JPH0989831A - Biosensor - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a highly reliable biosensor in which the activity of oxidoreductase does not lower during preservation and the pH of test liquid has no effect on the activity of oxidoreductase at the time of measurement. SOLUTION: The biosensor comprises an electrode system comprising a measuring electrode 4 and a counter electrode 5 formed on an insulating substrate 1, and a reactive layer 7 formed directly on the electrode system. The reactive layer comprises a first layer containing an oxidoreductase, a second layer of hydrophilic polymer, and a third layer containing an electron acceptor and a buffer. Preferably, the first layer is composed of oxidoreductase and hydrophilic polymer and the third layer is compose of electron acceptor, buffer and lipid, or the first layer is composed of oxidoreductase, butter and hydrophilic polymer and the third layer is composed of electron acceptor, buffer and lipid.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の特定成分
について、迅速かつ高精度な定量を実施するためのバイ
オセンサに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a biosensor for carrying out a rapid and highly accurate quantification of a specific component in a sample.

【０００２】[0002]

【従来の技術】これまで、試料液中の特定成分につい
て、迅速かつ高精度な定量を実施可能な方式としては、
次のようなバイオセンサがある（特開平３−２０２７６
４号公報）。以下、このバイオセンサについて説明す
る。図３は同バイオセンサの一例を示す断面図、図４は
図３の斜視図である（反応層は図示せず）。絶縁性の基
板２１上にスクリーン印刷等の方法で測定極２４および
対極２５からなる電極系を形成し、さらに絶縁層２６を
形成した後、上記電極系上に親水性高分子と酸化還元酵
素と電子受容体からなる反応層２７を形成したものであ
る。２２および２３は、それぞれ対極２５および測定極
４の端子を表す。2. Description of the Related Art Hitherto, as a method capable of performing a rapid and highly accurate quantification of a specific component in a sample solution,
There are the following biosensors (Japanese Patent Laid-Open No. 3-20276).
No. 4). The biosensor will be described below. FIG. 3 is a sectional view showing an example of the biosensor, and FIG. 4 is a perspective view of FIG. 3 (reaction layer is not shown). After forming an electrode system consisting of the measuring electrode 24 and the counter electrode 25 on the insulating substrate 21 by a method such as screen printing, and further forming an insulating layer 26, a hydrophilic polymer and a redox enzyme are formed on the electrode system. The reaction layer 27 made of an electron acceptor is formed. 22 and 23 represent the terminals of the counter electrode 25 and the measuring electrode 4, respectively.

【０００３】このバイオセンサは、絶縁性の基板上に形
成した電極系上に、親水性高分子と酸化還元酵素と電子
受容体からなる酵素反応層を形成したもので、基質を含
む試料液が反応層へ供給されると反応層が溶解し、酸化
還元酵素と基質が反応し、さらに電子受容体が還元さ
れ、この還元された電子受容体を前記電極系で電気化学
的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料液中
の基質濃度を求めるものである。This biosensor has an enzyme reaction layer composed of a hydrophilic polymer, a redox enzyme, and an electron acceptor formed on an electrode system formed on an insulating substrate. When supplied to the reaction layer, the reaction layer dissolves, the oxidoreductase reacts with the substrate, the electron acceptor is further reduced, and the reduced electron acceptor is electrochemically oxidized by the electrode system. The substrate concentration in the sample solution is obtained from the oxidation current value obtained at this time.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】前記のような従来のバ
イオセンサでは、緩衝剤が反応層中にない構成になって
いる。しかし、酵素にはそれぞれ至適ｐＨ域と呼ばれる
触媒能が最も高くなるｐＨ領域があり、溶液中のｐＨに
より酵素活性が大きく変化する。そのため緩衝剤が反応
層中にない構成のセンサでは、試料液のｐＨによって酵
素活性が変化し、センサの測定値にばらつきが生じ、信
頼性に問題があった。また、酸化還元酵素は、共存する
物質との化学的相互作用により、センサ構成後の活性が
著しく影響を受ける。そのため、酸化還元酵素と電子受
容体などを混在させると酸化還元酵素の活性が低下し、
保存性が劣化する場合があった。In the conventional biosensor as described above, the buffer is not present in the reaction layer. However, each enzyme has a pH region called the optimum pH region where the catalytic ability is highest, and the enzyme activity greatly changes depending on the pH in the solution. Therefore, in a sensor having a structure in which the buffer is not present in the reaction layer, the enzyme activity changes depending on the pH of the sample solution, and the measured value of the sensor varies, which is problematic in reliability. In addition, the activity of the oxidoreductase after the formation of the sensor is significantly affected by the chemical interaction with the coexisting substance. Therefore, if oxidoreductase and an electron acceptor are mixed, the activity of oxidoreductase decreases,
The storability was sometimes deteriorated.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板に形成した
測定極と対極を主体とする電極系および前記電極系上に
接して形成した反応層を具備し、前記反応層は、酸化還
元酵素を含む第一層、親水性高分子からなる第二層、お
よび電子受容体と緩衝剤を含む第三層から構成したもの
である。また、本発明のバイオセンサは、第一層が酸化
還元酵素と親水性高分子からなり、第三層が電子受容体
と緩衝剤と脂質からなる。さらに、本発明のバイオセン
サは、第一層が酸化還元酵素と緩衝剤と親水性高分子か
らなり、第三層が電子受容体と緩衝剤と脂質からなる。In order to solve the above problems, a biosensor of the present invention is formed by contacting an electrode system mainly composed of a measuring electrode and a counter electrode formed on an insulating substrate and the electrode system. The reaction layer comprises a first layer containing an oxidoreductase, a second layer containing a hydrophilic polymer, and a third layer containing an electron acceptor and a buffer. Further, in the biosensor of the present invention, the first layer is composed of an oxidoreductase and a hydrophilic polymer, and the third layer is composed of an electron acceptor, a buffer and a lipid. Further, in the biosensor of the present invention, the first layer is composed of a redox enzyme, a buffer and a hydrophilic polymer, and the third layer is composed of an electron acceptor, a buffer and a lipid.

【０００６】本発明のバイオセンサは、次のようにして
製造するのが好ましい。すなわち、反応層の第一層が親
水性高分子と酸化還元酵素を含み、第二層が親水性高分
子からなり、第三層が電子受容体と緩衝剤を含む構成に
おいては、基板上に電極系に接して水を媒体として第一
層を形成し、前記親水性高分子を溶解せず、かつ第二層
の親水性高分子を溶解する有機溶媒を媒体として第一層
上に第二層を形成し、さらに第二層上に、前記第一層の
親水性高分子を溶解しない有機溶媒、好ましくは前記両
者の親水性高分子を溶解しない有機溶媒を媒体として第
三層を形成する方法である。The biosensor of the present invention is preferably manufactured as follows. That is, in the configuration in which the first layer of the reaction layer contains a hydrophilic polymer and a redox enzyme, the second layer consists of a hydrophilic polymer, and the third layer contains an electron acceptor and a buffer, A second layer is formed on the first layer by contacting the electrode system to form a first layer using water as a medium, and an organic solvent that does not dissolve the hydrophilic polymer and dissolves the hydrophilic polymer of the second layer as a medium. A layer is formed, and a third layer is further formed on the second layer by using an organic solvent that does not dissolve the hydrophilic polymer of the first layer, preferably an organic solvent that does not dissolve the hydrophilic polymers of the both layers as a medium. Is the way.

【０００７】上記構成により、反応層中の緩衝剤によっ
て試料液のｐＨによる影響が緩和され、反応層中の酸化
還元酵素の活性が試料液のｐＨによって変動を受け難く
なり、センサの応答性および再現性が著しく向上する。
さらに、電子受容体と酸化還元酵素を別々の層に分離す
ることにより、センサの保存性が大きく向上する。With the above structure, the buffering agent in the reaction layer reduces the influence of the pH of the sample solution, and the activity of the oxidoreductase in the reaction layer is less likely to be changed by the pH of the sample solution. The reproducibility is remarkably improved.
Further, by separating the electron acceptor and the redox enzyme into separate layers, the storage stability of the sensor is greatly improved.

【０００８】[0008]

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により説明
する。 ［実施例１］図１は本発明の一実施例として作製したフ
ルクトースセンサの断面図である。また、図２は図１の
分解斜視図である（反応層は図示せず）。以下、フルク
トースセンサの作製方法について説明する。まず、ポリ
エチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板１に、ス
クリーン印刷により銀ペ−ストを印刷しリ−ド２、３を
形成した。次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボン
ペーストを用いて電極系（測定極４、対極５）を、また
絶縁性ペーストを用いて絶縁層６をそれぞれ印刷して形
成した。絶縁層６は、測定極４の露出部分の面積を一定
とし、かつリ−ド２、３を部分的に覆っている。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described with reference to embodiments. [Embodiment 1] FIG. 1 is a sectional view of a fructose sensor manufactured as an embodiment of the present invention. 2 is an exploded perspective view of FIG. 1 (reaction layer is not shown). Hereinafter, a method for manufacturing the fructose sensor will be described. First, silver paste was printed on the insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate by screen printing to form leads 2 and 3. Next, an electrode system (measurement electrode 4, counter electrode 5) was formed by using a conductive carbon paste containing a resin binder, and an insulating layer 6 was formed by using an insulating paste. The insulating layer 6 makes the area of the exposed portion of the measurement electrode 4 constant and partially covers the leads 2 and 3.

【０００９】次に、前記電極系上に親水性高分子として
カルボキシメチルセルロ−ス（以下ＣＭＣで表す）の
０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、乾燥させてＣＭＣ層を形
成した。つづいて、前記ＣＭＣ層上に酵素としてフルク
トースデヒドロゲナーゼ（以下ＦＤＨで表す。東洋紡
製）を、ＣＭＣ０．５ｗｔ％を含むマッキルバイン（Ｍ
ｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（０．２Ｍリン酸ナトリウム
−０．１Ｍクエン酸、ｐＨ＝５．０）に溶解させた溶液
を滴下し、温風乾燥器中で加温乾燥させて第一層を形成
した。この後、親水性高分子としてポリビニルピロリド
ン（以下ＰＶＰで表す）の１．０ｗｔ％エタノール溶液
を前記第一層上に滴下し、室温で乾燥させて第二層を形
成した。さらに、電子受容体としのフェリシアン化カリ
ウム、および緩衝剤としてのリン酸ナトリウムとクエン
酸をトルエン中に分散させたものを前記第二層上に滴下
し、トルエンを揮発させることにより第三層を形成し
た。ここで、フェリシアン化カリウム、リン酸ナトリウ
ム、クエン酸は各々あらかじめ微粒子状態にしたものを
トルエン中に分散させるか、もしくはトルエン中で粉砕
して分散させたものである。Next, a 0.5 wt% aqueous solution of carboxymethyl cellulose (hereinafter referred to as CMC) as a hydrophilic polymer was dropped on the electrode system and dried to form a CMC layer. Subsequently, a fructose dehydrogenase (hereinafter referred to as FDH, manufactured by Toyobo) as an enzyme was added to the CMC layer by using McKilvine (M) containing 0.5 wt% of CMC.
cIlvaine) buffer solution (0.2 M sodium phosphate-0.1 M citric acid, pH = 5.0) was added dropwise, and the mixture was heated and dried in a warm air dryer to form a first layer. . Then, a 1.0 wt% ethanol solution of polyvinylpyrrolidone (hereinafter referred to as PVP) as a hydrophilic polymer was dropped on the first layer and dried at room temperature to form a second layer. Further, potassium ferricyanide as an electron acceptor and sodium phosphate as a buffer and citric acid dispersed in toluene are dropped onto the second layer, and the third layer is formed by volatilizing the toluene. did. Here, potassium ferricyanide, sodium phosphate, and citric acid are either fine particles in advance and dispersed in toluene, or they are pulverized and dispersed in toluene.

【００１０】第一層、第二層および第三層からなる反応
層７の外周部分は、直径約３．６ｍｍであり、対極の直
径に略一致している。最後に、カバー９およびスペーサ
ー８を図２中、一点鎖線で示すような位置関係をもって
基板１に接着した。上記のように作製したセンサにおい
ては、スペーサー８のスリット１０の部分に試料の供給
路が形成される。そして、この試料の供給路は、カバー
９に設けた空気孔１１に連通し、また反応層７はこの供
給路に露出している。The outer peripheral portion of the reaction layer 7 composed of the first layer, the second layer and the third layer has a diameter of about 3.6 mm, which is substantially the same as the diameter of the counter electrode. Finally, the cover 9 and the spacer 8 were bonded to the substrate 1 in the positional relationship shown by the alternate long and short dash line in FIG. In the sensor manufactured as described above, the sample supply path is formed in the slit 10 portion of the spacer 8. The sample supply path communicates with the air holes 11 provided in the cover 9, and the reaction layer 7 is exposed in the supply path.

【００１１】このフルクトースセンサに試料液としてフ
ルクトース水溶液３μｌを試料供給路を構成するスリッ
ト１０の入口より供給した。試料液は毛細管現象によっ
て速やかに空気孔１１部分まで達し、電極系上の反応層
７が溶解した。試料液を供給してから一定時間後に、電
極系の対極５を基準にして測定極４にアノード方向へ＋
０．５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定
したところ、試料液中のフルクトース濃度に比例した応
答電流値が得られた。反応層７が試料液に溶解すると、
試料液中のフルクトースはＦＤＨによって酸化され、５
−ケト−フルクトースが生成する。次に、ＦＤＨによる
酸化反応で移動した電子によってフェリシアン化カリウ
ムがフェロシアン化カリウムに還元される。そして、前
記のパルス電圧の印加により、生成したフェロシアン化
カリウムの酸化電流が得られ、この電流値は基質である
フルクトースの濃度に対応する。To this fructose sensor, 3 μl of a fructose aqueous solution was supplied as a sample solution from the entrance of the slit 10 constituting the sample supply path. The sample solution quickly reached the air holes 11 by the capillary phenomenon, and the reaction layer 7 on the electrode system was dissolved. After a certain period of time from the supply of the sample solution, the counter electrode 5 of the electrode system is used as a reference to the measurement electrode 4 in the anode direction
When a pulse voltage of 0.5 V was applied and the current value after 5 seconds was measured, a response current value proportional to the fructose concentration in the sample solution was obtained. When the reaction layer 7 dissolves in the sample solution,
Fructose in the sample solution is oxidized by FDH and becomes 5
-Keto-fructose is produced. Next, potassium ferricyanide is reduced to potassium ferrocyanide by the electrons transferred by the oxidation reaction by FDH. Then, by applying the pulse voltage, an oxidation current of the generated potassium ferrocyanide is obtained, and this current value corresponds to the concentration of fructose which is the substrate.

【００１２】上記第一層の形成において、ＦＤＨ、リン
酸塩、クエン酸塩、およびＣＭＣの混合溶液を滴下する
と、最初に形成したＣＭＣ層は一度溶解し、その後の乾
燥過程で酵素などと混合された形で第一層を形成する。
しかし、攪拌等をともなわないため完全な混合状態とは
ならず、電極系表面はＣＭＣのみによって被覆された状
態となる。すなわち、酵素および各塩が電極系表面に接
触しないために、電極系表面へのタンパク質の吸着や、
イオンによる電極系の特性変化が起こり難くなるものと
考えられ、その結果、高精度なセンサ応答を有するフル
クトースセンサ得ることができる。また、保存特性も良
好であった。上記反応層の形成において、第二層の形成
に用いたエタノールに溶解する成分は第一層にはない。
また、第三層の形成に用いたトルエンに溶解する成分は
第一層、第二層のいずれにも存在しない。このため、各
層は相互に混合されることなく形成される。したがて、
酵素を含む第一層と電子受容体を含む第三層が、親水性
高分子を含む第二層によって確実に隔てられ、酵素が電
子受容体と接触することなく担持されており、酵素活性
の低下が阻止される利点がある。In the formation of the first layer, when a mixed solution of FDH, phosphate, citrate, and CMC is dropped, the first formed CMC layer is once dissolved and then mixed with an enzyme in the subsequent drying process. Forming a first layer in the formed shape.
However, since it is not accompanied by stirring or the like, it is not in a completely mixed state, and the electrode system surface is in a state of being covered only with CMC. That is, since the enzyme and each salt do not contact the surface of the electrode system, adsorption of proteins on the surface of the electrode system,
It is considered that the change in the characteristics of the electrode system due to the ions is unlikely to occur, and as a result, a fructose sensor having a highly accurate sensor response can be obtained. The storage characteristics were also good. In the formation of the above reaction layer, there is no component in the first layer which is soluble in the ethanol used in the formation of the second layer.
Further, the component soluble in toluene used for forming the third layer does not exist in either the first layer or the second layer. Therefore, the layers are formed without being mixed with each other. Therefore,
The first layer containing the enzyme and the third layer containing the electron acceptor are reliably separated by the second layer containing the hydrophilic polymer, and the enzyme is supported without contact with the electron acceptor, and There is an advantage that the reduction is prevented.

【００１３】［実施例２］反応層以外は上記実施例１と
全て同じであるので、ここでは省略して反応層に関して
してのみ説明する。上記実施例１と同様に電極系上へ第
一層を形成し、この後、親水性高分子としてＰＶＰの
１．０ｗｔ％エタノール溶液を前記第一層上に滴下し、
室温で乾燥させて第二層を形成した。次に、電子受容体
としてのフェリシアン化カリウム、および緩衝剤として
のリン酸ナトリウムとリン酸カリウムをエタノール中に
分散させたものを滴下し、エタノールを揮発させること
により第三層を形成した。第三層を形成するときの分散
媒であるエタノールが第二層のＰＶＰ層に溶け込む可能
性はあるが、フェリシアン化カリウムおよび緩衝剤はエ
タノールに溶解せず分散されているので、第二層と第三
層の混合はきわめて少なくすることが可能であり、実施
例１の場合と同様に、良好な基質応答性と保存性が得ら
れた。[Embodiment 2] Except for the reaction layer, it is the same as Embodiment 1 above, so that it will be omitted here and only the reaction layer will be described. A first layer was formed on the electrode system in the same manner as in Example 1 above, and then a 1.0 wt% ethanol solution of PVP as a hydrophilic polymer was dropped on the first layer,
It was dried at room temperature to form a second layer. Next, potassium ferricyanide as an electron acceptor and sodium phosphate and potassium phosphate as buffers dispersed in ethanol were added dropwise to volatilize ethanol to form a third layer. Ethanol, which is the dispersion medium when forming the third layer, may dissolve into the PVP layer of the second layer, but potassium ferricyanide and the buffering agent are not dissolved in ethanol and are dispersed, so the second layer and the Mixing of the three layers can be made extremely small, and as in the case of Example 1, good substrate responsiveness and storage stability were obtained.

【００１４】［実施例３］反応層以外は上記実施例１と
全て同じであるので、ここでは省略して反応層に関して
してのみ説明する。上記実施例１と同様に電極系上へ第
一層、および第二層を形成した。さらに、電子受容体と
してのフェリシアン化カリウム、および緩衝剤としての
リン酸ナトリウムとクエン酸を、脂質のレシチン０．５
ｗｔ％を含むトルエン中に分散させたものを前記第二層
上に滴下し、トルエンを揮発させることにより第二層を
形成した。脂質を含有させることにより、緩衝剤や電子
受容体をトルエン中へ分散させることが容易となるな
ど、反応層の形成工程における利点が大きい。また、カ
バー、およびスペーサーと一体化したセンサに試料液を
供給するとき、試料液が極めて速やかに吸引されるな
ど、測定上でも大きな利点を有する。[Embodiment 3] Except for the reaction layer, it is the same as Embodiment 1 above, so that it will be omitted here and only the reaction layer will be described. A first layer and a second layer were formed on the electrode system in the same manner as in Example 1 above. Furthermore, potassium ferricyanide as an electron acceptor, and sodium phosphate and citric acid as buffers were added to the lipid lecithin 0.5
What was dispersed in toluene containing wt% was dropped onto the second layer, and the second layer was formed by volatilizing the toluene. The inclusion of the lipid makes it easier to disperse the buffer and the electron acceptor in toluene, and thus has a great advantage in the step of forming the reaction layer. In addition, when the sample solution is supplied to the sensor integrated with the cover and the spacer, the sample solution is sucked very quickly, which is a great advantage in measurement.

【００１５】なお、上記実施例では、酸化還元酵素とし
てフルクトースデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を用いた
が、これに限定されることはない。ヘキソキナーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェイトデヒドロゲナーゼの組み合せからなる酵素、ある
いはグルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ
の組み合せからなる酵素など、基質に応じて適宜酵素を
選択することにより優れたセンサ応答が得られる。ま
た、酸化還元酵素として乳酸オキシダーゼまたは乳酸デ
ヒドロゲナーゼを用いた乳酸センサ、グルコースオキシ
ダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いたグル
コースセンサ、コレステロールオキシダーゼまたはコレ
ステロールデヒドロゲナーゼを用いたコレステロールセ
ンサ、グルコースオキシダーゼ、インベルターゼの組合
せ、グルコースオキシダーゼ、インベルターゼ、ムタロ
ターゼの組合せ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、イン
ベルターゼの組合せ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、
インベルターゼ、ムタロターゼの組合せを用いたしょ糖
センサにおいても、実施例にあげたフルクトースセンサ
と同様の効果が得られる。In the above examples, fructose dehydrogenase (FDH) was used as the oxidoreductase, but it is not limited to this. An excellent sensor response can be obtained by appropriately selecting an enzyme depending on the substrate, such as an enzyme composed of a combination of hexokinase, phosphoglucose isomerase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, or an enzyme composed of a combination of glucose isomerase and glucose oxidase. . Further, a lactate sensor using lactate oxidase or lactate dehydrogenase as a redox enzyme, a glucose sensor using glucose oxidase or glucose dehydrogenase, a cholesterol sensor using cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase, a combination of glucose oxidase, invertase, glucose oxidase, invertase. , Mutarotase combination, fructose dehydrogenase, invertase combination, fructose dehydrogenase,
The sucrose sensor using a combination of invertase and mutarotase also has the same effect as the fructose sensor described in the examples.

【００１６】また、上記実施例では親水性高分子として
ＣＭＣおよびＰＶＰを用いたが、これに限定されること
はなく、ポリビニルアルコール、ゼラチンおよびその誘
導体、アクリル酸およびその塩、メタアクリル酸および
その塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸お
よびその塩、セルロース誘導体、具体的には、ヒドロキ
シプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセル
ロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキ
シエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロー
ス等を組み合せて用いることも可能である。一方、電子
受容体としては、上記実施例に示したフェリシアン化カ
リウムは安定性や反応速度の点などから優れているが、
これ以外にもｐ−ベンゾキノン、フェロセンやその誘導
体なども使用できる。Further, although CMC and PVP were used as the hydrophilic polymer in the above examples, the present invention is not limited to this, and polyvinyl alcohol, gelatin and its derivatives, acrylic acid and its salts, methacrylic acid and its It is also possible to use a combination of salts, starch and its derivatives, maleic anhydride and its salts, cellulose derivatives, specifically hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, ethyl hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl ethyl cellulose and the like. . On the other hand, as the electron acceptor, potassium ferricyanide shown in the above examples is excellent in terms of stability and reaction rate,
Other than this, p-benzoquinone, ferrocene and derivatives thereof can also be used.

【００１７】また、緩衝剤としては上記実施例に示した
リン酸塩およびクエン酸は使用するＦＤＨの至適ｐＨ領
域において緩衝能が高いが、これに限定されることはな
く、使用する酸化還元酵素の至適ｐＨ領域に合わせて種
々の緩衝剤の選択が可能である。なお、上記実施例では
電子受容体と緩衝剤の分散媒としてトルエン、エタノー
ルを用いたが、これに限定されることはない。さらに、
上記実施例では測定極と対極からなる二電極系について
述べたが、参照極を加えた三電極方式とするとより精度
の高い測定が可能である。As the buffering agent, the phosphate and citric acid shown in the above-mentioned examples have high buffering ability in the optimum pH region of FDH to be used, but the buffering agent is not limited to this, and the redox agent to be used is not limited thereto. Various buffers can be selected according to the optimum pH range of the enzyme. Although toluene and ethanol were used as the dispersion medium of the electron acceptor and the buffer in the above-mentioned examples, the present invention is not limited to this. further,
Although the two-electrode system including the measurement electrode and the counter electrode has been described in the above embodiment, the three-electrode system including the reference electrode enables more accurate measurement.

【００１８】[0018]

【発明の効果】以上の実施例からも明かなように本発明
によると、反応層中の酸化還元酵素の活性が保存中に低
下することなく、また測定に際して試料液のｐＨにより
影響を受けることなく、高い信頼性を有するバイオセン
サを得ることができる。As is apparent from the above examples, according to the present invention, the activity of the oxidoreductase in the reaction layer does not decrease during storage and is affected by the pH of the sample solution during measurement. In addition, a biosensor having high reliability can be obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の一実施例におけるフルクトースセンサ
の縦断面図である。FIG. 1 is a vertical sectional view of a fructose sensor according to an embodiment of the present invention.

【図２】同フルクトースセンサのうち反応層を除いた分
解斜視図である。FIG. 2 is an exploded perspective view of the fructose sensor excluding a reaction layer.

【図３】従来のバイオセンサの一例を示す縦断面図であ
る。FIG. 3 is a vertical cross-sectional view showing an example of a conventional biosensor.

【図４】同バイオセンサのうち反応層を除いた分解斜視
図である。FIG. 4 is an exploded perspective view of the biosensor from which a reaction layer is removed.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１ 絶縁性の基板 ２、３ リード ４ 測定極 ５ 対極 ６ 絶縁層 ７ 反応層 ８ スペーサー ９ カバー １０ 試料供給路 １１ 空気孔 1 Insulating Substrate 2, 3 Lead 4 Measuring Electrode 5 Counter Electrode 6 Insulating Layer 7 Reaction Layer 8 Spacer 9 Cover 10 Sample Supply Channel 11 Air Vent

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 絶縁性の基板に形成した測定極と対極を
主体とする電極系および前記電極系上に接して形成した
反応層を具備し、前記反応層が酸化還元酵素を含む第一
層、親水性高分子からなる第二層、および電子受容体と
緩衝剤を含む第三層から構成されること特徴とするバイ
オセンサ。1. A first layer comprising an electrode system mainly composed of a measuring electrode and a counter electrode formed on an insulating substrate, and a reaction layer formed in contact with the electrode system, the reaction layer containing an oxidoreductase. A biosensor comprising a second layer composed of a hydrophilic polymer and a third layer containing an electron acceptor and a buffer. 【請求項２】 第一層が酸化還元酵素と親水性高分子か
らなり、第三層が電子受容体と緩衝剤と脂質からなる請
求項１記載のバイオセンサ。2. The biosensor according to claim 1, wherein the first layer comprises an oxidoreductase and a hydrophilic polymer, and the third layer comprises an electron acceptor, a buffer and a lipid. 【請求項３】 第一層が酸化還元酵素と緩衝剤と親水性
高分子からなり、第三層が電子受容体と緩衝剤と脂質か
らなる請求項１記載のバイオセンサ。3. The biosensor according to claim 1, wherein the first layer comprises an oxidoreductase, a buffer and a hydrophilic polymer, and the third layer comprises an electron acceptor, a buffer and a lipid.