JP4070250B2 - Carbohydrate with reduced reducibility, its production method and use - Google Patents
Carbohydrate with reduced reducibility, its production method and use Download PDFInfo
- Publication number
- JP4070250B2 JP4070250B2 JP18221695A JP18221695A JP4070250B2 JP 4070250 B2 JP4070250 B2 JP 4070250B2 JP 18221695 A JP18221695 A JP 18221695A JP 18221695 A JP18221695 A JP 18221695A JP 4070250 B2 JP4070250 B2 JP 4070250B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- trehalose
- reducing
- enzyme
- starch
- molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Seasonings (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、還元性を低減させた糖質とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有してなる実質的に還元性を示さない糖質とその製造方法並びに用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、古くからトレハロース（α，α−トレハロース）が知られており、その存在は、『アドバンシズ・イン・カーボハイドレイト・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第１８巻、第２０１乃至２２５頁（１９６３年）アカデミック・プレス社（米国）及び『アプライド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第５６巻、第３２１３乃至３２１５頁（１９９０年）などにも記載されているように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など広範囲に及んでいる。トレハロースのような非還元性糖質は、アミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を起こさず、含アミノ酸物質を損なわないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることが期待され、その工業的製造方法の確立が望まれている。
【０００３】
トレハロースの製造方法としては、例えば、特開昭５０−１５４４８５公報で報告されている微生物菌体を用いる方法や、特開昭５８−２１６６９５公報で提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレハロース・ホスホリラーゼとの組合せでマルトースを変換する方法などが知られている。しかしながら、微生物菌体を用いる方法は、該菌体を出発原料とし、これに含まれるトレハロースの含量が、通常、固形物当り１５ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、ｗ／ｗ％を単に％と略称する）未満と低く、その上、これを抽出、精製する工程が煩雑で、工業的製造方法としては不適である。また、マルトース・ホスホリラーゼ及びトレハロース・ホスホリラーゼを用いる方法は、いずれもグルコース−１リン酸を経由しており、その基質濃度を高めることが困難であり、また、両酵素の反応系が可逆反応で目的物の生成率が低く、更には、両酵素の反応系を安定に維持して反応をスムーズに進行させることが困難であって、未だ、工業的製造方法として実現するに至っていない。
【０００４】
これに関係して、『月刊フードケミカル』、８月号、第６７乃至７２頁（１９９２年）、「澱粉利用開発の現状と課題」の「オリゴ糖」の項において、「トレハロースについては著しく広い応用範囲が考えられるが、本糖の澱粉糖質からの直接糖転移、加水分解反応を用いた酵素的生産は、現在のところ学術的には不可能であるといわれている。」と記載されているように、澱粉を原料とし、酵素反応によってトレハロースを製造することは、従来、学術的にも不可能であると考えられてきた。
【０００５】
一方、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元基を有し還元性を示すことが知られている。このような澱粉部分分解物を、本明細書では、還元性澱粉部分分解物と称する。一般に、還元性澱粉部分分解物は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレント（ＤｅｘｔｒｏｓｅＥｑｕｉｖａｌｅｎｔ，ＤＥ）として表している。この値の大きいものは、通常、分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあることが知られている。
【０００６】
このような還元性澱粉部分分解物の種々の特性は、ＤＥの大小に依存しており、還元性澱粉部分分解物とＤＥとの関係は極めて重要である。従来、当業界では、この関係を断ち切ることは不可能とさえ信じられてきた。
【０００７】
これを解決するために、本発明者等は、先に、特願平５−３４９２１６号明細書（特開平７−１４３８７６号公報）で、グルコース重合度３以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物から分子の末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する新規非還元性糖質生成酵素（本酵素を、本明細書を通じて、非還元性糖質生成酵素と称する。）を開示し、本非還元性糖質生成酵素を利用して、還元性澱粉部分分解物から分子の末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質とこれを含む低還元性糖質並びにこれら糖質からのトレハロースの製造方法を確立した。
【０００８】
また、本発明者等は、特願平６−７９２９１号明細書（特開平７−２１３２８３号公報）で、分子の末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とそれ以外の部分との間の結合を特異的に加水分解する新規トレハロース遊離酵素（本酵素を、本明細書を通じて、トレハロース遊離酵素と称する。）を開示し、前述の非還元性糖質生成酵素と本トレハロース遊離酵素とを併用して還元性澱粉部分分解物から比較的高収量のトレハロースの製造方法を確立した。しかしながら、これら酵素を利用して還元性澱粉部分分解物から分子中にトレハロース構造を有する糖質や、トレハロースなどの非還元性糖質を製造する場合には、未反応の還元性澱粉部分分解物の残存が避けられないばかりか、新たに、グルコース、マルトースなどの還元性澱粉糖を生成することも判明した。このような非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質の還元性を更に低減することが強く望まれる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、分子中にトレハロース構造を有する糖質、すなわち、分子の末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質（以下、本物質を、本明細書では、α−グリコシルトレハロースと称する。）、トレハロースの両グルコースに重合度１若しくは２以上のグルコースを有している非還元性糖質（以下、本物質を、本明細書では、α−グリコシル α−グリコシドと称する。）及びトレハロースなどの非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質の還元性を更に低減せしめた糖質、及び、その製造方法を確立し、併せて、これら糖質の用途を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記課題を解決するために、該低還元性糖質の水素添加法に着目し、種々研究を続けてきた。その結果、分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質を水素添加すると該非還元性糖質が悪影響を与えること無く、還元性澱粉糖が対応する澱粉糖アルコールになり、原料の低還元性糖質の還元性を更に低減し、その還元性を実質的に消滅させることも容易であることを見いだし、本発明を完成した。
【００１１】
また、本発明者等は、原料の製造方法についても検討したところ、分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含有する低還元性糖質としては、例えば、グルコース重合度３以上の還元性澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素又は非還元性糖質生成酵素とともにトレハロース遊離酵素を作用させて得られるものが有利に利用でき、とりわけ、澱粉を液化した溶液に、非還元性糖質生成酵素、又は、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させるに際し、澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを併用して得られる低還元性糖質が好都合であり、また、本出願人が特願平６−１４４０９２号明細書（特開平７−１７０９７７号公報）で開示した、マルトースにマルトース・トレハロース変換酵素を作用させて得られる低還元性糖質も好都合であることを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
例えば、澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶液、望ましくは、ＤＥ１５未満の溶液に非還元性糖質生成酵素を作用させて該低還元性糖質を製造するに際し、澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼをともに作用させて得られる非還元性糖質を含む低還元性糖質は、非還元性糖質生成酵素だけを作用させた場合と比較して、その還元性をほとんど増加させることなく、その分子量を著しく低減し、粘度を低下し、取扱い容易で、本発明の原料糖質として好適であることが判明した。ちなみに、このようにして得られた低還元性糖質にグルコアミラーゼを作用させたところ、その構造中に含まれるトレハロース含量が大幅に増加していることも判明した。また、澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶液、望ましくはＤＥ１５未満の溶液に非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させてトレハロースを製造するに際し、澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼをともに作用させて得られるトレハロースは、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素だけを作用させた場合と比較して、その収量が大幅に増加し、本発明の原料として好適であることも判明した。また、マルトース・トレハロース変換酵素の作用により、マルトースから製造されるトレハロースとマルトースとの混合糖質も、本発明の原料糖質として好適であることが判明した。このようにして得られる分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質含量を高めた低還元性糖質を原料として、これに水素添加することは有利に実施できる。このようにして得られる本発明の還元性を低減させた糖質は、実質的に還元性を示さない糖質、望ましくはＤＥ１未満の糖質で、安定性が高く、取扱い容易で、広範な用途に利用でき、例えば、飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００１３】
まず、本発明で用いる非還元性糖質生成酵素としては、澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶液に含まれるグルコース重合度３以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物からα−グリコシルトレハロースを生成する酵素であればよく、例えば、特願平５−３４９２１６号明細書（特開平７−１４３８７６号公報）に開示されるリゾビウム属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属、クルトバクテリウム属、マイコバクテリウム属及びテラバクター属などに属する微生物由来の酵素が有利に利用できる。また、必要ならば、耐熱性の非還元性糖質生成酵素を用いることも随意であり、例えば、本出願人が特願平６−１６６０１１号明細書（特開平８−６６１８８号公報）で開示したスルフォロブス属由来の耐熱性非還元性糖質生成酵素を用いることも有利に実施できる。また、トレハロース遊離酵素としては、澱粉を液化した溶液に非還元性糖質生成酵素を作用させて生成されるα−グリコシルトレハロースを、そのトレハロース部分とそれ以外の部分との間の結合を特異的に加水分解する酵素であればよく、例えば、特願平６−７９２９１号明細書（特開平７−２１３２８３号公報）で開示したリゾビウム属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属及びミクロコッカス属などに属する微生物由来の酵素が有利に利用できる。また、必要ならば、耐熱性のトレハロース遊離酵素を用いることも随意であり、例えば、本出願人が特願平６−１６６１２６号明細書（特開平８−６６１８７号公報）で開示したスルフォロブス属に属するトレハロース遊離酵素を用いることも有利に実施できる。
【００１４】
更に、本発明で用いるマルトース・トレハロース変換酵素としては、マルトースからトレハロースを生成する酵素であればよく、例えば、本出願人が、特願平６−１４４０９２号明細書（特開平７−１７０９７７号公報）で開示されるピメロバクター属、シュードモナス属およびサーマス属などに属する微生物由来の酵素が有利に利用できる。微生物から、例えば、非還元性糖質生成酵素及び／又はトレハロース遊離酵素を調製する方法は、更には、マルトース・トレハロース変換酵素を調製する方法は、これら酵素の産生能を有する微生物を培養して調製すればよい。
【００１５】
微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、該酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化しうる物であればよく、例えば、グルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜、還元性澱粉部分分解物などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸又はその塩も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例えば、還元性澱粉部分分解物の場合には、通常、２０％以下が望ましく、菌の生育及び増殖からは５％以下が好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いられる。
【００１６】
培養は、通常、温度４乃至４０℃、好ましくは２０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは５乃至９から選ばれる条件で好気的に行われる。また、耐熱性酵素を産生する微生物の場合には、通常、温度４０乃至９０℃、好ましくは５０乃至８０℃、ｐＨ２乃至１０、好ましくはｐＨ３乃至９から選ばれる条件で行われる。培養時間は微生物が増殖し得る以上の時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１００時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００１７】
このようにして、微生物を培養した後、酵素を回収する。酵素活性は、培養物の菌体及び除菌液いずれにも認められ、菌体及び除菌液を粗酵素液として採取することも、また、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液をそのまま酵素液として用いることができるが、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮方法としては、例えば、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空糸膜など膜濃縮法などが採用される。
【００１８】
更に、除菌液及びその濃縮物を公知の方法により固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。また、培養物から分離した菌体もそのまま粗酵素として用いることができるが、これを固定化して用いてもよい。一例として、これをアルギン酸ナトリウムと混合して、塩化カルシウム溶液中に滴下して粒状にゲル化させて固定化する。この粒状化物をさらにポリエチレンイミン、グルタールアルデヒドで処理して固定化してもよい。菌体から酵素を抽出して、その抽出液を粗酵素液として用いることもできる。例えば、超音波による破砕法、ガラスビーズ及びアルミナによる機械的破砕法、フレンチプレスによる破砕法などで菌体から酵素を抽出し、遠心分離又は膜濾過などで清澄な粗酵素液を得ることができる。
【００１９】
本酵素液はそのまま用いることができるが、公知の方法によって更に精製して利用することもできる。一例として、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール』などを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、同社製『ブチルトヨパール』などを用いた疎水カラムクロマトグラフィー、同社製『トヨパール ＨＷ−５５』などを用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製することにより、電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００２０】
このようにして得られる非還元性糖質生成酵素は、一般的には、例えば、下記の理化学的性質を有する。
（１） 作用
グルコース重合度３以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物からα−グリコシルトレハロースを生成する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７６，０００乃至８７，０００ダルトン。
（３） 等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．６乃至４．６。
（４） 至適温度
ｐＨ７．０、６０分間反応で、３５乃至４０℃付近。
（５） 至適ｐＨ
４０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．４乃至７．２。
（６） 温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、３５乃至４０℃付近まで安定。
（７） ｐＨ安定性
２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約５．５乃至１１．０。
【００２１】
非還元性糖質生成酵素の活性測定方法は、基質としてマルトペンタオース１．２５ｗ／ｖ％（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）４ｍｌに酵素液を１ｍｌ加え４０℃で６０分間反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させ、その反応液を正確に脱イオン水で１０倍に希釈し、その希釈液の還元力をソモギー・ネルソン法にて測定する。対照として、あらかじめ１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液を用いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、１分間に１μｍｏｌｅのマルトペンタオースに相当する還元力を減少させる酵素量を１単位と定義した。
【００２２】
また、前述のようにして得られるトレハロース遊離酵素は、一般的には、例えば、下記の理化学的性質を有する。
（１） 作用
α−グリコシルトレハロースのトレハロース部分とそれ以外のグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約５７，０００乃至６８，０００ダルトン。
（３） 等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．３乃至４．６。
（４） 至適温度
ｐＨ７．０、３０分間反応で、３５乃至４５℃付近。
（５） 至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至７．５。
（６） 温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、３０乃至４５℃付近まで安定。
（７） ｐＨ安定性
２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約５．０乃至１０．０。
【００２３】
トレハロース遊離酵素の活性は次のようにして測定する。基質としてマルトトリオシルトレハロース（別名、α−マルトテトラオシル α−Ｄ−グルコシド）１．２５ｗ／ｖ％（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）４ｍｌに酵素液を１ｍｌ加え４０℃で３０分間反応させた後、ソモギー銅液を加え反応を停止させ、還元力をソモギー・ネルソン法にて測定する。対照として、あらかじめ１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液を用いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、１分間に１μｍｏｌｅのグルコースに相当する還元力を増加させる酵素量を１単位と定義する。
【００２４】
更に、前述のようにして得られるマルトース・トレハロース変換酵素は、下記の理化学的性質を有する。
（１） 作用
マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至１２０，０ ００ダルトン。
（３） 等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃至５．１。
（４） 活性阻害
１ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害を受ける。
（５） 起源
微生物により産生された酵素である。
【００２５】
マルトース・トレハロース変換酵素の活性は、次のようにして測定する。基質としてマルトース２０ｗ／ｖ％（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）１ｍｌに酵素液１ｍｌを加え、反応温度を２５℃とし、６０分間反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。この反応液を正確に５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５で１１倍に希釈し、その希釈液０．４ｍｌにトレハラーゼ含有溶液（１単位／ｍｌ）を０．１ｍｌ添加したものを４５℃、１２０分間インキュベートした後、この反応液中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。対照として、予め１００℃で１０分間加熱することにより、失活させた酵素液及びトレハラーゼを用いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、増加するグルコース量からマルトース・トレハロース変換酵素により生成するトレハロース量を求め、１分間に１μｍｏｌｅのトレハロースを生成する酵素量を１単位と定義する。
【００２６】
次に、本発明で用いる澱粉枝切酵素は、澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶液、望ましくは、ＤＥ１５未満の液化溶液に作用し、澱粉の枝分かれ結合を加水分解する酵素であって、公知のプルラナーゼ、イソアミラーゼなどが有利に利用でき、また、市販の酵素剤を利用することも有利に実施できる。また、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼは、澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶液、望ましくは、ＤＥ１５未満の液化溶液に作用し、澱粉糖を糖転移し、不均化（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｉｏｎ）反応する酵素であって、公知のバチルス属、クレブシーラ属などに属する微生物由来の酵素が有利に利用でき、また、市販の酵素剤を利用することも有利に実施できる。
【００２７】
また、前述の澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼに加えて、必要に応じて、他のアミラーゼ、望ましくは、澱粉を比較的低ＤＥに液化した溶液に作用して、主としてグルコース重合度３以上のオリゴ糖を生成するアミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ、マルトトリオース生成アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ、マルトヘプタオース生成アミラーゼなどを用いることも有利に実施できる。
【００２８】
本発明で使用される澱粉は、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉であっても、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉であってもよい。澱粉を液化するには、通常、澱粉を水に懸濁した澱粉乳、望ましくは濃度１０％以上、更に望ましくは約２０乃至５０％とし、これを加熱して機械的に液化しても、酸又は酵素で液化してもよい。液化の程度は、比較的低いものが適しており、望ましくはＤＥ１５未満、更に望ましくはＤＥ１０未満のものが好適である。酸で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚酸などで液化し、その後、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどで必要ｐＨに中和して利用すればよい。酵素で液化する場合には、α−アミラーゼ、とりわけ、耐熱性の液化型α−アミラーゼの使用が適している。
【００２９】
このようにして得られる澱粉を液化した溶液に、非還元性糖質生成酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させるか、又は、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させるには、これら酵素が作用しうるｐＨ、温度で行えばよく、通常、ｐＨ４乃至１０、好ましくは、ｐＨ５乃至８、温度約１０乃至８０℃、好ましくは、約３０乃至７０℃で行われる。また、澱粉を液化した溶液にこれら酵素を加える順序は問わず、いずれかの酵素を先に加え、他の酵素をその後に加えて作用させることも、また、これら酵素を同時に加えて作用させることも随意である。
【００３０】
酵素の使用量は、作用条件、反応時間によって適宜選べばよいが、通常、基質である澱粉を液化した溶液に対して、固形物グラム当たり、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素の場合、それぞれ約０．０１乃至１００単位から選ばれ、また、澱粉枝切酵素の場合、約１乃至１０，０００単位から選ばれ、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの場合、約０．０５乃至５００単位から選ばれる。このようにして得られる非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含む低還元性糖質は、澱粉を液化した溶液に、澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼが非還元性糖質生成酵素又は非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素とともに作用するため、比較的低分子のα−グリコシルトレハロース及び／又はα−グリコシル,α−グリコシドを多量に含有するか、又はトレハロースを多量に含有する特長を有しており、本発明の原料用低還元性糖質として好適である。なお、α−グリコシル,α−グリコシドは、本出願人が特願平６−５４３７７号明細書（特開平８−１２７５８７号公報）で開示したα−Ｄ−オリゴグリコシル,α−Ｄ−オリゴグルコシドを含む呼称である。
【００３１】
反応液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。必要ならば、更に、精製、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離などの方法を１種又は２種以上組み合わせて精製することにより、非還元性糖質含量を高めた、本発明の原料用低還元性糖質を得ることも容易である。
【００３２】
とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、非還元性糖質含量を高めた、原料用低還元性糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００３３】
このようにして得られた分子中にトレハロース構造を有する非還元性糖質を含む低還元性糖質を、必要により、アミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどや、又はα−グルコシダーゼで分解し、甘味性を調整したり、粘性を低下させたりする更なる加工処理を施して、原料用の低還元性糖質を製造することも随意である。
【００３４】
このようにして得られる還元性を低減した糖質は、本発明の原料糖質として有利に用いられる。原料糖質としては、分子中にトレハロース構造を有する糖質及びトレハロースからなる非還元性糖質含量が高いものが望ましく、通常、２０％以上、望ましくは４０％以上、更に望ましくは６０％以上が好適であり、また、そのＤＥは低いものが望ましく、通常、ＤＥ７０未満、望ましくは５０未満のもの、更に望ましくは３０未満のものが好適である。本発明の原料糖質は、糖組成によっても変動するが、一般的には、多量の非還元性糖質を含有し、甘味を有する程の比較的低分子、低粘度であるにもかかわらず、そのＤＥが低く、本発明の水素添加工程、その後の精製、濃縮などの製造工程を容易にし、しかも、水素必要量を大幅に低減させる特長を有している。
【００３５】
このようにして得られる分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含む低還元性糖質を水素添加するには、該非還元性糖質を分解することなく、これに含まれる還元性澱粉糖が澱粉糖アルコールに還元されればよく、例えば、原料の糖質を濃度３０乃至７０％水溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒としてラネーニッケル約８乃至１０％を添加し、攪拌しながら温度を９０乃至１５０℃に上げて水素添加を完了、望ましくは、ＤＥを０．５未満に低減させるまで水素添加を行い、ラネーニッケルを除去し、次いで、常法に従って、活性炭による脱色、イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にする。必要ならば、更に乾燥、粉末状製品にすることも、また、トレハロースなどを晶出させた結晶性粉末状製品にすることも随意である。このようにして製造される本発明の還元性を低減させた糖質は、α−グリコシルトレハロース、α−グリコシル α−グリコシドなど分子中にトレハロース構造を有する非還元性糖質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質に加えて、ソルビトール、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール及びマルトペンタイトールから選ばれる１種又は２種以上の澱粉糖アルコールを含有している。
【００３６】
従って、本発明の還元性を低減させた糖質は、還元性が極めて低く安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、還元力が低いにもかかわらず低粘度であり、平均グルコース重合度が低いものの場合には、良質で上品な甘味を有している。
【００３７】
また、本発明の還元性を低減させた糖質に含まれる分子中にトレハロース構造を有する糖質は、アミラーゼ、例えば、すい臓由来α−アミラーゼにより分解し、低分子非還元性オリゴ糖や低分子マルトオリゴ糖を生成し、また、これらオリゴ糖も、α−グルコシダーゼや小腸酵素でも容易に分解し、グルコース及びトレハロースを生成し、更に、生成したトレハロースはトレハラーゼにより容易にグルコースにまで分解することから、経口摂取により、消化吸収され、カロリー源として利用される。虫歯誘発菌などによって、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用できる。
【００３８】
また、安定な甘味料であることにより、結晶高含有製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の老化防止性などの性質を具備している。
【００３９】
また、本発明の還元性を低減させた糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、飲食物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００４０】
本発明の還元性を低減させた糖質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メープルシュガー、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトスクロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の１種又は２種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００４１】
また、本発明の還元性を低減させた糖質、とりわけ、結晶状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することも随意である。
【００４２】
また、本発明の還元性を低減させた糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００４３】
例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に使用できる。
【００４４】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、ヨーグルト、チーズなどの乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、コーヒー、紅茶、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付けに、呈味改良に、また、品質改良などに有利に利用できる。
【００４５】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、さらには品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００４６】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状又は固状の健康食品や医薬品などに容易に製造できることとなる。
【００４７】
以上述べたような各種組成物に本発明の還元性を低減させた糖質を含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有せしめるのが好適である。
【００４８】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００４９】
まず、新規微生物リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１及びアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６からの非還元性糖質生成酵素について説明し、次いで、公知微生物からの非還元性糖質生成酵素について説明する。
【００５０】
【実験１ リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１からの非還元性糖質生成酵素の生産】
マルトース２．０ｗ／ｖ％、ペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二ナトリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一カリウム０．１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整した。５００ｍｌ容三角フラスコにこの培地を約１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で２０分間滅菌し、冷却して、リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）を接種し、２７℃、１３０ｒｐｍで２４時間培養したものを種培養液とした。
【００５１】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地約２０ｌを入れて滅菌、冷却して温度３０℃とした後、種培養液１ｗ／ｖ％を接種し、温度３０℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、約２４時間通気撹拌培養した。培養液の本酵素活性は約１．５単位／ｍｌであった。培養液の一部を採り遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更に菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で元の培養液と同じ液量の懸濁液とした後、菌体懸濁液と培養液上清の酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液には約０．６単位／ｍｌの酵素活性が、また、培養液上清には約０．９単位／ｍｌの酵素活性が認められた。
【００５２】
【実験２ 酵素の精製】
実験１で得られた培養液約１８ｌを、超高圧菌体破砕装置、大日本製薬株式会社製『ミニラボ』で処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、約１６ｌの上清を得た。その液に飽和度０．２になるように硫安を溶解させ、４℃、１時間放置した後、遠心分離して上清を回収した。
【００５３】
更に、その液に飽和度０．６になるように硫安を溶解させ、４℃、２４時間放置した後、遠心分離して硫安塩析物を回収した。得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液（３６０ｍｌ）を２回に分けて、『ＤＥＡＥ−トヨパール』を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。
【００５４】
本酵素は『ＤＥＡＥ−トヨパール』に吸着し、食塩を含む同緩衝液でカラムから溶出した。得られる酵素活性画分を、２Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、得られる上清を東ソー株式会社製『ブチルトヨパール ６５０』を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。吸着した本酵素を硫安２Ｍから０Ｍのリニアグラジエントによりカラムから溶出させ、酵素活性画分を回収した。続いて、『トヨパールＨＷ−５５』を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行い、酵素活性画分を回収した。精製の各工程における酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００５５】
【表１】
表１の工程でゲル濾過溶出液として得られた精製酵素標品をポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度７．５％）を用いる電気泳動法で純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であることが示され、得られた酵素標品は電気泳動的に単一な純度の高い標品であった。
【００５７】
【実験３ 酵素の性質】
実験２で得られた精製酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０％）を用いる電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約７７，０００乃至８７，０００ダルトンであった。
【００５８】
精製酵素標品を２％アンフォライン含有ポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳動法に供し、泳動後、ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は約３．６乃至４．６であった。
【００５９】
本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの影響は活性測定方法に準じて調べた。結果を図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ７．０、６０分間反応で、４０℃付近、至適ｐＨは、４０℃、６０分間反応で、約７．０であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で２５℃、１６時間保持した後、ｐＨを７に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は４０℃付近まで安定であり、ｐＨ安定性は約６乃至９であった。
【００６０】
【実験４ 非還元性糖質の調製】
基質として、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、又はマルトヘプタオースの２０％水溶液を調製し、それぞれに実験２で得られた精製酵素を基質固形物グラム当たり２単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０で４８時間作用させた後、脱塩し、和光純薬工業株式会社製『ワコービーズ ＷＢ−Ｔ−３３０』を用いた高速液体クロマトグラフィーで反応生成物を分析した。高速液体クロマトグラフィーは、室温下で行い、溶離液として水を流速０．５ｍｌ／分で流し、示差屈折計、東ソー株式会社製『ＲＩ−８０１２』で分析した。その結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
表２の結果から明らかなように、反応物中には残存するそれぞれの基質と新たに生成したそれぞれの糖質ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶからなり、それ以外の糖質はほとんど検出されない。それぞれの生成率はグルコース重合度３のＰＩが比較的低いものの、グルコース重合度４以上のＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶは８５％以上の高い生成率であることが判明した。なお、グルコース、マルトースからは、新たな糖質を生成しないことが判明した。
【００６３】
それぞれの反応物から新たに生成した糖質を精製するため、脱色、脱塩、濃縮後、ナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂、東京有機化学工業株式会社製『ＸＴ−１０１６』（架橋度４％）を用いたカラム分画を行った。樹脂を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付ステンレス製カラム３本に充填し、直列につなぎ、カラム内温度を５５℃に維持しつつ、反応糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、新たに生成した糖質含量９７％以上の高純度画分を採取した。得られた高純度画分を真空乾燥し、それぞれ高純度糖質標品を調製した。基質原料に対する収率は、固形物換算で、それぞれＰＩで約９％、ＰＩＩで約６５％、ＰＩＩＩで約８２％、ＰＩＶで約８０％、ＰＶで約７７％であった。その純度は、それぞれＰＩで９７．５％、ＰＩＩで９８．６％、ＰＩＩＩで９９．５％、ＰＩＶで９８．４％、ＰＶで９８．４％であった。
【００６４】
またこれらの新たに生成した高純度糖質標品の還元力をソモギー・ネルソン法で測定し、ＤＥで表した。結果は表３にまとめた。
【００６５】
【表３】
表３の結果から明らかなように、いずれの標品にも僅かな還元力しか認めらなかった。その僅かな還元力は、その標品中に微量に混入、残存している基質由来の還元性マルトオリゴ糖に起因するものと推定され、新たに生成した糖質はいずれも実質的に非還元性であると判断される。
【００６７】
【実験５ メイラード反応】
実験４において調製した糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、又はＰＶの１０％とグリシン１％と、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを含む溶液を１００℃で９０分間保ち、冷却後、この溶液の４８０ｎｍ、１ｃｍセルにおける吸光度を測定した。対照として、それぞれの原料であるマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、又はマルトヘプタオースを用いて、同様に、処理し、４８０ｎｍにおける吸光度を測定した。それらの結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】
表４の結果から明らかなように、新たに生成した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶのいずれもメイラード反応による着色度は極めて低く、それぞれ原料の基質であるマルトオリゴ糖の着色度の僅かに３乃至６％程度であり、本発明の新規酵素によって生成する非還元性糖質はメイラード反応をほとんど示さない糖質であることが判明した。
【００７０】
【実験６ グルコアミラーゼによる酵素分解】
実験４において調製した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ又は、ＰＶのそれぞれ５０ｍｇを、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに溶解し、１単位のグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）を加え、４０℃で６時間保ち、酵素分解した後、高速液体クロマトグラフィーで分解物を分析したところ、いずれの標品からも分解物としてグルコースとトレハロースのみが検出された。検出されたグルコース含量、トレハロース含量、その組成モル比の結果を表５に示す。
【００７１】
【表５】
表５の結果から明らかなように、グルコアミラーゼにより、非還元性糖質ＰＩはグルコース１分子とトレハロース１分子に分解され、非還元性糖質ＰＩＩはグルコース２分子とトレハロース１分子に分解され、非還元性糖質ＰＩＩＩはグルコース３分子とトレハロース１分子に分解され、非還元性糖質ＰＩＶはグルコース４分子とトレハロース１分子に分解され、非還元性糖質ＰＶはグルコース５分子とトレハロース１分子に分解されることが判明した。
【００７３】
また、グルコアミラーゼの反応特性を考慮すると、これら非還元性糖質の構造はトレハロース分子にグルコース分子がα−１，４−結合、もしくはα−１，６−結合で結合した糖質で、それぞれ、ＰＩはトレハロース１分子にグルコース１分子が結合したグルコース重合度３の非還元性糖質で、ＰＩＩはトレハロース１分子にグルコース２分子が結合したグルコース重合度４の非還元性糖質で、ＰＩＩＩはトレハロース１分子にグルコース３分子が結合したグルコース重合度５の非還元性糖質で、ＰＩＶはトレハロース１分子にグルコース４分子が結合したグルコース重合度６の非還元性糖質で、ＰＶはトレハロース１分子にグルコース５分子が結合したグルコース重合度７の非還元性糖質であると判断される。なお、同様に、非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、又はＰＶにβ−アミラーゼを作用させたところ、非還元性糖質ＰＩ、ＰＩＩは分解されず、ＰＩＩＩはマルトースの１分子とＰＩの１分子に分解され、ＰＩＶはマルトースの１分子とＰＩＩの１分子に分解され、ＰＶはマルトースの２分子とＰＩの１分子に分解されることが判明した。
【００７４】
以上の結果から、本発明の非還元性糖質生成酵素による反応は、基質の低分子化及び高分子化を伴わない、換言すれば、グルコース重合度の変化を伴わない、分子内変換反応と判断され、また、この非還元性糖質生成酵素によって生成した非還元性糖質、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ及びＰＶは、それぞれ、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースで示されるα−グリコシルトレハロース（Ｇn−Ｔ：但し、 Ｇはグルコース残基を意味し、ｎは１以上の整数を意味し、Ｔはα，α−トレハロースを意味する。）であると判断される。
【００７５】
【実験７ 各種の酵素による分解】
実験４において調製した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、又はＰＶのそれぞれを基質として、ブタすい臓由来α−アミラーゼ（シグマ社販売）、コメ由来α−グルコシダーゼ（同社販売）、又はラット小腸アセトン粉末酵素（同社販売）のそれぞれに作用させた後、分解物の糖組成を高速液体クロマトグラフィーで分析した。α−アミラーゼの反応は、それぞれの基質１０ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１ｍｌに溶解し、これに、酵素活性１単位加え、３７℃で１８時間保って行った。α−グルコシダーゼの反応は、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いた以外、α−アミラーゼの場合と同様の条件で行った。ラット小腸アセトン粉末酵素の場合も、５０ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた以外、α−アミラーゼの場合と同様の条件で行った。α−アミラーゼによる分解物の糖組成を以下の表６に、α−グルコシダーゼ及びラット小腸アセトン粉末酵素による分解物の糖組成を以下の表７、表８に示す。
【００７６】
【表６】
【表７】
【表８】
表６の結果から明らかなように、糖質標品、ＰＩ及びＰＩＩは、α−アミラーゼによりほとんど分解されないものの、糖質標品、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、及びＰＶはα−アミラーゼにより低分子のオリゴ糖、ＰＩ、ＰＩＩ、マルトトリオース、マルトース及びグルコースにまで分解されることが判明した。
【００８０】
また、表７、表８の結果から明らかなように、糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶいずれもα−グルコシダーゼ及びラット小腸アセトン粉末酵素により、実験６のグルコアミラーゼの場合と同様に、グルコースとトレハロースにまで分解されることが判明した。
【００８１】
また、同様にα−グルコシダーゼ及びラット小腸アセトン粉末酵素によって分解されたそれぞれの反応物に、更に、１単位のブタ腎臓由来トレハラーゼ（シグマ社販売）を加え、ｐＨ５．７、３７℃で１８時間作用させ、高速液体クロマトグラフィー法で糖組成を分析したところ、糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶいずれの場合も、α−グルコシダーゼ及びラット小腸アセトン粉末酵素により生成したトレハロースはトレハラーゼによりグルコースにまで分解することが判明した。
【００８２】
上述のように、
（１） 非還元性糖質生成酵素は、グルコース重合度３以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物から、そのグルコース重合度を変化することなく、α−グリコシルトレハロースを生成している。
（２） 非還元性糖質ＰＶは、α−アミラーゼにより、主に非還元性糖質ＰＩＩとマルトトリオースを生じ、非還元性糖質ＰＩＩは、グルコアミラーゼにより、トレハロース１分子とグルコース２分子を生じている。
これらの結果から、本発明の非還元性糖質生成酵素は、還元性澱粉部分分解物の還元性末端を非還元性のトレハロース構造に分子内変換する全く新しい作用機作の酵素であると判断される。
【００８３】
【実験８ 急性毒性】
７週齢のｄｄ系マウスを使用して、実験４において調製した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、又はＰＶを経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、これら非還元性糖質はいずれも低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。従って、正確な値とはいえないが、それらのＬＤ50値は、いずれも５０ｇ／ｋｇ以上であった。
【００８４】
【実験９ アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６からの非還元性糖質生成酵素の生産】
リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）に代えて、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６）を用いた以外は、実験１と同様にファーメンターで約７２時間培養した。培養液の非還元性糖質生成酵素の酵素活性は、約１．２単位／ｍｌであった。実験１と同様にして菌体懸濁液と培養液上清の酵素活性を測定したところ、それぞれ約０．５単位／ｍｌ及び約０．７単位／ｍｌであった。
【００８５】
【実験１０ 酵素の精製】
実験９の方法で得られた培養液約１８ｌを用いて、実験２と同様に精製した。精製の各工程結果は表９にまとめた。
【００８６】
【表９】
表９の工程で、ゲル濾過溶出液として得られた精製酵素標品を、実験２の場合と同様に電気泳動法で純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であることが示され、得られた酵素標品は電気泳動的に単一な純度の高い標品であった。
【００８８】
【実験１１ 酵素の性質】
実験１０で得られた精製酵素標品を、実験３の場合と同様に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定したところ、約７６，０００乃至８６，０００ダルトンであった。また、本精製酵素標品の等電点を実験３の場合と同様に等電点電気泳動法で求めたところ、ｐＩ約３．６乃至４．６であった。また、本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの影響、及び本酵素の温度安定性、ｐＨ安定性について、実験３の場合と同様にして求めた。結果は、温度の影響を図５に、ｐＨの影響を図６に、温度安定性を図７に、ｐＨ安定性を図８に示した。
【００８９】
図から明らかなように酵素の至適温度は４０℃付近、至適ｐＨは約６．５乃至７．０である。温度安定性は４０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．５である。
【００９０】
【実験１２ 非還元性糖質の調製】
実験１０で得られた精製酵素標品を用いて、実験４及び実験６の方法に従って、非還元性糖質の調製とその構造確認の実験を行ったところ、リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非還元性糖質生成酵素の場合と同様に、グルコース重合度３以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物からα−グリコシルトレハロースを生成することが判明した。
【００９１】
【実験１３ 公知微生物からの非還元性糖質生成酵素の生産とその性質】
公知微生物のうち、本発明の非還元性糖質生成酵素産生能の確認された表１０に示す特定の微生物を、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＡＴＣＣ１９４２０の場合に３７℃で培養した以外は、実験１の場合と同様にファーメンターで２７℃で７２時間培養した。それぞれの培養液約１８ｌを用いて、実験２の場合と同様に、培養液を破砕装置にかけ、その上清を硫安塩析、透析し、更にイオン交換カラムにかけ、部分精製酵素標品を得、その性質を調べた。結果を表１０にまとめた。
【００９２】
【表１０】
また、これら公知菌由来の部分精製酵素を用いて、実験１２の方法に従って、非還元性糖質の調製とその構造確認を行ったところ、いずれの酵素もリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非還元性糖質生成酵素の場合と同様に、グルコース重合度３以上から選ばれる１種又は２種以上の還元性澱粉部分分解物からα−グリコシルトレハロースを生成することが判明した。
【００９４】
次に、新規微生物リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１及びアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６からのトレハロース遊離酵素について説明し、次いで、公知微生物からのトレハロース遊離酵素について説明する。
【００９５】
【実験１４ リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１からのトレハロース遊離酵素の生産】
澱粉部分分解物、松谷化学工業株式会社製『パインデックス＃』４２．０ｗ／ｖ％、ペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二ナトリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一カリウム０．１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整した。５００ｍｌ容三角フラスコにこの培地を約１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で２０分間滅菌し、冷却して、リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）を接種し、２７℃、１３０ｒｐｍで２４時間培養したものを種培養液とした。
【００９６】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地約２０ｌを入れて殺菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｗ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨは６．０乃至８．０に保ちつつ、約７２時間通気攪拌培養した。
【００９７】
培養液の非還元性糖質生成酵素の酵素活性は約１．５単位／ｍｌで、本発明のトレハロース遊離酵素の酵素活性は約２単位／ｍｌであった。培養液の一部を採り遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更に菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で元の培養液と同じ液量の懸濁液とした後、菌体懸濁液と培養上清との酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液には、非還元性糖質生成酵素の酵素活性が約０．６単位／ｍｌ、トレハロース遊離酵素の酵素活性が約０．８単位／ｍｌ認められ、培養上清には、非還元性糖質生成酵素の酵素活性が約０．９単位／ｍｌ、トレハロース遊離酵素の酵素活性が約１．２単位／ｍｌ認められた。
【００９８】
【実験１５ 酵素の精製】
実験１４の方法で得られた培養液約１８ｌを超高圧菌体破砕装置『ミニラボ』で処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、約１６ｌの遠心上清液を得た。その液に飽和度０．２になるように硫安を加え溶解させ、４℃、１時間放置した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）することにより上清を回収した。
【００９９】
更に、その液に硫安を飽和度０．６になるように溶解させ、４℃、２４時間放置した後、遠心分離して硫安塩析物を回収した。得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離し、不溶物を除いた。その透析液（３６０ｍｌ）を２回に分けて、『ＤＥＡＥ−トヨパール』を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。
【０１００】
本発明のトレハロース遊離酵素、非還元性糖質生成酵素とも『ＤＥＡＥ−トヨパール』に吸着し、食塩を含む同緩衝液でカラムから異なる食塩濃度においてそれぞれ溶出した。『ＤＥＡＥ−トヨパール』からの溶出パターンを図９に示す。非還元性糖質生成酵素は食塩濃度約０．２Ｍで、トレハロース遊離酵素は食塩濃度約０．３Ｍで溶出し、それぞれの酵素活性画分を回収し、以下、両酵素を別々に精製した。
【０１０１】
非還元性糖質生成酵素活性画分を２Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離し不溶物を除き、得られる上清を『ブチルトヨパール ６５０』を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。吸着した本酵素を２Ｍから０Ｍ硫安のリニアグラジエントでカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。続いて、『トヨパール ＨＷ−５５』を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行い、非還元性糖質生成酵素活性画分を回収した。
【０１０２】
トレハロース遊離酵素の精製は、『ＤＥＡＥ−トヨパール』から溶出したトレハロース遊離酵素活性画分を用いて、上記の非還元性糖質生成酵素の精製方法と同様に、２Ｍ硫安を含む緩衝液に対して透析し、次いで疎水カラムクロマトグラフィー、ゲル瀘過クロマトグラフィーを行った。
【０１０３】
精製の各工程における酵素活性量、比活性、収率を、非還元性糖質生成酵素の場合は表１１に、本発明のトレハロース遊離酵素の場合は表１２に示す。
【０１０４】
【表１１】
【表１２】
表１１及び表１２の工程でそれぞれゲル瀘過溶出液として得られた、精製非還元性糖質生成酵素標品及び精製トレハロース遊離酵素標品をポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度７．５％）を用いる電気泳動法で純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であることが示され、得られた酵素標品は電気泳動的に単一な純度の高い標品であった。
【０１０７】
【実験１６ トレハロース遊離酵素の性質】
実験１５の方法で得られた精製トレハロース遊離酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０％）を用いる電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約５８，０００乃至６８，０００ダルトンであった。
【０１０８】
精製酵素標品をポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳動法に供し、泳動後、ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は約３．３乃至４．３であった。
【０１０９】
本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの影響を活性測定方法に準じて調べた。結果を図１０（温度の影響）、図１１（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は、ｐＨ７．０、３０分間反応で、４５℃付近、至適ｐＨは、４０℃、３０分間反応で、約６．０乃至７．５であった。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で２５℃、１６時間保持した後、ｐＨを７に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図１２（温度安定性）、図１３（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の熱安定性は約４０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５乃至１０であった。
【０１１０】
【実験１７ α−グリコシルトレハロースからのトレハロースの調製】
基質として用いるα−グリコシルトレハロースは、実験４の方法に従って調製した。即ち、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースから選ばれる還元性澱粉部分分解物の２０％水溶液に実験１５の方法で得られた精製非還元性糖質生成酵素標品を基質固形物グラム当りそれぞれ２単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０で４８時間作用させた後、常法に従って、加熱失活、瀘過、脱色、脱塩、濃縮し、ナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。樹脂を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付ステンレス製カラム３本に充填し、直列につなぎ、カラム内温度を５５℃に維持しつつ、反応糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質の高純度標品を調製した。得られた高純度標品のうち、グルコシルトレハロース標品の純度は９７．６％で、マルトシルトレハロース標品の純度は９８．６％で、マルトトリオシルトレハロース標品の純度は９９．６％で、マルトテトラオシルトレハロース標品の純度は９８．３％で、マルトペンタオシルトレハロース標品の純度は９８．１％であった。
【０１１１】
上記５種の非還元性糖質（α−グリコシルトレハロース）の２０％水溶液を調製し、それぞれに実験１５で得られた精製トレハロース遊離酵素を基質固形物グラム当り２単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０で４８時間作用させた後、脱塩し、『ワコービーズ ＷＢ−Ｔ−３３０』を用いた高速液体クロマトグラフィーで反応生成物を分析した。対照として、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースに精製トレハロース遊離酵素を同様に作用させ、高速液体クロマトグラフィーで分析した。それらの結果を表１３に示す。
【０１１２】
【表１３】
表１３の結果から明らかなように、
（１） トレハロース遊離酵素は、α−グリコシルトレハロースのトレハロース部分とグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解し、トレハロースとグルコース重合度が１以上の還元性糖質とを生成する。
（２） マルトオリゴ糖は、トレハロース遊離酵素によって全く作用を受けない。
これらの結果から、本発明のトレハロース遊離酵素は、α−グリコシルトレハロースのトレハロース部分とその他のグリコシル部分との間の結合を極めて特異的に加水分解し、トレハロースを遊離する全く新しい作用機構の酵素であると判断される。
【０１１４】
次いで、それぞれの反応物からトレハロースを精製するため、脱色、脱塩、濃縮し、ナトリウム型強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』を用いたカラム分画を行い、トレハロース含量９７％以上の高純度画分を採取した。得られた高純度画分を濃縮して濃度約６５％にし、２５℃で２日間放置して含水トレハロース結晶を晶出させ、分蜜し、真空乾燥して、トレハロース含量９９％以上の高純度標品を調製した。原料基質に対するそれぞれの収率は、固形物換算で、グルコシルトレハロースから９．５％、マルトシルトレハロースから１４．９％、マルトトリオシルトレハロースから１６．０％、マルトテトラオシルトレハロースから１８．５％、マルトペンタオシルトレハロースから１７．７％であった。得られたそれぞれの高純度トレハロース標品を用いて、市販の試薬トレハロース（和光純薬工業株式会社販売）を標準品として、融点、融解熱、比旋光度、赤外線吸収スペクトル、粉末Ｘ線回折パターン及びブタ腎臓由来トレハラーゼでの分解性について比較したところ、調製したすべての高純度トレハロース標品は、融点９７．０±０．５℃、融解熱５７．８±１．２ＫＪ／ｍｏｌｅ、比旋光度＋１８２±１．１°で、試薬トレハロースの実測値とよく一致し、また、赤外線吸収スペクトル及び粉末Ｘ線回折パターンについても、試薬トレハロースのスペクトル又はパターンとよく一致した。更に、ブタ腎臓由来トレハラーゼによって、高純度トレハロース標品は試薬トレハロースと同様にグルコースに分解された。以上の結果から明らかなように、α−グリコシルトレハロースに本発明のトレハロース遊離酵素を作用させ生成した糖質はトレハロースであると確認された。
【０１１５】
【実験１８ 還元性澱粉部分分解物からのトレハロースの調製】
５％ワキシーコーンスターチ懸濁液を加熱糊化させた後、ｐＨ４．５、温度５０℃に調整し、これにイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当り４，０００単位の割合になるように加え、２０時間反応させた。その反応液をオートクレーブ（１２０℃、１０分間）し、次いで６０℃に冷却し、これを東ソー株式会社製『トヨパール ＨＷ−５０Ｓ』を用いたゲル瀘過クロマトグラフィー（ゲル量７５０ｍｌ）でグルコース重合度３５乃至１０の還元性澱粉部分分解物を調製した。
【０１１６】
得られた還元性澱粉部分分解物、又はグルコース重合度３のマルトトリオースを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１％濃度に調整し、これに実験１５の方法で調製した精製非還元性糖質生成酵素標品及び精製トレハロース遊離酵素標品をそれぞれ基質固形物当り４単位の割合で加え、４０℃で２４時間作用させた後、一部を採り、脱塩し、高速液体クロマトグラフィーで反応生成物を分析した。
【０１１７】
残りの反応液は、更に、５０℃、ｐＨ４．５に調整した後、グルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）を基質固形物当り５０単位の割合で加え、２４時間作用させ、同様に脱塩し、高速液体クロマトグラフィーで反応生成物を分析した。それらの結果を表１４に示す。
【０１１８】
【表１４】
表１４に示すように、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させた後のトレハロース生成率は、グルコース重合度３のマルトトリオースでは４．２％と低い値であったが、グルコース重合度１０乃至３４．１の澱粉部分分解物では６６．１乃至８０．８％の高い値が得られた。また、原料の還元性澱粉部分分解物のグルコース重合度が高い程、得られるトレハロース純度が高いことも判明した。更に、該両酵素を作用させた反応液にグルコアミラーゼを作用させ、残存する末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質をトレハロースとグルコースとに分解することにより、生成するトレハロース純度がより高まることも判明した。
【０１２０】
【実験１９ メイラード反応】
実験１７の方法で得られた高純度トレハロース標品（純度９９．５％）の１０％とグリシン１％と、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを含む溶液を１００℃で９０分間保ち、冷却後、この溶液の４８０ｎｍ、１ｃｍセルにおける吸光度を測定した。対照として、グルコース、マルトースを用いて、同様に処理し、４８０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を表１５に示す。
【０１２１】
【表１５】
表１５の結果から明らかなように、トレハロース標品は、メイラード反応による着色度は僅かであり、グルコースやマルトースの着色度の僅か０．４乃至０．６％程度であり、本発明のトレハロース標品はメイラード反応をほとんど示さない糖質であることが判明した。従って、本糖質は、アミノ酸と混合しても、アミノ酸を損なうことが少ない糖質である。
【０１２３】
【実験２０ 生体内での利用試験】
厚治等が、『臨床栄養』、第４１巻、第２号、第２００乃至２０８頁（１９７２年）で報告している方法に準じて、実験１７の方法で得られた高純度トレハロース標品（純度９９．５％）３０ｇを２０ｗ／ｖ％水溶液とし、これをボランティア６名（健康な２６才、２７才、２８才、２９才、３０才、３１才の男性）にそれぞれ経口投与し、経時的に採血して、血糖値及びインスリン値を測定した。対照としては、グルコースを用いた。その結果、トレハロースは、グルコースの場合と同様の挙動を示し、血糖値、インスリン値ともに、投与後、約０．５乃至１時間で最大値を示した。トレハロースは、容易に消化吸収、代謝利用されて、エネルギー源になることが判明した。
【０１２４】
【実験２１ 急性毒性試験】
マウスを使用して、実施例Ａ−５、Ａ−７およびＡ−８の方法で得られた還元性を低減させた糖質粉末を経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、いずれの標品も低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。従って、正確な値とはいえないが、それらのＬＤ５０値は、５０ｇ／ｋｇ以上であった。
【０１２５】
【実験２２ アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６からのトレハロース遊離酵素の生産】
リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）に代えて、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６）を用いた以外は、実験１４と同様に、ファーメンターで約７２時間培養した。培養液の非還元性糖質生成酵素の酵素活性は約１．３単位／ｍｌで、本発明のトレハロース遊離酵素の酵素活性は約１．８単位／ｍｌであった。実験１４と同様にして菌体懸濁液と培養上清との酵素活性を測定したところ、菌体懸濁液には、非還元性糖質生成酵素の酵素活性が約０．５単位／ｍｌ、トレハロース遊離酵素の酵素活性が約０．５単位／ｍｌ認められ、培養上清には、非還元性糖質生成酵素の酵素活性が約０．８単位／ｍｌ、トレハロース遊離酵素の酵素活性が約１．３単位／ｍｌ認められた。
【０１２６】
【実験２３ 酵素の精製】
実験２２の方法で得られた培養液約１８ｌを用いて、実験１５と同様の方法で精製した。精製の各工程結果は非還元性糖質生成酵素の場合は表１６に、トレハロース遊離酵素の場合は表１７にまとめた。
【０１２７】
【表１６】
【表１７】
表１６及び表１７の工程で、それぞれゲル瀘過溶出液として得られた精製非還元性糖質生成酵素及び精製トレハロース遊離酵素を、実験１５の場合と同様に電気泳動法で純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であることが示され、得られた両精製酵素は電気泳動的に単一な純度の高い標品であった。
【０１３０】
【実験２４ 酵素の性質】
実験２３の方法で得られた精製トレハロース遊離酵素を、実験１６の場合と同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定したところ、約５７，０００乃至６７，０００ダルトンであった。また、本酵素の等電点を実験３の場合と同様に等電点電気泳動法で求めたところ、等電点は３．６乃至４．６であった。また、本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの影響、及び本酵素の温度安定性、ｐＨ安定性について、実験１６の場合と同様にして求めた。結果は、温度の影響を図１４に、ｐＨの影響を図１５に、温度安定性を図１６に、ｐＨ安定性を図１７に示した。
【０１３１】
図から明らかなように酵素の至適温度は４５℃付近、至適ｐＨは約６．０乃至７．５である。温度安定性は４５℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５．０乃至１０．０である。
【０１３２】
【実験２５ α−グリコシルトレハロースからのトレハロースの調製】
実験２３の方法で得られた精製酵素を用いて、実験１７の方法に従って、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からのトレハロースの調製の実験を行ったところ、リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来のトレハロース遊離酵素の場合と同様に、α−グリコシルトレハロースからトレハロースを遊離することが判明した。
【０１３３】
【実験２６ 公知微生物からのトレハロース遊離酵素の生産とその性質】
公知微生物のうち、本発明のトレハロース遊離酵素産生能の確認されたブレビバクテリウム・ヘロボルムＡＴＣＣ１１８２２及びミクロコッカス・ロゼウスＡＴＣＣ１８６を、実験１４の場合と同様にファーメンターで２７℃で７２時間培養した。それぞれの培養液約１８ｌを用いて、実験１５の場合と同様に、培養液を破砕装置で処理し、その遠心上清を回収し、続いて、硫安塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィーし、得られた部分精製酵素標品の性質を調べた。これらの結果を、前述のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１及びアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６の場合とともに表１８にまとめた。
【０１３４】
【表１８】
また、これらの公知微生物由来の部分精製酵素を用いて、実験２５の方法に従って、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質からのトレハロースの調製の実験を行ったところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来のトレハロース遊離酵素の場合と同様に、α−グリコシルトレハロースからトレハロースを遊離することが判明した。
【０１３６】
【実験２７ トレハロース高含有糖質を製造するための澱粉の液化程度と使用酵素の影響】
澱粉からトレハロース高含有糖質を製造するために、澱粉の液化程度と使用する酵素の組合わせの影響を調べた。濃度２０％のとうもろこし澱粉乳に炭酸カルシウムを０．１％加えてｐＨ６．５に調整した後、これにα−アミラーゼ、ノボ社販売『ターマミール』を澱粉当たり０．１乃至２．０％を加え、９５℃で１５分間反応させ、１２０℃にオートクレーブして１０分間保って、ＤＥ２．５乃至２０．５の液化溶液とし、これを急冷したものに実験２の方法で調製した精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり５単位及び実験１５の方法で調製した精製トレハロース遊離酵素を澱粉グラム当たり１０単位加え、更に澱粉枝切酵素イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売）を澱粉グラム当たり５００単位及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売）を澱粉グラム当たり５単位加えてｐＨ６．０、４５℃で２４時間反応させた。本反応液を９５℃、１０分間加熱した後、冷却し、次いで、グルコアミラーゼを澱粉グラム当たり１０単位加えてｐＨ５．０で１０時間反応させた。本反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、糖質中のトレハロース含量（％）を求めた。対照として、澱粉液化溶液に非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素だけを同様に作用させ、同様に、グルコアミラーゼを作用させて、高速液体クロマトグラフィーで分析した。結果は、表１９に示す。
【０１３７】
【表１９】
表１９の結果から明らかなように、澱粉からトレハロース高含有糖質を製造するには、その液化の程度は比較的低いものが適しており、望ましくは、ＤＥ１５未満、更に望ましくはＤＥ１０未満が好適であることが判明した。また、それに使用する酵素は、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素だけを作用させるよりも、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させた方が、澱粉からのトレハロース収量を約２乃至４倍にも向上することとなり、澱粉からトレハロースを工業的に大量生産する上で、極めて有利であることが判明した。
【０１３９】
以下、本発明の還元性を低減させた糖質の製造方法を実施例Ａで、該糖質を含有せしめた組成物を実施例Ｂで示す。
【０１４０】
【実施例Ａ−１】
馬鈴薯澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに蓚酸を０．３％加えてオートクレーブし、冷却し、炭酸カルシウムでｐＨ６．５に中和して、ＤＥ約１２の液化溶液を得た。本液化溶液に実験２の方法で得た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり２単位及びイソアミラーゼを澱粉グラム当たり３００単位加え、温度４５℃で２４時間反応させた、本反応液を９５℃に加熱して酵素を失活させた後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約５０％のシラップを固形物当たり約９０％の収率で得た。本品は、α−グリコシルトレハロースとともに還元性澱粉糖を含むＤＥ約８の低還元性糖質である。本低還元性糖質シラップをオートクレーブに入れ、ラネーニッケル１０％を添加し、攪拌しながら温度を９０乃至１２０℃に上げ、水素圧を２０乃至１２０ｋｇ／ｃｍ2に上げて水素添加を完了させた後、ラネーニッケルを除去し、次いで、常法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮して、濃度７０％のシラップを固形物当たり約８０％の収率で得た。本品は、分子中にトレハロース構造を有する非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質で、温和で上品な甘味、比較的低粘度、適度な保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１４１】
【実施例Ａ−２】
タピオカ澱粉を濃度約２５％澱粉乳とし、これにα−アミラーゼ、ナガセ生化学工業株式会社製『ネオスピターゼ』を澱粉グラム当たり０．２％加え、８５乃至９０℃で約２０分間反応させ、次いで１２０℃にオートクレーブし、急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実験９の方法で得た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり５単位、プルラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売）を澱粉グラム当たり１００単位及びマルトテトラオース生成アミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり２０単位加え、ｐＨ６．５、温度４０℃で３６時間反応させた。本反応液を、実施例Ａ−１と同様に、加熱して酵素を失活させた後、精製し、濃度約６０％に濃縮した。本濃縮液を原糖液とし、非還元性糖質の含量を高めるため、カルシウム型強酸性カチオン交換樹脂、東京有機化学工業株式会社製『ＸＴ−１０１６』を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層長全長２０ｍとした。カラム内温度を５５℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、非還元性糖質高含有のグルコース重合度４乃至６の画分を採取し、精製、濃縮し、濃度約５０％のシラップを得た。本品は、α−グリコシルトレハロースとともに還元性澱粉糖を含むＤＥ５．４の低還元性糖質である。本低還元性シラップを、実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮して、濃度７０％のシラップを固形物当たり約５０％の収率で得た。本品は、分子中にトレハロース構造を有する非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質で、温和で上品な甘味、比較的低粘度、適度な保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１４２】
【実施例Ａ−３】
とうもろこし澱粉を濃度約３０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ、ノボ社製『ターマミール６０Ｌ』を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃にオートクレイブし、急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、これに実験２の方法で得た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり４単位、イソアミラーゼを澱粉グラム当たり３００単位及びシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売）を澱粉グラム当たり５単位加え、ｐＨ６．３、温度４５℃で４８時間反応させた。本反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、これにβ−アミラーゼを澱粉グラム当たり１０単位加えてｐＨ５．５、温度５５℃で１６時間反応させた。本反応液を、加熱して酵素を失活させた後、常法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮して濃度約５０％のシラップを得た。本品は、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質及びα−グリコシル α−グルコシドなどの非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含む低還元性糖質である。本低還元性シラップを、実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し濃縮して、濃度７０％のシラップを固形物当たり約８０％の収率で得た。本品は、分子中にトレハロース構造を有する非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質で、温和で上品な甘味、比較的低粘度、適度な保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１４３】
【実施例Ａ−４】
実施例Ａ−３の方法で得たシラップを濃度約５５％にして原糖液とし、非還元性糖質の含量を高めるため、実施例Ａ−２の方法に準じて塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行って、非還元性糖質高含有のグルコース重合度３乃至６の画分を採取し、精製、濃縮し、濃度約５０％のシラップを得た。本品は、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質及びα−グリコシル α−グルコシドなどの非還元性糖質を多量含むとともに還元性澱粉糖を含むＤＥ８の低還元性糖質である。本低還元性シラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮して濃度７０％のシラップを固形物当たり約３０％の収率で得た。本品は、分子中にトレハロース構造を有する非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質で、温和で上品な甘味、比較的低粘度、適度な保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１４４】
【実施例Ａ−５】
とうもろこし澱粉を濃度約３０％の澱粉乳とし、これに実施例Ａ−３の方法に準じて、α−アミラーゼを作用させてＤＥ４の液化溶液を得、次いで、実験２の方法で得た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり５単位、実験１５記載の精製トレハロース遊離酵素を澱粉グラム当たり１０単位及びイソアミラーゼを澱粉グラム当たり５００単位加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。本反応液には、トレハロースを７６．３％含有していた。本反応液を加熱して酵素を失活させた後、常法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮して約４５％のシラップを得た。本トレハロース高含有低還元性糖質シラップを、実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮して濃度約８５％にして助晶機にとり、撹拌しつつ徐冷して助晶し、これをプラスチック製バットに取り出し、室温で２日間放置し、晶出熟成させてブロックを調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕してトレハロース含水結晶とともに澱粉糖アルコールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質粉末を、原料澱粉に対して固形物当たり８０％の収率で得た。本品は、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１４５】
【実施例Ａ−６】
タピオカ澱粉を濃度約３０％の澱粉乳とし、これに実施例Ａ−２の方法に準じて、α−アミラーゼを作用させてＤＥ５の液化溶液を得、次いで、実験１０の方法で得た精製非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり３単位、実験２３の方法で得た精製トレハロース遊離酵素を澱粉グラム当たり５単位及びプルラナーゼを２００単位及びシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを澱粉グラム当たり３単位加え、ｐＨ６．０、温度４５℃で４８時間反応させた。本反応液には、固形物当たりトレハロースを８４．７％含有していた。本反応液を加熱失活し、常法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮しながら連続晶析させ、得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水でスプレーし洗浄してトレハロース含水結晶を固形物当たり約５５％の収率で得た。この方法で得られた母液には多量のトレハロース及びトレハロース構造を有する非還元性糖質とともに還元性澱粉糖を含有しており、これを濃縮して濃度５０％のシラップを得た。本低還元性糖質シラップを、実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮して、濃度７０％のシラップを固形物当たり約３０％得た。本品は、トレハロース及びトレハロース構造を有する非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質で、温和で上品な甘味、比較的低粘度、適当な保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種組成物に有利に利用できる。
【０１４６】
【実施例Ａ−７】
実施例Ａ−６の方法で得た加熱失活した反応液に、グルコアミラーゼを基質グラム当たり１０単位加え、ｐＨ５．０、温度５０℃で１０時間反応させた。本反応液を加熱失活し、常法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮して濃度４５％のシラップを得た。本トレハロース高含有低還元性糖質シラップを、実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、次いで、濃度約７０％に濃縮した後、助晶機にとり撹拌しつつ徐冷して助晶し、晶出率約４０％のマスキットを得た。本マスキットを乾燥塔上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ2の高圧にて噴霧し、同時に乾燥塔の上部より８５℃の熱風を送風し、底部に設けた移送金網コンベア上に結晶粉末を補集した。コンベアの下より４５℃の温風を送りつつ、該粉末を乾燥塔外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成塔に充填して温風を送りつつ１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、トレハロース含水結晶及びソルビトールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質粉末を、原料の澱粉に対して、固形物当たり約７５％の収率で得た。本品は、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１４７】
【実施例Ａ−８】
リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）の変異株を実験１の方法に準じて、ファーメンターで約７０時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌瀘過し、約１００ｌの培養瀘液を回収し、更に、その瀘液をＵＦ膜濃縮し、非還元性糖質生成酵素（約４１０単位／ｍｌ）とトレハロース遊離酵素（約４９０単位／ｍｌ）とを含む濃縮酵素液約５ｌを回収した。とうもろこし澱粉を濃度約３３％の澱粉乳とし、これに実施例Ａ−３の方法に準じて、α−アミラーゼを作用させてＤＥ約４の液化溶液を得、次いで、前記方法で調製した非還元性糖質精製酵素とトレハロース遊離酵素とを含む濃縮液を澱粉グラム当たり０．０２ｍｌ、イソアミラーゼを澱粉グラム当たり５００単位及びシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを澱粉グラム当たり５単位加え、ｐＨ６．２、温度４０℃で４８時間反応させた。本反応液を加熱失活し、次いで、グルコアミラーゼを基質グラム当たり１０単位加え、ｐＨ５．０、温度５０℃で１０時間反応させた。本反応液には、固形物当たりトレハロースを８５．６％含有していた。本反応液を加熱失活し、常法に従って、脱色、脱塩して精製し、濃縮して濃度４５％のシラップを得た。本トレハロース高含有低還元性糖質シラップを、実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、次いで、実施例Ａ−５の方法に準じて、濃縮、晶出させてブロックを調製し、切削機にて粉砕して、トレハロース含水結晶とともにソルビトールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質粉末を原料澱粉に対して固形物当たり約８０％の収率で得た。本品は、取扱いが容易であり、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物などに有利に利用できる。
【０１４８】
【実施例Ａ−９】
グルコース２ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地をファーメンターにとり、加熱滅菌、冷却し、これにピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）を植菌し、温度２７℃で約４０時間、通気攪拌培養した。この培養液のマルトース・トレハロース変換酵素の活性は、培養液ｍｌ当たり０．５５単位であった。この培養液１８ｌから回収した湿重量０．１８ｋｇの菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約１．５ｌを、超音波破砕装置で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約１８単位有する濃縮酵素液約５００ｍｌを回収した。１５％とうもろこし澱粉乳（ｐＨ５．５）に、α−アミラーゼ、ナガセ生化学工業株式会社製『スピターゼＨＳ』を澱粉グラム当たり２単位加えて攪拌し、加熱糊化、液化させ、直ちにオートクレーブ（１２０℃）を２０分間行った後、温度５５℃、ｐＨ５．０に調整した。これにイソアミラーゼを澱粉グラム当たり３００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム当たり２０単位の割合になるように加え、２４時間反応させ、マルトース含量約９２％の糖液を得た。その反応液を１００℃で２０分間加熱した後、温度２０℃、ｐＨ７．０に調整し、これに前記方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり１．５単位の割合になるよう加え、７２時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約５０％のシラップを得た。
【０１４９】
本品は、固形物当たり、トレハロースを約６４％含有していて還元力がＤＥ１８．０と低い。本シラップを実施例Ａ−１の方法に準じて、水素添加し、精製し、濃縮して、濃度約７０％のシラップを固形物当たり約８０％の収率で得た。本品は、トレハロースとともにマルチトール及び少量のソルビトールを含有する還元性を低減させたＤＥ１未満の糖質シラップで、温和な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品、など各種組成物に有利に利用できる。
【０１５０】
【実施例Ｂ−１ 甘味料】
実施例Ａ−７の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末１重量部に、α−グリコシルステビオシド、東洋精糖株式会社販売『αＧスイート』０．０１重量部及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、味の素株式会社販売『アスパルテーム』０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有し、甘味度当たりカロリーは、蔗糖の約１／２に低下している。本甘味料は、それに配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優れており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味料は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付けにも好適である。
【０１５１】
【実施例Ｂ−２ ハードキャンディー】
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得た還元性を低減させた糖質含有シラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出、変形も起こらない高品質のハードキャンディーである。
【０１５２】
【実施例Ｂ−３ チョコレート】
カカオペースト４０重量部、カカオバター１０重量部、蔗糖３０重量部、実施例Ａ−８の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末２０重量部を混合してレファイナーに通して粒度を下げた後、コンチェに入れて５０℃で２昼夜練り上げる。この間に、レシチン０．５重量部を加え充分に混和分散させた。次いで、温度調節器で３１℃に調節し、バターの固まる直前に型に流し込み、振動機でアワ抜きを行い、１０℃の冷却トンネルを２０分間くぐらせて固化させた。これを型抜きして包装し製品を得た。本品は、吸湿性がなく、色、光沢共によく、内部組織も良好で、口中でなめらかに溶け、上品な甘味とまろやかな風味を有する。
【０１５３】
【実施例Ｂ−４ チューインガム】
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部及び実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末３重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも良好なチューインガムである。
【０１５４】
【実施例Ｂ−５ 加糖練乳】
原乳１００重量部に実施例Ａ−３の方法で得た還元性を低減させた糖質含有シラップ３重量部及び蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【０１５５】
【実施例Ｂ−６ 乳酸菌飲料】
脱脂粉乳１７５重量部、実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質高含有粉末８０重量部及び特開平４−２８１７９５号公報で開示されているラクトスクロース高含有粉末５０重量部を水１，２００重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【０１５６】
【実施例Ｂ−７ 粉末ジュース】
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末５０重量部、蔗糖１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ酸０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量部、クエン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部、粉末香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに、実施例Ａ−６の方法で得たトレハロース高含有シラップをバインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。また、本品は異味、異臭がなく、長期に安定であった。
【０１５７】
【実施例Ｂ−８ カスタードクリーム】
コーンスターチ１００重量部、実施例Ａ−６の方法で得た還元性を低減させた糖質含有シラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗糖２０重量部及び食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２８０重量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳１，０００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて撹拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【０１５８】
【実施例Ｂ−９ ういろうの素】
米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、蔗糖４０重量部、実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末８０重量部及びプルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当りも良好で、風味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良い。
【０１５９】
【実施例Ｂ−１０ あん】
原料あずき１０重量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きして、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重量部を得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例Ａ−９の方法で得た還元性を低減させた糖質含有シラップ５重量部及び水４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、製品のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼けもなく、舌ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まんじゅう、だんご、もなか、氷菓などのあん材料として好適である。
【０１６０】
【実施例Ｂ−１１ パン】
小麦粉１００重量部、イースト２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−７の方法で得た還元性を低減させた糖質含有粉末１重量部及び無機フード０．１重量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。本品は、色相、すだちともに良好で適度な弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【０１６１】
【実施例Ｂ−１２ ハム】
豚もも肉１，０００重量部に食塩１５重量部及び硝酸カリウム３重量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例Ａ−８の方法で得た還元性を低減させた糖質含有粉末４０重量部及び香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、燻煙し、クッキングし、冷却包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【０１６２】
【実施例Ｂ−１３ 粉末ペプチド】
濃度４０％食品用大豆ペプチド溶液、不二製油株式会社製『ハイニュートＳ』１重量部に、実施例Ａ−８の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末２重量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用できる。
【０１６３】
【実施例Ｂ−１４ 化粧用クリーム】
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末２重量部、α−グリコシル ルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリル１０重量部及び防腐剤の適量を、常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部及び精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【０１６４】
【実施例Ｂ−１５ 固体製剤】
ヒト天然型インターフェロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製）を、常法に従って、固定化抗ヒトインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に含まれるヒト天然型インターフェロン−αを吸着させ、安定剤であるウシ血清アルブミンを素通りさせて除去し、次いで、ｐＨを変化させて、ヒト天然型インターフェロン−αを実施例Ａ−７の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末を５％含有する生理食塩水を用いて溶出した。本液を精密濾過し、約２０倍量の株式会社林原商事販売無水結晶マルトース粉末『ファイントース』に加えて脱水、粉末化し、これを打錠機にて打錠し、１錠（約２００ｍｇ）当たりヒト天然型インターフェロン−αを約１５０単位含有する錠剤を得た。本品は、舌下錠などとして、一日当たり、大人１乃至１０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性疾患、アレルギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫瘍などの治療に有利に利用できる。とりわけ、近年、患者数の急増しているエイズ、肝炎などの治療剤として有利に利用できる。本品は、本発明の非還元性糖質と無水結晶マルトースが共に安定剤として作用し、室温で放置してもその活性を長期間よく維持する。
【０１６５】
【実施例Ｂ−１６ 糖衣錠】
重量１５０ｍｇの素錠を芯剤とし、これに実施例Ａ−８の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部及び酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じ還元性を低減させた糖質粉末６５重量部、プルラン１重量部及び水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、ロウ液で艶出しして光沢の在る外観の優れた糖衣錠を得た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間維持する。
【０１６６】
【実施例Ｂ−１７ 練歯磨】
配合
第２リン酸カルシウム ４５．０重量部
プルラン ２．９５重量部
ラウリル硫酸ナトリウム １．５重量部
グリセリン ２０．０重量部
ポリオキシエチレンソルビタンラウレート ０．５重量部
防腐剤 ０．０５重量部
実施例Ａ−５の方法で得た還元性を低減させた糖質粉末 １２．０重量部
マルチトール ５．０重量部
水 １３．０重量部
上記の材料を常法に従って混合し、練歯磨を得た。本品は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として好適である。
【０１６７】
【実施例Ｂ−１８ 流動食用固体製剤】
実施例Ａ−７の方法で製造した還元性を低減させた糖質粉末５００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【０１６８】
【実施例Ｂ−１９ 外傷治療用膏薬】
実施例Ａ−５の方法で製造した還元性を低減させた糖質粉末２００重量部及びマルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、トレハロースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから、治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【０１６９】
【発明の効果】
上記から明らかなように、本発明の分子中にトレハロース構造を有する糖質及び／又はトレハロースからなる非還元性糖質とともに澱粉糖アルコールを含有してなる還元性を低減させた糖質は、安定性に優れ、良質で上品な甘味を有している。また、経口摂取により消化吸収され、カロリー源となる。とりわけ、これに含まれるトレハロースは、よく代謝利用される。従って、本発明の還元性を低減させた糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。また、本発明の還元性を低減させた糖質の原料用低還元性糖質としては、澱粉を液化した溶液に、非還元性糖質生成酵素を澱粉枝切酵素及び／又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに作用させることにより、澱粉からの分子中にトレハロース構造を有する糖質やトレハロースなどの非還元性糖質の収量を高め、比較的低分子、低粘度で取扱い容易な低還元性糖質が得られ、また、マルトースにマルトース・トレハロース変換酵素を作用させることにより、トレハロースとマルトースとの混合糖質が得られ、これらは、いずれも本発明の原料糖質として好適であり、本発明の工業実施を極めて容易にする。
【０１７０】
本発明の確立は、安価で無限の資源である澱粉から、従来望むべくして容易に得られなかった非還元性糖質、還元性を低減させた糖質を工業的に大量かつ安価に提供できる全く新しい道を拓くこととなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品業界は言うに及ばず、農水畜産業、化学工業にも及びこれら産業界に与える工業的意義は計り知れないものがある。
【図面の簡単な説明】
【図１】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非還元性糖質生成酵素の活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非還元性糖質生成酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非還元性糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図４】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非還元性糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来の非還元性糖質生成酵素の活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来の非還元性糖質生成酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図７】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来の非還元性糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来の非還元性糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】ＤＥＡＥ−トヨパールからの本発明のトレハロース遊離酵素と非還元性糖質生成酵素の溶出パターンを示す図である。
【図１０】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１１】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１２】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１３】本発明のリゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１４】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１５】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１６】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１７】本発明のアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a saccharide having reduced reducing ability, a method for producing the same, and uses, and more specifically, a saccharide having a trehalose structure in the molecule and / or a starch sugar alcohol together with a non-reducing saccharide consisting of trehalose. The present invention relates to a saccharide containing substantially no reducing property, a method for producing the same, and a use thereof.
[0002]
[Prior art]
Trehalose (α, α-trehalose) has been known for a long time as a non-reducing carbohydrate having glucose as a constituent sugar, and its existence is “Advanceds in Carbohydrate Chemistry”. 18: 201-225 (1963) Academic Press (USA) and “Applied and Environmental Microbiology”, 56: 3213-3215 As described in the page (1990), it covers a wide range of microorganisms, mushrooms, insects, etc. in small quantities. Non-reducing carbohydrates such as trehalose do not cause an aminocarbonyl reaction with substances having amino groups such as amino acids and proteins, and do not damage amino acid-containing substances, so that they can be used and processed without concern about browning and deterioration. Therefore, establishment of an industrial production method is desired.
[0003]
As a method for producing trehalose, for example, a method using microbial cells reported in Japanese Patent Laid-Open No. 50-154485, or maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase proposed in Japanese Patent Laid-Open No. 58-216695 can be used. A method of converting maltose by a combination is known. However, in the method using a microbial cell, the content of trehalose contained in the microbial cell is usually 15 w / w% per solid (hereinafter, unless otherwise specified, w / w% is simply abbreviated as%), and the process of extracting and purifying this is complicated and unsuitable as an industrial production method. In addition, both the methods using maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase are via glucose-1 phosphate, and it is difficult to increase the substrate concentration, and the reaction system of both enzymes is a reversible reaction. The product production rate is low, and furthermore, it is difficult to keep the reaction system of both enzymes stable and allow the reaction to proceed smoothly, and it has not yet been realized as an industrial production method.
[0004]
In this connection, “Monthly Food Chemical”, August issue, pages 67 to 72 (1992), “Current status and issues of starch utilization development”, “Oligosaccharide”, Although the range of application is conceivable, it is said that enzymatic production using the direct sugar transfer and hydrolysis reaction of the present sugar from starch sugar is currently impossible scientifically. " As described above, it has been conventionally considered that it is impossible to produce trehalose by enzymatic reaction using starch as a raw material.
[0005]
On the other hand, it is known that partially decomposed starch produced from starch as a raw material, for example, starch liquefaction product, various dextrins, various maltooligosaccharides, etc., usually has a reducing group at the end of the molecule and exhibits reducibility. Yes. Such a starch partial decomposition product is referred to as a reducing starch partial decomposition product in the present specification. In general, a reducing starch partial decomposition product represents the magnitude of the reducing power per solid as Dextrose Equivalent (DE). Those with large values usually have small molecules, low viscosity, and strong sweetness, but are highly reactive and easily cause aminocarbonyl reactions with substances having amino groups such as amino acids and proteins. Thus, it is known that the quality is easily deteriorated.
[0006]
Various properties of such a reduced starch partial decomposition product depend on the size of DE, and the relationship between the reduced starch partial decomposition product and DE is extremely important. Traditionally, the industry has even believed that it was impossible to break this relationship.
[0007]
In order to solve this problem, the present inventors previously described Japanese Patent Application No. 5-349216. (Japanese Patent Laid-Open No. 7-143876) And a novel non-reducing saccharide-forming enzyme that produces a non-reducing saccharide having a trehalose structure at the end of the molecule from one or more reducing starch partial degradation products selected from a glucose polymerization degree of 3 or more The enzyme is referred to as a non-reducing saccharide-forming enzyme throughout this specification.) Using this non-reducing saccharide-forming enzyme, a trehalose structure is formed at the end of the molecule from the reduced starch partial degradation product. A non-reducing sugar having a glucose polymerization degree of 3 or more, a low-reducing sugar containing the same, and a method for producing trehalose from these sugars were established.
[0008]
Further, the present inventors have disclosed Japanese Patent Application No. 6-79291. (JP-A-7-213283) Then, a novel trehalose-releasing enzyme (this enzyme, which specifically hydrolyzes the bond between the trehalose part of the non-reducing carbohydrate having a trehalose structure at the end of the molecule and a glucose polymerization degree of 3 or more and the other part) Throughout the present specification, it is referred to as trehalose-releasing enzyme), and a relatively high yield of trehalose is produced from a reduced starch partial degradation product by using the aforementioned non-reducing saccharide-forming enzyme and the present trehalose-releasing enzyme in combination. Established a method. However, when producing a sugar having a trehalose structure in the molecule or a non-reducing sugar such as trehalose from a reduced starch partial decomposition product using these enzymes, an unreacted reduced starch partial decomposition product In addition to the inevitable persistence, it has been found that reducing starch sugars such as glucose and maltose are newly produced. It is strongly desired to further reduce the reducing ability of low-reducing saccharides containing reductive starch sugar together with such non-reducing saccharides.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to a saccharide having a trehalose structure in the molecule, that is, a non-reducing saccharide having a trehalose structure at the end of the molecule (hereinafter, this substance is referred to herein as α-glycosyl trehalose). Non-reducing carbohydrates having a polymerization degree of 1 or 2 or more in both glucoses of trehalose (hereinafter, this substance is referred to herein as α-glycosyl α-glycoside) and non-reducing carbohydrates such as trehalose. Establishing a saccharide with reduced reducing saccharides that contains reducing saccharides together with reducing saccharides, and a method for producing the same, and also provides uses of these saccharides is there.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have focused on the hydrogenation method of the low-reducing carbohydrate and have continued various studies. As a result, hydrogenation of low-reducing saccharides containing reducing starch sugars together with non-reducing saccharides consisting of trehalose structures and / or trehalose in the molecule may adversely affect the non-reducing saccharides. The reducing starch sugar becomes the corresponding starch sugar alcohol, and it is found that the reducing ability of the low-reducing carbohydrate of the raw material can be further reduced and the reducing ability can be substantially extinguished. Was completed.
[0011]
In addition, the present inventors also examined a method for producing a raw material, and found that a low-reducing sugar containing a reducing starch sugar together with a sugar having a trehalose structure in the molecule and / or a non-reducing sugar consisting of trehalose. As the quality, for example, a non-reducing saccharide-forming enzyme or a non-reducing saccharide-forming enzyme and a trehalose-free enzyme can be advantageously used on a reduced starch partial decomposition product having a glucose polymerization degree of 3 or more. In particular, when a non-reducing saccharide-forming enzyme or non-reducing saccharide-forming enzyme and trehalose-releasing enzyme are allowed to act on a solution in which starch is liquefied, starch debranching enzyme and / or cyclomaltodextrin glucanotransferase is used. The low-reducing saccharide obtained by using the combination of these compounds is advantageous, and the applicant of the present application is described in Japanese Patent Application No. 6-144092. (Japanese Patent Laid-Open No. 7-170977) The present inventors have found that the low-reducing carbohydrate obtained by allowing maltose and trehalose converting enzyme to act on maltose is also advantageous, and thus completed the present invention.
[0012]
For example, when a non-reducing saccharide-forming enzyme is allowed to act on a solution in which starch is liquefied to a relatively low DE, preferably a solution having a DE of less than 15 to produce the low-reducing saccharide, starch debranching enzyme and / or Low-reducing carbohydrates, including non-reducing saccharides obtained by the action of cyclomaltodextrin / glucanotransferase together, reduce their reducibility compared to the case where only non-reducing saccharide-forming enzymes are allowed to act. It has been found that the molecular weight is remarkably reduced, the viscosity is lowered, the handling is easy, and it is suitable as a raw material carbohydrate of the present invention with little increase. Incidentally, when glucoamylase was allowed to act on the low-reducing saccharide thus obtained, it was also found that the trehalose content contained in the structure was greatly increased. In addition, when a trehalose is produced by allowing a non-reducing saccharide-forming enzyme and a trehalose-releasing enzyme to act on a solution in which starch is liquefied to a relatively low DE, preferably a solution of less than DE15, starch debranching enzyme and / or cyclomalto Trehalose obtained by the action of dextrin / glucanotransferase together has a significantly increased yield compared to the case where only non-reducing saccharide-forming enzyme and trehalose-free enzyme are allowed to act. It has also been found to be suitable. It was also found that a mixed carbohydrate of trehalose and maltose produced from maltose is also suitable as a raw material carbohydrate of the present invention due to the action of maltose / trehalose converting enzyme. It is possible to advantageously carry out hydrogenation using a saccharide having a trehalose structure in the molecule thus obtained and / or a low-reducing saccharide consisting of trehalose with an increased non-reducing saccharide content as a raw material. . The thus-reduced reduced saccharide of the present invention is a saccharide that does not substantially exhibit reducibility, preferably a saccharide of less than DE1, has high stability, is easy to handle, and has a wide range. For example, it can be advantageously used for various compositions such as foods, drinks, cosmetics, and pharmaceuticals.
[0013]
First, as the non-reducing saccharide-forming enzyme used in the present invention, one or two or more reducing starch partial degradation products selected from a glucose polymerization degree of 3 or more contained in a solution obtained by liquefying starch to a relatively low DE Any enzyme capable of producing α-glycosyl trehalose from E. coli, for example, Japanese Patent Application No. 5-349216 (Japanese Patent Laid-Open No. 7-143876) Enzymes derived from microorganisms belonging to the genus Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Kurtobacterium, Mycobacterium, and Terrabacter can be advantageously used. . If necessary, it is also optional to use a heat-resistant non-reducing saccharide-forming enzyme. For example, the applicant of the present application describes Japanese Patent Application No. 6-166011. (JP-A-8-66188) It is also possible to advantageously use the heat-resistant non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Sulfolobus genus disclosed in (1). In addition, as trehalose-releasing enzyme, α-glycosyl trehalose produced by allowing a non-reducing saccharide-forming enzyme to act on a solution in which starch is liquefied specifically binds between the trehalose part and the other part. As long as it is an enzyme that hydrolyzes, for example, Japanese Patent Application No. 6-79291 (JP-A-7-213283) The enzymes derived from microorganisms belonging to the genus Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium, Micrococcus and the like disclosed in the above can be advantageously used. Further, if necessary, it is also optional to use a thermostable trehalose-releasing enzyme. For example, the applicant of the present application describes Japanese Patent Application No. 6-166126. (JP-A-8-66187) The trehalose releasing enzyme belonging to the genus Sulfolobus disclosed in the above can also be advantageously used.
[0014]
Furthermore, the maltose / trehalose converting enzyme used in the present invention may be any enzyme that produces trehalose from maltose. For example, the applicant of the present application has disclosed Japanese Patent Application No. 6-144092. (Japanese Patent Laid-Open No. 7-170977) Enzymes derived from microorganisms belonging to the genera Pymelobacter, Pseudomonas, Thermus and the like disclosed in (1) can be advantageously used. For example, a method for preparing a non-reducing saccharide-forming enzyme and / or trehalose-releasing enzyme from a microorganism, and a method for preparing a maltose / trehalose-converting enzyme include culturing a microorganism capable of producing these enzymes. What is necessary is just to prepare.
[0015]
The medium used for culturing the microorganism may be any nutrient medium that can grow microorganisms and can produce the enzyme, and may be either a synthetic medium or a natural medium. As the carbon source, any substance that can be assimilated by microorganisms may be used. For example, sugars such as glucose, fructose, lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, molasses, and reduced starch partial degradation products, citric acid, succinic acid, etc. An organic acid such as or a salt thereof can also be used. The concentration of these carbon sources in the medium is appropriately selected depending on the type of carbon source. For example, in the case of a reduced starch partial decomposition product, usually 20% or less is desirable, and 5% or less is preferred from the growth and proliferation of bacteria. Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts and nitrates, and organic nitrogen-containing materials such as urea, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract and meat extract. Moreover, as an inorganic component, calcium salt, magnesium salt, potassium salt, sodium salt, phosphate, manganese salt, zinc salt, iron salt, copper salt, molybdenum salt, cobalt salt etc. are used suitably, for example. Furthermore, amino acids, vitamins and the like are also used as necessary.
[0016]
Cultivation is usually carried out aerobically under conditions selected from a temperature of 4 to 40 ° C., preferably 20 to 37 ° C.,
[0017]
In this way, the enzyme is recovered after culturing the microorganism. Enzyme activity is observed in both the microbial cells and the sterilization solution of the culture, and the microbial cells and the sterilization solution can be collected as a crude enzyme solution, or the entire culture can be used as a crude enzyme solution. A known solid-liquid separation method is employed to remove the cells from the culture. For example, a method of centrifuging the culture itself as it is, a method of separating by filtration using a precoat filter or the like, a method of separating by membrane filtration such as a flat membrane or a hollow fiber membrane, etc. are appropriately employed. The sterilizing solution can be used as an enzyme solution as it is, but generally it is used after being concentrated. As the concentration method, for example, an ammonium sulfate salting out method, an acetone and alcohol precipitation method, a membrane concentration method such as a flat membrane or a hollow fiber membrane, or the like is employed.
[0018]
Furthermore, the disinfectant solution and the concentrate thereof can be immobilized by a known method. For example, a binding method to an ion exchanger, a covalent bond / adsorption method with a resin and a membrane, a comprehensive method using a polymer substance, and the like are employed. Moreover, although the microbial cell isolate | separated from the culture can be used as a crude enzyme as it is, you may fix | immobilize and use this. As an example, this is mixed with sodium alginate and dropped into a calcium chloride solution to be gelled and fixed in a granular form. This granulated product may be further fixed with polyethyleneimine or glutaraldehyde. It is also possible to extract an enzyme from the cells and use the extract as a crude enzyme solution. For example, an enzyme can be extracted from the cells by ultrasonic crushing, glass beads and alumina mechanical crushing, French press crushing, etc., and a clear crude enzyme solution can be obtained by centrifugation or membrane filtration. .
[0019]
This enzyme solution can be used as it is, but can be further purified and used by a known method. As an example, after dialysis of a crude enzyme preparation concentrated by subjecting the treated solution of the culture solution to salting out with ammonium sulfate, anion exchange column chromatography using “DEAE-Toyopearl” manufactured by Tosoh Corporation, followed by “ A single enzyme can be obtained electrophoretically by purifying it using hydrophobic column chromatography using "Butyl Toyopearl" etc. or gel filtration chromatography using "Toyopearl HW-55" etc. .
[0020]
The non-reducing saccharide-producing enzyme thus obtained generally has the following physicochemical properties, for example.
(1) Action
Α-Glycosyl trehalose is produced from one or two or more reduced starch partial degradation products selected from a glucose polymerization degree of 3 or more.
(2) Molecular weight
About 76,000 to 87,000 daltons by SDS-gel electrophoresis.
(3) Isoelectric point
PI of about 3.6 to 4.6 as determined by ampholine-containing electrophoresis.
(4) Optimal temperature
pH 7.0, reaction for 60 minutes, around 35-40 ° C.
(5) Optimum pH
PH of about 6.4 to 7.2 after reaction at 40 ° C. for 60 minutes.
(6) Temperature stability
Stable up to around 35-40 ° C with pH 7.0 and 60 minutes holding.
(7) pH stability
The pH is about 5.5 to 11.0 at 25 ° C. for 16 hours.
[0021]
The non-reducing saccharide-forming enzyme activity was measured by adding 1 ml of enzyme solution to 4 ml of maltopentaose 1.25 w / v% (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) as a substrate and allowing the mixture to react at 40 ° C. for 60 minutes. Thereafter, the reaction is stopped by heating at 100 ° C. for 10 minutes, the reaction solution is accurately diluted 10 times with deionized water, and the reducing power of the diluted solution is measured by the Somogy Nelson method. As a control, the same measurement is performed using an enzyme solution inactivated by heating at 100 ° C. for 10 minutes in advance. Using the above measurement method, the amount of enzyme that reduces the reducing power corresponding to 1 μmole of maltopentaose per minute was defined as 1 unit.
[0022]
The trehalose-free enzyme obtained as described above generally has the following physicochemical properties, for example.
(1) Action
It specifically hydrolyzes the bond between the trehalose moiety of α-glycosyl trehalose and the other glycosyl moiety.
(2) Molecular weight
About 57,000 to 68,000 daltons by SDS-gel electrophoresis.
(3) Isoelectric point
PI of about 3.3 to 4.6 as determined by ampholine-containing electrophoresis.
(4) Optimal temperature
pH 7.0, reaction for 30 minutes, around 35 to 45 ° C.
(5) Optimum pH
PH of about 6.0 to 7.5 after reaction at 40 ° C. for 30 minutes.
(6) Temperature stability
Stable up to around 30 to 45 ° C with pH 7.0 and 60 minutes holding.
(7) pH stability
The pH is about 5.0 to 10.0 at 25 ° C. for 16 hours.
[0023]
The activity of trehalose-free enzyme is measured as follows. Add 1 ml of enzyme solution to 4 ml of maltotriosyl trehalose (also known as α-maltotetraosyl α-D-glucoside) 1.25 w / v% (50 mM phosphate buffer, pH 7.0) as a substrate at 40 ° C. for 30 minutes. After reacting, the reaction is stopped by adding a somological copper solution, and the reducing power is measured by the somological Nelson method. As a control, the same measurement is performed using an enzyme solution inactivated by heating at 100 ° C. for 10 minutes in advance. Using the above measurement method, the amount of enzyme that increases the reducing power corresponding to 1 μmole of glucose per minute is defined as 1 unit.
[0024]
Furthermore, the maltose / trehalose converting enzyme obtained as described above has the following physicochemical properties.
(1) Action
Convert maltose to trehalose and convert trehalose to maltose.
(2) Molecular weight
About 57,000 to 120,000 daltons by SDS-gel electrophoresis.
(3) Isoelectric point
PI of about 3.8 to 5.1 by an ampholine-containing electrophoresis.
(4) Activity inhibition
1 mM Cu ++ , Hg ++ Alternatively, it is inhibited with 50 mM Tris-HCl buffer.
(5) Origin
It is an enzyme produced by a microorganism.
[0025]
The activity of maltose / trehalose converting enzyme is measured as follows. 1 ml of enzyme solution is added to 1 ml of maltose 20 w / v% (10 mM phosphate buffer, pH 7.0) as a substrate, the reaction temperature is 25 ° C., the reaction is performed for 60 minutes, and the reaction is performed by heating at 100 ° C. for 10 minutes. Stop. This reaction solution was precisely diluted 11-fold with 50 mM phosphate buffer pH 7.5, and 0.1 ml of a trehalase-containing solution (1 unit / ml) was added to 0.4 ml of the diluted solution at 45 ° C. and 120 ° C. After incubating for minutes, the amount of glucose in the reaction solution is quantified by the glucose oxidase method. As a control, the same measurement is performed using an enzyme solution and trehalase which have been inactivated by heating at 100 ° C. for 10 minutes in advance. Using the above measurement method, the amount of trehalose produced by maltose / trehalose converting enzyme is determined from the increasing amount of glucose, and the amount of enzyme producing 1 μmole of trehalose per minute is defined as 1 unit.
[0026]
Next, the starch debranching enzyme used in the present invention is an enzyme that acts on a solution in which starch is liquefied to a relatively low DE, preferably a liquefied solution of less than
[0027]
In addition to the aforementioned starch debranching enzyme and / or cyclomaltodextrin / glucanotransferase, if necessary, it acts on other amylases, preferably a solution in which starch is liquefied to a relatively low DE, mainly. Amylases that produce oligosaccharides with a glucose polymerization degree of 3 or more, such as α-amylase, maltotriose-producing amylase, maltotetraose-producing amylase, maltopentaose-producing amylase, maltohexaose-producing amylase, maltoheptaose-producing amylase, etc. It can also be advantageously implemented.
[0028]
The starch used in the present invention may be ground starch such as corn starch, rice starch and wheat starch, or underground starch such as potato starch, sweet potato starch and tapioca starch. In order to liquefy starch, starch milk in which starch is suspended in water is usually used, preferably at a concentration of 10% or more, more preferably about 20 to 50%. Or you may liquefy with an enzyme. A relatively low degree of liquefaction is suitable, desirably less than DE15, more desirably less than DE10. When liquefying with an acid, for example, it may be liquefied with hydrochloric acid, phosphoric acid, oxalic acid, etc., and then neutralized to the required pH with calcium carbonate, calcium oxide, sodium carbonate or the like. In the case of liquefying with an enzyme, use of α-amylase, particularly heat-resistant liquefied α-amylase is suitable.
[0029]
A non-reducing saccharide-forming enzyme is allowed to act together with starch debranching enzyme and / or cyclomaltodextrin / glucanotransferase in a solution obtained by liquefying starch thus obtained, or non-reducing saccharide-forming enzyme and In order for trehalose-releasing enzyme to act together with starch debranching enzyme and / or cyclomaltodextrin / glucanotransferase, it may be carried out at a pH and temperature at which these enzymes can act, usually
[0030]
The amount of enzyme used may be appropriately selected depending on the operating conditions and reaction time. Usually, in the case of non-reducing saccharide-forming enzyme and trehalose-free enzyme per gram of solid matter with respect to a solution obtained by liquefying starch as a substrate. Selected from about 0.01 to 100 units, and in the case of starch debranching enzyme, from about 1 to 10,000 units, and in the case of cyclomaltodextrin glucanotransferase, about 0.05 to 500 units. Chosen from. The low-reducing saccharide containing the reducing starch sugar together with the non-reducing saccharide thus obtained is a non-reducing starch debranching enzyme and / or cyclomaltodextrin / glucanotransferase in a solution obtained by liquefying starch. It contains a large amount of relatively low molecular weight α-glycosyl trehalose and / or α-glycosyl, α-glycoside, or trehalose because it acts together with saccharide-forming enzyme or non-reducing saccharide-forming enzyme and trehalose-releasing enzyme. It has a feature of being contained in a large amount and is suitable as a low-reducing saccharide for raw materials of the present invention. Note that α-glycosyl and α-glycoside are disclosed in Japanese Patent Application No. 6-54377 by the present applicant. (JP-A-8-127487) The name includes α-D-oligoglycosyl and α-D-oligoglucoside disclosed in 1. above.
[0031]
The reaction solution is filtered, centrifuged, etc., to remove insoluble matters, and then decolorized with activated carbon, desalted with H-type and OH-type ion exchange resins, purified, concentrated, and made into a syrup-like product. . Furthermore, it is optional to dry it into a powdered product. If necessary, further purification, for example, fractionation by column chromatography such as ion exchange column chromatography, activated carbon column chromatography, silica gel column chromatography, fractionation with organic solvents such as alcohol and acetone, membranes with appropriate separation performance It is also easy to obtain the low-reducing saccharide for raw materials of the present invention having an increased non-reducing saccharide content by purifying a method such as separation by one or a combination of two or more.
[0032]
In particular, as an industrial mass production method, it is preferable to employ ion exchange column chromatography. For example, strongly acidic cations disclosed in JP-A-58-23799 and JP-A-58-72598 are disclosed. It is possible to advantageously produce a low-reducing saccharide for raw materials in which contaminating saccharides are removed by column chromatography using an exchange resin and the non-reducing saccharide content is increased. At this time, it is optional to adopt any of a fixed floor method, a moving floor method, and a simulated moving floor method.
[0033]
A low-reducing saccharide including a non-reducing saccharide having a trehalose structure in the molecule thus obtained is converted into an amylase, for example, α-amylase, β-amylase, glucoamylase, or the like, if necessary. -It is also optional to produce a low-reducing saccharide for raw materials by subjecting it to further processing such as degradation with glucosidase to adjust sweetness or reduce viscosity.
[0034]
The saccharide having reduced reducing properties obtained in this manner is advantageously used as the raw material saccharide of the present invention. As the raw material carbohydrate, a carbohydrate having a trehalose structure in the molecule and a non-reducing carbohydrate content consisting of trehalose is desirable, usually 20% or more, desirably 40% or more, more desirably 60% or more. It is preferable that the DE is low, and it is usually less than
[0035]
In order to hydrogenate a carbohydrate having a trehalose structure and / or a low-reducing carbohydrate containing a reducing starch sugar together with a non-reducing carbohydrate consisting of trehalose in the molecule thus obtained, the non-reducing carbohydrate It is sufficient that the reducing starch sugar contained therein is reduced to starch sugar alcohol without decomposing it. For example, the raw material sugar is made into an aqueous solution of 30 to 70% and placed in an autoclave, and about 8 to Raney nickel is used as a catalyst. Add 10% and raise the temperature to 90-150 ° C. with stirring to complete the hydrogenation, preferably hydrogenation until DE is reduced below 0.5 to remove Raney nickel, then conventional method According to the above, after a purification process such as decolorization with activated carbon or desalting with an ion exchange resin, it is concentrated to a syrup-like product. If necessary, it is optional to further make a dry, powdered product, or to make a crystalline powdery product from which trehalose has been crystallized. The reduced sugar of the present invention thus produced comprises non-reducing carbohydrate and / or trehalose having a trehalose structure in the molecule such as α-glycosyl trehalose and α-glycosyl α-glycoside. In addition to non-reducing saccharides, it contains one or more starch sugar alcohols selected from sorbitol, maltitol, maltotriitol, maltotetriitol, and maltopentitol.
[0036]
Therefore, the reduced carbohydrate of the present invention is extremely low in reducibility and stable, and even when mixed and processed with other materials, particularly substances having amino acids such as amino acids, oligopeptides and proteins, browning occurs. It does not cause odors and does not damage other mixed materials. In addition, in the case where the reducing power is low but the viscosity is low and the average degree of polymerization of glucose is low, it has a good quality and elegant sweetness.
[0037]
In addition, a carbohydrate having a trehalose structure in a molecule contained in the reduced carbohydrate of the present invention is decomposed by amylase, for example, pancreatic α-amylase, so that low molecular weight non-reducing oligosaccharide or low molecular weight Malto-oligosaccharides are produced, and these oligosaccharides are also easily decomposed by α-glucosidase and small intestine enzymes to produce glucose and trehalose. Further, the produced trehalose is easily degraded to glucose by trehalase. Digested and absorbed by ingestion and used as a calorie source. It can also be used as a sweetener that is not easily fermented by caries-causing bacteria and that is unlikely to cause caries.
[0038]
In addition, since it is a stable sweetener, it can be advantageously used as a sugar coating for tablets in combination with binders such as pullulan, hydroxyethyl starch, and polyvinylpyrrolidone in the case of products with high crystal content. In addition, it has properties such as osmotic pressure controllability, shaping, irradiating properties, moisture retention, viscosity, anti-crystallization of other sugars, difficult fermentation, and anti-aging properties of gelatinized starch.
[0039]
In addition, the reduced carbohydrate of the present invention has various compositions such as foods, feeds, feeds, cosmetics, and pharmaceuticals as sweeteners, taste improvers, quality improvers, stabilizers, excipients, and the like. It can be used to advantage.
[0040]
The reduced carbohydrate of the present invention can be used as it is as a seasoning for sweetening. If necessary, for example, flour, glucose, maltose, sucrose, isomerized sugar, honey, maple sugar, isomaltoligosaccharide, galactooligosaccharide, fructooligosaccharide, lactosucrose, sorbitol, maltitol, lactitol, dihydrochalcone, stevioside, α -May be used in admixture with one or more suitable amounts of other sweeteners such as glycosyl stevioside, rebaudioside, glycyrrhizin, L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, saccharin, glycine, alanine, If necessary, it can be used by mixing with a bulking agent such as dextrin, starch, lactose and the like.
[0041]
Further, the reduced carbohydrate of the present invention, particularly a crystalline product, may be used as it is or mixed with a filler, excipient, binder, etc. It is also optional to use it in various shapes such as a rod, plate, cube, and tablet.
[0042]
In addition, the sweetness of carbohydrates with reduced reducing ability according to the present invention is well harmonized with various substances having other tastes such as acidity, salt to taste, astringency, umami, and bitterness, and also has acid resistance and heat resistance. Since it is large, it can be advantageously used for sweetening and taste improvement of general foods and drinks, and quality improvement.
[0043]
For example, amino acids, peptides, soy sauce, powdered soy sauce, miso, powdered miso, moromi, hishio, sprinkle, mayonnaise, dressing, vinegar, three cups of vinegar, sushi vinegar, Chinese soup, tempura soup, noodle soup, sauce, ketchup, yakiniku It can be advantageously used as various seasonings such as sauce, curry roux, stew, soup, dashi, nucleic acid-based seasoning, compound seasoning, mirin, new mirin, table sugar, coffee sugar.
[0044]
In addition, for example, Japanese rice cakes such as rice crackers, hail, rice cakes, rice cakes, manju, oirou, chanterelles, sheep mushrooms, water sheep rice cakes, brocade balls, jelly, castella, rice cakes, bread, biscuits, crackers, cookies, pie , Pudding, butter cream, custard cream, cream puff, waffle, sponge cake, donut, chocolate, chewing gum, caramel, candy and other Western confectionery, ice cream, sorbet and other ice confectionery, fruit syrup pickled, syrup such as ice honey, flower Paste such as paste, peanut paste, fruit paste, spread, fruit such as jam, marmalade, syrup pickles, sugar cane, processed foods of vegetables, pickles such as Fukujin pickles, bedara pickles, thousand pieces pickles, pickled pickles, takan pickles, Pickles such as Chinese cabbage pickles Meat products such as fish, ham and sausage, fish meat ham, fish sausage, fish products such as kamaboko, chikuwa, tempura, sea urchin, squid salt, vinegared konbu, suki-meme, various delicacies Tsukudani, made with seaweed, wild vegetables, seaweed, small fish, shellfish, stewed beans, potato salad, side dish foods such as konbu rolls, dairy products such as yogurt and cheese, fish meat, livestock meat, fruits, bottled canned vegetables, canned food Alcohol, Sake, Synthetic Sake, Liqueur, Western Sake, etc., Coffee, Tea, Cocoa, Juice, Carbonated Beverages, Lactic Beverages, Lactic Bacterial Beverages, Soft Drinks, Pudding Mix, Hot Cake Mix, Instant Shiko, Instant Soup, etc. Instant foods, sweetening foods such as weaning foods, therapeutic foods, drinks, peptide foods, frozen foods, improving taste, and quality It can be advantageously used in such good.
[0045]
Moreover, it can also be used for the purpose of improving the palatability of feed, feed, etc. for domestic animals, poultry, and other domestic animals such as bees, cormorants and fish. In addition, tobacco, toothpaste, lipstick, lip balm, oral solution, tablets, troches, liver oil drop, mouth freshener, mouth fragrance, mouthwash, etc. It can be advantageously used as a sweetener for various compositions, as a taste improver, a corrigent, and as a quality improver, stabilizer and the like.
[0046]
The quality improver and stabilizer can be advantageously applied to various physiologically active substances that easily lose active ingredients, activity, etc., health foods containing them, and pharmaceuticals. For example, interferon-α, interferon-β, interferon-γ, tsumore necrosis factor-α, tsumore necrosis factor-β, macrophage migration inhibitory factor, colony stimulating factor, transfer factor, lymphokine such as interleukin II, insulin , Hormones such as growth hormone, prolactin, erythropoietin, egg cell stimulating hormone, BCG vaccine, Japanese encephalitis vaccine, measles vaccine, polio vaccine, seedling, tetanus toxoid, hub antitoxin, human immunoglobulin and other biologics, penicillin, erythromycin, Chloramphenicol, tetracycline, su G Antibiotics such as leptomycin, kanamycin sulfate, thiamine, riboflavin, L-ascorbic acid, liver oil, carotenoid, ergosterol, tocopherol and other vitamins, lipase, elastase, urokinase, protease, β-amylase, isoamylase, glucanase, lactase, etc. Enzymes, ginseng extract, suppon extract, chlorella extract, aloe extract, propolis extract and other extracts, viruses, lactic acid bacteria, live bacteria such as yeast, and various physiologically active substances such as royal jelly also lose their active ingredients and activities Therefore, it can be easily manufactured into a stable, high-quality liquid, pasty or solid health food or medicine.
[0047]
The method for adding the reduced sugar of the present invention to the various compositions as described above may be included in the process until the product is completed, for example, mixing, dissolution, melting, immersion Well-known methods such as permeation, spraying, coating, coating, spraying, pouring, crystallization and solidification are appropriately selected. The amount is usually 0.1% or more, preferably 1% or more.
[0048]
Next, the present invention will be described more specifically by experiments.
[0049]
First, the non-reducing saccharide-forming enzyme from the novel microorganisms Rhizobium sp. M-11 and Arthrobacter sp. Q36 will be described, and then the non-reducing saccharide-forming enzyme from known microorganisms will be described.
[0050]
[
It consists of maltose 2.0 w / v%, peptone 0.5 w / v%, yeast extract 0.1 w / v%, disodium phosphate 0.1 w / v%, monopotassium phosphate 0.1 w / v% and water. The liquid medium was adjusted to pH 7.0. About 100 ml of this medium is placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes, cooled, inoculated with Rhizobium species M-11 (FERM BP-4130), and incubated at 27 ° C. and 130 rpm for 24 hours. The culture was used as a seed culture solution.
[0051]
A fermenter having a volume of 30 l is charged with about 20 l of medium having the same composition as in the case of seed culture, sterilized and cooled to a temperature of 30 ° C., then inoculated with 1 w / v% of the seed culture solution,
[0052]
[
About 18 liters of the culture solution obtained in
[0053]
Further, ammonium sulfate was dissolved in the solution so as to have a saturation degree of 0.6, and allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours, and then centrifuged to recover an ammonium sulfate salted-out product. The obtained ammonium sulfate salted-out product was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), dialyzed against the same buffer for 24 hours, and centrifuged to remove insolubles. The dialysate (360 ml) was divided into two portions and subjected to ion exchange column chromatography (gel amount: 300 ml) using “DEAE-Toyopearl”.
[0054]
This enzyme was adsorbed on “DEAE-Toyopearl” and eluted from the column with the same buffer containing sodium chloride. The resulting enzyme active fraction is dialyzed against the same buffer containing 2M ammonium sulfate, the dialyzed solution is centrifuged to remove insoluble matters, and the resulting supernatant is subjected to “Butyl Toyopearl 650” manufactured by Tosoh Corporation. The used hydrophobic column chromatography (gel amount: 300 ml) was performed. The adsorbed enzyme was eluted from the column with an ammonium sulfate 2M to 0M linear gradient, and the enzyme activity fraction was recovered. Subsequently, gel filtration chromatography (gel amount: 300 ml) using “Toyopearl HW-55” was performed to collect the enzyme activity fraction. Table 1 shows the amount of enzyme activity, specific activity, and yield in each step of purification.
[0055]
[Table 1]
When the purity of the purified enzyme preparation obtained as a gel filtration eluate in the step of Table 1 was tested by electrophoresis using polyacrylamide gel (gel concentration 7.5%), it was found that the protein band was single. The enzyme preparation shown and obtained was an electrophoretically single, high purity preparation.
[0057]
[
The purified enzyme preparation obtained in
[0058]
The purified enzyme preparation was subjected to isoelectric focusing using 2% ampholine-containing polyacrylamide gel. After electrophoresis, the pH of the gel was measured to determine the isoelectric point of the enzyme. It was 3.6 to 4.6.
[0059]
The effects of temperature and pH on the enzyme activity were examined according to the activity measurement method. The results are shown in FIG. 1 (effect of temperature) and FIG. 2 (effect of pH). The optimum temperature of the enzyme was about 7.0 ° C. when reacted at pH 7.0 for 60 minutes, and the optimum pH was about 7.0 after reacting at 40 ° C. for 60 minutes. The temperature stability of the enzyme was determined by measuring the remaining enzyme activity after holding the enzyme solution (containing 50 mM phosphate buffer, pH 7.0) at each temperature for 60 minutes, cooling with water. The pH stability was determined by maintaining the enzyme in a 50 mM buffer solution at each pH at 25 ° C. for 16 hours, adjusting the pH to 7, and measuring the remaining enzyme activity. The respective results are shown in FIG. 3 (temperature stability) and FIG. 4 (pH stability). The temperature stability of this enzyme was stable up to around 40 ° C., and the pH stability was about 6 to 9.
[0060]
[
Prepare 20% aqueous solutions of glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, or maltoheptaose as substrates, and add the purified enzyme obtained in
[0061]
[Table 2]
As is apparent from the results in Table 2, each of the remaining substrates and newly generated carbohydrates PI, PII, PIII, PIV, and PV are hardly detected in the reaction product. . Each of the production rates was found to have a high production rate of 85% or more for PII, PIII, PIV and PV having a glucose polymerization degree of 4 or more, although the PI with a glucose polymerization degree of 3 was relatively low. It has been found that no new carbohydrate is produced from glucose or maltose.
[0063]
In order to purify newly produced carbohydrates from each reaction product, after decolorization, desalting and concentration, sodium-type strongly acidic cation exchange resin, “XT-1016” manufactured by Tokyo Organic Chemical Industry Co., Ltd. (
[0064]
The reducing power of these newly produced high-purity carbohydrate preparations was measured by the Somogy Nelson method and expressed in DE. The results are summarized in Table 3.
[0065]
[Table 3]
As is apparent from the results in Table 3, only a slight reducing power was observed in any of the samples. The slight reducing power is presumed to be attributable to the reducing malto-oligosaccharide derived from the substrate mixed in and remaining in the sample in a trace amount, and any newly produced carbohydrate is substantially non-reducing. It is judged that.
[0067]
[
A solution containing 10% of the carbohydrate preparation prepared in
[0068]
[Table 4]
As is apparent from the results in Table 4, all of the newly produced non-reducing carbohydrate preparations, PI, PII, PIII, PIV, and PV, have a very low degree of coloration due to the Maillard reaction, and each is a malto-oligo, which is a raw material substrate. It has been found that the non-reducing carbohydrate produced by the novel enzyme of the present invention is a carbohydrate that exhibits almost no Maillard reaction, which is only about 3 to 6% of the coloring degree of the sugar.
[0070]
[Experiment 6: Enzymatic degradation with glucoamylase]
50 mg each of the non-reducing carbohydrate preparation, PI, PII, PIII, PIV or PV prepared in
[0071]
[Table 5]
As is apparent from the results in Table 5, glucoamylase decomposes the non-reducing carbohydrate PI into one glucose molecule and one trehalose molecule, and the non-reducing carbohydrate PII into two glucose molecules and one trehalose molecule. Non-reducing carbohydrate PIII is decomposed into 3 glucose molecules and 1 trehalose molecule, non-reducing carbohydrate PIV is decomposed into 4 glucose molecules and 1 trehalose molecule, and non-reducing carbohydrate PV is 5 glucose molecules and 1 trehalose molecule. It was found that it was decomposed.
[0073]
In addition, considering the reaction characteristics of glucoamylase, the structure of these non-reducing carbohydrates is a saccharide in which glucose molecules are linked to trehalose molecules by α-1,4-linkages or α-1,6-linkages, respectively. , PI is a non-reducing saccharide having a glucose polymerization degree of 3 and 1 molecule of trehalose bound to 1 molecule of glucose, and PII is a non-reducing sugar having a glucose polymerization degree of 4 and a molecule of trehalose bound to 2 molecules of glucose. Is a non-reducing saccharide with a glucose polymerization degree of 5 in which 3 molecules of glucose are bonded to 1 molecule of trehalose, PIV is a non-reducing saccharide with a polymerization degree of glucose in which 4 molecules of glucose are bonded to 1 molecule of trehalose, and PV is trehalose. It is judged to be a non-reducing carbohydrate having a glucose polymerization degree of 7 in which 5 molecules of glucose are bonded to 1 molecule. Similarly, when β-amylase was allowed to act on a non-reducing carbohydrate preparation, PI, PII, PIII, PIV, or PV, the non-reducing carbohydrate PI, PII was not degraded, and PIII was maltose. It was found that 1 molecule was decomposed into 1 molecule of PI, PIV was decomposed into 1 molecule of maltose and 1 molecule of PII, and PV was decomposed into 2 molecules of maltose and 1 molecule of PI.
[0074]
From the above results, the reaction by the non-reducing saccharide-forming enzyme of the present invention does not involve lowering the molecular weight and increasing the molecular weight of the substrate, in other words, an intramolecular conversion reaction without changing the degree of glucose polymerization. The non-reducing carbohydrates, PI, PII, PIII, PIV and PV produced by this non-reducing saccharide-forming enzyme are α-glucosyl trehalose, α-maltosyl trehalose, α-maltotrio, respectively. Α-glycosyl trehalose (G) represented by syltrehalose, α-maltotetraosyl trehalose and α-maltopentaosyl trehalose n -T: provided that G represents a glucose residue, n represents an integer of 1 or more, and T represents α, α-trehalose. ).
[0075]
[Experiment 7: Degradation by various enzymes]
Porcine pancreatic α-amylase (sold by Sigma) and rice-derived α-glucosidase (sold by the company) using each of the non-reducing carbohydrate preparations PI, PII, PIII, PIV, or PV prepared in
[0076]
[Table 6]
[Table 7]
[Table 8]
As is apparent from the results of Table 6, the carbohydrate preparations, PI and PII are hardly degraded by α-amylase, but the carbohydrate preparations, PIII, PIV and PV are low molecular oligosaccharides by α-amylase. , PI, PII, maltotriose, maltose and glucose were found to be degraded.
[0080]
Further, as is clear from the results of Tables 7 and 8, all of the carbohydrate preparations, PI, PII, PIII, PIV, and PV were obtained with α-glucosidase and rat small intestine acetone powder enzyme in the case of glucoamylase of
[0081]
Similarly, 1 unit of porcine kidney-derived trehalase (sold by Sigma) is further added to each reaction product decomposed by α-glucosidase and rat small intestine acetone powder enzyme, and the mixture acts at pH 5.7 and 37 ° C. for 18 hours. When the sugar composition was analyzed by high performance liquid chromatography, trehalose produced by α-glucosidase and rat small intestine acetone powder enzyme was found to be trehalase in any of the carbohydrate preparations, PI, PII, PIII, PIV, and PV. It was found to degrade to glucose.
[0082]
As mentioned above,
(1) A non-reducing saccharide-forming enzyme is produced by converting α-glycosyl trehalose from one or more reduced starch partial degradation products selected from three or more glucose polymerization degrees without changing the glucose polymerization degree. Is generated.
(2) Non-reducing carbohydrate PV mainly produces non-reducing carbohydrate PII and maltotriose by α-amylase, and non-reducing carbohydrate PII has one trehalose molecule and two glucose molecules by glucoamylase. Has produced.
From these results, the non-reducing saccharide-forming enzyme of the present invention is judged to be an enzyme with a completely new mechanism of action for intramolecular conversion of the reducing end of the reducing starch partial degradation product into a non-reducing trehalose structure. Is done.
[0083]
[Experiment 8: Acute toxicity]
A 7-week-old dd mouse was used to orally administer the non-reducing carbohydrate preparation prepared in
[0084]
[Experiment 9: Production of non-reducing carbohydrate-forming enzyme from Arthrobacter sp. Q36]
The culture was performed in a fermenter for about 72 hours in the same manner as in
[0085]
[Experiment 10 Enzyme Purification]
Purification was carried out in the same manner as in
[0086]
[Table 9]
When the purity of the purified enzyme preparation obtained as a gel filtration eluate in Table 9 was examined by electrophoresis in the same manner as in
[0088]
[Experiment 11: Properties of enzyme]
When the molecular weight of the purified enzyme preparation obtained in
[0089]
As is apparent from the figure, the optimum temperature of the enzyme is around 40 ° C., and the optimum pH is about 6.5 to 7.0. The temperature stability is up to around 40 ° C., and the pH stability is about 6.0 to 9.5.
[0090]
[Experiment 12 Preparation of non-reducing carbohydrate]
Using the purified enzyme preparation obtained in
[0091]
[Experiment 13: Production and properties of non-reducing saccharide-forming enzymes from known microorganisms]
Among the known microorganisms, the specific microorganisms shown in Table 10 in which the ability to produce the non-reducing saccharide-forming enzyme of the present invention was confirmed was cultured at 37 ° C. in the case of Mycobacterium smegmatis ATCC 19420. In the same manner as in
[0092]
[Table 10]
Moreover, when these non-reducing saccharides were prepared and their structures were confirmed according to the method of Experiment 12 using partially purified enzymes derived from these known bacteria, both enzymes were non-reducing from Rhizobium sp. M-11. It was found that α-glycosyl trehalose was produced from one or two or more reducing starch partial degradation products selected from the degree of glucose polymerization of 3 or more, as in the case of the active saccharide-forming enzyme.
[0094]
Next, the trehalose releasing enzyme from the novel microorganisms Rhizobium species M-11 and Arthrobacter species Q36 will be described, and then the trehalose releasing enzyme from known microorganisms will be described.
[0095]
[Experiment 14 Production of trehalose-releasing enzyme from Rhizobium sp. M-11]
Partially decomposed starch, “Paindex #” 42.0 w / v%, peptone 0.5 w / v%, yeast extract 0.1 w / v%, disodium phosphate 0.1 w / v%, manufactured by Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. A liquid medium consisting of 0.1 w / v% monopotassium phosphate and water was adjusted to pH 7.0. About 100 ml of this medium is placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes, cooled, inoculated with Rhizobium species M-11 (FERM BP-4130), and incubated at 27 ° C. and 130 rpm for 24 hours. The culture was used as a seed culture solution.
[0096]
About 20 liters of medium having the same composition as in the case of seed culture is put into a 30 liter fermenter, sterilized and cooled to a temperature of 27 ° C., then seed culture solution 1 w / v % And aerated and stirred for about 72 hours while maintaining the temperature at 27 ° C. and the pH at 6.0 to 8.0.
[0097]
The enzyme activity of the non-reducing saccharide-forming enzyme in the culture solution was about 1.5 units / ml, and the enzyme activity of the trehalose-free enzyme of the present invention was about 2 units / ml. A portion of the culture solution is collected and centrifuged to separate the cells and the culture supernatant, and the cells are suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) in the same volume as the original culture solution. Then, the enzyme activity of the bacterial cell suspension and the culture supernatant was measured. The bacterial cell suspension had an enzyme activity of about 0.6 units / ml of non-reducing saccharide-forming enzyme, trehalose. The enzyme activity of the free enzyme is found to be about 0.8 unit / ml, and the culture supernatant has about 0.9 unit / ml of the enzyme activity of the non-reducing saccharide-forming enzyme and about 1 unit of trehalose free enzyme. 2 units / ml were observed.
[0098]
[Experiment 15 Enzyme Purification]
About 18 liters of the culture solution obtained by the method of Experiment 14 was processed with an ultrahigh-pressure cell disruption apparatus “Minilab” to disrupt the contained cells. The treatment liquid was centrifuged (10,000 rpm, 30 minutes) to obtain about 16 l of a centrifugal supernatant. Ammonium sulfate was added to the solution so that the degree of saturation was 0.2, dissolved, and allowed to stand at 4 ° C. for 1 hour, and then centrifuged (10,000 rpm, 30 minutes) to recover the supernatant.
[0099]
Further, ammonium sulfate was dissolved in the solution so as to have a saturation degree of 0.6, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours, and then centrifuged to recover an ammonium sulfate salted-out product. The obtained ammonium sulfate salted-out product was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), dialyzed against the same buffer for 24 hours, and centrifuged to remove insoluble matters. The dialysate (360 ml) was divided into two portions and subjected to ion exchange column chromatography (gel amount: 300 ml) using “DEAE-Toyopearl”.
[0100]
Both the trehalose-free enzyme and the non-reducing saccharide-forming enzyme of the present invention were adsorbed on “DEAE-Toyopearl” and eluted from the column at different salt concentrations with the same buffer containing salt. The elution pattern from “DEAE-Toyopearl” is shown in FIG. The non-reducing saccharide-forming enzyme was eluted at a salt concentration of about 0.2M, and the trehalose-free enzyme was eluted at a salt concentration of about 0.3M. The respective enzyme activity fractions were collected, and both enzymes were purified separately below.
[0101]
The nonreducing carbohydrate-forming enzyme active fraction was dialyzed against the same buffer containing 2M ammonium sulfate, the dialyzed solution was centrifuged to remove insoluble matters, and the resulting supernatant was used with “Butyl Toyopearl 650”. Hydrophobic column chromatography (gel amount: 300 ml) was performed. The adsorbed enzyme was eluted from the column with a linear gradient of 2M to 0M ammonium sulfate, and the enzyme activity fraction was recovered. Subsequently, gel filtration chromatography (gel amount: 300 ml) using “Toyopearl HW-55” was performed to collect a non-reducing carbohydrate-forming enzyme active fraction.
[0102]
For the purification of trehalose-free enzyme, the trehalose-free enzyme active fraction eluted from “DEAE-Toyopearl” is used for the buffer solution containing 2M ammonium sulfate in the same manner as the above-mentioned method for purifying non-reducing saccharide-forming enzyme. Dialysis was performed, followed by hydrophobic column chromatography and gel filtration chromatography.
[0103]
The amount of enzyme activity, specific activity, and yield in each purification step are shown in Table 11 for the non-reducing saccharide-forming enzyme and Table 12 for the trehalose-free enzyme of the present invention.
[0104]
[Table 11]
[Table 12]
A purified non-reducing saccharide-forming enzyme preparation and a purified trehalose-free enzyme preparation obtained as gel filtration eluates in the steps of Table 11 and Table 12, respectively, are used on polyacrylamide gel (gel concentration 7.5%). When the purity was tested by electrophoresis, it was shown that the protein band was single, and the obtained enzyme preparation was a single sample having high purity by electrophoresis.
[0107]
[Experiment 16: Properties of trehalose-releasing enzyme]
The purified trehalose-free enzyme preparation obtained by the method of
[0108]
The purified enzyme preparation was subjected to isoelectric focusing using polyacrylamide gel, and after electrophoresis, the pH of the enzyme was measured to determine the isoelectric point of the enzyme. The isoelectric point was about 3.3 to 4 .3.
[0109]
The effects of temperature and pH on the enzyme activity were examined according to the activity measurement method. The results are shown in FIG. 10 (effect of temperature) and FIG. 11 (effect of pH). The optimum temperature of the enzyme was about 45 ° C. when reacted at pH 7.0 for 30 minutes, and the optimum pH was about 6.0 to 7.5 after reacting at 40 ° C. for 30 minutes. The temperature stability of the enzyme was determined by measuring the remaining enzyme activity after holding the enzyme solution (containing 50 mM phosphate buffer, pH 7.0) at each temperature for 60 minutes, cooling with water. The pH stability was determined by maintaining the enzyme in a 50 mM buffer solution at each pH at 25 ° C. for 16 hours, adjusting the pH to 7, and measuring the remaining enzyme activity. The respective results are shown in FIG. 12 (temperature stability) and FIG. 13 (pH stability). The thermal stability of the enzyme was up to about 40 ° C., and the pH stability was about 5 to 10.
[0110]
[Experiment 17 Preparation of Trehalose from α-Glycosyl Trehalose]
Α-Glycosyl trehalose used as a substrate was prepared according to the method of
[0111]
A 20% aqueous solution of the above five non-reducing carbohydrates (α-glycosyl trehalose) was prepared, and the purified trehalose-free enzyme obtained in
[0112]
[Table 13]
As is clear from the results in Table 13,
(1) Trehalose-releasing enzyme specifically hydrolyzes the bond between the trehalose part and the glycosyl part of α-glycosyl trehalose to produce trehalose and a reducing sugar having a glucose polymerization degree of 1 or more.
(2) Maltooligosaccharides are not affected at all by trehalose releasing enzyme.
From these results, the trehalose-releasing enzyme of the present invention is an enzyme with a completely new mechanism of action that hydrolyzes the bond between the trehalose part of α-glycosyl trehalose and other glycosyl moieties very specifically and releases trehalose. It is judged that there is.
[0114]
Subsequently, in order to purify trehalose from each reaction product, decolorization, desalting, concentration, column fractionation using sodium type strong acid cation exchange resin “XT-1016”, and high purity with a trehalose content of 97% or more Fractions were collected. The obtained high-purity fraction is concentrated to a concentration of about 65%, and left at 25 ° C. for 2 days to crystallize hydrous trehalose crystals, honey, vacuum-dried, and high-purity with a trehalose content of 99% or more A sample was prepared. The respective yields relative to the raw material substrate are 9.5% from glucosyl trehalose, 14.9% from maltosyl trehalose, 16.0% from maltotriosyl trehalose, and 18.5 from maltotetraosyl trehalose in terms of solids. %, 17.7% from maltopentaosyl trehalose. Each high-purity trehalose preparation obtained The Using commercially available reagent trehalose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a standard product, melting point, heat of fusion, specific rotation, infrared absorption spectrum, powder X-ray diffraction pattern, and degradability with porcine kidney-derived trehalase were compared. As a result, all the high-purity trehalose preparations prepared had a melting point of 97.0 ± 0.5 ° C., a heat of fusion of 57.8 ± 1.2 KJ / mole, and a specific rotation of + 182 ± 1.1 °. It was in good agreement with the measured value, and the infrared absorption spectrum and powder X-ray diffraction pattern were also in good agreement with the spectrum or pattern of the reagent trehalose. Further, the high-purity trehalose preparation was decomposed into glucose by the porcine kidney-derived trehalase in the same manner as the reagent trehalose. As is clear from the above results, it was confirmed that the carbohydrate produced by the action of the trehalose-releasing enzyme of the present invention on α-glycosyl trehalose was trehalose.
[0115]
[Experiment 18 Preparation of Trehalose from Reduced Starch Partially Degraded Product]
5% waxy corn starch suspension was gelatinized by heating, then adjusted to pH 4.5 and
[0116]
The resulting reduced starch partial degradation product or maltotriose with a glucose polymerization degree of 3 was adjusted to a concentration of 1% with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), and the purified non-purified product prepared by the method of
[0117]
The remaining reaction solution was further adjusted to 50 ° C. and pH 4.5, glucoamylase (manufactured by Seikagaku Corporation) was added at a rate of 50 units per substrate solid, allowed to act for 24 hours, and similarly desalted. Then, the reaction product was analyzed by high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 14.
[0118]
[Table 14]
As shown in Table 14, the trehalose production rate after the action of the non-reducing saccharide-forming enzyme and trehalose-releasing enzyme was a low value of 4.2% for maltotriose with a glucose polymerization degree of 3, High values of 66.1 to 80.8% were obtained for the partially decomposed starch having a glucose polymerization degree of 10 to 34.1. It has also been found that the higher the degree of glucose polymerization of the reduced starch partial decomposition product, the higher the trehalose purity obtained. Furthermore, glucoamylase is allowed to act on the reaction solution in which the both enzymes are allowed to act, and a non-reducing carbohydrate having a trehalose structure at the remaining terminal and having a glucose polymerization degree of 3 or more is decomposed into trehalose and glucose. It has also been found that the purity of trehalose increases.
[0120]
[Experiment 19 Maillard reaction]
A solution containing 10% of the high-purity trehalose preparation (purity 99.5%) obtained by the method of
[0121]
[Table 15]
As is clear from the results in Table 15, the trehalose preparation has a slight degree of coloration due to the Maillard reaction and is only about 0.4 to 0.6% of the degree of coloration of glucose and maltose. The product was found to be a carbohydrate showing little Maillard reaction. Therefore, even if this carbohydrate is mixed with an amino acid, it is a carbohydrate that hardly damages the amino acid.
[0123]
[Experiment 20 In vivo use test]
In accordance with the method reported by Koji et al. In “Clinical Nutrition”, Vol. 41, No. 2, pp. 200 to 208 (1972), a high-purity trehalose preparation obtained by the method of Experiment 17 ( (99.5% purity) 30 g of 20 w / v% aqueous solution, and this was orally administered to 6 volunteers (healthy 26-year-old, 27-year-old, 28-year-old, 29-year-old, 30-year-old, 31-year-old man) Blood was collected and blood glucose level and insulin level were measured. As a control, glucose was used. As a result, trehalose behaved in the same manner as glucose, and both the blood glucose level and the insulin level showed the maximum value after about 0.5 to 1 hour after administration. Trehalose has been found to be easily digested, absorbed, and metabolized to become an energy source.
[0124]
[Experiment 21: Acute toxicity test]
Using mice, the acute toxicity test was carried out by orally administering the reduced reducing carbohydrate powder obtained by the methods of Examples A-5, A-7 and A-8. As a result, none of the preparations were low-toxic substances, and no deaths were observed even at the maximum dose. Therefore, although it cannot be said that it is an accurate value, those LD50 values were 50 g / kg or more.
[0125]
[Experiment 22: Production of trehalose-releasing enzyme from Arthrobacter sp. Q36]
The cells were cultured in a fermenter for about 72 hours in the same manner as in Experiment 14 except that Arthrobacter species Q36 (FERM BP-4316) was used instead of Rhizobium species M-11 (FERM BP-4130). The enzyme activity of the non-reducing saccharide-forming enzyme in the culture solution was about 1.3 units / ml, and the enzyme activity of the trehalose-free enzyme of the present invention was about 1.8 units / ml. The enzyme activity of the bacterial cell suspension and the culture supernatant was measured in the same manner as in Experiment 14. As a result, the enzymatic activity of the non-reducing carbohydrate-forming enzyme was about 0.5 units / ml in the bacterial cell suspension. The enzyme activity of trehalose-free enzyme is found to be about 0.5 unit / ml, and the culture supernatant has about 0.8 unit / ml of non-reducing saccharide-forming enzyme activity and trehalose-free enzyme activity. About 1.3 units / ml were observed.
[0126]
[Experiment 23 Enzyme Purification]
Purification was carried out in the same manner as in
[0127]
[Table 16]
[Table 17]
Purity of the purified non-reducing saccharide-forming enzyme and purified trehalose-free enzyme obtained as gel filtration eluates in Table 16 and Table 17, respectively, was examined by electrophoresis in the same manner as in
[0130]
[Experiment 24: Properties of enzyme]
When the molecular weight of the purified trehalose-free enzyme obtained by the method of Experiment 23 was measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in the same manner as in Experiment 16, it was about 57,000 to 67,000 daltons. Further, when the isoelectric point of the enzyme was determined by isoelectric focusing as in the case of
[0131]
As is apparent from the figure, the optimum temperature of the enzyme is around 45 ° C., and the optimum pH is about 6.0 to 7.5. The temperature stability is up to around 45 ° C., and the pH stability is about 5.0 to 10.0.
[0132]
[Experiment 25 Preparation of trehalose from α-glycosyl trehalose]
Using the purified enzyme obtained by the method of Experiment 23, an experiment for the preparation of trehalose from a non-reducing carbohydrate having a trehalose structure at the terminal and a glucose polymerization degree of 3 or more was performed according to the method of Experiment 17. It was found that trehalose is released from α-glycosyl trehalose, as in the case of trehalose releasing enzyme derived from Rhizobium species M-11.
[0133]
[Experiment 26 Production and properties of trehalose-releasing enzyme from known microorganisms]
Among known microorganisms, Brevibacterium heroborum ATCC 11822 and Micrococcus roseus ATCC 186, which were confirmed to have the ability to produce the trehalose-releasing enzyme of the present invention, were cultured at 27 ° C. for 72 hours in a fermenter as in Experiment 14. Using about 18 l of each culture solution, the culture solution is treated with a crushing apparatus in the same manner as in
[0134]
[Table 18]
Further, using these partially purified enzymes derived from known microorganisms, an experiment for the preparation of trehalose from a non-reducing saccharide having a trehalose structure at the terminal and a glucose polymerization degree of 3 or more was conducted according to the method of
[0136]
[Experiment 27: Effect of starch liquefaction and enzyme used to produce high trehalose-containing carbohydrates]
In order to produce a trehalose-rich saccharide from starch, the influence of the combination of the degree of starch liquefaction and the enzyme used was investigated. After adjusting the pH to 6.5 by adding 0.1% calcium carbonate to corn starch milk with a concentration of 20%, add 0.1-2.0% per starch of α-amylase and Novo's “Tamarmeal”. Reaction at 95 ° C. for 15 minutes, autoclaving at 120 ° C. and maintaining for 10 minutes to obtain a liquefied solution of DE 2.5 to 20.5, which was rapidly cooled to the purified non-reducing sugar prepared by the method of
[0137]
[Table 19]
As apparent from the results in Table 19, in order to produce a trehalose-rich saccharide from starch, a relatively low liquefaction level is suitable, desirably less than DE15, more desirably less than DE10. It turned out to be. In addition, the enzyme used for the enzyme is a non-reducing saccharide-forming enzyme and / or trehalose-releasing enzyme that acts on a starch debranching enzyme and / or cyclomaltodextrin / gluca rather than acting only on non-reducing saccharide-forming enzyme and trehalose-releasing enzyme It has been found that the action with no-transferase increases the trehalose yield from starch by about 2 to 4 times, and is extremely advantageous for industrially producing trehalose from starch on a large scale.
[0139]
Hereinafter, a method for producing a saccharide with reduced reducing ability according to the present invention is shown in Example A, and a composition containing the saccharide is shown in Example B.
[0140]
Example A-1
Potato starch was made into starch milk having a concentration of about 20%, 0.3% succinic acid was added thereto, autoclaved, cooled, and neutralized to pH 6.5 with calcium carbonate to obtain a liquefied solution having a DE of about 12. To this liquefied solution, 2 units of purified non-reducing saccharide-forming enzyme obtained by the method of
[0141]
Example A-2
Tapioca starch was made into starch milk having a concentration of about 25%, and α-amylase and “Neospirase” manufactured by Nagase Seikagaku Co., Ltd. were added at 0.2% per gram of starch, reacted at 85 to 90 ° C. for about 20 minutes, and then 120 Autoclaved to 0 ° C. and rapidly cooled to obtain a liquefied solution of DE of about 4, and 5 units of purified non-reducing saccharide-forming enzyme obtained by the method of
[0142]
Example A-3
Corn starch is made into starch milk with a concentration of about 30%, calcium carbonate 0.1% is added to this, pH is adjusted to 6.5, α-amylase, “Termameal 60L” manufactured by Novo, is added 0.3% per gram starch, The mixture was reacted at 95 ° C. for 15 minutes, then autoclaved to 120 ° C. and rapidly cooled to obtain a liquefied solution of DE about 4, to which the purified non-reducing saccharide-forming enzyme obtained by the method of
[0143]
Example A-4
In order to increase the content of non-reducing carbohydrates by making the syrup obtained by the method of Example A-3 into a raw sugar solution with a concentration of about 55%, a salt-type strongly acidic cation exchange was performed according to the method of Example A-2. By performing column chromatography using a resin, a fraction having a high non-reducing sugar content and a glucose polymerization degree of 3 to 6 was collected, purified and concentrated to obtain syrup having a concentration of about 50%. This product is a low-reducing saccharide of DE8 containing a large amount of non-reducing saccharides having a trehalose structure at the terminal and non-reducing saccharides such as α-glycosyl α-glucoside and reducing starch sugar. This low-reducing syrup was hydrogenated, purified and concentrated according to the method of Example A-1 to obtain syrup having a concentration of 70% in a yield of about 30% per solid. This product is a non-reducing saccharide with a trehalose structure in the molecule and a reduced sugar containing DE sugar that contains starch sugar alcohol. It is mild, elegant sweetness, relatively low viscosity, and moderate moisturizing. And can be advantageously used in various compositions such as various foods, cosmetics, and pharmaceuticals as sweeteners, taste improvers, quality improvers, stabilizers, excipients, and the like.
[0144]
Example A-5
According to the method of Example A-3, α-amylase was allowed to act on starch milk having a corn starch concentration of about 30% to obtain a liquefied solution of DE4, and then the purified non-purified product obtained by the method of
[0145]
Example A-6
Tapioca starch was made into starch milk having a concentration of about 30%, and α-amylase was allowed to act on this starch starch according to the method of Example A-2 to obtain a liquefied solution of DE5. Then, the purified non-purified solution obtained by the method of
[0146]
Example A-7
10 units of glucoamylase per gram of substrate was added to the reaction mixture obtained by the method of Example A-6 and deactivated by heating, and reacted at a pH of 5.0 and a temperature of 50 ° C. for 10 hours. This reaction solution was inactivated by heating, and purified by decoloring, desalting and concentrating according to a conventional method to obtain syrup having a concentration of 45%. This trehalose-rich low-reducing saccharide syrup is hydrogenated and purified in accordance with the method of Example A-1, and then concentrated to a concentration of about 70%, followed by slow cooling with stirring in an auxiliary crystallizer. Then, crystallization was carried out to obtain a mass kit having a crystallization rate of about 40%. This mass kit is 150kg / cm from the nozzle on the drying tower. 2 At the same time, hot air at 85 ° C. was blown from the top of the drying tower, and the crystalline powder was collected on a transfer wire mesh conveyor provided at the bottom. The powder was gradually moved out of the drying tower while hot air of 45 ° C. was sent from the bottom of the conveyor and taken out. This crystalline powder is packed in an aging tower and aged for 10 hours while sending warm air, crystallization and drying are completed, and a saccharide powder less than DE1 containing reduced trehalose-containing crystals and sorbitol is reduced. It was obtained in a yield of about 75% per solid based on the raw starch. The product is easy to handle, and can be advantageously used as a sweetener, a taste improver, a quality improver, a stabilizer, an excipient, and the like for various compositions such as various foods, cosmetics, and pharmaceuticals.
[0147]
[Example A-8]
According to the method of
[0148]
Example A-9
Glucose 2w / v%, polypeptone 0.5w / v%, yeast extract 0.1w / v%, dipotassium phosphate 0.1w / v%, monosodium phosphate 0.06w / v%, magnesium sulfate 0.05w / V%, calcium carbonate 0.5w / v%, and a liquid medium consisting of water and fermenter, heat sterilized and cooled, inoculated with Pimerobacter species R48 (FERM BP-4315) at a temperature of 27 ° C. The culture was aerated and stirred for about 40 hours. The activity of maltose / trehalose converting enzyme in this culture was 0.55 units per ml of culture. The microbial cells with a wet weight of 0.18 kg collected from the culture solution 18 l were suspended in a 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). About 1.5 l of this bacterial cell suspension was treated with an ultrasonic crusher to crush the bacterial cells. This cell disruption suspension was centrifuged, the supernatant was collected, the solution was further concentrated in a UF membrane, and about 500 ml of concentrated enzyme solution having about 18 units of maltose / trehalose converting enzyme per ml was collected. To 15% corn starch milk (pH 5.5), α-amylase, 2 units of “Spitase HS” manufactured by Nagase Seikagaku Co., Ltd. are added per gram of starch, stirred, heat gelatinized and liquefied, and immediately autoclaved (120 ° C. ) For 20 minutes and then adjusted to a temperature of 55 ° C. and a pH of 5.0. To this, isoamylase was added in an amount of 300 units per gram of starch and β-amylase (manufactured by Nagase Seikagaku Corporation) at a rate of 20 units per gram of starch, reacted for 24 hours, and a sugar solution having a maltose content of about 92%. Got. After heating the reaction solution at 100 ° C. for 20 minutes, the temperature was adjusted to 20 ° C. and pH 7.0, and the maltose / trehalose converting enzyme prepared by the above method was added at a rate of 1.5 units per gram of solids. In addition, the reaction was allowed to proceed for 72 hours. The reaction solution is kept at 95 ° C. for 10 minutes, then cooled, decolorized with activated carbon and filtered according to a conventional method, purified by desalting with H-type and OH-type ion exchange resins, and further concentrated to a concentration of about 50%. Got syrup.
[0149]
This product contains about 64% trehalose per solid and has a low reducing power of DE 18.0. This syrup was hydrogenated, purified and concentrated according to the method of Example A-1 to obtain syrup having a concentration of about 70% in a yield of about 80% per solid. This product is a sugar syrup of less than DE1 that contains maltitol and a small amount of sorbitol together with trehalose, and has a mild sweetness, moderate viscosity, and moisturizing, sweetener, taste improver As stabilizers, excipients, and the like, it can be advantageously used in various compositions such as various foods, cosmetics, and pharmaceuticals.
[0150]
Example B-1 Sweetener
To 1 part by weight of the reduced sugar powder obtained by the method of Example A-7, α-glycosyl stevioside, 0.01 part by weight of “αG Sweet” sold by Toyo Seika Co., Ltd. and L-aspartyl-L- Phenylalanine methyl ester and 0.01 parts by weight of “Apartame” sold by Ajinomoto Co., Inc. were uniformly mixed and subjected to a granulating machine to obtain a granular sweetener. This product has excellent sweetness quality, has about twice the sweetness of sucrose, and the calorie per sweetness is about 1/2 that of sucrose. This sweetener has no degradation of high-intensity sweetener blended in it, has excellent stability, and as a low-calorie sweetener, low-calorie food and drink for obese people, diabetics, etc. who restrict caloric intake Suitable for sweetening products. In addition, the present sweetener is suitable for sweetening foods and the like that suppress dental caries because it produces less acid by caries-inducing bacteria and produces less insoluble glucan.
[0151]
[Example B-2 Hard Candy]
30 parts by weight of a saccharide-containing syrup having reduced reducing properties obtained by the method of Example A-1 was heated and mixed with 100 parts by weight of a 55% sucrose solution, and then concentrated by heating until the water content was less than 2% under reduced pressure. This was mixed with 1 part by weight of citric acid and appropriate amounts of lemon flavor and colorant, and molded according to a conventional method to obtain a product. This product is a high quality hard candy that is crisp, tastes good, and does not crystallize or deform.
[0152]
[Example B-3 Chocolate]
[0153]
Example B-4 Chewing gum
3 parts by weight of gum base is heated and melted to the extent that it is softened, and 4 parts by weight of sucrose and 3 parts by weight of reduced sugar powder obtained by the method of Example A-5 are added thereto, and an appropriate amount of perfume And a colorant were mixed, kneaded by a roll, molded and packaged according to a conventional method to obtain a product. This product is a chewing gum with good texture and flavor.
[0154]
[Example B-5 Sweetened condensed milk]
3 parts by weight of sugar-containing syrup and 1 part by weight of sucrose with reduced reductability obtained by the method of Example A-3 were dissolved in 100 parts by weight of raw milk, sterilized by heating with a plate heater, and then adjusted to a concentration of 70%. Concentrated and canned under aseptic conditions to obtain the product. This product has a mild sweet taste and good flavor, and can be advantageously used for seasoning infant foods, fruits, coffee, cocoa, tea, and the like.
[0155]
[Example B-6 Lactic acid bacteria beverage]
175 parts by weight of skim milk powder, 80 parts by weight of a high sugar content powder with reduced reducing ability obtained by the method of Example A-5, and 50 parts by weight of a high lactose sucrose powder disclosed in JP-A-4-281795 Dissolve in 1,200 parts by weight of water, sterilize at 65 ° C. for 30 minutes, cool to 40 ° C., inoculate 30 parts by weight of a starter of lactic acid bacteria, and incubate at 37 ° C. for 8 hours. Thus, a lactic acid bacteria beverage was obtained. This product is a lactic acid bacteria beverage with good flavor. In addition, this product contains oligosaccharides and not only stably retains lactic acid bacteria, but also has a bifidobacteria growth promoting action.
[0156]
[Example B-7 powdered juice]
50 parts by weight of reduced sugar powder obtained by the method of Example A-5, 10 parts by weight of sucrose, and 0.65 parts by weight of anhydrous citric acid based on 33 parts by weight of orange juice powder produced by spray drying. 1 part by weight, 0.1 part by weight of malic acid, 0.1 part by weight of L-ascorbic acid, 0.1 part by weight of sodium citrate, 0.5 part by weight of pullulan, and appropriate amount of powdered fragrance are mixed and stirred well, pulverized into a fine powder This is charged into a fluidized bed granulator, the exhaust air temperature is set to 40 ° C., and the trehalose-rich syrup obtained by the method of Example A-6 is sprayed as a binder, granulated for 30 minutes, weighed and packaged. And got the product. This product is a powdered juice with a fruit juice content of about 30%. In addition, this product had no off-flavors and off-flavors and was stable for a long time.
[0157]
[Example B-8 Custard cream]
100 parts by weight of corn starch, 100 parts by weight of reduced saccharide containing syrup obtained by the method of Example A-6, 80 parts by weight of maltose, 20 parts by weight of sucrose and 1 part by weight of sodium chloride were thoroughly mixed, Add 280 parts by weight and stir, and gradually add 1,000 parts by weight of boiled milk to it, and continue to stir it over fire. When the corn starch is completely gelatinized and the whole becomes translucent, The product was obtained by cooling, cooling, adding an appropriate amount of vanilla flavoring, weighing, filling and packaging. This product has a smooth luster, mild sweetness and deliciousness.
[0158]
[Example B-9 Uiro no Moto]
To 90 parts by weight of rice flour, 20 parts by weight of corn starch, 40 parts by weight of sucrose, 80 parts by weight of reduced sugar powder obtained by the method of Example A-5 and 4 parts by weight of pullulan will be uniformly mixed. The element was manufactured. Ui-no-Moto, an appropriate amount of Matcha and water were kneaded, and the mixture was placed in a container and steamed for 60 minutes to produce Matcha Uiro. This product has good shine, mouthfeel, and good flavor. Moreover, the aging of starch is suppressed and the shelf life is good.
[0159]
[Example B-10 An]
In accordance with a conventional method, water was added to 10 parts by weight of azuki bean, boiled, astringent, drained, and water-soluble impurities were removed to obtain about 21 parts by weight of azuki bean paste. To this raw bean paste, 14 parts by weight of sucrose, 5 parts by weight of saccharide-containing syrup with reduced reduction obtained by the method of Example A-9 and 4 parts by weight of water were boiled, and a small amount of salad oil was added thereto. Was added and kneaded so as not to break, and about 35 parts by weight of the product was obtained. This product has no color burn, has a good texture, has a good flavor, and is suitable as an ingredient for anpan, bun, dumpling, peach and ice confectionery.
[0160]
Example B-11 Bread
100 parts by weight of wheat flour, 2 parts by weight of yeast, 5 parts by weight of sugar, 1 part by weight of a saccharide-containing powder with reduced reductivity obtained by the method of Example A-7 and 0.1 part by weight of an inorganic food The medium seeds were fermented at 26 ° C. for 2 hours, then aged for 30 minutes and baked. This product is a high quality bread with good hue and sudoku, moderate elasticity and mild sweetness.
[0161]
[Example B-12 Ham]
The pork thigh is uniformly rubbed with 1,000 parts by weight of meat and 15 parts by weight of sodium chloride and 3 parts by weight of potassium nitrate, and deposited in a cold room day and night. In a cold room, put this into a salted solution consisting of 500 parts by weight of water, 100 parts by weight of sodium chloride, 3 parts by weight of potassium nitrate, 40 parts by weight of reduced sugar-containing powder obtained by the method of Example A-8 and a spice. It was soaked for 7 days, then washed with cold water, wound with string, smoked, cooked and cooled and packaged according to a conventional method to obtain a product. This product is a high-quality ham with good color and good flavor.
[0162]
[Example B-13 powdered peptide]
A 2% by weight reduced sugar powder obtained by the method of Example A-8 was mixed with 1 part by weight of a soy peptide solution for food with a concentration of 40%, “High Nuts S” manufactured by Fuji Oil Co., Ltd. These were put in a plastic vat, dried under reduced pressure at 50 ° C., and pulverized to obtain a powdered peptide. This product has a good flavor and can be advantageously used not only as a confectionery material such as premix and frozen confectionery but also as a baby food such as oral liquid food and tube liquid food, and a therapeutic nutrient.
[0163]
[Example B-14 Cosmetic cream]
2 parts by weight of polyoxyethylene glycol monostearate, 5 parts by weight of glyceryl monostearate self-emulsifying, 2 parts by weight of reduced sugar powder obtained by the method of Example A-5, α-
[0164]
[Example B-15 Solid preparation]
A human natural interferon-α preparation (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.) is applied to an immobilized anti-human interferon-α antibody column according to a conventional method to adsorb the human natural interferon-α contained in the preparation. The bovine serum albumin, which is a stabilizer, was removed by passage, and then the pH was changed to reduce the reducing ability of human natural interferon-α obtained by the method of Example A-7. Elution was performed using 5% physiological saline. This liquid is microfiltered, added to approximately 20 times the amount of anhydrous crystal maltose powder “Finetose” sold by Hayashibara Co., Ltd., dehydrated and powdered, and then tableted with a tableting machine. A tablet containing about 150 units of human natural interferon-α was obtained. About 1 to 10 adults per day are administered orally as sublingual tablets, etc., and this product can be advantageously used for the treatment of viral diseases, allergic diseases, rheumatism, diabetes, malignant tumors and the like. In particular, it can be advantageously used as a therapeutic agent for AIDS, hepatitis, etc., whose number of patients is rapidly increasing in recent years. In this product, both the non-reducing saccharide of the present invention and anhydrous crystalline maltose act as a stabilizer, and maintain its activity well for a long time even when left at room temperature.
[0165]
[Example B-16 Dragee]
A core powder of 150 mg in weight is used as a core, 40 parts by weight of reduced sugar powder obtained by the method of Example A-8, 2 parts by weight of pullulan (average molecular weight 200,000), 30 parts by weight of water , Sugar coating using an undercoat liquid consisting of 25 parts by weight of talc and 3 parts by weight of titanium oxide until the tablet weight is about 230 mg, and then 65 parts by weight of sugar powder with the same reduced reduction, 1 part by weight of pullulan And a sugar-coated tablet having an excellent glossy appearance was obtained by sugar-coating using an overcoat liquid comprising 34 parts by weight of water and further polishing with wax solution. This product has excellent impact resistance and maintains high quality for a long time.
[0166]
[Example B-17 Toothpaste]
Formulation
Dicalcium phosphate 45.0 parts by weight
Pullulan 2.95 parts by weight
Sodium lauryl sulfate 1.5 parts by weight
Glycerin 20.0 parts by weight
0.5 parts by weight of polyoxyethylene sorbitan laurate
Preservative 0.05 parts by weight
12.0 parts by weight of reduced sugar powder obtained by the method of Example A-5
Maltitol 5.0 parts by weight
13.0 parts by weight of water
The above materials were mixed according to a conventional method to obtain a toothpaste. This product has moderate sweetness and is particularly suitable as a toothpaste for children.
[0167]
[Example B-18 Solid formulation for liquid food]
500 parts by weight of reduced sugar powder produced by the method of Example A-7, 270 parts by weight of powdered egg yolk, 209 parts by weight of skim milk powder, 4.4 parts by weight of sodium chloride, 1.8 parts by weight of potassium chloride A blend of 4 parts by weight of magnesium sulfate, 0.01 part by weight of thiamine, 0.1 part by weight of sodium ascorbate, 0.6 part by weight of vitamin E acetate and 0.04 part by weight of nicotinamide is prepared. Each 25 grams of the product was filled into a moisture-proof laminated sachet and heat sealed to obtain a product. This product is dissolved in about 150 to 300 ml of water to make a liquid food, and it is used orally or by tube use to the nasal cavity, stomach, intestine, etc., and is advantageous for supplementing energy to the living body. Available to:
[0168]
[Example B-19 Ointment for trauma treatment]
50 parts by weight of methanol in which 3 parts by weight of iodine was dissolved and mixed with 200 parts by weight of reduced sugar powder and 300 parts by weight of maltose produced by the method of Example A-5, and further mixed with 10 w / v% 200 parts by weight of an aqueous solution of pullulan was added and mixed to obtain a plaster for treatment of trauma exhibiting moderate elongation and adhesion. This product not only acts as a bactericidal action by iodine, but also acts as an energy replenisher to cells by trehalose, shortening the healing period and healing the wound surface cleanly.
[0169]
【The invention's effect】
As is apparent from the above, the reduced sugars containing starch sugar alcohol together with the non-reducing carbohydrate consisting of a sugar having a trehalose structure and / or trehalose in the molecule of the present invention is stable. Excellent in quality, has a good quality and elegant sweetness. Moreover, it is digested and absorbed by ingestion and becomes a calorie source. In particular, trehalose contained therein is often metabolized. Therefore, the reduced carbohydrate of the present invention is advantageous for various compositions such as various foods, cosmetics, and pharmaceuticals as sweeteners, taste improvers, quality improvers, stabilizers, excipients and the like. Available. Further, as the low-reducing saccharide for a saccharide raw material with reduced reducing ability of the present invention, a non-reducing saccharide-forming enzyme is added to a starch liquefaction enzyme and / or cyclomaltodextrin By acting together with glucanotransferase, the yield of non-reducing carbohydrates such as trehalose and carbohydrates with trehalose structure in the molecule from starch is increased. In addition, a mixed carbohydrate of trehalose and maltose is obtained by causing maltose to act on a maltose / trehalose converting enzyme, and these are all suitable as the raw material carbohydrate of the present invention. Making the industrial implementation of
[0170]
The establishment of the present invention provides industrially abundantly and inexpensively non-reducing saccharides that have not been easily obtained as desired, and reduced-reducing saccharides from starch, an inexpensive and endless resource. It will open up a whole new path that can be done, not only in the food, cosmetics and pharmaceutical industries, but also in the agriculture, aquaculture and chemical industries, and the industrial significance of these industries. is there.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the influence of temperature on the activity of a non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Rhizobium species M-11.
FIG. 2 is a graph showing the influence of pH on the activity of a non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Rhizobium species M-11.
FIG. 3 is a graph showing the temperature stability of a non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Rhizobium species M-11.
FIG. 4 is a graph showing the pH stability of a non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Rhizobium species M-11.
FIG. 5 is a graph showing the effect of temperature on the activity of non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Arthrobacter species Q36.
FIG. 6 is a graph showing the influence of pH on the activity of non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Arthrobacter species Q36.
FIG. 7 is a graph showing temperature stability of a non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Arthrobacter species Q36.
FIG. 8 is a graph showing the pH stability of a non-reducing saccharide-forming enzyme derived from Arthrobacter sp. Q36.
FIG. 9 is a diagram showing an elution pattern of trehalose-releasing enzyme and non-reducing saccharide-forming enzyme of the present invention from DEAE-Toyopearl.
FIG. 10 is a graph showing the effect of temperature on the enzyme activity of trehalose-free enzyme derived from Rhizobium species M-11 of the present invention.
FIG. 11 is a graph showing the influence of pH on the enzyme activity of trehalose-free enzyme derived from Rhizobium species M-11 of the present invention.
FIG. 12 is a graph showing the influence of temperature on the stability of trehalose-free enzyme derived from Rhizobium species M-11 of the present invention.
FIG. 13 is a graph showing the influence of pH on the stability of trehalose-free enzyme derived from Rhizobium species M-11 of the present invention.
FIG. 14 is a graph showing the influence of temperature on the enzyme activity of trehalose-free enzyme derived from Arthrobacter species Q36 of the present invention.
FIG. 15 is a graph showing the influence of pH on the enzyme activity of trehalose-free enzyme derived from Arthrobacter species Q36 of the present invention.
FIG. 16 is a graph showing the effect of temperature on the stability of trehalose-free enzyme derived from Arthrobacter species Q36 of the present invention.
FIG. 17 shows the influence of pH on the stability of trehalose-free enzyme derived from Arthrobacter species Q36 of the present invention.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18221695A JP4070250B2 (en) | 1994-06-27 | 1995-06-27 | Carbohydrate with reduced reducibility, its production method and use |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18039394 | 1994-06-27 | ||
| JP6-180393 | 1994-06-27 | ||
| JP18221695A JP4070250B2 (en) | 1994-06-27 | 1995-06-27 | Carbohydrate with reduced reducibility, its production method and use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0873482A JPH0873482A (en) | 1996-03-19 |
| JP4070250B2 true JP4070250B2 (en) | 2008-04-02 |
Family
ID=26499926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18221695A Expired - Lifetime JP4070250B2 (en) | 1994-06-27 | 1995-06-27 | Carbohydrate with reduced reducibility, its production method and use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4070250B2 (en) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4034846B2 (en) * | 1996-12-10 | 2008-01-16 | 株式会社林原生物化学研究所 | Crystalline powdered sugar, production method and use thereof |
| JPH11116588A (en) | 1997-10-16 | 1999-04-27 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Production of trehalose and sugar alcohol |
| JP3908868B2 (en) * | 1997-12-26 | 2007-04-25 | 株式会社林原生物化学研究所 | Method for inhibiting trimethylamine formation and its use |
| US6268353B1 (en) | 1998-09-03 | 2001-07-31 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Method for inhibiting the formation of volatile aldehydes including their related compounds and/or the decomposition of fatty acids including their related compounds, and uses thereof |
| JP3958884B2 (en) | 1998-09-11 | 2007-08-15 | 株式会社林原生物化学研究所 | Non-reducing saccharide-forming enzyme, trehalose-releasing enzyme, and method for producing saccharide using the enzyme |
| JP4652540B2 (en) | 2000-03-02 | 2011-03-16 | 株式会社林原生物化学研究所 | Body odor inhibitors and their uses |
| FR2831541B1 (en) * | 2001-10-30 | 2005-08-19 | Roquette Freres | SOLUBLE HYDROGEN STARCH DERIVATIVES CONTAINING NON-DIGESTIBLE FOOD FIBERS |
| CN1761450B (en) * | 2003-02-13 | 2010-05-05 | 株式会社林原生物化学研究所 | Skin preparation for external use characterized by containing sugar derivative of a,a-trehalose |
| WO2009136432A1 (en) * | 2008-05-06 | 2009-11-12 | 長崎県公立大学法人 | Method for determining carbohydrate and kit for determining carbohydrate |
| JP2021106548A (en) * | 2019-12-27 | 2021-07-29 | キリンホールディングス株式会社 | Reduced-sugar fruit beverage having improved flavor and method for producing the same |
| CN112080448B (en) * | 2020-09-14 | 2022-08-12 | 江苏省奥谷生物科技有限公司 | Culture medium and method for producing trehalase through bacterial fermentation |
-
1995
- 1995-06-27 JP JP18221695A patent/JP4070250B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0873482A (en) | 1996-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4249055B2 (en) | Non-reducing saccharide-forming enzyme, its production method and use | |
| KR100394149B1 (en) | Trehalose and its production and use | |
| JP3633648B2 (en) | Maltose / trehalose converting enzyme, its production method and use | |
| JP3559585B2 (en) | Trehalose-releasing enzyme, its production method and use | |
| JP3793590B2 (en) | Non-reducing saccharides, production method and use thereof | |
| JP3182679B2 (en) | Non-reducing oligosaccharides, their production and use | |
| JP3557277B2 (en) | Thermostable trehalose releasing enzyme, its production method and use | |
| KR100362689B1 (en) | Reduced reducing sugar composition, its preparation method and use | |
| JP3662972B2 (en) | Non-reducing saccharides, production method and use thereof | |
| JP3557287B2 (en) | Thermostable non-reducing saccharide-forming enzyme, its production method and use | |
| JP4070250B2 (en) | Carbohydrate with reduced reducibility, its production method and use | |
| JP3616166B2 (en) | Trehalose and its production method and use | |
| JP5240480B2 (en) | Trehalose-releasing enzyme, its production method and use | |
| JP3963491B2 (en) | Crystalline maltosyl glucoside, its production method and use | |
| JP2002255988A (en) | Sugar mixture, method for producing the same and use | |
| US5908767A (en) | Non-reducing saccharide and its production and use | |
| JP3725148B2 (en) | Maltose / trehalose converting enzyme, its production method and use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060221 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060412 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071009 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071106 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20071207 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080108 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080115 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110125 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120125 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130125 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130125 Year of fee payment: 5 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140125 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |