配列番号：２４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２４： CCCAAATTAA ACGCCGAGAG 20
【０１８３】（２） 配列番号：２５の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２５： CTCTCGGCGT TTAATTTGGG 20
【０１８４】（２） 配列番号：２６の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２６： GGTACTTTGA GTCCAGTCAT C 21
【０１８５】（２） 配列番号：２７の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２７： CCAGACTCTG TCGACTATCG 20
【０１８６】（２） 配列番号：２８の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２８： CACATATGGG TAGGCATCTT C 21
【０１８７】（２） 配列番号：２９の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：２９： GAAGATGCCT ACCCATATGT G 21
【０１８８】（２） 配列番号：３０の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：３０： GTTACATTAT CGCTATTGCA C 21
【０１８９】（２） 配列番号：３１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：３１： GCAAAGGTGT GTATTATGAT G 21
【０１９０】（２） 配列番号：３２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）断片の型： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号：３２： GCCGTTGTTC TTATTTCGAG C 21
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図２】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図３】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図４】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図５】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図６】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図７】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図８】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図９】 ヒトカテプシンＫのゲノムヌクレオチド配列
［配列番号：１］を示す。エキソンを大文字で示し、下
線を引く。イントロンを小文字で示す。
【図１０】 ヒトカテプシンＫのヌクレオチド、エキソ
ン−イントロン境界および推定アミノ酸配列を示す。
【図１１】 ヒトカテプシンＫのヌクレオチド、エキソ
ン−イントロン境界および推定アミノ酸配列を示す。
【図１２】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図１３】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図１４】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図１５】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図１６】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図１７】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図１８】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図１９】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図２０】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図２１】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図２２】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図２３】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図２４】 カテプシンＫ［配列番号：２−１９］の構
造的特徴を示す。
【図２５】 イントロン−エキソン接合を示す
【図２６】 カテプシンＫ、ヒトカテプシンＳ、Ｌ、
Ｈ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧならびにウサギＯＣ２ポリペプチド
のアミノ酸配列の間の類似領域を示す。
【図２７】 カテプシンＫ、ヒトカテプシンＳ、Ｌ、
Ｈ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＧならびにウサギＯＣ２ポリペプチド
のアミノ酸配列の間の類似領域を示す。
【図２８】 ヒトカテプシンＫの推定アミノ酸配列を示
す。
【図２９】 ゲノムＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプラ
イマーを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/64 Ａ６１Ｋ 37/54 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジュディス・エイ・ブレイク アメリカ合衆国20878メリーランド州ロー レル、マラド・ドライブ9933番 (72)発明者 クリスティーヌ・エム・デブーク アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ ェイン、ピュフ・ロード667番 (72)発明者 フレッド・エイチ・ドレイク アメリカ合衆国19343ペンシルベニア州グ レンムーア、ウォルナット・バンク・ロー ド24番 (72)発明者 リサ・エム・フィッツジェラルド アメリカ合衆国20876メリーランド州ジャ ーマンタウン、オブザベイション・コート 13番 アパートメント・ナンバー201 (72)発明者 クレア・エム・フレイザー アメリカ合衆国20854メリーランド州ノー ス・ポトマック、グレン・ミル・ロード 11915番 (72)発明者 マキシン・ゴーウェン アメリカ合衆国19481ペンシルベニア州バ レー・フォージュ、リバティー・レイン10 番 ピー・オー・ボックス463 (72)発明者 グレッグ・エイ・ヘイスティングス アメリカ合衆国20874メリーランド州ジャ ーマンタウン、アンセル・テラス13504番 (72)発明者 イーウェン・エフ・カークネス アメリカ合衆国20832メリーランド州オー ルニ、リトル・ビスタ・テラス2519番 (72)発明者 ノーマン・エイチ・リー アメリカ合衆国21163メリーランド州ウッ ドストック、ウェザーバーン・ロード 10344番 (72)発明者 ジュリー・ロッド アメリカ合衆国19050ペンシルベニア州ラ ンスダウン、ウエスト・ボルティモア・ア ベニュー80番

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号：１の配列と少なくとも８０％同
    一である配列； 配列番号：１の配列と少なくとも８５％同一である配
    列； 配列番号：１の配列と少なくとも９０％同一である配
    列； 配列番号：１の配列と少なくとも９５％同一である配
    列；および 配列番号：１の配列と少なくとも９７％同一である配
    列； からなる群より選択される領域を有してなる単離ポリヌ
    クレオチド。
  2. 【請求項２】 領域がゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであ
    る請求項１記載の単離ポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 カテプシンＫエンハンサーまたはプロモ
    ーターを有してなる単離ポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号：１の配列を有する請求項３記
    載の単離ポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 カテプシンＫポリアデニル化領域を有し
    てなる単離ポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 配列番号：１の配列を有する請求項５記
    載の単離ポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 カテプシンＫイントロンを有してなる単
    離ポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 配列番号：１の配列を有する請求項７記
    載の単離ポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 イントロン１、２、３、４、５、６およ
    び７からなる群より選択される配列を有してなる単離ポ
    リヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 イントロン１、２、３、４、５、６お
    よび７からなる群より選択される配列を有してなるポリ
    ヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 カテプシンＫエキソンを有してなる単
    離ポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号：１の配列を有する請求項１
    １記載の単離ポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 エキソン１、２、３、４、５、６、７
    および８からなる群より選択される配列を有してなる単
    離ポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 エキソン１、２、３、４、５、６、７
    および８からなる群より選択される配列を有してなるポ
    リヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 １−３、１−４、１−５、１−６、１
    −７、１−８、２−４、２−５、２−６、２−７、２−
    ８、３−４、３−５、３−６、３−７、３−８、４−
    ５、４−６、４−７、４−８、５−７、５−８および６
    −８からなる群より選択されるエキソン−エキソン対を
    有してなる単離ポリヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 １−３、１−４、１−５、１−６、１
    −７、１−８、２−４、２−５、２−６、２−７、２−
    ８、３−４、３−５、３−６、３−７、３−８、４−
    ５、４−６、４−７、４−８、５−７、５−８および６
    −８からなる群より選択されるエキソン−エキソン対を
    有してなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ポ
    リペプチド。
  17. 【請求項１７】ＡＴＣＣ寄託番号９８０３５のヒトｃＤ
    ＮＡと少なくとも８０％同一である配列；ＡＴＣＣ寄託
    番号９８０３５のヒトｃＤＮＡと少なくとも８５％同一
    である配列；ＡＴＣＣ寄託番号９８０３５のヒトｃＤＮ
    Ａと少なくとも９０％同一である配列；ＡＴＣＣ寄託番
    号９８０３５のヒトｃＤＮＡと少なくとも９５％同一で
    ある配列；およびＡＴＣＣ寄託番号９８０３５のヒトｃ
    ＤＮＡと少なくとも９７％同一である配列；からなる群
    より選択される領域を有してなる単離ポリヌクレオチ
    ド。
  18. 【請求項１８】（ａ）配列番号：２０に示すアミノ酸配
    列を有してなるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チドと少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオ
    チド；（ｂ）配列番号：２０に示すアミノ酸１からアミ
    ノ酸３２９を有してなるポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリ
    ヌクレオチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレ
    オチドにハイブリダイズし、そのポリヌクレオチドと少
    なくとも７０％相補的であるポリヌクレオチド；および
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
    のポリヌクレオチド断片が配列番号：１の少なくとも３
    ０の連続した塩基を有してなる、（ａ）、（ｂ）または
    （ｃ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド断片；か
    らなる群より選択される構成因子を有してなる単離ポリ
    ヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 領域が、ＡＴＣＣ寄託番号９８０３５
    のヒトｃＤＮＡ挿入物におけるカテプシンＫをコードす
    る領域である、請求項１記載の単離ポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 宿主細胞にて機能的に連結した請求項
    １に記載のポリヌクレオチドの発現に有効なシス作用制
    御要素を有してなる発現ベクター。
  21. 【請求項２１】 制御要素が宿主細胞におけるポリヌク
    レオチドの発現を誘発するのに効果的である請求項２０
    記載発現ベクター。
  22. 【請求項２２】 宿主細胞にて機能的に連結した請求項
    １８に記載のポリヌクレオチドの発現に有効なシス作用
    制御要素を有してなる発現ベクター。
  23. 【請求項２３】 その中に請求項２２に記載の発現ベク
    ターを発現するように組み込まれている宿主細胞。
  24. 【請求項２４】 その中に請求項１８に記載の発現ベク
    ターを発現するように組み込まれている宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 宿主細胞にて請求項１に記載のポリヌ
    クレオチドを発現する工程を有してなるポリペプチドの
    製造方法。
  26. 【請求項２６】 宿主細胞にて請求項１８に記載のポリ
    ヌクレオチドを発現する工程を有してなるポリペプチド
    の製造方法。
  27. 【請求項２７】 配列番号：２０のアミノ酸配列の連続
    領域と配列が同一である１５またはそれ以上のアミノ酸
    のポリペプチド。
  28. 【請求項２８】 ＡＴＣＣ寄託番号９８０３５のヒトｃ
    ＤＮＡにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の連
    続領域と配列が同一である１５またはそれ以上のアミノ
    酸のポリペプチド。
  29. 【請求項２９】 配列番号：２０のアミノ酸配列の連続
    領域と配列が同一である５０またはそれ以上のアミノ酸
    のポリペプチド。
  30. 【請求項３０】 配列番号：１のポリペプチドと配列が
    少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドの連続領
    域と配列が同一である２５またはそれ以上のヌクレオチ
    ドのポリヌクレオチド。
  31. 【請求項３１】 ５０またはそれ以上のヌクレオチドの
    請求項２３記載のポリヌクレオチド。
  32. 【請求項３２】 ７５またはそれ以上のヌクレオチドの
    請求項３１記載のポリヌクレオチド。
  33. 【請求項３３】 請求項２０に記載のベクターで遺伝子
    操作した宿主細胞。
  34. 【請求項３４】 該ＤＮＡによりコードされるポリペプ
    チドを請求項３３記載の宿主細胞から発現することから
    なるポリペプチドの産生方法。
  35. 【請求項３５】 請求項２０に記載のベクターで細胞を
    遺伝子操作することからなるポリペプチドの発現能を有
    する細胞の産生方法。
  36. 【請求項３６】 試料中のカテプシンＫをコードするポ
    リヌクレオチドの測定法であって、 カテプシンＫをコードするポリヌクレオチドに特異的な
    プローブが該ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイ
    ズするのに有効な条件下で、該プローブを試料とハイブ
    リッド形成させ、 該試料中のポリヌクレオチドに対する該プローブのハイ
    ブリダイゼーションを測定する工程からなり、 ここに、該プローブは配列番号：１のポリヌクレオチド
    配列と少なくとも９０％同一の２０またはそれ以上の塩
    基対の領域の配列を有することからなる方法。
  37. 【請求項３７】 試料中のカテプシンＫをコードするポ
    リヌクレオチドの測定方法であって、 カテプシンＫをコードするポリヌクレオチドに特異的な
    プローブが該ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイ
    ズするのに有効な条件下で、該プローブを試料とハイブ
    リッド形成させ、 該試料中のポリヌクレオチドに対する該プローブのハイ
    ブリダイゼーションを測定する工程からなり、 ここに、該プローブはＡＴＣＣ寄託番号９８０３５のヒ
    トｃＤＮＡ挿入物のポリヌクレオチド配列と少なくとも
    ９０％同一の２０またはそれ以上の塩基対の領域の配列
    を有することからなる方法。
  38. 【請求項３８】 試料中、配列番号：１の１から１３５
    の残基のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一の
    領域を有してなるポリペプチドを検出する方法であっ
    て、 特異的結合に効果的な条件下で該ポリペプチドに特異的
    に結合する試薬を試料と一緒にインキュベーションし；
    および該試料中のポリペプチドへの該試薬の結合を測定
    することからなる検定方法。
  39. 【請求項３９】 カテプシンＫのポリヌクレオチドの異
    常発現により特徴づけられる疾患の診断方法であって、 特異的ハイブリダイゼーションに効果的な条件下で、配
    列番号：１の１から３２９のアミノ酸をコードするＲＮ
    ＡまたはＤＮＡに配列が少なくとも９０％同一である領
    域を有してなるポリヌクレオチドに対して特異的なプロ
    ーブをハイブリッド形成し；該試料中の該ポリヌクレオ
    チドへの該プローブのハイブリダイゼーションを測定す
    ることからなる方法。
  40. 【請求項４０】 カテプシンＫのポリペプチドの異常発
    現により特徴づけられる疾患の診断方法であって、 特異的結合に効果的な条件下で配列番号：１の１から３
    ２９の残基のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同
    一である領域を有してなるポリペプチドに特異的に結合
    する試薬を試料と一緒にインキュベーションし；および
    該試料中の該ポリペプチドへの該試薬の結合を測定する
    ことからなる方法。
  41. 【請求項４１】 請求項１３に記載のポリペプチドの活
    性化を阻害する化合物。
  42. 【請求項４２】 請求項１３に記載の治療上有効量のポ
    リペプチドを患者に投与することからなるカテプシンＫ
    を必要とする患者の治療方法。
  43. 【請求項４３】 治療上有効量のポリペプチドを、該ポ
    リペプチドをコードするＤＮＡを患者に付与し、in viv
    oにて該ポリペプチドを発現することにより投与する請
    求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 カテプシンＫポリペプチドを阻害する
    必要のある患者の治療方法であって、治療上有効量の請
    求項４１記載の化合物を該患者に投与することからなる
    方法。
  45. 【請求項４５】 請求項１３に記載のポリペプチドの発
    現不足に関与する疾患またはその疾患に対する感受性の
    診断方法であって、 該ポリペプチドをコードする核酸配列における変異を測
    定することからなる方法。
  46. 【請求項４６】 宿主由来の試料中の請求項１３に記載
    のポリペプチドの存在について分析することからなる診
    断方法。
  47. 【請求項４７】 請求項１３に記載のポリペプチドに結
    合し、該ポリペプチドの活性化を阻害する化合物の同定
    方法であって、 該ポリペプチドに対する受容体（化合物の受容体への結
    合に応答して、検出可能な信号を付与しうる第二の成分
    と結合する）をその表面で発現する細胞を、分析的に検
    出可能なカテプシンＫのポリペプチドおよび化合物と、
    受容体への結合を可能とする条件下で接触させ、 カテプシンＫと受容体との相互作用から生じる信号の不
    在を検出することにより、化合物が受容体に結合し、そ
    の受容体を阻害するかどうかを測定することからなる同
    定方法。
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