JPH09510009A - 合成ペプチドを用いるhtlv−iおよびhtlv−iiの識別 - Google Patents
合成ペプチドを用いるhtlv−iおよびhtlv−iiの識別Info
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Abstract
(57)【要約】
HTLV−Iに対する抗体を含有する血清をHTLV−IIに対する抗体を含有する血清から識別する方法を、その識別のためのペプチドと一緒に開示する。これらペプチドを含有する製造物品も提供され、これら物品はHTLV−II感染血清からHTLV−I感染血清を識別することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
合成ペプチドを用いるHTLV−Iおよび
HTLV−IIの識別 発明の背景
本発明は一般に試験試料におけるヒトT−細胞リンパ栄養性ウィルスIおよび
II型(HTLV−IおよびHTLV−II)に対する抗体の検出方法に関し、より
詳細にはそれぞれHTLV−IおよびHTLV−IIに対し特異性の合成ペプチド
、並びにHTLV−IおよびHTLV−IIに対する抗体を識別検出することによ
り、HTLV−I感染およびHTLV−II感染の識別診断を可能にするのに有用
な方法に関するものである。
HTLV−Iはヒトにて病気を発生することが知られているのに対し、HTL
V−IIは明瞭には病気と関連しない。疫学的データは、HTLV−Iにつき血清
陽性と確認された米国の献血者の約50%が実はHTLV−IIで感染されている
ことを示す[リー等、未公開見解]。したがって、適する献血者に告知およびカ
ウンセリングするに際し、2種のウィルスを識別しうることに重要なニーズが存
在する。
HTLV−I感染をスクリーニングする現在の免疫分析は、
HTLV−Iに対する抗体を検出すると共に、より低い程度であるがHTLV−
IIに対する抗体をも検出する。EIAよりも特異性である、たとえばウエスタン
・ブロット(WB)および放射免疫沈澱分析(RIPA)のような血清学的方法
は、これら2種のウィルスを識別しえない。
今日まで、HTLV−IとHTLV−IIとの識別は、たとえばプロウィルスの
制限地図作成もしくはDNA配列決定のような分子遺伝学技術を用いて、または
HTLV−IもしくはHTLV−IIに関する特異的プライマーを用いるポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)によってのみ達成しうる。これら方法は試験すべき患者
からのリンパ腫の使用を必要とし、血清もしくは血漿試験試料よりも明らかに収
集および貯蔵が不便である。したがって、これら技術は時間がかかり、高価であ
り、特殊な施設を必要とし、さらに容易には自動化されないという点で有用性に
制限がある。
ヨシダに係る米国特許第4,525,300号および第4,804,476号
は、ヒト白血病ウィルス関連ペプチドに対する抗体の作成方法を教示している。
開示された抗体はヒト白血病ウィルスに結合することができる。
パルカー等、ジャーナル・イミュノロジー、第135(1)巻、第247〜2
54頁(1985)は、p19gag内部コア蛋白質の各部分を示す合成ペプチ
ドに対し発生したHTLV−Iと反応するモノクローナル抗体の作成につき報告
している。或る種の発生したクローンはHTLV−Iウィルス分離物に結合する
がHTLV−IIには結合しないと報告されている。
1986年3月27日付け公開のスラモンに係るPCT出願PCT/US85
/01803号は、試料における抗体HTLV−IおよびHTLV−IIの検出方
法を教示しており、これは試料をHTLVゲノムから得られ固体支持体に固定化
された合成もしくはクローン化ポリペプチドおよび蛋白質と共に培養して行われ
る。その教示はHTLV−IおよびHTLV−IIを識別診断する方法を含み、こ
れは蛋白質の免疫沈澱に続くたとえばSDS−PAGE電気泳動のような方法に
よる分子量測定を必要とする。しかしながら、SDS−PAGE電気泳動は容易
には自動化されず、或いは日常の実験室使用に適する形態に変換することができ
ない。
ウーに係る米国特許第4,689,398号はHTLVゲノム配列から得られ
る他の合成ペプチドの群を教示しており、こ
れらを用いて試験試料におけるHTLVに対し特異性の抗体を検出することがで
きる。
1988年5月18日付け公開のマサノリに係るヨーロッパ特許出願第0 2
67 622号は、固相に固定化された融合HTLV gagおよびenv遺伝
子蛋白質を含む装置を教示しており、これを用いて試料におけるこれら蛋白質に
対する抗体を検出することができる。しかしながら、この装置はHTLV−Iに
対する抗体とHTLV−IIに対する抗体とを識別することができない。
パルカー等、ジャーナル・イミュノロジー、第142巻、第971〜978頁
(1989)は、HTLV−Igp46およびgp21 env蛋白質の免疫原
性領域の地図作成、並びに特異性モノクローナル抗体の生成に有用であるペプチ
ドの合成につき報告している。これらペプチドは、HTLVに対する抗体を検出
すべく免疫分析にて使用することができる。さらに、この報告はHTLV−Iお
よびHTLV−IIにより共有されないgp46蛋白質の領域の存在を示唆するが
同定しておらず、したがって2種のウィルスに対する抗体を識別検出すべく使用
することができない。
1989年9月21日付け公開のバールネ等に係るPCT特許公開WO89/
08664(PCT/SE89/00126)は、HTLV−Iゲノムのenv
領域から得られた他の合成ペプチドにつき教示しており、これらをHTLV−I
ウィルスに対する抗体の検出に使用することができる。HTLV−Iに対する抗
体とHTLV−IIに対する抗体との識別については記載されていない。
1990年7月26日付け公開のユナイテッド・バイオメジカル社に係るPC
T特許公開WO90/08162号は、HTLV−I反応性抗体の検出およびA
TL(成人T細胞白血病/リンパ腫)の診断のための合成ペプチドを記載してい
る。これらペプチドはHTLV−Iの外被蛋白質における膜内外(p21e)部
分および外部(gp46)部分から得られる。さらに、これらペプチドを用いる
免疫分析についても記載されている。記載されたペプチドはシンスEIA(登録
商標)[オリンパス社、レイク・サクセス、NY]にてHTLV−Iにつき使用
される。
1990年3月5日付け公開のブロンベルクに係るPCT特許公開WO90/
10231号は、HTLV−IおよびHTL
V−IIに対する各抗体を識別検出する方法を教示しており、これにはHTLV−
IおよびHTLV−IIのgagおよびenv領域から得られた合成ペプチドに対
するこれら抗体の結合を検出する。記載された方法は各試料につき少なくとも4
回の免疫分析の実施を必要とし、したがって多数の試料を日常的にスクリーニン
グするには不便である。ブロンベルクの公開公報に開示されたペプチドは顕著な
交差反応性をも示す。ブロンベルクは、全ての結果を集積してHTLV−IとH
TLV−IIとを識別する各ペプチドの相対的能力に従い吸光度と重量とを積算し
て感染血清の識別性を向上させた。次いで加重吸光度をコンピュータプログラム
に入力して、それぞれHTLV−IもしくはHTLV−IIにつき「点数」を計算
した。ブロンベルクによれば、この血清分類技術を用いたとき間違った分類結果
はなかったが、少数のものが「分類しえない」と判明した。
1990年12月27日付け公開のバールネ等に係るPCT特許公開WO90
/15820は、HTLV−I特異性抗体に対し免疫学的に反応するペプチドお
よび開示されたペプチドから得られる抗体を記載している。これらペプチドの数
種はHTLV−I感染とHTLV−II感染とを区別することができる。
最近、R.B.ラル等は合成ペプチドを使用するHTLV−IIからのHTLV
−Iの血清学的識別につき記載しており、これを用いてHTLV−IとHTLV
−IIとを識別する[R.B.ラル等、ジャーナル・インフェクシャス・ディジー
ズ、第163巻、第41〜46頁(1991年1月)]。特に、HTLV−I「
Env−5」(アミノ酸242〜257)はHTLV−Iの免疫優性領域を示し
、さらにENV−5に基づくELISAはHTLV−IとHTLV−IIとの区別
を可能にしたと報告されている。この最近の論文および識別につき記載した2種
の特許出願[バールネ、WO90/15820号およびブロンベルグ、WO90
/10231号]を例外として、上記の開示された技術は全てHTLV−Iおよ
びHTLV−IIに対する特異性抗体の検出を目的とする。しかしながら、現在ま
でHTLV−Iに対する抗体とHTLV−IIに対する抗体とを効果的に検出する
と共に識別する簡単な方法を提供する詳細な方法については記載がない。HTL
V−Iに対する抗体とHTLV−IIに対する抗体とを検出および識別するには、
これら2種のウィルスに対する独特な抗原決定子を同定せねばならない。蛋白質
に対する抗原決定子は、ホップおよびウッズの方
法[プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第78
巻、第3824頁(1981)]を用いる親水性領域の同定、並びにカープルス
およびシュルツの方法[ナチュールビッセンシャフテン、第72巻、第212〜
213頁(1985)]を用いる柔軟性領域の同定により予測されていた。抗原
決定子は蛋白質配列の親水性領域および柔軟性領域に位置すると思われる。さら
に、抗原決定子は蛋白質分解またはインビトロ合成により産生されたペプチドの
免疫学的検査により実験的にも同定されている。
HTLV−IもしくはHTLV−IIからのペプチド配列を用いてHTLV−I
感染とHTLV−II感染とを識別する従来技術の方法は、HTLV−I由来のペ
プチドがHTLV−II感染した血清に対し交差反応性であると共に、HTLV−
II由来のペプチドがHTLV−I感染した血清に対し交差反応性であるという問
題を有する。さらに従来技術の方法は血清における抗体の検出に関し重大な感度
の問題を示している。本発明者等は、ペプチドに対するアミノ酸の付加もしくは
欠失が、抗体に対するその結合能力に顕著な影響を及ぼすと考える。その結果、
HTLV−IおよびHTLV−IIの独特な免疫優性領域からの
ペプチド長さを変化させて分析の性能を顕著に向上させることができる。従来未
知とされていた抗原領域および既知の抗原領域であると思われた領域を調査する
と共に系統的に解析して、顕著な抗原エピトープを示すペプチド配列を同定し、
これらはHTLV−IとHTLV−IIごとに株特異性であると共に相互に僅かな
交差反応性しか示さない。発明の要点
本発明の目的は、HTLV−IとHTLV−IIとを識別するための優秀なペプ
チド分析を与えることにある。
さらに本発明の目的は、HTLV−IとHTLV−IIとの間で向上した選択性
およびしたがって減少した交差反応性を有するペプチドを用い、HTLV−Iと
HTLV−IIとを識別するための分析を与えることにある。
本発明の他の目的は、血清における抗体を検出するための優秀な感度を示すH
TLV−IとHTLV−IIとを識別する分析を与えることにある。
さらに本発明の他の目的は、病気の一層詳細な診断、したがって一層適切な患
者のカウンセリングおよび処置を可能にする医者の有用な手段となる方法を提供
することにある。
さらに本発明の目的は、容易に日常的な実験室使用を可能とすると共に敏感か
つ特異的結果をもたらす簡単かつ再現性のあるHTLV−IおよびHTLV−II
識別分析を与えることにある。
HTLV−I合成ペプチドに関する本発明によるアミノ酸配列は、セイキ等、
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、USA、第80巻、
第3618〜3622頁(1983)により公表された予想アミノ酸配列から得
られた。HTLV−Iに対し特異性のペプチドは次のものを包含する:
HTLV−I env−1(配列番号1)、HTLV−Ienv−2(配列番号
2)、HTLV−I env−3(配列番号3)、HTLV−I env−4(
配列番号4)、HTLV−I env−5(配列番号5)およびHTLV−I env
−6(配列番号6)。さらにHTLV−Iに対し特異性のペプチドはHT
LV−I gag−1(配列番号7)、HTLV−I gag−2(配列番号8
)、HTLV−I gag−3(配列番号9)、HTLV−I gag−5(配
列番号10)、HTLV−I gag−6(配列番号11)およびHTLV−I
gag−7(配列番号12)をも包含する。
HTLV−II合成ペプチドに関する本発明によるアミノ酸配列は、2種のHT
LV−II基本型の予想アミノ酸配列から得られた。Mo HTLV−IIのアミノ
酸配列はシモトーノ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエン
ス、USA、第82巻、第3101〜3105頁(1985)により公表された
。NRA HTLV−II基本型の配列は未公開のデータである。HTLV−IIに
対し特異性のペプチドは次のものを包含する:HTLV−II env−1(配列
番号13)、HTLV−II env−1A(配列番号14)、HTLV−IIen v
−2(配列番号15)、HTLV−II env−2A(配列番号16)、HT
LV−II env−3(配列番号17)、HTLV−II env−4(配列番号
18)、HTLV−II env−5(配列番号19)、HTLV−II env−
5A(配列番号20)、HTLV−II env−6(配列番号21)およびHT
LV−II env−8(配列番号22)。HTLV−IIに対し特異性のペプチド
はさらにHTLV−II gag−2(配列番号23)、HTLV−II gag−
3(配列番号24)およびHTLV−II gag−4(配列番号25)をも包含
する。ペプチドHTLV−II env−1A、HTLV−
II env−2AおよびHTLV−II env−5AはNRA配列である。他の
残余のHTLV−II配列は全てMo配列である。
本発明によれば、試験試料におけるHTLV−Iに対する抗体をHTLV−II
に対する抗体から識別する方法が提供され、この方法は試験試料をHTLV−I
に対し特異性の少なくとも1種のペプチドと接触させて混合物を形成させ、HT
LV−Iに対し特異性のペプチドを配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列
番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列
番号10、配列番号11および配列番号12よりなる群から選択し;この混合物
を抗原/抗体の複合体が形成するのに充分な時間および条件にて培養し;複合体
を抗−ヒトIgG抗体に接合させたシグナル発生化合物を含む指示薬と接触させ
て第2混合物を形成させ;この第2混合物を抗原/抗体/抗体の複合体が形成す
るのに充分な時間および条件にて培養し;さらに測定対象のシグナル発生化合物
を検出することによりHTLV−Iに対する抗体の存在を判定することからなっ
ている。
本発明の他の具体例においては、試験試料にてHTLV−I
に対する抗体をHTLV−IIに対する抗体から識別して判定する方法が提供され
、この方法は試験試料におけるHTLV−IIに対する抗体の存在を判定し、これ
には試験試料を配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配
列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列
番号22、配列番号23、配列番号24および配列番号25よりなる群から選択
されるHTLV−IIに対し特異性の少なくとも1種のペプチドと接触させて混合
物を形成させ;この混合物を抗原/抗体の複合体が形成するのに充分な時間およ
び条件にて培養し;複合体を抗−ヒトIgG抗体に接合させたシグナル発生化合
物を含む指示薬と接触させて第2混合物を形成させ;この第2混合物を抗原/抗
体/抗体の複合体が形成するのに充分な時間および条件にて培養し;さらに測定
対象のシグナルを検出することによりHTLV−IIに対する抗体の存在を判定す
る。
本発明の好適具体例においては第1および第2の分析を上記したように行うが
、第1分析は試験試料を本発明によりHTLV−Iからのペプチドと接触させる
ことからなり、第2分析は試験試料を本発明によりHTLV−IIからのペプチド
と接触さ
せることからなっている。
本発明のさらに好適な具体例は前記試験試料を第1分析にて配列番号1と接触
させると共に、前記試験試料を第2分析にて配列番号15もしくは16の1つと
接触させることからなっている。
最も好適な本発明による方法は上記2種の分析を行うことによるHTLV−I
およびHTLV−II感染血清の識別を与え、第1分析は試験試料を第1ペプチド
が配列番号1、2および6よりなる群から選択されると共に第2ペプチドが配列
番号3、4および5よりなる群から選択されるHTLV−Iから得られた2種の
ペプチドと同時に接触させることからなっている。第2分析は試験試料を第1ペ
プチドが配列番号13、14、15および16よりなる群から選択されると共に
第2ペプチドが配列番号22であるHTLV−IIから得られた2種のペプチドと
同時に接触させることからなっている。両分析からの結果を解析して、HTLV
−IおよびHTLV−IIに対する各抗体につき試験試料の反応パターンを判定し
てHTLV−I感染とHTLV−II感染とを区別する。
さらに本発明は、固相に結合させたHTLV−Iに対し特異
性の本発明のペプチドを含む第1容器と、固相に接合させたHTLV−IIに対し
特異性の本発明のペプチドを含む第2容器とを備え、包装材料が前記容器にラベ
ルを備えて、HTLV−Iで感染した血清をHTLV−IIで感染した血清から識
別すべく内容物を使用しうることを示すことを特徴とする包装材料を含む製品を
も提供する。
本発明は、他の目的およびそれに付随する利点と共に以下の説明、実施例およ
び表を参照して最も良く理解されるであろう。しかしながら、本発明はこれらの
みに限定されない。発明の詳細な説明
本発明は、新規かつ独特なここに開示する合成ペプチドに対する抗体の結合を
検出することによるHTLV−IもしくはHTLV−IIとに対する抗体の検出方
法を提供する。
本発明は、これらウィルスに対する抗体を含有した血清を検出すると共に両者
を識別するための分析にて有用である、HTLV−IおよびHTLV−IIの領域
における新規かつ独特なペプチド配列を同定する。これらの目的で、HTLV−
Iに対し特異性であってHTLV−IIに対する抗体を持った血清には顕著に交差
反応しないような、HTLV−I envおよびgag
の数種の抗原領域での独特なペプチド配列が与えられる。HTLV−I合
成ペプチドのアミノ酸配列は、セイキ等、プロシーディング・ナショナル・アカ デミー・サイエンス、USA、
第80巻、第3618〜3622頁(1983)
により公表された推定アミノ酸配列から得られた。
さらに本発明は、HTLV−IIに対し特異性であるがHTLV−Iに対する抗
体を持った血清とは交差反応しないような、HTLV−II gp46 envお
よびgagにおける新規かつ独特なペプチド配列を同定する。HTLV−II合成
ペプチドのアミノ酸配列は2種のHTLV−II基本型、すなわちMoおよびNR
Aの推定アミノ酸配列から得られた。Mo HTLV−II基本型のアミノ酸配列
はシモトウノ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、U SA、
第82巻、第3101〜3105頁(1985)により公表された。NR
A HTLV−II基本型の配列は未公表データであって、本出願人およびカリホ
ルニア大学評議会に譲渡された、係属中の1993年7月1日付け米国特許出願
第08/086,415号に含まれる。
一般に本発明の方法は、試験試料を少なくとも1種のHTL
V−Iもしくは少なくとも1種のHTLV−IIペプチドが結合された固相と接触
させて混合物を形成させることを含む。この混合物を抗原/抗体の複合体が形成
するのに充分な時間および条件にて培養する。次いで、複合体をシグナル発生化
合物に接合された抗−ヒト抗体を含む指示薬と接触させて第2混合物を形成させ
る。この第2混合物を、抗原/抗体/抗体の複合体を形成させるのに充分な時間
および条件にて培養する。発生した測定可能なシグナルを検出することにより固
定化抗体の存在を判定する。HTLV−Iに対する抗体およびHTLV−IIに対
する抗体につき別々に試験試料を検査して、これら2種のウィルスによる各感染
を識別するための効果的方法を可能にする。
「固相」は臨界的でなく、不当な実験を要することなく当業者により選択しう
る任意各種の物質とすることができる。「固相」という用語は広義に使用され、
不溶性であるか或いはその後の反応により不溶性にしうる任意の物質を意味する
。すなわち多孔質もしくは非孔質の各物質、ラテックスもしくはポリスチレン粒
子、微粒子、ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウエルの壁
部およびタンニン処理ヒツジ赤血球は、全て適する例である。固相の寸法、構造
および形状は本発
明の方法にて一般に臨界的でない。しかしながら、好ましくは本発明は、HTL
V−Iにつき特異性の2種以上のペプチドまたはHTLV−IIに対し特異性の2
種以上のペプチドを固相に固定化させる場合は、微粒子の使用を想定する。
固相にペプチドを固定化するのに適する方法は、イオン性、疎水性、共有性の
各相互反応などを包含する。当業者は、有用な固相の使用に関し用いうる方法の
範囲を認識するであろう。当業界で知られた結合剤を用いて、固相に対するペプ
チドの接合を確保することができる。結合剤は、ペプチドを添加する前に固相の
1部として混入することができ或いは固相に誘導化させることもできる。
「試験試料」という用語はヒトおよび動物の体液の試料、たとえば血清、血漿
、腹液、尿、脳髄液またはその他任意の身体成分、或いは問題とする抗体を含有
しうる任意の組織培養上澄液とすることができる。
適する「指示薬」は、試験試料から得られた抗体につき特異的な結合員子に結
合(接合)された、外部手段により検出しうる測定可能なシグナルを発生するこ
とのできるシグナル発生化合物(標識)とすることができる。試験試料由来の抗
体に対し
特異的な結合対の抗体員子である場合のほか、指示薬は任意特定の結合対の員子
でもあり、たとえばビオチンもしくは抗−ビオチン、アビジンもしくはビオチン
、炭水化物もしくはレクチン、相補性ヌクレオチド配列、イフェクタもしくは受
容体分子、酵素補因子および酵素、酵素抑制剤もしくは酵素などいずれかのハプ
テン/抗−ハプテンを包含する。
考えられる各種の「シグナル発生化合物」(標識)は発色源、たとえば酵素の
ような触媒、たとえばフルオレセンおよびローダミンのような発光性化合物、化
学発光性化合物、放射性元素および直接可視標識を包含する。酵素の例はアルカ
リホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどを
包含する。特定標識の選択は臨界的でないが、それ自身で或いは1種もしくはそ
れ以上の追加物質と組合わされてシグナルを発生しうるものである。
反応混合物は、HTLV抗原/抗体の複合体が形成するのに充分な時間および
条件にて培養される。培養の適する時間、温度および他の条件の選択は当業者に
周知されている。
下記する説明および実施例で用いる方法は、たとえばマニアチス等、モレキュ ラ・クローニング、ラボラトリー・マニュア ル、
コールド・スプリング・ハーバー(1982)に記載されたような、当業界
で知られた標準的分学遺伝学技術により行った。本発明の1具体例においては、
HTLV−Iに対する抗体に特異性である本発明の合成ペプチドを、ポリスチレ
ンビーズに固定化させる。次いで、このビーズをヒト血清、血漿もしくは他の体
液の希釈試験試料と共に培養し、さらに抗体がビーズ上の固定化ペプチドに対し
特異的に結合する条件下で適する時間にわたり培養する。次いでビーズを洗浄し
て、存在しうる未結合の蛋白質を除去する。次いで第2の培養を行い、ビーズを
適するシグナル発生化合物で標識された抗−ヒト抗体を含む指示薬と共に培養す
る。適する検出系により、ビーズ上に固定化された標識抗−ヒト抗体複合体の量
を検出可能なシグナルの測定により測定することができる。かくして、試験試料
におけるHTLV−Iに対する特異的抗体の存在が判定される。次いで上記した
ように免疫分析を反復するが、ただしHTLV−IIに対する抗体に特異性である
本発明による合成ペプチドを固相に固定化させる。HTLV−Iに対する抗体お
よびHTLV−IIに対する抗体に関する試験試料の反応パターンを比較して、こ
れら2種のウィルスによる感染を識別することができる。
他の具体例においては、HTLV−Iに対し特異性の本発明による合成ペプチ
ドをポリスチレンビーズに固定化させる。次いでビーズを試験試料または希釈試
験試料および抗−ヒトIgGに接合させたシグナル発生化合物を含む適する指示
薬と共に、抗体をビーズ上の固定化ペプチドに対し特異的にかつ指示薬に対し同
時的に結合させうる条件下で適する時間にわたり培養する。ビーズ上に固定化さ
れた標識抗−ヒト抗体複合体の量は、発生した測定可能なシグナルを検出して測
定することができる。かくして、試験試料におけるHTLV−Iに対する抗体の
存在を1回の培養により判定することができる。次いで免疫分析を上記したよう
に反復するが、HTLV−IIに対し特異性である本発明による合成ペプチドを用
いる。HTLV−Iに対する抗体およびHTLV−IIに対する抗体に関する試験
試料の反応パターンを比較することにより、これら2種のウィルスによる各感染
の識別を可能にする。
さらに他の具体例においては、HTLV−Iに対する抗体に特異性の本発明に
よる合成ペプチドの少なくとも1種またはHTLV−IIに対する抗体に特異性の
本発明による合成ペプチドの少なくとも1種を、ニトロセルロース膜に固定化さ
せる。
さらにペプチドそれ自身、他のペプチドまたはたとえばBSA、鍵穴リンペット
ヘモシアニン、卵アルブミンなどの各種のキャリヤ蛋白質に、ニトロセルロース
膜への固定化前に結合させ或いは架橋させることもできる。試験試料を希釈する
と共に膜上で抗原/抗体の複合体が形成するのに充分な時間および条件にて培養
する。次いで膜表面を洗浄して未結合蛋白質を除去し、第2培養にて膜をシグナ
ル発生化合物で標識された抗−ヒト抗体を含む指示薬と共に培養する。膜上に固
定化された標識抗−ヒト抗体の量、したがってHTLV−IもしくはHTLV−
IIに対する抗体の存在を、適する検出系で発生した測定可能なシグナルを検出し
て判定する。検出系により認識されたシグナルレベルの定量は、試験試料に存在
する特異性抗体の量の定量を可能にする。HTLV−Iに対する抗体およびHT
LV−IIに対する抗体との試験試料の反応パターンを比較することにより、これ
ら2種のウィルスによる各感染の識別を可能にする。
さらに他の具体例においてはサンドイッチ分析を用いる。この方法は、試験試
料を少なくとも1種のHTLV−Iペプチドもしくは少なくとも1種のHTLV
−IIペプチドが結合された固相と接触させて混合物を形成させることを含む。こ
の混合物
を、抗原/抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および条件にて培養する。
次いで複合体をシグナル発生化合物が結合された抗原と接触させて第2混合物を
形成させる。この第2混合物を培養すると共に、抗原/抗体/抗原の複合体の存
在を発生した測定可能なシグナルの検出により判定する。HTLV−Iに対する
抗体およびHTLV−IIに対する抗体につき試験試料の反応パターンを比較して
、これら2種のウィルスによる各感染を識別することができる。
さらに他の具体例においては、HTLV−Iに対し特異性の本発明による2種
のペプチドの組合せ物を、たとえばポリスチレンビーズに対する固定化により単
一の固体支持体に同時被覆する。これらペプチドの同時被覆の手順は、上記した
および後記の実施例に記載する単一ペプチドの被覆と実質的に同じである。要約
すれば、各ペプチドを個々に保存溶液に適する濃度で溶解する。次いで2種のペ
プチドの一部をビーズ用の被覆溶液に一緒に添加する。好ましくは2種のペプチ
ドを等しい濃度で添加するが、各ペプチドごとに異なる比率も使用することがで
きる。次いで被覆されたビーズを上記方法による免疫分析で使用する。次いで、
この手順をHTLV−IIに対し特異性である
本発明による同時被覆された2種のペプチドを有するビーズで反復する。HTL
V−Iに対する抗体およびHTLV−IIに対する抗体の試験試料への反応パター
ンを比較して、これら2種のウィルスによる各感染を識別することができる。
好適具体例は、HTLV−Iに対し特異性の2種のペプチドまたはHTLV−
IIに対し特異性の2種のペプチドを使用して微粒子固相に結合させることを含む
。好ましくは微粒子EIA(MEIA)をポリスチレン微粒子を用いて行う。こ
れら粒子の寸法は好ましくは0.19〜5μmである。蛋白質は粒子上に受動的
または積極的に結合させることができる。受動被覆はペプチドと微粒子との間の
非共有結合もしくは接合を意味する。受動被覆の例は、ペプチドを無菌水により
保存溶液に溶解させることを含む。次いでペプチドを適する被覆緩衝液で所望最
終被覆濃度の2倍に希釈させる。微粒子を洗浄すると共に緩衝塩被覆溶液に再懸
濁する。微粒子とペプチドとの溶液を等比率で混合し、適する温度および時間に
て培養する。被覆過程の終了後、被覆された微粒子を遠心分離により分離し、洗
浄し、次いで微粒子希釈剤に再懸濁させる。微粒子の性質に応じ、ペプチドは静
電相互作用などにより微粒子に結合するようになる。
積極被覆は、ペプチドと固体支持体との間で共有結合を生成せしめることを意
味する。一般に、この種の共有結合は微粒子の表面における適する官能基に対し
、結合すべきペプチドのカルボキシ末端もしくはアミノ末端により形成される。
かかる官能基を有する微粒子を、誘導化微粒子と称する。誘導化微粒子の例は、
その表面にカルボキシ官能基を有する。次いで、カルボキシ誘導化微粒子を1−
エチル−3−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDAC)で
処理する。次いで微粒子を受動被覆された微粒子の手順と同様に処理するが、た
だし溶液のpHは4.5とすべきである。EDACをペプチドおよび微粒子と同
時に最終被覆溶液に添加することができ、或いは混合前のペプチドもしくは微粒
子に添加することができる。得られる被覆微粒子は、ペプチドのアミノ末端と微
粒子のカルボキシ基との間の反応により微粒子に結合したペプチドを有する。非
誘導化微粒子と共にEDACを使用しても積極被覆が得られる。
2種のペプチド配列で被覆された微粒子を同じ分析で使用するには、2種の手
法が想定される。第1に、微粒子を同時被覆することができる。同時被覆に際し
、ペプチドを適する濃度で
保存溶液に個々に溶解させ、次いで一緒に添加する。このペプチド混合物に微粒
子を添加する。しかしながら、好ましくは相互に独立して、第1量の微粒子を第
1ペプチド配列により被覆すると共に、第2量の微粒子を第2ペプチド配列によ
り被覆する。個々の被覆の後、第1および第2量の被覆微粒子を分析に使用すべ
く合する。この好適技術は、実際に微粒子ビーズに存在する各ペプチドの量の定
量を容易化させる。
本発明の方法は、固相が微粒子からなる自動化および半自動化システムを用い
る装置で使用するのに適する。この種のシステムは、ここに参考のため引用する
それぞれ公開EPO出願第0 425 633号および第0 424 634号
に対応する係属中の米国特許出願第425,651号および第425,643号
に記載されたシステムを包含する。
各種の他の固相を用いる他の具体例も考えられ、本発明の範囲内である。たと
えばいずれも本出願人によるものであって参考のためここに引用する、EPO公
開0 326 100号に対応する同時係属の米国特許出願第150,278号
およびEPO公開0 406 473号に対応する米国特許出願第375,02
9号に記載された、負帯電ポリマーとの固定化し
うる反応複合体を固定化するイオン捕獲法を本発明により用いて、迅速溶液相免
疫化学反応を行うことができる。免疫化しうる免疫複合体を、負帯電ポリアニオ
ン/免疫複合体と予め処理された正帯電多孔質マトリックスとの間のイオン相互
作用により反応混合物の残部から分離し、本出願人によるものであって参考のた
めここに引用するEPO公開0 273 115号に対応する同時係属の米国特
許出願第921,979号に記載されたような、化学発光シグナル測定を包含す
る各種の上記シグナル発生系を用いて検出する。
免疫分析に関する走査型トンネル顕微鏡測定の使用も、本発明の方法を容易に
適合させうる技術である。走査型プローブ顕微鏡測定、特に原子力顕微鏡測定に
おいては、捕獲相(たとえば本発明の選択ペプチド)を固相に付着させると共に
、走査型プローブ顕微鏡測定を用いて、固相の表面に存在しうる抗原/抗体の複
合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡測定の使用により、一般には抗原/抗体
の複合体を検出すべく多くの免疫分析系にて用いねばならない標識が不要となる
。この種の系は本出願人によるものであって参考のためここに引用する係属中の
米国特許出願第662,147号に記載されている。
本発明を主として固相の使用につき開示したが、本発明のペプチドは非固相分
析系で用いることも考えられる。これら分析系は当業者に公知であり、本発明の
範囲内であると考えられる。
HTLV−Iに対し特異性のペプチドまたはHTLV−IIに対し特異性のペプ
チドのみを、上記方法のいずれかにより免疫分析に用いる他の具体例も想定され
る。ここに開示したペプチドの特異性およびこれらペプチドにより示される交差
反応性の欠如は、単一の分析でこれらペプチドを使用しても優秀な結果を与える
ことを可能にする。すなわち、HTLV−Iに対し特異性の本発明による1種も
しくはそれ以上のペプチド、またはHTLV−IIに対し特異性の本発明による1
種もしくはそれ以上のペプチドを用いる単一の免疫分析は、HTLV−Iまたは
HTLV−IIによる感染に関し向上した特異性および選択性をもたらす。しかし
ながら、優秀な識別結果を得るためには、2つの分析を行い、第1分析にてHT
LV−Iに対し特異性の1種もしくはそれ以上のペプチドを用いると共に第2分
析にてHTLV−IIに対し特異性の1種もしくはそれ以上のペプチドを用いて、
HTLV−IまたはHTLV−IIで感染された各血清を識別するのが好適である
。
したがって、HTLV−Iに対する特異性抗体をHTLV−IIに対する抗体と
は独立して検出する試験を設計することができ、これはこれらウィルスのそれぞ
れの適する合成ペプチドを選択すると共に、これらを固相に被覆して2種のウィ
ルス感染の識別診断を容易化させる。HTLV−Iに対する抗体の特異的検出に
適するペプチドはここに特定され、配列番号1〜配列番号12として示されるH
TLV−I env領域のペプチドおよびHTLV−I gag領域のペプチド
を含む。HTLV−IIに対する抗体の特異的検出に適するペプチドもここに特定
され、HTLV−II env領域のペプチドおよびHTLV−II gag領域の
ペプチドを含み、配列番号13〜配列番号25として示される。
分析につき使用される試薬は、たとえば小瓶もしくは瓶のような1個もしくは
それ以上の容器を有するキットの形態で提供することが考えられる。各容器もし
くは小瓶は、たとえば希釈剤、指示薬、シグナル発生化合物、本発明の少なくと
も1種のペプチドを含む分析試薬など別々の試薬を含有する。さらにキットは、
その内容物を用いてHTLV−I感染とHTLV−II感染とを識別しうることを
示す指示書をも含む。
以下の実施例および関連する表はさらに本発明を例示することを意図する。し
かしながら、本発明はこれら特定実施例またはその実施形態のみに限定されない
ことが了解されよう。
実施例実施例1 HTLV−Iに対する抗体の検出 試薬
各ペプチドは、当業界に公知であってメリフィールド、ジャーナル・アメリカ ン・ケミカル・ソサエティ、
第85巻、第2149〜2154頁(1963)並
びにバラニーおよびメリフィールド、E.グロスおよびJ.マイエンホファー編
、ザ・ペプチド、第2巻、第1〜284頁(1979)、アカデミック・プレス
、ニューヨーク(参考のためここに引用する)に記載された手法を用い、アミノ
酸を固相に段階的に付加することにより合成した。要約すれば、この手順は次の
通りである。C末端から開始しN末端方向に進行させて合成を行った。Nをt−
ブチルオキシカルボニル(t−Boc)とするN−保護アミノ酸を用いた。C末
端側のt−Bocアミノ酸を固相に接合させた。t−Boc保護基をトリフルオ
ロ酢酸で除去して遊離ア
ミノ基とし、次のアミノ酸に結合させた。順次にt−Bocアミノ酸を添加し、
たとえばDCC(N−N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド)のような試薬を
用いて結合させ、次いで脱保護した。ペプチド合成完了後、最終t−Boc保護
基を除去し、該ペプチドを無水弗化水素を用いてポリマーから切除した。
上記のように作成したペプチドを、HTLV−Iに対する抗体を捕獲すべく、
当業界で知られた手法によりポリスチレンビーズ固体支持体に被覆した。要約す
れば、ポリスチレンビーズを蒸留水で洗浄し、燐酸塩緩衝塩水(PBS)溶液に
おける0.01〜50μg/mLのペプチドと共に40℃にて2時間にわたり培
養した。これらビーズを0.1%トリトンX−100(登録商標)を含有するP
BSで1時間にわたり洗浄し、PBSにおける2%牛血清アルブミン(BSA)
で1時間にわたり封鎖し、PBSにおける5%蔗糖で15分間かけてオーバーコ
ートし、次いで乾燥させた。
この実施例にてHTLV−Iに対する抗体の検出につき固相として用いたビー
ズは、アミノ酸174〜204に対応するペプチドHTLV−I env−1(
配列番号1)で被覆した。
抗−ヒトIgG抗血清は、ヤギを公知方法により精製ヒト
IgGで免疫化して作成した。得られた抗血清を親和性精製し、西洋ワサビペル
オキシダーゼ(HRPO)で標識した。方法
各試料を1:2〜1:1000の希釈率の範囲で試料希釈剤緩衝液で希釈した
。200μLの希釈試料を、被覆ビーズと共に反応皿にて40℃で60分間にわ
たり培養した。充分洗浄した後、ビーズを適する希釈剤で希釈されたヤギ抗−ヒ
トHRPOと共に40℃にて30分間培養した。ビーズを再び充分洗浄した。ビ
ーズ上に固定化されたHRPOの量を、室温における30分間にわたるO−フェ
ニレンジアミン二塩酸塩(OPD)試薬との培養により定量した。この培養の終
了後、1.0mLの1N硫酸を添加して発色反応を停止させた。発色程度を、4
92/600nmにおける得られた溶液の吸光度を測定して決定した。結果
本発明の方法を、D.W.アンダーソン等、ブラッド、第74巻、第2585
〜2591頁(1989)の方法により、HTLVに対する抗体につき陽性であ
ると予め確認されている100種の試験試料パネルに適用した。うち50種の試
料はHTLV−Iにつき陽性であると確認され、また50種の試料
はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりHTLV−IIにつき陽性であると確認
されたものである。本発明の方法は50種の試料のうち48種(96%)がHT
LV−Iに対する抗体につき陽性であると検出した。さらにHTLV−II感染血
清の50種の試料では顕著な交差反応が検出されなかった。実施例2 HTLV−IIに対する抗体の検出 試薬
実施例1に上記したように作成したペプチドを、HTLV−IIに対する抗体を
捕獲するため固相としてのポリスチレンビーズに次のように被覆した。ポリスチ
レンビーズを15%v/vのイソプロパノールで洗浄し、40℃にて2時間にわ
たりPBS溶液における0.01〜50μg/mLのペプチドと共に培養した。
これらビーズを0.15%トリトンX−100(登録商標)を含有するPBSで
1時間かけて1回洗浄し、PBSにおける2%BSAで1時間にわたり封鎖し、
次いでPBSにおける5%蔗糖で室温にて20分間にわたりオーバーコートし、
次いで乾燥させた。
この実施例にてHTLV−IIに対する抗体を検出するため、
ビーズをHTLV−II gp46 env蛋白質のアミノ酸171〜198に対
応するペプチドHTLV−II env−2(配列番号15)で被覆した。
抗−ヒトIgG抗血清は、ヤギを精製ヒトIgGで免疫化して作成した。得ら
れた抗血清を親和性精製し、当業界で知られた標準法によりHRPOで標識した
。方法
各試料を試料希釈剤緩衝液で1:2〜1:1000の希釈率にて希釈した。2
00μLの希釈試料を被覆ビーズと共に反応皿にて40℃で60分間にわたり培
養した。充分洗浄した後、ビーズを適する希釈剤で希釈されたヤギ抗−ヒトHR
POと共に40℃にて30分間培養した。ビーズを再び充分洗浄した。ビーズ上
に固定化されたHRPOの量は、OPD試薬と共に室温にて30分間にわたり培
養して定量した。この培養の終了後、1.0mLの1N硫酸を添加して発色反応
停止させた。発色の程度を、492/600nmにおける基質の吸光度を測定し
て決定した。結果
この方法を、アンダーソンの方法(上記)によりHTLVに対する抗体につき
陽性であると共に、PCRによりHTLV−
IIにつき陽性であると確認された試験試料のパネルに適用した場合、この試験は
74種の試料のうち72種(97.3%)を検出することができた。さらにHT
LV−Iにつき陽性と確認された50種の試料につき試験した場合、1つの試料
についてのみ交差反応が検出された。しかしながら、この試料はHTLV−II陽
性であるとする限界付近でもあった。実施例3 HTLV−IおよびHTLV−II感染血清に対するペプチドの反応性
各試薬を実施例2と同様に作成したが、ただし配列番号1〜配列番号25のた
めのペプチドを個々にビーズに被覆した。表1に下記するデータは、28種の確
認されたHTLV陽性試料のパネルにつき得たデータの総括である。これら試料
の14種はHTLV−I陽性であると確認され、他の14種の試料はHTLV−
II陽性であると確認されているものである。配列番号の対応名を括弧内に示す。
表1に示したように、HTLV−Iに対し特異性のペプチドにつきHTLV−
II血清に対する交差反応性は観察されず、HTLV−IIに対し特異性のペプチド
では顕著な交差反応性がHTLV−I血清につき観察されなかった。
実施例4 同時被覆ビーズを用いるHTLV−IおよびHTLV−IIに対する各抗体の検出 試験A
実施例1に記載した手順を用い、ビーズをHTLV−Iに対し特異性の本発明
によるペプチドの混合物を含有する溶液で同時被覆した。ビーズを同時被覆する
ことにより、本発明者らはHTLV−IもしくはHTLV−IIを検出する分析の
感度増大が可能であると共に、交差反応性に対する選択性のレベルを維持しうる
ことを突き止めた。たとえば所定の試験試料における抗体は、一方のペプチドで
検出しうるが他方のペプチドでは検出できない。しかしながら、同じ2種のペプ
チドが他の試料については反対の結果をもたらしうる。したがって、両ペプチド
による同時被覆ビーズは、この両試料のいずれにおいてもそれぞれの抗体を検出
する。この分析のため、各ペプチドを実施例1におけるように被覆したが、ただ
しペプチド被覆溶液は等しい濃度の配列番号2および5を含んだ。分析は、実施
例3におけると同じ28種の血清試料パネルを用いて行った。表2に示したよう
に、28員のパネルに用いた際、本発明の方法はHT
LV−Iにつき陽性である14種の試料のうち14種(100%)を正確に同定
することができ、HTLV−IIにつき陽性の14種の試料につき顕著な交差反応
は観察されなかった。配列番号1および4並びに配列番号1および5の組合せ物
につき行った分析でも同様な結果が得られた。
実施例1に記載した手順を用い、上記のように作成したHTLV−IIにつき特
異性であるペプチドをポリスチレンビーズに同時被覆した。用いたペプチド組合
せ物は配列番号15および13、配列番号15および14、配列番号15および
18、配列番号15および19、配列番号15および21、並びに配列番号15
および22とした。結果を表2に示す。表2に示したように、HTLV−II特異
性ペプチドの組合せ物で行った分析は、HTLV−Iにつき陽性と確認された試
料につき顕著な交差反応性を示さず、HTLV−IIの検出に関しては優秀な結果
を示した。
試験B
同時被覆されたビーズを用いる分析を他の試料試験につき準備した。本発明に
より作成したペプチドを、当業界で知られた方法を用いHTLV−IIに対する抗
体を捕獲すべく固体支持体としてのポリスチレンビーズに被覆した。15%N−
プロピルアルコールで洗浄することによりポリスチレンビーズを作成し、
燐酸塩緩衝溶液における0.01〜50μg/mLのペプチドと共に40℃にて
2時間にわたり培養した。これらビーズを0.15%トリトンX−100を含有
するPBSにより40℃で1時間にわたり1回洗浄し、PBSにおける2%BS
Aにより40℃で1時間にわたり封鎖し、次いでPBSにおける5%蔗糖で室温
にて20分間かけてオーバーコートした。次いでビーズを排液すると共に、37
℃に加熱された窒素ガスにより乾燥するまで約1〜2時間かけて乾燥させた。こ
れらビーズを使用するまで2〜8℃にて脱水貯蔵した。
この実施例にてHTLV−IIに対する抗体を検出するため、ビーズを配列番号
15および22によるペプチドで等しい濃度にて同時被覆した。ヤギを精製ヒト
IgGで免疫化して抗−ヒトIgG抗血清を作成した。得られた抗血清を親和性
精製すると共に、標準法によりHRPOで標識した。同様な分析を、配列番号1
および5で同時被覆されたポリスチレンビーズを用いて行った。結果
この実施例の方法により作成されたビーズをアンダーソンの方法(上記)によ
りHTLVにつき陽性と確認された100種
の試験試料パネルに対する免疫分析で使用した。うち50種の試料はHTLV−
Iにつき陽性と確認され、また50種の試料はPCRによりHTLV−IIにつき
陽性であると確認されたものである。この分析において、配列番号15および2
2で被覆されたビーズは50種の試料のうち47種をHTLV−II陽性と正しく
同定した。さらに、この免疫分析において、ビーズはHTLV−Iにつき陽性と
確認された血清試料に対しては顕著な交差反応性を示さなかった。
配列番号2および5で同時被覆されたビーズを用いて行った分析につき、HT
LV−Iに対し陽性と確認された57種の試料のうち55種が検出され、HTL
V−II感染の血清については顕著な交差反応性を示さなかった。実施例5 分析性能に及ぼすペプチド配列の影響
実施例1と同様に試薬を作成したが、ただしビーズを個々にHTLV−I e nv
−1(配列番号1)(174〜204)、HTLV−I env−6(配列
番号6)(190〜213)、HTLV−I gag−1(配列番号7)(10
0〜129)、HTLV−I gag−3(配列番号9)(109〜129)、
HTLV−II env−2(配列番号15)(171〜198)およびHTLV
−II gag−2(配列番号23)(111〜129)で被覆した。さらに、本
発明のペプチドと同じ抗原領域から採取したが、数個短いか或いは数個長いアミ
ノ酸残基を有するペプチドをも作成した。これらペプチドはHTLV−I ga g
−4(103〜116)(配列番号26)、HTLV−II gag−1(11
5〜135)(配列番号28)およびHTLV−II env−7(186〜19
5)(配列番号27)に対応する。これら分析からのデータを表3に示す。
このデータは、ペプチドに少数のアミノ酸を付加または欠失した場合に、抗体
に対する結合能力および結合特異性に顕著に影響しうることを明かに示す。実施例6 従来技術のペプチドによるHTLV−IおよびHTLV−IIの識別
実施例1および2におけると同様に免疫分析を行い、実施例3に用いたと同じ
28員のパネルに適用した。ビーズをブロンベルグ(上記)およびバールネ(上
記)に開示されたペプチド
で被覆した。試験したバールネのペプチドはHTLV−I「H」および「O」並
びにHTLV−II「H」および「O」とした。試験したブロンベルグのペプチド
は、この開示のペプチドとほぼ同じ領域における4種の開示された好適ペプチド
IGB、2GB、IEAおよび2EAとした。比較法のそれぞれを本発明の方法
により行ったが、従来技術のペプチドで置換した。市販の合成EIAの場合、分
析は製造業者の推奨する方法にしたがって行った。結果を表4に要約する。
実施例7 HTLV−IとHTLV−IIとの識別(比較)
実施例1および2の方法を用いて、予めPCRにより分類された試験試料のパ
ネルを調査した。本発明をブロンベルグの方
法と比較した。試験したブロンベルグのペプチドは、本発明の数種のペプチドと
ほぼ同じ領域に入る4種の開示された好適ペプチド1GB、2GB、1EAおよ
び2EAとした。これら比較法のそれぞれを本発明の方法により従来技術のペプ
チドと置換して行った。結果を表5に示す。
上記した好適態様については、広範囲の変化および改変をなしうることがもち
ろん了解されよう。したがって上記の詳細な説明については、本発明の範囲を定
義しているのは以下の請求の範囲(その全ての均等物を含む)であることが了解
されよう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 リー,ヘレン・エイチ
アメリカ合衆国、イリノイ・60045、レイ
ク・フオレスト、モーニングサイド・ドラ
イブ・825
(72)発明者 オードン,デブラ・エル
アメリカ合衆国、イリノイ・60002、アン
テイオク、ウエスト・レイク・ビスタ・
23865
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 試験試料にてHTLV−Iに対する抗体をHTLV−IIに対する抗体から 識別する方法であって: a. 前記試験試料におけるHTLV−Iに対する抗体の存在を判定し、この判 定は i. 前記試験試料をHTLV−Iに対し特異性の少なくとも1種のペプチド と接触させて混合物を形成させ、その際HTLV−Iに対し特異性のペプチドを 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、 配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列 番号12よりなる群から選択し; ii. 前記混合物を、抗原/抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および 条件にて培養し; iii. 前記複合体を、抗ヒトIgG抗体に接合させたシグナル発生化合物を含 む指示薬と接触させて第2混合物を形成させ; iv. 前記第2混合物を、抗原/抗体/抗体の複合体を形成させるのに充分な 時間および条件にて培養し; v. 測定しうるシグナルを検出することにより前記試験試 料におけるHTLV−Iに対する抗体の存在を判定する ことからなり; b. 前記試験試料におけるHTLV−IIに対する抗体の存在を判定し、前記判 定は i. 前記試験試料を配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号 16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号2 1、配列番号22、配列番号23、配列番号24および配列番号25よりなる群 から選択されるHTLV−IIに対し特異性の少なくとも1種のペプチドと接触さ せて混合物を形成させ; ii. 前記混合物を、抗原/抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および 条件にて培養し; iii. 前記複合体を、抗ヒトIgG抗体に接合させたシグナル発生化合物を含 む指示薬と接触させて第2混合物を形成させ; iv. 前記第2混合物を抗原/抗体/抗体の複合体を形成させるのに充分な時 間および条件にて培養し; v. 測定しうるシグナルを検出することにより前記試験試料におけるHTL V−IIに対する抗体の存在を判定する ことからなり; c. HTLV−IおよびHTLV−IIに対する各抗体につき前記試験試料の反 応パターンを判定してHTLV−I感染とHTLV−II感染とを識別する ことを特徴とする抗体の識別方法。 2. HTLV−Iに対し特異性の前記ペプチドを配列番号1、2、4、5、7 および8よりなる群から選択する請求の範囲第1項に記載の方法。 3. HTLV−IIに対し特異性の前記ペプチドを配列番号15および16より なる群から選択する請求の範囲第1項に記載の方法。 4. 前記試験試料を前記工程(a)(i)にてHTLV−Iに対し特異性の前 記ペプチドの2種と接触させる請求の範囲第1項に記載の方法。 5. 前記2種のペプチドのうち、第1ペプチドを配列番号1、2および6より なる群から選択すると共に、前記2種のペプチドのうち、第2ペプチドを配列番 号3、4および5よりなる群から選択する請求の範囲第4項に記載の方法。 6. 前記第1ペプチドが配列番号1であり、前記第2ペプチドが配列番号5で ある請求の範囲第4項に記載の方法。 7. 前記試験試料を前記第1と第2ペプチドに同時に接触させる請求の範囲第 4項に記載の方法。 8. 前記第1と第2ペプチドを、ポリスチレンビーズに被覆する請求の範囲第 7項に記載の方法。 9. 前記第1と第2ペプチドを、微粒子ビーズに被覆する請求の範囲第7項に 記載の方法。 10. 前記試験試料を前記工程(b)(i)にてHTLV−IIに対し特異性の 前記ペプチドの2種と接触させる請求の範囲第1項に記載の方法。 11. 前記2種のペプチドのうち、第1ペプチドを配列番号13、14、15 および16よりなる群から選択すると共に、前記2種のペプチドのうち、第2ペ プチドが配列番号22である請求の範囲第10項に記載の方法。 12. 前記試験試料を前記2種のペプチドに同時に接触させる請求の範囲第1 1項に記載の方法。 13. 前記第1と前記第2ペプチドを、ポリスチレンビーズに被覆する請求の 範囲第12項に記載の方法。 14. 前記第1と前記第2ペプチドを、微粒子ビーズに被覆する請求の範囲第 12項に記載の方法。 15. 前記試験試料を前記工程(a)(i)にてHTLV−Iに対し特異性の 第1と第2ペプチドに同時に接触させ、前記第1ペプチドを配列番号1、2およ び6よりなる群から選択すると共に前記第2ペプチドを配列番号3、4および5 よりなる群から選択し、前記試験試料を工程(b)(i)にてHTLV−IIに対 し特異性の第3と第4ペプチドに同時に接触させ、前記第3ペプチドを配列番号 13、14、15および16よりなる群から選択すると共に前記第4ペプチドが 配列番号22である請求の範囲第1項に記載の方法。 16. 固相に接合させたHTLV−Iに対し特異性のペプチド(HTLV−I に対し特異性の前記ペプチドは配列番号1〜12よりなる群から選択される)を 含む第1容器と; 固相に接合させたHTLV−IIに対し特異性のペプチド(HTLV−IIに対し特 異性の前記ペプチドは配列番号13〜25よりなる群から選択される)を含む第 2容器と を備え、包装材料が前記容器に付されたラベルを含み、HTLV−Iで感染した 血清をHTLV−IIで感染した血清から識別すべく内容物を使用しうることを表 示することを特徴とする包装材料を含む製造物品。 17. HTLV−Iに対し特異性の前記ペプチドが配列番号1、2、4、5、 7および8よりなる群から選択されると共に、HTLV−IIに対し特異性の前記 ペプチドが配列番号15および16よりなる群から選択される請求の範囲第16 項に記載の物品。 18. 前記第1容器が配列番号1、2および6よりなる群から選択されるHT LV−Iに対し特異性の第1ペプチドと配列番号3、4および5よりなる群から 選択されるHTLV−Iに対し特異性の第2ペプチドとを含み、前記第2容器が 配列番号13、14、15および16よりなる群から選択されるHTLV−IIに 対し特異性の第1ペプチドと配列番号22であるHTLV−IIに対し特異性の第 2ペプチドとを含む、請求の範囲第16項に記載の物品。 19. 試験試料にてHTLV−Iに対する抗体をHTLV−IIに対する抗体か ら識別する方法であって: a. 前記試験試料におけるHTLV−Iに対する抗体の存在を判定し、前記判 定は i. 前記試験試料をHTLV−Iに対し特異性の少なくとも1種のペプチド と接触させて混合物を形成させ、その際 HTLV−Iに対し特異性のペプチドを配列番号1、配列番号2、配列番号3、 配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、 配列番号10、配列番号11および配列番号12よりなる群から選択し; ii. 前記混合物を、抗原/抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および 条件にて培養し; iii. 前記複合体を、前記抗原/抗体の複合体に結合しうるペプチド抗原に接 合させたシグナル発生化合物を含む指示薬と接触させて第2混合物を形成させ; iv. 前記第2混合物を、抗原/抗体/抗原の複合体を形成させるのに充分な 時間および条件にて培養し; v. 測定しうるシグナルを検出することにより前記試験試料におけるHTL V−Iに対する抗体の存在を判定する ことからなり; b. 前記試験試料におけるHTLV−IIに対する抗体の存在を判定し、前記判 定は i. 前記試験試料を配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号 16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号2 1、配列番号22、配列番 号23、配列番号24および配列番号25よりなる群から選択されるHTLV− IIに対し特異性の少なくとも1種のペプチドと接触させて混合物を形成させ; ii. 前記混合物を、抗原/抗体の複合体を形成させるのに充分な時間および 条件にて培養し; iii. 前記複合体を、前記抗原/抗体の複合体に結合しうるペプチド抗原に接 合させたシグナル発生化合物を含む指示薬と接触させて第2混合物を形成させ; iv. 前記第2混合物を、抗原/抗体/抗原の複合体を形成させるのに充分な 時間および条件にて培養し; v. 測定しうるシグナルを検出することにより前記試験試料におけるHTL V−IIに対する抗体の存在を判定する ことからなり; c. HTLV−IおよびHTLV−IIに対する各抗体につき前記試験試料の反 応パターンを判定してHTLV−I感染とHTLV−II感染とを識別する ことを特徴とする抗体の識別方法。 20. HTLV−Iに対し特異性の前記ペプチドを配列番号1、2、4、5、 7および8よりなる群から選択する請求の範 囲第19項に記載の方法。 21. HTLV−IIに対し特異性の前記ペプチドを配列番号15および16よ りなる群から選択する請求の範囲第19項に記載の方法。 22. 前記試験試料を前記工程(a)(i)にてHTLV−Iに対し特異性の 前記ペプチドの2種と接触させる請求の範囲第19項に記載の方法。 23. 前記2種のペプチドのうち、第1ペプチドを配列番号1、2および6よ りなる群から選択すると共に、前記2種のペプチドのうち、第2ペプチドを配列 番号3、4および5よりなる群から選択する請求の範囲第22項に記載の方法。 24. 前記試験試料を前記工程(b)(i)にてHTLV−IIに対し特異性の 前記ペプチドの2種と接触させる請求の範囲第19項に記載の方法。 25. 前記2種のペプチドのうち、第1ペプチドを配列番号13、14、15 および16よりなる群から選択すると共に、前記2種のペプチドのうち、第2ペ プチドが配列番号22である請求の範囲第24項に記載の方法。
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