JPH099986A - Trehalose and its production and use - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To readily produce and accumulate trehalose which is a nonreduclng glucide useful for foods, cosmetics, medicines, etc., by making a mlcroorganism having the ability to produce a maltose-trehalose converting enzyme coexist in a nutrient culture medium during the culture. SOLUTION: Maltose in an amount of about 5-10wt./vol.% is contained in a nutrient culture medium during the culture of a mlcroorganism having the ability to produce a maltose-trehalose converting enzyme, e.g. Plmelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) or Thermus aquaticus ATCC33923.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、トレハロースとそ
の製造方法並びに用途に関し、詳細には、マルトースを
含有せしめた栄養培地に、マルトース・トレハロース変
換酵素産生能を有する微生物を培養し、得られるトレハ
ロース、又は、これを含む糖質、及び該糖質の製造方法
並びにその用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to trehalose, a method for producing the same, and uses thereof. More specifically, a trehalose obtained by culturing a microorganism capable of producing maltose / trehalose converting enzyme in a nutrient medium containing maltose is obtained. Or a saccharide containing the same, a method for producing the saccharide, and its use.

【０００２】[0002]

【従来の技術】グルコースを構成糖とする非還元性糖質
として、古くからトレハロース（α、α−トレハロー
ス）が知られており、その存在は、『アドバンシズ・イ
ン・カーボハイドレイト・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）』、第１８巻、第２０１乃至２２５頁（１９６
３年）アカデミック・プレス社（米国）及び『アプライ
ド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジー
（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第５６巻、第３２
１３乃至３２１５頁（１９９０年）などにも記載されて
いるように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など広
範囲に及んでいる。トレハロースのような非還元性糖質
は、アミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とアミ
ノカルボニル反応を起こさず、含アミノ酸物質を損なわ
ないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、加
工できることが期待され、その工業的製造方法の確立が
望まれている。2. Description of the Related Art Trehalose (α, α-trehalose) has long been known as a non-reducing sugar having glucose as a constituent sugar, and its existence is described in "Advances in Carbohydrate Chemistry (Advanc)."
es in Carbohydrate Chemis
try), Vol. 18, pp. 201-225 (196).
3 years) Academic Press (USA) and “Applied and Environmental Microbiology”
l Microbiology), Vol. 56, No. 32
As described in pages 13 to 3215 (1990) and the like, microorganisms, mushrooms, insects, and the like are spread over a wide range in a small amount. Non-reducing saccharides such as trehalose do not cause aminocarbonyl reaction with substances having amino groups such as amino acids and proteins, and do not damage amino acid-containing substances, so that they can be used and processed without concern about browning and deterioration. Therefore, establishment of an industrial production method is desired.

【０００３】トレハロースの製造方法としては、例え
ば、特開昭５０−１５４４８５公報で報告されている微
生物菌体を用いる方法や、特開昭５８−２１６６９５公
報で提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレ
ハロース・ホスホリラーゼとの組合わせでマルトースを
変換する方法などが知られている。しかしながら、微生
物菌体を用いる方法は、該菌体を出発原料とし、これに
含まれるトレハロースの含量が、通常、固形物当たり１
５ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限
り、ｗ／ｗ％を単に％と略称する）未満と低く、その
上、これを抽出、精製する工程が煩雑で、工業的製造方
法としては不適である。また、マルトース・ホスホリラ
ーゼ及びトレハロース・ホスホリラーゼを用いる方法
は、いずれもグルコース−１リン酸を経由しており、そ
の基質濃度を高めることが困難であり、また、両酵素の
反応系が可逆反応で目的物の生成率が低く、更には、両
酵素の反応系を安定に維持して反応をスムーズに進行さ
せることが困難であって、未だ、工業的製造方法として
実現するに至っていない。As a method for producing trehalose, for example, a method using a microbial cell reported in JP-A-50-154485 or maltose phosphorylase and trehalose-proposed in JP-A-58-216695 is proposed. A method of converting maltose in combination with phosphorylase is known. However, in the method using microbial cells, the microbial cells are used as a starting material, and the content of trehalose contained in the microbial cells is usually 1 per solid matter.
It is as low as less than 5 w / w% (hereinafter, w / w% is simply abbreviated as "%" unless otherwise specified in the present specification), and in addition, the steps of extracting and purifying the same are complicated and industrial production. It is not suitable as a method. In addition, the methods using maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase both involve glucose-1 phosphate, it is difficult to increase the substrate concentration, and the reaction system of both enzymes is a reversible reaction. The production rate of the product is low, and it is difficult to maintain the reaction system of both enzymes stably to allow the reaction to proceed smoothly, and it has not yet been realized as an industrial production method.

【０００４】これに関係して、『月刊フードケミカ
ル』、８月号、第６７乃至７２頁（１９９２年）、「澱
粉利用開発の現状と課題」の「オリゴ糖」の項におい
て、「トレハロースについては著しく広い応用範囲が考
えられるが、本糖の澱粉糖質からの直接糖転移、加水分
解反応を用いた酵素的生産は、現在のところ学術的には
不可能であるといわれている。」と記載されているよう
に、澱粉を原料とし、酵素反応によってトレハロースを
製造することは、従来、学術的にも不可能であると考え
られてきた。[0004] In connection with this, in "Monthly Food Chemicals", August issue, pp. 67-72 (1992), in the "Oligosaccharides" section of "Current Status and Issues of Starch Utilization Development," Although it is considered to have a remarkably wide range of applications, enzymatic production of this saccharide directly from starch carbohydrates and hydrolysis using a hydrolysis reaction is said to be scientifically impossible at present. " As described, it has heretofore been considered scientifically impossible to produce trehalose by using an enzyme reaction from starch.

【０００５】一方、澱粉を原料として製造される澱粉部
分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各
種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元
基を有し還元性を示すことが知られている。このような
澱粉部分分解物を、本明細書では、還元性澱粉部分分解
物と称する。一般に、還元性澱粉部分分解物は、固形物
当たりの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレ
ント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ、Ｄ
Ｅ）として表している。この値の大きいものは、通常、
分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強
く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミ
ノカルボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生し
て、品質を劣化し易い性質のあることが知られている。On the other hand, starch partially decomposed products produced from starch as a raw material, such as starch liquefaction, various dextrins, various maltooligosaccharides, etc., usually have a reducing group at the end of the molecule and thus show reducibility. Are known. Such a partially degraded starch is referred to as a partially degradable starch in this specification. Generally, the reducing starch partially decomposed product has a degree of reducing power per solid substance that is determined by Dextrose Equivalent (D).
E). The one with the larger value is usually
It has a small molecule, low viscosity, and strong sweetness, but it is highly reactive, and easily undergoes an aminocarbonyl reaction with substances with amino groups such as amino acids and proteins, causing browning, producing a bad odor, and easily degrading quality. Is known to exist.

【０００６】このような還元性澱粉部分分解物の種々の
特性は、ＤＥの大小に依存しており、還元性澱粉部分分
解物とＤＥとの関係は極めて重要である。従来、当業界
では、この関係を断ち切ることは不可能とさえ信じられ
てきた。Various characteristics of such a partially decomposed product of reducing starch depend on the size of DE, and the relationship between the partially decomposed product of reducing starch and DE is extremely important. Traditionally, it has been believed in the industry that it is impossible to break this relationship.

【０００７】還元性澱粉部分分解物とＤＥとの関係を断
ち切る唯一の方法は、還元性澱粉部分分解物を高圧水素
添加法などによって、その還元基を糖アルコールに変換
して非還元性糖質にする方法である。しかし、この方法
は、高圧オートクレーブを必要とし、多量の水素やエネ
ルギーを消費するのみならず、防災上からも高度な安全
施設や管理を必要としている。その上、得られる還元性
澱粉部分分解物の糖アルコールは、原料の還元性澱粉部
分分解物がグルコースのみからなるのに対し、グルコー
スとソルビトールとから構成される点で異なり、それを
摂取することによって、一過性ではあるが、難消化、緩
下の症状を起こす懸念もある。従って、還元性澱粉部分
分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、そ
の還元力を低減若しくは消滅させる方法の確立が望まれ
る。The only method of breaking the relationship between the partially decomposed product of reducing starch and DE is to convert the reducing group of the partially decomposed starch into a sugar alcohol by a high-pressure hydrogenation method or the like to form a non-reducing sugar. Is the way to. However, this method requires a high-pressure autoclave, consumes a large amount of hydrogen and energy, and also requires advanced safety facilities and management from the viewpoint of disaster prevention. In addition, the sugar alcohol of the resulting partially decomposed reducing starch is different in that the raw degradable starch partially decomposed product is composed of glucose and sorbitol, whereas the raw material is composed of glucose and sorbitol. There are concerns about temporary but indigestible and laxative symptoms. Therefore, it is desired to establish a method for reducing or eliminating the reducing power without changing glucose, which is a constituent sugar of the partially decomposed reductive starch.

【０００８】これを解決するために、本発明者等は、先
に、特願平６−１４４０９２号明細書で、マルトースを
トレハロースに変換する新規マルトース・トレハロース
変換酵素（本酵素を、本明細書を通じて、マルトース・
トレハロース変換酵素と称する。）を開示し、本マルト
ース・トレハロース変換酵素を利用して、マルトースか
らトレハロースとこれを含む糖質の製造方法を確立し
た。[0008] In order to solve this, the present inventors previously described in Japanese Patent Application No. 6-144092 a novel maltose-trehalose converting enzyme for converting maltose to trehalose (this enzyme is referred to as Through maltose
It is called trehalose converting enzyme. ) Was disclosed, and a method for producing trehalose and a sugar containing the same from maltose was established using the present maltose-trehalose converting enzyme.

【０００９】しかしながら、微生物を培養して該酵素を
産生せしめる培養時間に加えて、酵素回収の時間、マル
トースからのトレハロースへの酵素反応時間を必要と
し、工業的に実施する上でかなりの長時間を要する欠点
のあることが判明した。マルトースからトレハロースを
生産するに際し、該酵素の生産をも含めて、より簡便
に、容易に実施しうるトレハロースの製造方法の確立が
望まれる。However, in addition to the culture time for culturing the microorganism to produce the enzyme, a time for enzyme recovery and an enzyme reaction time for converting trehalose from maltose are required, which is a considerably long time for industrial implementation. It turned out that there is a drawback that requires. In producing trehalose from maltose, it is desired to establish a method for producing trehalose that can be carried out more easily and easily, including production of the enzyme.

【００１０】[0010]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、マルトース
からのトレハロースを、簡便に、短時間に製造しうる新
規方法を確立し、併せて、その用途を提供するものであ
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention establishes a novel method for producing trehalose from maltose easily and in a short time, and at the same time, provides its use.

【００１１】[0011]

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
を解決するために、マルトース・トレハロース変換酵素
産生能を有する微生物の培養状況と該酵素の産生状況に
ついて鋭意研究を続けてきた。その結果、該微生物は、
マルトース・トレハロース変換酵素をかなり早期から産
生していることを見出すとともに、培養中の栄養培地
に、マルトースを共存せしめることにより、容易にトレ
ハロースを生成、蓄積することを見出し、本発明を完成
した。[Means for Solving the Problems] In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have continued to earnestly study the culture condition of a microorganism capable of producing maltose / trehalose converting enzyme and the production condition of the enzyme. As a result, the microorganism
The present inventors have found that maltose / trehalose converting enzyme is produced from a fairly early stage, and have found that trehalose can be easily produced and accumulated by allowing maltose to coexist in a nutrient medium in culture, and completed the present invention.

【００１２】すなわち、本発明は、マルトースを含有せ
しめた栄養培地に、マルトース・トレハロース変換酵素
産生能を有する微生物を培養し、得られるトレハロー
ス、又は、これを含む糖質、及び該糖質の製造方法、並
びに、該糖質を含有せしめた組成物を確立するものであ
る。本発明において、マルトースとしては、とりわけ、
澱粉を液化したものにβ−アミラーゼ又はβ−アミラー
ゼとともに澱粉枝切酵素を、作用させて得られるものが
好適であり、また、微生物としては、とりわけ、マルト
ース・トレハロース変換酵素産生能を有している微生物
の利用が、トレハロース生産にとって極めて有利であ
る。このようにして得られるトレハロースやこれを含む
糖質は、安定性が高く、取扱いが容易で、広範な用途に
利用でき、例えば、飲食物、化粧品、医薬品など各種組
成物に有利に利用できる。That is, the present invention cultivates a microorganism capable of producing maltose / trehalose converting enzyme in a nutrient medium containing maltose, and obtains trehalose or a sugar containing the same, and the production of the sugar. A method and a composition containing the sugar are established. In the present invention, as maltose, among others,
Those obtained by reacting starch liquefaction with β-amylase or a starch debranching enzyme together with β-amylase are preferable, and as microorganisms, among others, maltose / trehalose converting enzyme producing ability is preferable. Utilization of existing microorganisms is extremely advantageous for trehalose production. The trehalose and the saccharide containing the trehalose thus obtained have high stability, are easy to handle, and can be used in a wide variety of applications. For example, they can be advantageously used in various compositions such as food and drink, cosmetics, and pharmaceuticals.

【００１３】本発明で用いるマルトース・トレハロース
変換酵素産生能を有する微生物としては、マルトースを
トレハロースに変換する酵素を産生する微生物であれば
よく、例えば、特願平６−１４４０９２号明細書に開示
されるピメロバクター属、シュードモナス属及びサーマ
ス属に属する微生物が好適である。The maltose-trehalose converting enzyme-producing microorganism used in the present invention may be any microorganism that produces an enzyme that converts maltose into trehalose, and is disclosed in, for example, Japanese Patent Application No. 6-144092. Microorganisms belonging to the genus Pimelobacter, the genus Pseudomonas and the genus Thermus are preferred.

【００１４】微生物の培養に用いる培地は、微生物が生
育でき、マルトース・トレハロース変換酵素を産生しう
る栄養培地であって、トレハロース生成のための基質と
なるマルトースを含有するものが採用される。必要に応
じて、微生物が資化しうる他の炭素源、例えば、グルコ
ース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニ
トール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、更には、クエ
ン酸、コハク酸などの有機酸、又は、その塩を併用する
ことも随意である。培地に含有せしめるマルトースの濃
度は、２０ｗ／ｖ％以下、望ましくは１５ｗ／ｖ％以
下、更に望ましくは５乃至１０ｗ／ｖ％付近が好適であ
る。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩
などの無機窒素化合物や、例えば、尿素、コーン・ステ
ィープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉
エキスなどの有機窒素含有物が適宜用いられる。また、
無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウ
ム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン
塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩な
どが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミノ酸、
ビタミンなども適宜用いられる。The medium used for culturing the microorganism is a nutrient medium in which the microorganism can grow and which can produce maltose / trehalose converting enzyme, and which contains maltose as a substrate for trehalose production. If necessary, other carbon sources that can be assimilated by microorganisms, for example, glucose, fructose, lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, sugars such as molasses, further, citric acid, organic acids such as succinic acid, or, It is optional to use the salt together. The concentration of maltose contained in the medium is preferably 20 w / v% or less, preferably 15 w / v% or less, more preferably 5 to 10 w / v%. As the nitrogen source, for example, inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates, and organic nitrogen-containing substances such as urea, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract and meat extract are appropriately used. Also,
As the inorganic component, for example, calcium salt, magnesium salt, potassium salt, sodium salt, phosphate salt, manganese salt, zinc salt, iron salt, copper salt, molybdenum salt, cobalt salt and the like are appropriately used. Furthermore, if necessary, amino acids,
Vitamins and the like are also used as appropriate.

【００１５】培養条件は、微生物が生育し、マルトース
・トレハロース変換酵素を産生すればよく、通常、温度
４乃至８０℃、望ましくは２０乃至７５℃、ｐＨ５乃至
９、望ましくは６乃至８．５から選ばれる条件で好気的
に行われる。培養時間は微生物が増殖し得る以上の時間
であればよく、望ましくは１０乃至１００時間である。
また、培養液の溶存酸素濃度に特に制限はないが、通常
は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通
気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加した
り、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段
が採用される。また、培養方式は、回分培養、連続培養
又は半連続培養のいずれでもよい。The culturing conditions are such that the microorganism grows and produces maltose / trehalose converting enzyme, and the temperature is usually 4 to 80 ° C., preferably 20 to 75 ° C., pH 5 to 9 and preferably 6 to 8.5. It is performed aerobically under the selected conditions. The culturing time may be any time that allows the microorganism to grow, and is preferably 10 to 100 hours.
The dissolved oxygen concentration of the culture solution is not particularly limited, but usually 0.5 to 20 ppm is preferable. For that purpose, means such as adjusting the air flow rate, stirring, adding oxygen to the air flow, and increasing the pressure in the fermenter are adopted. The culture method may be batch culture, continuous culture or semi-continuous culture.

【００１６】このようにして、マルトースを含有せしめ
た栄養培地に、マルトース・トレハロース変換酵素産生
能を有する微生物を培養して、培養物中にトレハロース
を生成、蓄積せしめることができる。また、必要なら
ば、別に調製したマルトース・トレハロース変換酵素
を、培養中の栄養培地に補足して、トレハロースの生成
速度を高めることも、また、アニオン界面活性剤、非イ
オン界面活性剤などの界面活性剤及び／又は卵白リゾチ
ームなどの溶菌酵素を培養中の栄養培地に加えてトレハ
ロースの生成速度を高めることも有利に実施できる。こ
のようにして、生成、蓄積されたトレハロースは、培養
物中の不溶物を分離し、得られる液体部分に含まれる。[0016] In this way, a microorganism having the ability to produce maltose / trehalose converting enzyme can be cultured in a nutrient medium containing maltose to produce and accumulate trehalose in the culture. If necessary, a separately prepared maltose / trehalose converting enzyme may be supplemented to the nutrient medium in the culture to increase the production rate of trehalose. It may also be advantageous to add an activator and / or a lytic enzyme such as egg white lysozyme to the nutrient medium in culture to increase the rate of trehalose production. The trehalose thus produced and accumulated is contained in the liquid portion obtained by separating the insoluble matter in the culture.

【００１７】トレハロースを含有する培養物は、まず、
公知の固液分離法、例えば、濾過又は遠心分離などによ
り、除菌液とし、これを常法に従って、濃縮し、活性炭
で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩して精製
し、濃縮し、シラップ状製品とする。更に乾燥して粉末
状製品にすることも随意である。必要ならば、培養物を
そのまま平膜又は中空糸膜などの膜濾過にかけ、菌体な
どの不溶物とともに溶性の蛋白質、核酸などの高分子物
を除去するか、又は、予め、遠心分離などにより不溶物
を除去し、次いで、膜濾過により溶性高分子物を除去し
た後、常法に従って、濃縮、脱色、脱塩して精製し、ト
レハロース、又は、これを含む糖質製品を有利に製造す
ることができる。The culture containing trehalose was prepared as follows.
A known solid-liquid separation method, for example, filtration or centrifugation to obtain a sterilized solution, which is concentrated and decolorized with activated carbon, and then desalted with H-type and OH-type ion exchange resins to be purified, Concentrate to a syrupy product. Further drying to a powdered product is optional. If necessary, the culture is directly subjected to membrane filtration such as flat membrane or hollow fiber membrane to remove soluble proteins such as bacterial cells and high molecular substances such as nucleic acids, or by centrifugation in advance. After removing insoluble matter and then soluble polymer by membrane filtration, concentration, decolorization, desalting and purification are carried out by a conventional method, and trehalose or a sugar product containing the same is advantageously produced. be able to.

【００１８】次に、本発明のトレハロース生成に寄与し
ているマルトース・トレハロース変換酵素について説明
する。酵素活性は、培養物の菌体及び除菌液いずれにも
認められ、菌体及び除菌液を粗酵素液として採取するこ
とも、また、培養物全体を粗酵素液として用いることも
できる。培養物から菌体を除去するには公知の固液分離
法が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠
心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなど
を用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾
過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液を
そのまま酵素液として用いることができるが、一般的に
は、濃縮して用いられる。濃縮方法としては、例えば、
硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中
空糸膜など膜濃縮法などが採用される。Next, the maltose / trehalose converting enzyme contributing to the production of trehalose of the present invention will be described. The enzyme activity is found in both the bacterial cells and the sterilized solution of the culture, and the bacterial cells and the sterilized solution can be collected as a crude enzyme solution, or the entire culture can be used as a crude enzyme solution. A known solid-liquid separation method is adopted to remove the bacterial cells from the culture. For example, a method of centrifuging the culture itself as it is, a method of separating by filtration using a precoat filter, a method of separating by membrane filtration of a flat membrane, a hollow fiber membrane, etc. are appropriately adopted. The sterilized solution can be used as it is as an enzyme solution, but it is generally concentrated before use. As the concentration method, for example,
Ammonium sulfate salting-out method, acetone and alcohol precipitation method, membrane concentration method such as flat membrane and hollow fiber membrane are adopted.

【００１９】更に、除菌液及びその濃縮物を公知の方法
により固定化することもできる。例えば、イオン交換体
への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高
分子物質を用いた包括法などが採用される。また、培養
物から分離した菌体もそのまま粗酵素として用いること
ができるが、これを固定化して用いてもよい。一例とし
て、これをアルギン酸ナトリウムと混合して、塩化カル
シウム溶液中に滴下して粒状にゲル化させて固定化す
る。この粒状化物をさらにポリエチレンイミン、グルタ
ールアルデヒドで処理して固定化してもよい。菌体から
酵素を抽出して、その抽出液を粗酵素液として用いるこ
ともできる。例えば、超音波による破砕法、ガラスビー
ズ及びアルミナによる機械的破砕法、フレンチプレスに
よる破砕法などで菌体から酵素を抽出し、遠心分離又は
膜濾過などで清澄な粗酵素液を得ることができる。Further, the sterilized liquid and its concentrate can be immobilized by a known method. For example, a binding method to an ion exchanger, a covalent binding / adsorption method with a resin or a membrane, an encapsulation method using a polymer substance, etc. are adopted. Further, the bacterial cells separated from the culture can be directly used as the crude enzyme, but they may be immobilized and used. As an example, this is mixed with sodium alginate and added dropwise into a calcium chloride solution to gel and immobilize into a granular form. This granule may be further treated with polyethyleneimine or glutaraldehyde to be immobilized. It is also possible to extract the enzyme from the cells and use the extract as a crude enzyme solution. For example, the enzyme can be extracted from the bacterial cells by a disruption method by ultrasonic waves, a mechanical disruption method by glass beads and alumina, a disruption method by a French press, etc., and a clear crude enzyme solution can be obtained by centrifugation or membrane filtration. .

【００２０】本酵素液はそのまま用いることができる
が、公知の方法によって更に精製して利用することがで
きる。一例として、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮
した粗酵素標品を透析後、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ
−トヨパール』などを用いた陰イオン交換カラムクロマ
トグラフィー、続いて、同社製『ブチルトヨパール』な
どを用いた疎水カラムクロマトグラフィー、同社製『ト
ヨパール ＨＷ−５５』などを用いたゲル濾過クロマト
グラフィーを用いて精製することにより、電気泳動的に
単一な酵素を得ることができる。The enzyme solution of the present invention can be used as it is, but can be further purified by a known method before use. As an example, a crude enzyme preparation obtained by salting out a treated product of the culture solution with ammonium sulfate and concentrating it is dialyzed and then manufactured by Tosoh Corporation “DEAE”.
-Anion exchange column chromatography using "Toyopearl", etc., followed by hydrophobic column chromatography using "Butyl Toyopearl" manufactured by the same company, and gel filtration chromatography using "Toyopearl HW-55" manufactured by the same company. By purification using it, an electrophoretically single enzyme can be obtained.

【００２１】このようにして得られるマルトース・トレ
ハロース変換酵素は、一般的には、例えば、下記の理化
学的性質を有する。 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至１２
０，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃
至５．１。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ⁺⁺、Ｈｇ⁺⁺又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 起源 微生物により産生された酵素である。The maltose / trehalose converting enzyme thus obtained generally has, for example, the following physicochemical properties. (1) Action Maltose is converted into trehalose and trehalose is converted into maltose. (2) Molecular weight By SDS-gel electrophoresis, about 57,000 to 12
10,000 daltons. (3) pI of about 3.8 to 5.1 by an isoelectric focusing ampholine-containing electrophoresis method. (4) Activity inhibition 1 mM Cu ⁺⁺ , Hg ^++, or 50 mM Tris-HCl buffer is used for inhibition. (5) Origin It is an enzyme produced by a microorganism.

【００２２】由来微生物の違いによる具体例を示せば次
の通りである。Specific examples of the difference in the originating microorganism are as follows.

【ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８由来のマルト
ース・トレハロース変換酵素】 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至６７，
０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約４．１乃至
５．１。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ⁺⁺、Ｈｇ⁺⁺又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、２０℃付近。 （６） 至適ｐＨ ２５℃、６０分間反応で、ｐＨ約７．０乃至８．０。 （７） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、３０℃付近まで安定。 （８） ｐＨ安定性 ２０℃、６０分間保持で、ｐＨ約６．０乃至９．０。[Pimellobacterium species R48-derived maltose / trehalose converting enzyme] (1) Action Maltose is converted to trehalose and trehalose is converted to maltose. About 1 mol of trehalose or maltose is produced from 1 mol of maltose or trehalose, respectively. (2) Molecular weight By SDS-gel electrophoresis, about 57,000 to 67,
000 Daltons. (3) Isoelectric focusing by ampholine-containing electrophoresis, pI of about 4.1 to 5.1. (4) Activity inhibition 1 mM Cu ⁺⁺ , Hg ^++, or 50 mM Tris-HCl buffer is used for inhibition. (5) Optimum temperature: pH 7.0, reaction for 60 minutes, at around 20 ° C. (6) Optimum pH 25 ° C., reaction for 60 minutes, pH about 7.0 to 8.0. (7) Temperature stability It is stable up to around 30 ° C by holding at pH 7.0 for 60 minutes. (8) pH stability A pH of about 6.0 to 9.0 when kept at 20 ° C. for 60 minutes.

【００２３】[0023]

【シュードモナス・プチダ Ｈ２６２由来のマルトース
・トレハロース変換酵素】 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約１１０，０００乃至１２
０，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約４．１乃至
５．１。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ⁺⁺、Ｈｇ⁺⁺又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、３７℃付近。 （６） 至適ｐＨ ３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約７．３乃至８．３。 （７） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、４０℃付近まで安定。 （８） ｐＨ安定性 ３５℃、６０分間保持で、ｐＨ約６．０乃至９．５。[Pseudomonas putida H262-derived maltose / trehalose converting enzyme] (1) Action Maltose is converted to trehalose and trehalose is converted to maltose. About 1 mol of trehalose or maltose is produced from 1 mol of maltose or trehalose, respectively. (2) Molecular weight By SDS-gel electrophoresis, about 110,000 to 12
10,000 daltons. (3) Isoelectric focusing by ampholine-containing electrophoresis, pI of about 4.1 to 5.1. (4) Activity inhibition 1 mM Cu ⁺⁺ , Hg ^++, or 50 mM Tris-HCl buffer is used for inhibition. (5) Optimum temperature: around 37 ° C. after reacting at pH 7.0 for 60 minutes. (6) Optimum pH 35 ° C., reaction for 60 minutes, pH about 7.3 to 8.3. (7) Temperature stability It is stable up to around 40 ° C by keeping at pH 7.0 for 60 minutes. (8) pH stability A pH of about 6.0 to 9.5 when kept at 35 ° C. for 60 minutes.

【００２４】[0024]

【サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３由来
のマルトース・トレハロース変換酵素】 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約１００，０００乃至１１
０，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約３．８乃至
４．８。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ⁺⁺、Ｈｇ⁺⁺又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、６５℃付近。 （６） 至適ｐＨ ６０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至６．７。 （７） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、８０℃付近まで安定。 （８） ｐＨ安定性 ６０℃、６０分間保持で、ｐＨ約５．５乃至９．５。[Thermus aquaticus ATCC 33923-derived maltose / trehalose converting enzyme] (1) Action Maltose is converted to trehalose and trehalose is converted to maltose. About 1 mol of trehalose or maltose is produced from 1 mol of maltose or trehalose, respectively. (2) Molecular weight By SDS-gel electrophoresis, about 100,000 to 11
10,000 daltons. (3) Isoelectric focusing apholine-containing electrophoresis, pI of about 3.8 to 4.8. (4) Activity inhibition 1 mM Cu ⁺⁺ , Hg ^++, or 50 mM Tris-HCl buffer is used for inhibition. (5) Optimum temperature pH of 7.0, reaction for 60 minutes, around 65 ° C. (6) Optimum pH 60 ° C., reaction for 60 minutes, pH about 6.0 to 6.7. (7) Temperature stability It is stable up to around 80 ° C by keeping at pH 7.0 for 60 minutes. (8) pH stability A pH of about 5.5 to 9.5 when kept at 60 ° C. for 60 minutes.

【００２５】マルトース・トレハロース変換酵素の活性
は、次のようにして測定する。基質としてマルトース２
０ｗ／ｖ％（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）１
ｍｌに酵素液１ｍｌを加え、反応温度を２５℃、３５℃
あるいは６０℃とし、６０分間反応させた後、１００℃
で１０分間加熱して反応を停止させる。この反応液を正
確に５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５で１１倍に希釈
し、その希釈液０．４ｍｌにトレハラーゼ含有溶液（１
単位／ｍｌ）を０．１ｍｌ添加したものを４５℃、１２
０分間インキュベートした後、この反応液中のグルコー
ス量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。対照とし
て、予め１００℃で１０分間加熱することにより失活さ
せた酵素液及びトレハラーゼを用いて同様に測定する。
上記の測定方法を用いて、増加するグルコース量からマ
ルトース・トレハロース変換酵素により生成するトレハ
ロース量を求め、その活性１単位は、１分間に１μｍｏ
ｌｅのトレハロースを生成する酵素量と定義する。The activity of maltose / trehalose converting enzyme is measured as follows. Maltose 2 as a substrate
0 w / v% (10 mM phosphate buffer, pH 7.0) 1
1 ml of enzyme solution was added to ml, reaction temperature was 25 ℃, 35 ℃
Alternatively, the temperature is set to 60 ° C, and after reacting for 60 minutes, 100 ° C
The reaction is stopped by heating for 10 minutes. This reaction solution was diluted exactly 11-fold with 50 mM phosphate buffer pH 7.5, and 0.4 ml of the diluted solution was added with a trehalase-containing solution (1
Unit / ml) added at 0.1 ml at 45 ° C, 12
After incubating for 0 minutes, the amount of glucose in this reaction solution is quantified by the glucose oxidase method. As a control, the same measurement is performed using an enzyme solution and trehalase that have been inactivated by heating at 100 ° C. for 10 minutes in advance.
Using the above measurement method, the amount of trehalose produced by maltose / trehalose converting enzyme was determined from the increasing amount of glucose, and the activity 1 unit was 1 μmo per minute.
It is defined as the amount of enzyme that produces le trehalose.

【００２６】なお、反応温度は、マルトース・トレハロ
ース変換酵素が、ピメロバクター属に属する微生物由来
の場合に２５℃とし、シュードモナス属に属する微生物
由来の場合に３５℃とし、サーマス属に属する微生物由
来の場合に６０℃とした。The reaction temperature is 25 ° C. when the maltose / trehalose converting enzyme is derived from a microorganism belonging to the genus Pimelobacter, 35 ° C. when derived from a microorganism belonging to the genus Pseudomonas, and is derived from a microorganism belonging to the genus Thermus. To 60 ° C.

【００２７】次に、本発明で使用される澱粉は、とうも
ろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉であって
も、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱
粉であってもよい。澱粉を液化するには、通常、澱粉を
水に懸濁した澱粉乳、望ましくは濃度１０％以上、更に
望ましくは約２０乃至５０％とし、これを加熱して機械
的に液化しても、酸又は酵素で液化してもよい。液化の
程度は、比較的低いものが適しており、望ましくはＤＥ
１５未満、更に望ましくはＤＥ１０未満のものが好適で
ある。酸で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚
酸などで液化し、その後、炭酸カルシウム、酸化カルシ
ウム、炭酸ナトリウムなどで必要ｐＨに中和して利用す
ればよい。酵素で液化する場合には、α−アミラーゼ、
とりわけ、耐熱性の液化型α−アミラーゼの使用が適し
ている。Next, the starch used in the present invention may be ground starch such as corn starch, rice starch and wheat starch, or underground starch such as potato starch, sweet potato starch and tapioca starch. To liquefy starch, starch milk is usually suspended in water, and the concentration of starch milk is preferably 10% or more, more preferably about 20 to 50%. Alternatively, it may be liquefied with an enzyme. A relatively low degree of liquefaction is suitable, and DE is preferably
It is preferably less than 15, more preferably less than DE10. In the case of liquefying with an acid, for example, it may be liquefied with hydrochloric acid, phosphoric acid, oxalic acid or the like, and then neutralized to a required pH with calcium carbonate, calcium oxide, sodium carbonate or the like before use. When liquefying with an enzyme, α-amylase,
In particular, the use of thermostable liquefied α-amylase is suitable.

【００２８】本発明で澱粉液化溶液からマルトースを産
生するために用いるβ−アミラーゼは、公知方法によ
り、甘藷、大豆、小麦麩などの植物、バチルス属に属す
る微生物の培養物などから調製してもよく、また、市販
の酵素剤を利用することも随意である。また、本発明で
用いる澱粉枝切酵素は、澱粉を比較的低ＤＥに液化した
もの、望ましくは、ＤＥ１５未満の液化溶液に作用し、
澱粉の枝分かれ結合を加水分解する酵素であって、公知
のプルラナーゼ、イソアミラーゼなどが有利に利用で
き、また、市販の酵素剤を利用することも有利に実施で
きる。The β-amylase used in the present invention to produce maltose from a liquefied starch solution may be prepared by a known method from plants such as sweet potato, soybean, wheat flour and the like, cultures of microorganisms belonging to the genus Bacillus and the like. Of course, the use of commercially available enzyme preparations is also optional. In addition, the starch debranching enzyme used in the present invention acts on a liquefied starch having a relatively low DE, and desirably acts on a liquefied solution having a DE of less than 15.
As the enzyme that hydrolyzes the branched bond of starch, known pullulanase, isoamylase and the like can be advantageously used, and a commercially available enzyme agent can also be advantageously used.

【００２９】酵素の使用量は、作用条件、反応時間によ
って適宜選べばよいが、通常、基質である澱粉液化溶液
に対して、固形物グラム当たり、β−アミラーゼの場
合、約１乃至１００単位から選ばれ、澱粉枝切酵素の場
合、約１乃至２，０００単位から選ばれる。The amount of the enzyme to be used may be appropriately selected depending on the working conditions and the reaction time, but is usually about 1 to 100 units in the case of β-amylase per gram of solid matter with respect to the starch liquefied solution as the substrate. In the case of starch debranching enzyme, it is selected from about 1 to 2,000 units.

【００３０】このようにして得られるマルトースは、本
発明の培養方法によるトレハロース、又は、これを含む
糖質製造用の糖源として有利に利用できる。また、市販
のマルトースを利用することも有利に実施できる。マル
トースを栄養培地に含有せしめる時期は、トレハロース
が生成できる時期であればよく、培養初期から含有せし
めておくことも、培養途中から含有せしめることも随意
である。また、連続又は半連続培養する場合には、例え
ば、トレハロースを生成せしめた培養培地の一部を抜き
出し、これと同容量のマルトースを含有せしめた栄養培
地を追加して培養すればよい。また、培養を、澱粉液化
溶液にβ−アミラーゼ又はβ−アミラーゼとともに澱粉
枝切酵素を共存せしめた栄養培地で行うことも随意であ
る。The maltose thus obtained can be advantageously used as trehalose by the culturing method of the present invention or a sugar source for sugar production containing the same. Further, it is also possible to advantageously use commercially available maltose. The maltose may be added to the nutrient medium at a time when trehalose can be produced, and it may be added from the beginning of the culture or from the middle of the culture. Further, in the case of continuous or semi-continuous culture, for example, a part of the culture medium in which trehalose is produced may be extracted, and the nutrient medium in which the same volume of maltose is contained may be additionally cultured. Further, it is optional to carry out the culture in a nutrient medium in which β-amylase or β-amylase together with starch debranching enzyme coexist in a liquefied starch solution.

【００３１】このようにして得られるトレハロースを含
む培養物は、常法により、濾過、遠心分離などして菌体
などの不溶物を除去した後、濃縮、活性炭で脱色、Ｈ
型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮し、
シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にす
ることも随意である。必要ならば、更に、精製、例え
ば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラ
ムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラ
フィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、ア
ルコール及びアセトンなど有機溶媒による分別、適度な
分離性能を有する膜による分離、更には、酵母での発酵
処理、アルカリ処理などによる残存している還元性糖質
の分解除去などの方法を１種又は２種以上組合わせて精
製することにより、最高純度のトレハロース製品を得る
ことも容易である。The trehalose-containing culture thus obtained is filtered, centrifuged and the like to remove insolubles such as bacterial cells, and then concentrated, decolorized with activated carbon,
-Type, OH-type ion-exchange resin for desalination, purification, concentration,
Syrup-shaped product. Further, it is optionally dried to give a powder product. If necessary, further purification, for example, fractionation by column chromatography such as ion exchange column chromatography, activated carbon column chromatography, silica gel column chromatography, fractionation by organic solvents such as alcohol and acetone, a membrane having appropriate separation performance. The trehalose product of the highest purity can be obtained by purifying by one or a combination of two or more methods such as separation by yeast, further fermentation treatment with yeast, decomposition and removal of remaining reducing sugars by alkali treatment, etc. Is also easy to obtain.

【００３２】とりわけ、工業的大量生産方法としては、
イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であ
り、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５
８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチ
オン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより
夾雑糖類を除去し、目的のトレハロース含量を向上させ
た低還元性糖質を有利に製造することができる。この
際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれ
の方式を採用することも随意である。In particular, as an industrial mass production method,
Ion exchange column chromatography is suitable for use, and examples thereof include JP-A-58-23799 and JP-A-SHO-5.
Contaminant saccharides can be removed by column chromatography using a strongly acidic cation exchange resin disclosed in Japanese Unexamined Patent Publication No. 8-72598, and a target low-reducing saccharide having an improved trehalose content can be advantageously produced. At this time, any one of a fixed bed system, a moving bed system, and a simulated moving bed system may be adopted.

【００３３】このようにして得られた本発明のトレハロ
ースを含む糖質を、必要により、グルコアミラーゼ又は
α−グルコシダーゼで分解し、甘味性、還元力などを調
整したり、粘性を低下させたりすることも、また、水素
添加して残存する還元性糖質を糖アルコールにして還元
力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施すこと
も随意である。The trehalose-containing saccharide of the present invention thus obtained is, if necessary, decomposed with glucoamylase or α-glucosidase to adjust sweetness, reducing power and the like, or to reduce viscosity. In addition, it is optional to perform further processing such as converting the reducing sugar remaining after hydrogenation into a sugar alcohol to eliminate the reducing power.

【００３４】とりわけ、本発明のトレハロースを含む糖
質に対して、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼ
を作用させてトレハロースとグルコースとの混合溶液と
し、これを、前述の精製方法、例えば、イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーなどにより、グルコースを除去す
れば、トレハロース高含有画分を採取することができ
る。これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ること
も、更に濃縮して過飽和にし、晶出させてトレハロース
含水結晶又は無水結晶トレハロースを得ることも有利に
実施できる。In particular, glucoamylase or α-glucosidase is allowed to act on the trehalose-containing carbohydrate of the present invention to give a mixed solution of trehalose and glucose, which is then purified by the above-mentioned purification method, for example, ion exchange column chromatography. If glucose is removed by chromatography or the like, a trehalose-rich fraction can be collected. It can be advantageously carried out by purifying and concentrating it to obtain a syrupy product, and further concentrating it to supersaturate it and crystallizing it to obtain trehalose hydrous crystals or anhydrous crystalline trehalose.

【００３５】トレハロース含水結晶を製造するには、例
えば、純度約６０％以上、濃度約６５乃至９０％のトレ
ハロース高含有液を助晶缶にとり、必要に応じて、０．
１乃至２０％の種晶共存下で、温度９５℃以下、望まし
くは１０乃至９０℃の範囲で、撹拌しつつ徐冷し、トレ
ハロース含水結晶を含有するマスキットを製造する。ま
た、減圧濃縮しながら晶析させる連続晶析法を採用する
ことも有利に実施できる。マスキットからトレハロース
含水結晶又はこれを含有する含蜜結晶を製造する方法
は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方
法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。In order to produce trehalose hydrous crystals, for example, a trehalose-rich liquid having a purity of about 60% or more and a concentration of about 65 to 90% is placed in an auxiliary crystal can and, if necessary, added to the auxiliary crystal can.
In the coexistence of 1 to 20% of seed crystals, the mixture is gradually cooled with stirring at a temperature of 95 ° C or lower, preferably 10 to 90 ° C to produce a mass kit containing trehalose hydrous crystals. Further, it is also advantageous to employ a continuous crystallization method in which crystallization is performed while concentrating under reduced pressure. As a method for producing the trehalose hydrous crystal or the syrup-containing crystal containing the trehalose from the musket, a known method such as a mashing method, a block pulverizing method, a fluidized granulation method, and a spray drying method may be adopted.

【００３６】分蜜方法の場合には、通常、マスキットを
バスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶
と蜜（母液）とを分離し、必要により、該結晶に少量の
冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、
より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適
である。噴霧乾燥方法の場合には、通常、濃度７０乃至
８５％、晶出率２０乃至６０％程度のマスキットを高圧
ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しない温
度、例えば、６０乃至１００℃の熱風で乾燥し、次いで
３０乃至６０℃の温風で約１乃至２０時間熟成すれば非
吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。ま
た、ブロック粉砕方法の場合には、通常、水分１０乃至
２０％、晶出率１０乃至６０％程度のマスキットを約
０．１乃至３日間静置して全体をブロック状に晶出固化
させ、これを粉砕又は切削などの方法によって粉末化し
乾燥すれば、非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に
製造できる。In the case of the syrup method, a masquette is usually placed in a basket centrifuge to separate the trehalose-containing crystals and the syrup (mother liquor), and the crystals are washed with a small amount of cold water if necessary. Is also an easy way
It is suitable for producing trehalose hydrous crystals of higher purity. In the case of the spray drying method, a mass kit having a concentration of 70 to 85% and a crystallization rate of 20 to 60% is usually sprayed from a nozzle by a high pressure pump, and hot air at a temperature at which the crystal powder is not dissolved, for example, 60 to 100 ° C is used. A non-hygroscopic or hardly hygroscopic syrup-containing crystal can be easily produced by drying at 37 ° C. and then aging with warm air at 30 to 60 ° C. for about 1 to 20 hours. In the case of the block pulverization method, usually, a mass kit having a water content of 10 to 20% and a crystallization rate of 10 to 60% is allowed to stand for about 0.1 to 3 days to crystallize and solidify the whole in a block form. If this is powdered by a method such as crushing or cutting and dried, a non-hygroscopic or hardly hygroscopic honey-containing crystal can be easily produced.

【００３７】また、無水結晶トレハロースを製造するに
は、トレハロース含水結晶を乾燥して変換させることも
できるが、一般的には、水分１０％未満の高濃度トレハ
ロース高含有溶液を助晶缶にとり、種晶共存下で５０乃
至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で撹拌
しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキットを製
造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブロッ
ク粉砕、流動造粒、噴霧乾燥などの方法で晶出、粉末化
して製造される。Further, in order to produce anhydrous crystalline trehalose, trehalose hydrous crystals can be dried and converted, but generally, a high-concentration trehalose-rich solution having a water content of less than 10% is taken in a supporting crystal can. A mass kit containing anhydrous crystalline trehalose was produced while stirring in the range of 50 to 160 ° C., preferably 80 to 140 ° C. in the presence of seed crystals. It is produced by crystallizing by a method such as granules or spray drying and pulverizing.

【００３８】このようにして製造される本発明のトレハ
ロース、又はこれを含む糖質は、還元性が低く安定であ
り、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質
などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変
することも、異臭を発生することもなく、混合した他の
素材を損なうことも少ない。また、還元力が低いにもか
かわらず低粘度であり、良質で上品な甘味を有してい
る。The trehalose of the present invention thus produced, or the saccharide containing the same, has low reducibility and is stable, and is mixed with other materials, particularly substances having amino acids such as amino acids, oligopeptides and proteins. Even if it is processed, it does not turn brown, does not generate an offensive odor, and hardly damages other mixed materials. Further, it has a low viscosity even though it has a low reducing power, and has a good quality and a sweet taste.

【００３９】更に、本発明のトレハロースはトレハラー
ゼにより容易にグルコースにまで分解することから、経
口摂取により、消化吸収され、カロリー源として利用さ
れる。虫歯誘発菌などによって、醗酵されにくく、虫歯
を起こしにくい甘味料としても利用できる。また、浸透
圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖
の晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の老化防止性などの
性質を具備している。Furthermore, since the trehalose of the present invention is easily decomposed into glucose by trehalase, it is digested and absorbed by ingestion and used as a calorie source. It can also be used as a sweetener that is unlikely to be fermented by caries-inducing bacteria and is unlikely to cause caries. Further, it has properties such as osmotic pressure controllability, shaping property, luster imparting property, moisturizing property, viscosity, crystallization preventing property of other sugars, fermentability, and aging preventing property of gelatinized starch.

【００４０】また、本発明のトレハロースは、経管栄養
剤、輸液剤などとして非経口的に使用され、毒性、副作
用の懸念もなく、よく代謝、利用され、生体へのエネル
ギー補給に有利に利用することができる。また、安定な
甘味料であることにより、トレハロース含水結晶の場合
には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニ
ルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤の糖衣剤とし
て利用することも有利に実施できる。Further, the trehalose of the present invention is used parenterally as a tube feeding agent, infusion solution, etc., is well metabolized and utilized without fear of toxicity and side effects, and is advantageously used for energy supply to the living body. can do. Further, since it is a stable sweetener, in the case of trehalose hydrous crystals, it can be advantageously used in combination with a binder such as pullulan, hydroxyethyl starch, polyvinylpyrrolidone and the like as a sugar coating agent for tablets.

【００４１】また、無水結晶トレハロースの場合には、
食品、医薬品、化粧品、その原材料、又は加工中間物な
どの含水物の脱水剤としても有利に利用でき、安定で高
品質の粉末、顆粒、錠剤など固状物を容易に製造するこ
とができる。In the case of anhydrous crystalline trehalose,
It can be advantageously used as a dehydrating agent for water-containing substances such as foods, pharmaceuticals, cosmetics, raw materials thereof, or processing intermediates, and stable and high-quality solid materials such as powders, granules and tablets can be easily produced.

【００４２】従って、本発明のトレハロース、又はこれ
を含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤、脱水剤などとして、飲食物、嗜好物、飼
料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利
用できる。Therefore, the trehalose of the present invention or the sugar containing the trehalose is used as a sweetener, a taste improver, a quality improver, a stabilizer, an excipient, a dehydrating agent, etc., foods, drinks, feeds, feeds, It can be advantageously used for various compositions such as foodstuffs, cosmetics and pharmaceuticals.

【００４３】本発明のトレハロース、又は、これを含む
糖質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用す
ることができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ
糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メープルシュ
ガー、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラク
トオリゴ糖、ラクトスクロース、ソルビトール、マルチ
トール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシ
ド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、
グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニン
などのような他の甘味料の１種又は２種以上の適量と混
合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリ
ン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用する
こともできる。The trehalose of the present invention or the sugar containing the trehalose can be used as it is as a seasoning for sweetening. If necessary, for example, starch syrup, glucose, maltose, sucrose, isomerized sugar, honey, maple sugar, isomalt oligosaccharide, galactooligosaccharide, fructooligosaccharide, lactosucrose, sorbitol, maltitol, lactitol, dihydrochalcone, stevioside, α -Glycosyl stevioside, rebaudioside,
It may be used in admixture with one or more suitable amounts of other sweeteners such as glycyrrhizin, L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, saccharin, glycine, alanine, etc., and if necessary, dextrin. It can also be used as a mixture with a bulking agent such as starch, lactose or the like.

【００４４】また、本発明のトレハロース、又は、これ
を含む糖質の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、又は
必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合し
て、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種
形状に成型して使用することも随意である。The trehalose of the present invention, or a sugar powder or crystalline product containing the trehalose, may be used as it is or, if necessary, mixed with a bulking agent, an excipient, a binder or the like to form granules. It is also possible to mold it into various shapes such as a spherical shape, a short rod shape, a plate shape, a cube, and a tablet for use.

【００４５】また、本発明のトレハロース、又は、これ
を含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦
味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸
性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈
味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。The trehalose of the present invention, or the sweetness of sugar containing the trehalose, is in good harmony with various substances having other tastes such as sourness, salt to taste, astringency, umami and bitterness, and has acid resistance. Since it has high heat resistance, it can be advantageously used for sweetening and improving the taste of general food and drink, and for improving the quality.

【００４６】例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉
末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、
マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし
酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、
焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、
ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みり
ん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味
料として有利に使用できる。For example, amino acids, peptides, soy sauce, powdered soy sauce, miso, powdered miso, moromi, hishio, sprinkle,
Mayonnaise, dressing, vinegar, three tablespoons vinegar, powdered sushi vinegar, Chinese ingredients, tentsuyu, noodle soup, sauce, ketchup,
Grilled meat sauce, curry roux, stew ingredients, soup ingredients,
It can be advantageously used as various seasonings such as dashi stock, nucleic acid-based seasonings, complex seasonings, mirin, new mirin, table sugar, and coffee sugar.

【００４７】また、例えば、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊
羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、
パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなど
の洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、
果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペ
ースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプ
レッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロ
ップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、
べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たく
あん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソー
セージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、
かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカ
の塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの
各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造
されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻など
の惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、
畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リ
キュール、洋酒などの酒類、コーヒー、紅茶、ココア、
ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼
飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席
しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、
治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品、乾燥食
品などの各種飲食物への甘味付けに、呈味改良に、ま
た、品質改良などに有利に利用できる。Further, for example, various Japanese sweets such as rice crackers, hail, rice cakes, rice cakes, steamed buns, uiro, bean paste, yokan, water yoyo, nishikidama, jelly, castella, candy, etc.,
Bread, biscuits, crackers, cookies, pies, pudding, butter cream, custard cream, puff cream, waffles, sponge cakes, donuts, chocolate, chewing gum, caramel, candy and other confectionery, ice cream, sherbet and other ice confections,
Fruit syrup pickles, syrups such as ice honey, flower paste, peanut paste, fruit paste, pastes such as spreads, jam, marmalade, syrup pickles, fruits such as sugar fruit, processed foods of vegetables, Fukugami pickles,
Pickles such as betta pickles, senmai pickles, lucky pickles, pickles such as takuan pickles, Chinese cabbage pickles, meat products such as ham and sausage, fish ham, fish sausage,
Fish products such as kamaboko, chikuwa, tempura, seafood, various delicacies such as salted squid, vinegar konbu, sakisume, fugumirin dried, seaweed, wild vegetables, sardines, small fish, boiled tsukudani, boiled beans , Potato salad, konbu-maki and other prepared foods, yogurt, cheese and other dairy products, fish meat,
Meat, fruit, vegetable bottled, canned, sake, synthetic liquor, liqueur, liquor such as Western liquor, coffee, tea, cocoa,
Soft drinks such as juices, carbonated drinks, lactic acid drinks, and lactic acid bacteria drinks, pudding mixes, hot cake mixes, instant foods, instant foods such as instant soups, and even baby foods
It can be advantageously used for sweetening various foods and drinks such as therapeutic foods, drinks, peptide foods, frozen foods and dried foods, for improving taste and for improving quality.

【００４８】また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚な
どの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上さ
せる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練
歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トロー
チ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤な
ど各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧
品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈
味改良剤、矯味剤として、さらには品質改良剤、安定剤
などとして有利に利用できる。It can also be used for the purpose of improving palatability of feed, feed, etc. for domestic animals, poultry and other domestic animals such as bees, silkworms and fish. In addition, tobacco, toothpaste, lipstick, lip balm, oral solution, tablets, troches, liver oil drops, mouthwash, mouthwash, mouthwash, various solid materials such as paste, liquid, etc., preference, cosmetics, pharmaceuticals, etc. Can be advantageously used as a sweetening agent for various compositions, or as a taste improving agent, a corrigent, a quality improving agent, a stabilizer, and the like.

【００４９】品質改良剤、安定剤としては、有効成分、
活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健
康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、イン
ターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフ
ェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツ
モア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊
走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファク
ター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン、イン
シュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエ
チン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワク
チン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワ
クチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免
疫グロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマ
イシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ス
プレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、
チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、
カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなど
のビタミン、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、
プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グル
カナーゼ、ラクターゼなどの酵素、薬用人参エキス、ス
ッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポ
リスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母な
どの生菌、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、
その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液
状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品などに容易
に製造できることとなる。As the quality improver and stabilizer, active ingredients,
It can be advantageously applied to various physiologically active substances which easily lose their activity or the like, health foods and pharmaceuticals containing the same. For example, interferon-α, interferon-β, interferon-γ, Tumor necrosis factor-α, Tumor necrosis factor-β, macrophage migration inhibitory factor, colony-stimulating factor, transfer factor, lymphokines such as interleukin II, and insulin. , Hormones such as growth hormone, prolactin, erythropoietin, egg cell stimulating hormone, BCG vaccine, Japanese encephalitis vaccine, measles vaccine, live polio vaccine, pox seedling, tetanus toxoid, hub antitoxin, biologics such as human immunoglobulin, penicillin, erythromycin, Antibiotics such as chloramphenicol, tetracycline, sprepomycin, kanamycin sulfate,
Thiamine, riboflavin, L-ascorbic acid, liver oil,
Carotenoids, vitamins such as ergosterol, tocopherol, lipase, elastase, urokinase,
Enzymes such as protease, β-amylase, isoamylase, glucanase, lactase, ginseng extract, soft-shelled turtle extract, chlorella extract, aloe extract, propolis extract and other extracts, viruses, lactic acid bacteria, yeasts and other viable bacteria, royal jelly, etc. Physiologically active substances
The stable and high-quality liquid, paste or solid health food or pharmaceutical product can be easily produced without losing the active ingredient and activity.

【００５０】以上述べたような各種組成物にトレハロー
ス、又は、これを含む糖質を含有せしめる方法は、その
製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例え
ば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被
覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ば
れる。その量は、通常０．１％以上、望ましくは１％以
上含有せしめるのが好適である。次に実験により本発明
をさらに具体的に説明する。The method of incorporating trehalose or a sugar containing the same into various compositions as described above may be included in the steps until the product is completed. For example, mixing, dissolving, melting, Known methods such as dipping, infiltration, spraying, coating, coating, spraying, pouring, crystallization and solidification are appropriately selected. The amount is usually 0.1% or more, preferably 1% or more. Next, the present invention will be described more specifically by experiments.

【００５１】まず、新規微生物ピメロバクター・スピー
シーズ Ｒ４８、シュードモナス・プチダ Ｈ２６２及
びサーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３から
のマルトース・トレハロース変換酵素について説明し、
次いで、他の公知微生物からのマルトース・トレハロー
ス変換酵素について説明する。First, the maltose trehalose converting enzyme from the novel microorganisms Pimelobacters species R48, Pseudomonas putida H262 and Thermus aquaticus ATCC 33923 will be described.
Next, maltose / trehalose converting enzyme from other known microorganisms will be described.

【００５２】[0052]

【実験１ 酵素の生産】グルコース２．０ｗ／ｖ％、ポ
リペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ
％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリ
ウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．
０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．５ｗ／ｖ％、及び水
からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１０
０ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１１５℃、３０分間
滅菌し、冷却して、ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ
４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）を接種し、２７℃、
２００ｒｐｍで２４時間回転振盪培養したものを種培養
とした。[Experiment 1 Enzyme production] Glucose 2.0 w / v%, polypeptone 0.5 w / v%, yeast extract 0.1 w / v
%, Dipotassium phosphate 0.1 w / v%, monosodium phosphate 0.06 w / v%, magnesium sulfate heptahydrate 0.7.
A liquid medium consisting of 05 w / v%, calcium carbonate 0.5 w / v%, and water was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask at a concentration of 10%.
Add 0 ml each, sterilize in an autoclave at 115 ° C for 30 minutes, cool, and then pimerobacters species R
48 (FERM BP-4315), 27 ° C,
What was cultivated by rotating and shaking at 200 rpm for 24 hours was used as a seed culture.

【００５３】容量３０ｌのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却し
て温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、
温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、約４０
時間通気攪拌培養した。About 20 liters of a medium having the same composition as in the case of seed culture was placed in a fermenter having a volume of 30 liters, sterilized by heating and cooled to a temperature of 27 ° C., and 1 v / v% of seed culture was inoculated,
While maintaining the temperature at 27 ° C and pH 6.0 to 8.0, about 40
The cells were cultured with aeration and stirring for hours.

【００５４】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は、０．５５単位／ｍｌであった。培養液の一部
を採り、遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更
に菌体を５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養
液上清のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定
したところ、菌体懸濁液には、０．５単位／ｍｌの活性
が、培養液上清には、０．０５単位／ｍｌの活性が認め
られた。なお、本酵素の活性は、反応温度を２５℃にし
て測定した。The maltose / trehalose converting enzyme activity of the culture broth was 0.55 unit / ml. A part of the culture solution is collected and centrifuged to separate the cells and the culture solution supernatant, and the cells are suspended in 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) to obtain the same solution as the original culture solution. After determining the amount, the maltose / trehalose converting enzyme activity of the bacterial cell suspension and the culture supernatant was measured. As a result, 0.5 unit / ml of activity was found in the bacterial supernatant in the bacterial suspension. Was observed to have an activity of 0.05 unit / ml. The activity of this enzyme was measured at a reaction temperature of 25 ° C.

【００５５】[0055]

【実験２ 酵素の精製】実験１で得た培養液を遠心分離
して湿重量約０．５ｋｇの菌体を回収し、これを１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸
濁液約５ｌをエドモンドビューラー社製『ヴィブローゲ
ン セルミル』にかけ、菌体を破砕し、この破砕処理液
を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）することによ
り、約４．５ｌの上清を得た。その上清液に飽和度０．
３になるように硫安を加え溶解させ、４℃、４時間放置
した後、遠心分離することにより上清を回収した。[Experiment 2 Purification of Enzyme] The culture solution obtained in Experiment 1 was centrifuged to recover a bacterial cell having a wet weight of about 0.5 kg.
It was suspended in M phosphate buffer (pH 7.0). About 5 liters of this cell suspension was applied to Edmund Buehler's "Vibrogen Cell Mill" to crush the cells, and the disrupted solution was centrifuged (15,000 G, 30 minutes) to give about 4.5 liters. A supernatant was obtained. The degree of saturation was 0.
Ammonium sulphate was added to the solution to give a solution of 3, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 4 hours and then centrifuged to collect the supernatant.

【００５６】更に、その液に飽和度０．８になるように
硫安を加え溶解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離
することにより硫安塩析物を回収した。Further, ammonium sulfate was added to the solution so as to have a saturation level of 0.8, dissolved, allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then centrifuged to recover a salted-out product of ammonium sulfate.

【００５７】得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液（４００ｍｌ）を２回に分けて、『ＤＥＡＥ−トヨ
パール』を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー
（ゲル量３００ｍｌ）を行った。The obtained ammonium sulfate salt-out product was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), dialyzed against the same buffer for 24 hours, and centrifuged to remove insoluble materials. The dialysate (400 ml) was divided into two portions and subjected to ion exchange column chromatography (gel amount 300 ml) using "DEAE-Toyopearl".

【００５８】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素は『ＤＥＡＥ−トヨパール』に吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、
その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、東ソー
株式会社製『ブチルトヨパール ６５０』を用いた疎水
カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行っ
た。吸着したマルトース・トレハロース変換酵素を硫安
１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶
出させ、酵素活性画分を回収した。The maltose / trehalose converting enzyme of the present invention was adsorbed on "DEAE-Toyopearl" and eluted from the column with the same buffer containing sodium chloride. After the eluted enzyme active fraction was collected, it was dialyzed against the same buffer containing 1M ammonium sulfate,
The dialysate was centrifuged to remove insoluble matter, and then subjected to hydrophobic column chromatography (gel amount 300 ml) using "Butyl Toyopearl 650" manufactured by Tosoh Corporation. The adsorbed maltose / trehalose converting enzyme was eluted from the column with a linear gradient of ammonium sulfate 1M to 0M to collect an enzyme active fraction.

【００５９】続いて、ファルマシア・エルケイビー社製
『モノＱ ＨＲ５／５』を用いたイオン交換クロマトグ
ラフィー（ゲル量１０ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性
画分を回収した。精製の各ステップにおける酵素活性
量、比活性、収率を表１に示す。Subsequently, ion exchange chromatography (gel amount 10 ml) using "Mono Q HR5 / 5" manufactured by Pharmacia LCAB was performed, and the eluted enzyme active fraction was collected. Table 1 shows the amount of enzyme activity, the specific activity, and the yield in each step of purification.

【００６０】[0060]

【表１】 [Table 1]

【００６１】精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポ
リアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の
純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い
標品であった。The purified enzyme preparation was subjected to gel electrophoresis containing 7.5 w / v% concentration polyacrylamide to examine the purity of the enzyme preparation. As a result, the protein band was single and had a high purity.

【００６２】[0062]

【実験３ 酵素の性質】実験２の方法で得た精製マルト
ース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度１０ｗ／ｖ％）に供
し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッ
ド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分
子量を測定したところ、分子量約５７，０００乃至６
７，０００ダルトンであった。[Experiment 3 Properties of enzyme] The purified maltose / trehalose-converting enzyme preparation obtained by the method of Experiment 2 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 10 w / v%), and molecular weight markers (Nippon Bio・ The molecular weight of this enzyme was measured in comparison with Rad Laboratories Co., Ltd.), and the molecular weight was about 57,000 to 6
It was 7,000 daltons.

【００６３】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（ファルマシア・エルケ
イビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定
して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約
４．１乃至５．１であった。The purified maltose / trehalose converting enzyme preparation was subjected to isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis containing 2 w / v% ampholine (manufactured by Pharmacia LCAB), and after electrophoresis, the pH of the protein band and gel was measured. When the isoelectric point of this enzyme was determined by the method, the isoelectric point was pI of about 4.1 to 5.1.

【００６４】本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図１（温度の影
響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、６０分間反応で２０℃付近、至適ｐＨ
は、２５℃、６０分間反応で約７．０乃至８．０であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷
した後、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩
衝液中で２０℃、６０分間保持した後、ｐＨを７．０に
調整し、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。それぞれの結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ
安定性）に示した。本酵素の温度安定性は３０℃付近ま
でであり、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．０であった。
なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ⁺⁺、Ｈｇ⁺⁺又は５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液で阻害された。The effects of temperature and pH on the enzyme activity were examined according to the activity measuring method. The results are shown in FIG. 1 (effect of temperature) and FIG. 2 (effect of pH). The optimum temperature of the enzyme is pH 7.0, around 20 ℃ for 60 minutes reaction, the optimum pH
Was about 7.0 to 8.0 after reacting at 25 ° C. for 60 minutes. The temperature stability of this enzyme was determined by holding the enzyme solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) at each temperature for 60 minutes, cooling with water, and measuring the remaining enzyme activity. The pH stability was determined by maintaining the enzyme in 50 mM buffer of each pH at 20 ° C. for 60 minutes, adjusting the pH to 7.0, and measuring the remaining enzyme activity. The results are shown in Fig. 3 (temperature stability) and Fig. 4 (pH).
Stability). The temperature stability of this enzyme was up to around 30 ° C., and the pH stability was about 6.0 to 9.0.
The enzyme activity is 1 mM Cu ⁺⁺ , Hg ⁺⁺ or 50 m
Inhibited with M Tris-HCl buffer.

【００６５】[0065]

【実験４ 各種糖質への作用】各種糖質を用いて、基質
になりうるかどうかの試験をした。グルコース、マルト
ース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス、可溶性澱粉、アミロース（平均重合度１８）、トレ
ハロース、ネオトレハロース、ゲンチオビオース、コー
ジビオース、イソマルトース、セロビオース、マルチト
ール、シュクロース、マルツロース、ツラノース、パラ
チノース、トレハルロース、あるいはラクトースの溶
液、更に、α−グルコース・１−リン酸と等量のグルコ
ース、又は、β−グルコース・１−リン酸と等量のグル
コースとを含む溶液を調製した。[Experiment 4 Action on Various Carbohydrates] Using various sugars, it was tested whether they could be substrates. Glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, soluble starch, amylose (average degree of polymerization 18), trehalose, neotrehalose, gentiobiose, kojibiose, isomaltose, cellobiose, multi Tol, sucrose, maltulose, turanose, palatinose, trehalulose, or a solution of lactose, and glucose equivalent to α-glucose / 1-phosphate, or β-glucose / 1-phosphate and equal glucose. Was prepared.

【００６６】これらの溶液に、実験２の方法で得た精製
マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム
当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を５ｗ／ｖ％
になるよう調整し、これを２０℃、ｐＨ７．０で２４時
間作用させた。酵素反応前後の反応液をメルク社製『キ
ーゼルゲル６０』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ）
を用いた薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略称
する。）にかけ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有
無を確認した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノール：ピ
リジン：水＝６：４：１（容積比）を用い、室温で１回
展開した。発色は２０％硫酸−メタノール溶液を噴霧
し、１１０℃で１０分間加熱しておこなった。結果を表
２に示す。To each of these solutions, 2 units of the purified maltose-trehalose-converting enzyme obtained by the method of Experiment 2 were added per gram of substrate solid, and the substrate concentration was 5 w / v%.
Was adjusted so that it was allowed to act for 24 hours at 20 ° C. and pH 7.0. "Kieselgel 60" manufactured by Merck & Co., Inc. before and after the enzymatic reaction (aluminum plate, 20 x 20 cm)
Was subjected to thin-layer chromatography (hereinafter, abbreviated as TLC) using, to confirm the presence or absence of enzyme action on each sugar. TLC was developed once at room temperature using 1-butanol: pyridine: water = 6: 4: 1 (volume ratio) as a developing solvent. Color development was performed by spraying a 20% sulfuric acid-methanol solution and heating at 110 ° C. for 10 minutes. Table 2 shows the results.

【００６７】[0067]

【表２】 [Table 2]

【００６８】表２の結果から明かなように、本発明の酵
素は、試験した多種の糖質のうち、マルトースとトレハ
ロースにのみ作用し、その他の糖質、とりわけ、α−グ
ルコース・１リン酸とグルコースとを含む系や、β−グ
ルコース・１−リン酸とグルコースとを含む系に作用し
ないことから、従来知られているマルトース・ホスホリ
ラーゼやトレハロース・ホスホリラーゼなどのホスホリ
ラーゼとは違い、新規な酵素であることが判明した。As is clear from the results shown in Table 2, the enzyme of the present invention acts only on maltose and trehalose among the various kinds of sugars tested, and other sugars, especially α-glucose monophosphate. Since it does not act on a system containing glucose and glucose, or a system containing β-glucose / 1-phosphate and glucose, it is a novel enzyme, unlike phosphorylases such as conventionally known maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase. It turned out to be

【００６９】[0069]

【実験５ マルトース又はトレハロースからの生成物】
最終濃度５％のマルトース水溶液に実験２の方法で得た
精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グ
ラム当たり２単位加え、２０℃、ｐＨ７．０で２４時間
作用させた。酵素反応液の糖組成は、ガスクロマトグラ
フィー（以下、ＧＬＣと略称する。）で分析した。酵素
反応液の一部を乾固し、ピリジンに溶解した後トリメチ
ルシリル化したものを分析試料とした。ガスクロマトグ
ラフ装置は株式会社島津製作所製『ＧＣ−１６Ａ』、カ
ラムはジー・エル・サイエンス株式会社製『２％シリコ
ンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を充填したステンレス
カラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガス
を流量４０ｍｌ／分で、カラムオーブン温度は１６０℃
から３２０℃まで７．５℃／分の昇温速度で分析した。
検出は水素炎イオン検出器を用いた。その結果を表３に
示す。[Experiment 5 Products from maltose or trehalose]
To the maltose aqueous solution having a final concentration of 5%, 2 units of the purified maltose-trehalose converting enzyme obtained by the method of Experiment 2 was added per gram of the solid substrate, and the mixture was allowed to act at 20 ° C. and pH 7.0 for 24 hours. The sugar composition of the enzyme reaction solution was analyzed by gas chromatography (hereinafter abbreviated as GLC). A part of the enzyme reaction solution was dried, dissolved in pyridine and then trimethylsilylated to obtain an analytical sample. The gas chromatograph is “GC-16A” manufactured by Shimadzu Corporation, the column is a stainless steel column (3 mmφ × 2 m) filled with “2% silicon OV-17 / chromosolve W” manufactured by GL Science Co., and the carrier gas is Nitrogen gas flow rate 40ml / min, column oven temperature 160 ℃
To 320 ° C at a heating rate of 7.5 ° C / min.
A hydrogen flame ion detector was used for detection. Table 3 shows the results.

【００７０】[0070]

【表３】 [Table 3]

【００７１】表３の結果から明かなように、反応生成物
Ｘが多量に生成し、その保持時間が市販トレハロースの
それと一致していることが判明した。反応生成物Ｘを同
定するために次の確認試験を行った。すなわち、前述の
マルトースを基質とした酵素反応液を糖濃度２％になる
よう２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５で希釈し、この
０．５ｍｌにグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社
製）０．１単位を加え４０℃で２０時間反応させた。As is clear from the results in Table 3, it was found that the reaction product X was produced in a large amount and the retention time thereof was in agreement with that of the commercially available trehalose. The following confirmation test was performed to identify the reaction product X. That is, the above-mentioned enzyme reaction solution using maltose as a substrate was diluted with 20 mM acetate buffer, pH 4.5 to a sugar concentration of 2%, and 0.5 ml of glucoamylase (Seikagaku Corporation) 0.1 A unit was added and reacted at 40 ° C. for 20 hours.

【００７２】また、同様に酵素反応液を糖濃度２％にな
るよう２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で希釈し、こ
の０．５ｍｌにトレハラーゼ０．５単位を加え４０℃で
２０時間反応させた。マルトースを基質とした酵素反応
液、そのグルコアミラーゼ処理液及びトレハラーゼ処理
液をＧＬＣで分析、比較したところ、グルコアミラーゼ
処理によりマルトースは完全にグルコースに分解され、
反応生成物Ｘは分解されずに残存していた。Similarly, the enzyme reaction solution was diluted with 20 mM phosphate buffer, pH 7.0 so that the sugar concentration was 2%, 0.5 unit of trehalase was added to 0.5 ml, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 20 hours. It was When the enzyme reaction solution using maltose as a substrate, its glucoamylase treatment solution and trehalase treatment solution were analyzed and compared by GLC, maltose was completely decomposed into glucose by the glucoamylase treatment,
The reaction product X remained without being decomposed.

【００７３】一方、トレハラーゼ処理によりマルトース
は残存していたが、反応生成物Ｘは完全にグルコースに
分解された。グルコアミラーゼ及びトレハラーゼの反応
特性を考慮すると、本発明の新規酵素によって生成する
マルトースからのオリゴ糖はトレハロースであると判断
される。On the other hand, although the maltose remained due to the trehalase treatment, the reaction product X was completely decomposed into glucose. Considering the reaction characteristics of glucoamylase and trehalase, the oligosaccharide from maltose produced by the novel enzyme of the present invention is judged to be trehalose.

【００７４】更に、トレハロースを基質として、マルト
ースの場合と同様の条件で精製酵素を作用させ、その反
応液も同様にＧＬＣ分析したところ、本発明の酵素によ
ってトレハロースからはマルトースが生成することが判
明した。以上のＧＬＣ分析結果をまとめて表４に示す。Furthermore, using trehalose as a substrate, a purified enzyme was allowed to act under the same conditions as in the case of maltose, and the reaction solution was also subjected to GLC analysis. It was found that maltose was produced from trehalose by the enzyme of the present invention. did. The above GLC analysis results are summarized in Table 4.

【００７５】[0075]

【表４】 [Table 4]

【００７６】表４の結果から明かなように、本発明の酵
素は、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロー
スをマルトースに変換する。その平衡点は、トレハロー
ス側に片寄っており、マルトースからのトレハロースへ
の変換率が高く、約７０％以上になることが判明した。As is clear from the results shown in Table 4, the enzyme of the present invention converts maltose into trehalose and trehalose into maltose. It was found that the equilibrium point was offset to the trehalose side, and the conversion rate from maltose to trehalose was high, which was about 70% or more.

【００７７】[0077]

【実験６ トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度の
影響】マルトース濃度を２．５％、５％、１０％、２０
％あるいは４０％で、温度２０℃、ｐＨ７．０にて、実
験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵
素をマルトースグラム当たり２単位加えて反応させ、経
時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵
素を失活させた。[Experiment 6 Effect of maltose concentration on trehalose production] Maltose concentration was 2.5%, 5%, 10%, 20
% Or 40%, at a temperature of 20 ° C. and a pH of 7.0, 2 units of the purified maltose / trehalose converting enzyme obtained by the method of Experiment 2 was added to the maltose gram, and the reaction was carried out. The enzyme was inactivated by heating at 0 ° C for 10 minutes.

【００７８】この反応液の全糖量をアンスロン硫酸法
で、還元糖量をソモギー・ネルソン法でグルコース換算
で定量し、全糖量に対する還元糖量の割合を還元力とし
て算出した。The total sugar amount of this reaction solution was quantified by the Anthuron-sulfuric acid method and the reducing sugar amount was quantified by glucose conversion by the Somogy-Nelson method, and the ratio of the reducing sugar amount to the total sugar amount was calculated as the reducing power.

【００７９】また、この反応液を糖濃度約１％になるよ
う希釈し、少量限外濾過器、日本ミリポアリミテッド製
『モルカットＩＩ ＬＧＣ』にて除蛋白を行い、高速液
体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する。）
にて糖組成を分析した。ＨＰＬＣの装置は東ソー株式会
社製『ＣＣＰＤシステム』、分析カラムは株式会社ワイ
エムシィー製『ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＰＡ−０３』（４．
６ｍｍφ×２５０ｍｍ）、溶離液はアセトニトリル：水
＝７８：２２（容積比）を流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで、
検出は示差屈折計で行った。それらの結果を表５に示
す。The reaction solution was diluted to a sugar concentration of about 1%, deproteinized with a small amount ultrafilter, "Morcut II LGC" manufactured by Japan Millipo Limited, and subjected to high performance liquid chromatography (hereinafter, referred to as HPLC). Will be abbreviated.)
The sugar composition was analyzed at. The HPLC apparatus is "CCPD system" manufactured by Tosoh Corporation, and the analytical column is "YMC-pack PA-03" manufactured by YMC Corporation (4.
6 mmφ × 250 mm), the eluent is acetonitrile: water = 78: 22 (volume ratio) at a flow rate of 1.2 ml / min,
Detection was performed with a differential refractometer. The results are shown in Table 5.

【００８０】[0080]

【表５】 [Table 5]

【００８１】表５の結果から明かなように、基質のマル
トース濃度に関係なく、マルトースからのトレハロース
への変換反応はよく進行し、トレハロースへ約８０％変
換した。As is clear from the results in Table 5, the conversion reaction from maltose to trehalose proceeded well regardless of the maltose concentration of the substrate, and about 80% conversion to trehalose was achieved.

【００８２】[0082]

【実験７ トレハロース生成に及ぼす温度の影響】マル
トース濃度２０％で、ｐＨ７．０にして、実験２の方法
で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルト
ースグラム当たり２単位加えて、温度５℃、１０℃、１
５℃、２０℃あるいは２５℃で反応させ、経時的に反応
液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せた。この酵素反応液を実験６と同様にして、ＨＰＬＣ
にて糖組成を分析した。各温度、各時間でのトレハロー
ス含量を表６に示す。[Experiment 7 Effect of temperature on trehalose production] At a maltose concentration of 20%, pH 7.0, 2 units of the purified maltose / trehalose converting enzyme obtained by the method of Experiment 2 were added per maltose gram, and the temperature was kept at 5 ° C and 10 ° C. ℃, 1
The reaction was carried out at 5 ° C., 20 ° C. or 25 ° C., the reaction solution was collected over time, and heated at 100 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme. This enzyme reaction solution was subjected to HPLC as in Experiment 6.
The sugar composition was analyzed at. Table 6 shows the trehalose content at each temperature and each time.

【００８３】[0083]

【表６】 [Table 6]

【００８４】表６の結果から明かなように、反応温度が
高いほどトレハロース生成速度は大きくなる傾向にあっ
たが、温度５℃でもマルトースからのトレハロースへの
変換反応はよく進行し、トレハロースへ約８２％変換し
た。As is clear from the results in Table 6, the higher the reaction temperature, the higher the trehalose production rate, but the conversion reaction from maltose to trehalose proceeded well even at a temperature of 5 ° C. 82% conversion.

【００８５】[0085]

【実験８ マルトースからのトレハロースの調製】マル
トース（株式会社林原生物化学研究所製）１０重量部を
水４０重量部に溶解し、温度１５℃、ｐＨ７．０にて、
実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換
酵素をマルトースグラム当たり２単位加えて４８時間反
応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活
させた。本溶液には、トレハロースを固形物当たり約７
４％含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交
換樹脂（Ｈ型及びＯＨ型）にて脱塩して精製し、濃度約
７８％に濃縮して、トレハロース含水結晶を種晶として
固形物当たり０．１％添加し、室温に一夜放置したとこ
ろ、結晶が析出した。得られたマスキットを分蜜し、結
晶に少量の水をスプレーして結晶を洗浄し、純度９９．
８％の極めて高純度のトレハロース含水結晶約３．０重
量部を得た。[Experiment 8 Preparation of Trehalose from Maltose] 10 parts by weight of maltose (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratory Co., Ltd.) was dissolved in 40 parts by weight of water, and the temperature was 15 ° C. and the pH was 7.0.
The purified maltose-trehalose converting enzyme obtained by the method of Experiment 2 was added in an amount of 2 units per maltose gram and reacted for 48 hours, and then heated at 100 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme. This solution contains about 7 trehalose per solid.
It contained 4%. This solution was decolorized with activated carbon, desalted with an ion exchange resin (H-type and OH-type), purified, and concentrated to a concentration of about 78%, and trehalose hydrous crystals were used as seed crystals to give 0.1% per solid matter. When added, and allowed to stand at room temperature overnight, crystals were precipitated. The obtained musket is dehusked, the crystals are sprayed with a small amount of water to wash the crystals, and the purity is 99.
About 3.0 parts by weight of an extremely high-purity trehalose hydrous crystal of 8% was obtained.

【００８６】[0086]

【実験９ 酵素の生産】グルコース２．０ｗ／ｖ％、硫
酸アンモニウム１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．
１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫
酸マグネシウム０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．
３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容
三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで
１１５℃で、３０分間滅菌し、冷却して、シュードモナ
ス・プチダ Ｈ２６２（ＦＥＲＭＢＰ−４５７９）を接
種し、２７℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振とう培養
したものを種培養とした。[Experiment 9 Enzyme production] Glucose 2.0 w / v%, ammonium sulfate 1.0 w / v%, dipotassium phosphate 0.
1 w / v%, monosodium phosphate 0.06 w / v%, magnesium sulfate 0.05 w / v%, calcium carbonate 0.
Liquid medium consisting of 3 w / v% and water was put in a 500 ml Erlenmeyer flask by 100 ml, sterilized in an autoclave at 115 ° C. for 30 minutes, cooled, and inoculated with Pseudomonas putida H262 (FERMBP-4579), What was subjected to rotary shaking culture at 27 ° C. and 200 rpm for 24 hours was used as a seed culture.

【００８７】容量３０ｌのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却し
て温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、
温度２７℃、ｐＨ６．５乃至８．０に保ちつつ、約２０
時間通気攪拌培養した。About 20 liters of a medium having the same composition as in the case of seed culture was put in a fermenter having a volume of 30 liters, sterilized by heating, cooled to a temperature of 27 ° C., and then inoculated with 1 v / v% of the seed culture,
Approximately 20 while keeping the temperature at 27 ° C and pH 6.5 to 8.0.
The cells were cultured with aeration and stirring for hours.

【００８８】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は、０．１２単位／ｍｌであった。培養液の一部
を採り、遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更
に菌体を５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養
液上清のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定
したところ、菌体懸濁液には、０．１１単位／ｍｌの活
性が、培養液上清には、０．０１単位／ｍｌの活性が認
められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を３５℃に
して測定した。The maltose / trehalose converting enzyme activity of the culture broth was 0.12 unit / ml. A part of the culture solution is collected and centrifuged to separate the cells and the culture solution supernatant, and the cells are suspended in 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) to obtain the same solution as the original culture solution. After determining the amount, the maltose / trehalose converting enzyme activity of the bacterial cell suspension and the culture supernatant was measured, and it was found that 0.11 unit / ml of activity was found in the culture supernatant in the bacterial suspension. Was observed to have an activity of 0.01 unit / ml. The activity of this enzyme was measured at a reaction temperature of 35 ° C.

【００８９】[0089]

【実験１０ 酵素の精製】実験９で得た培養液を遠心分
離して湿重量約０．４５ｋｇの菌体を回収し、これを１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌
体懸濁液約２ｌを超高圧菌体破砕装置（大日本製薬株式
会社販売『ミニラボ』）で処理し、菌体を破砕し、この
破砕処理液を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）す
ることにより、約１．７ｌの上清を得た。その上清液に
飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、
一夜放置した後、遠心分離することにより硫安塩析物を
回収した。[Experiment 10 Purification of Enzyme] The culture solution obtained in Experiment 9 was centrifuged to recover a bacterial cell having a wet weight of about 0.45 kg.
The cells were suspended in 0 mM phosphate buffer (pH 7.0). Approximately 2 liters of this microbial cell suspension was treated with an ultra-high pressure microbial cell disruption device (“Minilab” sold by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) to disrupt the bacterial cells, and the disrupted treatment liquid was centrifuged (15,000 G, 30 minutes). ), About 1.7 l of supernatant was obtained. Ammonium sulfate was added to the supernatant to dissolve it at a saturation level of 0.7,
After allowing to stand overnight, the salted out product of ammonium sulfate was recovered by centrifugation.

【００９０】得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液（４００ｍｌ）を２回に分けて、『ＤＥＡＥ−トヨ
パール』を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー
（ゲル量３００ｍｌ）を行った。The obtained ammonium sulfate salt precipitate was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), dialyzed against the same buffer for 24 hours, and centrifuged to remove insolubles. The dialysate (400 ml) was divided into two portions and subjected to ion exchange column chromatography (gel amount 300 ml) using "DEAE-Toyopearl".

【００９１】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素は『ＤＥＡＥ−トヨパール』に吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、同緩衝液に対して透析し、再度、『ＤＥＡ
Ｅ−トヨパール』を用いたイオン交換カラムクロマトグ
ラフィー（ゲル量８０ｍｌ）を行った。吸着したマルト
ース・トレハロース変換酵素を食塩０．１Ｍから０．３
Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵
素活性画分を回収した。The maltose-trehalose converting enzyme of the present invention was adsorbed on "DEAE-Toyopearl" and eluted from the column with the same buffer containing salt. After the eluted enzyme activity fraction was collected, it was dialyzed against the same buffer solution, and again "DEA
Ion exchange column chromatography (gel amount 80 ml) using "E-Toyopearl" was performed. The adsorbed maltose / trehalose converting enzyme was converted to 0.1M to 0.3M of sodium chloride.
A linear gradient of M was used to elute from the column, and the enzyme active fraction was collected.

【００９２】続いて、東ソー株式会社製造『トヨパール
ＨＷ−５５Ｓ』を用いたゲル濾過クロマトグラフィー
（ゲル量４００ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を
回収した。精製の各ステップにおける酵素活性量、比活
性、収率を表７に示す。Then, gel filtration chromatography (400 ml of gel amount) using "Toyopearl HW-55S" manufactured by Tosoh Corporation was carried out to collect the eluted enzyme active fraction. Table 7 shows the amount of enzyme activity, the specific activity, and the yield at each purification step.

【００９３】[0093]

【表７】 [Table 7]

【００９４】精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポ
リアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の
純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い
標品であった。The purified enzyme preparation was subjected to gel electrophoresis containing 7.5 w / v% concentration polyacrylamide to examine the purity of the enzyme preparation. As a result, the protein band was single and had a high purity.

【００９５】[0095]

【実験１１ 酵素の性質】実験１０の方法で得た精製マ
ルトース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ
％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイ
オ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本
酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１０，００
０乃至１２０，０００ダルトンであった。[Experiment 11 Properties of enzyme] The purified maltose-trehalose-converting enzyme preparation obtained by the method of Experiment 10 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration: 7.5 w / v).
%), And the molecular weight of this enzyme was measured by comparison with a molecular weight marker (manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) that was electrophoresed at the same time.
It was 0 to 120,000 daltons.

【００９６】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（ファルマシア・エルケ
イビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定
して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約
４．１乃至５．１であった。The purified maltose / trehalose converting enzyme preparation was subjected to an isoelectric point polyacrylamide gel electrophoresis method containing 2 w / v% ampholine (Pharmacia LCA), and the pH of the protein band and gel was measured after the electrophoresis. When the isoelectric point of this enzyme was determined by the method, the isoelectric point was pI of about 4.1 to 5.1.

【００９７】本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図５（温度の影
響）、図６（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、６０分間反応で３７℃付近、至適ｐＨ
は、３５℃、６０分間反応で約７．３乃至８．３であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷
した後、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩
衝液中で３５℃、６０分間保持した後、ｐＨを７．０に
調整し、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。それぞれの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ
安定性）に示した。本酵素の温度安定性は４０℃付近ま
でであり、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．５であった。
なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ⁺⁺、Ｈｇ⁺⁺又は５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液で阻害された。The effects of temperature and pH on the activity of this enzyme were examined according to the activity measuring method. The results are shown in FIG. 5 (effect of temperature) and FIG. 6 (effect of pH). The optimum temperature of the enzyme is pH 7.0, around 37 ℃ for 60 minutes reaction, the optimum pH
Was about 7.3 to 8.3 after reacting at 35 ° C. for 60 minutes. The temperature stability of this enzyme was determined by holding the enzyme solution (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) at each temperature for 60 minutes, cooling with water, and measuring the remaining enzyme activity. The pH stability was determined by holding the enzyme in a 50 mM buffer of each pH at 35 ° C. for 60 minutes, adjusting the pH to 7.0, and measuring the remaining enzyme activity. The results are shown in Fig. 7 (temperature stability) and Fig. 8 (pH).
Stability). The temperature stability of this enzyme was up to around 40 ° C., and the pH stability was about 6.0 to 9.5.
The enzyme activity is 1 mM Cu ⁺⁺ , Hg ⁺⁺ or 50 m
Inhibited with M Tris-HCl buffer.

【００９８】[0098]

【実験１２ 各種糖質への作用】反応温度を３５℃とし
た以外は、実験４の方法に準じて、実験１０で得たシュ
ードモナス・プチダ Ｈ２６２の精製酵素を各種糖質に
作用させて、基質になりうるかどうかの試験をした。そ
の結果、シュードモナス・プチダ Ｈ２６２の酵素は、
ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８の酵素と同様、
マルトースとトレハロースにのみ作用しマルトースをト
レハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換
した。その平衡点は、トレハロース側に片寄っており、
マルトースからのトレハロースへの変換率が高く、約７
０％になることが判明した。[Experiment 12 Action on various carbohydrates] The purified enzyme of Pseudomonas putida H262 obtained in Experiment 10 was allowed to act on various carbohydrates according to the method of Experiment 4 except that the reaction temperature was 35 ° C. It was tested whether it could become. As a result, the enzyme of Pseudomonas putida H262 was
Like the enzyme of Pimelobacter species R48,
It acts only on maltose and trehalose to convert maltose to trehalose and trehalose to maltose. The equilibrium point is offset to the trehalose side,
High conversion rate from maltose to trehalose, about 7
It turned out to be 0%.

【００９９】[0099]

【実験１３ トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度
の影響】マルトース濃度を５％、１０％、２０％あるい
は３０％で、温度３５℃、ｐＨ７．０にて、実験１０の
方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマ
ルトースグラム当たり２単位加えて反応させ、経時的に
反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失
活させた。[Experiment 13 Effect of maltose concentration on trehalose production] Purified maltose-trehalose conversion obtained by the method of Experiment 10 at a maltose concentration of 5%, 10%, 20% or 30% at a temperature of 35 ° C and pH 7.0. The enzyme was added to the maltose gram in an amount of 2 units for reaction, the reaction solution was sampled with time, and heated at 100 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme.

【０１００】この反応液を用いて、実験６と同様に還元
力及び糖組成を測定した。それらの結果を表８に示す。Using this reaction solution, the reducing power and the sugar composition were measured in the same manner as in Experiment 6. Table 8 shows the results.

【０１０１】[0101]

【表８】 [Table 8]

【０１０２】表８の結果から明らかなように、基質のマ
ルトース濃度に関係なく、トレハロースを約７０％生成
した。As is clear from the results in Table 8, about 70% of trehalose was produced regardless of the maltose concentration of the substrate.

【０１０３】[0103]

【実験１４ マルトースからのトレハロースの調製】マ
ルトース（株式会社林原生物化学研究所販売）１０重量
部を水４０重量部に溶解し、温度３５℃、ｐＨ７．０に
して、実験例１０の方法で得た本発明の精製マルトース
・トレハロース変換酵素をマルトースグラム当たり２単
位加えて４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間
加熱して酵素を失活させた。本溶液には、トレハロース
を固形物当たり約６９％含有していた。本溶液を活性炭
で脱色し、イオン交換樹脂（Ｈ型及びＯＨ型）にて脱塩
して精製し、濃度約７８％に濃縮して、トレハロース含
水結晶を種晶として固形物当たり０．１％添加し、室温
に一夜放置したところ、結晶が析出した。得られたマス
キットを分蜜し、結晶に少量の水をスプレーして結晶を
洗浄し、純度９９．７％の極めて高純度のトレハロース
結晶約２．３重量部を得た。[Experiment 14 Preparation of Trehalose from Maltose] 10 parts by weight of maltose (available from Hayashibara Biochemical Laboratories Co., Ltd.) was dissolved in 40 parts by weight of water, and the temperature was 35 ° C. and the pH was 7.0. The purified maltose / trehalose converting enzyme of the present invention was added in an amount of 2 units per maltose gram, reacted for 48 hours, and then heated at 100 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme. This solution contained about 69% trehalose per solid. This solution was decolorized with activated carbon, desalted with an ion exchange resin (H-type and OH-type), purified, and concentrated to a concentration of about 78%, and trehalose hydrous crystals were used as seed crystals to give 0.1% per solid matter. When added, and allowed to stand at room temperature overnight, crystals were precipitated. The obtained mass kit was mashed and the crystals were washed by spraying a small amount of water to obtain about 2.3 parts by weight of extremely high-purity trehalose crystals having a purity of 99.7%.

【０１０４】[0104]

【実験１５ 酵素の生産】ポリペプトン０．５ｗ／ｖ
％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．０
７ｗ／ｖ％、リン酸二ナトリウム０．０１ｗ／ｖ％、硫
酸マグネシウム０．０２ｗ／ｖ％、塩化カルシウム０．
０１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、ｐＨ７．５に
調整した後、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌず
つ入れ、オートクレーブで１２０℃で、２０分間滅菌
し、冷却して、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３
３９２３を接種し、６０℃、２００ｒｐｍで２４時間回
転振とう培養したものを種培養とした。[Experiment 15 Enzyme production] Polypeptone 0.5 w / v
%, Yeast extract 0.1 w / v%, sodium nitrate 0.0
7 w / v%, disodium phosphate 0.01 w / v%, magnesium sulfate 0.02 w / v%, calcium chloride 0.
A liquid medium consisting of 01 w / v% and water was adjusted to pH 7.5, 100 ml each was put in a 500 ml Erlenmeyer flask, sterilized in an autoclave at 120 ° C. for 20 minutes, cooled, and cooled by Thermus aquaticus ATCC3.
The seed culture was obtained by inoculating 3923 and culturing with shaking at 60 ° C. and 200 rpm for 24 hours.

【０１０５】容量３０ｌのファーメンター２基に種培養
の場合と同組成の培地をそれぞれ約２０ｌ入れて、加熱
滅菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ
％を接種し、温度６０℃、ｐＨ６．５乃至８．０に保ち
つつ、約２０時間通気攪拌培養した。Approximately 20 liters of a medium having the same composition as in the case of seed culture were placed in two fermenters each having a volume of 30 liters, sterilized by heating and cooled to 60 ° C., and then 1 v / v of the seed culture solution was added.
% Of the solution was inoculated, and the culture was carried out with aeration and stirring for about 20 hours while maintaining the temperature at 60 ° C. and pH 6.5 to 8.0.

【０１０６】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は０．３５単位／ｍｌであった。培養液の一部を
採り、遠心分離して菌体と培養上清液とに分離し、更に
菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、
元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養上清
液のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定した
ところ、菌体懸濁液には０．３３単位／ｍｌの酵素活性
が、また、培養液上清には０．０２単位／ｍｌの酵素活
性が認められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を６
０℃にして測定した。The maltose / trehalose converting enzyme activity of the culture was 0.35 unit / ml. Taking a part of the culture solution, centrifuging to separate the cells into a culture supernatant liquid, and further suspending the cells in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0),
After making the same volume as the original culture solution, the maltose / trehalose converting enzyme activity of the bacterial cell suspension and the culture supernatant solution was measured, and it was found that the bacterial cell suspension had an enzyme activity of 0.33 unit / ml. However, 0.02 units / ml of enzyme activity was observed in the culture supernatant. The activity of this enzyme is 6
It was measured at 0 ° C.

【０１０７】[0107]

【実験１６ 酵素の精製】実験１５で得た培養液を遠心
分離して湿重量約０．２８ｋｇの菌体を回収し、これを
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この
菌体懸濁液約１．９ｌを、超音波破砕機（株式会社日本
精機製作所製『モデルＵＳ３００』）で処理し、菌体を
破砕した。この破砕処理液を遠心分離（１５，０００
Ｇ、３０分間）することにより、約１．８ｌの上清を得
た。その上清に飽和度０．７になるように硫安を加え溶
解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離機にかけ、硫
安塩析物を回収した。[Experiment 16 Purification of Enzyme] The culture solution obtained in Experiment 15 was centrifuged to recover a microbial cell having a wet weight of about 0.28 kg, which was suspended in a 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.0). About 1.9 l of the cell suspension was treated with an ultrasonic crusher (“Model US300” manufactured by Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.) to crush the cells. Centrifuge (15,000) the crushing solution.
G, 30 minutes) to obtain about 1.8 l of supernatant. Ammonium sulfate was added to the supernatant so as to give a saturation degree of 0.7, dissolved, allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then centrifuged to recover a salt of ammonium sulfate.

【０１０８】得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液（１５６０ｍｌ）を、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ
−トヨパール ６５０』を用いたイオン交換カラムクロ
マトグラフィー（ゲル量５３０ｍｌ）を３回に分けて行
った。The obtained ammonium sulfate salt-out product was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), dialyzed against the same buffer for 24 hours, and centrifuged to remove insoluble materials. The dialysate (1560 ml) was used as "DEAE" manufactured by Tosoh Corporation.
-Ion exchange column chromatography (gel amount 530 ml) using "Toyopearl 650" was performed in three times.

【０１０９】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素は『ＤＥＡＥ−トヨパール』に吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、
次に、『ブチルトヨパール６５０』を用いた疎水カラム
クロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）を行った。吸
着したマルトース・トレハロース変換酵素を硫安１Ｍか
ら０Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶出さ
せ、酵素活性画分を回収した。The maltose / trehalose converting enzyme of the present invention was adsorbed on "DEAE-Toyopearl" and eluted from the column with the same buffer containing sodium chloride. After the eluted enzyme active fraction was collected, it was dialyzed against the same buffer containing 1M ammonium sulfate,
Next, hydrophobic column chromatography (gel amount 380 ml) using "Butyl Toyopearl 650" was performed. The adsorbed maltose / trehalose converting enzyme was eluted from the column with a linear gradient of ammonium sulfate 1M to 0M to collect an enzyme active fraction.

【０１１０】次に、『トヨパール ＨＷ−５５Ｓ』を用
いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）
を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。Next, gel filtration chromatography using "Toyopearl HW-55S" (gel amount 380 ml).
Then, the eluted enzyme active fraction was collected.

【０１１１】続いて、ファルマシア・エルケイビー社製
『モノＱ ＨＲ５／５』を用いたイオン交換クロマトグ
ラフィー（ゲル量１．０ｍｌ）を行い、食塩０．１Ｍか
ら０．３５Ｍのリニアグラジエントにより溶出した酵素
活性画分を回収した。精製の各ステップにおける酵素活
性量、比活性、収率を表９に示す。Subsequently, ion exchange chromatography (gel amount 1.0 ml) using "Mono Q HR5 / 5" manufactured by Pharmacia LCAB was performed, and the enzyme was eluted with a linear gradient of 0.1 M to 0.35 M sodium chloride. The active fraction was collected. Table 9 shows the amount of enzyme activity, specific activity and yield in each step of purification.

【０１１２】[0112]

【表９】 [Table 9]

【０１１３】精製した酵素標品を５ｗ／ｖ％濃度ポリア
クリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度
を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品
であった。The purified enzyme preparation was assayed for the purity of the enzyme preparation by gel electrophoresis containing 5 w / v% concentration polyacrylamide. As a result, the protein band was single and had a high purity.

【０１１４】[0114]

【実験１７ 酵素の性質】実験１６の方法で得た精製マ
ルトース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ
％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイ
オ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本
酵素の分子量を測定したところ、分子量約１００，００
０乃至１１０，０００ダルトンであった。[Experiment 17 Properties of enzyme] The purified maltose / trehalose-converting enzyme preparation obtained by the method of Experiment 16 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 7.5 w / v).
%), And the molecular weight of this enzyme was measured by comparison with a molecular weight marker (manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) that was electrophoresed at the same time.
It was 0 to 110,000 daltons.

【０１１５】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を２％ｗ／ｖアンフォライン（ファルマシア・エルケ
イビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定
して本酵素の等電点を求めたところ、等電点はｐＩ約
３．８乃至４．８であった。The purified maltose / trehalose converting enzyme preparation was subjected to isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis containing 2% w / v ampholine (manufactured by Pharmacia LCA), and the pH of the protein band and gel was measured after the electrophoresis. Then, the isoelectric point of this enzyme was determined, and the isoelectric point was pI of about 3.8 to 4.8.

【０１１６】本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図９（温度の影
響）、図１０（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、６０分間反応で６５℃付近、至適ｐＨ
は、６０℃、６０分間反応で約６．０乃至６．７であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸
緩衝液を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持
し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することによ
り求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０
ｍＭ緩衝液中で６０℃、６０分間保持した後、ｐＨを
７．０に調整し、残存する酵素活性を測定することによ
り求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図
１２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約
８０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５．５乃至９．
５であった。なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ⁺⁺、Ｈｇ
⁺⁺又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害された。The effects of temperature and pH on the enzyme activity were examined according to the activity measuring method. The results are shown in FIG. 9 (effect of temperature) and FIG. 10 (effect of pH). The optimum temperature of the enzyme is pH 7.0, around 65 ° C for 60 minutes reaction, and the optimum pH.
Was about 6.0 to 6.7 after reacting at 60 ° C. for 60 minutes. The temperature stability of the present enzyme was determined by holding the enzyme solution (containing 50 mM phosphate buffer, pH 7.0) at each temperature for 60 minutes, cooling with water, and measuring the remaining enzyme activity. In addition, the pH stability of this enzyme is 50
After maintaining in mM buffer at 60 ° C. for 60 minutes, the pH was adjusted to 7.0 and the residual enzyme activity was measured to obtain the value. The respective results are shown in FIG. 11 (temperature stability) and FIG. 12 (pH stability). The temperature stability of this enzyme is up to about 80 ° C., and the pH stability is about 5.5 to 9.
It was 5. The enzyme activity is 1 mM Cu ⁺⁺ , Hg
^{+ +} Or 50 mM Tris-HCl buffer.

【０１１７】[0117]

【実験１８ 各種糖質への作用】反応温度を５０℃とし
た以外は、実験４の方法に準じて、実験１６で得たサー
マス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３の精製酵素
を各種糖質に作用させて、基質になりうるかどうかの試
験をした。その結果、サーマス・アクアティカスＡＴＣ
Ｃ３３９２３の酵素はピメロバクター・スピーシーズ
Ｒ４８の酵素、あるいは、シュードモナス・プチダ Ｈ
２６２の酵素と同様、マルトースとトレハロースにのみ
作用しマルトースをトレハロースに変換し、トレハロー
スをマルトースに変換した。その平衡点は、トレハロー
ス側に片寄っており、マルトースからトレハロースへの
変換率が高く、７０％以上になることが判明した。[Experiment 18 Action on Various Carbohydrates] The purified enzyme of Thermus aquaticus ATCC33923 obtained in Experiment 16 was allowed to act on various sugars according to the method of Experiment 4 except that the reaction temperature was 50 ° C. It was tested whether it could be a substrate. As a result, Thermus Aquaticus ATC
The enzyme of C33923 is Pimelobacter species
R48 enzyme or Pseudomonas putida H
Similar to the enzyme of No. 262, it acted only on maltose and trehalose to convert maltose to trehalose and trehalose to maltose. It was found that the equilibrium point was offset to the trehalose side, and the conversion rate from maltose to trehalose was high, reaching 70% or more.

【０１１８】[0118]

【実験１９ トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度
の影響】マルトース濃度を２．５％、５％、１０％、２
０％あるいは４０％で、温度６０℃、ｐＨ６．５にて、
実験１６の方法で得たサーマス・アクアティカス ＡＴ
ＣＣ３３９２３の精製マルトース・トレハロース変換酵
素をマルトースグラム当たり２．５単位加えて反応さ
せ、７２時間目に反応液を採取し、１００℃で３０分間
加熱して酵素を失活させた。この反応液を用いて、実験
６と同様に還元力及び糖組成を測定した。その結果を表
１０に示した。[Experiment 19 Effect of maltose concentration on trehalose production] Maltose concentration was 2.5%, 5%, 10%, 2
0% or 40%, temperature 60 ℃, pH 6.5,
Thermus aquaticus AT obtained by the method of Experiment 16
2.5 units of purified maltose / trehalose converting enzyme of CC33923 was added per maltose gram for reaction, a reaction solution was collected at 72 hours, and heated at 100 ° C. for 30 minutes to inactivate the enzyme. Using this reaction solution, the reducing power and the sugar composition were measured in the same manner as in Experiment 6. Table 10 shows the results.

【０１１９】[0119]

【表１０】 [Table 10]

【０１２０】表１０の結果から明らかなように、基質の
マルトース濃度に関係なく、トレハロースを約７０％生
成した。As is clear from the results in Table 10, about 70% of trehalose was produced regardless of the maltose concentration of the substrate.

【０１２１】[0121]

【実験２０ トレハロース生成に及ぼす温度の影響】マ
ルトース濃度２０％で、ｐＨ６．５にして、実験１６の
方法で得たサーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９
２３の精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルト
ースグラム当たり２．５単位加えて、温度４０℃、５０
℃、６０℃、あるいは７０℃で反応させ、経時的に反応
液を採取し、１００℃で３０分間加熱して酵素を失活さ
せた。この反応液を実験６と同様にして、ＨＰＬＣにて
糖組成を分析した。各温度、各時間でのトレハロース含
量を表１１に示す。[Experiment 20 Effect of temperature on trehalose production] Thermus aquaticus ATCC339 obtained by the method of Experiment 16 at a maltose concentration of 20% and a pH of 6.5
Add 23 units of purified maltose-trehalose converting enzyme of 23 units per maltose gram, and heat at 40 ° C, 50 ° C.
The reaction was carried out at 60 ° C., 60 ° C. or 70 ° C., the reaction solution was sampled with time, and heated at 100 ° C. for 30 minutes to inactivate the enzyme. This reaction solution was analyzed for sugar composition by HPLC in the same manner as in Experiment 6. Table 11 shows the trehalose content at each temperature and each time.

【０１２２】[0122]

【表１１】 [Table 11]

【０１２３】表１１の結果から明らかなように、マルト
ースからのトレハロースへの変換率は反応温度が低いほ
ど高く、４０℃においてトレハロースへ約８０％変換し
た。As is clear from the results shown in Table 11, the conversion rate from maltose to trehalose was higher as the reaction temperature was lower, and about 80% was converted to trehalose at 40 ° C.

【０１２４】[0124]

【実験２１ 他の微生物からのマルトース・トレハロー
ス変換酵素の生産とその性質】公知微生物のうち、本発
明のマルトース・トレハロース変換酵素産生能の確認さ
れた特定の微生物を、実験１５の場合に準じて三角フラ
スコにて４８時間培養した。培養液の酵素活性を調べた
後、実験１６の方法に準じて、培養液を破砕装置にか
け、その上清を透析して、部分精製酵素を得、実験１７
の方法に従って、その性質を調べた。結果を表１２に示
した。[Experiment 21: Production of maltose / trehalose converting enzyme from other microorganisms and its properties] Among known microorganisms, a specific microorganism confirmed to have the ability to produce maltose / trehalose converting enzyme of the present invention was used in the same manner as in Experiment 15. It culture | cultivated in the Erlenmeyer flask for 48 hours. After examining the enzyme activity of the culture broth, according to the method of Experiment 16, the culture broth was applied to a disruption device, and the supernatant was dialyzed to obtain a partially purified enzyme.
The property was investigated according to the method of. The results are shown in Table 12.

【０１２５】[0125]

【表１２】 [Table 12]

【０１２６】表１２に示すこれらサーマス属に属する公
知微生物由来の部分精製酵素を用いて、実験１８の方法
に従って、各種糖質への作用を調べたところ、サーマス
・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３由来の酵素の場
合と同様に、マルトースとトレハロースにのみ作用し、
マルトースからトレハロースを生成することが判明し
た。Using the partially purified enzymes derived from these known microorganisms belonging to the genus Thermus shown in Table 12, according to the method of Experiment 18, the action on various sugars was examined. In the case of the enzyme derived from Thermus aquaticus ATCC 33923, Similar to, only acts on maltose and trehalose,
It was found to produce trehalose from maltose.

【０１２７】また、サーマス・ルーバー ＡＴＣＣ３５
９４８のマルトース・トレハロース変換酵素は、サーマ
ス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３の酵素に比
し、その至適温度、安定温度は低かったが、他のサーマ
ス属の酵素は、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３
３９２３の酵素とほぼ同じ性質を示し、耐熱性の高いこ
とが判明した。Also, Thermus Louver ATCC35
The maltose-trehalose converting enzyme of 948 had lower optimum temperature and stable temperature than the enzyme of Thermus aquaticus ATCC 33923, but other enzymes of the genus Thermus belong to Thermus aquaticus ATCC3.
It was found that it has almost the same properties as the enzyme of 3923 and has high thermostability.

【０１２８】[0128]

【実験２２ 調製したトレハロースの理化学的性質】実
験８の方法で調製したトレハロースの高純度標品を用い
て理化学的性質を調べた。融点は９７．０℃、比旋光度
は［α］²⁰ _D＋１９９゜（ｃ＝５）、融解熱は５７．８
ＫＪ／ｍｏｌｅ、溶解度は２５℃の水に対し、無水物と
して７７．０ｇであった。これらの物性値は、同時に測
定した市販トレハロース含水結晶（和光純薬工業株式会
社製）の値とよく一致した。[Experiment 22 Physicochemical properties of the prepared trehalose] The physicochemical properties of the trehalose prepared by the method of Experiment 8 were examined using a highly pure preparation. Melting point is 97.0 ° C., specific rotation is [α] ²⁰ _D + 199 ° (c = 5), and heat of fusion is 57.8.
KJ / mole, the solubility was 77.0 g as an anhydride in water at 25 ° C. These physical property values were in good agreement with those of a commercially available trehalose hydrous crystal (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) that was measured at the same time.

【０１２９】[0129]

【実験２３ 生体内での利用試験】厚治等が、『臨床栄
養』、第４１巻、第２号、第２００乃至２０８頁（１９
７２年）で報告している方法に準じて、実験８において
調製した高純度トレハロース標品（純度９９．８％）３
０ｇを２０ｗ／ｖ％水溶液とし、これをボランティア３
名（健康な２６才、２７才、３０才の男性）にそれぞれ
経口投与し、経時的に採血して、血糖値及びインスリン
値を測定した。対照としては、グルコースを用いた。そ
の結果、トレハロースは、グルコースの場合と同様の挙
動を示し、血糖値、インスリン値ともに、投与後、約
０．５乃至１時間で最大値を示した。トレハロースは、
容易に消化吸収、代謝利用されて、エネルギー源になる
ことが判明した。従って、本発明の方法で得られるトレ
ハロース及びこれを含む糖質は、エネルギー補給用糖源
として好適である。[Experiment 23: In-vivo utilization test] Kouji et al., "Clinical Nutrition", Vol. 41, No. 2, pp. 200-208 (19
High purity trehalose preparation (purity 99.8%) 3 prepared in Experiment 8 according to the method reported in (1972) 3
0 g was made a 20 w / v% aqueous solution, and this was volunteer 3
Orally administered to healthy individuals (healthy 26-year-old, 27-year-old, and 30-year-old male), and blood samples were collected over time to measure blood glucose level and insulin level. Glucose was used as a control. As a result, trehalose behaved similarly to the case of glucose, and both the blood glucose level and the insulin level showed maximum values about 0.5 to 1 hour after administration. Trehalose is
It was found to be easily digested, absorbed, and metabolized and used as an energy source. Therefore, the trehalose obtained by the method of the present invention and the sugar containing the same are suitable as a sugar source for energy supply.

【０１３０】[0130]

【実験２４ 急性毒性試験】マウスを使用して、実施例
Ａ−６において調製した高純度トレハロース含水結晶を
経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、トレハ
ロースは低毒性の物質で、投与可能な最大投与量におい
ても死亡例は認められなかった。従って、正確な値とは
いえないが、そのＬＤ₅₀値は、５０ｇ／ｋｇ以上であっ
た。[Experiment 24 Acute toxicity test] Using a mouse, the high-purity trehalose hydrous crystal prepared in Example A-6 was orally administered to perform an acute toxicity test. As a result, trehalose was a low-toxic substance, and no death was observed even at the maximum dose that could be administered. Therefore, although not an accurate value, the LD ₅₀ value was 50 g / kg or more.

【０１３１】[0131]

【実験２５ 培養法によるトレハロース生成に与えるマ
ルトース濃度の影響】マルトース・トレハロース変換酵
素産生能を有する微生物を、マルトースを２乃至２０ｗ
／ｖ％含有せしめた栄養培地に培養し、培養物中のトレ
ハロース収量に与えるマルトース濃度の影響を調べた。
培養方法は、ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）の場合、栄養培地が、グ
ルコース２．０ｗ／ｖ％の代わりに、別滅菌したマルト
ースを２乃至２０ｗ／ｖ％を含有せしめた培地とした以
外は、実験１と同様にファーメンターで２７℃、７２時
間培養し、更に界面活性剤（ポリオキシエチレン・ソル
ビタン・モノパルミテート、和光純薬工業株式会社販売
『Ｔｗｅｅｎ ４０』）を０．１ｖ／ｖ％加えて２４時
間培養を続けた。また、サーマス・アクアティカス Ａ
ＴＣＣ３３９２３の場合、栄養培地を別滅菌したマルト
ースを２乃至２０ｗ／ｖ％を含有せしめた培地とした以
外は、実験１５と同様にファーメンターで６０℃、２４
時間培養し、更に、界面活性剤『Ｔｗｅｅｎ ４０』を
０．１ｖ／ｖ％加えて２４時間培養を続けた。培養物
は、遠心分離して、上清に含まれるトレハロース含量
（ｍｇ／ｍｌ）をＨＰＬＣで測定した。結果は、表１３
に示す。[Experiment 25 Effect of maltose concentration on trehalose production by culture method] Maltose was added to maltose in an amount of 2 to 20 w
It was cultured in a nutrient medium containing / v%, and the effect of maltose concentration on the trehalose yield in the culture was examined.
The culturing method is Pimelobacter species R48.
In the case of (FERM BP-4315), the same as in Experiment 1 except that the nutrient medium was a medium containing separately sterilized maltose in an amount of 2 to 20 w / v% instead of 2.0 w / v% glucose. Incubate for 72 hours at 27 ° C in a fermenter, then add 0.1v / v% of surfactant (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, "Tween 40" sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 24 hours. Continued. Also, Thermus Aquaticus A
In the case of TCC33923, the nutrient medium was separately sterilized, and a medium containing 2 to 20 w / v% of maltose was used.
After culturing for 24 hours, the surfactant "Tween 40" was further added at 0.1 v / v% and the culturing was continued for 24 hours. The culture was centrifuged and the trehalose content (mg / ml) contained in the supernatant was measured by HPLC. The results are shown in Table 13.
Shown in

【０１３２】[0132]

【表１３】 [Table 13]

【０１３３】表１３の結果から明らかなように、栄養培
地中のマルトースが濃度２０ｗ／ｖ％以下、望ましくは
１５ｗ／ｖ％以下、更に望ましくは５乃至１０ｗ／ｖ％
付近でトレハロース収量が高く、トレハロース生産に好
適であることが判明した。As is clear from the results shown in Table 13, the concentration of maltose in the nutrient medium is 20 w / v% or less, preferably 15 w / v% or less, more preferably 5 to 10 w / v%.
It was found that the trehalose yield was high in the vicinity, which was suitable for trehalose production.

【０１３４】以下、本発明のマルトース・トレハロース
変換酵素産生能を有する微生物を利用したトレハロー
ス、又はこれを含む糖質の製造方法を実施例Ａで、トレ
ハロース、又は、これを含む糖質を含有せしめた組成物
を実施例Ｂで示す。Hereinafter, a method for producing trehalose or a sugar containing the same by using a microorganism having the ability to produce maltose / trehalose converting enzyme of the present invention will be described in Example A in which trehalose or a sugar containing the same is added. Such a composition is shown in Example B.

【０１３５】[0135]

【実施例Ａ−１】濃度１０％馬鈴薯澱粉乳（ｐＨ５．
５）にα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製
『スピターゼ ＨＳ』）を澱粉グラム当たり２単位加え
て撹拌下、加熱糊化・液化させ、直ちにオートクレーブ
（１２０℃）を２０分間行った後、温度５０℃、ｐＨ
５．０に調整した。これにβ−アミラーゼ（ナガセ生化
学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位及びイ
ソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉
グラム当たり５００単位の割合になるように加えて２４
時間反応させ、次いで、９５℃に加熱して酵素を失活さ
せ、濾過、脱色して、マルトース含量約９２％の糖液を
得た。糖源として、グルコース２．０ｗ／ｖ％の代わり
に、前述の糖液を別滅菌して固形物当たり１０ｗ／ｖ％
を使用した以外は、実験１の方法に準じて調製した栄養
培地をファーメンターにとり、これにマルトース・トレ
ハロース変換酵素産生能を有するピメロバクター・スピ
ーシーズ Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）の種培
養物を１ｖ／ｖ％植菌し、実験１と同様に２７℃で７２
時間通気撹拌培養し、更に、界面活性剤（アルキルフェ
ノール・ポリオキシエチレンエーテル、和光純薬工業株
式会社販売『Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００』）を０．２ｖ
／ｖ％加えて培養を２４時間続けた。この培養物を濾過
して不溶物を除去し、得られる濾液を、９５℃に加熱し
て酵素を失活させた後、濃縮し、常法に従って活性炭で
脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱
塩して精製し、更に濃縮して濃度約７０％のシラップを
固形物当たり約６５％の収率で得た。本品は、固形物当
たりトレハロースを約４４％含有しており、温和な甘
味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、
安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品
など各種組成物に有利に利用できる。Example A-1 10% Concentration Potato Starch Milk (pH 5.
To 5), 2 units of α-amylase (“Spitase HS” manufactured by Nagase Seikagaku Co., Ltd.) was added per gram of starch to heat-gelatinize and liquefy with stirring, and immediately after autoclaving (120 ° C.) for 20 minutes, Temperature 50 ℃, pH
Adjusted to 5.0. To this, β-amylase (manufactured by Nagase Seikagaku Co., Ltd.) was added in an amount of 20 units per gram of starch, and isoamylase (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratory Co., Ltd.) in a ratio of 500 units per gram of starch.
The mixture was reacted for a time, then heated to 95 ° C. to inactivate the enzyme, filtered and decolorized to obtain a sugar solution having a maltose content of about 92%. As a sugar source, instead of 2.0 w / v% glucose, the above sugar solution was separately sterilized to obtain 10 w / v% per solid matter.
Except that the nutrient medium prepared according to the method of Experiment 1 was used as a fermenter, and the seed culture of Pimelobacter species R48 (FERM BP-4315) capable of producing maltose / trehalose converting enzyme was added at 1 v / v% inoculation and 72 at 27 ° C as in Experiment 1.
Culturing with aeration and stirring for 0.2 hours, and 0.2v of surfactant (alkylphenol polyoxyethylene ether, "Triton X-100" sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
/ V% was added and the culture was continued for 24 hours. This culture was filtered to remove insoluble matter, and the resulting filtrate was heated to 95 ° C. to deactivate the enzyme, then concentrated, decolorized and filtered with activated carbon according to a conventional method, and H-type and OH-type. It was desalted with an ion exchange resin for purification, and further concentrated to obtain a syrup having a concentration of about 70% in a yield of about 65% based on a solid substance. This product contains about 44% trehalose per solid matter, has a mild sweetness, moderate viscosity and moisturizing property, and is a sweetener, a taste improver,
It can be advantageously used as a stabilizer, an excipient, etc. in various compositions such as various foods, drinks, cosmetics and pharmaceuticals.

【０１３６】[0136]

【実施例Ａ−２】実施例Ａ−１の方法で得た培養物の濾
液に、固形物グラム当たり１０単位のグルコアミラー
ゼ、ナガセ生化学工業株式会社製『グルコチーム』をｐ
Ｈ５．０、５０℃で２４時間作用させ、次いで、加熱失
活、脱色、脱塩精製して得られる糖液を原糖液とし、ト
レハロースの含量を高めるため、ナトリウム型強酸性カ
チオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製『ＸＴ−
１０１６』、架橋度４％）を用いたイオン交換カラムク
ロマトグラフィーを行った。樹脂を内径５．４ｃｍのジ
ャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列に
つなぎ、樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃
に維持しつつ、糖液を樹脂に対して、５ｖ／ｖ％加え、
これに６０℃の温水をＳＶ０．１５で流して分画し、グ
ルコースを除去し、トレハロース高含有画分を採取し
た。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレ
ハロース高含有粉末を固形物当たり、約３５％の収率で
得た。本品は、トレハロースを約９７％含有しており、
極めて低い還元性、まろやかで上品な甘味を有し、甘味
料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとし
て、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利
に利用できる。[Example A-2] To the filtrate of the culture obtained by the method of Example A-1, 10 units of glucoamylase per gram of solid matter, "glucozyme" manufactured by Nagase Seikagaku Co., Ltd. was added.
A sugar solution obtained by reacting at H5.0 and 50 ° C. for 24 hours, followed by heat inactivation, decolorization, and desalting purification is used as a raw sugar solution. In order to increase the content of trehalose, a sodium-type strongly acidic cation exchange resin ( "XT-" manufactured by Tokyo Organic Chemical Industry Co., Ltd.
1016 ″, cross-linking degree 4%) was used for ion exchange column chromatography. The resin was packed in four jacketed stainless steel columns having an inner diameter of 5.4 cm and connected in series to give a resin layer total length of 20 m. Column temperature 60 ℃
While maintaining at 5%, add 5% v / v of sugar solution to the resin,
Warm water at 60 ° C. was flown through this with SV 0.15 to fractionate, glucose was removed, and a trehalose-rich fraction was collected. Further purification, concentration, vacuum drying and crushing gave a trehalose-rich powder in a yield of about 35% based on solids. This product contains about 97% trehalose,
It has extremely low reducibility, mellow and elegant sweetness, and is advantageously used as a sweetener, taste improver, quality improver, stabilizer, excipient, etc. in various compositions such as food and drink, cosmetics, and pharmaceuticals. it can.

【０１３７】[0137]

【実施例Ａ−３】実施例Ａ−２の方法で得たトレハロー
ス高含有画分を、常法に従って、活性炭で脱色し、イオ
ン交換樹脂により脱塩して精製した溶液を濃度約７０％
に濃縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロース
含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマス
キットを得た。本マスキットを乾燥塔上のノズルより１
５０ｋｇ／ｃｍ²の高圧にて噴霧した。これと同時に８
５℃の熱風を乾燥塔の上部より送風して底部に設けた移
送金網コンベア上に捕集し、コンベアの下より４５℃の
温風を送りつつ、金網コンベア上に捕集した結晶粉末を
乾燥塔外に徐々に移動させ取り出した。この取り出した
結晶粉末を、熟成塔に充填して温風を送りつつ１０時間
熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、トレハロース含水結
晶粉末を原料のトレハロース高含有糖液に対して固形物
当たり約９０％の収率で得た。本品は、実質的に吸湿性
を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、
安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種
組成物に有利に利用できる。Example A-3 The trehalose-rich fraction obtained by the method of Example A-2 was decolorized with activated carbon and desalted with an ion exchange resin according to a conventional method to obtain a purified solution, which had a concentration of about 70%.
After concentrating to 2, the mixture was taken in an auxiliary crystallizer, and about 2% of trehalose hydrous crystals was added as a seed crystal and gradually cooled to obtain a maskit with a crystallization rate of about 45%. From the nozzle on the drying tower 1
It was sprayed at a high pressure of 50 kg / cm ² . At the same time 8
Hot air of 5 ° C is blown from the top of the drying tower to collect it on the transfer wire mesh conveyor provided at the bottom, and while blowing warm air of 45 ° C from under the conveyor, the crystal powder collected on the wire mesh conveyor is dried. It was gradually moved out of the tower and taken out. The crystal powder thus taken out is filled in an aging tower and aged for 10 hours while sending warm air, crystallization and drying are completed, and trehalose hydrous crystal powder is added to a raw material trehalose-rich sugar solution to a solid content of about Obtained in a yield of 90%. This product has virtually no hygroscopicity, is easy to handle, has a sweetener, a taste improver,
It can be advantageously used as a stabilizer or the like in various compositions such as various foods and drinks, cosmetics and pharmaceuticals.

【０１３８】[0138]

【実施例Ａ−４】実施例Ａ−２の方法で得たトレハロー
ス高含有画分を、実施例Ａ−３と同様に精製し、次い
で、蒸発釜にとり、減圧下で煮詰め、水分約３．０％の
シラップとした。次いで、助晶機に移し、これに種晶と
して無水結晶トレハロースをシラップ固形物当たり１％
加え、１２０℃で攪拌助晶し、次いで、アルミ製バット
に取り出し、１００℃で６時間晶出熟成させてブロック
を調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕し、
流動乾燥して、水分約０．３％の無水結晶トレハロース
粉末を、原料のトレハロース高含有糖液に対して、固形
物当たり約８５％の収率で得た。本品は、食品、化粧
品、医薬品、その原材料、又は加工中間物などの含水物
の脱水剤としてのみならず、上品な甘味を有する白色粉
末甘味料としても、各種飲食物、化粧品、医薬品など各
種組成物に有利に利用できる。Example A-4 The trehalose-rich fraction obtained by the method of Example A-2 was purified in the same manner as in Example A-3, then placed in an evaporator and boiled under reduced pressure to a water content of about 3. It was 0% syrup. Then, it was transferred to an auxiliary crystallizer, to which anhydrous crystalline trehalose was seeded as 1% per syrup solid.
In addition, a block was prepared by stirring and assisting crystallization at 120 ° C., then taking out to an aluminum vat and aging at 100 ° C. for 6 hours for crystallization. Then, crush this block with a cutting machine,
By fluidizing and drying, anhydrous crystalline trehalose powder having a water content of about 0.3% was obtained in a yield of about 85% based on the solid content, based on the raw trehalose-rich sugar solution. This product can be used not only as a dehydrating agent for water-containing products such as foods, cosmetics, pharmaceuticals, raw materials thereof, or processed intermediates, but also as a white powder sweetener having an elegant sweetness for various foods, beverages, cosmetics, pharmaceuticals, etc. It can be advantageously used in a composition.

【０１３９】[0139]

【実施例Ａ−５】濃度３３％とうもろこし澱粉乳に炭酸
カルシウムを０．１％加えた後、ｐＨ６．５に調整し、
これにα−アミラーゼ（ノボ社製『ターマミール６０
Ｌ』）を澱粉グラム当たり０．２％加え、９５℃で１５
分間反応させた。その反応液をオートクレーブ（１２０
℃）を３０分間行った後、５５℃に冷却し、これにイソ
アミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グ
ラム当たり５００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化
学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり３０単位加え、
４８時間反応させ、次いで、９５℃に加熱して酵素を失
活させ、濾過、脱色して、マルトース含量約８４％の糖
液を得た。糖源として、前述の糖液を別滅菌して固形物
当たり１０ｗ／ｖ％を追加した以外は、実験９の方法に
準じて調製した栄養培地をファーメンターにとり、これ
にマルトース・トレハロース変換酵素産生能を有するシ
ュードモナス・プチダ Ｈ２６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
５７９）の種培養物を１ｖ／ｖ％植菌し、実験９と同様
に２７℃で４８時間通気撹拌培養し、更に、界面活性剤
『Ｔｗｅｅｎ ４０』を０．２ｖ／ｖ％加えて２４時間
培養を続けた。この培養物を濾過して不溶物を除去し、
得られる濾液を、９５℃に加熱して酵素を失活させた
後、濃縮し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型
及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に
濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物当たり約５０
％の収率で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを
約６４％を含有しており、低還元性、温和な甘味、適度
の粘度、保湿性を有し、各種飲食物、化粧品、医薬品な
どの各種組成物に有利に利用できる。Example A-5 0.1% calcium carbonate was added to corn starch milk with a concentration of 33%, and the pH was adjusted to 6.5.
In addition to this, α-amylase ("Tamamir 60" manufactured by Novo Co.
L ″) is added at 0.2% per gram of starch and the mixture is added at 95 ° C. for 15
Allowed to react for minutes. The reaction solution was autoclaved (120
C.) for 30 minutes and then cooled to 55.degree. C., to which 500 units of isoamylase (manufactured by Hayashibara Biochemical Research Co., Ltd.) per gram of starch and .beta.-amylase (manufactured by Nagase Seikagaku Corp.) are added. Add 30 units per gram,
The mixture was reacted for 48 hours, then heated to 95 ° C. to inactivate the enzyme, filtered and decolorized to obtain a sugar solution having a maltose content of about 84%. As a sugar source, a nutrient medium prepared according to the method of Experiment 9 was placed in a fermenter except that the above-mentioned sugar solution was separately sterilized and 10 w / v% was added per solid matter, and maltose / trehalose converting enzyme production was performed on the nutrient medium. Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4 with ability)
The seed culture of (579) was inoculated with 1 v / v% and cultured under aeration and stirring at 27 ° C. for 48 hours in the same manner as in Experiment 9, and then 0.2 v / v% of the surfactant “Tween 40” was added for 24 hours. The culture was continued. The culture is filtered to remove insolubles,
The obtained filtrate is heated to 95 ° C. to deactivate the enzyme, then concentrated, decolorized and filtered with activated carbon according to a conventional method, purified by desalting with H-type and OH-type ion exchange resins, and further concentrated. And syrup with a concentration of about 70% per solid
% Yield. This product contains about 64% of trehalose per solid, has low reducing property, mild sweetness, moderate viscosity and moisturizing property, and is advantageous for various compositions such as various foods, drinks, cosmetics and pharmaceuticals. Available for

【０１４０】[0140]

【実施例Ａ−６】実施例Ａ−５の方法で得たシラップを
濃度約８０％に濃縮して助晶機にとり、種晶としてトレ
ハロース含水結晶粉末約１％を加え、攪拌しつつ徐冷、
晶出させた。次いで、バスケット型遠心分離機で分蜜
し、結晶を少量の水でスプレーし、洗浄して高純度トレ
ハロース含水結晶を固形物当たり約２０％の収率で得
た。本品は、実験２２と同様の理化学的性質を示し、甘
味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして、各
種飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利
用できる。更には、工業試薬、化学原料などに利用する
ことも有利に実施できる。[Example A-6] The syrup obtained by the method of Example A-5 was concentrated to a concentration of about 80% and placed in an auxiliary crystallizer, to which about 1% of trehalose hydrous crystalline powder was added as a seed crystal and gradually cooled with stirring. ,
Crystallized. Then, the mixture was mashed with a basket type centrifuge, and the crystals were sprayed with a small amount of water and washed to obtain high-purity trehalose-containing crystals in a yield of about 20% based on solids. This product exhibits the same physicochemical properties as in Experiment 22, and can be advantageously used as various sweeteners, taste improvers, quality improvers, stabilizers and the like in various compositions such as various foods and drinks, cosmetics and pharmaceuticals. Further, it can be advantageously used as an industrial reagent or a chemical raw material.

【０１４１】[0141]

【実施例Ａ−７】濃度１０％とうもろこし澱粉乳（ｐＨ
５．５）にα−アミラーゼ『スピターゼＨＳ』を澱粉グ
ラム当たり２単位加えて撹拌下、加熱糊化・液化させ、
直ちにオートクレイブ（１２０℃）を２０分間行った
後、温度５５℃、ｐＨ５．０に調整した。これにイソア
ミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラ
ム当たり３００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化学
工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位の割合に
なるように加えて２４時間反応させ、次いで、９５℃に
加熱して酵素を失活させ、濾過、脱色して、マルトース
含量約９２％の糖液を得た。糖源として、前述の糖液を
別滅菌して固形物当たり１０ｗ／ｖ％を追加した以外
は、実験１５の方法に準じて調製した栄養培地をファー
メンターにとり、これにマルトース・トレハロース変換
酵素産生能を有するサーマス・アクアティカスＡＴＣＣ
３３９２３の種培養物を１ｖ／ｖ％植菌し、実験１５
と同様に６０℃で４０時間通気撹拌培養し、更に、界面
活性剤『Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００』を０．１ｖ／ｖ％
及び培養液１ｌ当たり卵白リゾチーム５０ｍｇを加えて
１６時間培養を続けた。この培養物を濾過して不溶物を
除去し、得られる濾液を、９５℃に加熱して酵素を失活
させた後、濃縮し、常法に従って活性炭で脱色・濾過
し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物当た
り約５５％の収率で得た。本品は、固形物当たりトレハ
ロースを約６８％含有しており、温和な甘味、適度の粘
度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形
剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成
物に有利に利用できる。[Example A-7] Corn starch milk (pH 10%)
To 5.5), add 2 units of α-amylase "Spitase HS" per gram of starch and heat-gelatinize / liquefy under stirring.
Immediately after autoclaving (120 ° C.) for 20 minutes, the temperature was adjusted to 55 ° C. and pH 5.0. Isoamylase (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratory Co., Ltd.) was added to this at 300 units per gram of starch and β-amylase (Nagase Seikagaku Co., Ltd.) at a ratio of 20 units per gram of starch, and reacted for 24 hours. Then, it was heated to 95 ° C. to inactivate the enzyme, filtered and decolorized to obtain a sugar solution having a maltose content of about 92%. As a sugar source, a nutrient medium prepared according to the method of Experiment 15 was placed in a fermenter except that the above-mentioned sugar solution was separately sterilized and 10 w / v% was added per solid matter, and maltose / trehalose-converting enzyme production was performed on the nutrient medium. Thermus Aquaticus ATCC with ability
The seed culture of 33923 was inoculated with 1 v / v% and experiment 15
Similarly, culture with aeration and stirring at 60 ° C. for 40 hours, and then add 0.1% v / v% of the surfactant “Triton X-100”.
And 50 mg of egg white lysozyme was added per 1 liter of the culture solution, and the culture was continued for 16 hours. This culture was filtered to remove insoluble matter, and the resulting filtrate was heated to 95 ° C. to deactivate the enzyme, then concentrated, decolorized and filtered with activated carbon according to a conventional method, and H-type and OH-type. It was desalted with an ion exchange resin, purified, and further concentrated to obtain a syrup having a concentration of about 70% in a yield of about 55% based on a solid matter. This product contains about 68% trehalose per solid, has mild sweetness, moderate viscosity and moisturizing property, and is used as a sweetener, taste improver, stabilizer, excipient, etc. for various foods and drinks. , It can be advantageously used for various compositions such as cosmetics and pharmaceuticals.

【０１４２】[0142]

【実施例Ａ−８】実施例Ａ−７の方法で得たシラップを
濃度約８５％に濃縮して助晶機にとり、種晶約１％を混
合した後、バットにとり、２０℃で４日間静置して晶出
固化させ、次いで切削機にて粉砕し、乾燥して含蜜型ト
レハロース含水結晶粉末を固形物当たり約９５％の収率
で得た。本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容
易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤な
どとして、各種飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成
物に有利に利用できる。[Example A-8] The syrup obtained by the method of Example A-7 was concentrated to a concentration of about 85% and placed in an auxiliary crystallizer. After mixing about 1% of seed crystals, the syrup was placed in a vat and kept at 20 ° C for 4 days. The mixture was left to stand to be crystallized and solidified, then pulverized with a cutting machine and dried to obtain a trehalose hydrous crystal powder containing honey in a yield of about 95% based on solids. This product has virtually no hygroscopicity, is easy to handle, and is useful as a sweetener, taste improver, quality improver, stabilizer, etc. for various compositions such as food and drink, cosmetics, and pharmaceuticals. Available for

【０１４３】[0143]

【実施例Ａ−９】実施例Ａ−７の方法で得たシラップを
濃度約８０％に濃縮して助晶機にとり、実施例Ａ−６と
同様に晶出、分蜜して高純度のトレハロース含水結晶を
固形物当たり約２０％の収率で得た。本品は、実験２２
と同様の理化学的性質を示し、実施例Ａ−６と同様に、
各種飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成物、更に
は、工業試薬、工業原料、化学原料などに有利に利用で
きる。Example A-9 The syrup obtained by the method of Example A-7 is concentrated to a concentration of about 80% and taken in an auxiliary crystallizer. Crystallization is performed in the same manner as in Example A-6. Water-containing trehalose crystals were obtained in a yield of about 20% based on solids. Experiment 22
Showing the same physicochemical properties as in Example A-6,
It can be advantageously used for various compositions such as various foods and drinks, cosmetics and pharmaceuticals, as well as industrial reagents, industrial raw materials and chemical raw materials.

【０１４４】[0144]

【実施例Ｂ−１ 甘味料】実施例Ａ−３の方法で得たト
レハロース含水結晶粉末１重量部に、α−グリコシルス
テビオシド（東洋精糖株式会社販売『αＧスイート』）
０．０１重量部及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル（味の素株式会社販売『アスパル
テーム』）０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成型機
にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優
れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有し、甘味度当たりカロリ
ーは、蔗糖の約１／２に低下している。本甘味料は、そ
れに配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優
れており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制
限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲
食物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味
料は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グル
カンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物な
どに対する甘味付けにも好適である。[Example B-1 Sweetener] 1 part by weight of trehalose hydrous crystal powder obtained by the method of Example A-3 was mixed with α-glycosyl stevioside (“αG sweet” sold by Toyo Seika Co., Ltd.).
0.01 parts by weight and 0.01 parts by weight of L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (“Aspartame” sold by Ajinomoto Co., Inc.) were uniformly mixed and subjected to a granule molding machine to obtain a granular sweetener. This product has an excellent sweetness and has about twice the sweetness of sucrose, and the calorie per sweetness is reduced to about 1/2 that of sucrose. This sweetener has excellent stability without decomposition of the high-intensity sweeteners mixed in it, and as a low-calorie sweetener, it is a low-calorie food and drink for obese people, diabetics, etc. whose calorie intake is restricted. It is suitable for sweetening things. Further, the present sweetener is suitable for sweetening foods and beverages that suppress tooth decay because it produces less acid due to cavities-inducing bacteria and less insoluble glucan.

【０１４５】[0145]

【実施例Ｂ−２ ハードキャンディー】濃度５５％蔗糖
溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得たトレハロ
ース含有シラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧
下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン
酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、
常法に従って成型し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈
味良好で、蔗糖の晶出、変形も起こらない高品質のハー
ドキャンディーである。[Example B-2 Hard candy] 100 parts by weight of a 55% sucrose solution were mixed with 30 parts by weight of the trehalose-containing syrup obtained by the method of Example A-1 by heating, and then the water content was reduced to less than 2% under reduced pressure. Concentrate by heating, mix with 1 part by weight of citric acid and an appropriate amount of lemon flavor and color,
A product was obtained by molding according to a conventional method. This product is a high-quality hard candy that is crisp, has a good taste, and does not crystallize or deform sucrose.

【０１４６】[0146]

【実施例Ｂ−３ チョコレート】カカオペースト４０重
量部、カカオバター１０重量部、蔗糖３０重量部、実施
例Ａ−６の方法で得た高純度トレハロース含水結晶２０
重量部を混合してレファイナーに通して粒度を下げた
後、コンチェに入れて５０℃で２昼夜練り上げる。この
間に、レシチン０．５重量部を加え、充分に混和分散さ
せた。次いで、温度調節機で３１℃に調節し、バターの
固まる直前に型に流し込み、振動機でアワ抜きを行い、
１０℃の冷却トンネルを２０分間くぐらせて固化させ
た。これを型抜きして包装し製品を得た。本品は、吸湿
性がなく、色、光沢共によく、内部組織も良好で、口中
でなめらかに溶け、上品な甘味とまろやかな風味を有す
る。[Example B-3 Chocolate] 40 parts by weight of cocoa paste, 10 parts by weight of cocoa butter, 30 parts by weight of sucrose, high-purity trehalose hydrous crystal 20 obtained by the method of Example A-6
After mixing parts by weight and passing through a refiner to reduce the particle size, the mixture is put in a conche and kneaded at 50 ° C. for 2 days and nights. During this period, 0.5 part by weight of lecithin was added and thoroughly mixed and dispersed. Next, adjust the temperature to 31 ° C with a temperature controller, pour into the mold immediately before the butter hardens, and remove the foam with a vibrator.
It was solidified by passing through a 10 ° C. cooling tunnel for 20 minutes. This was die-cut and packaged to obtain a product. This product has no hygroscopicity, has good color and gloss, has a good internal structure, melts smoothly in the mouth, and has an elegant sweetness and mellow flavor.

【０１４７】[0147]

【実施例Ｂ−４ チューインガム】ガムベース３重量部
を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部
及び実施例Ａ−３の方法で得たトレハロース含水結晶粉
末３重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合
し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包
装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも良
好なチューインガムである。[Example B-4 Chewing gum] 3 parts by weight of a gum base was heated and melted to a softness, and 4 parts by weight of sucrose and 3 parts by weight of the trehalose hydrous crystal powder obtained by the method of Example A-3 were added to the chewing gum. A proper amount of flavor and color was mixed, and kneaded by a roll, molded and packaged according to a conventional method to obtain a product. This product is a chewing gum with good texture and flavor.

【０１４８】[0148]

【実施例Ｂ−５ 加糖練乳】原乳１００重量部に実施例
Ａ−５の方法で得たトレハロース含有シラップ３重量部
及び蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺
菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して
製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼
児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味
用に有利に利用できる。Example B-5 Sweetened condensed milk: In 100 parts by weight of raw milk, 3 parts by weight of the trehalose-containing syrup obtained by the method of Example A-5 and 1 part by weight of sucrose were dissolved, sterilized by heating with a plate heater, and then the concentration was 70. %, And aseptically canned to obtain the product. The product has a mild sweetness and a good flavor, and can be advantageously used for seasoning baby food, fruit, coffee, cocoa, tea and the like.

【０１４９】[0149]

【実施例Ｂ−６ 乳酸菌飲料】脱脂粉乳１７５重量部、
実施例Ａ−２の方法で得たトレハロース高含有粉末８０
重量部及び特開平４−２８１７９５号公報で開示されて
いるラクトスクロース高含有粉末５０重量部を水１，２
００重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃
に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターター
を３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲
料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。ま
た、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持す
るだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。[Example B-6 Lactic acid bacterium beverage] 175 parts by weight of skim milk powder,
Powder containing a high amount of trehalose obtained by the method of Example A-2 80
1 part by weight and 50 parts by weight of the powder containing a high amount of lactosucrose disclosed in JP-A-4-281795 are added to water 1,2.
Dissolve in 00 parts by weight, sterilize at 65 ℃ for 30 minutes, 40 ℃
After cooling to 30 ° C., in accordance with a conventional method, 30 parts by weight of a starter of lactic acid bacteria was inoculated and cultured at 37 ° C. for 8 hours to obtain a lactic acid bacteria drink. This product is a lactic acid bacteria beverage with good flavor. In addition, the product contains oligosaccharides and not only stably retains lactic acid bacteria, but also has a bifidobacterium growth promoting effect.

【０１５０】[0150]

【実施例Ｂ−７ 粉末ジュース】噴霧乾燥により製造し
たオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−６
の方法で得た高純度トレハロース含水結晶５０重量部、
蔗糖１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ
酸０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量部、ク
エン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部、粉
末香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれ
を流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これ
に、実施例Ａ−５の方法で得たトレハロース高含有シラ
ップをバインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、
計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０
％の粉末ジュースである。また、本品は異味、異臭がな
く、長期に安定であった。[Example B-7 Powdered juice] Example A-6 was prepared based on 33 parts by weight of orange juice powder prepared by spray drying.
50 parts by weight of high-purity trehalose hydrous crystal obtained by the method of
Sucrose 10 parts by weight, anhydrous citric acid 0.65 parts by weight, malic acid 0.1 parts by weight, L-ascorbic acid 0.1 parts by weight, sodium citrate 0.1 parts by weight, pullulan 0.5 parts by weight, powdered flavor An appropriate amount was thoroughly mixed and stirred, pulverized into a fine powder, charged into a fluidized bed granulator, and the exhaust air temperature was set to 40 ° C., and the trehalose-rich syrup obtained by the method of Example A-5 was used as a binder. Spray, granulate for 30 minutes,
The product was obtained by weighing and packaging. This product has a fruit juice content of about 30.
% Powdered juice. In addition, this product had no offensive taste or odor and was stable for a long period of time.

【０１５１】[0151]

【実施例Ｂ−８ カスタードクリーム】コーンスターチ
１００重量部、実施例Ａ−１の方法で得たトレハロース
含有シラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗
糖２０重量部及び食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２
８０重量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳１，０
００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて撹拌
を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明
になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香
料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、
なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。Example B-8 Custard Cream 100 parts by weight of corn starch, 100 parts by weight of syrup containing trehalose obtained by the method of Example A-1, 80 parts by weight of maltose, 20 parts by weight of sucrose and 1 part by weight of salt were thoroughly mixed. , Chicken eggs 2
Add 80 parts by weight and stir, then boil the milk 1,0
00 parts by weight was gradually added, and the mixture was further heated and stirred, and when the cornstarch was completely gelatinized and the whole became translucent, turn off the heat, cool it, add an appropriate amount of vanilla flavor, and measure. The product was filled, packed, and obtained. This product is
It has a smooth luster and is mildly sweet and delicious.

【０１５２】[0152]

【実施例Ｂ−９ ういろうの素】米粉９０重量部に、コ
ーンスターチ２０重量部、蔗糖４０重量部、実施例Ａ−
３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末８０重量部及
びプルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製
造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、こ
れを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製
造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風味も良
い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良い。[Example B-9 Uironomoto] 90 parts by weight of rice flour, 20 parts by weight of corn starch, 40 parts by weight of sucrose, Example A-
80 parts by weight of trehalose hydrous crystal powder obtained by the method of 3 and 4 parts by weight of pullulan were uniformly mixed to produce iuirosin. Uironin, an appropriate amount of matcha and water were kneaded, put in a container and steamed for 60 minutes to produce matcha uiro. This product has good shine, mouthfeel, and flavor. In addition, the aging of starch is suppressed and the shelf life is good.

【０１５３】[0153]

【実施例Ｂ−１０ あん】原料あずき１０重量部に、常
法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし
て、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重
量部を得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例Ａ
−７の方法で得たトレハロース含有シラップ５重量部及
び水４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイ
ルを加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、製品
のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼けもなく、舌
ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まんじゅう、だ
んご、もなか、氷菓などのあん材料として好適である。[Example B-10 Apricot] 10 parts by weight of raw azuki bean was added with water according to a conventional method, and boiled, astringently cut, and drained to remove water-soluble impurities, and about 21 parts by weight of azuki bean paste. Obtained. This raw bean paste, 14 parts by weight of sucrose, Example A
Add 5 parts by weight of trehalose-containing syrup obtained by the method of -7 and 4 parts by weight of water, boil, and add a small amount of salad oil to the mixture to knead it so as not to break the mash and obtain about 35 parts by weight of bean paste. It was This product has no color burn, has a good texture, and has a good flavor, and is suitable as an ingredient for red bean bread, steamed bun, dumpling, monaka, frozen dessert and the like.

【０１５４】[0154]

【実施例Ｂ−１１ パン】小麦粉１００重量部、イース
ト２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−２の方法で得た
トレハロース高含有粉末１重量部及び無機フード０．１
重量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２
時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。本
品は、色相、すだちともに良好で適度な弾力、温和な甘
味を有する高品質のパンである。[Example B-11 Bread] 100 parts by weight of wheat flour, 2 parts by weight of yeast, 5 parts by weight of sugar, 1 part by weight of trehalose-rich powder obtained by the method of Example A-2, and 0.1 parts of inorganic food.
According to a conventional method, knead parts by weight with water, and add 2 seeds at 26 ° C.
Fermented for a period of time, then aged for 30 minutes and baked. This product is a high-quality bread with good hue and color, moderate elasticity and mild sweetness.

【０１５５】[0155]

【実施例Ｂ−１２ ハム】豚もも肉１，０００重量部に
食塩１５重量部及び硝酸カリウム３重量部を均一にすり
込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量
部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例
Ａ−２の方法で得たトレハロース高含有粉末４０重量部
及び香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次
いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、燻
煙し、クッキングし、冷却包装して製品を得た。本品
は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。[Example B-12 Ham] 1,000 parts by weight of pork thigh meat are uniformly rubbed with 15 parts by weight of salt and 3 parts by weight of potassium nitrate, and are deposited in a cold room for one day. 500 parts by weight of water, 100 parts by weight of salt, 3 parts by weight of potassium nitrate, 40 parts by weight of trehalose-rich powder obtained by the method of Example A-2 and spices are soaked in a salting solution for 7 days in a cold room, and then, According to a conventional method, the product was washed with cold water, wrapped with a string, smoked, cooked, and cold-packed to obtain a product. This product is a high quality ham with good color and good flavor.

【０１５６】[0156]

【実施例Ｂ−１３ 粉末ペプチド】濃度４０％食品用大
豆ペプチド溶液（不二製油株式会社製『ハイニュート
Ｓ』）１重量部に、実施例Ａ−６の方法で得た高純度ト
レハロース含水結晶２重量部を混合し、プラスチック製
バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプ
チドを得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓
などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管
流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に
利用できる。Example B-13 Powder Peptide 1 part by weight of a soybean peptide solution for foods (“High New S” manufactured by Fuji Oil Co., Ltd.) at a concentration of 40% was added to a high-purity trehalose hydrous crystal obtained by the method of Example A-6. 2 parts by weight were mixed, put in a plastic vat, dried under reduced pressure at 50 ° C., and pulverized to obtain a powdered peptide. The product has a good flavor and can be advantageously used not only as a material for confectionery such as premixes and frozen desserts, but also as a baby food such as oral liquid food and tube liquid food, and a therapeutic nutrient.

【０１５７】[0157]

【実施例Ｂ−１４ 粉末味噌】赤味噌１重量部に実施例
Ａ−４の方法で得た無水結晶トレハロース粉末３重量部
を混合し、多数の半球状凹部を設けた金属板に流し込
み、これを室温下で一夜静置して固化し、離型して１個
当たり約４ｇの固形味噌を得、これを粉砕機にかけて粉
末味噌を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの
調味料として有利に利用できる。また、固形味噌は、固
形調味料としてだけでなく味噌菓子などとしても利用で
きる。Example B-14 Powdered Miso 3 parts by weight of the anhydrous crystalline trehalose powder obtained by the method of Example A-4 were mixed with 1 part by weight of red miso and poured into a metal plate having a large number of hemispherical recesses. The mixture was allowed to stand overnight at room temperature to solidify, and the mold was released to obtain about 4 g of solid miso, and the solid miso was crushed to obtain a powdered miso. This product can be advantageously used as a seasoning for instant ramen, instant soup, etc. The solid miso can be used not only as a solid seasoning but also as a miso confectionery or the like.

【０１５８】[0158]

【実施例Ｂ−１５ 粉末卵黄】生卵から調製した卵黄を
プレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得ら
れる液状卵黄１重量部に対して、実施例Ａ−４の方法で
得た無水結晶トレハロース粉末４重量部の割合で混合し
た後バットに移し、一夜放置して、トレハロース含水結
晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削
機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。本品は、プレミ
ックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみなら
ず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養
剤などとしても有利に利用できる。また、美肌剤、育毛
剤などとしても有利に利用できる。Example B-15 Powdered Egg Yolk Egg yolk prepared from raw eggs is sterilized by a plate-type heat sterilizer at 60 to 64 ° C., and 1 part by weight of the obtained liquid yolk is obtained by the method of Example A-4. The anhydrous crystalline trehalose powder was mixed at a ratio of 4 parts by weight, transferred to a vat and left overnight to be converted into trehalose hydrous crystals to prepare a block. This block was pulverized with a cutting machine to obtain powder egg yolk. The product can be advantageously used not only as a material for confectionery such as premixes, frozen desserts and emulsifiers, but also as baby foods such as oral liquid foods and tube liquid foods, nutritional supplements for therapy and the like. Further, it can be advantageously used as a skin beautifying agent, a hair restorer and the like.

【０１５９】[0159]

【実施例Ｂ−１６ 化粧用クリーム】モノステアリン酸
ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モ
ノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−２の方
法で得たトレハロース高含有粉末２重量部、α−グリコ
シル ルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、トリ
オクタン酸グリセリル１０重量部及び防腐剤の適量を、
常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、
１，３−ブチレングリコール５重量部及び精製水６６重
量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の
適量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。本品は、
抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、
美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。Example B-16 Cosmetic Cream 2 parts by weight of polyoxyethylene glycol monostearate, 5 parts by weight of self-emulsifying glyceryl monostearate, 2 parts by weight of trehalose-rich powder obtained by the method of Example A-2, 1 part by weight of α-glycosyl rutin, 1 part by weight of liquid paraffin, 10 parts by weight of glyceryl trioctanoate, and an appropriate amount of a preservative,
It is heated and dissolved according to a conventional method, and 2 parts by weight of L-lactic acid is added thereto.
5 parts by weight of 1,3-butylene glycol and 66 parts by weight of purified water were added, emulsified by applying a homogenizer, and an appropriate amount of flavor was further added and mixed with stirring to prepare a cream. This product is
Has high anti-oxidant, high stability, high quality sunscreen,
It can be advantageously used as a skin beautifying agent and a whitening agent.

【０１６０】[0160]

【実施例Ｂ−１７ 粉末薬用人参エキス】薬用人参エキ
ス０．５重量部に実施例Ａ−４の方法で得た無水結晶ト
レハロース粉末１．５重量部を混捏した後、バットに移
し、２日間放置してトレハロース含水結晶に変換させブ
ロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化
し、分級して粉末薬用人参エキスを得た。本品を適量の
ビタミンＢ１及びビタミンＢ２粉末とともに顆粒成型機
にかけ、ビタミン含有顆粒状薬用人参エキスとした。本
品は、疲労回復剤、強壮、強精剤などとして有利に利用
できる。また、育毛剤などとしても利用できる。[Example B-17 Powdered ginseng extract] 0.5 part by weight of ginseng extract was mixed with 1.5 parts by weight of the anhydrous crystalline trehalose powder obtained by the method of Example A-4, and the mixture was transferred to a vat for 2 days. The mixture was allowed to stand and converted into trehalose hydrous crystals to prepare blocks. This block was pulverized with a cutting machine and classified to obtain a powdered ginseng extract. This product was granulated with a proper amount of Vitamin B1 and Vitamin B2 powder in a granulating machine to obtain a vitamin-containing granular ginseng extract. This product can be advantageously used as a fatigue recovery agent, tonic, tonic agent, etc. It can also be used as a hair restorer.

【０１６１】[0161]

【実施例Ｂ−１８ 固体製剤】ヒト天然型インターフェ
ロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製）を、常
法に従って、固定化抗ヒトインターフェロン−α抗体カ
ラムにかけ、該標品に含まれるヒト天然型インターフェ
ロン−αを吸着させ、安定剤であるウシ血清アルブミン
を素通りさせて除去し、次いで、ｐＨを変化させて、ヒ
ト天然型インターフェロン−αを実施例Ａ−６の方法で
得た高純度トレハロース含水結晶を５％含有する生理食
塩水を用いて溶出した。本液を精密濾過し、約２０倍量
の無水結晶マルトース粉末、株式会社林原商事販売『フ
ァイントース』に加えて脱水、粉末化し、これを打錠機
にて打錠し、１錠（約２００ｍｇ）当たりヒト天然型イ
ンターフェロン−αを約１５０単位含有する錠剤を得
た。本品は、舌下錠などとして、一日当たり、大人１乃
至１０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性疾患、ア
レルギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫瘍などの
治療に有利に利用できる。とりわけ、近年、患者数の急
増しているエイズ、肝炎などの治療剤として有利に利用
できる。本品は、本発明の非還元性糖質と無水結晶マル
トースが共に安定剤として作用し、室温で放置してもそ
の活性を長期間よく維持する。[Example B-18 Solid formulation] A human natural interferon-α preparation (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratory Co., Ltd.) was applied to an immobilized anti-human interferon-α antibody column according to a conventional method, and contained in the preparation. Human natural interferon-α was adsorbed and the stabilizer, bovine serum albumin, was passed through to remove it, and then the pH was changed to obtain human natural interferon-α obtained by the method of Example A-6. Elution was performed using physiological saline containing 5% pure trehalose hydrous crystals. This solution is subjected to microfiltration and dehydrated and pulverized by adding about 20 times the amount of anhydrous crystalline maltose powder and "Fine Tose" sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd., and tabletted with a tableting machine to give 1 tablet (about 200 mg. ), A tablet containing about 150 units of human natural interferon-α was obtained. As a sublingual tablet, about 1 to 10 tablets for adults are orally administered per day, and this product can be advantageously used for treatment of viral diseases, allergic diseases, rheumatism, diabetes, malignant tumors and the like. In particular, it can be advantageously used as a therapeutic agent for AIDS, hepatitis, etc., for which the number of patients is increasing rapidly in recent years. In this product, the non-reducing sugar of the present invention and anhydrous crystalline maltose both act as stabilizers, and their activity is maintained well for a long period of time even when left at room temperature.

【０１６２】[0162]

【実施例Ｂ−１９ 糖衣錠】重量１５０ｍｇの素錠を芯
剤とし、これに実施例Ａ−９の方法で得た高純度トレハ
ロース含水結晶４０重量部、プルラン（平均分子量２０
万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部及び酸
化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が
約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じトレハロ
ース含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部及び水
３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、
ロウ液で艶出しして光沢の在る外観の優れた糖衣錠を得
た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間
維持する。Example B-19 Sugar-coated tablet A plain tablet having a weight of 150 mg was used as a core, to which 40 parts by weight of high-purity trehalose hydrous crystals obtained by the method of Example A-9 and pullulan (average molecular weight 20
10,000 parts), 2 parts by weight, 30 parts by weight of water, 25 parts by weight of talc and 3 parts by weight of titanium oxide were used to sugar-coat until the tablet weight became about 230 mg, and then 65 parts by weight of the same trehalose hydrous crystalline powder. , A coating solution consisting of 1 part by weight of pullulan and 34 parts by weight of water, sugar coating, and
It was polished with a wax solution to obtain a sugar-coated tablet having an excellent glossy appearance. The product has excellent impact resistance and maintains high quality for a long time.

【０１６３】[0163]

【実施例Ｂ−２０ 練歯磨】 配合 第２リン酸カルシウム ４５．０重量部 プルラン ２．９５重量部 ラウリル硫酸ナトリウム １．５重量部 グリセリン ２０．０重量部 ポリオキシエチレンソルビタンラウレート ０．５重量部 防腐剤 ０．０５重量部 実施例Ａ−８の方法で得たトレハロース含水結晶粉末 １２．０重量部 マルチトール ５．０重量部 水 １３．０重量部 上記の材料を常法に従って混合し、練歯磨を得た。本品
は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として
好適である。[Example B-20 Toothpaste] Compounded dicalcium phosphate 45.0 parts by weight Pullulan 2.95 parts by weight Sodium lauryl sulfate 1.5 parts by weight Glycerin 20.0 parts by weight Polyoxyethylene sorbitan laurate 0.5 parts by weight Antiseptic Agent 0.05 part by weight Trehalose hydrous crystal powder obtained by the method of Example A-8 12.0 parts Maltitol 5.0 parts water 13.0 parts by weight The above materials are mixed according to a conventional method, and toothpaste is prepared. Got This product has a moderate sweetness and is particularly suitable as a toothpaste for children.

【０１６４】[0164]

【実施例Ｂ−２１ 流動食用固体製剤】実施例Ａ−６の
方法で製造した高純度トレハロース含水結晶５００重量
部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩
化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量
部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量
部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミン
Ｅアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０
４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラ
ムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールし
て製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍ
ｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、
腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネ
ルギー補給用に有利に利用できる。[Example B-21 Solid formulation for liquid foods] 500 parts by weight of high-purity trehalose hydrous crystals produced by the method of Example A-6, 270 parts by weight of powdered egg yolk, 209 parts by weight of skim milk powder, 4.4 parts by weight of sodium chloride, 1.8 parts by weight of potassium chloride, 4 parts by weight of magnesium sulfate, 0.01 part by weight of thiamine, 0.1 part by weight of sodium ascorbate, 0.6 part by weight of vitamin E acetate and 0.0 part of nicotinic acid amide.
A compound consisting of 4 parts by weight was prepared, and 25 g of this compound was filled in a moisture-proof laminated pouch and heat-sealed to obtain a product. This product is about 150 to 300m per bag
Orally, or nasal cavity, stomach,
It is used in the intestine and the like by a tube-based method, and can be advantageously used for supplying energy to the living body.

【０１６５】[0165]

【実施例Ｂ−２２ 輸液剤】実施例Ａ−６の方法で製造
した高純度トレハロース含水結晶を水に濃度約１０ｗ／
ｖ％に溶解し、次いで、常法に従って、精密濾過してパ
イロジェンフリーとし、プラスチック製ボトルに無菌的
に充填し施栓して製品を得た。本品は、経日変化もなく
安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などに投与するのに好
適である。本品は濃度１０ｗ／ｖ％で血液と等張で、グ
ルコースの場合の２倍濃度でエネルギー補給できる。[Example B-22 Infusion] A highly pure trehalose-containing crystal produced by the method of Example A-6 was added to water to a concentration of about 10 w /.
It was dissolved in v% and then microfiltered by a conventional method to make it pyrogen-free, and aseptically filled in a plastic bottle and stoppered to obtain a product. This product is a stable infusion solution that does not change over time and is suitable for intravenous, intraperitoneal, etc. administration. This product is isotonic with blood at a concentration of 10 w / v% and can be supplemented with energy at twice the concentration of glucose.

【０１６６】[0166]

【実施例Ｂ−２３ 輸液剤】実施例Ａ−９の方法で製造
した高純度トレハロース含水結晶と下記の組成のアミノ
酸配合物とがそれぞれ５ｗ／ｖ％、３０ｗ／ｖ％になる
ように水に混合溶解し、次いで実施例Ｂ−２２と同様に
精製してパイロジェンフリーとし、更に、プラスチック
製バックに充填し施栓して製品を得た。 アミノ酸配合物の組成（ｍｇ／１００ｍｌ） Ｌ−イソロイシン １８０ Ｌ−ロイシン ４１０ Ｌ−リジン塩酸塩 ６２０ Ｌ−メチオニン ２４０ Ｌ−フェニルアラニン ２９０ Ｌ−スレオニン １８０ Ｌ−トリプトファン ６０ Ｌ−バリン ２００ Ｌ−アルギニン塩酸塩 ２７０ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １３０ グリシン ３４０ 本品は、糖質とアミノ酸との複合輸液剤にもかかわら
ず、トレハロースが還元性を示さないため、経日変化も
なく安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などへ投与するの
に好適である。本品は、生体へのエネルギー補給のみな
らず、アミノ酸補給のためにも有利に利用できる。[Example B-23 Infusion] A high-purity trehalose hydrous crystal produced by the method of Example A-9 and an amino acid mixture having the following composition were dissolved in water to give 5 w / v% and 30 w / v%, respectively. It was mixed and dissolved, and then purified in the same manner as in Example B-22 to be pyrogen-free, further, filled in a plastic bag and stoppered to obtain a product. Composition of amino acid formulation (mg / 100 ml) L-isoleucine 180 L-leucine 410 L-lysine hydrochloride 620 L-methionine 240 L-phenylalanine 290 L-threonine 180 L-tryptophan 60 L-valine 200 L-arginine hydrochloride 270 L-histidine hydrochloride 130 glycine 340 This product is a stable infusion solution that does not change over time because trehalose does not show reducibility despite the complex infusion solution of sugar and amino acid. It is suitable for administration to the inside. This product can be advantageously used not only for supplying energy to the living body but also for supplying amino acids.

【０１６７】[0167]

【実施例Ｂ−２４ 外傷治療用膏薬】実施例Ａ−８の方
法で製造したトレハロース含水結晶粉末２００重量部及
びマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解し
たメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ
％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の
延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、ヨ
ウ素による殺菌作用のみならず、トレハロースによる細
胞へのエネルギー補給剤としても作用することから、治
癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。Example B-24 Ointment for Treatment of Wounds To 200 parts by weight of trehalose hydrous crystal powder and 300 parts by weight of maltose produced by the method of Example A-8, 50 parts by weight of methanol in which 3 parts by weight of iodine were dissolved was added and mixed. , 10 w / v
% 200 parts by weight pullulan aqueous solution was added and mixed to obtain a plaster for treating wounds, which has a proper extension and shows adhesiveness. This product not only acts as a bactericidal action by iodine, but also acts as an energy supplement to cells by trehalose, so the healing period is shortened and the wound surface is healed cleanly.

【０１６８】[0168]

【発明の効果】上記から明らかなように、マルトースを
含有せしめた栄養培地に、マルトース・トレハロース変
換酵素産生能を有する微生物を培養することにより、培
養物から非還元性糖質を極めて簡便、短時間に製造する
ことができることとなり、トレハロース、又は、これを
含む糖質の工業的な製造を容易にする。また、マルトー
スとして、澱粉を液化した溶液にβ−アミラーゼ又はβ
−アミラーゼとともに澱粉枝切酵素を作用させて得られ
るマルトースを利用すれば、澱粉からのトレハロース収
量を著しく高め、その工業的な製造を容易にする。この
ようにして得られるトレハロース又はこれを含む糖質
は、安定性に優れ、良質で上品な甘味を有している。ま
た、経口摂取により消化吸収され、カロリー源となる。
とりわけ、トレハロースは非経口的にも使用され、よく
代謝利用される。従って、本発明のトレハロース、又
は、これを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良
剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、
医薬品など各種組成物に有利に利用できる。As is apparent from the above, by culturing a microorganism capable of producing maltose / trehalose converting enzyme in a nutrient medium containing maltose, a non-reducing sugar can be extremely easily and shortly obtained from the culture. Since it can be produced in a short time, it facilitates the industrial production of trehalose or a sugar containing the same. Further, as maltose, β-amylase or β-amylase was added to a liquefied starch solution.
Utilizing maltose obtained by allowing starch debranching enzyme to act together with amylase significantly enhances the yield of trehalose from starch and facilitates its industrial production. The trehalose or the sugar containing the trehalose thus obtained is excellent in stability, has a good quality and has an elegant sweetness. Also, it is digested and absorbed by ingestion and becomes a calorie source.
In particular, trehalose is also used parenterally and is often metabolically utilized. Therefore, the trehalose of the present invention, or a sugar containing the trehalose is used as a sweetener, a taste improver, a quality improver, a stabilizer, an excipient, etc.
It can be advantageously used for various compositions such as pharmaceuticals.

【０１６９】本発明の確立は、安価で無限の資源である
澱粉から、従来望むべくして容易に得られなかったトレ
ハロース、又は、これを含む糖質を工業的に大量かつ安
価に提供できる全く新しい道を拓くこととなり、それが
与える影響は、食品、化粧品、医薬品業界は言うに及ば
ず、農水畜産業、化学工業にも及びこれら産業界に与え
る工業的意義は計り知れないものがある。The establishment of the present invention makes it possible to industrially provide a large amount of trehalose or a sugar containing the trehalose, which has not heretofore been easily obtained from starch, which is an inexpensive and unlimited resource, on an industrial scale. It opens up a new path, and its impact is not limited to the food, cosmetics and pharmaceutical industries, but also to the agricultural, aquatic and livestock industries, the chemical industry, and the industrial significance to these industries is immeasurable.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８のマル
トース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度
の影響を示す図である。FIG. 1 is a graph showing the effect of temperature on the enzyme activity of maltose-trehalose converting enzyme of Pimobacter plaques species R48.

【図２】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８のマル
トース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすｐＨ
の影響を示す図である。[Fig. 2] pH on the enzyme activity of maltose-trehalose converting enzyme of Pimelobacter species R48.
It is a figure which shows the influence of.

【図３】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８のマル
トース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の
影響を示す図である。FIG. 3 is a graph showing the effect of temperature on the stability of maltose-trehalose converting enzyme of Pimobacter plaques species R48.

【図４】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８のマル
トース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすｐＨの
影響を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the effect of pH on the stability of maltose-trehalose-converting enzyme of Pimelobacter species R48.

【図５】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度の影
響を示す図である。FIG. 5 is a graph showing the effect of temperature on the enzyme activity of Pseudomonas putida H262 maltose-trehalose converting enzyme.

【図６】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影
響を示す図である。FIG. 6 is a graph showing the effect of pH on the enzyme activity of maltose trehalose converting enzyme of Pseudomonas putida H262.

【図７】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の影響
を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing the effect of temperature on the stability of Pseudomonas putida H262 maltose trehalose converting enzyme.

【図８】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響
を示す図である。FIG. 8 shows the effect of pH on the stability of Pseudomonas putida H262 maltose trehalose converting enzyme.

【図９】サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２
３のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及
ぼす温度の影響を示す図である。FIG. 9: Thermus aquaticus ATCC3392
It is a figure which shows the influence of the temperature on the enzyme activity of the maltose trehalose converting enzyme of 3.

【図１０】サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９
２３のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に
及ぼすｐＨの影響を示す図である。FIG. 10: Thermus Aquaticus ATCC339
It is a figure which shows the influence of pH on the enzyme activity of the maltose trehalose converting enzyme of 23.

【図１１】サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９
２３のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及
ぼす温度の影響を示す図である。FIG. 11: Thermus Aquaticus ATCC339
It is a figure which shows the influence of the temperature on the stability of 23 maltose trehalose converting enzyme.

【図１２】サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９
２３のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及
ぼすｐＨの影響を示す図である。FIG. 12: Thermus Aquaticus ATCC339
It is a figure which shows the influence of pH on the stability of 23 maltose trehalose converting enzyme.

Claims (13)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 マルトースを含有せしめた栄養培地に、
マルトース・トレハロース変換酵素産生能を有する微生
物を培養し、得られるトレハロース、又は、これを含む
糖質。1. A nutrient medium containing maltose,
Trehalose obtained by culturing a microorganism capable of producing a maltose / trehalose converting enzyme, or a sugar containing the same. 【請求項２】 マルトースが、澱粉を液化したものに、
β−アミラーゼ又はβ−アミラーゼとともに澱粉枝切酵
素を作用させて得られるマルトースである請求項１記載
のトレハロース、又は、これを含む糖質。2. Maltose is liquefied starch,
The trehalose according to claim 1, which is β-amylase or maltose obtained by reacting β-amylase with starch debranching enzyme, or a sugar containing the same. 【請求項３】 微生物が、ピメロバクター属、シュード
モナス属及びサーマス属から選ばれる微生物であること
を特徴とする請求項１又は２記載のトレハロース、又
は、これを含む糖質。3. The trehalose according to claim 1, wherein the microorganism is a microorganism selected from the genus Pimelobacter, the genus Pseudomonas, and the genus Thermus, or the saccharide containing the trehalose. 【請求項４】 トレハロースが、含水結晶又は無水結晶
である請求項１、２又は３記載のトレハロース、又は、
これを含む糖質。4. The trehalose according to claim 1, 2 or 3, which is a water-containing crystal or an anhydrous crystal.
Carbohydrate containing this. 【請求項５】 マルトースを含有せしめた栄養培地に、
マルトース・トレハロース変換酵素産生能を有する微生
物を培養し、得られる培養物からトレハロース、又は、
これを含む糖質を採取することを特徴とするトレハロー
ス、又は、これを含む糖質の製造方法。5. A nutrient medium containing maltose,
A microorganism having the ability to produce maltose / trehalose converting enzyme is cultured, and trehalose or, from the obtained culture,
A method for producing trehalose or a saccharide containing the trehalose, which comprises collecting a saccharide containing the trehalose. 【請求項６】 栄養培地に、マルトースを２０ｗ／ｖ％
以下含有せしめることを特徴とする請求項５記載のトレ
ハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。6. Maltose is added to the nutrient medium at 20 w / v%.
The method for producing trehalose according to claim 5, or a saccharide containing the trehalose, which is contained below. 【請求項７】 栄養培地に、マルトースとともに界面活
性剤を含有せしめることを特徴とする請求項５又は６記
載のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。7. The method for producing trehalose according to claim 5 or 6, or a carbohydrate containing the same, wherein the nutrient medium contains a surfactant together with maltose. 【請求項８】 微生物が、ピメロバクター属、シュード
モナス属及びサーマス属から選ばれる微生物であること
を特徴とする請求項５、６又は７記載のトレハロース、
又は、これを含む糖質の製造方法。8. The trehalose according to claim 5, 6 or 7, wherein the microorganism is a microorganism selected from the genus Pimelobacter, the genus Pseudomonas and the genus Thermus.
Alternatively, a method for producing a sugar containing the same. 【請求項９】 培養が、回分法、連続法又は半連続法で
行われることを特徴とする請求項５、６、７又は８記載
のトレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。9. The method for producing trehalose according to claim 5, 6, 7 or 8, or a saccharide containing the trehalose, characterized in that the culture is carried out by a batch method, a continuous method or a semi-continuous method. 【請求項１０】 培養物又はこれから得られる糖質に、
グルコアミラーゼ、又はα−グルコシダーゼを作用させ
ることを特徴とする請求項５、６、７、８又は９記載の
トレハロース、又は、これを含む糖質の製造方法。10. A culture or a carbohydrate obtained therefrom,
A method for producing trehalose according to claim 5, 6, 7, 8 or 9, or a saccharide containing the same, wherein glucoamylase or α-glucosidase is allowed to act. 【請求項１１】 マルトースを含有せしめた栄養培地
に、マルトース・トレハロース変換酵素産生能を有する
微生物を培養し、得られるトレハロース、又は、これを
含む糖質を含有せしめた組成物。11. A composition comprising trehalose obtained by culturing a microorganism having maltose / trehalose converting enzyme-producing ability in a nutrient medium containing maltose, or a saccharide containing the trehalose. 【請求項１２】 トレハロースが、含水結晶又は無水結
晶である請求項１１記載の組成物。12. The composition according to claim 11, wherein trehalose is a water-containing crystal or an anhydrous crystal. 【請求項１３】 組成物が、飲食物、化粧品又は医薬品
であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の組成
物。13. The composition according to claim 11 or 12, wherein the composition is a food or drink, a cosmetic product, or a pharmaceutical product.