JPH09511655A - レジオネラ特異性抗生物質、該抗生物質を産生する微生物および該抗生物質を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 レジオネラに特異的な新規の抗生物質ＡＬ０７２、該抗生物質を産生する新規なストレプトマイセス種ＡＬ９１、および該抗生物質を製造する方法が開示されている。該抗生物質化合物の構造は式（ａ）で表される。

Description

【発明の詳細な説明】 レジオネラ特異性抗生物質、該抗生物質を産生する 微生物および該抗生物質を製造する方法 発明の属する技術分野 本発明は、新規なレジオネラ特異性抗生物質ＡＬ０７２、該抗生物質を産生す る新規なストレプトマイセス種ＡＬ９１、および該抗生物質を製造する方法に関 する。 発明の背景 レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)は、レジオネラ感染症 の原因物質であり、レジオネラ症またはポンチアック熱(Pontiac fever)を引き 起こすことが知られている。この細菌が米国のフィラデルフィアで最初に単離さ れて以来、米国を含む世界中のあらゆる地域においていろいろな患者や環境由来 のレジオネラ種の単離が盛んに行われ、１０以上の種が同定された。レジオネラ ・ニューモフィラは、肺炎を引き起こす病原体の１つであり、肺炎の発生の５％ はレジオネラ・ニューモフィラに因ると推定されている。レジオネラ・ニューモ フィラは、エアコンの冷却塔、給水管、ドレイン管などの中において生長し、そ して、汚染されたエアロゾルを吸収することにより呼吸器官内で感染が起こるも のと考えられている。1984年、ソウルのコリョー(Koryo)病院のゆきとどいた医 療施設において患者のみならず医療従事者にも肺炎と思われる症状が発生し、そ の原因と考えられるのはレジオネラ種であるという事実に驚いてから関心が高ま った。韓国の国民保健局(The National Health Institute)により1985年に行わ れた調査の結果によれば、ソウル市内のエアコン用冷却塔の少なくとも90％がレ ジオネラ種で汚染され、また、単離されたレジオネラの93％はレジオネラ・ニュ ーモフィラと同定された。韓国全土の主要都市、例えば、ソウル、プサン、デジ ョンなどにおいて、1988年の７月から９月にかけて行われた国民保健局の追加調 査によれば、単離されたレジオネラの83％は、レジオネラ・ニューモフィラの 血清型１に属した。 マクロライド系抗生物質（例えば、エリスロマイシン）およびキノロン系抗生 物質（例えば、リファムピン）は、レジオネラ種に対して活性であることが知ら れており、レジオネラ感染症の治療に用いられてきた。しかしながら、これらの 抗生物質は、レジオネラ種に加えて、各種の微生物に対する広範囲の活性を有す る。したがって、そのような抗生物質を長期間にわたり濫用すると、いろいろな 微生物に対する抵抗性を発生させるおそれがあるのみならず、ヒトの体内に存在 する微生物のバランスを破壊するなど有害な問題の原因となり得る。 さらに、レジオネラ種の汚染源であるエアコン用冷却塔を殺菌するための化学 物質は、環境汚染およびエアコン装置の腐蝕の原因となるおそれがあるというや っかいな問題も生じている。 したがって、レジオネラ種にのみに対して特異的に活性な新規なレジオネラ特 異性抗生物質の開発が必要であり、これによって上述のような好ましくない問題 をできるだけ少なくすることができるであろう。本発明者は、そのような抗生物 質を開発する目的で、数年にわたり土壌微生物について鋭意研究した。その結果 、本発明者は、レジオネラ特異的抗生物質を産生するストレプトマイセスに属す る１つの種を単離し、そして、レジオネラ種のみに対して特異的に活性な新規な 抗生物質の精製に成功し、それを抗生物質ＡＬ０７２と命名した。 発明の概要 新規な微生物であるストレプトマイセス種ＡＬ９１を培養すると、レジオネラ 種に限って活性な新規な抗生物質ＡＬ０７２が得られ、該抗生物質の構造は次の ように表される。 図面の説明 図１は、抗生物質ＡＬ０７２の紫外吸収スペクトルを示す。 図２は、抗生物質ＡＬ０７２の赤外吸収スペクトルを示す。 図３は、抗生物質ＡＬ０７２のＦＡＢ／ＭＳで測定したマススペクトルを示す 。 図４は、抗生物質ＡＬ０７２の４００ＭＨｚプロトン核磁気共鳴スペクトルを 示す。 図５は、抗生物質ＡＬ０７２の１００ＭＨｚカーボン核磁気共鳴スペクトルを 示す。 発明の詳細な説明 微生物 レジオネラ特異的抗生物質ＡＬ０７２の産生のために用いた微生物はストレプ トマイセス種（Streptomyces sp.）ＡＬ９１である。この微生物は、特許手続の ための微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従い、1994年６月２ 日に、韓国ソウル内にある韓国微生物培養センター(The Korean Culture Center of Microorganisms)の永久保存期間に寄託されたものであり、該微生物の２次 培養物は受託番号ＫＣＣＭ１００５５により該機関から入手することができる。 本明細書において特徴を記述している特定の微生物に加えて、該微生物の変異体 （例えば、ｘ線、紫外線またはナイトロジェンマスタードを用いて得られた変異 体）を培養して抗生物質ＡＬ０７２を産生することもできる。 ストレプトマイセス種ＡＬ９１の単離は、殺菌した蒸留水１０ｍｌに乾燥させ た土壌サンプル１．０ｇを入れて振盪し、シクロヘキシミド（５０μｇ／ｍｌ） およびナリジキン酸（２００μｇ／ｍｌ）を補充したフミン酸−ビタミン寒天上 に土壌サスペンションの稀釈液０．１ｍｌをまき、得られたプレートを２８℃の 温度下に１４〜２１日間培養することにより行った。該培地は、抗カビ剤である シクロヘキシミドおよび抗菌剤であるナリジキン酸（これらは、別途、ろ過によ り殺菌したものである）を添加する前に１２１℃において１５分間殺菌した。フ ミン酸−ビタミン寒天の組成を表Ｉに記す。 ストレプトマイセス種ＡＬ９１（ＫＣＣＭ１００５５）の特性 形態：螺旋状分枝鎖により胞子が形成されている。胞子の表面は平滑である。 生化学的特性：ゼラチン液化能は陰性であり、デンプン分解能は陽性である。 培養特性： 炭素資化 陽性：Ｄ−グルコース、サッカロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ −フルクトース、ラムノース、ラフィノース、セルロース。 陰性：Ｌ−アラビノース、エーイソシトール。 抗生物質に対する感受性 抗生物質ＡＬ０７２の製造 ストレプトマイセス種ＡＬ９１（ＫＣＣＭ１００５５）を表IIに掲記する組成 を有する栄養寒天上で３日間培養した。培養菌を表IIIに掲記する組成を有する 液体培地に接種し、好気条件下２８℃の温度において３日間培養した。その後、 培養液を表IVに掲記する組成を有する液体培地６Ｌに接種し、好気条件下２８℃ の温度において５日間培養した。後述する方法により抗生物質ＡＬ０７２を単離 し、最終培養液から精製した。 培養終了後、６１の培養液を等量のイソプロピルアルコールと撹拌、混合した 。一晩放置した後、混合液を遠心分離にかけ、得られた上澄液を取り出した。該 上澄液を珪藻土に通して濾過し、次に、濾液を減圧下に濃縮してイソプロピルア ルコールを除去した。得られた濃縮物を酢酸エチルを用いて３回抽出し、該酢酸 エチルは後で減圧除去した。残渣を５０％イソプロピルアルコールに溶解し、次 に、得られた溶液を減圧下に濃縮してイソプロピルアルコールを除去した。残留 した水溶液をオクタデシルシリカゲルが充填されたカラムに通し、通過液を廃棄 した。ＯＤＳに吸着されたレジオネラ特異的抗生物質を７０％エチルアルコール を用いて溶出処理し、次いで、溶出液を減圧下に濃縮し乾燥した。該乾燥濃縮物 を８０％イソプロピルアルコールに溶解した後、シリカゲルを充填した分離用高 圧液体クロマトグラフィにより、３０ｍｌ／分の速度のアセトニトリル／蒸留水 （６８：３２）を用いて溶出すると、レジオネラ特異的抗生物質ＡＬ０７２の粗 製物が得られた。次に、この抗生物質粗製物を減圧下に濃縮して乾燥し、該乾燥 濃縮物を５０％イソプロピルアルコールに溶解し、得られた溶液を再度減圧下に 濃縮した。イソプロピルアルコールを除去し、残留物をクロロホルムで３回抽出 した。クロロホルムを除去し、残留物を８０％イソプロピルアルコールに溶解し た。前述したクロマトグラフィーで採取したのと同じ条件下で高圧液体クロマト グラフ ィー操作を行うことにより純粋な抗生物質ＡＬ０７２を得た。 抗生物質ＡＬ０７２の物理化学的性質 １．メルク(Merck)社のNo.5642 HPTLC シリカゲルを用い、クロロホルム／メ チルアルコール（１９：１）を展開剤として薄層クロマトグラフィーを行った。 該シリカゲルプレート上にＡＬ０７２のサンプルのスポットを付与し、密閉容器 内で展開した。展開後、５％のモリブデン酸アンモニウムおよびセリウム硫酸ア ンモニウムを含有する１０％硫酸水溶液をシリカゲルプレート上に噴霧し、次い で、１０分間１００℃に加熱して発色させた。この結果、抗生物質ＡＬ０７２の Ｒｆ値は０．５８であった。 ２．抗生物質は、アルコール、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール 、イソプロピルアルコール等、さらに、有機溶媒、例えば、酢酸エチル、クロロ ホルム等に可溶性であるが、水には不溶性またはわずかしか溶けない。 ３．抗生物質ＡＬ０７２は、ｐＨ２からｐＨ１２のｐＨを有する水溶液中にお いて非常に安定である。抗生物質ＡＬ０７２の活性は、９５℃に１時間加熱して も不変である。 ４．紫外吸光測定法の結果、メチルアルコール中で抗生物質ＡＬ０７２は、２ ４２ｎｍにおいて最大吸収を有することが示される（図１）。 ５．ブルカー（Bruker）ＦＴ−ＩＲ分光計を用いた臭化カリウム中の抗生物質 ＡＬ０７２の赤外吸収スペクトルは図２に示されている。 ６．ブルカー（Bruker）ＡＲＸ４００分光計を用いた抗生物質ＡＬ０７２のＣ ＤＣｌ₃中のプロトン核磁気共鳴スペクトルは図４に示されている。Ｈ−ＮＭＲ δ（４００ＭＨｚ）；０．８６（３Ｈ，ｍ）；０．８７（３Ｈ，ｍ）；０．８８ （３Ｈ，ｍ）；０．９１（３Ｈ，ｍ）；１．２９（４３Ｈ，ｍ）；１．６１（４ Ｈ，ｍ）；２．０３（２Ｈ，ｍ）；２．３１（４Ｈ，ｍ）；２．７５（１Ｈ，ｍ ）；３．６２（１Ｈ，ｄｄ，１２Ｈｚ，６Ｈｚ）；３．７２（１Ｈ，ｄｄ，４Ｈ ｚ，１２Ｈｚ）；３．９６（１Ｈ，ｍ）；４．１４（２Ｈ，ｍ）；５．３５（４ Ｈ，ｍ）ｐｐｍ。 ７．ブルカー（Bruker）ＡＲＸ４００分光計を用いた抗生物質ＡＬ０７２のＣ ＤＣｌ₂中の炭素核磁気共鳴スペクトルは図５に示されている。Ｃ−ＮＭＲ δ （１００ＭＨｚ）；１２．０１（ｑ）；１４．６７（ｑ）；１９．８５（ｑ）； ２３．２３（ｑ）；２３．２８（ｑ）；２５．３４（ｔ）；２５．３６（ｔ）； ２６．２９（ｔ）；２７．７８（ｔ）；２７．８４（ｔ）；２７．８７（ｔ）； ２８．１０（ｔ）；２８．６３（ｄ）；２９．７２（ｔ）；２９．７５（ｔ）； ２９．８２（ｔ）；２９．９３（ｔ）；３０．０２（ｔ）；３０．１７（ｔ）； ３０．２６（ｔ）；３０．２９（ｔ）；３０．３３（ｔ）；３０．３６（ｔ）； ３０．３８（ｔ）；３０．６２（ｔ）；３０．６９（ｔ）；３２．２０（ｔ）； ３４．７９（ｔ）；３４．８１（ｔ）；３５．０８（ｄ）；３７．３３（ｔ）； ３９．７５（ｔ）；６３．９０（ｔ）；６５．９５（ｔ）；７０．９６（ｄ）； １２８．５０（ｄ）；１２８．７０（ｄ）；１３０．６０（ｄ）；１３０．７０ （ｄ）；１７４．９（ｓ）；１８１．００（ｓ）ｐｐｍ。 抗生物質ＡＬ０７２の生物学的活性 上述のような方法に従って得られた抗生物質ＡＬ０７２による各種の微生物の 生長に対する効果を下記の表Ｖに示す。抗生物質ＡＬ０７２は、レジオネラ・ニ ューモフィラに対しては極めて活性であるが、その他の微生物に対しては活性で ないかまたは僅かしか活性でないことが明らかである。 抗生物質ＡＬ０７２に対するレジオネラ種の感受性をよく知られているペーパ ーディスク法により試験した。従来からの方法に従い、以下の組成から成るＢＣ ＹＥ培地を用いてレジオネラ種の予備培養菌を調製した。 ａ．プレート 酵母エキス １１．５ｇ 活性炭 １．５ｇ ＡＣＥＳ ６．０ｇ α−ケトグルタル酸 １．０ｇ バクト寒天 １７．０ｇ 蒸留水 １．０Ｌ ｐＨ ７．１〜７．２（１０ＭのＫＯＨによる） ｂ．培地強化 Ｌ−システイン−ＨＣｌ ０．２ｇ 第２鉄ピロリン酸 ０．１２５ｇ／ｍｌ（Ｄ．Ｗ．） ＢＣＹＥ培地は、１気圧下に１２１℃において１５分間殺菌し、その後、５０ 〜５５℃に冷却した。レジオネラ種の予備培養菌を０．９％の生理食塩水（Ｎａ Ｃｌ ９．０ｇ＋Ｄ．Ｗ．１Ｌ）で稀釈して最終濃度が５．０×１０⁶〜１０⁷cf u／ｍｌとなるようにした。該稀釈液を分配し、１０ｍｌを各ペトリ血に注入し て試験プレートを作製した。直径６ｍｍのペーパーディスクを２０μｌのＡＬ０ ７２で浸潤し、その後、充分に乾燥させた。この乾燥ディスクを予め作製したプ レートに配置し、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養した。生長抑制に より生じたリングの大きさをバーニアキャリパーを用いて測定した。 上述したのと同様の方法によりストレプトコッカス種の感受性試験を行った。 但し、用いた培地は以下のものである。 ａ．ミューラーヒントン（Mueller Hinton）培地（Difco） ビーフ抽出物 ３００．０ｇ バクトカザミノ酸 １７．５ｇ デンプン １．５ｇ バクト寒天 １７．０ｇ ｂ．トリプチン大豆ブロス（Difco） バクトトリプトン １７．０ｇ （大豆粉のすい臓消化物） バクトソイトン ３．０ｇ （大豆粉のpapic 消化物） バクトデキストロース ２．５ｇ 塩化ナトリウム ５．０ｇ リン酸ジカリウム ２．５ｇ １０％ウマ血清 その他の好気性微生物または嫌気性微生物についてもストレプトコッカス種と 同様に試験を行った。但し、ウマ血清は不要である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (31)優先権主張番号 １９９４２３５８４ (32)優先日 1994年９月14日 (33)優先権主張国 韓国（ＫＲ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リー、ヨン、ウー 大韓民国、136―104、ソウル特別市、スン ブク−ク、ジオンルン・４―ドン、セオン デュク・アパートメント・３・ドン・ 303・ホ (72)発明者 リー、イエオン、セオン 大韓民国、411―020、キュンギ−ドー、ゴ ヤン−シティー、セオングサ−ドン、シン ウオンダンマウル、ドンシン・アパートメ ント・704・ドン・401・ホ (72)発明者 ヨン、チャン、セウク 大韓民国、121―042、ソウル特別市、マポ −ク、ドーハ・２―ドン、ウオスン・アパ ートメント・８・ドン・403・ホ (72)発明者 スー、ユン、ウオー 大韓民国、402―042、インチュン−シティ ー、ナム−ク、ハキク・２―ドン、シンド ンガ・アパートメント・38・ドン・103・ ホ (72)発明者 リー、チュル、ホーン 大韓民国、138―130、ソウル特別市、ソン パ−ク、オグム−ドン、ウオーチャン・ア パートメント・１・ドン・304・ホ (72)発明者 リム、ヨーン、ホー 大韓民国、430―053、キュンギ−ドー、ア ンヤン−シティー、ドンガン−ク、1040― ９・ベーサン・３―ドン (72)発明者 ヨー、イク、ドン 大韓民国、305―340、ダエジェオン−シテ ィー、ユセオン−ク、ドリョン−ドン、ヒ ュンダイ・アパートメント・103・ドン・ 301・ホ 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の式から成ることを特徴とする化合物。 ２．請求項１に従うレジオネラ特異的抗生物質化合物を産生することを特徴とす るストレプトマイセス種微生物ＡＬ９１。 ３．請求項１に従うレジオネラ特異的抗生物質を製造する方法であって、ストレ プトマイセス種微生物ＡＬ９１を培養し、その培養液をイソプロピルアルコール および酢酸エチルで抽出し、該抽出物をオクタデシルシリカゲルが充填されたカ ラムを用いるクロマトグラフィ、次に、高圧液体クロマトグラフィにより精製し て前記抗生物質化合物を得ることを特徴とする方法。