JPH09505555A

JPH09505555A - ＴＧＦ−βの活性を刺激および阻害する方法および組成物

Info

Publication number: JPH09505555A
Application number: JP7507120A
Authority: JP
Inventors: イー．マーフィー−ウーリッヒ，ジョアン; ディー．ロバーツ，デイビッド; シー．クルッツ，ヘンリー; シュルツ−チェリー，ステイシー
Original assignee: US Department of Health and Human Services; UAB Research Foundation
Current assignee: US Department of Health and Human Services; UAB Research Foundation
Priority date: 1993-08-13
Filing date: 1994-08-12
Publication date: 1997-06-03
Also published as: US6384189B1; AU7565294A; AU697624B2; ATE314394T1; CA2169360A1; EP0716609B1; EP0716609A1; WO1995005191A1; EP0716609A4; DE69434593D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、TGF-βの活性を刺激する方法であって、潜在型TGF-βを、潜在型TGF-βを活性型TGF-βに変換するのに有効な量のTSPまたはTSP由来の活性化ペプチドと接触させる工程を含む方法を提供する。本発明はまた、TGF-βの活性の刺激を阻害する方法であって、潜在型TGF-βを、TSPに結合してTGF-βの活性化を予防するのに有効なTSPに特異的なリガンドと、または、潜在型TGF-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するのに有効な量のTSPの４つの連続したアミノ酸の配列に対応する配列を有する阻害ペプチドと、接触させる工程を含む方法を提供する。本発明はまた、創傷の治癒を増強する方法であって、創傷部位に、潜在型TGF-βを活性型TGF-βに変換するのに有効な量のTSPまたはTSP由来の活性化ペプチドを投与する工程を含み、TGF-βの活性化が結果として創傷の治癒を増強する方法を提供する。病的状態でTGF-βによって刺激される線維症を予防する方法もまた、提供される。この方法は、線維症を生じ得る部位に、TSPに結合してTGF-βの活性化を阻害するのに有効な量のTSPに特異的なリガンド、または潜在型TGF-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するのに有効な量のTSP由来の阻害ペプチドを投与する工程を含み、結果として線維症が抑制される。本発明はまた、TGF-β仲介型の内皮細胞の増殖の阻害を遮断する方法であって、内皮細胞を、TSPに結合してTGF-βの活性化を阻害するのに有効なTSPに特異的なリガンド、または潜在型TGF-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するのに有効なTSP由来の阻害ペプチドと接触させる工程を含み、結果として内皮細胞を増殖させる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 TGF-βの活性を刺激および阻害する方法および組成物発明の背景技術分野本発明は、TGF-βの活性を制御する方法に関する。特に、本発明は、TSPもしくはTGF-βの活性を刺激するTSP由来の特定のペプチドの適用によってTGF-βの活性を刺激する方法、またはTSPに対する抗体もしくはTGF-βの活性を阻害するT SP由来の特定のペプチドの適用によってTGF-βの活性を阻害する方法に関する。背景技術トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）は、成長、分化、および形態形成オートクリンおよびパラクリン因子のファミリーの一員である（3、26）。TGF -βは、ほとんど全ての細胞タイプにおいて、広範な細胞機能に影響し得る。細胞タイプおよびその細胞外環境に依存して、これらの影響は正でも負でもあり得る。TGF-βは、インビトロで内皮細胞の増殖を阻害する(31)が、インビボで血管形成を刺激する(39)。TGF-βはまた、存在する基質および***促進因子の性質に依存して、線維芽細胞の増殖を増強または阻害することが示されている(３)。筋芽細胞の分化もまた、***促進因子が利用できるか否かに依存して、TGF-βによって誘発または遮断され得る(25、45)。 TGF-β１は、潜在型前駆体分子の一部として合成される、ジスルフィド結合したホモダイマーである。この潜在型前駆体分子は、長さが390アミノ酸であって、Ｎ−末端278アミノ酸の潜在性会合ペプチド(LAP)およびＣ−末端112アミノ酸の活性ドメインからなる(15〜17)。TGF-βのプロ領域は、細胞内のタンパク質分解型プロセシングおよび分泌の後も活性領域に非共有結合的に付着したままでいるという点でユニークである(15)。LAPの成熟ペプチド領域との会合が、潜在性を付与する：LAP会合型の成長因子は、その細胞レセプターと相互作用し得ない。LAPは、３つのＮ−結合グリコシル化部位を含み、そのうち２つはマンノース −６−リン酸残基を有する(8、28、38)。これらの炭水化物構造は、潜在性のために重要であり得る。なぜなら、エンドグリコシダーゼＦでの処理がTGF-βの活性化を導くからである(28)。LAPのジスルフィド結合したダイマー構造は、潜在性のために極めて重要である。なぜなら、LAP内の極めて重要なシステイン残基(cys223、 225)の部位特異的変異誘発が潜在性機能を消失させるからである（９）。活性ドメインは、鎖の間および鎖内でのジスルフィド結合に関与する９つの保存されたシステイン残基を含む(27)。 TGF-βは、大抵の細胞タイプによって、潜在型複合体として分泌される(27、37 )。TGF-βの合成およびTGF-βレセプターの発現は高度には制御されていないので、TGF-βの活性の主たる制御は、潜在型TGF-β複合体の活性分子への変換の調節による。物理化学的な活性化が、極端なｐＨ、熱、カオトロピック剤および脱グリコシル化によって起こり得る(6、27、28、37)。インビボでの活性化はより複雑であって、良くは理解されていない。細胞培養モデルからの証拠によれば、活性化は、潜在型分子のマンノース−６−リン酸レセプターへの結合を通じて(12、21 )、プラスミン仲介型のタンパク質分解型プロセシングによって(4、23、40、41)、および／または酸性の細胞微小環境でのプロセシングによって(20)起こり得る。若干のシステムにおいては、プラスミンによる潜在型TGF-βの活性化は比較的非効率的である(41)。さらに、TGF-βの活性化がこれらの機構とは独立して起こるという報告もある(19)。これらの結果は、潜在型TGF-βの活性化のさらなる機構が存在し得ることを示唆する。 TGF-βは、多数の研究を通じて、創傷の治癒および線維症において重要な役割を果たすことが示されている。炎症、肉芽組織の形成および細胞外マトリックスの生合成という３つのフェーズは、創傷の治癒のプロセスおよび線維症の発達の両者において同一である。細胞外マトリックスの生合成に関与する生合成および分解経路の微妙なバランスが、適切な創傷の治癒もしくは線維症のどちらを生じるかを決定するようである。TGF-βは、細胞外マトリックスの形成に極めて重要な関与をする遺伝子を制御するというその機能のゆえに、組織再生のこのフェーズ（その最終的な結果は創傷の治癒または線維症のいずれかである）に著しく影響を与える(46)。従って、このプロセスにおけるTGF-βの活性の高感度の制御は、創傷の治癒および線維症のプロセスの調節を可能にする。トロンボスポンジン（TSP）は、マルチドメイン糖タンパク質の増加しつつあるファミリーである(5、30、48、49)。TSP１が最も良く特徴付けられており、プロトタイプのTSP分子として役立つ。TSPは、結合組織および血小板のα顆粒中に存在するジスルフィド結合したトリマー（450,000ダルトン）であって、刺激された血小板の放出物中で、活性複合体としてTGF-βと会合している(5、4、30、34)。T SPは分泌されて、多数の培養細胞の細胞外マトリックスへと取り込まれる(1〜5) 。TSPは、TGF-β同様、細胞タイプごとに異なる細胞の機能に対して広範な影響を与える。TSPは、内皮細胞の増殖および移動を阻害し得る(2、34、42、51)が、平滑筋細胞および皮膚の線維芽細胞の成長を刺激する(36、52)。TSPはまた、内皮細胞の集中性（focal）接着の分離を生じるその能力によって示されるように、付着タンパク質および抗接着分子の両方として役立ち得る(33)。TSPはまた、血管形成、線維素溶解、血小板凝集および炎症において役割を果たす(1〜5)。 TSPは創傷環境において一時的に存在し、その合成は、TGF-βを含む成長因子によって急速に誘発される(50)。TSPは切創の周縁で２〜７日間検出可能であり、その後は創傷近傍の血管路の周囲に局在化する。TSPの役割は未だ明確には理解されていないが、TSPが創傷部位への細胞の移動を容易にし得るか、もしくは局在化した成長促進因子として作用するかもしれないと推測されている(49)。 TSPには、タイプ１リピートとして知られる３つの配列がある。それぞれのリピートは約60アミノ酸からなり、６つの保存されたシステイン残基を有し、ヒトの補体成分であるプロペルジンにおいて見いだされる同様なリピートと約47％の配列相同性がある。TSPのタイプ１リピート中には、２つの良く定義されたコンセンサス配列であるＣＳＶＴＣＧ（配列番号１）およびＷＳＸＷ（配列番号２）がある。ＣＳＶＴＣＧ（配列番号１）は、ネズミ肺コロナイゼーション・アッセイにおいてメラノーマ細胞の転移を阻害し(47)、そして細胞接着を促進する(53、 54)。Tolsmaらは、角膜の新生血管形成アッセイを用いて、ＣＳＶＴＣＧ（配列番号１）がインビボで血管形成を阻害することを示した(55)。配列ＷＳＸＷ（配列番号２）は、硫酸化された糖接合体（glycoconjugates）に特異的に結合し、細胞接着および走化性を促進する(56)。フィブロネクチンのゼラチン結合ドメインへのTSPの結合は、ペプチドＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）を用いて遮断し得る(57)。この配列はまた、TGF-βの複数のメンバーおよびサイトカインレセプターのスーパーファミリーの間で保存されている(58、59)。本発明は、TSPによる潜在型TGF-βの活性化の方法、およびTSPを特定のリガンドに結合させることによる潜在型TGF-βの活性化を阻害する方法を提供する。本発明はまた、潜在型TGF-βを活性化させる特定のTSPペプチド、および潜在型TGF -βの活性化を阻害するTSPペプチドを提供する。TSP由来のこれらのペプチドは、ナノモルからマイクロモルの濃度でTGF-βレベルを正および負の両方に調整し得る。従って、これらのペプチドは、創傷の治癒の促進および線維症の阻害のために、インビボで、治療剤として使用され得る。発明の要旨本発明は、TGF-βの活性を刺激する方法であって、潜在型TGF-βを、潜在型TG F-βを活性型TGF-βに変換するのに有効な量のTSPまたはTSP由来の活性化ペプチドと接触させる工程を含む方法を提供する。本発明はまた、TGF-βの活性の刺激を阻害する方法であって、潜在型TGF-βを、TSPに結合してTGF-βの活性化を予防するのに有効なTSPに特異的なリガンドと、または、潜在型TGF-βの活性型TGF -βへの変換を阻害するのに有効な量のTSPの４つの連続したアミノ酸の配列に対応する配列を有する阻害ペプチドと、接触させる工程を含む方法を提供する。本発明はまた、創傷の治癒を増強する方法であって、創傷部位に、潜在型TGF- βを活性型TGF-βに変換するのに有効な量のTSPまたは活性化ペプチドを投与する工程を含み、TGF-βの活性化が結果として創傷の治癒を増強する方法を提供する。病的状態でTGF-βによって刺激される線維症を予防する方法もまた、提供される。この方法は、線維症を生じ得る部位に、TSPに結合してTGF-βの活性化を阻害するのに有効な量のTSPに特異的なリガンド、または潜在型TGF-βの活性型TGF -βへの変換を阻害するのに有効な量のTSP由来の阻害ペプチドを投与する工程を含み、結果として線維症が抑制される。本発明はまた、TGF-β仲介型の内皮細胞の増殖の阻害を遮断する方法であって、内皮細胞を、TSPに結合してTGF-βの活性化を阻害するのに有効なTSPに特異的なリガンド、または潜在型TGF-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するのに有効な TS P由来の阻害ペプチドと接触させる工程を含み、結果として内皮細胞を増殖させる方法を提供する。好適態様の説明本発明は、下記の特定態様の詳細な説明および本明細書中に含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解され得る。ひとつの態様において、本発明は、TGF-βの活性を刺激する方法であって、潜在型TGF-βを、潜在型TGF-βを活性型TGF-βに変換するのに有効な量の精製されたTSPまたはTSP由来の精製された活性化ペプチドと接触させる工程を含む方法を提供する。本明細書において用いられる「活性型TGF-β」または「TGF-βの活性」とは、TGF-βタンパク質がそれに曝された細胞に影響を及ぼすような構造で存在するTGF-βタンパク質をいう（その影響とは、増殖、分化、血管形成等である）。本明細書において用いられる「潜在型TGF-β」とは、TGF-βタンパク質の活性ドメインがＬＡＰと複合体化して、そのためにそれに曝された細胞には影響を及ぼさないような構造で存在するTGF-βタンパク質をいう。本明細書において用いられる用語「活性化ペプチド」は、少なくとも３アミノ酸を含み、潜在型TGF- βに曝されたとき潜在型TGF-βを活性型TGF-βに変換する、合成または天然タンパク質からもしくは組換え法により生成されるペプチド配列またはペプチド類似体（mimetic）として定義される。本発明のペプチドはTSPの配列に対応するかまたはTSPの機能的配列から誘導され得る。本明細書において用いられる用語「精製された」は、他のタンパク質、ペプチドおよび夾雑物から分離されていることをいう。潜在型TGF-βをTSP由来の相当量の活性化ペプチドと接触させることによって、TGF-βの活性を刺激する方法において、活性化ペプチドはTSPの第１、第２および第３のタイプ１リピート領域に由来し得る。例えば、配列番号５、９、14、 15および16は、第２のタイプ１リピート領域に由来する。本明細書において用いられる「第２のタイプ１リピート領域」とは、第２のタイプ１の反復する配列単位をいい、３つのタイプ１リピートのアミノ末端から数えられ、ヒトTSP１のアミノ酸412〜473からなる。活性化ペプチドは以下からなる群から選択され得る：または、アミノ酸配列ＲＦＫ（配列番号１８）からなり得る。活性化ペプチドは、その配列の部分的または完全なレトロ−インベルソ（retro-inverso）の改変、または適切な非天然アミノ酸を含み得る。このような配列およびTSPに対応するまたはTSPから誘導される他の配列は、実施例に記載のように軟寒天ＮＲＫコロニー形成アッセイおよび内皮細胞増殖アッセイにおいて、TGF-βの活性化機能についてスクリーニングすることによって、活性化配列であると決定される。 TGF-βを産生する細胞を、TSPに結合してTGF-βの活性化を予防するのに有効な量のTSPに特異的なリガンドと接触させることによって、TGF-βの活性の刺激を阻害する方法もまた提供される。本明細書において用いられる「特異的」とは、特定された部分（ここではTSP）以外のいかなる部分（moiety）とも実質的に交差反応しない、抗体または他のリガンドをいう。本明細書において意図されるものとして、リガンドはTSPと結合する任意の試剤、例えばそのままの抗体、抗体の断片、またはTSPとの特異的反応性を有する他の試剤を含む。リガンド、例えば抗体は、実施例において提供されているものであり得、または慣用的な手法を用いて、当該分野で記載されているようにして作製され得る(61)。他の態様において、本発明は、TGF-βの活性の刺激を阻害する方法であって、潜在型TGF-βを、潜在型TGF-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するのに有効な量のTSP由来の精製された阻害ペプチドと、接触させる工程を含む方法を提供する。本明細書において用いられる「阻害ペプチド」とは、TSPの機能性領域から誘導される少なくとも４つのアミノ酸を含み、潜在型TGF-βに曝されたとき潜在型TG F-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するペプチド配列をいう。精製された阻害ペプチドは、TSPの４つの連続したアミノ酸の配列に対応する、潜在型TGF-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するのに有効な配列を有し得る。 TGF-βの活性の刺激を阻害する方法において、阻害ペプチドはTSPの第１、第２および第３のタイプ１リピート領域に由来し得る。例えば、配列番号25、26、 27および３が、第２のタイプ１リピートに由来する。TSPから誘導される阻害ペプチドは、アミノ酸配列ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）からなり得、または以下からなる群から選択され得る：活性化ペプチドは、その配列の部分的または完全なレトロ−インベルソの改変、または適切な非天然アミノ酸を含み得る。このような配列およびTSPから誘導される他の配列は、実施例に記載のように軟寒天NRKコロニー形成アッセイにおいて、TGF-βの活性化機能の阻害についてスクリーニングすることによって、阻害配列であると決定される。 TGF-βは創傷の治癒を制御することが知られている。従って、本発明はまた、創傷部位に、潜在型TGF-βを活性型TGF-βに変換するのに有効な量の精製された TSPまたはTSP由来の精製された活性化ペプチドを投与することによって、創傷の治癒を増強する方法であって、TGF-βの活性化が結果として創傷の治癒を増強する方法を提供する。活性化ペプチドは、本明細書に記載されたものであり得る。本明細書において用いられる「増強された創傷の治癒」とは、創傷の治癒の速度における統計学上有意な増加として定義され、相当量のTSPまたはTSP由来の活性化ペプチドで処置した創傷についての、同様な未処置の創傷または非活性化コントロールで処置した同様な創傷と比較した場合の、組織学的分析、引っ張り強度および全タンパク質およびコラーゲン含量によって決定される。組織学的分析は、創傷の治癒の初期兆候である、線維芽細胞および毛細管の（capillary）内皮細胞の存在について検査することを含む。ペプチドＫＲＦＫ（配列番号５）を用いた本法の一例が、実施例において提供される。創傷の治癒を増強する方法において、活性化ペプチドは以下からなる群から選択され得る：または、アミノ酸配列ＲＦＫ（配列番号１８）からなり得る。このような配列は、実施例に記載のようにラットの創傷治癒モデルにおける増強された創傷の治癒についてスクリーニングすることによって、創傷の治癒を増強する活性化配列であると決定される。 TGF-βは線維症の発達において役割を果たすので、本発明はまた、線維症を生じ得る部位に、潜在型TGF-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するのに有効な量の TSP由来の精製された阻害ペプチドを投与することによって、病的状態でTGF-β によって刺激される線維症を予防する方法であって、結果として線維症が抑制される方法を提供する。阻害ペプチドは、本明細書に記載されたものであり得る。本明細書において用いられる「線維症」とは、繊維状組織の異常な形成を意味する(60、64)。本明細書において用いられる「抑制された線維症」とは、繊維状組織の異常な形成のレベルおける統計学上有意な抑制（reduction）として定義され、TSP由来の阻害ペプチドで処置した創傷における、同様な未処置の創傷または（線維症の発達が予期される条件下で）活性を有さないペプチドで処置した同様な創傷における繊維状組織の異常な形成のレベルと比較した場合の、組織学的分析、引っ張り強度および全タンパク質およびコラーゲン含量によって決定される。TSPペプチドＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）を用いた本法の一例が、実施例において提供される。病的状態でTGF-βによって刺激される線維症を予防する方法において、阻害ペプチドもまた以下からなる群から選択され得る：このような配列は、実施例に記載のようにラットの線維症形成モデルにおける線維症の予防についてスクリーニングすることによって、線維症を予防する阻害配列であると決定される。線維症を生じ得る部位に、TSPに結合するのに有効な量のTSPに特異的なリガンドを投与することによって、ある種の病的状態でTGF-βによって刺激される過剰な線維症を予防する方法であって、これによりTGF-βの活性化を阻害して、結果として線維症が抑制される方法もまた、提供される。活性型TGF-βは、内皮細胞および上皮細胞の増殖を阻害する。従って、他の態様において本発明は、TGF-β仲介型の内皮細胞または上皮細胞の増殖の阻害を遮断する方法であって、細胞を、潜在型TGF-βの活性型TGF-βへの変換を阻害するのに有効な量のTSPまたはTSP由来の精製された阻害ペプチドと接触させる工程を含み、結果として細胞を増殖させる方法を提供する。本明細書において用いられる「増殖」とは、細胞の数の増加を意味する。 TGF-β仲介型の内皮細胞または上皮細胞の増殖の阻害を遮断する方法であって、細胞を、TSPに結合してTGF-βの活性化を阻害するのに有効なTSPに特異的なリガンドと接触させる工程を含み、結果として細胞を増殖させる方法もまた提供される。 TGF-β仲介型の細胞の増殖の阻害を遮断する方法において、細胞は動脈の内皮細胞であり得る。本法に応答して増殖し得る他の細胞は、毛細管の内皮細胞である。阻害ペプチドは、以下からなる群から選択され得る：または、アミノ酸配列ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）からなり得る。このような配列は、実施例に記載のようにTGF-β仲介型の細胞の増殖の阻害についてスクリーニングすることによって、阻害配列であると決定される。本発明は、TSPの機能的配列から誘導される、TGF-β活性化および阻害ペプチドを提供する。本発明はまた、３から30アミノ酸を有する精製されたペプチドを提供し、ここで、このペプチドはサブ配列Ｒ₁−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｒ₂を含み、Ｘ₁ はArgおよびLysからなる群から選択され、Ｘ₂はProおよびPheからなる群から選択され、Ｘ₃はLysおよびArgからなる群から選択され、Ｒ₁はＨ₂、アシル、または１から26アミノ酸のペプチド、Ｒ₂はＨ、ＮＨ₂、または１から２６アミノ酸のペプチドであり、そして、このペプチドは、潜在型TGF-βを活性型TGF-βに変換する。精製されたペプチドは、以下からなる群から選択され得る：または、アミノ酸配列ＲＷＲＰＷＴＡＷＳＥ（配列番号１０）からなり得る。精製されたペプチドは、標準的なタンパク質接合のプロトコール（６１）を用いて、水溶性ポリマーに接合（conjugate）され得る。例えば、適切な水溶性ポリマーには、ポリスクロース、デキストラン、ポリエチレングリコールおよびポリビニルアルコールが含まれる。精製されたペプチドはまた、部分的および完全にレトロ−インベルソ（retro- inverso）のペプチド配列からなる群から選択され得る。本明細書において用いられる「部分的および完全にレトロ−インベルソのペプチド配列」とは、活性化または阻害配列であると決定されたペプチド配列であって、若干のＤ−アミノ酸を含むか（部分的）または完全にＤ−アミノ酸からなり（完全）、gem-ジアミノアルキル残基、およびアルキルマロヒル（alkylmalohyl）残基を含むものを意味する。これらは、未改変末端を有し得るか、または末端アミノ酸残基の電荷を改変する適切なアルキル、アシルまたはアミン置換を含み得る。本発明はさらに、アミノ酸配列ＬＳＫＬ（配列番号21）およびアセチル-ＷＨＳＷＡＡ-ＮＨ₂（配列番号28）からなる、精製されたペプチド、ならびにその部分的または完全にレトロ−インベルソのペプチド配列を提供する。インビボにおけるペプチドの半減期は比較的短いので、より長い半減期を有する改変されたペプチドの効果を調べ得る。例えば、本明細書に記載のペプチドのレトロ−インベルソの（すなわち、Ｄ−アミノ酸から構成される）アミノ酸配列、例えば、ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号１５）およびＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）ペプチドを、記載されるように用い得る。これらは、より長い半減期を有することが予期される。なぜなら、Ｄ−アミノ酸は、タンパク質中の天然に存在するＬ−型のアミノ酸のようには、細胞によって代謝され得ないからである(65)。このようなレトロ−インベルソのペプチドは、市販のＤ−アミノ酸を用いる標準的なペプチド合成法(74)によって合成し得る。ペプチド類似体（mimetics）は、確立された方法に基づいて、天然のペプチド配列の代替物として用い得る(75)。記載されたペプチドは、インビボのモデルにおいて、TGF-β仲介型の創傷の治癒および線維症の形成への影響の、それらによる調整を確認するために適用し得る。例えば、ラットの創傷治癒モデルを、ＫＲＦＫ（配列番号５）の、活性型TG F-βと比較しての、創傷の治癒の刺激における有効性を評価するために用い得る (62、63)。不活性ペプチドを、陰性コントロールとして用い得る（例えば、ＴＲＩＲ（配列番号30）、ＫＲＡＫ（配列番号35））。ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）ペプチドまたは本明細書において提供される他の阻害ペプチドはまた、TGF-βの活性化を遮断することによる創傷の治癒の阻害へのあらゆる効果について、またはケロイド形成におけるあらゆる効果について調べ得る。このペプチドの不活性なアナログを、陰性コントロールとして用い得る。 Spornらのインビボのプロトコール(62)を、TSPまたは本明細書に記載の活性化ペプチドの創傷の治癒に対する相対的な有効性を決定するために用い得る。例えば、２cm×１cmのワイヤ・メッシュの創傷チャンバーをラットの背部に移植し得る。創傷の治癒の応答が始まった後（４日目）に、ラットに、創傷部位において注射部位ごとに、毎日の注射で1000ngのTGF-β、100〜1000nMの活性化ペプチド、100〜1000nMのTSP、1000ngのアルブミンまたはベヒクル・コントロールを与え得る。９日目に、ラットを屠殺して、創傷チャンバー内の組織を組織学的に検査し、全タンパク質およびコラーゲン含量について（ヒドロキシプロリン含量の測定によって）アッセイし、そして創傷組織中のTGF-βの相対レベルを免疫組織化学的手法によって検査し得る。あるいは、ラットの切創の治癒のモデルを、Cromackらによる記載（６３）のように用い得る。このシステムでは、ラットの背の皮膚に６cmの直線上の切り傷をつくり得、創傷は外科用クランプで癒合させ得、そしてベヒクルとしての３％メチルセルロース中、100〜1,000nMのTSP、100〜1000nMの活性化ペプチドを創傷部位に注射し得る。７〜10日後、創傷切片を採取して、張力計を用いての引っ張り強度、および本明細書中に記載のような組織学的分析について評価し得る。上記のプロトコールはヒトに適用し得る。なぜなら、ラット、ウサギおよびブタにおける創傷の治癒および線維症の形成は、ヒトにおける創傷の治癒および線維症の形成の研究のためのモデルとして一般的に用いられているからである(66 〜69)。臨床上の適用においては、１μgから100mgのTSPまたはTSP由来の活性化ペプチドを、創傷の治癒を増強するかまたは線維症を予防する目的で、包帯に含浸させまたは創傷部位に施用すべき軟膏の一部として用い得る。当該分野の臨床医師は、創傷の治癒を増強するかまたは線維症を予防するために必要なペプチドの量および処置の期間をより具体的に決定することができる。リガンド、TSPまたはTSP由来のペプチドは、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射により、腹腔内注射により、局所的に、経皮的にまたはその他によって、投与し得るが、代表的には局所投与が好ましい。そのような化合物の要求される正確な量は被験体ごとに異なり、被験体の種、年齢、体重および一般的健康状態、処置される創傷または疾病の重篤度、用いられる特定の化合物、その投与形態などに依存する。従って、正確な量を特定することは不可能である。しかし、適切な量は、当業者が当該分野で周知の方法を用いて決定し得る。局所投与のためには、本発明の化合物は薬学的組成物中にあり得、固形状、半固形状または液状の用量形態、例えば、粉末、液体、懸濁液、ローション、クリーム、ゲル、またはその他であって、好ましくは正確な用量の単回投与に適した単位用量形態である。組成物は、上述のように、有効な量の選択された化合物を薬学的に受容し得るキャリヤと組み合わせて含み、これに加えて、他の医療剤、薬剤、キャリヤ、アジュバント、希釈剤等も含み得る。「薬学的に受容し得る」とは、生物学的にまたは他の意味で望ましくないものではない物質を意味する。すなわち、その物質は、望ましくない生物学的効果を何ら生じることなく、あるいはその物質が含まれる薬学的組成物の他のいずれの成分とも害になるような相互作用をすることなく、選択された化合物と共に個体に投与し得る。非経口投与は、用いられる場合は、概して注射によることを特徴とする。注射用剤は、液体溶液または懸濁液、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固形、または乳濁液のいずれかとして、慣用的な形態に調製される。非経口投与はまた、一定レベルの用量が維持されるような、遅延放出もしくは持続放出システムを使用し得る（例えば、米国特許第3,710,795号を参照）。有用性本発明はまた、TSPの活性を調整する能力について物質をスクリーニングするバイオアッセイを提供する。例えば、本発明は、TSPの活性を増強する能力について、例えば、創傷の治癒を促進する治療における使用のために、物質をスクリーニングするバイオアッセイを提供する。他の例においては、本発明は、TSPの活性を阻害する能力について、例えば、線維症の予防のための治療における使用のために、物質をスクリーニングするバイオアッセイを提供する。手短に言えば、これらのバイオアッセイは、インビトロにおいて、TSPまたはTSP由来のペプチドおよび潜在型TGF-βを伴うNRK細胞に物質を投与し、そして実施例に記載のように軟寒天コロニー形成についてアッセイすることによって行い得る。あるいは、これらのバイオアッセイは、インビトロにおいて、BAE細胞に物質を投与し、そして実施例に記載のように細胞増殖を測定することによって行い得る。このようなスクリーニング法の現在の使用は、実施例に記載されている。実施例は、ペプチドＫＲＦＫ（配列番号５）がTGF-βを活性化し、そしてペプチドＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）がTSP仲介型の潜在型TGF-βの活性化を阻害することを示す。インビボにおいては、これらのバイオアッセイは、創傷の治癒および線維症において役割を果たす物質についてスクリーニングするために、本明細書に記載のように創傷チャンバーまたは創傷部位に物質を投与することによって行い得る。本発明はさらに、TGF-βを活性化および阻害するペプチドであって、TGF-βの活性を調整する能力について物質をスクリーニングするインビトロのバイオアッセイにおいて、コントロールとして用い得るペプチドを提供する。例えば、物質およびTGF-βをＮＲＫ細胞に投与し得、この細胞を次に実施例に記載のように軟寒天コロニー形成についてアッセイし得る。活性化および阻害ペプチドをＮＲＫ細胞に投与し得、この細胞を次に、TGF-βの活性化および阻害についての陽性コントロールとして、軟寒天コロニー形成についてアッセイし得る。これらの活性化および阻害ペプチドはまた、TGF-βの活性を調整する能力について物質をスクリーニングするインビボのバイオアッセイにおいて、コントロールとして用い得る。例えば、実施例に記載のアッセイにおいて、物質を創傷および線維症を生じ得る部位に施用し得、そして創傷の治癒を増強しおよび線維症を抑制する能力について評価し得る。活性化および阻害ペプチドを、記載された実施例においてコントロールとして用い得る。本発明は、TSPまたは本発明のペプチドと特異的に反応性である精製された抗体を生成する方法を提供する。作製された抗体は、TSPの存在を検出するために用い得る。抗体は当該分野で記載されているように(61)作製され得る。手短に言えば、精製されたTSP、精製されたペプチド単独またはキャリヤタンパク質に接合されたペプチドを、免疫応答を誘起するのに十分な量および間隔で、動物に注射し得る。抗体は直接的に精製し得、または、モノクローナル抗体については、動物から脾臓細胞を取り出し得る。この細胞は次に不死化細胞系と融合させ、そして抗体分泌についてスクリーニングする。以下の実施例は、本発明を例示すること意図し、本発明を限定することは意図していない。これらは、使用され得るものの典型ではあるが、当業者に公知の他の手法を代わりに用い得る。本発明は、以下の実施例においてより具体的に記載される。数多くの修正および変更が当業者に自明である以上、これらは例示のみを意図している。実施例トロンボスポンジン精製 TSPを以前に記載(34)されているようにして精製した。簡単に述べると、８〜1 0単位の新鮮なヒト血小板をBirmingham American Red Crossから購入し、Hepes 洗浄バッファー(10%ACD、0.05M Hepes、0.15M NaCl、および5mMデキストロース）、pH7.6で洗浄した。この血小板をトロンビン刺激し、そして血小板からの放出物を、TBS-C(0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1mM CaCl、pH 7.4)であらかじめ平衡化したヘパリン−セファロース^TMCL-6B(Pharmacia、Piscataway、New Jer sey)アフィニティーカラムに供した。結合したTSPを、1mM CaClを含む0.55M NaC l/TBSで溶出させ、TBS-C、pH 11であらかじめ平衡化したA0.5Mゲル濾過カラム(B io-Rad、Richmond、California)に供し、会合したTGF-βを除去し、TGF-β活性をストリップした(stripped)TSP(sTSP)を得た。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびクーマシーブルーまたは銀染色によって、純度を評価した。正常ラット腎臓(NRK)軟寒天コロニー形成アッセイにおいて、sTSPに会合したTGF-β活性の混入は見られなかった。細胞ウシ大動脈内皮(BAE)細胞を地方の屠殺場から入手した大動脈から単離し、そしてアセチル化された低密度リポタンパク質(Dil-AcLDL)の取り込みおよび第VII I因子抗原についての染色によって特徴付けを行った。以前に記載(33)されたように、4.5g/Lのグルコース、2mMのグルタミン、および20%のウシ胎児血清(FBS;H yclone Laboratories、Logan、UT)を補充したDulbecco改変Eagle培地(DMEM;Cell -Gro、Mediatech、Herndon、VA)中で細胞を培養した。記載(1)されたように、4. 5g/Lのグルコース、2mMのグルタミン、および10%の仔ウシ血清(Hyclone Laborat ories、Logan、UT)を補充したDMEM中でNRKクローン49F細胞(ATCC受託番号CRL 15 70)を培養した。仔ウシ血清を試験し、低レベルの活性TGF-βについて選択した。4.5g/Lのグルコース、2mMのグルタミン、および10%のFBSを補充した最少Eagle 培地(MEM;Cell-Gro、Mediatech、Herndon、VA)中でミンク肺上皮細胞(ATCC受託番号CCL 64)(Mν１Lu)を培養した。10% FBSを補充したF-12(Cell-Gro、Mediatec h、Herndon、VA)中でストックを培養した。試験したすべての細胞はMycoplasma の混入について陰性であった。抗体マウス抗TSP 133はsTSPに対し誘起され、Birminghamのアラバマ大学のモノクローナル抗体コア施設(Monoclonal Antibody Core facility)において開発された。この抗体はIgG_2bであり、これウェスタンブロッティングによってsTSPの50k Daのキモトリプシンフラグメントを認識する。Mab TSP-B7腹水がヒト血小板放出物に対して誘起され、そしてこれはTSPに特異的である(11)(Sigma Chemical、St ．Louis、Missouri)。ニワトリ抗TGF-β抗体をOncomembrane、Seattle、Washingtonから購入し、そしてマウスモノクローナル抗TGF-β抗体をGenzyme、Cambridge、Masschusettsから購入した。抗ビトロネクチンモノクローナルおよびポリクローナル抗体をTeli os、San Diego、Californiaから購入した。ポリクローナル抗血小板第４因子抗体をAtlantic Antibodies、Scarborough、MEから購入した。マウスモノクローナル抗塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)をUpstate Biotech．Inc.、Lake Placid、 New Yorkから入手した。ペプチド合成 TSP1についてのcDNA配列(70)から推定されるヒトTSP1の配列に対応するペプチドを、標準Merifield固相合成プロトコルおよびt-Boc化学(56、57、71)を用いて、Model 9600ペプチド合成機(Biosearch、San Rafael、California)によって合成した。逆相HPLCによって、ペプチドを純度について分析した。より長いペプチドはまた、アミノ酸配列決定によって特徴付けた。第２のタイプ１リピート融合構築物の生成エキソン８-９および９-10のイントロン−エキソン境界に対応するPCRプライマーを作製することによって、エキソン９に対応するTSP1の第２のタイプ１リピートを生成した。cDNA鎖をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって伸長し、そしてグルタチオン-S-トランスフェラーゼを用いて、E.coli細胞中で発現させた。発現したタンパク質を配列分析およびゲル電気泳動によって特徴付けた。軟寒天におけるNRKコロニー形成 24ウェル組織培養プレートでアッセイを行ったこと以外は記載(34)と同様にして、軟寒天アッセイにおけるNRK細胞のコロニー形成を測定することよってTGF- β活性をアッセイした。簡単に述べると、５％Noble寒天(Difco、Detroit、Mich igan)を10%仔ウシ血清/DMEMで10倍希釈し、そしてこの0.5%寒天希釈物を24ウェルの組織培養プレートにベース層として各ウェル0.5mlずつ加え、硬化させた。5 ngの上皮成長因子(EGF)を含む試料0.2mlを、0.6mlの0.5%寒天および10%仔ウシ血清/DMEM中のNRK細胞懸濁液0.2ml(2×10³)と合わせた。この0.3%寒天試料溶液の0 .5mlアリコートを冷却した寒天ベース層に添加し、そしてプレートを37℃、5% C O₂で、７日間インキュベートした。直径62μmより大きいコロニー(＞8-10細胞) を数えた。実験は３つ組で行った。 BAE細胞増殖アッセイ BAE細胞を、24ウェル組織培養プレート中の20%FBSを含むDMEMの１ml中に、１ウェル当たり5000細胞で接種し、そして37℃、5% CO₂で、一晩インキュベートした。細胞を無血清DMEMで一回すすいだ。0.5mlの2.5%FBS DMEM中の試験試料を各ウェルに３つ組で添加した（０日目）。２日目に、0.5mlの新鮮な試験試料アリコートを、元の培地を除去せずに細胞に与えた（最終容量１mlとなる）。細胞をさらに２日間増殖させ、次いで培地を除去し、そして0.5mlのトリプシン-EDTA(G ibco、Grand Island、NY)によって細胞をトリプシン処理し、そして採取した。Z M型コールターカウンター(Coulter Electronics、Hialeah、FL)を用いて採取した細胞の数を測定した。 BAE馴化培地の調製 BAEを、20%または0.2%FBS/DMEM中に、25cm²フラスコ中100,000細胞の密度で接種し、37℃、5%CO₂で一晩インキュベートした。この密度を、sTSPが、まばらなB AE培養物、準集密なBAE培養物、および集密なBAE培養物における潜在型TGF-βを活性化する能力を比較することによって決定した。この細胞密度は、コントロールとTSP処理培地との間で活性TGF-βのレベルにおける最大の違いを示した。フラスコを2mlの無血清DMEMで１回すすぎ、次いで、0.2%または20%FBSのいずれかを含むDMEM 2.5ml中に試験試料を添加した。フラスコを37℃、5% CO₂でさらに数回インキュベートした。馴化培地を採集し、1200rpmで５分間遠心分離して細胞デブリを除去し、そしてポリプロピレンチューブ中４℃で保存し、TGF-β活性を測定するためにNRK軟寒天アッセイで試験するまでに３日を超えないようにした。 TSPまたはペプチドによる精製された潜在型組換えTGF-βの活性化種々の濃度のsTSPまたは合成ペプチドを、2nM(200ng/ml)の精製した少量の潜在型組換えTGF-β(LTGF-β)(Bristol-Myers Squibb、Seattle、WA)と共に、最終容量0.5mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で37℃にて１時間インキュベートした。ポジティブコントロールとして、４mMのHCLをTGF-β活性化について用いた。PBSを細胞に加え、細胞増殖のベースラインを確立した。ウシ血清アルブミン( BSA)(0.1％)をすべての試料に添加して、TGF-βのチューブへの非特異的結合を減少させた。TGF-β活性についての軟寒天NRKコロニー形成アッセイで試料を試験した。 TGF-β活性のsTSP仲介刺激の感受性に対するプロテアーゼ阻害剤の影響 BAE細胞を１×10⁵細胞/25cm²フラスコで20%FBSを含むDMEM中に播種し、一晩インキュベートした。細胞をDMEMで洗浄し、以下のプロテアーゼ阻害剤（ε-アミノカプロン酸(EACA、0.3mM)、アプロチニン(6mM)、およびアルファ2-抗プラスミン(0.6μM)）のうちの１つを、１μgのsTSP(0.4μg/ml)と共に、各フラスコ中、 2.5mlの0.2％または20％FBSのいずれかを含むDMEM中に加え、次いで、さらに48 時間、細胞と共にインキュベートした。馴化培地のアリコートをNRKコロニー形成軟寒天アッセイにおいて試験してTGF-β活性を測定した。組換えTGF-β(5ng/m l)もまた阻害剤と共にインキュベートし、そしてコロニー形成活性についてアッセイした。阻害剤単独もまた、この馴化培地に加えた。成熟rTGF-β活性に対するsTSPの影響およびFBS中におけるTGF-β活性の刺激 NRKコロニー形成アッセイを本明細書に記載のようにして行った。EGFが0.2%FB Sに入っている試料以外の試料はすべて、10%仔ウシ血清/DMEM中に5ng/mlのEGFを含んでいた。ストリップされたTSP(1μg/ml)を1ng/mlのrTGF-βと共に、37℃で２時間、あらかじめインキュベートし、1ng/mlのrTGF-βまたは1μg/mlのsTSPに対する相対活性について比較した。軟寒天にNRK細胞を添加する前に、抗sTSP抗体Mab133(10μg/ml)を組換えTGF-β(rTGF-β)(Bristol Myers Squibb、Seattle 、WA)と共に37℃で２時間、あらかじめインキュベートした。sTSP(3μg/ml)もまた0.2%FBSと共に37℃で２時間インキュベートし、sTSP(3μg/ml)または0.2%FBS に対する相対活性について試験した。すべての試料をNRK軟寒天で、37℃、5%CO₂ で７日間試験した。 TGF-β活性をストリップされたTSPはBAE細胞の増殖を阻害する関連するTGF-β活性をストリップされたTSP(sTSP)がBAE増殖を阻害するかどうかを試験するために、sTSPを用いて細胞増殖アッセイを行った。2.5%FBSを補充した培地中で、BAE細胞を、濃度を高めた天然TSP(TSPと関連するTGF-β活性）またはsTSP（関連するTGF-β活性なし）のいずれかに、４日間曝し、その時点で細胞数を測定した。天然TSPおよびsTSPは2.5%FBS単独と比べて、BAE細胞の増殖を顕著に阻害した。さらに、用量応答曲線は天然とsTSPとでほとんど同一であった。顕著な細胞死は観察されなかった。TSPによるBAE増殖の阻害は濃度依存性であり、１μg/mlのsTSPが増殖を75%阻害した。sTSP存在下において増殖した細胞は、より長く、繊維芽的な形状をしており、そして2.5%FBS培地コントロール中の多角形細胞と比べると突出した核小体(nucleoli)を有していた。同様に、TGF-β処理細胞は、伸長して、多数の突起および突出した核小体を有していた。 TGF-βに対する中和抗体はsTSPの増殖阻害効果を42％逆転させた。sTSPが入ったウェルにTGF-βに対する中和抗体を添加することによってもまた、部分的な逆転が生じ、正常なBAE細胞の特徴である、より小さい、より多角形の細胞となる。同様の結果が、マウスおよびニワトリの抗TGF-β抗体の両方で得られた。対照的に、天然TSPに特異的なポリクローナル抗体および種々のモノクローナル抗体はsTSP仲介増殖阻害を中和することはできなかった。抗体単独では細胞増殖に影響を与えなかった。従って、関連するTGF-β活性をストリップされたTSPによるB AE細胞の増殖阻害は、少なくとも一部はTGF-β依存成分に起因し得る。ストリップされたTSPはBAE馴化培地(CM)中でTGF-βを活性化する sTSP仲介BAE増殖阻害は部分的にTGF-β依存性なので、BAE細胞と共にsTSPをインキュベートすることにより内因性の潜在型TGF-βの活性化が引き起こされる。 TGF-βは内皮細胞から不活性分子として分泌され(18)、そして内皮細胞潜在型TG F-βがどのように活性化されるかについては完全には明らかではない。sTSPが潜在型TGF-βの内皮細胞による分泌を活性化するという仮説を検証するために、sT SPを0.2%FBSを含むDMEM中のBAE細胞に０〜48時間かけて、添加した。この馴化培地のアリコートをNRKコロニー形成軟寒天アッセイで、TGF-β活性の存在について試験した。ストリップされたTSPは0.4μg/ml(0.9nM)で、馴化培地中のコロニー形成活性を馴化培地単独の場合と比べて２〜３倍増加させた。TG F-β活性の増加はsTSPの細胞への添加から早くて15分後には観察され、そして少なくとも48時間はコントロールレベルを超えて持続した。同様の活性レベルは、血清レベルを0.2%から20%へと上昇させた培地中で細胞を馴化させた培地で観察され、このことはsTSP仲介のTGF-β活性の刺激が血清因子とは無関係であることを示唆している。 TGF-β活性の刺激はsTSP濃度に依存する BAE馴化培地におけるTGF-β活性の刺激が、存在するsTSP濃度に依存するかどうかを評価するために、10ngから10μgまでの範囲の異なる用量のsTSPを2.5mlの培地中のBAE細胞に加えた。40〜400ng/ml(100〜1000ng添加)のsTSP濃度が、軟寒天中でのNRKコロニー形成の刺激に有効であった。最大応答は、１μg sTSP/25cm² フラスコ（0.4μg/ml、または0.9nM)で繰り返し観察された。rTGF-βと比較すると、sTSPによって誘発されるNRKコロニー形成の最大レベルは、TGF-β活性の約0.1ng/mlに対応する。ストリップされたTSPは成熟rTGF-βの活性に影響せず、FBS中のTGF-β活性を刺激もしない NRK軟寒天アッセイにおけるTGF-β活性の増加がそのNRK細胞レベルで作用する sTSPに起因することを除外するために、sTSPが成熟rTGF-β活性に影響するか否か、および、馴化培地中でsTSPがTGF-β活性を刺激することを阻害する抗sTSP抗体133がNRKアッセイにおいてTGF-β活性に影響を与えるか否かを測定する実験を行った。rTGF-β活性はsTSPまたは抗TSP抗体のいずれによっても調整されず、sT SPそれ自身もコロニー形成を刺激しなかった。ストリップされたTSPはまた0.2%F BS中に存在する潜在型TGF-βを活性化しなかった。 BAE馴化培地中のTGF-β活性の刺激はsTSPに特異的である他の細胞外マトリックスタンパク質を、内皮細胞の潜在型TGF-βの分泌を活性化する能力について試験した。等モル量のテネイシン、フィブロネクチン、BSA 、またはラミニンはTGF-β活性化を刺激しなかった。塩基性FGFは以前の報告(13 )とは対照的に、我々の系においてはTGF-βの活性の増大を刺激しなかった。これらの結果は、BAE馴化培地におけるTGF-β活性の刺激はフィブロネクチンのようなTGF-β結合分子を包含する細胞外マトリックス分子の一般的な性質ではないことを示し、従ってsTSPに特異的な性質であることを示す。 sTSPに対する抗体はsTSPによるTGF-β活性の刺激を阻害する TGF-β活性の観察される増加がsTSPに会合する可能性のある成分に起因するという可能性を除去するため、TSPに対する抗体によって刺激を遮断する試みが成された。sTSPの50kDaのキモトリプシンフラグメントにおけるエピトープを認識するモノクローナル抗体133腹水は、sTSPによるTGF-β活性の刺激を完全に阻害した。血小板TSPの70kDaコアに特異的な(11)Mab TSP-B7腹水もまたsTSPのこの効果を遮断した。しかし、天然TSPの70kDaフラグメントのエピトープを認識する他のモノクローナル抗体は、潜在型TGF-βのsTSPによる活性化を32％阻害したに過ぎない。抗体単独では、これらのアッセイに影響を与えず、そして軟寒天中でrT GF-βがコロニーを形成する能力を妨害しなかった。コロニー形成もまたTGF-β依存性である。なぜなら、ポリクローナルニワトリ抗TGF-β抗体およびモノクローナルマウス抗TGF-β中和抗体は完全にコロニー形成を阻害したからである。これらの結果は、BAE馴化培地におけるsTSPによって活性化される因子はTGF-βであることを示している。対照的に、ビトロネクチン（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）、血小板第４因子、bFGF、およびコントロール腹水に対する抗体は、sTSPによる刺激を阻害しなかった。これらのデータは、NRK軟寒天アッセイにおいて観察されるTGF-β活性の増加が通常関連するマトリックスおよび血小板タンパク質の存在に起因せず、sTSPおよびTGF-βに依存することを示した。 BAE馴化培地におけるTGF-β活性のストリップされたTSPによる刺激は、細胞表面への結合とは無関係に生じるインビボにおける潜在型TGF-β活性化の提唱される機構は、マンノース-6-ホスフェートレセプターによる潜在型TGF-βの結合およびインターナリゼーション (internalization)、続いて酸性化ベシクルにおける処理または細胞表面でのプラスミンによる処理による機構である(12、20、21)。潜在型TGF-βを活性化するためにsTSPが細胞表面分子と相互作用することが必要かどうかを決定するために実験を行った。0.2%FBSを含むDMEM中でBAE細胞を一晩インキュベートした後、培地を培養フラスコから取り出し、そしてsTSP(0.4μg/ml)の存在下または非存在下、ポリプロピレンチューブ中で所定時間インキュベートした。これを細胞存在下でインキュベートしたsTSPと直接比較した。次に馴化培地のアリコートをNRK コロニー形成軟寒天アッセイで、sTSP仲介のTGF-β活性化について試験した。これらのデータは、sTSPが細胞の非存在下でも、細胞の存在下でsTSPをインキュベートする場合と同様の程度および同様の動力学でTGF-βを活性化することができることを示した。細胞非存在下でsTSPと共にインキュベートした細胞馴化培地は、sTSP添加から早くも15分後にはTGF-β活性を増加させることを示した。最大レベルは２時間で達成され、そしてベースラインを超えて少なくとも48時間持続した。従って、いままで報告されてきた活性化の機構とは対照的に、TSP仲介の潜在型TGF-β活性化は細胞表面分子との相互作用を必要としない。ストリップされたTSP仲介のTGF-β活性の刺激はセリンプロテアーゼ阻害剤に非感受性である以前の研究は、プラスミンはインビトロで潜在型TGF-βを活性化し得ることを示した(22、23)。内皮細胞および平滑筋細胞の共培養において、プラスミンレベルは上向きに制御される(upregulated)ことが示され、従って、潜在型TGF-βを活性化している(40、41)。共通のモチーフは、潜在型TGF-βの活性化にセリンプロテアーゼが関与することである。従って、BAE馴化培地におけるsTSPによるTGF -βの活性化に対する異なるセリンプロテアーゼ阻害剤の影響を試験した。BAE細胞をsTSP(0.4μg/ml)と、それに加えてε-アミノカプロン酸(EACA、0.3mM)、アプロチニン(6mM)、またはアルファ2-抗プラスミン(0.6μM)のいずれかとをインキュベートした。これらの阻害剤の濃度は、以前の研究(40)および用量応答アッセイに基づいて選択した。これらの阻害剤はsTSP仲介のTGF-β活性化を阻害せず、軟寒天アッセイにおけるrTGF-β活性に影響を与えなかった。阻害剤単独もまた馴化培地に加えたが、アッセイに影響を与えなかった。 TSPがこれらのセリンプロテアーゼと相互作用し得る(7)という証拠に基づいて、特異的基質(Boehringer-Mannheim、Indianapolis、IN)からの色素原の生成を測定する酵素アッセイを用いて、関連するプラスミンおよびトロンビン活性についてもまたsTSPを試験した。sTSPにおいて関連するプラスミンまたはトロンビン活性は検出されず、コントロール馴化培地と比べてsTSP馴化培地においてプラスミン活性は生成されなかった。これらのデータは、bFGFによる、または共培養系における内皮細胞誘導潜在型 TGF-βの活性化と対照的に、sTSPによる潜在型TGF-β活性化はセリンプロテアーゼを伴わないことを示した。ストリップされたTSPは精製された組換え潜在型TGF-β(LTGF-β)を活性化し得る細胞分泌因子が関与することなくsTSPが潜在型TGF-βを活性化していたかどうかを決定するために、sTSPをLTGF-βと共に２時間インキュベートし、次いでTGF -β活性についてアッセイした。ストリップされたTSPはLTGF-βを37℃および４ ℃の両方で活性化することができた。濃度13nMでのストリップされたTSPは、酸活性化可能なLTGF-βの約半分を活性化し得た。これらの結果は、sTSPが、プロテアーゼのような細胞分泌因子を伴うことなくLTGF-βを直接活性化し得ることを示した。第２のタイプ１リピート中の独特のペプチドが潜在型TGF-βを活性化する TGF-β活性化がタイプ１コンセンサス配列、ＣＳＶＴＣＧ（配列番号１）およびＷＳＸＷ（配列番号２）のいずれかに起因するかどうかを決定するために、ペプチドＶＴＣＧＧＧＶＱＫＲＳＲＬ（配列番号29）およびＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15）を構築しそして分析して、TGF-βの活性化に対するこれらの配列の影響を決定した。潜在型TGF-βを等モル濃度のsTSPまたは上記ペプチドと共にインキュベートし、TGF-βの活性化を軟寒天NRKコロニー形成によってアッセイした。表Ｉに示すように、11nMのsTSPと共にインキュベートされたTGF-βの添加はNRKコロニーの形成をPBSベースラインコントロールのおよそ２倍に増加させた。ＶＴＣＧＧＧＶＱＫＲＳＲＬ（配列番号29）ペプチドは、11μMまでの濃度で試験したとき、潜在型TGF-βを活性化させなかった。ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15）ペプチドはコロニー形成をsTSPで観察されるのと等しいレベルまで増加させた。これらのデータは、TSPが潜在型TGF-βを活性化させる機構がＣＳＶＴＣＧ（配列番号１）細胞接着モチーフと無関係であり、そしてＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15）ペプチドと関連していることを示した。アミノ酸配列、Arg-Phe-Lysは潜在型TGF-βを活性化する潜在型TGF-βを活性化するＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15 ）配列内の領域をさらに特定するために、このペプチドのカルボキシ末端に欠失を含む以下のペプチドを構築した：ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰ（配列番号14 ）、ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷ（配列番号16）、ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＷＳＰ（配列番号17）、ＫＲＦＫＱＤＧＧ（配列番号９）、ＫＲＦＫ（配列番号５）、およびＲＦＫ（配列番号18）。組換え潜在型TGF-βを当モル濃度のペプチド、sTSPまたはＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15）ペプチドとインキュベートし、そしてTGF-β活性についてテストした。表Iに示すように、ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15）のアミノ末端に塩基性残基を含む全てのペプチドは、潜在型TGF-βをsTSPに匹敵するレベルまで活性化した。トリペプチドＲＦＫ（配列番号18）は、TGF-βを活性化するために必要な最小配列を示した。このペプチドからのＷＳＨＷ（配列番号２）配列の欠失は、TGF-βを活性化する能力を弱めなかった。このことは、コンセンサス配列ＷＳＸＷがTSPによる潜在型TGF-βの活性化に直接的な役割を果たし得ないことを示す。これらのデータは、エクソン9によってコードされるアミノ酸の融合構築物が潜在型TGF-βを活性化し得ないことを示す実験結果と一致した。エクソン9は、4 15位のLysから473位のIleまでのアミノ酸残基をコードし、TSP1の第２のタイプ1 リピート配列全体を含む。しかし、産生される融合タンパク質はＫＲＦ配列を欠いている。これらの与えられたデータはさらに、配列（Ｋ）ＲＦＫが潜在型TGF- βの活性化に必要とされることを支持する。ＫＲＦＫ配列内の特定のアミノ酸が活性に必要である (Ｋ)ＲＦＫ配列内のどのアミノ酸が潜在型TGF-βの活性化に必要であるかを決定するために、アミノ酸置換を含むペプチドを合成し、それらが潜在型TGF-βを活性化する能力についてテストした。この実験の結果を表IIに示す。表IIに示すように、ペプチドＫＲＦＫ（配列番号５）は、潜在型TGF-βをベースラインコントロールの2倍に活性化した。ペプチドＴＲＩＲ（配列番号30）（T SP2の第２のタイプ1リピート内の対応する配列）は潜在型TGF-βを活性化しなかった。このことは、潜在型TGF-βの活性化がTSP1に特異的な機能であることを示す。 412位のLysをアミン基含有残基、Gln(ＱＲＦＫ（配列番号８）)またはHis(ＨＲＦＫ（配列番号６）)で置換しても活性は弱まらなかった。412位のLysを、アミン基を欠いているAla(ＡＲＦＫ（配列番号31）)で置換すると活性はなくなった（表II）。 413位のArgもまた活性には重要である。Argは活性を落とさずにLys(ＫＫＦＫ（配列番号32）)で置き換えられたが、正に帯電したアミン基を欠くGln(ＫＱＦＫ（配列番号33）)による置換は活性を完全に失った。このことは、正に帯電した413位のアミン基またはグアニジノ基が活性に必要であることを示唆する。同様に、415位のLysをGln(ＫＲＦＱ（配列番号34）)で置換すると活性を失った。表IIにさらに示されるように、414位のPheが活性には必要であった。414位のP heをAla(ＫＲＡＫ（配列番号35）)で置換すると活性を失った。Tyr(ＫＲＹＫ（配列番号36）)またはTrp(ＫＲＷＫ（配列番号37）)のような他の芳香族残基は41 4位のPheと置換され得ない。なぜなら、これらのアミノ酸による置換はペプチドを不活化したからである。これらの実験は、この位置にPheが特に必要であることを示した。トリペプチドＲＦＫ（配列番号18）は潜在型TGF-βをベースラインコントロールより2.5倍活性化させた。しかし、415位のLysをArg(ＲＦＲ（配列番号43）)で置換すると活性は破壊され、同様に414位のPheおよび415位のLysをそれぞれTrp およびArg(ＲＷＫ（配列番号44）)で置換すると活性は破壊された（表II）。さらに、ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15）の逆方向配列(i nverted sequence)を含むペプチド（D-アミノ酸から構成され、そしてN-末端をアセチルで、C-末端をアミドで修飾されている）を合成して生理学的半減期がより長いペプチドを得た。このレトロ−インベルソペプチド(retro-inverso pepti de)は、sTSPと当モル濃度で潜在型TGF-βを活性化した。これらのデータは、このペプチドが生理学的条件下（インビボ）では標準的ペプチドよりTGF-β調整活性を良く維持し得ることを示した。表IIIに挙げたペプチドは、本明細書の実施例に記載された実験プロトコルを用いた分析によって、潜在型TGF-βの活性を活性化するか阻害するかのいずれかであることが決定された。 (Ｋ)ＲＦＫによる潜在型TGF-βの活性化はヘパリン結合活性とは独立している BBxBは、周知のヘパリン結合モチーフである。ここで、Bは塩基性アミノ酸(K 、R、H)を示し、そしてxは任意のアミノ酸(72)を示す。TSPのＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15）ペプチドはヘパリンに結合することが示されたが、この活性はこのペプチドのＷＳＨＷ（配列番号4）の領域に存在する(56、 71)。TSPによる潜在型TGF-βの活性化がBBxBモチーフと関連しているかどうかを調べるために、TSPペプチドHep II、すなわちBBxBモチーフを含みヘパリンに結合する(73)ＡＳＬＲＱＭＫＫＴＲＧＴＬＬＡＬＥＲＫＤＨＳ（配列番号38）（残基74〜95位）、およびこのコンセンサスモチーフを欠く第２のヘパリン結合TSP ペプチドHep I、すなわちＥＬＴＧＡＡＲＫＧＳＧＲＲＬＶＫＧＰＤ（アミノ酸1 7〜35位）（配列番号39）をTGF-β活性化能力に関して分析した。Hep IもHep II もどちらも11μMまでの濃度でアッセイされた場合には潜在型TGF-βを活性化しなかった。これらの結果は、潜在型TGF-βの活性化が、TSPのＫＲＦＫ（配列番号５）配列の特異的機能であり、BBxBモチーフに依存していないことを示した。ヘパリンがアニオン性多糖であるため、ヘパリンがTGF-βの活性化をsTSPまたはペプチドのいずれかによって遮断するのかどうかを決定するために実験が行われた。それが何の効果も持たないことが見出された。これらの結果に基づくと、潜在型TGF-βのsTSPまたはペプチドによる結合/活性化は炭水化物の相互作用によって仲介されないことが決定された。他のタンパク質に存在するＲＦＫ配列はTGF-β活性化機能を持たないカルシニューリン(calcineurin)(Sigma Chemicals，St．Louis，Missouri)およびBSAはいずれもＲＦＫ（配列番号５）配列を含むが、これらは、この配列による潜在型TGF-βの活性化が他のタンパク質中のこのペプチド配列の機能であるかどうかを決定するために検査された。潜在型TGF-βを当モル量のsTSP、カルシニューリン、またはBSAと一緒にインキュベートし、活性化についてアッセイした。軟寒天NRKコロニー形成によって測定すると、sTSPのみがTGF-βを活性化し、このことは、カルシニューリン(ＫＲＦＫ(配列番号５))およびBSA(ＨＲＦＫ( 配列番号６))タンパク質内に存在するＲＦＫ（配列番号５）配列がTGF-β活性機能を欠いていることを示す。より大きなペプチド中のTrp残基の改変は活性損失を生じる上記の結果は、配列(Ｋ)ＲＦＫがsTSPによる潜在型TGF-βの活性化の直接的な原因であることを示した。より大きなペプチド中の他の残基がTGF-βの活性化に重要であるかどうかを決定するために、ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ（配列番号15）ペプチドおよびＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰ（配列番号14）内で、アミノ酸残基420位のTrp、423位のTrp、および426位のTrpを全てAla残基に置換してペプチドＫＲＦＫＱＤＧＧＡＳＨＡＳＰＡＳＳ（配列番号12）およびＫＲＦＫＱＤＧＧＡＳＨＡＳＰ（配列番号13）を作製し、これらをそれぞれTGF-β活性化能力についてテストした。潜在型TGF-βを4つのペプチドまたはTSPのそれぞれの濃度を増加させながら一緒にインキュベートし、NRKコロニー形成活性についてアッセイした。Trp残基のAla残基による置換は、改変されていないペプチドまたはsTSPには効果的であることが先に示されたナノモル濃度で、Trp含有ペプチドのTGF-β活性化機能を破壊する。しかし、Trp残基を欠くペプチドは、1μM より高い濃度で適用された場合にTGF-βを活性化した。これらのデータは、(Ｋ) ＲＦＫ配列が単独で潜在型TGF-βを活性化するに十分であるが、より大きなペプチド内では、同様に完全なTSP内では、(Ｋ)ＲＦＫ配列を適切に方向付ける(orie nt)ためには他のアミノ酸特異性が必要であるようであることを示す。配列ＧＧＷＳＨＷは潜在型TGF-βのsTSP仲介性活性化を阻害するＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）配列がTSP三量体によるTGF-βの活性化を競合的に遮断するかどうかを決定するために、累積濃度のペプチドＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）存在下で潜在型TGF-βをsTSPと一緒にインキュベートし、活性化についてアッセイした。軟寒天NRKコロニー形成アッセイにおいて、11nMまでの濃度のs TSPのみと組み合わせされたTGF-βは、PBSベースラインコントロールの約2倍コロニー形成を増加させた。しかし、100倍モル過剰(1.1μM)のＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）ペプチド存在下で潜在型TGF-βを11nMのsTSPとインキュベートした場合、TGF-β活性は完全に阻害された。GGWSHW（配列番号３）ペプチドによる潜在型TGF-βのsTSP仲介性活性化の阻害は、ペプチド濃度に依存し、ペプチドを1.1 μMの濃度で適用した後では100％の阻害が観察された。 TGF-βレセプタースーパーファミリーのメンバーもまた配列ＷＳＸＷ（配列番号２）を含み、観察される活性の減少は、TSP-TGF-βの相互作用の物理的な遮断によると言うよりむしろ、TGF-βレセプター結合部位に関してこのペプチドが活性型TGF-βと競合することに起因するということができる。この可能性を検査するために、ヒト血小板TGF-β(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)を製造者の指示に従って4mMのHClで活性化し、そして1.1μMのＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）ペプチドと30分間プレインキュベートしてペプチドとTGF-βとの間の可能な相互作用を最大にした。このサンプルのTGF-β活性を軟寒天NRKコロニー形成アッセイによってアッセイし、ペプチドなしでインキュベートされた活性化ヒト血小板TGF-βのTGF-β活性と比較した。ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）ペプチドは、ヒト血小板TGF-β単独の場合と比べてTGF-βの活性化に何の効果も及ぼさなかった。従って、ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）ペプチドの阻害的効果は、TGF-βレセプター結合部位の競合的遮断レベルにはないようである。配列ＧＧＷＳＨＷは内皮細胞成長のTGF-β仲介性阻害を遮断する BAE細胞を24ウェルのプレート(Corning，Corning，New York)に5×10³細胞/ウェルで接種し、37℃、5％CO₂で一晩付着させた。このウェルをFBSを含まないDME Mで1回洗浄した。記載したペプチドまたは完全なsTSPのサンプルを0.5mlの2.5％ FBS/DMEMに添加し、37℃、5％CO₂で4日間インキュベートした。細胞には48時間後にさらなるsTSPまたはペプチドを与え、そして総容量1mlの培地中でさらに48 時間インキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理し、Coulter Cell Cou nter model ZM(Coulter Electronics，Hialeah，Florida)上で計数した。阻害ペプチドは、活性を持たないペプチドより高いレベルの細胞増殖を生じた。これらの実験において、1000〜10,000倍モル過剰のＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）は、36〜47％のTSP仲介性BAE成長阻害を遮断した（表IV）。これらの実験は、阻害的ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）ペプチドは細胞環境において潜在型TGF-βの TSP活性化を遮断するに効果的な試剤であり得るということを示唆する。他の阻害ペプチドは、それらのTGF-βに対する同様の作用のために、細胞増殖に対して同じ効果を有することが予想される。配列ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳＣ（配列番号45）は内皮細胞の増殖を阻害する２代から８代継代させたウシ角膜内皮細胞（BCE細胞）を用いた(76)。BCE細胞培養物を、10％FCS、4mMGln、2.5μg/mlアンフォテリシンB、およびそれぞれ500 U/mlのペニシリンＧカリウムおよび硫酸ストレプトマイシンを含むDMEM（低グルコース）中で維持した（全ての培地成分はBiofluides Inc.，Rockville，Maryla ndから入手した)。BCE細胞を5％CO₂内で34℃で生育させた。培地を2〜3日毎に交換した。内皮細胞増殖をCELL TITER 96^TMアッセイ(Promega，Madison，Wisconsin)を用いて測定した。示された濃度の成長エフェクターとともに0.5または5％FCS含有培地を含む96ウェル培養プレートの各ウェルに5×10³細胞を接種した。72時間後、15μlの色素溶液を各ウェルに添加し、そしてそのプレートをさらに4時間インキュベートした。製造者によって記載されたように、可溶化溶液を添加して570n mでの吸光度を24時間後に測定した。 FICOLLと結合した活性化ペプチドＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳＣ（配列番号45）は、1μMより堅実に低い阻害濃度₅₀(IC₅₀)を有する内皮細胞増殖の強力なインヒビターであった。ペプチドを有さないFICOLLキャリヤは不活性であった。活性化ペプチドＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳＣ（配列番号46）（アミノ末端の塩基性アミノ酸を欠いている）のFICOLL結合物もまた、内皮細胞増殖の阻害に関して強力に活性である。同様の阻害的活性は、0.5％または5％ウシ胎児血清中で生育した細胞を用いて観察された。TGF-βを活性化する他のペプチドはそれらのTG F-βに対する作用のために同じ効果を有するはずである。ＫＲＦＫペプチドの投与による創傷治癒の増強 2cm×1cmのワイヤーメッシュ創傷チャンバーをラットの背中に移植する。創傷治癒の反応が開始した後（第４日目）、ラットに毎日1注入部位当たり100〜1000 nMのＫＲＦＫ（配列番号５）、1000ngのTGF-β、1000ngのアルブミンまたはベヒクルコントロールを創傷部位に与える。第９日目に動物を屠殺し、創傷チャンバー内の組織を組織学的に検査し総タンパク質およびコラーゲン含有量について（ヒドロキシ-プロリン含有量の測定により）アッセイする。TGF-βの相対レベルを免疫組織化学的技法によって創傷組織において検査する。あるいは、６cmの直線状の切開をラットの背中側の皮膚に作り、その創傷を外科用クランプで癒合させて１注射部位当たり100〜1000nMのＫＲＦＫ、1000ngのT GF-β、1000ngのアルブミン（ベヒクルとしての３％メチルセルロース中）またはベヒクルコントロールを創傷部位に注射した。他のコントロールは、ＫＲＦＫ（配列番号５）の不活性アナログ、例えば、ＫＲＡＫ（配列番号35）、ＴＲＩＲ（配列番号30）、またはＫＲＷＫ（配列番号37）を含み得る。7〜10日後、創傷片を回収し、そして張力計を用いて引っ張り強さについて、および上述の組織学的分析について評価する。増強された創傷の治癒は、創傷部位の細胞性の組織学的評価(DNA含有量の測定)、コラーゲン原繊維の存在、および創傷表面の再上皮形成の存在によって決定した。この状態に慣れている臨床医達は、統計的に有意な創傷治癒速度の増加が生じたという決定をなし得る。例えば、当業者は、どれだけのDNA含有量の変化が、処置されない創傷に比べて処置された創傷における治癒の増強を示すかを評価し得る。また、当業者は、創傷治癒の増強に必要な再上皮形成の量を容易に決定し得る。さらに、当業者は、創傷治癒の増強の評価において創傷の引っ張り強さを容易に評価し得る。ＧＧＷＳＨＷペプチドの投与による線維症の予防 2cm×1cmのワイヤーメッシュ創傷チャンバーをラットの背中に移植する。創傷治癒の反応が開始した後（第４日目）、ラットに毎日１注射部位当たり100〜100 0nMのＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）ペプチド、100〜2000ngのTGF-β、100〜2000n gのアルブミンまたはベヒクルコントロールを創傷部位に与える。第９日目に動物を屠殺し、創傷チャンバー内の組織を組織学的に検査し、総タンパク質およびコラーゲン含有量について（ヒドロキシ-プロリン含有量の測定により）アッセイする。免疫組織化学的技法によりTGF-βの相対レベルを創傷組織内で検査する。あるいは、６cmの直線状の切開をラットの背側の皮膚に作り、その創傷を外科用クランプで癒合させて１注射部位当たり100〜1000nMのＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）、100〜2000ngのTGF-β、100〜2000ngのアルブミン（ベヒクルとしての３％メチルセルロース中）またはベヒクルコントロールを創傷部位に注射した。他のコントロールは、ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）の不活性アナログ、例えば、ＳＨＷＷＳＳ（配列番号40）、ＧＧＷＳＨＹ（配列番号41）、およびＧＧＷＳＫＷ（配列番号42）を含み得る。７〜10日後、創傷片を回収し、そして張力計を用いて引っ張り強さについて、および上述の組織学的分析について評価した。線維症の主な尺度は、結合組織のトリクローム染色を用いる組織学的分析による、およびパンチバイオプシーで得た規定の創傷面積中のヒドロキシプロリン含有量の測定による創傷のコラーゲン含有量の評価である。この状態に慣れている臨床医達は、統計的に有意な線維症の減少が起きたという決定をなし得る。例えば、当業者は、処置された創傷のコラーゲン含有量のどれだけの変化が、処置されない創傷に比べて線維症の減少を示すかを評価し得る。また、当業者は、線維症の減少を示すヒドロキシプロリンの量を容易に決定し得る。創傷治癒を増強するためのTSPまたはTSP由来のペプチドによる創傷の局所的処置臨床的適用において、1μg〜100mgの精製TSPまたはTSP由来の活性化ペプチドを直接創傷に当てる包帯(bandage)に含浸させるか、または直接創傷に塗る軟膏に混合する。熟練した臨床医は、患者の年齢、体格、ならびに創傷の部位および状態に応じて、創傷の治癒を増強するのに必要なTSPまたはTSP由来の活性化ペプチドの量および処置の長さを決定し得る。線維症を減少させるためのTSPペプチドによる線維症を生じ得る部位の局所的処置臨床的適用において、TSPの1μg〜100mgの精製阻害ペプチドを直接線維症を生じ得る部位に当てる包帯に含浸させるか、または直接線維症を生じ得る部位に塗る軟膏に混合する。熟練した臨床医は、患者の年齢、体格、および線維症を生じ得る部位の状態に応じて、線維症を減少させるのに必要なペプチドの量およびペプチドによる処置の長さを決定し得る。この出願を通して種々の刊行物を参照した。本発明が属する分野の状態をより十分に記載するために、これらの刊行物の開示を全体として本出願の明細書に参考として援用する。本プロセスは、その特定の態様の特定の詳細な説明に関して記載されているが、それらが添付の請求の範囲に含まれる限りは、そのような詳細な説明が本発明の範囲に関する制限とみなされることを意図しない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 17/08 Ａ６１Ｋ 37/465 ＡＤＤ 17/10 ＡＢＮＣ１２Ｎ 5/06 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人ユーエイビーリサーチファウンデイションアメリカ合衆国アラバマ 35294―0111, バーミングハム，サウス 20ティーエイチストリート 701 スイート 1120ジー ―エイビー (72)発明者マーフィー−ウーリッヒ，ジョアンイー. アメリカ合衆国アラバマ 35222，バーミングハム，ランデールロード 939 (72)発明者ロバーツ，デイビッドディー. アメリカ合衆国メリーランド 20817, ベセスダ，パーシモントゥリーロード 6808 (72)発明者クルッツ，ヘンリーシー. アメリカ合衆国メリーランド 20817, ベセスダ，ドゥポールドライブ 9704 (72)発明者シュルツ−チェリー，ステイシーアメリカ合衆国アラバマ 35209，バーミングハム，バリービュードライブ 1501

Claims

【特許請求の範囲】１．被験体においてトランスフォーミング成長因子−βの活性を刺激する方法であって、該被験体中の潜在型トランスフォーミング成長因子−βを、潜在型トランスフォーミング成長因子−βを活性型トランスフォーミング成長因子−βに変換するのに有効な量のトロンボスポンジンと接触させる工程を包含する、方法。２．被験体においてトランスフォーミング成長因子−βの活性を刺激する方法であって、該被験体中の潜在型トランスフォーミング成長因子−βを、潜在型トランスフォーミング成長因子−βを活性型トランスフォーミング成長因子−βに変換するのに有効な量の、トロンボスポンジンの精製された活性化ペプチドと接触させる工程を包含する、方法。３．被験体においてトランスフォーミング成長因子−βの活性を刺激する方法であって、該被験体中の潜在型トランスフォーミング成長因子−βを、相当量の、３から３０アミノ酸を有する精製された活性化ペプチドと接触させる工程を包含し、ここで、該ペプチドはサブ配列Ｒ₁−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｒ₂を含み、Ｘ₁はArgおよびLysからなる群から選択され、Ｘ₂はProおよびPheからなる群から選択され、Ｘ₃はLysおよびArgからなる群から選択され、Ｒ₁はＨ、アシル、または１から２６アミノ酸のペプチド、Ｒ₂はＨ、ＮＨ₂、または１から２６アミノ酸のペプチドであり、そして、該ペプチドは、潜在型トランスフォーミング成長因子−βを活性型トランスフォーミング成長因子−βに変換する、方法。４．被験体においてトランスフォーミング成長因子−βの活性を刺激する方法であって、該被験体中の潜在型トランスフォーミング成長因子−βを、相当量の、以下からなる群から選択される精製された活性化ペプチドと接触させる工程を包含する、方法：５．前記精製された活性化ペプチドが、アミノ酸配列ＲＦＫ（配列番号１８）からなる、請求項２に記載の方法。６．被験体においてトランスフォーミング成長因子−βの活性の刺激を阻害する方法であって、該被験体中のトロンボスポンジンを、トロンボスポンジンに結合して潜在型トランスフォーミング成長因子−βの活性型トランスフォーミング成長因子−βへの変換を予防するのに有効な量の、トロンボスポンジンに特異的な抗体と接触させる工程を包含する、方法。７．被験体においてトランスフォーミング成長因子−βの活性の刺激を阻害する方法であって、該被験体中の潜在型トランスフォーミング成長因子−βを、潜在型トランスフォーミング成長因子−βの活性型トランスフォーミング成長因子− βへの変換を阻害するのに有効な量の、トロンボスポンジンの４つの連続したアミノ酸の配列に対応する配列を有する、精製された阻害ペプチドと接触させる工程を包含する、方法。８．被験体においてトランスフォーミング成長因子−βの活性の刺激を阻害する方法であって、該被験体中の潜在型トランスフォーミング成長因子−βを、相当量の、以下からなる群から選択される精製された阻害ペプチドと接触させる工程を包含する、方法：９．被験体において創傷の治癒を増強する方法であって、該被験体の創傷部位に、潜在型トランスフォーミング成長因子−βを活性型トランスフォーミング成長因子−βに変換するのに有効な量のトロンボスポンジンを投与する工程を包含し、トランスフォーミング成長因子−βの該活性化が結果として創傷の治癒を増強する、方法。１０．被験体において創傷の治癒を増強する方法であって、該被験体の創傷部位に、潜在型トランスフォーミング成長因子−βを活性型トランスフォーミング成長因子−βに変換するのに有効な量の、TSP由来の精製された活性化ペプチドを投与する工程を包含し、トランスフォーミング成長因子−βの該活性化が結果として創傷の治癒を増強する、方法。１１．前記精製された活性化ペプチドが以下のアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の方法：１２．前記精製された活性化ペプチドが、アミノ酸配列ＲＦＫ（配列番号１８）から実質的になる、請求項１０に記載の方法。１３．被験体において病的状態でトランスフォーミング成長因子−βによって刺激される線維症を予防する方法であって、該被験体の線維症を生じ得る部位に、トロンボスポンジンに結合するのに有効な量の、トロンボスポンジンに特異的な抗体を投与する工程を包含し、これによりTGF-βの活性化を予防して、結果として線維症が抑制される、方法。１４．被験体において病的状態でトランスフォーミング成長因子−βによって刺激される線維症を予防する方法であって、該被験体の線維症を生じ得る部位に、潜在型トランスフォーミング成長因子−βの活性型トランスフォーミング成長因子−βへの変換を阻害するのに有効な量の、TSP由来の精製された阻害ペプチドを投与する工程を包含し、結果として線維症が抑制される、方法。１５．前記精製された阻害ペプチドが以下からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法：１６．前記精製された阻害ペプチドが、アミノ酸配列ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）から実質的になる、請求項１４に記載の方法。１７．被験体においてトランスフォーミング成長因子−β仲介型の内皮細胞の増殖の阻害を遮断する方法であって、該被験体の内皮細胞を、トロンボスポンジンに結合するのに有効な量の、トロンボスポンジンに特異的な抗体と接触させる工程を包含し、これによりトランスフォーミング成長因子−βの活性化を予防して、結果として内皮細胞を増殖させる、方法。１８．被験体においてトランスフォーミング成長因子−β仲介型の内皮細胞の増殖の阻害を遮断する方法であって、該被験体の内皮細胞を、潜在型トランスフォーミング成長因子−βの活性型トランスフォーミング成長因子−βへの変換を阻害するのに有効な量の、TSP由来の精製された阻害ペプチドと接触させる工程を包含し、結果として内皮細胞を増殖させる、方法。１９．前記精製された阻害ペプチドが以下からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法：２０．前記精製された阻害ペプチドが、アミノ酸配列ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３）から実質的になる、請求項１８に記載の方法。２１．３から３０アミノ酸を有する精製されたペプチドであって、ここで、該ペプチドはサブ配列Ｒ₁−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｒ₂を含み、Ｘ₁はArgおよびLysからなる群から選択され、Ｘ₂はProおよびPheからなる群から選択され、Ｘ₃はLysおよびArgからなる群から選択され、Ｒ₁はＨ、アシル、または１から２６アミノ酸のペプチド、Ｒ₂はＨ、ＮＨ₂、または１から２６アミノ酸のペプチドであり、そして、該ペプチドは、潜在型トランスフォーミング成長因子−βを活性型トランスフォーミング成長因子−βに変換する、ペプチド２２．前記ペプチドが以下からなる群から選択される、請求項２１に記載のペプチド：２３．配列表において配列番号１０で定義されるアミノ酸配列ＲＷＲＰＷＴＡＷＳＥから実質的になる、ペプチド。２４．前記ペプチドが水溶性ポリマーに接合された、請求項２１に記載のペプチド。２５．前記ペプチドが部分的および完全にレトロ−インベルソのペプチド配列からなる群から選択される、請求項２１に記載のペプチド。２６．配列表において配列番号２８で定義されるアミノ酸配列アセチル-ＷＨＳＷＡＡ-ＮＨ₂から実質的になる、精製されたペプチド。２７．前記ペプチドが部分的または完全にレトロ−インベルソのペプチド配列の群から選択される、請求項２６に記載のペプチド。