CN101523216B - 人类免疫缺陷病毒系列蛋白抗体测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测生物样品中人类免疫缺陷病毒(HIV)存在情况的方法。更具体的,本发明涉及通过将多种人类免疫缺陷病毒蛋白抗原相组合检测生物样品中人类免疫缺陷病毒蛋白抗体的存在情况、藉此确定HIV感染存在与否的方法。本发明还涉及用于此方法中的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及检测生物样品中人类免疫缺陷病毒(HIV)存在情况的方法。更具体的,本发明涉及通过将多种人类免疫缺陷病毒蛋白抗原相组合检测生物样品中人类免疫缺陷病毒蛋白抗体的存在情况、藉此确定HIV感染存在与否的方法。本发明还涉及用于此方法中的试剂盒。
背景技术
艾滋病(Human immunodeficiency virus,HIV)是人类健康所面临的最凶恶的敌人之一,自1981年首次被发现以来,以难以遏制的速度在全球持续蔓延。据世界卫生组织(WHO)估计,截止2001年12月底,全球仍存活的HIV感染者/AIDS病例数约4000万人,在20年期间已有约2200万人死于艾滋病。成为排名前四位的生命杀手,加之感染和死亡者中青壮年比例很大,所以艾滋病给人类造成的灾难已经不亚于世界大战。
上世纪九十年代以来,艾滋病感染者增长最快的地区已从非洲转移到亚洲。我国1985年首次发现传入病例,1991年在云南出现第一个HIV感染流行区,至今HIV感染已在所有省市自治区流行。自1994年我国HIV流行进入快速增长期以来,估计的HIV感染人数已累计超过64万并将继续上升。如不采取有效措施加以控制,至2010年我国HIV感染者有可能突破1000万人,成为全球HIV感染者绝对数最高的国家之一,从而严重影响我国人民的健康、社会的安定和国家的改革开放。
HIV病毒主要有I型和II型,I型HIV病毒(HIV-1)是主要的感染流行型。我国目前发现的HIV感染者绝大多数为HIV-1病毒携带者,而HIV-2病毒携带者较少。其他HIV病毒类型也有不断发现。HIV可经血液、性接触及母婴途径传播。目前对HIV感染及AIDS尚无有效的治疗药物与疫苗,控制传染的方法主要是预防感染,而切断传播途径是最好的预防控制策略,因此,可靠的低成本高效的HIV检测方法就显得尤为重要。
HIV-1感染后,所有感染者血液中均会出现针对HIV-1各结构蛋白抗原,即由包膜基因(ENV)编码的gp41、gp120、gp160;由核壳基因(GAG)编码的p17、p24、p55及由多聚酶基因(POL)编码的P34、P51、P66等全部或大部分的特异性持续性IgG抗体。
血清中HIV抗体是判断HIV感染的间接指标。HIV感染机体后,机体将对HIV产生抗体,抗体可持续存在于整个病程中。因此体内抗体的检出通常意味着病毒的存在。
对抗体的检测是目前最常用、最简便有效的方法。为了使检测结果达到尽可能高的准确性,HIV检测使用特殊的策略,即先用敏感性高的方法进行初筛,初筛阳性的标本再用特异性强的方法进行确认。故抗体检测方法按其目的通常分两种:初筛检测和确认实验。
1.抗体初筛检测
初筛检测的目的是剔除抗体阴性的样品,并缩小确认范围。初筛阴性可认为抗体阴性,即无抗HIV抗体存在,可证明在三周至三个月前无感染发生。初筛阳性不证明必然感染,需用确认试剂方可确认是否感染。目前世界上主要的筛检方法有:①酶联免疫吸附实验(ELISA);②明胶颗粒凝集实验(PA);③乳胶凝集实验(LA);④各种快速检测法(如:HIV金标快速试纸条)等等。但以ELISA最为常用,ELISA有很高的灵敏度和特异性,且操作简便,适合于大规模筛检。自1985年第一代ELISA产品问世以来,国际上已有数十家较知名的公司近100个品种在使用中,国内也有十多家企业生产HIV ELISA检测试剂盒,但品种较单一,基本上是HIV-1/2型混合抗体的检测试剂盒,只能检测血清/血浆标本。ELISA试剂发展,至今根据抗原或抗体的来源不同及检测试剂的类型基本上可划分为四代产品。
第一代和第二代试剂盒均采用ELISA间接法,即先以混合抗原(gp41、gp36、gp120和p24)包被酶标板,再加入待检血清,最后加入酶标记的抗人IgG抗体。因此只能检测IgG抗体。由于方法学和原料等方面的限制,难以保证其检测灵敏度和特异性同时保持在较好水平上。第三代试剂则采用双抗原夹心法,即先以抗原包被酶标板,再加入待检血清,最后加入酶标记的抗原,可同时检测IgG和IgM抗体。在免疫学原理上,人体的免疫反应是感染病原后,先出现IgM抗体,再出现IgG抗体。因此与间接法相比,双抗原夹心法可缩短检测上的盲点——窗口期。
为进一步缩短窗口期,1998年推出了可同时检测HIV抗原(P24)和抗体(包括″O″亚型抗体)的***ELISA产品。该产品是将抗原和抗体同时包被聚苯乙烯酶标板,再加入待检血清,最后加入酶标记的抗原和单克隆抗体,从而能同时检测出血清中的P24抗原、HIV-1+2型抗体及HIV-1的″O″亚型抗体。
初筛实验是检测样本中HIV抗体的综合结果,其缺点是特异性较差,因此初筛中很多阳性样本为假阳性。
2.抗体确认实验
在初筛的基础上需要确认,目前可用于确认的方法有:①免疫印迹法(WB-Western Blot);②条带免疫实验法(LineImmunoassay LIA);③免疫荧光实验法(IFA);④放射免疫沉淀实验(RIPA);⑤病毒分离法等,在临床上应用较多的是前两种,即WB法和LIA法。
在国际市场上常用的HIV抗体确认试剂有HIV-1型、HIV-2型和HIV-1/2混合型,检测方法有WB的,也有LIA,在临床上应用较多的也是WB法和LIA法,目前所有这些方法均为将HIV病毒各结构蛋白抗原(天然或人工表达)制备在膜条上,使用时将条膜浸入人血清样本中过夜反应,最终用显色法来看相关蛋白是否出现可见条带来检测抗体,并最终按各抗原抗体出现的情况来综合判断是否感染HIV,判断标准参见例如本发明的实施例3中所述。
它们的共同的缺点是灵敏度远低于初筛检测的ELISA方法。本发明通过将至少五种HIV-1结构蛋白抗原和一种HIV-2结构蛋白抗原相组合用于生物样品中相应抗体的检测,实现了HIV感染的快速、灵敏检测,从而克服了现有技术中的缺陷。
发明内容
本发明提供了一种检测生物样品中抗HIV抗体存在情况的方法,包括将至少五种HIV-1结构蛋白抗原和一种HIV-2结构蛋白相组合并分别与所述样品接触,然后检测结合复合物的存在情况。
本发明还提供了用于对生物学样品进行HIV检测的试剂盒。
具体实施方式
在一个实施方案中,本发明提供了一种检测生物样品中抗HIV抗体存在情况的方法,其中包括将至少五种HIV-1结构蛋白抗原和一种HIV-2结构蛋白相组合并分别与所述样品接触,然后检测结合复合物的存在情况,所述至少五种HIV-1结构蛋白抗原包括(i)P24或其片段或类似物;(ii)p17或p55或其片段或类似物;(iii)P31、P34、P39、P51、P66五种中的至少一种或其片段或类似物;(iv)GP41或其片段或类似物;和(v)GP120或其片段或类似物。
在本发明中,术语“抗原”包括全长HIV蛋白、全长HIV蛋白的衍生物,例如、但不仅限于含有对应于全长HIV蛋白一或多个部分的氨基酸序列的蛋白质片段或合成肽,包括连接了配基的任何经修饰片段或合成肽。术语“抗原”还包括全长HIV蛋白的类似物,或者片段或肽的类似物,包括、但不仅限于与相应的亲本蛋白结合相同抗体的非肽分子,以及所述抗原的变体或融合多肽或免疫原性片段。
在本发明的上下文中,HIV蛋白抗原的“免疫原性部分”是指在接种到个体体内后能够引起免疫应答、并且同样能够与针对相应蛋白抗原产生的特异抗体结合的部分。因此,此处所述的蛋白质免疫原性部分可用抗体结合试验鉴定。这些试验通常可用本领域普通技术人员已知的多种方法中的任何一种进行,例如,在Harlow和Lane,《抗体:实验室手册》(冷泉港实验室,冷泉港,纽约,1988)中所述的方法。
此处所用的多肽“变体”是与所述多肽区别仅在于一或多个氨基酸的取代、缺失和/或***、而仍保留了多肽的免疫原性的多肽。优选地,所述取代是保守性替代。多肽变体与已鉴定的多肽优选有至少约80%、更优选至少约90%、最优选至少约95%同一性。有免疫活性的HIV蛋白抗原变体可通过例如修饰上述多肽之一的氨基酸序列并评估此修饰多肽的免疫活性而得以鉴定。
此处所用的“保守性替代”是指某一氨基酸被另一具相似特性的氨基酸所替代,肽化学领域内的技术人员可预知此多肽的二级结构和亲水特性并未实质性改变。通常说来,下述氨基酸组代表了保守性改变:(1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸;(2)半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸;(3)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸;(4)赖氨酸、精氨酸、组氨酸;和(5)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸。
变体可同时或只包含其它的修饰,包括删除或添加对该多肽抗原性、二级结构和亲水特性影响微小的氨基酸。例如,可将信号(或前导)序列在蛋白质的氨基末端与多肽缀合,该序列可以与蛋白质一起翻译,并在翻译后指导蛋白质的转移。多肽也可与接头或其它序列缀合,以易于多肽合成、纯化或鉴定(如多聚组氨酸)、或者增强多肽与固相支持物的结合。例如,可以将多肽与免疫球蛋白的FC区缀合。
此处所用的“抗原蛋白”还包括组合或融合多肽。“组合多肽”是含有至少一个上述免疫原性部分及一种或多种额外的免疫原性的HIV抗原蛋白,它们通过肽键连接成一条氨基酸单链。这些序列可直接连接在一起(即无***的氨基酸),或可通过不会明显削弱多肽组分免疫原性的连接序列(如Gly-Cys-Gly)连接在一起。
可用本领域熟知的多种方法中的任一种获得本发明的HIV抗原蛋白和编码此类蛋白质的DNA分子。相当于编码本发明HIV蛋白抗原之一的基因(或其一部分)的DNA序列可通过对野生型株进行测序并与已知的HIV病毒核酸序列进行比对后得到。这样得到的部分DNA序列可用于设计寡核苷酸引物,以在RT-PCR中扩增全长DNA序列,所用技术在本领域是众所周知的(可见如Mullis等人,Cold Spring Harber Symp.Quant.Biol.,51:263,1987;Erlich编,PCR技术,Stockton Press,纽约,1989)。一旦获得了编码HIV蛋白抗原的DNA序列,即可用标准的诱变技术,如Adelman等(DNA,2:183,1983)中所教导的寡核苷酸介导的定点诱变,轻易地引入上述任何一种修饰。本发明的序列也可以直接合成。
还可用合成或重组方式产生本文公开的HIV蛋白或其免疫原性部分。少于约100个氨基酸及通常少于约50个氨基酸的合成多肽可用本领域普通技术人员熟知的技术制备。例如,这类多肽可用任何可供利用的固相技术合成,如Merrifield固相合成方法,其中氨基酸被依次加到正在延长的氨基酸链上(可见于如,Merrifield,美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.85:2149-2146,1963)。多肽自动合成仪可购自如Perkin Elmer/应用生物***分部(Foster城,CA)等厂家,并可按制造商的指示进行操作。
任何上述多肽均可重组产生,即将编码多肽的DNA序列***表达载体中,并在适当的宿主中表达蛋白质。本领域普通技术人员所知的种种表达载体中的任一种均可用来表达本发明的重组多肽。在转化或转染了含有重组多肽编码DNA分子之表达载体的任何适当宿主细胞中均可进行表达。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高等真核细胞。优选所用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳类细胞系,如CHO细胞。以此方式表达的DNA序列可编码天然存在的多肽、天然存在多肽的部分,或它们的其它变体。
在本发明中,可以采用多种方式联合应用至少五种HIV-1结构蛋白抗原和一种HIV-2结构蛋白对生物样品进行HIV检测。这样的技术是本领域中熟知的,包括、但不限于酶免疫测定法(EIA),例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹和其它免疫印迹法、放射免疫测定法(RIA)、放射免疫沉淀测定法(RIPA)、颗粒凝集测定法和免疫荧光测定法(IFA)。
优选的,所述至少五种HIV-1结构蛋白抗原和一种HIV-2结构蛋白是通过酶免疫测定法或免疫荧光测定法对生物样品进行HIV检测的。在一个实施方案中,所述HIV结构蛋白抗原被单独地固定在固体支持物上。所述固体支持物可以是本领域中已知的,例如聚苯乙烯珠、塑料微孔板等。本领域常规技术人员已知多种使用抗原检测样品中的相应抗体的测定方式。见例如,Harlow和Lane,《抗体:实验室手册》,冷泉港实验室,1988。在一优选实施方案中,测定包括使用固定在固相支持物上的抗原来结合生物样品中的相应抗体并将其与样品的其余部分分开。结合的HIV蛋白抗原-抗体复合物随后可通过常规方法检测,包括例如采用含报告基团的第二抗体,或者含报告基团的相关抗原(即双抗原夹心法)。
固相支持物可以是本领域普通技术人员所已知的、蛋白质可附着于其上的任何物质。例如,固相支持物可以是微量滴定板上的检验孔或硝酸纤维素膜或其它合适的膜。或者,支持物可以是珠子或盘,诸如玻璃、纤维玻璃、乳胶、胶体金或塑料材料,如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持物也可以是磁性颗粒或纤维光学传感器,例如公开于美国专利号5,359,681中的那些材料。HIV抗原蛋白可用本领域技术人员已知的多种技术固定在固相支持物上,这些技术在专利和科学文献中有充分的描述。在本发明的上下文中,“固定化”一词指非共价结合(如吸附),及共价结合(可为抗原与支持物上官能团间的直接连接,或通过交联试剂的连接)。通过吸附到微量滴定板的孔上或膜上而固定化的方法是优选的。在这类情形中,可通过在适合的缓冲液中,使HIV蛋白抗原与固相支持物接触一段合适的时间而完成吸附。接触时间随温度而变化,但通常是在约1小时到1天之间。一般说来,将塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)小孔与约10ng-10μg、优选约100ng-1μg的抗原接触,足以固定适当量的结合剂。
一般可通过将双功能试剂与支持物首先反应来完成蛋白抗原与固相支持物的共价附着,所述双功能剂可与支持物及结合剂上的官能团(如羟基或氨基)二者反应。例如,利用苯醌,或通过在固相支持物上的醛基与抗原上的胺基和活性氢之间发生缩合,可以将抗原与具有适当聚合物包被的支持物共价连接起来。[参阅Pierce Immunotechndogy Catalog and Handbook,1991,于A12-A13]。
在某些实施方案中,可通过酶联免疫吸附测定法对样品中的HIV感染情况进行测定。首先将固定在固相支持物(常为微量滴定板的孔)上的HIV蛋白抗原与样品接触,以使样品中的抗体特异性地结合到固定化的抗原上,从而完成这一分析。随后将未结合的样品从固定化蛋白抗原-抗体复合体中去除,并加入抗人IgG抗体(被称为二抗)或相关抗原(二抗或相关抗原上缀合了合适的报道基团,包括例如辣根过氧化物酶、链霉亲和素等)。然后用适于检测特定报告基团的方法测定依然结合于固相支持物上的第二抗体或相关抗原的量。
更具体地说,一旦抗原如上所述被固定于支持物上,通常封闭支持物上残余的蛋白质结合位点。许多适合的封闭剂对本领域普通技术人员是已知的,如小牛血清白蛋白或吐温20TM(Sigma化学公司,圣路易斯,MO)。然后将固定化抗原与样品共同保温,使抗原与抗体结合。温育前可用合适的稀释液稀释样品,如磷酸盐缓冲液(PBS)。一般说来,合适的接触时间(即保温时间)是足以确定样品中针对HIV蛋白抗原的抗体存在情况的时间。优选的接触时间是足以使结合水平达到结合和未结合多肽平衡时结合水平的至少95%的时间。本领域普通技术人员会认识到,通过一段时间内的结合水平,可以很方便地测定达到平衡所必需的时间。室温时,大约30分钟的保温时间通常就足够了。
然后,可用适合的缓冲液(如含0.1%吐温20TM的PBS)清洗固相支持物而去除未结合样品,并采用合适的方法对包被抗原与抗体之间的结合进行检测。优选地,采用二抗或相关抗原检测包被抗原与生物样品中抗体之间的结合。更优选地,所述第二抗体或相关抗原是被标记的形式,其中含有报告基团。优选的报告基团包括酶(如辣根过氧化物酶)、底物、辅助因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。抗体或相关抗原与报告基团的附着或缀合可用本领域普通技术人员所知的标准方法完成。
然后将第二抗体或相关抗原与固定化的抗体-多肽复合体温育足够长时间,以检测相关多肽。通常根据试验一段时间后的结合水平来确定适当的温育时间。接着除去未结合的第二抗体或相关抗原,并通过报告基团检测结合的第二抗体或相关抗原。检测报告基团的方法取决于报告基团的性质。对于放射性基团,闪烁计数法或放射自显影方法通常是可行的。光谱法可用来检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可用偶联了其它报告基团(通常是放射性或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白来检测。通常通过加入底物(一般持续特定时间)、再用光谱法或其它方法分析反应产物而对酶报告基团进行检测。结果的判断可通过肉眼来观察。为排除实验人员的主观经验带来的影响,还可以采用曝光胶片来观察。当然,这种方式也要通过实验人员的肉眼来判断。因此更为优选的是,在化学发光法的情况下,可采用单光子分析法进行检测,如此可以极大地提高检测的灵敏度。
为了确定样品中针对HIV蛋白抗原的抗体的存在情况或者含量,通常将测得的仍结合于固相支持物的报告基团的信号与标准曲线进行比较。在一个优选的实例中,标准曲线是通过将固定化的HIV蛋白抗原与系列稀释的HIV阳性样品一起温育,并将检测到的信号与样品稀释倍数进行作图而得到的。
在一个相关实例中,可以流通形式进行该分析。其中抗原被固定在微珠上,如直径为4.5mm的聚苯乙烯微珠。在试验过程中,当样品接触微珠时,样品中的抗体即与固定化的抗原相结合。然后,当含有第二抗体或相关抗原的溶液接触微珠时时,标记的第二抗体或相关抗原即与抗原-抗体复合体相结合。结合的第二抗体或相关抗原的检测可依上述方法进行。
在一个实施方案中,将HIV-1各结构蛋白抗原,即由包膜基因(ENV)编码的gp41、gp120、gp160;由核壳基因(GAG)编码的p17、p24、p55及由多聚酶基因(POL)编码的P34、P51、P66等全部的特异性抗原分别包被在微孔板中,每个样本进行复合检测,并最终按各抗原抗体出现的情况来综合判断是否感染HIV。
酶免疫测定法包括下述步骤。首先,由病毒裂解物纯化HIV抗原,借助重组DNA技术或肽合成方法制备,并包被到微孔板的孔内,形成测定法的“固相”。将待检生物学样品例如血清加入到孔中。如果样品中存在HIV特异性抗体,则它将与固相上固定的抗原发生反应,然后将孔内的其它内容物通过洗涤除去。向孔中添加含有与酶或其它检测体系结合的抗人抗体或相关抗原。如果样品中含有HIV特异性抗体,它们将保持附着在固相抗原上,缀合了酶的抗人抗体或相关抗原将结合到这些抗体上,因而间接连接在固相上。接着进行另一洗涤步骤。如果个体的血清含有抗HIV抗体,酶将通过抗体保持附着到固相上,因而在将适当的底物添加到孔中后将催化生色反应。借助分光计可以测定颜色的变化。吸光度高于由对照样品计算的临界值意味着该样品是有反应性。
在本发明中,抗人抗体(在本领域中统称为“二抗”)或相关抗原是缀合了标记的形式。所述标记可以是例如辣根过氧化物酶、链霉亲和素等。可用于本发明中的二抗包括完整分子及其片段,包括例如Fab、F(ab’)2以及蛋白A和蛋白G等等,它们能够结合表位决定簇。制备这些片段的方法是本领域中已知的,参阅例如Harlow和Lane,《抗体:实验室手册》,冷泉港实验室出版社,纽约(1988)。将此文献在此引入作为参考。可用于本发明的相关抗原是指与包被(固定在固相支持物上)抗原相一致的抗原或其片段或类似物。
在本发明中,HIV蛋白抗原是以合适的用量(浓度)固定在固相支持物上的。这一用量(浓度)优选地是0.05-2.0μg/ml,尤其是0.5μg/ml。通常,蛋白抗原是以处于0.02mol/l,pH9.6的碳酸盐缓冲液中的溶液形式施加到固相支持物上的,一般以100μl体积进行固定。当然,普通技术人员知晓可以采用的缓冲液,蛋白抗原的浓度和所应用的蛋白抗原溶液的体积,并可通过常规实验确定。
在本发明的一个实施方案中,采用五种HIV-1结构蛋白抗原和一种HIV-2结构蛋白抗原进行检测。优选的,所述HIV-1结构蛋白抗原是p24,p55,P66,gp41和gp120,所述HIV-2结构蛋白抗原是GP36。在另一个实施方案中,采用至少六种HIV-1结构蛋白和一种HIV-2结构蛋白抗原进行检测,其中所述HIV-1结构蛋白抗原包括P31、P34、P39、P51、P66五种中的至少两种。优选地,所述至少六种HIV-1结构蛋白抗原是p24,p55,p31,P66,gp41,gp120。所述HIV-2结构蛋白是GP36。在本发明中,这些结构蛋白抗原可通过上文所述方法固定在固相支持物上,并按照前述方法进行检测。
在进一步的实施方案中,在本发明的方法中还可以包含其它HIV结构蛋白抗原。
此处所述“患者”是指任何温血动物,优选是人,患者可以是患病的,或不患有可察觉的疾病。
在本发明的上下文中,“样品”可以是任何可能含有针对HIV蛋白抗原的抗体的样品,包括例如血清、全血、尿液、胸腹腔积液、脑脊液和组织标本。
本发明还提供了用于对生物学样品进行HIV检测的试剂盒。本发明的试剂盒可以包含预先包装的以预定量存在的试剂,包括HIV蛋白抗原和标记形式的抗人IgG抗体或相关抗原等,以及用于实施本发明方法的说明书。优选的标记基团包括酶(如辣根过氧化物酶)、底物、辅助因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。抗体或相关抗原与标记基团(也可称作报告基团)的连接可用本领域普通技术人员所知的标准方法完成。在一个实施方案中,该试剂盒中可选地包含适于检测所述标记的试剂。例如,如果标记是酶,则试剂盒中可包含底物以及该酶所需的辅因子(例如可提供生色团或荧光团的底物前体)。此外,还可以包括其它添加剂,例如稳定剂、缓冲液等。各种试剂的相对量可以广泛变化,以便可以使该测定法的灵敏度最优化。试剂可以干粉形式提供,通常是冻干粉,包含在溶解时将使试剂溶液具有适当浓度的赋形剂。可以从本领域中已知的多种来源获得用于本发明试剂盒中的HIV抗原。例如,所述HIV抗原可以通过重组方法、例如本文中所述的那些方法制备。或者,HIV蛋白抗原可以从商品供应商处购得,例如可以从BiodesignInternational(Maine,USA)获得。在本发明中,HIV蛋白抗原可以是固定在微孔板或微珠或微球或其它异形塑料及玻璃材料的、能够同时并联测定的样式或形状的支持物中的形式。这些微孔板可以是可组装形式,从而按照需要将不同HIV蛋白抗原孔相组合用于HIV感染情况的测定。
本发明综合了原有初筛和确认方法的优点,以其卓越的灵敏度和完美的特异性提高了艾滋病诊断的准确性和时间。
以下是该发明的一个实施例,该实施例仅用于说明本发明,但本发明的内容不限于此。
实施例
实施例1HIV-1蛋白抗原和HIV-2蛋白抗原的制备
根据现有技术中已知的关于HIV-1蛋白抗原gp41、gp120、p66,p31、p55、p24和HIV-2蛋白抗原gp36的序列信息,通过基因工程方法生产6种HIV-1抗原(ENV区:gp41,gp120;POL区:p66,p31;GAG区:p55,p24;)和1种HIV-2抗原(ENV区:gp36)。抗原蛋白序列信息和制备方法参考文献见表1。
表1
实施例2HIV蛋白抗原包被板的制备
将按照实施例1制备的HIV蛋白抗原分别用pH9.6,0.02M的碳酸盐缓冲液配制为0.1μg/mL的包被液,按每孔100μl包被微孔板,2~8℃过夜后,弃包被液。按每孔200μl加入含1%BSA的PBS封闭液,37℃封闭2h;干燥后放入密封袋内真空保存。
实施例3采用HIV蛋白抗原包被板酶对生物样品进行检测
本例测定的样本来自四川省疾病预防控制中心,其中样本1、样本2、样本3为确认的HIV抗体阳性样本;样本4和样本5为确认的HIV抗体阴性样本;样本6、样本7和样本8为HIV抗体不确定样本。
向按照实施例2制备的HIV蛋白抗原的微孔板的微孔中加入按1:1000稀释于含1%BSA的PBS中的待检生物样品100μl,在37℃温度下温育2小时。然后,用PBS洗涤液清洗各孔,以去除未结合的组分。向孔中加入100μl以1%BSA的PBS为缓冲液且含约10ng/ml的缀合了辣根过氧化物酶的抗人IgG,抗人IgG可以从商品供应商处购得,例如可以从Biodesign International(Maine,USA)获得。缀合了辣根过氧化物酶的抗人IgG是采用常规的过碘酸氧化法制备的,再次反应1小时。再向孔中加入发光底物(1.25mmol/L鲁米诺,0.136mmol/L对-碘苯酚,10mmol/LTris·HCL(pH8.6),0.2%乙醇,0.3mmol/L NaCL,5mmol/L环已二胺四乙酸(CDTA)及4mmol/L的H2O2与4mmol/L的NaBO3混合液,按照中国专利91110621.9中公开的配方制备),测定相对发光强度,并与临界值比较,从而确定某种HIV抗原的抗体阳性还是阴性,最后综合标本对各种HIV抗原的反应性,根据如下所述的本领域公认判别标准,得出HIV抗体阳性、HIV抗体阴性或HIV抗体不确定的结论:
在实验中,还包括了一个鼠抗人IgG单抗包被孔作为***质控对照。不论生物样品中是否有HIV特异性的IgG,样品中的IgG都将与包被的鼠抗人IgG单抗结合,并与随后加入的缀合了辣根过氧化物酶的抗人IgG结合,显示阳性反应,提示生物样品和试剂是否已加入及试剂是否有效。同时,以BSA封闭蛋白对照孔做为本底对照。
实验结果如下:
表2
质控 | 本底 | P24 | P31 | GP41 | P55 | P66 | GP120 | GP36 | 结果 | |
样本1 | 6785 | 129 | 10719 | 20973 | 25242 | 13204 | 15917 | 21932 | 420 | + |
样本2 | 8472 | 120 | 18272 | 249 | 25495 | 17194 | 9969 | 25011 | 292 | + |
样本3 | 7736 | 128 | 16903 | 8193 | 24695 | 8519 | 16120 | 5147 | 430 | + |
样本4 | 6251 | 239 | 134 | 404 | 442 | 292 | 569 | 305 | 197 | - |
样本5 | 7340 | 119 | 126 | 182 | 228 | 348 | 206 | 175 | 216 | - |
样本6 | 3640 | 71 | 324 | 124 | 154 | 1333 | 197 | 10062 | 118 | + |
样本7 | 4049 | 67 | 2035 | 507 | 341 | 1912 | 841 | 10309 | 301 | + |
样本8 | 5666 | 191 | 698 | 1607 | 584 | 10200 | 900 | 17786 | 206 | + |
从中可看出,样本1、样本2、样本3、样本6、样本7和样本8均为阳性样本,样本4和样本5为阴性样本。本发明的方法在对生物样品进行检测时,对于已确认阳性的生物样品的检测结果均为阳性,而对于已确认阴性的生物样品的检测结果均为阴性,这说明本发明的方法完全可靠,其最大的特点在于快速简便。
针对感染状况纯属未知的生物样品6-8,为确认本发明检测结果的正确性,还采用了PCR方法对该样品中DNA形式的HIV核酸进行检测。该DNA形式可以是整合到感染细胞染色体内的原病毒,或者是在活跃表达病毒的感染细胞内合成的RNA,或者处于无细胞血浆内的病毒颗粒内。对生物样品中的细胞进行去污剂裂解,按照bioMérieux China Limited(法国)的试剂盒Comparison of NucliSens EasyQ HIV-1中的操作说明书对裂解物进行HIV DNA的PCR扩增。
结果表明,PCR方法对样本6、样本7和样本8的检测结果均为阳性(/代表没有检测),说明样本中确实存在HIV病毒。这与按照本发明方法进行检测的结果完全一致,进一步证明了本发明方法完全可靠,但相比于PCR方法,它是非常快速简便的。
申请人还采用现有技术中已知的蛋白印迹方法对生物样品1-8进行了检测,以便与本发明就灵敏度进行比较。蛋白质印迹的结果参见下表2,其中±表示结果不确定。
表3样本的WB带型及结果
P17 | P24 | P31 | GP41 | P55 | P66 | GP120 | GP160 | 结果 | 核酸结果 | |
样本1 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | / |
样本2 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | / |
样本3 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | / |
样本4 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 未检出 |
样本5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 未检出 |
样本6 | - | - | - | - | - | - | - | + | ± | 2.06×106 |
样本7 | + | - | - | - | - | - | - | + | ± | 2.14×104 |
样本8 | - | - | - | - | - | - | - | + | ± | 2.15×106 |
实施例4大量生物样品的检测
利用同实施例3相同的方法测定了已经蛋白印迹方法确认的样本1009例,检测结果为灵敏度(真阳性率)为99.66%,特异性(真阴性率)为100.00%,假阳性率(误诊率)为0.00%,假阴性率(漏诊率)为0.34%。
上述结果说明,借助本发明的方法,通过将至少五种HIV-1结构蛋白抗原与HIV-2结构蛋白抗原GP36相组合,可以高准确度简便地确定生物样品中HIV感染情况。其检测的灵敏度高于常规HIV检测中的蛋白印迹确认法,甚至与PCR检测的灵敏度相当。
上面以例示的方式对本发明进行了举例说明,但本发明绝不限于此。本领域普通技术人员在阅读了整篇说明书之后,完全清楚可对本发明作各种改动,而仍不偏离本发明的精神和范围。
Claims (16)
1.一种检测生物样品中针对HIV病毒蛋白抗原的抗体的存在情况的方法,其中包括将至少五种HIV-1结构蛋白抗原以及HIV-2结构蛋白GP36组合在一起并分别独立的与所述样品接触,然后检测结合复合物的存在情况,其中所述至少五种HIV-1结构蛋白抗原包括(1)P24、(2)p17或p55、(3)P31、P34、P39、P51、P66五种中的至少一种、(4)GP41和(5)GP120。
2.权利要求1的方法,其中所述的至少五种HIV-1结构蛋白和HIV-2结构蛋白被包被或共价偶联在能够同时并联测定的样式或形状的支持物材料上。
3.权利要求1的方法,其中还包括将所述至少五种HIV-1结构蛋白抗原和HIV-2结构蛋白抗原与所述样品接触后的混合物与针对所述抗体的第二抗体或相关抗原相接触的步骤。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中采用了P31、P34、P39、P51、P66五种抗原中的至少两种。
5.权利要求1的方法,其中采用了HIV结构蛋白抗原P24、p55、P66、GP41、GP120、GP36,。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述生物样品选自血清、全血、尿液、胸腹腔积液、脑脊液和组织标本。
7.一种试剂盒,其中包含分别独立的至少五种HIV-1结构蛋白抗原以及HIV-2结构蛋白GP36,其中所述至少五种HIV-1结构蛋白抗原包括(1)P24、(2)p17或p55、(3)P31、P34、P39、P51、P66五种中的至少一种、(4)GP41和(5)GP120,以及可选地用于检测的缓冲液。
8.权利要求7的试剂盒,其中还包含抗人抗体或相关抗原。
9.权利要求8的试剂盒,其中所述抗人抗体或相关抗原是被标记的形式。
10.权利要求8的试剂盒,其中所述抗人抗体或相关抗原缀合了辣根过氧化物酶或链霉亲和素,或者是放射性标记的形式。
11.权利要求8的试剂盒,其中还包含用于检测抗人抗体或相关抗原上所缀合的标记的试剂。
12.权利要求11的试剂盒,其中用于检测抗人抗体或相关抗原上所缀合的标记的试剂是酶底物。
13.权利要求7的试剂盒,其中所述多种蛋白抗原是固定在所述的微孔板或微珠或微球或其它异形塑料及玻璃材料的、能够同时并联测定的样式或形状的支持物。
14.权利要求7的试剂盒,其中还包含说明书。
15.权利要求7-14中任一项的试剂盒,其中包含P31、P34、P39、P51、P66五种抗原中的至少两种。
16.权利要求7的试剂盒,其中包含HIV结构蛋白抗原P24、p55、P66、GP41、GP120或GP36。
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