JP3163218B2 - Biosensor manufacturing method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、試料中の特定成分につ
いて、迅速かつ高精度な定量を実施することができ、更
に保存信頼性の高いバイオセンサの製造法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for producing a biosensor capable of rapidly and accurately quantifying a specific component in a sample and having high storage reliability.

【０００２】[0002]

【従来の技術】これまで、試料液中の特定成分につい
て、迅速かつ高精度な定量を実施可能な方式としては、
次のようなバイオセンサが提案されている（特開平３ー
２０２７６４号公報）。このバイオセンサは、絶縁性の
基板上に形成した電極系上に、親水性高分子と酸化還元
酵素と電子受容体からなる酵素反応層を形成したもの
で、基質を含む試料液が反応層へ供給されると反応層が
溶解し、酸化還元酵素と基質が反応し、更に電子受容体
が還元され、この還元された電子受容体を前記電極系で
電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から
試料液中の基質濃度を求めるものである。前記酵素反応
層の作製法としては、電極系上に親水性高分子溶液を塗
布した後に加熱乾燥し、その上に親水性高分子と酸化還
元酵素と電子受容体の混合液を塗布した後に、加熱乾燥
して形成する工程が開示されている。2. Description of the Related Art Hitherto, as a method capable of rapidly and accurately quantifying a specific component in a sample solution,
The following biosensor has been proposed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-202766). In this biosensor, an enzyme reaction layer consisting of a hydrophilic polymer, an oxidoreductase, and an electron acceptor is formed on an electrode system formed on an insulating substrate, and a sample solution containing a substrate is transferred to the reaction layer. When supplied, the reaction layer dissolves, the oxidoreductase reacts with the substrate, the electron acceptor is further reduced, and the reduced electron acceptor is electrochemically oxidized by the electrode system, which is obtained at this time. The substrate concentration in the sample solution is determined from the oxidation current value. As a method of preparing the enzyme reaction layer, after applying a hydrophilic polymer solution on the electrode system, and then heating and drying, after applying a mixed solution of a hydrophilic polymer, an oxidoreductase, and an electron acceptor thereon, A step of forming by heating and drying is disclosed.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】前記のような従来のバ
イオセンサの作製方法によると、反応層を加熱乾燥して
形成した後も空気中の水分の吸収により、酵素の活性そ
のものが吸湿により低下することもさることながら、反
応層中に共存させている各種成分の酵素活性失活への影
響も大きくなり、センサの応答特性が低下したり、保存
特性が著しく劣化するなどの課題があった。According to the conventional method for manufacturing a biosensor as described above, even after the reaction layer is formed by heating and drying, the activity of the enzyme itself decreases due to the absorption of moisture in the air due to moisture absorption. In addition, the effect of various components coexisting in the reaction layer on the deactivation of the enzyme activity also increased, and there were problems such as a decrease in the response characteristics of the sensor and a significant deterioration in the storage characteristics. .

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明のバイオセンサの
製造法は、（ａ）絶縁性の基板上に作用極と対極を主体
とする電極系を設ける工程、（ｂ）前記電極系上に親水
性高分子の水溶液を展開し乾燥させて親水性高分子層を
設ける工程、（ｃ）前記親水性高分子層上に酵素を含む
溶液を展開し乾燥させて酵素を含む第一層を設ける工
程、（ｄ）前記第一層上に親水性高分子の有機溶媒溶液
を展開し乾燥させて親水性高分子を含む第二層を設ける
工程、（ｅ）前記第二層上に電子受容体を含む有機溶媒
溶液または有機溶媒分散液を展開し乾燥させて電子受容
体を含む第三層を設ける工程、および（ｆ）前記基板に
スペーサとカバーを組み合わせて前記反応層に通じる試
料供給路を形成する工程を、工程（ａ）〜（ｆ）の順に
有し、少なくとも工程（ｄ）〜（ｆ）を湿度１０％以下
の低湿度環境下で実施するものである。Preparation of a biosensor of the present invention SUMMARY OF THE INVENTION may, (a) a step of providing an electrode system composed mainly of working electrode and the counter electrode on an insulating substrate, on (b) the electrode system Developing and drying an aqueous solution of a hydrophilic polymer to form a hydrophilic polymer layer; and (c) providing a first layer containing an enzyme by spreading and drying a solution containing an enzyme on the hydrophilic polymer layer. (D) developing and drying an organic solvent solution of a hydrophilic polymer on the first layer to provide a second layer containing the hydrophilic polymer, (e) an electron acceptor on the second layer (C) developing and drying an organic solvent solution or an organic solvent dispersion liquid containing the same to provide a third layer containing an electron acceptor; and (f) providing a sample supply passage leading to the reaction layer by combining a spacer and a cover on the substrate. Forming steps in the order of steps (a) to (f). Both steps (d) to (f) have a humidity of 10% or less
It is those carried out under the low humidity Dowa border.

【０００５】さらに、本発明のバイオセンサの製造法
は、（ａ）絶縁性の基板上に作用極と対極を主体とする
電極系を設ける工程、（ｂ）前記電極系上に親水性高分
子の水溶液を展開し乾燥させて親水性高分子層を設ける
工程、（ｃ）前記親水性高分子層上に酵素を含む溶液を
展開し乾燥させて酵素を含む第一層を設ける工程、
（ｄ）前記第一層上に親水性高分子の有機溶媒溶液を展
開し乾燥させて親水性高分子を含む第二層を設ける工
程、（ｅ）前記第二層上に電子受容体を含む疎水性およ
び揮発性の高い有機溶媒溶液または疎水性および揮発性
の高い有機溶媒分散液を展開し乾燥させて電子受容体を
含む第三層を設ける工程を、工程（ａ）〜（ｅ）の順に
有し、工程（ｄ）を湿度１０％以下の低湿度環境下で実
施するものである。 Further, the method for producing a biosensor according to the present invention comprises: (a) providing an electrode system mainly comprising a working electrode and a counter electrode on an insulating substrate; and (b) providing a hydrophilic polymer on the electrode system. (C) developing and drying a solution containing an enzyme on the hydrophilic polymer layer to provide a first layer containing the enzyme,
(D) developing and drying an organic solvent solution of a hydrophilic polymer on the first layer to provide a second layer containing a hydrophilic polymer, and (e) including an electron acceptor on the second layer. Hydrophobicity and
And highly volatile organic solvent solutions or hydrophobic and volatile
Providing a third layer containing an electron acceptor by developing and drying an organic solvent dispersion having a high concentration in the order of steps (a) to (e), wherein the step (d) is performed at a humidity of 10%. those carried out under the following low humidity Dowa boundary.

【０００６】[0006]

【作用】上記のように酵素を含む層を形成後の工程を低
湿度の雰囲気下で実施することにより、酵素を含む層が
周囲の水分を再吸収することなく乾燥した状態を保つこ
とができる。また、酵素を含む第一層上に、有機溶媒溶
液または有機溶媒分散液を用いて第二層、第三層を形成
する場合は、第二層のみを低湿度下で形成することによ
り、酵素を含む層が水分を吸収することなく乾燥した状
態を保つことができる。この場合、第三層の形成に用い
る媒体は水分を吸収しにくく、揮発性の高いものが好ま
しい。前記のように酵素を含む層が乾燥した状態に保た
れる結果、酵素活性の低下を防ぎ、応答特性が向上し高
い保存信頼性を有するバイオセンサが得られる。By performing the steps after forming the enzyme-containing layer in a low-humidity atmosphere as described above, the enzyme-containing layer can be kept dry without reabsorbing the surrounding moisture. . When the second layer and the third layer are formed on the first layer containing the enzyme using an organic solvent solution or an organic solvent dispersion, the enzyme is formed by forming only the second layer under low humidity. Can be kept dry without absorbing moisture. In this case, the medium used for forming the third layer is preferably a medium which hardly absorbs moisture and has high volatility. As described above, as a result of keeping the layer containing the enzyme in a dry state, a biosensor having a high storage reliability with improved response characteristics and a reduced storage of the enzyme activity can be obtained.

【０００７】[0007]

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。 ［実施例１］図１は本発明の一実施例として作製したフ
ルクトースセンサの断面図である。また、図２は図１の
斜め上方向からみた分解斜視図であり、反応層は省略し
てある。以下、フルクトースセンサの作製方法について
説明する。まず、ポリエチレンテレフタレートからなる
絶縁性の基板１上に、スクリーン印刷により銀ペ−スト
を印刷しリ−ド２、３を形成した。次に、樹脂バインダ
ーを含む導電性カーボンペーストを用いて測定極４と対
極５からなる電極系を、また絶縁性ペーストを用いて絶
縁層６を、それぞれ印刷して形成した。絶縁層６は、測
定極４の露出部分の面積（約１ｍｍ²）を一定とし、か
つリ−ド２、３を部分的に覆っている。次に、前記電極
系上に親水性高分子としてカルボキシメチルセルロ−ス
（以下ＣＭＣで表す）の０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、
乾燥させてＣＭＣ層を形成した。つづいて、前記ＣＭＣ
層上に酵素としてフルクトースデヒドロゲナーゼ（以下
ＦＤＨで表す）（東洋紡製）１０００Ｕおよび電子受容
体としてフェリシアン化カリウム３３ｍｇを、ＣＭＣ
０．５ｗｔ％を含むリン酸−クエン酸緩衝液（０．２
Ｍ：Ｎａ₂ＨＰＯ₄−０．１Ｍ：Ｃ₃Ｈ₄（ＯＨ）（ＣＯＯ
Ｈ）₃；ｐＨ＝５．０）１ｍｌに溶解させた混合溶液を
４μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥さ
せて反応層７を形成した。反応層の外周部分は直径約
３．６ｍｍであり、対極の直径に略一致している。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail with reference to embodiments. Embodiment 1 FIG. 1 is a sectional view of a fructose sensor manufactured as one embodiment of the present invention. FIG. 2 is an exploded perspective view as viewed obliquely from above in FIG. 1, and the reaction layer is omitted. Hereinafter, a method for manufacturing a fructose sensor will be described. First, leads 2 and 3 were formed by printing silver paste by screen printing on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate. Next, an electrode system including the measuring electrode 4 and the counter electrode 5 was formed by printing using a conductive carbon paste containing a resin binder, and the insulating layer 6 was formed by printing using an insulating paste. The insulating layer 6 keeps the area (about 1 mm ² ) of the exposed portion of the measuring electrode 4 constant and partially covers the leads 2 and 3. Next, a 0.5 wt% aqueous solution of carboxymethyl cellulose (hereinafter referred to as CMC) as a hydrophilic polymer was dropped on the electrode system,
It was dried to form a CMC layer. Then, said CMC
On the layer, 1000 U of fructose dehydrogenase (hereinafter referred to as FDH) (manufactured by Toyobo) as an enzyme and 33 mg of potassium ferricyanide as an electron acceptor were added to a CMC.
Phosphate-citrate buffer containing 0.5 wt% (0.2
M: Na ₂ HPO ₄ -0.1 M: C ₃ H ₄ (OH) (COO
H) ₃ ; pH = 5.0) 4 μl of the mixed solution dissolved in 1 ml was added dropwise, and dried in a 50 ° C. hot air drier for 10 minutes to form a reaction layer 7. The outer peripheral portion of the reaction layer has a diameter of about 3.6 mm, which is substantially equal to the diameter of the counter electrode.

【０００８】リン酸塩、クエン酸、ＦＤＨおよび電子受
容体の混合溶液を滴下すると、最初に形成したＣＭＣ層
は一度溶解し、その後の乾燥過程で酵素などと混合され
た形で反応層７を形成する。しかし、攪拌等をともなわ
ないため完全な混合状態とはならず、電極系表面はＣＭ
Ｃのみによって被覆された状態となる。すなわち、酵素
および電子受容体などが電極系表面に接触しないため
に、電極系表面へのタンパク質の吸着や、フェリシアン
化カリウムのような酸化能を有する物質の化学的作用に
よる電極系の特性変化が起こり難くなるもの考えられ、
その結果、高精度なセンサ応答を有するフルクトースセ
ンサ得ることができる。前記のようにして反応層７を形
成した後、センサを窒素を循環させているグローブボッ
クス中に移し、ここでグローブボックス中の相対湿度を
１％以下に保持することで水分の再吸収を防止した。最
後に、カバー９およびスペーサー８を図２中、一点鎖線
で示すような位置関係をもって接着した。カバーを装着
すると、カバーとスペーサーによってできる空間部が試
料供給路を形成し、その毛細管現象によって、試料液は
センサ先端の試料供給孔１０に接触させるだけの簡易な
操作で容易に反応層部分へ導入される。試料液の供給量
はカバーとスペーサーによって生じる空間容積に依存す
るため、あらかじめ定量する必要がない。さらに、測定
中の試料液の蒸発を最小限に抑えることができ、精度の
高い測定が可能となる。When a mixed solution of phosphate, citric acid, FDH and an electron acceptor is dropped, the CMC layer formed first is dissolved once, and the reaction layer 7 is mixed with enzymes and the like in the subsequent drying process. Form. However, it does not come to a complete mixing state without stirring, etc.
It becomes a state covered with only C. That is, since the enzyme and the electron acceptor do not come into contact with the surface of the electrode system, the characteristics of the electrode system change due to the adsorption of proteins to the electrode system surface and the chemical action of oxidizing substances such as potassium ferricyanide. It is thought that it will be difficult,
As a result, a fructose sensor having a highly accurate sensor response can be obtained. After forming the reaction layer 7 as described above, the sensor is moved into a glove box circulating nitrogen, and the relative humidity in the glove box is maintained at 1% or less to prevent reabsorption of moisture. did. Finally, the cover 9 and the spacer 8 were adhered in a positional relationship as indicated by a dashed line in FIG. When the cover is attached, the space formed by the cover and the spacer forms a sample supply path, and the sample liquid is easily brought into the reaction layer portion by a simple operation of contacting the sample supply hole 10 at the sensor tip by the capillary action. be introduced. Since the supply amount of the sample solution depends on the space volume generated by the cover and the spacer, it is not necessary to determine the amount in advance. Furthermore, evaporation of the sample liquid during measurement can be minimized, and highly accurate measurement can be performed.

【０００９】上記のように作製したフルクトースセンサ
に試料液としてフルクトース水溶液３μｌを試料供給孔
１０より供給すると、試料液は毛細管現象によって速や
かに空気孔１１部分まで達し、電極系上の反応層７が溶
解した。試料液を供給してから一定時間後に、電極系の
対極５を基準にして測定極４にアノード方向へ＋０．５
Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定したと
ころ、試料液中のフルクトース濃度に比例した応答電流
値が得られた。反応層７が試料液に溶解すると、試料液
中のフルクトースはＦＤＨによって酸化され５−ケト−
フルクトースが生成する。ＦＤＨによる酸化反応で移動
した電子によって、フェリシアン化カリウムがフェロシ
アン化カリウムに還元される。次に、前記のパルス電圧
の印加により、生成したフェロシアン化カリウムの酸化
電流が得られ、この電流値は基質であるフルクトースの
濃度に対応する。When 3 μl of a fructose aqueous solution is supplied from the sample supply hole 10 as a sample solution to the fructose sensor manufactured as described above, the sample solution quickly reaches the air hole 11 portion by a capillary phenomenon, and the reaction layer 7 on the electrode system is formed. Dissolved. After a certain period of time after the supply of the sample liquid, the measurement electrode 4 is added to the measurement electrode 4 in the anode direction by +0.5 with respect to the counter electrode 5 of the electrode system.
When a pulse voltage of V was applied and the current value after 5 seconds was measured, a response current value proportional to the fructose concentration in the sample solution was obtained. When the reaction layer 7 is dissolved in the sample solution, fructose in the sample solution is oxidized by FDH and
Fructose is produced. Potassium ferricyanide is reduced to potassium ferrocyanide by the electrons transferred in the oxidation reaction by FDH. Next, by the application of the pulse voltage, an oxidation current of the generated potassium ferrocyanide is obtained, and this current value corresponds to the concentration of fructose as a substrate.

【００１０】［実施例２］実施例１と反応層７の組成以
外は全て同じであるので、ここでは省略して反応層７に
関してしてのみ説明する。実施例１と同様に形成した電
極系上にＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、乾燥さ
せてＣＭＣ層を形成した。つづいて、前記ＣＭＣ層上に
酵素としてＦＤＨ（東洋紡製）１０００Ｕを、実施例１
と同じＣＭＣ０．５ｗｔ％を含むリン酸−クエン酸緩衝
液１ｍｌに溶解させた混合溶液を４μｌ滴下し、５０℃
の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて第一層を形成した
後、センサを窒素を循環させているグローブボックス中
に移した。ここでグローブボックス中の相対湿度を１％
以下に保持することで水分の再吸収を防止した。以後の
工程はすべて前記グローブボックス中で実施した。ま
ず、親水性高分子としてポリビニルピロリドン（以下Ｐ
ＶＰと略す）の０．５ｗｔ％エタノール溶液を前記第一
層上に４μｌ滴下し、室温で乾燥させて第二層を形成し
た。次に、電子受容体としてフェリシアン化カリウム１
９０ｍｇを大豆精製レシチン０．５ｗｔ％を含むエタノ
ール中に分散させたものを、前記第二層上に３μｌ滴下
し、室温で乾燥させて第三層を形成した。次に、カバー
１１およびスペーサー１０を図２中、一点鎖線で示すよ
うな位置関係をもって接着した。第一層、第二層および
第三層からなる反応層７の外周部分は直径約３．６ｍｍ
であり、対極の直径に略一致している。Embodiment 2 Since the composition of Embodiment 1 is the same as that of Embodiment 1 except for the composition of the reaction layer 7, it is omitted here and only the reaction layer 7 will be described. A 0.5 wt% aqueous solution of CMC was dropped on the electrode system formed in the same manner as in Example 1, and dried to form a CMC layer. Subsequently, 1000 U of FDH (manufactured by Toyobo) was placed on the CMC layer as an enzyme in Example 1.
4 μl of a mixed solution dissolved in 1 ml of a phosphate-citrate buffer solution containing 0.5 wt% of the same CMC as above was added dropwise at 50 ° C.
After drying in a warm air dryer for 10 minutes to form a first layer, the sensor was transferred into a glove box circulating nitrogen. Where the relative humidity in the glove box is 1%
By keeping below, re-absorption of water was prevented. All subsequent steps were performed in the glove box. First, polyvinylpyrrolidone (hereinafter referred to as P) is used as a hydrophilic polymer.
4 μl of a 0.5 wt% ethanol solution of VP) was dropped on the first layer and dried at room temperature to form a second layer. Next, potassium ferricyanide 1 was used as an electron acceptor.
A dispersion of 90 mg in ethanol containing 0.5 wt% of soybean-purified lecithin was dropped in 3 μl on the second layer and dried at room temperature to form a third layer. Next, the cover 11 and the spacer 10 were adhered in a positional relationship as indicated by a dashed line in FIG. The outer peripheral portion of the reaction layer 7 including the first layer, the second layer, and the third layer has a diameter of about 3.6 mm.
Which is substantially equal to the diameter of the counter electrode.

【００１１】実施例１に対し、実施例２では反応層７が
３層構造になっており、製造法としては煩雑である。し
かしながら、酵素を含む第一層と電子受容体を含む第三
層が、親水性高分子を含む第二層によって隔てられてお
り、酵素が電子受容体と接触することがなく、酵素活性
の低下が阻止される利点がある。上記のように作製した
フルクトースセンサに試料液としてフルクトース水溶液
３μｌを試料供給孔１０より供給すると、試料液は毛細
管現象によって速やかに空気孔１２部分まで達し、電極
系上の反応層が溶解した。試料液を供給してから一定時
間後に、電極系の対極５を基準にして測定極４にアノー
ド方向へ＋０．５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電
流値を測定したところ、試料液中のフルクトース濃度に
比例した応答電流値が得られた。In contrast to the first embodiment, in the second embodiment, the reaction layer 7 has a three-layer structure, and the production method is complicated. However, the first layer containing the enzyme and the third layer containing the electron acceptor are separated by the second layer containing the hydrophilic polymer, so that the enzyme does not come into contact with the electron acceptor and the enzyme activity decreases. Has the advantage of being prevented. When 3 μl of an aqueous fructose solution was supplied as a sample solution to the fructose sensor prepared as described above from the sample supply hole 10, the sample solution quickly reached the air hole 12 portion by capillary action, and the reaction layer on the electrode system was dissolved. After a certain period of time from the supply of the sample liquid, a +0.5 V pulse voltage was applied to the measurement electrode 4 in the anode direction with reference to the counter electrode 5 of the electrode system, and the current value after 5 seconds was measured. A response current value proportional to the fructose concentration in the medium was obtained.

【００１２】［実施例３］実施例１および２と反応層７
の組成以外は全て同じであるので、ここでは反応層７に
関してのみ説明する。実施例１および２と同様に形成し
た電極系上にＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、乾
燥させてＣＭＣ層を形成した。つづいて、前記ＣＭＣ層
上に酵素としてＦＤＨ（東洋紡製）１０００Ｕを、ＣＭ
Ｃ０．５ｗｔ％を含むリン酸−クエン酸緩衝液（実施例
１および２と同じ）１ｍｌに溶解させた混合溶液を４μ
ｌ滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて
第一層を形成した後、窒素を循環させているグローブボ
ックス中（相対湿度１％以下）にセンサを移し、親水性
高分子としてＰＶＰの０．５ｗｔ％エタノール溶液を前
記第一層上に４μｌ滴下し、室温で乾燥させて第二層を
形成した。次に、センサをグローブボックス中から取り
出し、電子受容体としてフェリシアン化カリウム１９０
ｍｇを卵黄レシチン１．０ｗｔ％を含むトルエン中に分
散させたものを、前記第二層上に３μｌ滴下し、室温で
乾燥させて第三層を形成した。次に、カバー１１および
スペーサー１０を図２中、一点鎖線で示すような位置関
係をもって接着した。[Embodiment 3] Embodiments 1 and 2 and reaction layer 7
Since the composition is the same except for the composition, only the reaction layer 7 will be described here. A 0.5 wt% aqueous solution of CMC was dropped on the electrode system formed in the same manner as in Examples 1 and 2, and dried to form a CMC layer. Subsequently, 1000 U of FDH (manufactured by Toyobo) was placed on the CMC layer as an enzyme,
4 μl of a mixed solution dissolved in 1 ml of a phosphate-citrate buffer solution containing 0.5 wt% of C (same as in Examples 1 and 2)
After dripping for 1 minute in a hot air dryer at 50 ° C. to form a first layer, the sensor was transferred into a glove box (1% or less relative humidity) in which nitrogen was circulated, and the hydrophilic layer was dried. 4 μl of a 0.5 wt% ethanol solution of PVP as a molecule was dropped on the first layer and dried at room temperature to form a second layer. Next, the sensor is taken out of the glove box, and potassium ferricyanide 190 is used as an electron acceptor.
3 μl of a dispersion of mg of yolk lecithin in toluene containing 1.0 wt% of egg yolk was dropped on the second layer and dried at room temperature to form a third layer. Next, the cover 11 and the spacer 10 were adhered in a positional relationship as indicated by a dashed line in FIG.

【００１３】実施例１に対し、実施例３では酵素と電子
受容体が混在していないので実施例２と同様の利点があ
るが、電子受容体を分散させる有機溶媒をトルエンに代
えたことで実施例２に比べ、電子受容体を含む第三層の
形状が不均一になり易い。しかしながら、実施例２で用
いたエタノールは水を吸収しやすいので湿度の高い状態
で第二層および第三層を形成すると、酵素を含む第一層
に水分や溶解した電子受容体が溶け込み、酵素の活性が
低下する。一方、トルエンはエタノールに比べ揮発性が
高いので乾燥速度が早く、水を吸収しにくく、かつ不純
物としての水を殆ど含まないことから、第三層を低湿度
の環境下で形成する必要がなく簡易な工程でバイオセン
サを得ることができる。反応層が試料液に溶解すると、
試料液中のフルクトースはＦＤＨによって酸化され５−
ケト−フルクトースが生成する。ＦＤＨによる酸化反応
で移動した電子によって、フェリシアン化カリウムがフ
ェロシアン化カリウムに還元される。次に、前記のパル
ス電圧の印加により、生成したフェロシアン化カリウム
の酸化電流が得られ、この電流値は基質であるフルクト
ースの濃度に対応する。また、上記実施例では相対湿度
１％以下の環境下での製造法について述べたが、湿度１
０％以下であれば実施例と同様の効果が得られた。In contrast to Example 1, Example 3 has the same advantage as Example 2 because the enzyme and the electron acceptor are not mixed, but the organic solvent for dispersing the electron acceptor is changed to toluene. As compared with Example 2, the shape of the third layer including the electron acceptor is likely to be non-uniform. However, since the ethanol used in Example 2 easily absorbs water, when the second layer and the third layer are formed in a high humidity state, moisture and dissolved electron acceptors dissolve into the first layer containing the enzyme, and Activity decreases. On the other hand, since toluene has a higher volatility than ethanol, it has a faster drying rate, hardly absorbs water, and contains almost no water as an impurity, so that it is not necessary to form the third layer in a low humidity environment. A biosensor can be obtained by a simple process. When the reaction layer dissolves in the sample solution,
Fructose in the sample solution is oxidized by FDH and
Keto-fructose is produced. Potassium ferricyanide is reduced to potassium ferrocyanide by the electrons transferred in the oxidation reaction by FDH. Next, by the application of the pulse voltage, an oxidation current of the generated potassium ferrocyanide is obtained, and this current value corresponds to the concentration of fructose as a substrate. Further, in the above-described embodiment, the manufacturing method in an environment where the relative humidity is 1% or less has been described.
If it is 0% or less, the same effect as that of the embodiment is obtained.

【００１４】なお、上記実施例では酸化還元酵素として
フルクトースデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を用いたが、
これに限定されることはない。ヘキソキナーゼ、ホスホ
グルコースイソメラーゼ、グルコース−６−ホスフェイ
トデヒドロゲナーゼの組み合せからなる酵素、あるいは
グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼの組
み合せからなる酵素を前記ＦＤＨの替わりに用いても優
れたセンサ応答が得られる。また、酸化還元酵素として
乳酸オキシダーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼを用いた
乳酸センサ、グルコースオキシダーゼまたはグルコース
デヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサ、コレステ
ロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナ
ーゼを用いたコレステロールセンサ、グルコースオキシ
ダーゼ、インベルターゼの組合せ、グルコースオキシダ
ーゼ、インベルターゼ、ムタロターゼの組合せ、フルク
トースデヒドロゲナーゼ、インベルターゼの組合せ、フ
ルクトースデヒドロゲナーゼ、インベルターゼ、ムタロ
ターゼの組合せを用いたしょ糖センサにおいても、実施
例にあげたフルクトースセンサと同様の効果が得られ
る。In the above embodiment, fructose dehydrogenase (FDH) was used as the oxidoreductase.
It is not limited to this. An excellent sensor response can be obtained by using an enzyme composed of a combination of hexokinase, phosphoglucose isomerase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, or an enzyme composed of a combination of glucose isomerase and glucose oxidase instead of the FDH. Further, a lactate sensor using lactate oxidase or lactate dehydrogenase as a redox enzyme, a glucose sensor using glucose oxidase or glucose dehydrogenase, a cholesterol sensor using cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase, a combination of glucose oxidase and invertase, glucose oxidase, invertase , Sucrose sensor using a combination of mutarotase, fructose dehydrogenase and invertase, and a combination of fructose dehydrogenase, invertase and mutarotase can provide the same effect as the fructose sensor described in the embodiment.

【００１５】また、上記実施例では親水性高分子として
ＣＭＣおよびＰＶＰを用いたが、これらに限定されるこ
とはなく、ポリビニルアルコール、ゼラチンおよびその
誘導体、アクリル酸およびその塩、メタアクリル酸およ
びその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸
およびその塩、そして、セルロース誘導体、具体的に
は、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロー
ス、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、
エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチル
エチルセルロースなどを用いても同様の効果が得られ
る。一方、電子受容体としては、上記実施例に示したフ
ェリシアン化カリウムは安定性や反応速度の点などから
優れているが、これ以外にもｐ−ベンゾキノン、フェロ
センなども使用できる。さらに、上記実施例では測定極
と対極からなる２電極系について述べたが、参照極を加
えた３電極方式とするとより精度の高い測定が可能であ
る。In the above embodiments, CMC and PVP were used as hydrophilic polymers. However, the present invention is not limited to these, and polyvinyl alcohol, gelatin and its derivatives, acrylic acid and its salts, methacrylic acid and its Salts, starch and its derivatives, maleic anhydride and its salts, and cellulose derivatives, specifically, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose,
Similar effects can be obtained by using ethylhydroxyethylcellulose, carboxymethylethylcellulose, or the like. On the other hand, as the electron acceptor, potassium ferricyanide shown in the above examples is excellent in terms of stability and reaction rate, but p-benzoquinone, ferrocene and the like can also be used. Further, in the above-described embodiment, a two-electrode system including a measurement electrode and a counter electrode has been described. However, a three-electrode method including a reference electrode enables more accurate measurement.

【００１６】[0016]

【発明の効果】以上の実施例からも明かなように本発明
によると、高い信頼性を有するバイオセンサを得ること
ができる。As apparent from the above embodiments, according to the present invention, a highly reliable biosensor can be obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】本発明の一実施例におけるフルクトースセンサ
の縦断面図である。FIG. 1 is a longitudinal sectional view of a fructose sensor according to an embodiment of the present invention.

【図２】同フルクトースセンサをその反応層を除いて斜
め上方向からみた分解斜視図である。FIG. 2 is an exploded perspective view of the fructose sensor viewed obliquely from above, excluding its reaction layer.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１ 絶縁性の基板 ２、３ リード ４ 測定極 ５ 対極 ６ 絶縁層 ７ 反応層 ８ スペーサー ９ カバー １０ 試料供給孔 １１ 空気孔 REFERENCE SIGNS LIST 1 insulating substrate 2, 3 lead 4 measuring electrode 5 counter electrode 6 insulating layer 7 reaction layer 8 spacer 9 cover 10 sample supply hole 11 air hole

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−84448（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−88805（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−119013（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−94672（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−109698（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−138080（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−90687（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/327 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (56) References JP-A-3-84448 (JP, A) JP-A-6-88805 (JP, A) JP-A-5-119013 (JP, A) JP-A-6-18813 94672 (JP, A) JP-A-6-109698 (JP, A) JP-A-6-138080 (JP, A) JP-A-52-90687 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. ⁷ , DB name) G01N 27/327 JICST file (JOIS)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 （ａ）絶縁性の基板上に作用極と対極を
主体とする電極系を設ける工程、（ｂ）前記電極系上に
親水性高分子の水溶液を展開し乾燥させて親水性高分子
層を設ける工程、（ｃ）前記親水性高分子層上に酵素を
含む溶液を展開し乾燥させて酵素を含む第一層を設ける
工程、（ｄ）前記第一層上に親水性高分子の有機溶媒溶
液を展開し乾燥させて親水性高分子を含む第二層を設け
る工程、（ｅ）前記第二層上に電子受容体を含む有機溶
媒溶液または有機溶媒分散液を展開し乾燥させて電子受
容体を含む第三層を設ける工程、および（ｆ）前記基板
にスペーサとカバーを組み合わせて前記反応層に通じる
試料供給路を形成する工程を、工程（ａ）〜（ｆ）の順
に有し、工程（ｄ）〜（ｆ）を湿度１０％以下の 低湿度環境下で
実施することを特徴とするバイオセンサの製造法。 (A) a step of providing an electrode system mainly composed of a working electrode and a counter electrode on an insulating substrate; and (b) developing and drying an aqueous solution of a hydrophilic polymer on the electrode system to dry the electrode system. Providing a polymer layer; (c) developing a solution containing an enzyme on the hydrophilic polymer layer and drying it to provide a first layer containing an enzyme; (d) providing a hydrophilic layer on the first layer. Developing and drying a solution of the molecule in an organic solvent to provide a second layer containing a hydrophilic polymer, and (e) developing and drying an organic solvent solution or an organic solvent dispersion containing an electron acceptor on the second layer. Forming a third layer containing an electron acceptor and (f) combining a spacer and a cover on the substrate to form a sample supply path leading to the reaction layer, comprising the steps of (a) to (f). order
In a step (d) ~ method for producing a biosensor which comprises carrying out in a low humidity environment of humidity of 10% or less (f). 【請求項２】 （ａ）絶縁性の基板上に作用極と対極を
主体とする電極系を設ける工程、（ｂ）前記電極系上に
親水性高分子の水溶液を展開し乾燥させて親水性高分子
層を設ける工程、（ｃ）前記親水性高分子層上に酵素を
含む溶液を展開し乾燥させて酵素を含む第一層を設ける
工程、（ｄ）前記第一層上に親水性高分子の有機溶媒溶
液を展開し乾燥させて親水性高分子を含む第二層を設け
る工程、（ｅ）前記第二層上に電子受容体を含む疎水性
および揮発性の高い有機溶媒溶液または疎水性および揮
発性の高い有機溶媒分散液を展開し乾燥させて電子受容
体を含む第三層を設ける工程を、工程（ａ）〜（ｅ）の
順に有し、工程（ｄ） を湿度１０％以下の低湿度環境下で実施する
ことを特徴とするバイオセンサの製造法。 (A) a step of providing an electrode system mainly comprising a working electrode and a counter electrode on an insulating substrate; and (b) developing and drying an aqueous solution of a hydrophilic polymer on the electrode system to dry the electrode system. Providing a polymer layer; (c) developing a solution containing an enzyme on the hydrophilic polymer layer and drying it to provide a first layer containing an enzyme; (d) providing a hydrophilic layer on the first layer. Providing a second layer containing a hydrophilic polymer by developing and drying an organic solvent solution of the molecule, and (e) a highly hydrophobic and highly volatile organic solvent solution containing an electron acceptor or a hydrophobic layer on the second layer. The step of developing and drying an organic solvent dispersion having high solubility and volatility to provide a third layer containing an electron acceptor comprises steps (a) to (e).
Turn a method for producing a biosensor which comprises carrying out step (d) is at low humidity Dowa boundary of a less than 10% humidity.