JPH09504790A - Biochemically active substances for chemical catalysis and cell receptor activation - Google Patents

Biochemically active substances for chemical catalysis and cell receptor activation

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JPH09504790A JP7513349A JP51334994A JPH09504790A JP H09504790 A JPH09504790 A JP H09504790A JP 7513349 A JP7513349 A JP 7513349A JP 51334994 A JP51334994 A JP 51334994A JP H09504790 A JPH09504790 A JP H09504790A
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Abstract

(57)【要約】 生化学的に反応性の対（ＢＲＰ）を、変性することなく付着させることができるよう設計された層でコートされたコア粒子または表面で製造された生物活性組成物。付着させるＢＲＰとしては、リガンド−受容体対、酵素−基質対、医薬−受容体対、触媒−反応物対、毒素−リガンド対、吸収剤−アブソーベート対、および吸着剤−アドソーベート対が挙げられる。また生物活性物質を、変性させることなく付着させることができるよう設計された層でコートされている生物分解性コア粒子で製造された生物活性組成物も開示する。これらの組成物はさらに、特異的な受容体に対する選択的ターゲッティングを行う外側ターゲッティング膜を含んでいてもよい。さらに、遺伝子療法などのトランスフェクション法に用いる生物活性組成物を開示する。これらの組成物は、トランスフェクション物質（ＤＮＡ／ＲＮＡセグメントまたはアンチセンスフラグメント）を、変性させることなく付着させることができるよう設計された層でコートされたナノ結晶コア粒子で構成されている。この組成物はさらに、トランスフェクション物質の特異的細胞受容体に対する選択的ターゲッティングを行う外側ターゲッティング膜を含有していてもよい。   (57) [Summary] A bioactive composition made of core particles or surfaces coated with layers designed to allow biochemically reactive pairs (BRP) to be attached without modification. BRPs that are attached include ligand-receptor pairs, enzyme-substrate pairs, drug-receptor pairs, catalyst-reactant pairs, toxin-ligand pairs, absorbent-absorbent pairs, and adsorbent-adsorbate pairs. Also disclosed are bioactive compositions made with biodegradable core particles that are coated with layers designed to allow bioactive agents to be deposited without modification. These compositions may further include an outer targeting membrane that provides selective targeting to specific receptors. Further disclosed are bioactive compositions for use in transfection methods such as gene therapy. These compositions consist of nanocrystalline core particles coated with layers designed to allow transfection agents (DNA / RNA segments or antisense fragments) to be attached without denaturation. The composition may further include an outer targeting membrane that provides selective targeting of the transfection agent to specific cell receptors.

Description

【発明の詳細な説明】 化学的触媒作用および細胞受容体活性化 のための生化学的活性物質 発明の背景 この出願は、１９９０年６月２２日出願の係属中米国特許出願第０７／５４２ ，２５５号の一部継続出願である１９９１年４月２４日出願の米国特許出願第０ ７／６９０，６０１号の一部継続出願である１９９３年１月４日出願の係属中米 国特許出願第０８／０００，１９９号の一部継続出願である。１． 発明の分野 この発明は、一般に微細粒子（ナノ粒子）のコアを有する合成の生物活性組成 物に関する。一面において、この発明は、トランスフェクティングＤＮＡまたは ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡ）を微細粒子のコア に付着させ次いでターゲッティング膜またはリガンド（targeting membrane or ligand）でコートした生物活性組成物に関する。これらのトランスフェクション ナノ粒子は、トランスフェクティングＤＮＡまたはＲＮＡを標的細胞に送達する のに有用である。別の面において、この発明は、化学触媒および／または細胞受 容体を活性化するのに有用な合成の生化学的に活性な物質に関する。この発明は 、また、微細粒子のコアが生物分解性である生物活性組成物に関する。２． 関連技術の説明 生物活性を有するタンパク質、ペプチドまたは薬剤を各種の担体粒子に付着さ せる技術は、熱心に研究されている技術分野である。これらの接合された生物学 的システムは、生物活性物質の毒性を減 らし、効きめを増大し、かつコストを下げることが期待されている。その結果、 多数の各種担体モデルが現在入手できる。（Goldberg，E.P.編集：Polymers in Biology and Medicine、ニューヨーク、Wiley社、２巻、７３〜８８頁（１９８ ３年）のVarga,J.M.とAsato，N.の報告。Juliano,R.L.編集：Biological Approa ches to the Delivery of Drugs、Ann.N.Y.Acad.Sci.、５０７巻、１０４〜１１ ９頁（１９８７年）のRanney,D.F.およびHuffaker,H.H.の報告。）ナノ結晶性で ミクロンサイズの無機基材が最も普通の担体であり、タンパク質が最も普通に接 合される物質である。例えば、５ｎｍといった小さい大きさの金／タンパク質（ 主として免疫グロブリン）接合体が、免疫ブロッティング法のみならず、光学顕 微鏡法、透過型電子顕微鏡法および走査型電子顕微鏡法における免疫学的標識の 用途で使用されている。（Faulk,W.およびTaylor,G.の報告 Immunochemistry、 ８巻、１０８１〜１０８３頁（１９７１年）。Hainfeld,J.F.の報告Nature、３ ３３巻、２８１〜２８２頁（１９８８年） 大きさが一般に５００〜１５００ｎｍのシラン化処理酸化鉄タンパク質接合体 （やはり主に抗体類）は、常磁性を有利に利用できる各種の生体外用途に有用で あることが分かっている。（Research Products Catalog、Advanced Magnetics ，Inc.社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、１９８８〜１９８９年）Ugel stad他は、薄いポリスチレンシェルでコートされたγ酸化鉄コアを製造した。（ Nustad,K.、Johansen,L.、Schmid,R.、Ugelstad,J.、Ellengsen,T.、Berge,A.の 報告：Covalent coupling of proteins tomonodisperse particles。Preparatio n of solid phase second antibodyo Agents Actions１９８２年、９巻、２０７ 〜２１２頁（ｉｄ．ｎｏ．６０）、）得られた４５００ｎｍのビーズは、常磁性 の比較的新規 な利点のみならず、ポリスチレンラテックスビーズの吸着性能を実証した。 生体内での用途向けに設計された担体系は、無機コアからも有機コアからも造 られてきている。例えば、DavisとIllumは、ポリオキシエチレンとポリオキシプ ロピレンのプロック共重合体であるポロキサマーの外側コート、これはラットの 肝臓マクロファージと脾臓マクロファージをバイパスする注目すべき性能を示し た、を有するポリスチレンコアからなる６０ｎｍの系を開発した。（Davis,S.S ．およびIllum,L.、Biomaterials ９巻、１１１〜１１５頁（１９８８年））。 これらの粒子による医薬送達は、まだ例証されていない。RanneyとHuffakerは、 ３５０〜１６００ｎｍの常磁性医薬担体を生成する酸化鉄／アルブミン／医薬系 を報告した。（Juliano,R.L.編集：Biological approaches to the delivery of drugs、Ann.N.Y.Acad.Sci.５０７巻、１０４〜１１９頁（１９８７年）のRanne y,D.F.とHuffaker,H.H.の報告）Poznaskyは、自然酵素の見掛けの抗原性をマス クしながら生成物の生物分解に対する感受性を低下させると思われる酵素アルブ ミン接合体系を開発した。（Juliano,R.L.編集：Biological approaches to the delivery of drugs、Annals New York Academy Sciences、１９８７年、５０７ 巻、２１１〜２１９頁のPoznasky,M.J.の報告：Targeting enzyme albumin conj ugates．Examining the magic bullet。） Shaw他は、リポタンパク質／医薬複合体を製造しキャラクタリゼーションを行 った。（Juliano,R.L.編集：Biological Approaches to the delivery of drugs 、Annals New York Academy Sciences１９８７年、５０７巻、２５２〜２７１頁 のShaw,J.M.,Shaw,K.V.、Yanovich,S.、Iwanik,M.、Futch,W.S.、Rosowsky,A.,S chook、L.B.の 報告：Delivery of lipophilic drugs using lipoproteins）親油性医薬は、こ れらの担体内で比較的安定であり、細胞の相互作用が起こるが、その詳細は殆ど 分かっていない。 いかなる接合体の生物学的組成物においても、吸着されるタンパク質などの生 物学的物質の配置完全性と生物活性が、不利な免疫応答を引き起こすことなく保 存されることが重要である。多くのペプチド、タンパク質および薬理物質（薬剤 ）の生化学活性を測定する際に、空間配向と構造立体配置が役割を演じているこ とが知られている。これらの化合物の構造立体配置が変化すると、生物活性が一 部分または全体が失われることがある。立体配置の変化は、生物活性を有する化 合物または物質の周りの環境を変えることによって起こすことができる。例えば 、生体外活性を示す薬剤は、生体外の環境によって先に一部測定された分子立体 配置が失われるため生体内活性を示さないことがある。さらに、食細胞の捕捉性 （phagocytic trapping）を最小にする担体粒子の大きさおよび関連性能は、そ の組成物を生体内で使用しようとするときの主な関心事である。これらの要因の すべてを、担体粒子を製造する際には考慮しなければならない。 生化学現象は、分子対間の二元相互作用で構成されている。このような生化学 的に反応性の対（「ＢＲＰ」）の一般名称としては、以下に限定される訳ではな いが、免疫学的対、リガンド−受容体対、酵素−基質対、医薬−受容体対、触媒 −反応物対、触媒−基質対、アブソーベート（ａｂｓｏｒｂａｔｅ）−吸収剤（ ａｂｓｏｒｂｅｎｔ）対、アドソーベート（ａｄｓｏｒｂａｔｅ）−吸着剤（ａ ｄｓｏｒｂｅｎｔ）対、および毒素−リガンド対がある。分子レベルにおいて、 このような対の間の生化学現象の殆ど全てが、一方の分 子の他方の分子による空間認識（spatial recognition）を含んでおり、このよ うな認識は、エネルギと情報を伝達し、産物を生成し、応答を開始しそして複雑 な生物学的構造を構築する手段としての働きがある。 空間認識のプロセスには、ＢＲＰ間のレギオ選択的相互作用と立体選択的相互 作用の両者が含まれている。基本的な生物物理学的法則によって束縛されている 、ＢＲＰの一方のメンバーは、両方のメンバーが可能な空間配置のうちのいくつ かの制限された状態に物理的になっている場合とこのようになっている場合のみ 、ならびに両方のメンバーがそれぞれの相互に作用する領域を妨害されない場合 に、ＢＲＰの他方のメンバーと相互作用することができる。ＢＲＰが相互に作用 する環境は、空間認識のプロセスに大きく影響する。空間移動性を抑制するかま たは分子領域を妨害する環境は、抑制の度合いと得られた空間配座によって、Ｂ ＲＰの相互作用を促進または阻害する。 前者の例は、「固相合成」として知られているプロセスにおける合成化学反応 の表面活性化である。固体のガラス状ポリマー、結晶物質または複雑な巨大分子 ポリマーのような固相は、１９６０年代初期以来、合成生化学の目玉技術であっ た。ペプチド合成を容易にするためこれら固相を使用することは、Merrifieldが 大きく進歩させた。彼は、そのため１９８４年に化学部門でノーベル賞を受けた 。固相法は、単純で迅速であり、中間で単離を行わず、かつ自動式であったので 、広く普及した。固相を広範囲に利用する場合の主な制限は、少数の表面だけが 有効なＢＲＰ相互作用のプロモータであるという経験的観測であった。 生物活性物資を生体内で送達するのに使用する医薬送達系は、非 常に複雑になりがちである。これらの系の大部分は、更なる発展に対して将来性 および可能性を与えるいくつかの利点を有するが、医薬負荷（drug load）が低 いことに始まって生体内で不安定であることに至るまで問題点が多い。特定の標 的細胞に、適度な投与量の治療剤を送達することができる医薬送達系が極めて望 ましい。この種の送達系は、受容体を通じて担体を細胞に結合させ、次いでイン ターナリゼーションのメカニズムを働かせて、医薬を担体から細胞内空間に放出 しなければならない。また、その担体は、生物分解性でなければならず、かつ、 いかなるタイプの免疫反応または免疫応答も誘発してはならない。その送達系は 、特異的で、しかも効力が大で、かつ非標的毒性（non-targeted toxicity）が 低くなければならない。その送達系は、投与と製造を行うのに便利で、かつ患者 とメーカーの両者にとって経済的でなければならない。 多数の各種担体粒子が開発されているが、生物学的に活性なペプチド、タンパ ク質または薬剤を、その活性配置での安定性を促進する方式で付着させることが できる、生体内と生体外の両方の用途に用いる担体粒子が引き続き要求されてい る。化学触媒と細胞受容体の活性化については、個々の触媒がその触媒活性を破 壊することなく取り付くことができる合成表面を開発することが望ましい。また 、このような表面は、触媒基質対のような生化学的に反応性の対（ＢＲＰ）を、 生化学反応を促進するそれら対の性能を低下させることなしに不動化するのに有 用である。 今までのところ、ヒトの遺伝子療法は、組織を培養皿内でトランスフェクトし てから身体に戻すという体外プロトコルに限定されてきている。生体内操作は、 まだ臨床前の開発段階であり、安全性と効力の限界が問題点になっているので、 動物モデルに限定されてい る。このような問題は、主として、遺伝子転移を行うのにウイルスのベクターを 使用することから起こる。レトロウイルスは、標的細胞をほぼ１００％体外で安 定してトランスフェクトすることができるので、レトロウイルスのトランスフェ クションに対して関心が高まっている。トランスフェクトするが複製不全のレト ロウイルスの産生は、原則として野生型ウイルスを産生できないパッケージング 細胞系によって進行する。しかし、これらの系に、低力価の「野生型」（複製コ ンピテントな）ウイルスが観察されている。このようなプロトコルを利用する霊 長類において、リンパ腫の突然の出現は、パッケージング系から野生型レトロウ イルスが検出されることに関連があった。潜在的な病原性の外に、これらのベク ターの有用なトランスフェクティング力価を保持することは困難である。それら はエンベロープ（膜）が極めて不安定であるので精製および濃縮がむずかしい。 代わりに、アデノウイルスの方がかなり安定であることが分かっている。さらに 、これらのウイルスは、静止組織をトランスフェクトして多量の遺伝子産物を産 生できる。あいにく、ウイスルゲノムは、染色体外のままであることが多いので 、遺伝子の発現は過渡的発現であることが多い。ベクターが複製されると、宿主 のタンパク質合成が異常になって、腫瘍形成から細胞毒性にまでにわたる有害作 用をもたらすことがあるので、直接臨床に利用することは問題である。 生体内でのウイルスのトランスフェクションという実際問題を考慮して、非ウ イルス法も開発中である。現在、最も努力が注がれているのは、受容体仲介転移 法である。というのは、この方法は、ＤＮＡ（およびＲＮＡ）を生体内で標的に 向けて送達できるからである。受容体仲介系は、細胞表面の細胞受容体が認識す ることができ るリガンドＤＮＡ（およびＲＮＡ）複合体を利用する。この複合体のインターナ リゼーションは、細胞質中に輸送することができるエンドサイトーシス小胞の形 成を介して起こる。しかし、このエンドソームが、内容物を破壊するリソソーム と融合すると問題が起こる。したがって、これら複合体のトランスフェクション 速度は、臨床効力以下のままである。幾人かの研究者が、トランスフェクション 速度を高めるエンドソームの生成を中断させるために、インフルエンザ・ヘモグ ルチンＡ（Influenza Hemmoglutin A）の融合誘導ペプチドを用いた。それにも 拘わらず、生体内発現のデータは、この方法が遺伝子の過渡的発現しかできない ことを示唆している。 リガンドＤＮＡ（およびＲＮＡ）複合体以外に、リポフェクション（lipofect ion）法も試みられ、色々な度合いで成功している。リポソームは、特に、フィ ルター臓器によって取り込まれ易く、そしてそれらの生体内でのトランスフェク ションの効率と特異性を制限するマクロファージによって抹消組織に取り込まれ 易い。 上記のことから、生体内または生体外の両環境において細胞をＤＮＡまたはＲ ＮＡでトランスフェクトするのに用いることができる組成物を提供することが望 ましい。 発明の要約 本発明によれば、生物学的に活性のペプチド、タンパク質または薬剤のような ＢＲＰのメンバーを、コア粒子に付着させて多種類の生物活性組成物が提供され る。本発明は、超微細粒子（ナノ結晶粒子）の表面を、表面コーティングで改質 して、生物活性部分を付着させると、該生物活性部分が天然に存在する構造環境 が生物活性が保存されるよう充分コピーされた組成物を製造できるようになると いう発見に基づいている。本発明にしたがって、ナノ結晶粒子に生 物活性部分を付着させるコーティングは、塩基性もしくは改質された糖またはオ リゴヌクレオチドで構成されていてもよい。ナノ結晶粒子を塩基性の糖またはオ リゴヌクレオチドでコートすると、これら粒子がＢＲＰの生物活性部分などのメ ンバーを付着させるのに充分好適になる変化が表面エネルギーなどの表面特性に 生じる。 本発明によれば、直径が約１０００ナノメートル未満の超微細コア粒子を用い て、酸素などの触媒粒子を、その触媒を変性させることなく固定することができ る。コア粒子の表面をコーティングすると、触媒を粒子表面に直接付着させた場 合触媒が別の状態になって実質的に変化するのを防止する固定面が生成する。ま たこのコートされた粒子は、ＢＲＰの触媒活性を破壊することなく、触媒−基質 （酵素−基質）対などの生物学的反応性対を固定するのに有用である。 また本発明には、フィルムまたは固体の表面のような巨視的表面にＢＲＰを付 着させることも含まれる。この種の表面積が大きい系にＢＲＰを固定することは 、化学触媒または細胞受容体の活性化が、ナノ結晶コアの固定粒子が提供する微 細形態（ｍｉｃｒｏｇｅｏｍｅｔｒｙ）に依存しないかまたはこれを必要としな い場合に有用である。 本発明の別の態様では、生物活性を有するペプチド、タンパク質または薬剤を 生物分解性コア粒子に付着させて広範囲の生物活性組成物が得られる。本発明は 、超微細粒子（ナノ結晶粒子）の表面を表面コーティングで改質して、生物活性 部分を付着させると、生物活性を保存するように生物活性部分の天然に存在する 構造環境に充分に似せた組成物を生成することができるという発見に一部基づい ている。表面をコーティングし次に生物活性部分を付着させたコア 粒子に、さらに生物活性リガンドまたはリン脂質膜複合体のようなターゲッティ ング物質をコートする。 また本発明は、生物分解性コア粒子を生物活性物質または薬剤と組み合わせて 生物活性コアを得ることができ、そしてそのコアをさらにターゲッティングリガ ンドまたは膜複合体で処理して生体内で生化学的に活性なコアの選択的ターゲッ ティングを行うことができるという発見に一部基づいている。 本発明の一つの特徴は、ナノ結晶コアが結晶リン酸カルシウムで構成されてい るブルッシャイト（ｂｒｕｓｈｉｔｅ）で構成されていることである。この物質 は生物分解性で安価であり、かつ骨合成の基材としてヒトに見出される物質であ る。ブルッシャイトの粒子は、ナノメートルの大きさ（約５ｎｍ〜１５０ｎｍ） で合成することができる。このように大きさが小さいので、その医薬送達構造体 は、身体の細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みを回避して、医薬または生物活 性物質を、マクロファージに対して非特異的毒性または医薬の損失なしに生体内 で送達するのに充分に小さくすることができる。 ブルッシャイトのコアは、医薬または物質を徐々に放出しかつ生理的環境から 保護するように、医薬または物質と共結晶化（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｉｚｅ）す ることができる。逆に、ブルッシャイトコアは先に述べたようにセロビオースの ような糖またはピリドキサルリン酸でコートして、その表面付着特性を改善する ことができる。この糖のコートは、医薬などの生物学的物質を変化させることな く活性もしくは非活性の形態で結合させることができる。この糖にはその表面に 吸着される医薬もしくは物質の配座を保持する働きがある。このコア構造体は、 生物学的物質の大きさによって、医薬また は物質の適度の負荷を運ぶことができる。 本発明の一つの特徴は、ブルッシャイトベースの粒子が特定の組織または細胞 型を標的としていることである。このターゲッティングを達成するため、その構 造体はその表面にしっかり吸着されたターゲッティングリガンドまたは感作リン 脂質膜（ｐｒｉｍｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を備え ている。この膜は、伝達体のターゲッティングを行うタンパク質、受容体および 炭水化物を含有していてもよい。また上記の膜は、生物学的物質の安定性と構造 体の完全性をさらに保持する働きもする。この膜は、細胞膜、ウイルスのエンベ ロープ（米国特許第５，１７８，８８２号参照）または他の特別な処理または合 成を行って得た膜から誘導したものでもよい。生物分解性コア粒子送達系は大き さが非常に小さいため、多重層の膜をコア粒子に吸着させてターゲッティングの 効率を増大させることができる。 本発明の一つの態様で、生物分解性ナノ結晶粒子を使用して、ウイルスのＤＮ ＡもしくはＲＮＡのコアが微細粒子で置換されているデコイウイルス（ｄｅｃｏ ｙ ｖｉｒｕｓ）が製造される。その微細粒子は、周囲のタンパク質コートの配 座が天然のウイルスに正確に似ているようにウイルスコアとほぼ同じ大きさにな るよう選択される。得られたウイルスデコイは、感染挙動はないが、同時に充分 に免疫応答を行うことができ、別の方式で抗原として生物学的に反応性である。 本発明の生物活性微細粒子には、その生物分解性微細粒子コアに付着させる生 物活性化合物の種類によって広範囲の用途がある。ＨＩＶ由来のウイルスタンパ ク質を該微細粒子に付着させると、ＡＩＤＳのワクチン、診断手段または抗体を 生成する抗原剤として使用 できるデコイウイルスが得られる。非ウイルスのタンパク質または抗原のコーテ ィングを選択して構築して、特異的な抗体を生成させるために用いたりまたは診 断手段として用いることができる。さらに前記微細粒子は、薬理活性を有する化 合物を生物分解性コア粒子に付着させると薬剤として機能することができる。 本発明によって、直径が約１０００ナノメートル未満の生物分解性コア粒子を 用いて、触媒を変性することなく、酵素などの触媒粒子が固定される。コア粒子 の表面をコートすると、触媒を粒子表面に直接付着させるとき触媒が別の状態に なって実質的に変化するのを防止する固定表面が得られる。またこのコートされ た粒子は、触媒−基質（酵素−基質）対などの生物反応性対（ＢＲＰ）を、ＢＲ Ｐの触媒活性を破壊することなく固定するのに有用である。 本発明の別の態様では、トランスフェクティングＤＮＡまたはＲＮＡをナノ結 晶コア粒子に付着させ次いでターゲッティングリガンドまたは膜でコートして、 遺伝子療法に使用できるウイルストランスフェクション系が得られる。本発明は 、超微細粒子（ナノ結晶粒子）の表面を表面コーティングで改質して、トランス フェクティングＤＮＡまたはＲＮＡを付着させると、生物活性が保存されるよう 該ＤＮＡまたはＲＮＡの天然に存在する構造環境に充分に似せてた組成物が生成 するという発見に一部分基づいている。表面がコートされ次いでトランスフェク ティングＤＮＡまたはＲＮＡを付着させたコア粒子はさらに、リガンドまたはリ ン脂質膜複合体のようなターゲッティング物質でコートして、特定の細胞受容体 に対してＤＮＡまたはＲＮＡのターゲッティングを行わせる。 本発明のこの態様の特徴は、ナノ結晶コアがブルッシャイトで構成されている ことである。この物質は、生物分解性で安価であり、 骨合成の基材としてヒトに見出される。ブルッシャイト粒子はナノメートルの大 きさ（約５ｎｍ〜１５０ｎｍ）で合成することができる。このように大きさが小 さいので、そのＤＮＡ／ＲＮＡ送達構造体は、身体の細網内皮系（ＲＥＳ）によ る取り込みを回避して、ＤＮＡ／ＲＮＡを、マクロファージに対して特異的な毒 性または医薬の損失なしに生体内で細胞に送達するのに充分に小さくすることが できる。 このＤＮＡ／ＲＮＡ粒子構造体は特定の組織または細胞型を標的としている。 このターゲッティングを達成するため、この構造体はその表面にターゲッティン グリガンドまたは感作リン脂質の膜をしっかり吸着させる。その膜は上記媒体に ターゲッティングを行わせるタンパク質、受容体および炭水化物を含有している 。またこの膜は、さらにトランスフェクティングＤＮＡまたはＲＮＡの安定性と 構造体の完全性を維持する働きもする。この膜は、細胞膜、ウイルスのエンベロ ープ（米国特許第５，１７８，８８２号参照）または他の特別の処理または合成 を行って得た膜から誘導したものでもよい。生物分解性コア粒子送達系は大きさ が非常に小さいため、多重層の膜をコア粒子に吸着させてターゲッティングの効 率を増大させることができる。本発明のＤＮＡ／ＲＮＡトランスフェクティング 微細粒子は、生物分解性微細粒子のコアに付着させた特定のＤＮＡまたはＲＮＡ によって広範囲の用途がある。 本発明の上記特徴およびそのほかの多くの特徴ならびに付随する利点は下記の 詳細な説明によって一層よく理解されるであろう。 発明の詳細な説明 本発明は、抗原物質、生物学的に反応性の対（ＢＲＰ）または他 の生物活性部分を利用する免疫学的処置または方法に広範囲の用途がある。これ らの用途分野には、予防接種剤；抗体を生成させたのち診断に利用するのに使用 する抗原剤；および診断手段として用いる抗原化合物が含まれる。また本発明の 組成物は、医薬または他の生物活性物質を、生体内と生体外の環境下で、特定の 細胞型にこれを目標として向かわせることを必要とする多種類の用途に利用する ことができる。 本発明の組成物は、タンパク質、ペプチドまたは医薬の粒子に対する結合を促 進する表面エネルギー改質層でコートされている生物分解性ナノ結晶コア粒子（ 直径が１００ｎｍ未満）を含有している。そのコーティングは、ナノ結晶コア粒 子の表面エネルギーを改変して、多種類の免疫原性タンパク質、ペプチドおよび 医薬が、抗原活性を著しく損失したりまたは変性することなしにコア粒子に付着 できるようにすることができる。その結果、生物学的に不活性なコアを含有する 生物活性組成物が得られる。本発明の組成物の最終用途は、（遺伝子療法を含め て）コートされたコア粒子に付着させる特定のタンパク質、ペプチドまたは医薬 によってきまる。例えば、抗原活性を有するタンパク質またはペプチドを付着さ せて、免疫診断用手段として有用な組成物を提供することができる。免疫原性活 性を有するウイルスフラグメントまたはタンパク質のコーティングを付着させて ワクチンを提供することができる。また医薬を付着させて、疾患を治療するのに 有用な組成物を提供することができる。また、疾患を治療するのに有用な遺伝子 セグメントまたはアンチセンスフラグメントを付着させることもできる。 コートされたコア粒子に付着させることができる個々の触媒の例としては、組 織プラスミノーゲンアクチベーター（全領域と一部の 領域）；トリプシンインヒビター；シトクロム類；フェレドキシン；ホスホトラ ンスフェラーゼ；アシルトランスフェラーゼ；パパイン；ＬｙｓＣ；ＡｒｇＣ； トリプシン；凝固因子Ｖ，Ｘｌｌａ，Ｘｌａ，Ｖｌｌａ；補体因子Ｃ３，Ｃ３ｂ ；およびプロペルジンが挙げられる。 酵素−基質対のような生物学的に反応性の対（ＢＲＰ）もコートされたコア粒 子に付着させることができる。代表的な酵素−基質対としては、リゾチーム−キ チン対（この場合リゾチームがＮＡＭとＮＡＧのグリコシド結合の加水分解反応 を触媒する）；リボヌクレアーゼ−ＲＮＡ対（この場合リボヌクレアーゼがＲＮ Ａの加水分解反応を触媒する）；カルボキシペプチダーゼＡ−カルボキシル末端 ポリペプチド対（この場合、該酵素がポリペプチド連鎖中のカルボキシル末端ペ プチド結合の加水分解反応を触媒する）；セリン、亜鉛、チオールおよびカルボ キシルプロテアーゼ−タンパク質対（この場合プロテアーゼがタンパク質の分解 反応を触媒する）；ＮＡＤＨ−Ｑレダクターゼ−ＮＡＤＨ対（この場合該レダク ターゼがＮＡＤＨの酸化反応とＱの還元反応を触媒する）；グルタチオン−セダ クターゼ−グルタチオン対；アセチルコリンエステラーゼ−アセチルコリン対； ＬｙＣ；ＡｒｇＣ；アシルおよびアシルトランスフェラーゼ；アスパルテートお よびアスパルテートカルバモイルトランスフェラーゼ；エラスターゼ；ならびに シトクロム類がある。 本発明のコートされた固体表面上に固定化することができる他の生化学的に反 応性の対（ＢＲＰ）としては、免疫学的対、リガンド−受容体対、医薬−受容体 対、触媒−反応物対、触媒−基質対、アブソーベート−吸収剤対、アドソーベー ト−吸着剤対、および毒素−リガンド対のメンバーがある。このようなメンバー としては限定 されないが以下のものがある。 ・免疫学的対のメンバー：ＣＤ１，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ１１，ＣＤ２ ５，ＣＤ６８のような細胞上のエピトープ（細胞表面抗原）に対する認識部位を 有するＦＣまたはＦａｂフラクション中のような全体もしくは一部分のポリクロ ーナルまたはモノクローナルのＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＥおよびＩｇＤ； ＥＢＶｇｐ３５０，ＨＩＶｐ２４，ＨＩＶｇｐ１２０，ＭＳウイルスコートタン パク質（バクテリオファージ）他のウイルス抗原のようなウイルスエピトープ、 細菌抗原、真菌抗原ならびに公知のウイルス、真菌、細菌、プリオンおよび原虫 。 ・リガンド受容体対のメンバー：例えばレクチン類とＦＶｌｌｌ受容体のような レクチン結合部位；ＨＤＬとＨＤＬ受容体細胞受容体部位；エストロゲンのよう なホルモンとエストロゲン受容体部位；抗体類；リボソームタンパク質類；ＦＫ ５０６とＦＫ５０６の結合タンパク質；リシンと細胞標的；ホスホチロシン認識 領域ＳＨ２（ＲＳＶ）とホスホチロシン；ならびに（オリゴ）ヌクレオチドとそ れらの対応するアンチセンスヌクレオペプチド。 ・医薬−受容体対のメンバー：エピネフリンとアドレナリン性受容体、メタドン とオピエート受容体、アドリアマイシンなどのようなＤＮＡキレート剤。 ・触媒−反応物対のメンバー：例えば鉄とスーパーオキシド、ロドプシンキナー ゼとロドプシン、過酸化水素とルミノール、西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸 化水素。 ・吸着剤−アドソーベート対のメンバー：例えばトリプシン−トリプシンインヒ ビター、ビオチン−ビオチンリプレッサー（イー．コリ）およびズブチリシンと ズブチリシンインヒビター。 ・毒素−リガンド対のメンバー：例えばストリキニーネとグリシン受容体、ヘモ グロビンと一酸化炭素、およびオルガノホスフェート化合物類（サリン、タブン 、パラチオン、ジメフォックス、マラチオン、ジアジノン）とアセチルコリンエ ステラーゼ；ムスカリン受容体と神経毒［エス・ヘリアンタス（Ｓ．ｈｅｌｉａ ｎｔｈｕｓ）のサソリ神経毒由来の神経毒Ｉ］；ベロトキシン（ｖｅｒｏｔｏｘ ｉｎ）と結腸粘膜上皮受容体；エンテロトキシンと結腸粘膜上皮受容体。 ＢＲＰのメンバーの一方または両者が最初に改質表面に結合される。一般に酵 素または触媒がまず結合され、その後、基質または反応物が、酵素と基質または 触媒と反応物が実際に相互作用を行っている間に結合される。 ワクチンとして用いるデコイウイルスを製造する場合、直径が約１０〜２００ ナノメートルの粒子が好ましい。というのはこの粒径範囲内にある粒子はウイル ス中に一般にみられるＤＮＡおよびＲＮＡのコアの直径に一層密接に類似してい るからである。 触媒またはＢＲＰを固定するのに用いるコア粒子は、デコイウイルスに用いる 粒子よりはるかに広い粒径範囲のものでもよい。その粒径は、ＢＲＰの触媒反応 または酵素反応が最大になるよう選択しなければならない。好ましい粒径は５０ 〜１５０ｎｍの範囲内である。所望により、ＢＲＰはフィルムまたは固体の基材 の表面のような巨視的表面に付着させてもよい。 コア粒子などの表面は、金属またはセラミックを始めとする多種類の無機物質 で製造することができる。好ましい金属及び合金としては、ベリリウム、ケイ素 、ガリウム、銅、金、チタン、ニッケル、アルミニウム、銀、鉄、スチール類、 コバルトクロム合金類及びチ タン合金類がある。好ましいセラミック材料としては、燐酸カルシウム、アルミ ナ、シリカ及びジルコニアが挙げられる。コア粒子は炭素（ダイヤモンド）を含 む有機材料で製造することができる。好ましいポリマーとしては、ポリスチレン 、シリコンゴム、ポリカーボネート、ポリウレタン類、ポリプロピレン類、ポリ メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエステル類、ポリエーテル類及び ポリエチレンがある。 コア粒子は、ポリマーまたはセラミックを始めとする各種の生分解性材料で製 造することができる。好ましいセラミック材料としては、リン酸カルシウム二水 塩で構成されたブルッシャイト、ならびにリン酸三カルシウムと酸化鉄がある。 好ましい生物分解性ポリマーとしては、ポリラクチド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ ）、ポリガラクチド（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｉｄｅ）及びポリリシンがある。ブ ルッシャイトで製造した粒子が特に好ましい。 上記材料で製造され直径が１０００ｎｍ未満の粒子は市販されているか、また は溶液中で進行する核生成反応（コロイド反応）もしくは各種の物理蒸着法と化 学蒸着法例えばスパッタ堆積法（Hayashi,C.,J.Vac.Sci.Technol.）Ａ５（４） 巻、１３７５〜１３８４頁、１９８７年７月／８月；Hayashi,C.,Phisics Today ,４４〜６０頁、１９８７年１２月；MRS Bulletin、１６〜４７頁、１９９０年 １月）で製造することができる。分散（水中）凝集体の粒径が約１４０ｎｍの酸 化スズはVaccum Metallurgical Co.社（日本）から市販されている。望ましい組 成と粒径範囲を有する他の市販粒子は、Advanced Refractory Technologies,Inc .社（米国ニューヨーク州バッファロー所在）から入手できる。 プラズマ利用化学蒸着法（ＰＡＣＶＤ）は適切な微細粒子を製造 するのに用いられる多数の方法の一つである。ＰＡＣＶＤは比較的高い大気圧下 （１ｔｏｒｒ以上のオーダー）で行われ、直径が１０００ｎｍまでの粒子を製造 するのに有用である。例えば、直径が１０００ｎｍ未満の窒化アルミニウムの粒 子は、反応物としてＡｌ（ＣＨ3）3とＮＨ3を用いてＰＡＣＶＤ法で合成するこ とができる。ＰＡＣＶＤの装置は一般に、水平に取り付けられた石英管とこれに 付随するポンプ装置とガス供給装置を備えている。サセプタが石英管の中央に配 置され、６０ＫＨｚの無線周波数源を用いて加熱される。合成された窒化アルミ ニウムの粒子は石英管の壁上に集められる。Ａｌ（ＣＨ3）3の担体として窒素ガ スを用いる。反応室内のＡｌ（ＣＨ3）3：ＮＨ3の比率は、反応室中に入るＮ2／ Ａｌ（ＣＨ3）3とＮＨ3ガスの流量を変えることによって制御される。一般に反 応室内の圧力を１０ｔｏｒｒの一定圧力に維持して超微細のナノ結晶窒化アルミ ニウム粒子を堆積生成させる。ＰＡＣＶＤを使用して他の適切なナノ結晶粒子を 各種製造することができる。 コア粒子などの表面は、生物学的に関連する部位を変性するほど強固でない結 合を生じさせるのに充分なしきい表面エネルギーを粒子などの表面に与える物質 でコートする。粒子の場合、コーティングは分散された表面改質剤を含有する溶 液中に粒子を懸濁することによって実施することが好ましい。コーティングは、 粒子の表面を、タンパク質またはペプチドが一層付着し易いようにすることが必 要である。表面に対してコーティングは、表面上の綿密に清浄な領域に塗布され る。 本発明の適切なコーティング物質としては、炭水化物、炭水化物誘導体、及び −ＯＨ（ヒドロキシル）側基が豊富であることを特徴とする炭水化物様成分を有 する他の巨大分子がある。これらのコー ティングとしては限定されないが以下のようなものが挙げられる。 ・短連鎖炭水化物類：例えばグルコース、スクロース、セロピオース、ナイスト ース、トリオース、デキストロース、トレハロース、グルコース、ラクトース、 マルトースなど。 ・ヒドロキシルリッチ弱酸類：例えばシトレート、フマレート、スクシネート、 イソシトレート、オキサロアセテート、マレートなど。 ・炭水化物またはホスフェートの側基を有するヌクレオチド様分子類：例えばピ リドキシル−５−ピロホスフェート、チアミンピロホスフェート、ウリジンジホ スフェート−グルコース、グルコース−１−ホスフェート、アデノシン、ニコチ ンアミド−アデニン−ジホスホスフェートなど。 ・炭水化物の誘導体：例えばニトロセルロース。 ・複合高分子炭水化物と誘導体：例えばデキストラン、グリコーゲンなど。 好ましいコーティング材料としては、セロビオース、スクロース、ピリドキシ ル−５−ホスフェートおよびシトレートが挙げられる。 安定化コートを固相に結合させ次にＢＲＰのメンバーを結合させる代表的な好 ましい方法は下記のステップで構成されている。 １． コートする固体に綿密に清浄な表面を得る。； ２． コートされる綿密に清浄な表面をコーティング材料の水溶液中に浸漬し； 続いて ３． その固体の表面から水性溶媒／分散剤を凍結乾燥し； ４． コートされた固体表面を、生化学的に反応性の対（ＢＲＰ）のメンバーを 含有する水溶液／分散液中に浸漬し；次いで ５． 水性溶媒を除去して、ＢＲＰのメンバーが結合されている分子安定化皮膜 でコートされた固体を得る； ステップで構成されている。 用語”綿密に清浄な表面”は上記ステップ１で用いいる場合、コートされる固 体の大部分を構成する材料に固有のものではないすべての物質が洗浄された材料 の表面を意味する。ある組成Ａの固体が、ある組成Ｂの第二の固体ですでにコー トされており、そして分子安定化皮膜を組成Ｂの表面に塗布したい場合、上記用 語は表面Ｂと、Ｂの大部分を構成する材料に固有の物でないものを意味する。こ のような方法としては、予め成形した表面に酸類、塩基類、音波エネルギー、プ ラズマグロー放電プロセスおよび機械的洗浄さえも個々にまたは組み合わせて適 用する方法がある 用語”浸漬”は上記ステップ２で用いる場合、コーティングされる表面に溶液 の隣接層を適用することを意味する。噴霧、ディッピング、機械的塗布などの転 写する手段のような方法も、コートされる表面に、溶媒とコーティング巨大分子 のみからなる隣接層を提供する限り、用語”浸漬”に含まれる。 ”凍結乾燥”という用語は上記ステップ３で用いる場合、周囲の気体の分圧を 低下させることによって、表面皮膜から水性相を除くことを意味する。固体と新 しく形成する表面皮膜に熱を加え、次に熱を除いて冷却する方法は凍結乾燥法の 変形である。 用語”浸漬”は上記ステップ４で用いる場合、コートされた固体のすでに改質 された表面にＢＲＰのメンバーを含有する溶液の隣接層を適用することを意味す る。噴霧、ディッピング、機械的塗布などの転写する手段のような方法も、コー トされる分子安定化被膜からなるすでに改質された表面に溶媒とＢＲＰのメンバ ーのみからなる隣接層を提供する限り、用語”浸漬”に含まれる。 用語”除去”は上記ステップ５で使う場合，（ａ）周囲の気体の 分圧を下げるか（凍結乾燥）または（ｂ）透析／限外濾過を行うことによって表 面被膜から水性相を除去することを意味する。固体と新しく生成してくる表面被 膜に熱を加え次いで熱を除いて冷却する方法は、凍結乾燥法の変形である。 粒子の場合、粒子はコーティング溶液中に懸濁させる。コア粒子が懸濁される コーティング溶液は、例えば１〜３０ｗ／ｖ％のコーティング材料を含有してい る。溶質は２回蒸留した水（ｄｄＨ2Ｏ）が好ましい。コーティング溶液中に懸 濁されるコア粒子の量は、粒子の種類と大きさによって変わる。一般に０．１〜 １０ｗ／ｖ％含有している懸濁液が適している。約１ｗ／ｖ％の粒子の懸濁液が 好ましい。コア粒子は、粒子の均一なコーテイングを提供するのに充分な時間、 コーティング溶液中に分散状態で保持される。音波処理は、分散状態を保持する のに好ましい方法である。粒子に適切なコーティングを付与するには、室温で３ ０分間〜数時間の範囲の分散時間で通常充分である。コーティングの厚みは５ナ ノメートル未満が好ましい。最終のコア粒子が粒子表面の実質的に全体にわたっ て均一なコーティングを有しているならば、コーティングの厚みは変えることが できる。 粒子は、コーティングを行った後、懸濁液から分離し、将来使用するために貯 蔵するかまたは粒子に付着させるタンパク質またはペプチドを含有する溶液中に 再び分散させる。あるいは、コートされた粒子を懸濁液中に残しておいて、その 後、所望のタンパク質またはペプチドを付着させる処理をしてもよい。 用語”生物分解性”はここで用いる場合、哺乳類の生体内環境に長期間暴露さ れた後、分解するかさもなければ破壊するコア粒子を意味する。コア粒子は生物 分解性であるためには、身体内に導入さ れてから数週間以内に実質的に破壊されなければならない。 コートされた粒子に塗布されるタンパク質またはペプチドは、多種類のタンパ ク質またはペプチドから選択することができる。ワクチンが要求される場合、こ れらタンパク質またはペプチドは、抗原性を有するものが好ましい。そのタンパ ク質は、選択されたウイルス由来のウイルスタンパク質外被またはその免疫原性 部分でよい。ウイルスタンパク質外被は、ウイルスタンパク質を単離し分離する 公知の分離法によって単離される。ウイルス外被は、ウイルスの抗原活性がどこ に位置しているのか知られているので好ましいタンパク質である。一般に、ウイ ルスは消化されるかまたは可溶化されてウイルスタンパク質の混合物を生成する 。このウイルスタンパク質を次に液体クロマトグラフィーなどの便利な方法で各 種のタンパク質粒子の画分に分離し、次いで透析して不純物を除く。 ウイルスタンパク質粒子を分離し単離することができる適切なウイルスとして は、エプスタイン・バールウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト乳 頭腫ウイルス、単独ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスが挙げられる。ま た多種類の抗原タンパク質材料の製剤が、Micragene Systems,Inc.社（米国 ０ ６５１６ コネティカット州、ウェストヘーブン、フロンテージ・ロード ４０ ０）、Amgen Corporation社（米国 ９１３２０−１７８９ カリフォルニア州 、サウザンドオークス、オーク・テラス・レーン １９００）、Cetus Corporat ion社（米国 ９４６０８ カリフォルニア州、エメリービル、５３ストリート １４００）およびAdvanced Biotechnology,Inc.社（米国メリーランド州、コ ロンビア）のような供給会社から購入できる。天然に存在するウイルス粒子に対 応する合成のペプチドおよび／またはタンパク質も利用できる。 ＨＩＶについては、免疫応答を引き出すことが分かっているウイルスフラグメ ントのいずれかを使用できる。適切なウイルスフラグメントとしては、ｇｐ１２ ０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１およびコアタンパク質類（ｐ２４）がある。組換え法 を含めてＨＩＶフラグメントの公知の製造方法のいずれかを使用できる。 付着させることができる、生物活性を有する他のタンパク質とペプチドとして は、酵素類、ホルモン類、輸送タンパク質類および保護タンパク質類がある。医 薬のアムホテリシン、タキソールおよびインスリンに加えてヒト血清トランスフ ェリン、プラスミノーゲンアクチベータおよび凝集因子類が具体例である。 コア粒子のコーティングに抗原などのタンパク質を付着させる方法には、抗原 を含有する水溶液中にコートされたコア粒子を懸濁させることが含まれる。粒子 表面に優先的に付着する物質が溶液中に存在すると不利なことが多い。例えば溶 液中に存在する分散剤は、タンパク質が付着する前に、懸濁粒子上に望ましくな りコーティングを生成することがある。メタノールまたはエタノールのような水 と混和可能な溶媒を使用できる。コートされた微細粒子を含有する水溶液は、粒 子を均一に懸濁させるように充分撹拌する。一般に、溶液中の粒子の量は約０． ５ｍｇ／ｍｌ溶液〜５ｍｇ／ｍｌ溶液である。音波処理は、コートされた粒子を 溶液中に均一に懸濁させる好ましい方法である。 コートされた粒子と抗原の懸濁液は、タンパク質が付着し自己集合（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を起こすにはパラメータ値が特定の範囲内でなければなら ない。粒子含有溶液の温度は１℃〜４５℃でなければならない。特定のタンパク 質と医薬は、蒸留水中で、コートされた粒子に結合させることができる。コート された粒子と、 蒸留水中では不安定であるかまたは容易に分散しないタンパク質および他の医薬 との反応を行わせるために、溶液に塩類を点火してもよい。一般に、その塩溶液 はイオンバランス（ｉｏｎｉｃ ｂａｌａｎｃｅ）（ｍＭで示す）が以下の限度 を超えないよう調合しなければならない。即ちＫ＝３００〜５００；Ｎａ＝３０ 〜７０；Ｃｌ＝４０〜１５０；Ｃａ＝０．０００３〜０．００１；およびＭｇ＝ ０．０００３〜０．００１である。溶液の酸素テンション（Ｏｘｙｇｅｎ ｔｅ ｎｓｉｏｎ）は、最初ヘリウムで分散され次にヘリウム、窒素及び二酸化炭素で ガス処理した溶液中１０％未満が有利である。溶液のｐＨは、わずかに酸性（血 液に比べて）のｐＨが有利であり、ｐＨ値は６．８〜７．２が好ましい。コート された微細粒子を分散させタンパク質を付着させるのに用いる代表的な溶液は、 ０．０３６０ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ4、０．０６０ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ 、０．０４４１ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２２．８２３ｇ／ＬのＫ2ＨＰ Ｏ4，１３．６０９ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、７．４５５ｇ／ＬのＫＣｌおよび４． １０１ｇ／Ｌの酢酸ナトリウムを含有する水溶液である。この水溶液のｐＨは６ ．８に調整される。 タンパク質を付着させた、コートされた粒子コアは、イオン成長媒体（ｉｏｎ ｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）から分離してその後使用するために貯蔵す ることができる。このコートされた粒子は、抗原化合物または抗体を貯蔵するの に一般に用いられる従来の方法のいずれかによって貯蔵することができる。例え ばそのコートされた粒子は凍結乾燥するかまたは相容性溶液の懸濁液として貯蔵 することができる。ウイルスタンパク質外被でコートされた粒子は、ワクチンと して使用される場合、従来の手順にしたがって個体に注射されるかまたは他の方 法で投与される。コートされた粒子を個体 に投与する場合、医薬として許容される坦体の溶液または他の化合物を使用でき る。タンパク質をコートされた粒子は、生体外で診断を目的として使用する場合 、溶液中に懸濁させ、他の抗原化合物と同じ方式で使用される。タンパク質をコ ートされた粒子を抗体を生成させるため使用する際に同じことが当てはまる。抗 体を調製するため抗原を用いる公知のプロトコルと手順と同じプロトコルと手順 を用いるが、通常用いられる抗原化合物の代わりに本発明のタンパク質をコート された粒子が用いられる。 コートされた粒子と付着させた生物活性物質のターゲティングを行いたい場合 、粒子を、特定の細胞上の受容体と反応性の標的リガンドまたはリン脂質の膜複 合体でコートする。代表的な標的リガンドとしては、ＨＩＶのコートタンパク質 類（ｇｐ１６０，４１，１２０）、コロナウイルスのコートタンパク質類、ＥＢ Ｖのコートタンパク質類（ｇｐ３５０）が挙げられる。膜結合リガンド／受容体 を使用することができる。これらのリガンド類は、上記の生物活性物質を付着さ せるのと同じ方法で粒子複合体に付着させる。 生物分解性ナノ結晶粒子と結合された物質をコートするのに用いられる脂質も 、リポソームを製造するのに通常使用するのと同じ脂質でよい。適切な脂質とし ては、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびホスファチジルセリンなど のリン脂質がある。またこれらの脂質は天然の起源から直接誘導することもでき る。このような脂質としては、ウイルス膜などの脂質に結合した生化学的に反応 性の対がある。その脂質層は、米国特許第５，３０６，５０８号に記載されてい る代用赤血球（Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）と同じ方 法でナノ結晶コア粒子に付与し、生物活性物質に結合させる。 コア粒子および結合された物質は全体を脂質層で覆う必要はない。粒子をコー トするのに用いられる脂質の量は、好ましくは全粒子を覆うのに充分な量である 。 特別の場合、生化学的に活性な物質を生物分解性コア粒子に直接付着させるこ とが望ましい。この直接付着は、生物分解性コア粒子を生化学的に活性な物質と ともに共結晶化させることによって行うことが好ましい。例えば、インスリン、 タキソールまたは（ＤＮＡ、ＲＮＡ）遺伝子フラグメントをブルッシャイトとと もに共結晶化させて、医薬を生体内で保護しながら医薬を徐々に放出する医薬負 荷粒子を製造することができる。この直接付着させる方法は生物活性を低下させ る。 また本発明には、ＤＮＡまたはＲＮＡを生体内または生体外で細胞に送達する すなわち細胞にトランスフェクトする手順と方法に対して広い用途がある。これ らの用途分野に遺伝子療法がある。本発明の組成物は、生体内及び生体外の環境 内で特定の細胞型を標的としてＤＮＡまたはＲＮＡを向かわせる必要がある他の 広範な用途に用いることができる。また本発明は、アンチセンスフラグメントな どの他のトランスフェクション物質を標的に向かわせるのに用いることができる 。”トランスフェクション物質”という用語は、本明細書で用いる場合、細胞中 にトランスフェクトすることができるＤＮＡもしくはＲＮＡのセグメントまたは アンチセンスフラグメントを意味するものとする。代表的なトランスフェクショ ン物質としては、センスＤＮＡ、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびアン チセンスＤＮＡが挙げられる。 本発明の組成物は、ナノ結晶コア粒子にタンパク質、ペプチドまたは医薬が結 合するのを促進する表面エネルギー改質層でコートさ れたナノ結晶コア粒子（直径が１０００ｍｍ未満）を含有している。このコーテ ィングは、ＤＮＡとＲＮＡのセグメントを、活性を有意に失うことなくまたは変 性することなくコア粒子に付着させることができるように、ナノ結晶コア粒子の 表面エネルギーを改変する。その結果、生化学的に不活性なコアを含有する生化 学的に活性な組成物が得られる。本発明の組成物の最終用途は、コートされたコ ア粒子に付着させた特定のトランスフェクション物質によって決まる。例えばヒ トの低密度脂質受容体のようなＤＮＡセグメントは遺伝子療法に使用される。ア ンチセンスＭＲＮＡとセンスＭＲＮＡのようなＲＮＡセグメントはトランスフェ クション法に用いられる。ＨＩＶ逆転写酵素のようなアンチセンスフラグメント はトランスフェクション粒子に使用される。好ましい粒径は１０ｎｍ〜１５０ｎ ｍのオーダーである。 コア粒子とコーティングは先に述べたのと同じものである。その粒子はコーテ ィングの後、懸濁液から分離し、将来使用するために貯蔵するかまたは粒子に付 着させるＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する溶液中に再度分散させる。あるいは、 コートされた粒子を懸濁液中にに残して、その後に所望のＤＮＡまたはＲＮＡを 付着させる処理を行ってもよい。 コア粒子は生物分解性のセラミックまたはポリマーで製造することができる。 用語”生物分解性”は、ここで用いる場合、哺乳類の生体内環境に長期間暴露さ れた後、分解するかまたは他の方式で破壊するコア粒子を意味する。生物分解性 であるためには、コア粒子は、身体に導入されてから数週間以内に実質的に破壊 されなければならない。ブルッシャイトが好ましい生物分解性コア粒子の材料で ある。 コートされた粒子に塗布されるＤＮＡまたはＲＮＡは、遺伝子療法を行ってい る際に細胞とトランスフェクトするのに用いる広範囲のＤＮＡまたはＲＮＡのセ グメントから選択することができる。アンチセンスフラグメントも使用できる。 代表的なトランスフェクション遺伝子セグメントとしては、ヒト低密度脂質受 容体ＣＤＮＡ、ヒトアデノシンデアミナーゼＣＤＮＡ，ヒトジストロファンＣＤ ＮＡおよびアンチセンスＨＩＶ逆行ＤＮＡ（antisense ＨＩＶ reversed Ｄ ＮＡ）があり、これらはすべて適切な発現ベクター中にサブクローン化される。 ＤＮＡもしくはＲＮＡのトランスフェクションセグメントは、Manniatis，T.，F ritsch,E.F.,およびSambrook,S.,Molecular Cloning,"，Cold Spring Laborator y Press,米国、ニューヨーク州、１．０〜１９．０、１９８９年に記載されてい る方法のような公知の方法にしたがって製造することができる。遺伝子セグメン トもいくつかの異なるメーカーから市販されている。 コア粒子上のコーティングに対して遺伝しセグメントもしくはアンチセンスフ ラグメントを付着させる方法は、コートされたコア粒子を、遺伝子セグメントを 含有する水溶液中に懸濁させて行われる。粒子の表面に優先的に付着する物質が 溶液中に存在していると不利な場合が多い。例えば、溶液中に存在している分散 剤は、タンパク質が付着する前に、懸濁粒子上に望ましくないコーティングを生 成することがある。メタノールまたはエタノールのような水と混和可能な溶媒が 使用できる。コートされた微細粒子含有水溶液は該粒子を均一に懸濁させるため 十分に撹拌する。一般に溶液中の粒子の量は約０．５ｇ／ｍＬ溶液〜５ｍｇ／ｍ Ｌ溶液である。音波処理は、コートされた粒子を溶液中に均一に懸濁させるのに 好ましい方法で ある。 コートされた粒子と遺伝子セグメントの懸濁液は、セグメントの付着と自己集 合を起こすには特定のパラメータ値の範囲内でなけらばならない。粒子含有溶液 の温度は１℃〜４５℃でなければならない。遺伝子セグメントまたはアンチセン スフラグメントは蒸留水中で、コートされた粒子に結合させることができる。溶 液の酸素テンションは、最初のヘリウムで分散され次にヘリウム、窒素および二 酸化炭素でガス処理した溶液中１０％未満が好ましい。その溶液のｐＨは、（血 液に比べて）わずかに酸性であることが好ましく、ｐＨ値は６．８〜７．２が好 ましい。コートされた微細粒子を分散させ、ＤＮＡを付着させるのに用いる代表 的な溶液は、０．０３６０ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ4、０．０６０９ｍｇ／ＬのＭｇ Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０４４１ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、２２．８２３ｇ ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、１３．６０９ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、７．４５５ｇ／ＬのＫｃ ｌ、および４．１０１ｇ／Ｌの酢酸ナトリウムを含有する水溶液である。この溶 液のｐＨは６．８に調節される。 遺伝子セグメントまたはアンチセンスフラグメントが付着した、コートされた 粒子コアは、イオン成長媒体から分離してその後に使用するため貯蔵することが できる。そのコートされた粒子は、遺伝子セグメントまたはアンチセンスセグメ ントを貯蔵するのに一般に用いられている従来の方法のいずれかで貯蔵すること ができる。例えばコートされた粒子は凍結乾燥するかまたは相溶性溶液による懸 濁液として貯蔵してもよい。遺伝子療法で使用する場合、下記のようにしてター ゲティング層でコートした粒子は、従来の手順にしたがって、個体に注射するか または他の方法で投与する。ＤＮＡ／ＲＮＡでコートされた粒子を個体に投与す るのに、医薬として許容さ れる坦体の溶液または他の化合物を用いてもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡをコートされ た粒子は、生体外で用いられる場合、溶液中に懸濁させ、他の遺伝子療法の化合 物の場合と同じ方式で使用される。アンチセンスでコートされた粒子を使用する 場合に同じことが当てはまる。生体内と生体外で遺伝子を細胞中に導入する遺伝 子療法の公知のプロトコルと手順と同じプロトコルと手順が用いられるが、本発 明のＤＮＡ／ＲＮＡ／アンチセンス粒子構造体を他の遺伝子療法用化合物の代わ りに使用する。 コートされた粒子および付着させた遺伝子サポートもしくはアンチセンスフラ グメントのターゲティングは、特定の細胞上の受容体と反応性のリガンドを含有 するリン脂質膜複合体で粒子をコートすることによって達成される。代表的な標 的リガンドとしては、ＨＩＶのコートタンパク質類（ｇｐ１６０，４１，１２０ ）、コロナウイルスのコートタンパク質類、ＥＢＶのコートタンパク質類（ｇｐ ３５０）が挙げられる。膜結合リガンド／受容体を使用することができる。これ らのリガンド類は、上記のトランスフェクション物質を付着させるのと同じ方法 で粒子複合体に付着させる。 生物分解性ナノ結晶粒子および結合されたトランスフェクション物質をコート するのに用いられる脂質は、リポソームを製造するのに通常用いられるのと同じ 脂質である。適切な脂質としては、ホスファチジルコリン、コレステロールおよ びホスファチジルセリンなどのリン脂質類がある。その脂質層は、他のコーティ ング類を塗布するのと同じ方式ですなわち表面に吸着させることによって、ナノ 結晶コア粒子に塗布されかつ生物活性物質に結合される。 コア粒子および結合された物質は完全に脂質層で覆う必要はない。粒子をコー トするのに使用する脂質の量は全粒子をコートするのに 充分な量が好ましい。脂質とターゲッティングリガンドを結合させた層は、コア 粒子および付着させた遺伝子セグメントに、対応する細胞受容体を標的として向 かわせるためのものである。 好ましいトランスフェクションナノ粒子は、ナノメートルの大きさで一般に１ ００ｎｍのオーダーの粒子の自己集合性複合体であり、トランスフェクティング ＤＮＡまたはＲＮＡの内層とターゲッティング分子の外層を備えている。ターゲ ッティング分子は、通常リガンドと呼ばれているが、ウイルスがその宿主を見い だすのと同じ方式で組織特異性を付与する機能がある。すなわちリガンドは、細 胞表面の受容体分子に結合することによって、トランスフェクションナノ粒子が 細胞表面に会合するのを促進する。 トランスフェクションナノ粒子の機築は単純なプロセスであり、明らかな共有 結合の変化なしで自発的に行われる。代表的な一合成例では、リン酸三カルシウ ム（ＴＣＰ）のナノ粒子の分散液を０．７５０Ｍの塩化カルシウムと０．２５Ｍ の一塩基性のリン酸ナトリウムの等容対向流（isochoric opposing stream）で 製造する。得られた沈澱物を室温で３０分間１７５ワットで音波処理し次に大量 の２０ｍＭリン酸緩衡液（ｐＨ６．８０）で洗浄した後、塩化セシウムで精製し たトランスフェクティングＤＮＡ，ＲＮＡおよびアンチセンスをゆるやかに攪拌 しながら室温で粒子表面に吸着させる。トランスフェクション物質を付着させる ステップが完了した後、一般にレトロウイルスのエンベロープから製造される膜 特異的リガンドを上記分散液に添加して、攪拌セル（ｓｔｉｒ ｃｅｌｌ）中、 ４．０℃で一夜吸着させる。 リガンド受容体複合体は、標的の組織に対して独特のものであるように選択さ れる。というのは、組織は、そのコンポネント細胞、 細胞表面受容体および相補的リガンドによって区別できるからである。相互作用 が起こると、トランスフェクションが、細胞取り組み構造によって進行して、標 的細胞内で、ＤＮＡ（ＲＮＡ／アンチセンス）が粒子複合体から溶出し組み換え られ発現する。ＤＮＡ，ＲＮＡまたはアンチセンスをこの方法で導入すると、標 的の組織内の特定の細胞の表現型を変えることができるようになる。それは、使 用されるリガンドの配座の安定性、トランスフェクティングＤＮＡ ＲＮＡ／ア ンチセンスの組込み遺伝子座、および標的の組織中でのトランスフェクティング ＤＮＡ（ＲＮＡ／アンチセンス）の発現性能によって起こる。 リガンドの製造方法はその起源と同様に多様である。リガンドは組換え法によ って製造するかまたはその天然起源から誘導することができる。ウイルスエンベ ロープのリガンドは、ヒト免疫不全ウイルス、エプスタイン−バールウイルスお よびマウスのエコトロピックウイルス株などのウイルスから抽出することが好ま しい。一般にウイルスエンベロープは公知の方法で抽出され次いでリン酸緩衡液 中でリン脂質と混合する。得られたウイルスエンベロープとリン脂質の溶液を、 ＤＮＡ／ＲＮＡでコートされたナノ粒子の懸濁液中に添加する。ウイルスエンベ ロープとリン脂質はナノ粒子に吸着されてターゲッティング膜を形成する。 トランスフェクションナノ粒子の典型的な製剤は、時間の経過とともに分光測 定法で測定して、約０．１μｇ／μｌ分散液の濃度のＤＮＡ（およびＲＮＡ）で 得られる。高濃度が必要な場合は、ＤＮＡ（およびＲＮＡ）を基質溶液（ｓｕｂ ｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とプレミックスし、次いでｐＨ６．５でコア 材料とともにゆっくり共沈させる。粒径は、膜リガンドを時間をおって添加して 表面に吸着させそして基質を限外濾過・透析で除去することによって制御する。 選択された合成ルートとは関係なしに、トランスフェクションナノ粒子は経腸お よび非経口のルートで投与される。その投与量は遺伝子療法で使用する投与量と 同じである。 本発明のナノ粒子−ＤＮＡ／ＲＮＡ構造体は、受容体依存性ターゲッティング が必要でない場合、ターゲッティング層なしで製造することができる。例えば、 該構造体は、ＤＮＡ／ＲＮＡのカルシウムチャンネル取り組みなどの非細胞受容 体取り組みが所望の場合、ターゲッティング層なしで製造することができる。こ れら構造体は大きさが小さいので網状内皮系をかいくぐることができ、循環時間 が増大しトランスフェクションの効力が高まる。 下記の実施例によって本発明の特定の態様を一層詳細に説明するが、これら実 施例は本発明を限定するものではない。実施例１．ナノ結晶酸化スズ微細粒子の製造 １．５〜２．０ｍｇの超微細（ナノ結晶）金属粉末を、１．５ｍｌの２回蒸留 水（ｄｄＨ2Ｏ）が入っている１．７ｍｌのねじ蓋付き微量遠心分離器中に入れ た。そのｄｄＨ2Ｏは、すすいだ０．４５ミクロンのフィルターによる濾過滅菌 装置またはアクロディスク（ａｃｒｏｄｉｓｃ）（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ社）で濾過した。金属粉末は平均直径（先子相関分光法による）が１４ ０ｎｍの酸化スズであった。その混合物を３０秒間、渦巻き攪拌を行い次いで音 波処理水浴中に一夜入れた。その音波処理浴の温度は６０℃に固定した。２４時 間音波処理した後、試料をさらに一回３０秒間渦巻き攪拌を行い得られた分散液 を約１６０００ｒｐｍで１５秒間微量遠心分離に付して透明にした。粒径の分析 はＣｏｕｌｔｅｒ Ｎ４ＭＤサブミクロン粒子分析器で行った。 酸化スズ粒子を、セロビオースの原液中に懸濁させることによって該粒子にコ ーティングを付与した。セロビオースの原液は、９００ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中に、 １．０００ｇのセロビオースを溶解することによって調製した２９２ｍＭ溶液で あった。迅速に溶解させるため、溶解は約７０℃で行った。得られたセルビオー ス溶液は、すすいだ０．４５ミクロンのフィルターによって濾過滅菌を行い、最 終容積を調節して１０．００ｍｌにした。 充分な量のセロビオース原液を、１５０μｌの超微細酸化スズ分散液に添加し て酸化スズの最終濃度を１．００ｗ／ｖ％すなわち２９．２ｍＭにした。製剤の 一般的な容積は２．０ｍｌであったが、これをマイクロピペッタを用いて４〜５ 回混合した。混合後、その分散液を２時間平衡化させた。粒子のコーティングに 成功していることは、粒子（コートしたものと未コートのもの）の移動度をＣｏ ｕｌｔｅｒ ＤＥＬＳＡ ４４０ドップラーエネルギー光散乱分析器で測定する ことによって実証した。コートされた酸化スズ粒子は、未コート酸化スズ粒子に 比べて低い移動度を示した。また各種の希釈塩濃度で測定を行って、移動度の測 定値が間違いではないことを確かめた。これらの試験結果は、粒子がセロビオー スでコートされたことを実証している。 次にこのコートされた粒子を用いて、抗原のタンパク質、ペプチドまたは医薬 を付着させて生物学的に反応性の粒子を製造する。実施例２．ナノ結晶酸化ルテニウム粒子の製造 酸化ルテニウム微細粒子を酸化スズ粒子の代わりに用いることを除いて同じ手 順を実施例１にしたがって実施した。酸化ルテニウム粒子はTacuum Metallurgic al Company（日本）から入手した。実施例３ ナノ結晶の二酸化ケイ素と酸化スズの粒子の製造 ナノ結晶二酸化ケイ素はAdvanced Refractory Technologies，Inc.社（米国ニ ューヨーク州バッファロー所在）から購入し、酸化スズはVaccum Metallurgical Co.社（日本）から購入した。またこの酸化スズ粒子は、スズをアルゴン−酸素 混合物中で反応性蒸着法によって製造し、冷却基板上に集めたものである。また ナノ結晶酸化スズはＤ．Ｃ．反応性マグネトロンスパッタリング法（逆転カソー ド）でも合成された。高純度のスズの３”直径の標的を、アルゴンと酸素の高圧 ガス混合物中でスパッタした。そのガス相中に生成した超微細粒子を、流動液体 窒素を用いて７７°Ｋに冷却した銅管上に集めた。全物質について、Ｘ線回折結 晶学法、透過型電子顕微鏡法、光子相関分光法およびドップラー電気泳動光拡散 分析法によって特性解析を行った。Ｘ線回折用の試料は、２倍の大きさのスコッ チテープを用いて粉末をスライドガラス上に置くことによって調製した。Ｎｏｒ ｅｌｃｏ自動回折装置で、Ｃｕｋａ線を用いた。得られたスペクトルを酸化スズ のＡＳＴＭ標準データ（Powder Diffraction File，Card ♯21-1250，Joint Com mittee on Power Diffraction Standards，American Society for Testing and Materials，米国フィラデルフィア、１９７６年）と比較した。２２−プロパノ ールによる（ＵＦＰ）の分散液中にディッピングを行うことによって標準の３ｍ ｍ直径の炭素でコートされた銅メッシュ上に（ＴＥＭ）の試料を集めた。これら の試料を６０〜８０ＫＶの加速電圧下にて、ＪＥＯＬ−ＳＴＥＭ１００ＣＸで検 査した。 これらの金属酸化物の作用分散液を作製するため、１．５〜３．０ｍｇの金属 酸化物の粉末を、ダストがないねじ蓋つき微量遠心分離管（Ｓａｒｓｔｅｄ社） 中の１．５ｍｌの２回蒸留蒸留水に添加し、３０秒間渦巻き撹拌を行った。得ら れた混合物を１６〜２４時 間音波処理に付し続いて２回目の３０秒間の渦巻き撹拌を行った。次に、微細粒 子を、１６，０００ｘｇで１５秒間微量遠心分離に付してペレット化することに よってサブミクロン画分を単離した。次に約１．３ｍｌの上澄み液を取り出し、 別のダストがないねじ蓋付き微量遠心分離管中に入れた。５０〜１００μｌの分 散液を取り出し、ポリスチレン製キュベット中に入れ、ｄｄＨ2Ｏで希釈して最 終容積を１．００ｍｌにすることによって、光子相関分光法（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ４ＭＤ）とドップラー電気泳動光散乱法（Ｃｏｕｌｔｅｒ ｄｅｌｓａ ４４ ０）用の試料を調整した。その分散液の安定性は、２４時間の期間にわたって連 続して測定することによって測定した結果安定であることが分かった。溶媒の漸 増塩分（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓａｌｉｎｉｔｙ）（導電性の増大）に関連 する分散液の安定性も同様の測定した。安定性は溶媒の漸増塩分によって向上し た。 予めすすいだ５×１０5の分子量カットオフ型Ｆ膜（Ｓｐｅｃｔｒａ社）を取 り付けた１５．０ｍｌ容量の限外濾過撹拌セル（Ｓｐｅｃｔｒａ社）中の８．０ ０ｍｌのｄｄＨ2Ｏと１．００ｍｌの２９．２ｍＭセロビオース原液に、１．０ ０ｍｌの上記分散液を混合して撹拌した。次に試料を１５分間撹拌した。撹拌後 、１０．０ｍｌ／ｍｉｎを超えない流量にて、ぜん動ポンプで２５０ｍｌのｄｄ Ｈ2Ｏをセルチャンバーを通じてフラッシュすることによって過剰のセロビオー スを除去した。洗浄後、炉液を、加圧窒素ガスによって約１．０ｍｌまで濃縮し た。処理された分散液５００μｌを取り出し、Ｎ４ＭＤ分析法によって特性を解 析した。平均分散直径はこのステップで再度測定した。コートされた粒子の分散 液の安定性は２４時間にわたって連続して測定して求めた。溶媒の漸増塩分（導 電性の増 大）に関連するコートされた粒子の分散液の安定性も同様に測定した。 得られた、コートされたナノ結晶粒子は各種のタンパク質、ペプチド及び医薬 を付着させるのに適している。実施例４ Ｐ５Ｐでコートされたリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）ナノ結晶粒子の 製造 １．２個の６０ｃｃシリンジおよび１個のＴ−Ｌｕｅｒロックを用いて、カッ プソニケーター内の１２０ｍｌ医薬びん中に５０ｍｌの０．７５ｍＣａＣｌ2と ５０ｍｌの０．２５ｍＮａ2ＨＰＯ4を注入する。室温で３０分間音波処理を行っ てＴＣＰ粒子の懸濁液を製造する。 ２．上記ＴＣＰ製剤を、３０００Ｔｐｍで１５分間バクットローターを用いて 遠心分離器で遠心分離して未反応成分を除く。 ３．得られたＴＣＰ粒子を５０ｍｌのＨＰＬＣグレードの水中に再度懸濁させ 充分混合する。３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行う。このステップを３回 （×３）繰り返す。 ４．１．０ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌピリドキサル−５−ホスフェート（Ｐ５Ｐ ）を添加し、次いで室温にてロッカーアームで３０分間インキュベートする。 ５．一夜、凍結乾燥する。 ６．上記Ｐ５Ｐ−ＴＣＰ製剤を、５０ｍｌの０．１ｎ水酸化ナトリウム溶液中 に再度懸濁させる。充分混合する。３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。こ れによって過剰のＰ５Ｐが除かれる（全炭水化物に対しては、このステップで終 わるべきではないであろう。遠心分離とこれに続いて洗浄ステップを行うことが 適切であろう）。 ７．５０ｍｌのＰＢＳ中に再度懸濁させ次に３０００ｒｐｍで１ ５分間遠心分離する。ステップ８を３回（×３）繰り返す。これによって水酸化 ナトリウムが除かれる。 ８．ペレットを５０ｍｌのＨＰＬＣグレードの水中に再度懸濁させ次に３００ ０ｒｐｍで１５分間遠心分離する。ステップ９を３回（×３）繰り返す。これに よってＰＢＳが除去される。 ９．得られたペレットを４．０ｍｌのＨＰＬＣグレードの水中に再度懸濁させ 、１．０ｍｌの１００ｍＭクエン酸ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．２にする 。 １０．室温で１５分間音波処理を行い、生化学的に活性な物質がすぐに付着で きる粒子の懸濁液を調製する。実施例５ セロビオースでコートされたＴＣＰナノ結晶粒子の製造 セロビオースをＰ５Ｐの代わりに用いることを除いて実施例１に記載したのと 同じ手順を実施した。このセロビオースのコーティングは、粒子をセロビオース の原液中に懸濁させることによって、粒子に付与する。セロビオースの原液は、 １．０００ｇのセロビオースを９．００ｍｌのｄｄＨ２０に溶解することによっ て調製した２９２ｍＭ溶液である。迅速な溶解を促進するため、溶解は約７０℃ で実施した。得られたセロビオース溶液は、すすいだ０．４５ミクロンフィルタ ーで濾過滅菌を行い、最終容積を１０．００ｍｌに調節する。 充分な量のセロビオース原液を、１５０μｌの超微細生物分解性粒子分散液に 添加して、粒子の最終濃度を１．００ｗ／ｖ％すなわち２９．２ｍＭにする。製 剤の一般的な容積は２．０ｍｌであり、マイクロピペッターによって４〜５回混 合する。混合後、分散液を２時間平衡化させる。Ｃｏｕｌｅｒ ＤＥＬＳＡ ４ ４０ドップラーエネルギー光散乱分析器で粒子（コートされたものと未コートの もの）の移動度を測定することによって、粒子のコーティングが成功しているこ とを実証する。コートされた粒子は未コート粒子と比べて低い移動度を示す。ま た各種の希釈塩濃度で測定を行って、移動度に関する測定値が間違いでないこと を確認する。 次にこのコートされた粒子を用いて、抗原のタンパク質、ペプチドまたは医薬 を付着させて生物学的に反応性の粒子を製造する。実施例６ セロビオースまたはＰ５Ｐのコーティングを有するナノ粒子の製造 実施例１〜３で製造した酸化スズ、酸化ルテニウムおよび二酸化ケイ素のナノ 粒子に、ＴＣＰと同じ方式でセロビオースまたはＰ５Ｐをコートする。実施例７ 綿密に正常な生物分解性ナノ粒子の製造 １．１音波処理管当たり５００ｍｇの生物分解性粒子が入っている６本の清浄 な音波処理管を準備する。 ２．ヒュームフード内で、約８ｍｌ／管のＨＣｌ（ＩＯＮ）を音波処理管に充 填する。 ３．３０分間音波処理を行う［全電力（１７５ワット）／２５℃］；１回の音 波処理当たり３管づつ。 ４．２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行う。 ５．酸性上澄み液をデカントし（ヒュームフード内）、該管をＨＰＬＣグレー ドの水で満たし次いで渦巻き撹拌を行う。 ６．３０分間音波処理を行い（上記条件）、次に３０分間遠心分離する（上澄 み液が透明になったならば遠心分離は完全である）。 ７．上澄み液をデカントし、次いで管にＨＰＬＣグレードの水を満たし次に渦 巻き撹拌を行う。 ８．ステップ７と８を２回づつ繰り返す。 ９．製剤を清浄なガラス（パイレックス）製ベーキング皿にデカントする。 １０．２１０℃で一夜アニールする。 １１．乾燥した生物分解性結晶を、清浄な非塗装スパチラを用いてゆるやかに はがしとって取り出し次に６本の清浄なガラス製音波処理管に移す。 １２．ステップ３〜８を繰り返す。 １３．１０ＫＤ（ＮＭＷＬ）１５０ｍｌの限外濾過セルを準備し、１本の管だ け内容物（１回濾過操作当たり５００ｍｇにすぎない）をセルに入れて空にし、 次に２０ｐｓｉ（レギュレーターの圧力ゲージの示度）のＮ2圧力ヘッド下でセ ルを通じて５００ｍｌのＨＰＬＣグレードの水で洗浄する。 １４．洗浄後、セルの側部の適当な容積マーキングを利用して製剤の容積を１ ００ｍｌに調節する。 １５．１．０ｍｌの製剤を上記セルから取り出し、その製剤を、予め秤量した １．７ｍｌのエッペンドルフ管内で凍結乾燥することによって濃度を測定する。 凍結乾燥を行った後、管をその内容物とともに重量を測定し、その値を空の管の 重量から差し引く。これによって製剤の初期密度が分かる。溶液中の粒子の濃度 または密度は約１０ｍｇ／ｍｌである。初期密度が１０ｍｇ／ｍｌより低い場合 、溶液は限外濾過セルでさらに濃縮しなければならない。実施例８ 綿密に清浄な生物分解性ナノ粒子の分子安定化被膜（セロビオース） によるコーティング インキュベーション／凍結乾燥 １．実施例７で調製した、綿密に清浄な生物分解性粒子（水性分散液）を、全 電力（１７５ワット）にて２５℃で３０分間温度処理 を行う。 ２．次にできるだけ速く懸濁媒体を水（ストック）から５００ｍＭのセロビオ ース溶液に交換するが、このとき、小容積の場合は卓上型微量遠心分離器（３０ 秒間、全回転速度１４，０００ＲＰＭ）を用い、または大容積の場合は床上型の 遠心分離器（モデル２１Ｋ、５０ｍｌ遠心分離管、最高２分間８，０００ＲＰＭ ）を用いる。ペレット化した粒子を５００ｍＭセロビオース溶液で懸濁させ、音 波処理をして分散を助け［全電力（１７５ワット）で２５℃にて約５分間］、最 後に、混合物を、冷室（４℃）内で一夜ロッキングプレート上に取り付ける。 ３．翌日、混合物を分割して適当な大きさの容器に入れて一夜凍結乾燥を行う 。 ４．それらの管の、蓋のまわりをパラフィン層で覆い、洗浄ステップまで冷凍 器内に入れておく。 ５．用途によって適切な緩衝液で粒子／セロビオースを再構成する。適切な緩 衝液は低イオン強度のリン酸緩衝液（ＰＲＢ）、水または重炭酸塩溶液である。 緩衝液による再構成は、渦巻き撹拌と５分間の音波処理（１７５ワット／２５℃ ）によって行う。 ６．遠心分離［小容積の場合は卓上型微量遠心分離器（３０秒、全回転速度１ ４，０００ＲＰＭ）を用い、または大容積の場合は床上型遠心分離器（モデル２ １Ｋ、５０ｍｌの遠心分離管、最高２分間８，０００ＲＰＭ）］および緩衝液中 への再懸濁を繰り返して洗浄する。 ７．１ｍｌの懸濁液を取り出し、予め秤量した１．７ｍｌのエッペンドルフ管 中に入れ、凍結乾燥器内で脱水して塊にすることによって濃度を測定する。 ８．濃度を１ｍｇ／ｍｌにするのに必要な最終容積を計算する。粒子／セロビ オース製剤の濃度を１ｍｇ／ｍｌにするのに充分な緩衝液を添加する。実施例９ ブルッシャイトの綿密に清浄な粒子の製造 試薬 ０．７５ＭのＣａＣｌ2：５５．１３ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2ＯをＨＰＬ Ｃグレードの水に溶解し、メスフラスコで０．５０Ｌにする。０．２μｍの濾過 滅菌装置で濾過滅菌し、次いで滅菌した５００ｍｌ培地フラスコ中に入れる。室 温で貯蔵する。 ０．２５ＭのＮａ2ＨＰＯ4：１７．７５ｇの無水Ｎａ2ＨＰＯ4をＨＰＬＣグレ ードの水に溶解し、メスフラスコで０．５００Ｌにする。０．２μｍの濾過滅菌 装置で濾過滅菌し、次いで滅菌した５００ｍｌ培地フラスコ中に入れる。やはり 室温で貯蔵する。 ブルッシャイトの合成 合成を行う約３０分前に、カップホーン（ｃｕｐ ｈ ｏｒｎ）を冷却することによってソニケーターを準備する。これは、水コンデン サーの低温サーモスタットを４℃に調節し、ペリスタティック（ｐｅｒｉｓｔａ ｔｉｃ）サーキュレーターの”４”のセッティングにダイヤルを合わして行う。 ４℃のマークに到達したならば、５０．０ｍｌの０．７５ＭＣａＣｌ2と５０． ０ｍｌの０．２５ＭＮａ2Ｈ2ＰＯ4を調製し５０ｍｌのシリンジに入れる。次に これらのシリンジを、直径の反対側に配置されるように三方ルアーコックコネク ターに接続し、残りのルアーポートは生成物を放出するためあけておく。混合装 置が設定されたならば、滅菌１２０ｍｌ音波処理フラスコをカップホーン中に入 れ、ソニケーターの電力を徐々に上げて１００％電力にする。あいているルアー ポートが音波処理フラスコの真上にあるように混合装置を配置する。各シリンジ がほぼ同時に空になるようシリンジの内容物をできるだけ 迅速かつ均等にフラスコ内に放出する。次にすばやくポリプロピレン製ライナー を音波処理フラスコ上に取り付けてさらに１５分間音波処理を行う。 ブルッシャイトの洗浄 製剤をおおまかに分割して２本の５０ｍｌブルートッ プ（ｂｌｕｅ ｔｏｐ）ポリプロピレン製管中に入れ、２０００ｒｐｍで１０分 間（室温）ペレット化を行う。各ペレットを滅菌ＨＰＬＣグレード水とともに渦 巻き撹拌することによって再構成して５０ｍｌ（または管容量）にし、次いで２ ０００ｒｐｍで１０分間ペレット化する。この洗浄をさらに３回繰り返し次いで 最後のペレットを再構成して５０．０ｍｌにする。その分散液を、ポリプロピレ ンライナーを備えた滅菌１２０ｍｌ音波処理フラスコに移す。そのフラスコを、 １℃に予め冷却したソニケーターカップホーン中に入れる。１００％電力で６０ 分間音波処理を行う。実施例１０ ピリドキシル−５−ピロホスフェートの分子安定化被膜による綿密 に清浄なブルッシャイト粒子のコーティング ブルッシャイト／ピロキシダル−５−ホスフェート（ビタミンＢ６） 実施例 １０で製造した分散液１００ｍｌを、その全内容物を５０ｍｌのコニカル管に移 せるようにペレット化する。管の容積を４０．０ｍｌに調節する。次に内容物を １０ｍｌづつ４本の１５ｍｌコニカル管に移す。１０００ｍｇのピロキシダル− ５−ホスフェートを８００μｌの１０ＮＮａＯＨで溶解し、次に水で１０ｍｌに 調節する。この透明の黄色溶液を２μｍのアクロディスクで濾過滅菌し、２．５ ｍｌづつを、予め調製した４本のブルッシャイト管各々に添加する。各管を数秒 間渦巻き撹拌して内容物を確実に充分分散させる。低乾燥速度の設定で一夜（約 １６時間）凍結乾燥する。翌朝、５０ｍｌづつの滅菌ＨＰＬＣグレードの水中に さらに５回再 懸濁させる。もう１回ペレット化してそのペレットを４個のコニカル管中に移し 、次に、最後の製剤の容積を水で４０．０ｍｌに調節する。実施例１１ シトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）の分子安定化被膜による綿密に清浄 なブルッシャイト粒子のコーティング ブルッシャイト／シトレート 全内容物を５０ｍｌコニカル管に移せるように 、実施例１３で調製した１００ｍｌの分散液をペレット化する。管の容積を４０ ．０ｍｌに調節する。次に内容物を１０ｍｌづつ４本の１５ｍｌコニカル管に移 す。１５ｍｌコニカル管の各々に、１０ｍｌの１００ｍＭシトレートを添加し室 温で３０分間旋回振盪させる。低乾燥速度の設定で一夜（約１６時間）凍結乾燥 を行う。翌朝、５０ｍｌづつの滅菌ＨＰＬＣグレード水にさらに５回懸濁させる 。さらに１回ペレット化し、そのペレットを４本の１５ｍｌコニカル管に移し、 最終の製剤容積を水で調節して４０．０ｍｌにする。実施例１２ ヒト血清のトランスフェリンタンパク質類の調製、単離および表面 への吸着 ナノ結晶酸化スズをＤ．Ｃ．反応性マグネトロンスパッタリング法（逆転カソ ード）で合成した。３”直径の高純度スズの標的をアルゴンと酸素の高圧ガス混 合物中でスパッタした。気体相中に生成した超微細粒子を、流動液体窒素で７７ °Ｋに冷却した銅管に集めた。Ｘ線回折結晶学法、選択領域電子線回折法、透過 型電子顕微鏡法、光子相関分光法、およびエネルギー分散型Ｘ線分析法によって 、全物質の特性解析を行った。Ｘ線回折法用試料は、粉末を２倍の大きさのスコ ッチテープを用いてスライドガラス上において調製した。Ｎｏｒｅｌｃｏ自動回 折装置でＣｕＫ（α）線を用いた。得られた スペクトルは酸化スズのＡＳＴＭ標準データと比較した。透過型電子顕微鏡法と 選択領域回折法用の試料は、２−プロパノールによるナノ結晶物質の分散液中に ディップすることによって標準の直径３ｍｍの炭素でコートされた銅メッシュ上 に集めた。これらの試料を、６０〜８０ＫｅＶの加速電圧下ＪＥＯＬ−ＳＴＥＭ １００ＣＸで検査した。また粒子の２−プロパノール懸濁液も、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ４ＭＤを用い、２２．５℃にて６００ｓ試験時間で光子相関分光法で特性を解 析した。エネルギー分散型分析法は、Ｋｅｖｅｘ ｑｕａｎｔｅｘ Ｖソフトウ ェアを用い、ＪＥＯＬ ＪＳＭ−Ｔ３３０Ａ走査型電子顕微鏡で実施した。 本発明の組成物を合成するのに用いるこれら金属酸化物の操作分散液を調製す るため、０．５ｍｇの金属酸化物の粉末を、ダストなしのねじ蓋付きガラスびん に入った１．０ｍｌの２９．２ｍＭセロビオースのリン酸緩衝食塩水溶液に添加 し、２２．５〜３５℃で２０分間音波処理を行った。次に１６，０００×ｇで３ ０秒間、微量遠心分離を行って巨大粒子をペレット化することによってサブミク ロン画分を単離した。約９００μｌの上澄み液を取り出し、ダストなしのねじ蓋 付き微量遠心分離管中に入れた。一部を取り出して光子相関分光法（Ｃｏｕｌｔ ｅｒ Ｎ４ＭＤ）とドップラー電気泳動光散乱法（Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＥＬＳＡ ４４０）で分析した。また一部を取り出し、コートされた粒子分散液の時間が 経過するにつれての安定性と溶媒の漸増塩分（導電性が増大する）について特性 を解析した。 セロビオースでコートした金属酸化物のナノ結晶コアにタンパク質を吸着させ るため、コアの試料を、Ｃａ++とＭｇ++を含有しないリン酸緩衝食塩水（Gibco 社）で１０．０ｍｌまで希釈した。 ４０．０μｇの精製ヒト血清トランスフェリン（４μｇ／μｌ）（Gibco社）（ その抗原性はＥＬＩＳＡ法によって確認した）を１０ｍｌの攪拌セル（Spectra 社）に添加した。次に試料は、泡立たないように充分注意しながら３０分間ゆっ くり攪拌した。添加時間が経過した後、１５ｍｌのＣａ++とＭｇ++を含有しない リン酸緩衝食塩水（Gibco社）でセルを通じて２ｐｓｉの窒素ガス圧ヘッド下で 洗浄した。洗浄後、試料をＮ2のもとで１．００ｍｌまで再び濃縮し、５００μ ｌの試料を取り出し、光子相関分光法、ドップラー電気泳動光散乱法および透過 型電子顕微鏡法で以下に詳細に述べるように分析した。 配座の完全性を、結合タンパク質の保持する抗原性を測定することによって評 価した。試料セルに、５０．０μｌのウサギポリクローナル抗ヒトトランスフェ リン抗体（Dako社）（その抗原性はＥＬＩＳＡ法で確認した）を、濃縮した１． ０ｍｌの反応生成物に、３７．５℃でゆっくり攪拌しながら添加した。３０分間 インキュベーションを行った後、１５ｍｌのＣａ++とＭｇ++を含有しないリン酸 緩衝食塩水（Gibco社）でセルを通じて２ｐｓｉの窒素ガス圧ヘッド下で洗浄し 、次いで反応容積を再び１．０ｍｌに減少させた。 ２００μｌのブロッキング剤すなわち２価イオンを含有しない食塩水中１％ｗ ／ｖのウシ血清アルブミンを添加し、次いで１０分間平衡化させた。次に、二次 抗体すなわち３０ｎｍの金を接合したヤギ抗ウサギポリクローナルＩｇＧ（Zyme d社）を添加し、反応混合物を３０分間インキュベートした。試料を取出し、透 過型電子顕微鏡法のグリッド上にチョップさせ（ｃｈｏｐ）、減圧乾燥させた。 その混合物を、窒素圧力ヘッド下１５ｍｌの２価イオンを含有しない食塩水で再 び洗浄し次いでグルタルアルデヒドで固定した。次に１ ｍｌの３％固体ウシコラーゲン（Collagen Corp.社）を混合物に添加し、複合体 を１０6ｘｇで３０分間超遠心分離に付し、得られたペレットを透過型電子顕微 鏡法用の生物学的試料として通常どおりに処理した。１０ｎｍの厚みの切片をＺ ｅｉｓｓの透過型電子顕微鏡法で観察した。対照試料を、セロビオースの中間結 合層なしで上記のようにして製造した。 透過型電子顕微鏡の写真は、Ｄ．Ｃ．マグネトロンでスパッタした酸化スズが 、直径２０〜２５ｎｍの個々の粒子で構成されこれら粒子が凝集して直径が８０ 〜１２０ｎｍのクラスターになっていることを示した。光子相関分光法によって 、これらの同じ粒子が蒸留水中に分散されると、１５４±５５ｎｍの大きさの凝 集体を生成することが分かった。酸化スズ粒子は、電子線回折法とＸ線回折法で 特性解析を行ったところ充分に結晶性であった。エネルギー分散型Ｘ線分析法に よって不純物として他の元素は全く存在しないことが分かった。 ドップラー電気泳動光散乱分析法によって、酸化スズの平均移動度が１０．８ 〜２０．３μＭＮａＣｌの範囲の水溶液中で２．１７７±０．２１５μｍ−ｃｍ ／ｖ−ｓであることが分かった。１％溶液にてセロビオースで表面コーティング を行ったところ、酸化スズは、０．０〜２１．０μＭＮａＣｌの範囲の水溶液中 で１．５４４±０．２４１μｍ−ｃｍ／ｖ−ｓの平均移動度を示した。酸化スズ は４０．０μＭを超える塩濃度では凝集し、またセロビオース濃度が増大した溶 液中で凝集した。 トランスフェリンを結合させた後、光子相関分光法と透過型電子顕微鏡法で測 定した結果、粗酸化スズ／セロビオース／タンパク質複合体の大きさは３５０± ８４ｎｍであった。低濃度の金抗体とと もに減圧乾燥で降下した試料は大きさが３５〜５０ｎｍであった。セロビオース 結合層なしで減圧乾燥した切片は大きさが４００〜＞１０００ｎｍであった。と ころどころに抗体が結合しているのがみとめられた。高濃度の免疫金（immunogo ld）で標識をつけて濾過した後、セロビオースで処理した試料の薄い切片は５０ 〜１００ｎｍの大きさであった。正の金の結合（positive gold binding）は適 当にコートされた試料の約２０％に確認されたが、負の対照（一次ウサギ抗体を 欠いていること以外は上記と同様にして製造した）は約１％の非特異的結合を示 した。 上記実施例から分かるように、炭水化物で処理したナノ結晶金属酸化物粒子の 表面に吸着されたタンパク質の生物活性は保存されている。 実施例１３ エプスタインバールウィルスデコイの製造と特性解析 デコイ ナノ結晶酸化スズをさきに実施例１に記載したようにしてＤ．Ｃ．反 応性マグネトロンスパッタリング法で製造した。 エリトリエーテッドスクロース勾配液法（elutriated sucrose gradient）で 精製した、Ｂ９５−８細胞系由来のエプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）は Advanced Biotechnologies Inc.社（米国メリーランド州コロンビア所在）から 購入した。約５．００×１０10ウィルス粒子／ｍｌを含有するウィルスの各アリ コートを１０ｍＭトリス−１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．５の緩衝液中に懸濁させ た（約０．９４ｍｇ／ｍｌのタンパク質）。ビリオンを０．７５％（Ｖ／Ｖ）Ｔ ｒｉｔｏｎ×１００で可溶化し次にWellsが報告した方法（Wells，A.，Koide,N. ，Klein，G.:Two large virion envelope glycoproteins mediate EBV binding to receptor-positive cel ls.,J．Virology,４１巻、２８６〜２９７頁、１９８２年）の変法を用いて、１ ５０，０００ｘｇで６０分間超遠心分離に付してＤＮＡコアをペレット化した。 透析を行った後、上澄液のＥＢＶ抽出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（変性）（Ｂｉ ｏｒａｄ Ｍｉｎｉ Ｇｅｌ II，４〜２０％の勾配ゲル、２００Ｖ×４５分間 、銀で染色）およびサイズ排除ＨＰＬＣ法（未変性）（ＷＩＳＰオートインジェ クターと７２０ホトダイオードアレー検出器を備えたＷａｔｅｒｓ６２０システ ム、１００ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリスｐＨ９．４勾配移動相を用いるＷａ ｔｅｒｓ ＳＷ３００ＧＦＣカラムで０．５ｍｌ／ｍｉｎ）の両方で特性解析を 行った。 対照（非ＥＢＶ）のタンパク質を、λファージウイルス（Pharmacia社、米国 ウイスコンシン州ミルウォキー所在）のアリコートから、上記方法と同じ方法を 用いて抽出した。 約１．５ｍｇの重量の酸化スズ粉末のアリコートを、まず、充分な時間渦巻き 攪拌を行うことによって（Vortex Genie,Scientific Industries社、米国ニュー ヨーク州ボヘミア）、ダストなしのガラスバイアルビン中の３．０ｍｌの２９． ２ｍＭセロビオース溶液中に懸濁させた。得られた褐色がかった色を呈し濁った 懸濁液を、２５℃にて、約２０ＫＨｚの周波数で１０分間１７５Ｗで音波処理を 行った（Branson 2"Cup Horn、Branson Ultrasonics Corp.社、米国コネティカッ ト州ダンバリー）。得られ分散液を１６，０００ｘｇで１５秒間微量遠心分離に 付すことによって透明にした。残留ペレットを排棄して上澄み液を残した。１０ ＫＤ呼称分子量濾過攪拌セル（１０ＫＤ nominal molecular weight filtered stir cell）（Pharnacia社）を用い、７．５ｐｓｉＮ2ガスヘッドのもとで３７ ．５℃にて２５ｍＭリン酸反応緩衝液（ｐＨ７．４０、２５ｍＭＨＰ Ｏ4 2+／Ｈ2ＰＯ4 1-）２０ｍｌに対し限外濾過を行うことによって未吸着のセロ ビオースを除去した。中間生成物のアリコートを、光子相関分光法で特性解析を 行い、および下記のように透析を行った後ドップラー電気泳動光散乱分析法によ って特性を解析した。 ウイルスタンパク質吸着のプロセスは、１０ＫＤ呼称分子量攪拌セル中で、４ ℃にて２５ｍｌのリン酸反応緩衝液に対して限外濾過を行うことによって２５０ μｌアリコートのＥＢＶ抽出液からマイルドなＴｒｉｔｏｎ界面活性剤を除去す ることによって開始し、次いで濃度を１．０μｇ／μｌに調節するかまたは最終 容積を約１．０ｍｌに調節した。次に５００μｌのＴｒｉｔｏｎを含有していな いＥＢＶ抽出液を、３７．５℃まで予め加温した表面処理済酸化スズ分散液２． ０ｍｌが入っているＭＤ呼称分子量攪拌セルに迅速に添加した。得られた混合物 をゆるやかにかに攪拌しながら３７．５℃で２．０時間インキュベートした。イ ンキュベーションを行った後、未吸着のＥＢＶ抽出物を、２５ｍｌのリン酸反応 緩衝液に対して限外濾過を行うことによって除去した。 λファージのウイルスタンパク質抽出物を用いて製造した対照（非ＥＢＶ）デ コイは、上記方法と同じ方法を用いて合成した。 中間成分、最後の組立てられたデコイおよび全エプスタイン−バールビリオン について、ドップラー電気泳動光散乱分析法（ＤＥＬＳＡ ４４０、Coulter El ectronics Inc.社、米国フロリダ州ハイアリーア）によって特性解析を行い、液 相中でのそれらの電気泳動移動度（表面電荷）を測定した。２５℃でｐＨが４． ５９〜９．０６であり対応する伝導率が２．２９０〜４．７２０ｍＳ／ｃｍの９ 個のリン酸緩衝液を調製した。原酸化スズ、セロビオースで被覆した表面改質酸 化スズ、合成ＥＢＶデコイ、および全ＥＢＶのアリコ ートを、上記９個の各溶液に対して透析し、分散液中での粒子の移動度を、それ ぞれ４．０、５．５、５．５および８．０ｍＡの電界強度下で測定した。測定装 置の４アングル検出器（４ angled detector）で同時に得た移動度の測定値を 平均して、１分散液当り３個の測定値の平均値を記録した。 合成したＥＢＶデコイおよび対照デコイは、免疫凝集光子相関分光法で特性を 解析してそれらの表面の抗体反応性を測定した。１５％ラクトース、０．９％Ｎ ａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液および０．２％ＮａＮ3中の抗ＥＢＶマ ウスモノクロナール抗体類（抗−ＥＢＶ−ＶＣＡ）抗−ＥＢＶ ＥＡ−Ｒ、抗− ＥＢＶ ＭＡおよび抗ＥＢＶ ＥＡ−Ｄを各々１μｇづつ）の混液（Dupont社、 米国デラウエア州ウィルミントン）とともにＥＢＶデコイを３７．５℃で６０分 間インキュベートすることによって陽性反応性（positive reactivity）を評価 した。バックグランドの反応性はＥＢＶデコイを関連のないマウスＩｇＧ1とと もにインキュベートすることによって評価した。特異性はλファージデコイをモ ノクロナール抗ＥＢＶマウス抗体と反応させることによって評価した。凝集は光 子相関分光法により９０°の角度によって測定した（Ｎ４ＭＤ、Ｃｏｕｌｔｅｒ ）。 抗体親和性強度（antibody affinity intensity）を、上記粒子と抗体を用い 二次抗マウス３０ｎｍ金標識抗体を添加して免疫金透過型電子顕微鏡法で評価し た（Faulk,W.,Taylor,G.:Immunocolloid method for electron microscopy,Immu nochemistry,８巻、１０８１〜１０８３頁、１９７１年）。 ＥＢＶデコイ（陽性反応）の標識化は、２０μｌのマウスモノクローナル抗体 の混合物〔１５％ラクトース、０．９ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液および０．２％ＮａＮ3中の１μｇの抗−ＥＢＶ−Ｖ ＣＡと１μｇの抗−ＥＢＶ ＥＡ−Ｒ（Dupont社）〕を新しい０．５ｍｌのＥＢ Ｖ試料とともに、３００ＫＤ呼称分子量の攪拌セル内で３７．５℃にて３０分間 インキュベートすることによって実施した。５．０ｐｓｉＮ2圧力ヘッドのもと に、２０ｍｌのリン酸反応緩衝液に対する限外濾過によって、未結合の抗体を除 去した。洗浄を終ってから、３０ｎｍの金球体〔１０6粒子／ｍｌ（Zymed Labor atories社、米国カリフォルニア州サンフランシスコ）〕に共有結合で融合した ヤギ抗マウス抗体５０μｌを、１Ｍ呼称分子攪拌セル内で、標識粒子２００μｌ とともに３７．５℃で３０分間インキュベートした。１０ｍｌのリン酸反応緩衝 液に対して限外濾過を行うことによって未結合の二次抗体を除去した。 ＥＢＶデコイ（陰性反応）の標識化は、２．５μｌのマウスポリクローナル非 特異的ＩｇＧｌ（１５ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４中１μｇ／μｌ（Sigma Chemical Corp.社、米国ミズーリ州セントルイス所在）を上記のようにＥＢＶデコイの新 しい０．５ｍｌの試料とともにインキュベートし、次に同様の洗浄と金標識化の ステップを行うことによって実施した。λファージ対照デコイ（陰性反応）の標 識化は、マウスモノクローナル抗ＥＢＶ抗体類の混合物２０μｌを、λファージ ウイルスをコートしたデコイとともに、先に詳述したのと同じ方法を用いてイン キュベートすることによって実施した。 免疫標識化粒子を２種の方法で電子顕微鏡法用に調製した。カーボンでコート した銅のビューインググリッド（viewing grid）（Ted Pella Inc.社、米国カリ フォルニア州レディング所在）を試料中に約５秒間沈め次に５％グルタルアルデ ヒドで１分間固定する直接浸漬法を、迅速スクリーニング法として全反応に用い た。グルタル アルデヒドを反応溶液に直接加え次に生成物を、０．５ｍｌ軟寒天製剤中［水中 ０．７％アガロース（Sea Kem社、米国カリフォルニア州タメキュラ所在）］中 に１６，０００×ｇで５分間ペレット化する方法をさらに実施した。得られた寒 天のプラグをプラスチック中に埋包し観察用に０．１μｍ厚の切片を作製した。 正と負の対照の両方の分析は、標識化反応生物をペレット化した試料を、透過 型電子顕微鏡法で試験することによって実施した。抗体結合の相対的強度は、金 球体を捕捉したことが観察された酸化スズベースの粒子の数を計数し（％陽性） 次に与えられた粒子に捕捉された金球体の数を記録する（強度、数／事象）こと によって求めた。 超微細酸化スズ粒子は、透過型電子顕微鏡法によってその直径が２０〜２５ｎ ｍであり直径が８０〜１２０ｎｍの凝集体を形成していることが分かった。これ らの同じ粒子は蒸留水中に分散されると１５４±５５ｎｍの大きさの凝集体を生 成することが光子相関分光法で分かった。酸化スズ粒子は電子線回折法又はＸ線 回折法で特性を解析したところ充分結晶性であった。エネルギー分散型Ｘ線分析 法によって、他の元素が不純物として全く存在してないことが分かった。 ＥＢＶタンパク質類の特性解析をＳＤＳ−ＰＡＧＥで行ったところ二つの明確 なタンパク質バンドを示した。第一のタンパク質は、可変グリコシル化を示唆す る二量体として存在し、ＥＢＶの主要なエンベロープ糖タンパク質と一致する約 ３５０ｋｄの分子量を示した。第二のタンパク質は、ウィルス表面に明らかに強 く吸着する、血清アルブミンと一致する約６７ｋｄの分子量を示した。分光測定 法で測定したところ、タンパク質と一致する２８０ｎｍでの最大吸 収を示した二つの明確なバンドが存在することがＨＰＬＣで確認された。その主 要ピークはクロマトグラフィの保持時間が１０．３０分でありかつモノクローナ ル抗ＶＣＡによって９０％抑制された。第二の比較的小さいピークは、ウシ血清 アルブミンの標準物に類似のクロマトグラフィー保持時間１５．７５分を示した 。 ｐＨ範囲４．５〜９．０で実施した前述のドップラー電気泳動法の移動度の試 験は三つの明確なパターンを示した。第一にデコイと未変性ＥＢウィルスは上記 ｐＨの範囲を通じて事実上同じ移動度約−１．４μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓを示した。 第二に未処理の酸化スズはｐＨ４．５で約−１．０μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓの移動度 を示し、移動度は５．０以上のｐＨ値では−３．０μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓまで急速 に上昇した。第三に、セロビオースで処理して表面を改質した酸化スズは約−１ ．５μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓの移動度示し、移動度はｐＨ７．５で急速に−２．５μ ｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓまで上昇した。 前述の光子相関分光法によって、未変性ＥＢＶの大きさが約１０２±３２ｎｍ であり合成のＥＢＶデコイの大きさが約１５４±５２ｎｍであることが分かった 。合成のＥＢＶデコイは、モノクローナル抗ＥＢＶ混液と反応させると凝集して １５３４±３９４ｎｍのかたまりを生成した。合成のＥＢＶデコイは非特異的マ ウスＩｇＧと反応させると、大きさはわずかしか増大せず凝集体の直径は２３０ ±７６ｎｍであった。λファージのデコイは、モノクローナル抗ＥＢＶ混液と反 応させると大きさはわずかしか増大せず凝集体の直径は１７０±３５ｎｍであっ た。 抗ＥＢＶ抗体で標識化したＥＢＶデコイ粒子を前述の透過型電子顕微鏡で試験 したところ、陽性の金染色頻度（positive gold staining frequency）が２３． ５１±５．５３％で、平均の染色強度が ７．４１金標識／事象であることが分かった。非特異的マウスＩｇＧ抗体で標識 化したＥＢＶデコイ粒子を試験したところ、陽性の金染色頻度が５．５３±２． ０４％で、平均染色強度が１．００金標識／事象であることが分かった。抗ＥＢ Ｖ抗体で標識化したλファージデコイ粒子を試験したところ、陽性金染色頻度が ７．２１±１．２６％で平均染色強度が１．０６金標識／事象であった。実施例１４． エプスタイン・バールウィルスデコイによる抗体の生体内誘発 四つの感作溶液を調製し、約８週齢のニュージーランドウサギに、一週間おき に３回、２５０μｌづつを筋肉内に注射することによって投与した。第一の４頭 の動物には、一回の注射当り、リン酸反応緩衝液中に分散した約１０9の全ＥＢ Ｖビリオン（２５μｇウシ血清アルブミン標準物に対し２８０ｎｍにおける分光 法の吸収曲線を積分することによって推定したｇｐ３５０約３２μｇ）を投与し た。第二の四頭の動物には、同じ注射プロトコルを用い、単離して精製したｇｐ ３５０を１回注射当り３２μｇづつ投与した。第三グループの動物には、１回注 射当り３２μｇのｇｐ３５０の出発アリコートから合成されたＥＢＶウィルスデ コイ（実施例５）を投与した。最後のグループの動物には、リン酸反応緩衝液中 に分散された、セロビオースでコートされた酸化スズを投与した。注射液はアジ ュバントを含有していなかった。３回の各注射を行ってから２週間後に心臓穿剌 によって無菌法を用いて全血を採取して動物は心臓穿剌を終り次いで６週間目に 致死鎮静（ｌｅｔｈａｌ ｓｅｄａｔｉｏｎ）に至った。全血を１６０００×ｇ で１分間微量遠心分離にかけて血清を抽出し、分析を行うまで−７０℃で凍結し て貯蔵した。 全ＥＢＶビリオンに対する免疫特異的抗体（ＡＢＩ）はＥＬＩＳ Ａ法で検定した。約１０9ビリオン／ｍｌリン酸反応緩衝液の液をコーティング 緩衝液によって１：１０の比率で希釈し、次いでポリカーボネート製検定プレー ト（Ｆａｌｃｏｎ）に４℃で一夜吸着させた。結合ＥＢＶビリオンに対するウサ ギ血清のアフィニティーを、ｐ−ニトロフェニルホスフェートで顕色されるヤギ 抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ社）の比色反応で測定した 。免疫特異的ＩｇＧの濃度は、吸着された抗原として非特異的ウサギＩｇＧを用 いて較正曲線と比べて、酸化スズだけで刺激されたウサギ由来の血清が入ってい るウェルから記録されたベースライン値を差引くことによって求めた。 酸化スズによって感作された４頭のウサギから収集した血清は、２週間の間隔 をおいた３回のサンプリングのいずれの時点でも免疫前の血清を越える抗ＥＢＶ 活性の増大を全く示さなかった。残りの３グループは、６週間にわたって、抗Ｅ ＢＶ特異的ＩｇＧの濃度が次第に増大した。精製ＥＢＶタンパク質で感作された 動物だけが、６週目に約０．０５μｇ／μｌという抗ＥＢＶＩｇＧの最大値を示 した。これに対して、全ＥＢＶまたはデコイＥＢＶで感作された動物は、６週目 に約０．２０μｇ／μｌの抗ＥＢＶＩｇＧという統計的に有意な４倍の応答を示 した。デコイＥＢＶと全ＥＢＶに対する免疫特異的応答は事実上同一であった。 実施例５と６から明らかなように、本発明にしたがって合成されたＥＢＶデコ イは、未変性ウィルスと同じ表面電荷を有し、モノクローナル抗体によって特異 的にかつ強く認識され、そして全ウィルスと同じ効力で免疫特異的抗体を誘発す る。光子相関分光法を用いて、上記三つの反応条件下で凝集した粒子の数を凝集 体の直径の測定値から計算した。これらの計算結果は、モノクローナル抗ＥＢＶ 抗体が平均９８８．０個のデコイＥＢＶ粒子からなる凝集塊を生成することを示 している。非特異的マウスＩｇＧ抗体は、平均３．３３個のデコイＥＢＶ粒子か らなる凝集塊を生成し、一方モノクローナル抗ＥＢＶ抗体は平均１．３５個の対 照のλファージデコイ粒子からなる凝集塊を生成する。これらの測定結果は、本 発明のＥＢＶデコイの測定された凝集能力が対照と比べてほぼ３桁大きいことを 示している。免疫金透過型電子顕微鏡法によって、抗ＥＢＶ標識化ＥＢＶデコイ を染色する金標識抗体は対照の２５〜３０倍であることが分かった。ＥＢＶデコ イによってウサギに誘発された抗ＥＢＶＩｇＧの免疫特異性をＥＬＩＳＡ法で分 析したところ、未変性ウィルスによって誘発される応答に類似しておりかつ単離 された精製タンパク質によって誘発される応答の４倍である。実施例５と６はKo ssovsky,N.ら：Nanocrystalline Epstein-Barr Virus Decoys,Journal of Appli ed Biomaterial,２巻、２５１〜２５９頁、１９９１年に要約されている。実施例１５． ＨＩＶデコイの製造 以下の手順を用いてＨＩＶ膜抗原をダイヤモンドのナノ結晶粒子に吸着させて ＨＩＶデコイを得た。 ＨＩＶの調整 １．０ｍｌのＨＩＶ（メーカーのAdvanced Biotechnology,Inc .社が測定したＴＣＩＤ ５０の力価は１０5.75〜１０7.17の間を変動した）を 、１００ＫＤ限外濾過によってＰＢＳ中に透析して必要になるまで−７０℃に凍 結した。注射日にはウィルス貯蔵物を氷上で解凍し次いでＰＢＳで１：２５の比 率で希釈した。この製剤１００μｌを注射に用いた。１．０ｍｌのＨＩＶ（１０5.74 トランスフォーミング単位／ｍｌ）（ＡＢＩ）を０．５ｍｌのエンベロープ 抽出緩衝液（１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ×１００／０．２ ５ｍＭＤＴＴ／１０ｍＭトリスｐＨ７．４／１．０ｍＭ ＭｇＣｌ）に添加し、 次いで室温で１．０ｈｒインキュベートした。抽出物を１００，０００×ｇで２ ．０時間４．０℃にて超遠心分離にかけて（３５０００ｒｐｍ、ＳＷ５０．１ Ｂａｃｋｍａｎローター）ヌクレオキャプシドを除去した。ポリエスチレンの微 細ビーズのスラリー３００μｌ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｇｅｌ Ｄ２）とともにイン キュベートし次にＰＢＳに対して１００ＫＤ限外濾過を行うことによってＴｒｉ ｔｏｎＸを除きエンペロープタンパク質を濃縮した。１００μｌの注射を行う場 合、抽出液の容積を１．０ｍｌに調整し次いでＰＢＳで１：２５の比率で希釈す るか、またはタンパク質の濃度を約２．５μｇ／１００μｌ／注射容積に調整し た。タンパク質の定量はＨＰＬＣによって実施した。ＨＰＬＣの条件は次のとお りである。Ｗａｔｅｒｓ ＧＦＣ ＳＷ ３００；移動相：３００ｍＭ ＮａＣ ｌ，２０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．４；０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で約８．９分の保 持時間を有する一つの主要ピーク；インテグレーションはＢＳＡ標準に対して行 った。 ＨＩＶデコイの製造 ＨＩＶ抽出液を、ｐＨ７．４０の２０ｍＭリン酸緩衝液 に対して限外濾過を行った後、１．０ｍｌの容積に調節し、５００ｍＭのセロビ オースでコートしたダイヤモンド粒子１．０ｍｌとともに４．０℃で２４時間イ ンキュベートした。ダイヤモンド粒子の平均粒径は５０ｎｍのオーダーであった 。吸着を行った後、ＰＢＳに対する３００ＫＤ限外濾過を行って未吸着のタンパ ク質を除くことによって注射用のデコイ分散液を調製し、次いでＰＢＳで１．０ ｍｌに調節し、１００μｌづつ１０個の注射液に分けた。 ＨＩＶデコイの免疫活性 ウサギ、モルモットおよびマウスに、生ウィルス、 タンパク質抽出物、フロイントアジュバントと混合し たタンパク質抽出物またはＨＩＶデコイウィルスを注射した。全ウィルスに対す る抗体価はＥＬＩＳＡ法で測定し、ウェスタンブロット法で特性を解析した。細 胞性反応性（Ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）は、生ウィ ルスで真皮を攻撃し次いで生検を行うことによってモルモットで評価した。 生理的ｐＨにおける、これら合成担体の平均電気泳動移動度と、平均分散直径 （５０ｎｍ）はこれらの感染性対応物に密接に似ていた。マウス、モルモットお よびウサギにＨＩＶデコイで予防接種すると、ＥＬＩＳＡ法で測定した場合、全 ＨＩＶ製剤に対する特異的結合を示す抗血清の産生が誘発された。デコイウィル スおよび全ウィルスによって感作された動物の耳たぶ部位の組織学的分析を行っ たところ同様の反応（定性的および定量的）を示したが、その反応は、フロイン トで感作された動物および精製タンパク質で感作された動物とは１，２，７およ び２４週目で有意に異なっていた。結合特異性はウエスタンブロット法によって 確認した。 上記実施例で分かるように、本発明のＨＩＶデコイは、いくつもの特性を未変 性の全ＨＩＶウィルスと共有している。これらの特性としては、大きさ、表面電 荷、免疫認識性、同じような抗体価を誘発する性能、および細胞応答の大きさと 特性が挙げられる。これらの特性は、本発明のデコイウィルスが予防接種剤とし て有効に機能できることを示している。 予め成形された固体を洗浄するかまたは清浄な固体と面を新たに製造すること によって綿密に清浄な固体表面を得る方法；炭水化物、炭水化物誘導体、および 多数の−ＯＨ（ヒドロキシル）側基を特徴とする炭水化物様成分を有する他の巨 大分子を含有する溶液を塗布する方法；分子安定化表面被膜を得るための凍結乾 燥法；ならびに ＢＲＰのメンバーを固定化する方法を、追加の下記実施例で説明する。実施例１６． 綿密に清浄な炭素セラミック（ダイヤモンド）ナノ粒子の製造 １． １つの管当り５００ｍｇの粒子が入っている６個の清浄な音波処理管を 準備する。 ２． ヒュームフード内で、約８ｍｌ／管のＨＣｌ（１０Ｎ）を管に充填する 。 ３． ３０分間音波処理を行う［全電力（１７５ワット）／２５℃］；一回音 波処理当り３本づつの管。 ４． ２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。 ５． 酸性上澄み液をデカントし（ヒュームフード内で）、管にＨＰＬＣグレ ードの水を満たし次いで渦巻き攪拌を行う。 ６． ３０分間音波処理を行い（上記条件）次に３０分間遠心分離する（上澄 み液が透明になれば遠心分離は完全である）。 ７． 上澄み液をデカントし次に管にＨＰＬＣグレードの水を満たし次いで渦 巻き攪拌を行う。 ８． ステップ７と８をさらに２回繰返す。 ９． 製剤を清浄なガラス（パイレックス）製ベーキング皿にデカントする。 １０． ２１０℃で一夜アニールする。 １１． 清浄な非塗装スパチラでゆるやかにはがしとることによって乾燥ダイ ヤモンド結晶を取り出し、６本の清浄なガラス製音波処理管に移す。 １２． ステップ３〜８を繰返す。 １３． １０ＫＤ（ＮＭＷＬ）１５０ｍｌの限外濾過セルを準備 し、管の１本だけ内容物を空にして（１回濾過操作当り５００ｍｇにすぎない） セル内に入れ、次いで２０ｐｓｉのＮ2圧力ヘッド（レギュレーターの圧力ゲー ジの示度）のもとでセルを通じて５００ｍｌのＨＰＬＣグレードの水で洗浄する 。 １４． 洗浄後、セルの側部の適当な容積マーキングを用いて製剤の容積を１ ００．０ｍｌに調節する。 １５． １．０ｍｌの製剤をセルから取り出し、予め秤量した１．７ｍｌのエ ッペンドルフ管内で凍結乾燥することによって濃度を測定する。凍結乾燥後、そ の内容物とともに管の重量を測定し、その重量を空の管の重量から差引く。これ によって製剤の初期密度が得られる。溶液中の粒子の濃度または密度は約１０ｍ ｇ／ｍｌが好ましい。初期密度が１０ｍｇ／ｍｌより低い場合、溶液は限外濾過 セルでさらに濃縮しなければならない。実施例１７ 綿密に清浄なダイヤモンドナノ粒子の分子安定化被膜（セロビオー ス）によるコーティング インキュベーション／凍結乾燥 １． 実施例１６で製造した綿密に清浄な炭素（ダイヤモンド）（水性分散液 ）を、全電力（１７５ワット）で２５℃にて３０分間、音波処理を行う。 ２． 小容積の場合、卓上型微量遠心分離器（３０秒間、全回転速度 １４， ０００ｒｐｍ）を使用し、または大容積の場合は床上型遠心分離器（モデル２１ Ｋ、５０ｍｌ遠心分離管、最大２分間８，０００ｒｐｍ）を用いて、懸濁媒体を 水（貯蔵物）から５００ｍＭセロビオース溶液にできるだけ迅速に交換する。ペ レット化された炭素を５００ｍＭセロビオースで懸濁させ、音波処理を行って分 散を促進し［全電力（１７５ワット）で２５℃にて約５分間］、次い で最後に、その混合物を、冷室（４℃）内のロッキングプレートに一夜取付ける 。 ３． 翌日、その混合物を適当な大きさの容器に分割して一夜凍結乾燥する。 ４． それらの管の蓋のまわりをパラフィンの層で覆い、次にこれらの管を洗 浄ステップに入るまで冷凍器内に入れておく。 ５． 用途によって適切な緩衝液中に炭素／セロビオースを再構成する。適切 な緩衝液は、低イオン強度のリン酸緩衝液（ＰＲＢ）、水または重炭酸塩溶液で ある。緩衝液での再構成は、渦巻き攪拌と５分間の音波処理（１７５ワット／２ ５℃）によって行う。 ６． 遠心分離［小容積の場合、卓上型微量遠心分離器（３０秒間、全回転速 度１４，０００ｒｐｍ）を用い、または大容積の場合は床上型遠心分離器（モデ ル２１Ｋ、５０ｍｌ遠心分離管、最高２分間８，０００ＲＰＭ）を用いる］と緩 衝液中への再懸濁とを繰返すことによって洗浄する。 ７． １ｍｌの懸濁液を取出し、これを予め秤量した１．７ｍｌのエッペンド ルフ管内にて凍結乾燥器で脱水し、塊にする。 ８． 濃度を１ｍｇ／ｍｌにするのに必要な最終容積を計算する。炭素／セロ ビオース製剤の濃度を１ｍｇ／ｍｌにするのに充分な緩衝液を添加する。実施例１８． 綿密に清浄な炭素粒子の製造 １． ２ｇのＧＥ炭素粉末を、２５０ｍｌのＢｅｌｃｏ攪拌フラスコ（懸濁培 養用に設計されたもの）内で２５ｍｌの３０％過酸化水素溶液＋７５ｍｌの３６ Ｎ硫酸と混合した。反応は発熱反応であり焼灼性蒸気（caustic vapor）を発生 する。したがって次のような事前の対策を行うことが推奨される。１．ヒューム フード内で操作 する；２．Ｂｅｌｃｏジャーのねじ蓋を完全にしめずにジャーの二つのアームに よって通気を行う。８日間おだやかに攪拌する。 ２． 溶液を２×５０ｍｌの遠心分離管に注入する（各々約４０ｍｌづつ）。 溶液の最後の１５〜２０％を廃棄し白色物質だけを保存する。炭素を、８，００ ０ＲＰＭで１分間（室温）遠心分離してペレット化する。ペレットを２０ｍＭリ ン酸緩衝液（７．４）で懸濁させる。３回洗浄する。３回目の洗浄ステップでは 、遠心分離期間は５〜１０分間まで延長する必要がある。なぜならば炭素はｐＨ が上昇するにつれて沈澱しにくくなるからである。最終の洗浄の後、ペレットを ＨＰＬＣ水中に懸濁させ、室温で貯蔵する。得られた粒子は平均粒径が２６０ｎ ｍ±８７ｎｍであった。 ・測定結果：平均粒径２６０±８７ｎｍ；ＳＴＤ分析結果２８２ｎｍ（９８％） および３５．２ｎｍ（２％）ダスト（４％）。実施例１９． コートされた綿密に清浄な固体表面に対する、生化学的に反応性 の対（ＢＲＰ）のメンバーの固定化 １． １ｍｌのエプスタイン・バールウィルスＥＢＶ（ＡＢＩ）を、４．０ｍ ｌのエンペロープ抽出緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ×１００／０．２５ｍＭのジ チオトレイトール／１０ｍＭのトリスｐＨ７．４／１０ｍＭのＭｇＣｌ）に添加 し次いで室温にて１時間インキュベートする。得られた抽出液を、４℃にて１０ ０，０００×ｇで２時間超遠心分離にかけて（３５０００ｒｐｍ、ＳＷ５０．１ Ｂｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｏｒ）ヌクレオキャプシドを除去する。 ２． ペレットを廃棄して上澄み液を残す。 ３． その上澄み液を、４℃の循環水で冷却した１００ＫＤ限外濾過装置に移 す。 ４． 合計２００ｍｌの新鮮な滅菌ＰＲＢ（２０ｍＭリン酸塩、 ｐＨ７．４）を用いて連続透析を始める。１００μｌの注射液とするため、抽出 液の容積を１．０ｍｌの容積に調整し、次いで注射を行う直前にＰＢＳで１：２ ５の比率で希釈するか、またはタンパク質の濃度を約２．５μｇ／１００μｌ／ 注射容積にする。タンパク質の定量はＨＰＬＣで行うことができる（ＨＰＬＣの 条件は次のとおり：Ｗａｔｅｒｓ ＧＦＣ ＳＷ３００；移動相：３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４；０．５ｍｌ／ｍｌの流量で約８．９ 分の保持時間を有する一つの主要ピーク；インテグレーションはＢＳＡ標準に対 して行った）。 ５． ＥＢＶ抽出液を１００ｋｄフィルター装置に移した後、実施例１０で調 製した炭素／セロビオース粒子を添加して最終濃度１ｍｇ／ｍｌにする。合計２ ００ｍｌの新しい滅菌ＰＲＢ（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）を用いて連続透 析を始める。結合ＨＢＶを注射用に調製する場合、最終容積を１．０ｍｌに調節 し次いで１００μｌの注射液用にＰＢＳで１：２５の比率で希釈する。他のすべ ての用途のため、結合ＨＢＶはＰＲＢ中に４℃で保存する。実施例２０． コートされた綿密に清浄な固体表面に対する生化学的に反応性の 対（ＢＲＰ）のメンバーの固定化 １． マウスリンパ親和性ウィルス（ＭｕＬＶ）の抽出：ＭｕＬＶの貯蔵物（ ＡＢＩ）を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００抽出緩衝液（１．０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／０．２５ｍＭのジチオトレイトール／１０ｍＭのトリスｐＨ７．４ ／１．０ｍＭのＭｇＣｌ）で１：５の比率で希釈し（例えば１ｍｌのウィルス貯 蔵物を希釈剤で最終容積５ｍｌまで希釈する）、次いで４℃で一夜インキュベー トしした。得られた抽出液を、１００，０００×ｇで２時間４℃にて超遠心分離 にかけて（３５０００ＲＰＭ、ＳＷ５０．１／Ｂ ｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｏｒ）ヌクレオキャプシドを除去した。 ２． ペレットを排棄し上澄み液を残す。 ３． ＭｕＬＶデコイの合成：合成全体を通じて無菌法を用いることが望まし い。反応混合物に対するアクセスが厳密に制御されるように攪拌セル装置を調整 する。ＭｕＬＶ抽出液を、１０ｍｌの容積の１００ｋｄフィルター装置に移し、 次いで炭素／セロビオースのコアを１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。合計 ２００ｍｌの新鮮な滅菌ＰＲＢ（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）を用いて連続 透析を開始する。デコイを注射用に調製する場合は、１．０ｍｌの最終容積に調 節し、次いでＰＢＳで１：２５の比率で希釈して１００μｌの注射液とする。他 のすべての用途のためデコイはＰＲＢ中に４℃で保存する。実施例２１． リン酸カルシウム二水塩（ブルッシャイト）の綿密に清浄な固体 表面の製造 試薬類 ０．７５Ｍ ＣａＣｌ2：５５．１３ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2ＯをＨＰ ＬＣグレードの水で溶解し、メスフラスコで０．５００Ｌにする。０．２μｍの 滅菌濾過装置で濾過滅菌し、次いで滅菌５００ｍｌ培地フラスコ中に入れる。室 温で保存する。 ０．２５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4：１７．７５ｇの無水Ｎａ2ＨＰＯ4をＨＰＬＣグレ ードの水で溶解し、メスフラスコで０．５００Ｌにする。０．２μｍの滅菌濾過 装置で濾過滅菌し、次いで滅菌５００ｍｌ培地フラスコ中に入れる。やはり室温 で保存する。 ブルッシャイトの合成 合成を行う約３０分前に、カップホーンを冷却するこ とによってソニケーターを準備する。これは、水コンデンサーの低温サームスタ ットを４℃に調節し、ペリスティックサーキュレータの“４”の設定にダイヤル を合わせて実施する。４℃ のマークに到達したならば、５０．０ｍｌの０．７５Ｍ ＣａＣｌ2と５０．０ ｍｌの０．２５Ｍ Ｎａ2Ｈ2ＰＯ4を準備しそれぞれ５０ｍｌのシリンジに入れ る。これらのシリンジを直径に対して反対側に配置されるように３方ルアーコッ クコネクターに接続し、残りのルアーポートは生成物を放出させるためあけてお く。混合装置を調整したならば滅菌１２０ｍｌ音波処理フラスコをカップホーン 中にいれ、ソニケーターの電力をゆっくり上昇させて１００％電力にする。あけ ておいたルアーポートが音波処理フラスコの真上に位置するように混合装置を配 置する。できるだけ迅速かつ均等にシリンジ内容物を上記フラスコ中に放出して 各シリンジをほぼ同時に空にする。次いで迅速に、ポリプロピレン製ライナーを 音波処理フラスコの真上に設置し、さらに１５分間、音波処理を行う。 ブルッシャイトの洗浄 ２本の５０ｍｌブルートップポリプロピレン製管に製 剤をおおまかに分けていれ次いで２０００ｒｐｍで１０分間（室温）でペレット 化する。各ペレットを滅菌ＨＰＬＣグレード水とともに渦巻き攪拌を行い５０ｍ ｌ（または管の容量）にすることによって再構成し次に２０００ｒｐｍで１０分 間ペレット化を行う。この洗浄をさらに３回繰返し、次に最後のペレットを再構 成して５０．０ｍｌにする。その分散液を、ポリプロピレン製ライナーを備えた 滅菌１２０ｍｌ音波処理フラスコに移す。予め１℃に冷却したソニケーターのカ ップホーン中に上記フラスコを入れる。１００％電力で６０分間、音波処理を行 う。実施例２２． ピリドキシル−５−ピロホスフェートの分子安定化被膜による、 リン酸カルシウム二水塩（ブルッシャイト）の綿密に清浄な固体表面のコーティ ング ブルッシャイト／ピリドキシル−５−ホスフェート（ビタミンＢ ６） 全内容物が５０ｍｌコニカル管に移せるように、実施例１３で調製した分 散液１００ｍｌをペレット化する。管の容積を４０．０ｍｌに調節する。次に内 容物を１０ｍｌづつ４本の１５ｍｌコニカル管に移す。１０００ｍｇのピロキシ ダル−５−ホスフェートを８０μｌの１０Ｎ ＮａＯＨで溶解し次に水で調節し て１０ｍｌにする。この透明の黄色溶液を０．２μｍのアクロディスクで濾過滅 菌し、その２．５ｍｌづつを、先に調製した４本のブルッシャイト管の各々に添 加する。各管を数秒間、渦巻き攪拌して、確実に内容物を充分に分散させる。低 い乾燥速度の設定で一夜（約１６時間）凍結乾燥する。翌朝、５０ｍｌづつの滅 菌ＨＰＬＣグレード水中にさらに５回再懸濁させる。もう１回ペレット化し、そ のペレットを４本のコニカル管に移し、製剤の最終容積を水で調節して４０．０ ｍｌにする。実施例２３． シトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）の分子安定化被膜によるリン酸カ ルシウム二水塩（ブルッシャイト）の綿密に清浄な表面のコーティング ブルッシャイト／シトレート 全内容物が５０ｍｌコニカル管に移せるように 実施例１３で調製した分散液１００ｍｌをペレット化する。管の容積を４０．０ ｍｌに調節する。内容物を１０ｍｌづつ４本の１５ｍｌコニカル管に移す。１０ ０ｍＭシトレート液１０ｍｌづつを１５ｍｌコニカル管の各々に添加し３０分間 室温で旋回振盪させる。低乾燥速度の設定で一夜（約１６時間）凍結乾燥する。 翌朝、５０ｍｌづつの滅菌ＨＰＬＣグレード水中にさらに５回懸濁させる。もう １回ペレット化し、そのペレットを４本の１５ｍｌコニカル管に移し、最終製剤 容積を水で調節して４０．０ｍｌにする。実施例２４ ブルッシャイト上へのインスリンの固定化 インスリンの添加 実施例１５で調製した４個の１０ｍｌづつの懸濁液に各々 、１００単位づつインスリンを添加し、旋回振盪器で４℃にて撹拌する。 １）凍結乾燥：二つのコア製剤と、低乾燥速度設定下、Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅ ｅｄ Ｖａｃ（ＳＶＣ１００）で一夜（約１６時間）凍結乾燥する。翌朝、凍結 乾燥物をＨＰＬＣグレードの滅菌水で懸濁させて１０ｍｌにする。ペレット化と 再懸濁によって、水を用いて３回洗浄を行う。各洗浄中、続けて１．０ｍｌづつ を取り出し２７２ｎｍの波長の光の吸光度を測定することによって活性を測定す る。上澄み液（担体）中に活性がないことが測定された場合、製剤は注射用１ｍ ｌ当り約４．０単位である。典型的な注射液は５００μｌ（２．０単位）である 。 所望により、インスリンが固定化されたブルッシャイト粒子を以 下のようにリン脂質で被包してもよい。 インスリンを凍結乾燥した後、各製剤を、１０％のホスファチジルコリン、１ ０％のホスファチジルセリンおよび５％の水溶性コレステロールの水分散液（Si gma Biochemical社）で１０．０ｍｌにする。その混合物をロッカー上で４℃に て一夜インキュベートする。翌朝、著しく発泡させることなく、１９ゲージのｎ ｅｅｄｅｄを通じて混合物を押し出す。ペレット化と再懸濁を行って水で３回洗 浄する。各洗浄中、続けて１．０ｍｌづつ取り出し２７２ｎｍの波長の光の吸光 度を測定して活性を求める。上澄み液（担体）に活性がないことが測定された場 合、製剤は注射用１ｍｌ当り約４単位である。典型的な注射液は約５００μｌ（ ２．０単位）である。 生体内試験によって、コートされたブルッシャイト粒子に固定化されたインス リンを静脈に注射すると溶液相インスリンと同じ生理活性（血清グルコースの抑 制）を示すことが分かる。コーティングがないと、インスリンは、ブルッシャイ トに固定化されると生物活性をすべて喪失する。実施例２５． セロビオースでコートされたセレン化亜鉛に対するウシ血清アル ブミンの固定化 この実施例ではフーリエ変換赤外分光法に用いられる分析装置の表面の改質に ついて説明する。綿密に洗浄されたＺｎＳｅ製試料ホルダーの高エネルギー面は セロビオースの安定化被膜によって改質される。これによってタンパク質の配座 の分析に用いる独特の試験面が提供されるが、物質の生体適合性を改善するのに も利用できる。 試料の調製 ＡＴＲの試料ホルダーをコートする表面被膜はセロビオースで構 成され、被検体はウシ血清アルブミンであった。１００ｍＭのセロビオース溶液 （Sigma社のＤ−（＋）セロビオース、Ｆ Ｗ＝３４２．３固体形）をＨＰＬＣグレードの水（Sigma社）で調製した。固体 ウシ血清アルブミン（Sigma社、分子量４６０００）をリン酸緩衝食塩水（Sigma 社、ダルベッコリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）に溶解して所望の濃度４％（ｗ／ ｖ）を得た。溶液はすべて調製してから１４日以内に使用し、試験と試験との間 は４℃で貯蔵した。 ＡＩＲ試料ホルダーの製造 横形ＺｎＳｅ−４５°ＡＴＲ試料ホルダー（Spec tra-Tech model,米国コネティカット州スタンフォード）にセロビオースの乾燥 被膜を積層する前に、そのプレートは１００ｍＭＮａＣｌと１００ｍＭＮａＣＨ Ｏ3の溶液で続いてＨＰＬＣグレードの水およびアセトンで徹底的に洗浄した。 ４００μｌの１００ｍＭセロビオース溶液を均一に塗布し次いで熱を加えたり回 転させることなく１０分間凍結乾燥する（Ｓａｖａｎｔ ＳＶＣ１００凍結乾燥 器、米国ニューヨーク州ウェズバリー）ことによってその結晶の洗浄表面にセロ ビオースの被膜を吸着させた。次に４％ＢＳＡ溶液１００μｌをセロビオースの コーティングに加えた。過剰のタンパク質溶液をゆるやかに吸引することによっ て除き、次いで試料をＦＴＩＲチャンバーの両者をＮ2で１５分間パージした。 固定化されたＢＳＡは、ＡＴＲ−ＦＴＩＲで分析したところ、二次構造成分が 比例分布（proportional distribution）している点からみて未結合水性相ＢＳ Ａと同じ配座を有していることが分かった。実施例２６ 炭素セラミックコアへのアンギオテンシン変換酵素の固定化 上記諸実施例に記載した手順によってコートした炭素ナノ結晶粒子にアンギオ テンシン変換酵素を固定化した。溶液相における基質分解速度すなわちＢＲＰ生 成の速度は、固定されていない酵素について溶液相で観察される基質分解速度の ５倍になることが分かった。 未コートの粒子に直接結合させたアンギオテンシン変換酵素の基質分解速度は、 固定されていない酵素の２．５倍に過ぎなかった。実施例２７ セロビオースでコートされたブルッシャイト粒子の製造とヒト血清 トランスフェリンタンパク質の表面吸着 ブルッシャイトナノ結晶粒子は実施例９に記載されているようにして製造する 。 セロビオースをコートされたナノ結晶コアにタンパク質を吸着させるため、コ アの試料を、Ｃａ++とＭｇ++を含有していないリン酸緩衝食塩水（Gibco社）で １０．０ｍｌまで希釈する。次に４０．０μｇの精製ヒト血清トランスフェリン （４μｇ／μｌ）（Gibco社）（その抗原性はＥＬＩＳＡ法で確認されている） を１０ｍｌの撹拌セル（Spectra社）に添加する。泡立たせないように充分注意 しながら試料を３０分間ゆるやかに撹拌する。添加を終わってから、２ｐｓｉ窒 素ガス圧ヘッド下、１５ｍｌのＣａ++とＭｇ++を含有しないリン酸緩衝食塩水（ Gibco社）でセルを通じて洗浄する。洗浄後、試料をＮ2雰囲気下、１．００ｍｌ まで再び濃縮し、次いで５００μｌの試料を取り出し、光子相関分光法、ドップ ラー電気泳動光散乱法および透過型電子顕微鏡法によって下記のように分析する 。 配座の完全性は結合タンパク質が保持する抗原性を測定することによって評価 する。試料セルに対し、５０．０μｌのウサギポリクローナル抗ヒトトランスフ ェリン抗体（Dako社）（その抗原性はＥＬＩＳＡ法で確認されている）を、濃縮 された１．０ｍｌの反応生成物にゆるやかに撹拌しながら３７．５℃で添加する 。３０分間インキュベートした後、２ｐｓｉ窒素ガス圧ヘッド下、１５ｍｌのＣ ａ++とＭｇ++を含有していないリン酸緩衝食塩水（Gibco社）でセルを通じて洗 浄し、反応容積を再び１０．０ｍｌに減らす。 ブロッキング剤である、２価イオンを含有しない食塩水中１％ｗ／ｖのウシ血 清アルブミン２００μｌを添加し続いて１０分間平衡化させる。次に二次抗体： ３０ｎｍ金を接合したヤギ抗ウサギポリクローナルＩｇＧ（Zymeｄ社）を添加し 、その反応混合物を３０分間インキュベートする。試料を取り出し、透過型電子 顕微鏡法のグリッド上にチョップ（ｃｈｏｐ）して減圧乾燥を行う。混合物を、 窒素圧力ヘッド下、１５ｍｌの二価イオンを含有しない食塩水で再び洗浄し次い でグルタルアルデヒドで固定する。その混合物に、１ｍｌの３％固体ウシコラー ゲン溶液（Collagen Corp.社）を添加し、その複合体を１０6×ｇで３０分間、 超遠心分離に付してペレットにし、そのペレットを透過型電子顕微鏡法用の生物 学的試料として通常どおりに処理した。 トランスフェリンを結合させると、そのブルッシャイト／セロビオース／タン パク質接合体は大きさが約１５０ｎｍである。炭水化物で処理されたナノ結晶Ｔ ＣＰ粒子の表面に吸収されたタンパク質の生物活性は保存されている。実施例２８ 綿密に清浄な生物分解性ナノ粒子の製造 １．１管当たり５００ｍｇの生物分解性粒子が入っている６本の清浄音波処理 管を準備する。 ２．ヒュームフード内で、管に１管当たり約８ｍｌのＨＣｌ（１０Ｎ）を満た す。 ３．３０分間、音波処理を行う［全電力（１７５ワット）／２５℃］；１回音 波処理毎に３本の管。 ４．２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかける。 ５．酸性上澄み液をデカントし（ヒュームフード内で）、管をＨＰＬＣグレー ド水で満たし次に渦巻き撹拌を行う。 ６．３０分間音波処理を行い（上記条件）、次に３０分間遠心分離を行う（上 澄み液が透明になれば遠心分離は完全である）。 ７．上澄み液をデカントし、ついで管にＨＰＬＣグレードの水を満たし渦巻き 撹拌を行う。 ８．ステップ７と８をさらに２回繰り返す。 ９．製剤を清浄なガラス（パイレックス）製ベーキング皿にデカントする。 １０．２１０℃で一夜アニールする。 １１．清浄な非塗装スパチラでゆるやかにはがしとることによって乾燥した生 物分解性結晶を取り出し、６本の清浄なガラス製音波処理管に移す。 １２．ステップ３〜８を繰り返す。 １３．１０ＫＤ（ＮＭＷＬ）１５０ｍｌ限外濾過セルを準備し、管のうち１本 だけ内容物を空にしてセル中に入れ（濾過試験当たり５００ｍｇにすぎない）、 次に２０ｐｓｉ（レギュレーター圧力ゲージの示度）のＮ2圧力ヘッド下５００ ｍｌのＨＰＬＣグレードの水でセルを通じて洗浄する。 １４．洗浄後、セルの側部の適当な容積マーキングを用いることによって製剤 の容積を１００．０ｍｌに調節する。 １５．１．０ｍｌの製剤をセルから取り出し次いで予め秤量した１．７ｍｌの エッペンドルフ管内で凍結乾燥することによって濃度を測定する。凍結乾燥を行 った後、その内容物とともに管の重量を測定し、その重量を空の管の重量から差 し引く。これによって製剤の初期密度が得られる。溶液中の粒子の濃度または密 度は好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌである。初期密度が１０ｍｇ／ｍｌより低い場 合、溶液は限外濾過セルでさらに濃縮しなければならない。実施例２９ 分子安定化被膜（セロビオース）による綿密に清浄な生物分解性ナ ノ粒子のコーティング インキュベーション／凍結乾燥 １．実施例７で調製した綿密に清浄な生物分解性粒子（水性分散液）を、全電 力（１７５ワット）で２５℃にて３０分間音波処理を行う。 ２．小容積の場合は卓上型微量遠心分離器（３０秒間、全回転速度１４，００ ０ＲＰＭ）を用いまたは大容積の場合は床上型遠心分離器（モデル２１Ｋ、５０ ｍｌ遠心分離管、最高２分間８，０００ＲＰＭ）を用い、懸濁媒体を、水（貯蔵 物）から５００ｍＭセロビオース溶液にできるだけ速く交換する。ペレット化さ れた粒子を５００ｍＭセロビオース溶液で懸濁させ、分散を促進するため音波処 理を行い［全電力（１７５ワット）で約５分間２５℃］、次に最後に混合物を冷 室（４℃）中、ロッキングプレートに一夜取り付ける。 ３．翌日、その混合物を適当な大きさの容器に分けて一夜凍結乾燥する。 ４．ふたのまわりをパラフィンの層で覆い管を洗浄のステップまで冷凍器内に 入れる。 ５．用途によって適当な緩衝液で粒子／セロビオースを再構成する。適切な緩 衝液は低イオン強度のリン酸緩衝液（ＰＲＢ）、水または重炭酸塩溶液である。 緩衝液での再構成は、渦巻き撹拌と５分間の音波処理（１７５ワット／２５℃） によって行う。 ６．遠心分離［小容積の場合は卓上型微量遠心分離器（３０秒間、全回転速度 １４，０００ＲＰＭ）を用いまたは大容積の場合は床上型遠心分離器（モデル２ １Ｋ、５０ｍｌ遠心分離管、最高２分間８、０００ＲＰＭ）を用いる］と緩衝液 中への再懸濁を繰り返して洗浄 する。 ７．１ｍｌの懸濁液を取り出し、凍結乾燥器を用い、予め秤量した１．７ｍｌ のエペンドルフ管内で脱水して塊にして濃度を測定する。 ８．濃度を１ｍｇ／ｍｌにするのに必要な最終容積を計算する。粒子／セロビ オース製剤の濃度を１ｍｇ／ｍｌにするのに充分な量の緩衝液を添加する。実施例３０ ヘモグロビンを結合させた、セロビオース被覆ブルッシャイト粒子 の製造 以下の実施例によって、本発明のヘモグロビンを結合されたブルッシャイト粒 子の製造について説明する。この製造工程は、超微細ナノ結晶ブルッシャイト粒 子を二種類のガラス状被膜でコートし次いで精製ヘモグロビンを物理的に吸着さ せることで構成されていた。得られた集合体をリン脂質でコートした。 実施例２８の場合のようにして製造した超微細粒子１．００ｇを、１７５ワッ トで１０分間音波処理を行うことによって（Branson）５．０ｍｌの１０ｍＭセ ロビオース（Sigma社）溶液中に分散させた。得られたコロイドを１０ＫＤ撹拌 セル中で４．０℃にて一夜インキュベートした。翌日このコロイドを２４時間凍 結乾燥し次いで１．０ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中に再構成した。未吸収のセロビオース を、１００ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ＰＲＢ）に対して１０ ＫＤセル限外濾過（ＵＦ）（Ｆｉｌｔｒｏｎ）によって除き、２．０ｍｌに調整 した。１００ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ＰＲＢ）に対する（ ＵＦ）および２．０ｍｌへの調整。 ５００ｍｇのヒトヘモグロビンＡ0型（Sigma社）を５．０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ ６．８）（Ｇｉｂｃｏ社）に溶解し、次に５９ＫＤ撹 拌セル中３０ｐｓｉ Ｎ2を用い４．０℃にて１５０ｍｌＰＲＢに対して限外濾 過を行った。濾液を３．０ｍｌに調節した。次に表面改質ブルッシャイト分散液 （２．０ｍｌ）を５０ＫＤ限外濾過セルに添加し、ゆっくり撹拌しながら一夜イ ンキュベートした（５ｐｓｉ Ｎ2）。濾液を３．０ｍｌに調節した。次に表面 を改質したダイヤモンドの分散液（２．０ｍｌ）を５０ＫＤ限外濾過セルに加え 、ゆっくり撹拌しながら一夜インキュベートした（５ｐｓｉ Ｎ2，４．０℃） 。翌朝、３５μｌのホスファチジルジパルミトイルセリン（１０ｍＭの６．０ｍ Ｍ ＮａＯＨ）（Sigma社）、５０μｌのホスファチジルジパルミトイルコリン （６．８ｍＭ 貯蔵物）（Sigma社）および８．７μｌのコレステロール（３． ９ｍＭ 貯蔵物）（Sigma社）を加えて撹拌し、約６．０時間インキュベートし た。最終生成物を３０ｐｓｉ Ｎ2を用い２０ｍｌＰＢＳに対して５０ＫＤ限外 濾過セルで再び濾過した（ｐＨ７．４、４．０℃、推定ヘモグロビン濃度が１０ ｇ／ｄｌになるよう５．０ｍｌに調節した）。実施例３１． ヘモグロビンを結合させた、Ｐ５Ｐ被覆ブルッシャイト粒子の製 造 この実施例では、ピリドキサル−５−ホスフェートを酸素担体固定コーティン グとしてセロビオースの代わりに使用することを除いて実施例３０と同じ方式で 赤血球代用品を製造した。 酸で洗浄した粒子５０ｍｇを１７５ワットで１０分間音波処理を行って（Ｂｒ ａｎｓｏｎ）分散させ、７５．０ｍｇのピリドキサル−５−ホスフェート（Ｓｉ ｇｍａ社）と混合し、次に脱塩水を用いて１０．０ｍｌに調節した。混合物を遠 心分離し一夜凍結乾燥し、４〜１０ｍｌの脱塩水で洗浄し次にｐＨ７．４０、２ ０ｍＭリン酸緩衝液で再構成して２５ｍｇ／ｍｌにした。 ４．０ｍｌ（２５ｍｇ／ｍｌ）のナノ結晶コア粒子を回収赤血球溶解ヘモグロ ビン１０ｍｌ（２６．１０ｇ／ｄＬ）に加えた。得られた混合物を、２０ｐｓｉ の窒素圧力ヘッドで１０ＫＤ限外濾過セルを通じて４．０℃にて一夜、１００ｍ ｌの０．５×ＰＲＢ中にゆっくり透析した。翌朝、３４μｌのホスファチジルセ リン（１０ｍＭの６．０ｍＭＮａＯＨ）（Ｓｉｇｍａ社）、５０μｌのコレステ ロール（３．９ｍＭ貯蔵物）（Ｓｉｇｍａ社）を加えて撹拌し、約６．０時間イ ンキュベートした。最終生成物を３０ｐｓｉＮ2を用い２００ｍｌのＰＢＳに対 し５０ＫＤ限外濾過セルで再び濾過して遊離のヘモグロビンを除き（ｐＨ７．４ ，４．０℃）、次いで１．０〜２．５ｍｌに調節して推定ヘモグロビン濃度が１ ０ｇ／ｄＬになるようにした。 上記の手順を、異なる濃度のピリドキサル−５−ホスフェートで繰り返した。 その結果、１ｍＭのピリドキサル−５−ホスフェートおよび３０ｍＭのピリドキ サル−５−ポスフェートをそれぞれ含有する溶液でナノ結晶粒子をコートしてな る赤血球代用品が製造された。 実施例３０と３１で製造した赤血球代用品について、粒径分布、電気泳動移動 度および保持されている分子配座のみならず酸素解離の特性を分析した。セロビ オースでコートされた赤血球代用品（実施例３０）は約２６〜３０ｍｍＨｇとい う酸素解離分圧（Ｐ５０）を示した。ピロキシダル−５−ホスフェートのコーテ ィングを有する赤血球代用品は約３７ｍｍＨｇという酸素解離分圧（Ｐ５０）を 有していた。この酸素解離分圧はヒト全血の酸素解離分圧３１ｍｍＨｇに充分匹 敵している。さらに、脂質のコーティングを除外したことを除いて実施例３０と 同じ方式でヘモグロビン結合ナノ結晶粒 子を製造した。得られた脂質なしのヘモグロビン結合ナノ結晶粒子の酸素解離分 圧は約１０ｍｍＨｇであった。 実施例３０と３１で製造した赤血球代用品の電気泳動移動度をドップラー電気 泳動光散乱分析法で測定した。（ＤＥＬＳＡ ４４０、Coulter Elctronics，In c.社、米国フロリダ州ハイアリーア所在）。その電気泳動移動度は、２５℃でｐ Ｈ７．４ ＰＲＧＢ ＢＵＦＦＥＲにて−１．７μｍ／Ｖｓであった。 実施例３０と３１で製造された赤血球代用品の粒径分布を２２．５℃にてＰＲ Ｂ緩衝液中、９０°の角度で光子相関分光法（Ｎ４ＭＤ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）によ って、および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ，Ｚｅｉｓｓ１９０）によって測定し た。これらの赤血球代用品の大きさは光子相関分光法で測定したところ約２００ ナノメートルであった。電子顕微鏡法の場合、粒子含有溶液の１０μＬの液滴を パラフィン面上に置き、その液滴の頂部には炭素で安定化したＦＯＲＭＶＡＲ ＧＲＩＤ（Ted Pella，Inc.社、米国カリフォルニア州レディング）を浮かべた 。ＴＥＭ ＧＲＩＤの表面電荷は高いので、赤血球代用品は、グリッドに吸収さ れ過剰の溶液は注意深くブロットすることによって除くことができた。次に類似 の方法を用いて粒子を２％のリンタングステン酸で染色した。染色されたグリッ ドを乾燥し、赤血球代用品が５０〜１００ナノメートルの範囲の粒径を有してい ることが確認された。 赤血球代用品の配座の完全性は免疫金抗体アフィニティーの強度で確認された 。１ナノメートルのＴＥＭ銅グリッド上に堆積させた後、タンパク質結合粒子を 、ポリクローナルウサギ抗ヒトヘモグロビン抗体（Dako社）および二次ヤギ抗ウ サギ３０ナノメートル金標識化抗体（Zymed Laboratories社、米国カリフォルニ ア州サンフラ ンシスコ所在）とともに２７℃で１時間インキュベートした。金標識化抗体は、 赤血球代用品中に存在するヘモグロビンに強く付着することが観察された。実施例３２ タキソールを結合させた、Ｐ５Ｐ被覆ブルッシャイト粒子の製造 この実施例では、タキソールをヘモグロビンの代わりに用いることを除いて実 施例３０と同じ方式で医薬送達媒体を製造する。 洗浄した粒子５０ｍｇを１７５ワットで１０分間音波処理して（Branson）分 散させ、７５．０ｍｇのピリドキサル−５−ホスフェート（Sigma社）と混合し 、次いで脱イオン水で１０．０ｍｌに調節した。得られた混合物を遠心分離し、 一夜凍結乾燥し、４〜１０ｍｌの脱イオン水で洗浄し次にｐＨ７．４０の２０ｍ Ｍリン酸緩衝液で再構成して２５ｍｇ／ｍｌにした。 ４．０ｍｌ（２５ｍｇ／ｍｌ）のナノ結晶コア粒子を１．０ｍｌの可溶化タキ ソール（１００ｍｇ／１０ｍｌ ｄｄ Ｈ2Ｏ）に添加した。得られた混合物を 、２０ｐｓｉの窒素ヘッド下、１０ＫＤ限外濾過セルによって１００ｍｌの０． ５×ＰＲＢに対し一夜４℃でゆっくりと透析し、次に凍結乾燥を行った。翌朝、 ３４μｌのホスファチジルセリン（１０ｍＭの６．０ｍＭ ＮａＯＨ）（Sigma 社）と５０μｌのコレステロール（３．９ｍＭ貯蔵物）（Sigma社）を加えて攪 拌し、約６．０時間インキュベートした。最終生成物を再び、３０ｐｓｉ Ｎ2 を用い２００ｍｌ ＰＢＳに対し５０ＫＤ限外濾過セルで濾過した（ｐＨ７．４ 、４．０℃）。実施例３３ トランスフェクション物質の付着 下記の手順を用いて、前記諸実施例に記載した被覆粒子のいずれかにＤＮＡま たはＲＮＡのセグメントを付着させる。 ４０ｍｇ／ｍｌの被覆ナノ粒子の２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８０による分 散液を製造する。この分散液に、塩化セシウムで精製したＤＮＡまたはＲＮＡの フラグメント１．００μｇを添加し、室温でゆるやかに攪拌しながら約１６時間 吸収させる。この実施例で用いられる特定のＤＮＡフラグメントはヒトのデアミ ナーゼ遺伝子である。実施例３４ ターゲッティングリガンドとリン脂質膜の付着 ターゲッティングリガンドとリン脂質膜の単離と付着についてこの実施例で述 べる方法は、前記諸実施例に述べた粒子／コーティング／ＤＮＡまたはＲＮＡの すべての組合わせに利用できる。 ウイルスの１０6のトランスフォーミング単位を、Ｔｒｉｔｏｎ抽出緩衝液（ １．０％Ｔｒｉｔｏｎ×１００／０．２５ｍＭ ＤＴＴ／１０ｍＭトリスｐＨ７ ．４／１．０ｍＭ ＭｇＣｌ）とともにインキュベートする。次に抽出物を１０ ０，０００ｘｇで２時間４℃で超遠心分離にかけて（３５ｒｐｍ，ＳＷ５０．１ Ｂｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｏｒ）ヌクレオキャプシドを除去する。ポリスチレン マイクロビーズ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｇｅｌ Ｄ２）のスラリー３００μｌととも にインキュベートし次いでリン酸緩衝液中の５ｍｇ／ｍｌのホスフォチジルコリ ンおよび５ｍｇ／ｍｌのホスフォチジルセリンに対し１００ＫＤ限外濾過を行う ことによってトリトンの除去とエンベロープタンパク質の濃縮が達成される。ウ イルス抽出の別法は以下のとおりである。２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の ホスフォチジルコリン（５ｍｇ／ｍｌ）とホスフォチジルセリン（５ｍｇ／ｍｌ ）の混合物は４．０℃で３０分間音波処理を行う。１ｍｌ当り１０6単位のウイ ルスを１．０ｍｌのリン脂質混合物に添加し、１ｍｉｎ当り５秒のサイクルで３ ０分間音波処理を４０℃で行う。 ヌクレオキャプシドは、３５０００ｒｐｍで４０℃にて超遠心分離にかけること によって除去する。炭水化物の介在層をまずＴＣＰ−ＤＮＡ／ＲＮＡ複合体に吸 着させてからリガンド／膜成分を添加する。実施例３５ 一つの構造体は、アルブミンエンハンサーとゲノム取り込みのための限定末端 重複とを有する発現カセット中のヒトデアミナーゼ遺伝子からなる第一層が吸着 したブルッシャイトコアで構成されている。その構造体には、セロビオースの第 二層とヒトの低密度脂質由来の膜タンパク質（ＬＤＬ受容体リガンド）の第三層 が吸着している。 引用文献はすべてその全内容を本明細書に援用するものである。 本発明の代表的な実施態様を説明してきたが、開示したのは代表例だけであり 、他の各種の変形、適用および改変は本発明の範囲内で実施できることは当該技 術分野の当業者であれば分かるであろう。したがって本発明は本明細書に例示し た特定の実施態様に限定されず後記特許請求の範囲にのみ限定される。Detailed Description of the Invention                 Chemical catalysis and cell receptor activation                         Biochemically active substances for                                  Background of the Invention   This application is pending US patent application Ser. No. 07/542, filed June 22, 1990. No. 0,255 filed on April 24, 1991, which is a continuation-in-part application of No. Pending Central America filed on January 4, 1993, which is a continuation-in-part application of 7 / 690,601. It is a partial continuation application of national patent application No. 08 / 000,199.1.   Field of the invention   This invention generally relates to synthetic bioactive compositions having a core of fine particles (nanoparticles). About things. In one aspect, the invention provides transfecting DNA or RNA (transfecting DNA or RNA) core of fine particles Targeting membrane or ligand (targeting membrane or ligand) coated bioactive composition. These transfections Nanoparticles deliver transfecting DNA or RNA to target cells Useful for. In another aspect, the invention features a chemical catalyst and / or cell receptor. It relates to synthetic biochemically active substances useful for activating a body. This invention , Also to a bioactive composition in which the core of the fine particles is biodegradable.2.   Description of related technology   A biologically active protein, peptide or drug is attached to various carrier particles. The technology for making is a technical field that is being enthusiastically studied. These joined biology Systems reduce the toxicity of bioactive substances. It is expected to increase the effectiveness, and reduce the cost. as a result, Many different carrier models are currently available. (Edited by Goldberg, E.P .: Polymers in Biology and Medicine, New York, Wiley, Vol. 2, pp. 73-88 (198). 3 years) Varga, J.M. and Asato, N. report. Juliano, R.L.Edit: Biological Approa ches to the Delivery of Drugs, Ann.N.Y.Acad.Sci., Volume 507, 104-11 Report of Ranney, D.F. and Huffaker, H.H., page 9 (1987). ) Nanocrystalline Micron-sized inorganic substrates are the most common carriers, and proteins are the most commonly used carriers. It is a substance to be combined. For example, gold / protein ( Not only immunoblotting method but also optical microscopy. Of immunological labels in microscopy, transmission electron microscopy and scanning electron microscopy Used in applications. (Faulk, W. and Taylor, G. report Immunochemistry, 8: 1081-1083 (1971). Report of Hainfeld, J.F. Nature, 3 Volume 33, 281-282 (1988)   Silanized iron oxide protein conjugates generally 500-1500 nm in size (Mainly antibodies) are useful for various in vitro applications that can take advantage of paramagnetism. I know there is. (Research Products Catalog, Advanced Magnetics , Inc., Cambridge, Mass., USA, 1988-1989) Ugel stad et al. produced a gamma iron oxide core coated with a thin polystyrene shell. ( Nustad, K., Johansen, L., Schmid, R., Ugelstad, J., Ellengsen, T., Berge, A. Report: Covalent coupling of proteins to monodisperse particles. Preparatio n of solid phase second antibodyo Agents Actions 1982, 9: 207 ~ 212 pages (id.no.60),) The obtained 4500 nm beads are paramagnetic. Relatively new Not only the advantages but also the adsorption performance of polystyrene latex beads was demonstrated.   Carrier systems designed for in vivo applications can be made from both inorganic and organic cores. Has been done. For example, Davis and Illum are polyoxyethylene and polyoxyp Outer coat of poloxamer, a block copolymer of ropylene, Demonstrates remarkable performance of bypassing liver and splenic macrophages A 60 nm system consisting of a polystyrene core having (Davis, S.S . And Illum, L., Biomaterials 9: 111-115 (1988)). Drug delivery by these particles has not yet been demonstrated. Ranney and Huffaker Iron oxide / albumin / pharmaceutical system producing paramagnetic drug carrier of 350-1600 nm Reported. (Juliano, R.L.Edit: Biological approaches to the delivery of  Ranne, drugs, Ann.N.Y.Acad.Sci. 507, 104-119 (1987). y, D.F. and Huffaker, H.H.) Poznasky reported the apparent antigenicity of natural enzymes. Enzyme, albu, which appears to reduce the susceptibility of the product to biodegradation The min-junction system was developed. (Juliano, R.L.Edit: Biological approaches to the  delivery of drugs, Annals New York Academy Sciences, 1987, 507. Poznasky, M.J., Vol. 211-219: Targeting enzyme albumin conj ugates. Examining the magic bullet. )   Shaw et al. Produced and characterized lipoprotein / drug conjugates. Was. (Edited by Juliano, R.L .: Biological Approaches to the delivery of drugs , Annals New York Academy Sciences 1987, 507, 252-271. Shaw, J.M., Shaw, K.V., Yanovich, S., Iwanik, M., Futch, W.S., Rosowsky, A., S chook, L.B. Report: Delivery of lipophilic drugs using lipoproteins) It is relatively stable in these carriers and cell interactions occur, but most of the details I don't understand.   The biological composition of any conjugate will produce a protein, such as an adsorbed protein. The physical integrity and biological activity of the physical substance are preserved without triggering an adverse immune response. It is important to be preserved. Many peptides, proteins and pharmacological substances (drugs The spatial orientation and structural configuration play a role in measuring the biochemical activity of). And is known. Changes in the structural configuration of these compounds lead to a decrease in biological activity. Part or all may be lost. A change in configuration causes a biological activity. It can be caused by changing the environment around the compound or substance. For example , A drug that exhibits in vitro activity is a molecule that has previously been measured in part by its in vitro environment. May not show in vivo activity due to loss of configuration. Furthermore, the ability to capture phagocytes Carrier particle size and associated performance to minimize (phagocytic trapping) Is a major concern when attempting to use the composition in vivo. Of these factors All must be taken into account when making the carrier particles.   Biochemical phenomena consist of binary interactions between pairs of molecules. Biochemistry like this The generic names of chemically reactive pairs ("BRP") are not limited to the following: Potato, immunological pair, ligand-receptor pair, enzyme-substrate pair, drug-receptor pair, catalyst -Reactant pair, catalyst-substrate pair, absorbate-absorbent ( Absorbent vs. adsorbate-adsorbent (a There is a dsorbent) pair, and a toxin-ligand pair. At the molecular level, Almost all of the biochemical phenomena between such pairs are It includes spatial recognition by the other molecule of the offspring. The cognition conveys energy and information, produces products, initiates responses and is complex. It acts as a means of constructing various biological structures.   The spatial recognition process involves regioselective interactions and stereoselective interactions between BRPs. Both effects are included. Bound by basic biophysical laws , One of the BRPs is one of the possible spatial arrangements for both members. Only when it's physically in a restricted state and when it's like this , And if both members do not interfere with their respective interaction areas In particular, it can interact with the other member of BRP. BRP interacts The environment in which it is used greatly affects the process of spatial recognition. Bite that suppresses spatial mobility Or the environment that interferes with the molecular domain depends on the degree of inhibition and the resulting spatial conformation. Promotes or inhibits RP interaction.   An example of the former is a synthetic chemical reaction in a process known as "solid phase synthesis". Surface activation. Solid glassy polymers, crystalline materials or complex macromolecules Polymer-like solid phases have been a focus of synthetic biochemistry since the early 1960s. Was. The use of these solid phases to facilitate peptide synthesis has been demonstrated by Merrifield. Made a big progress. He was therefore awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1984. . The solid phase method was simple, rapid, did not perform isolation in the middle, and was automatic. Widely spread. The major limitation of widespread use of solid phase is that only a few surfaces It was an empirical observation that it was an effective promoter of BRP interaction.   Pharmaceutical delivery systems used to deliver bioactive materials in vivo are non- It always tends to be complicated. Most of these systems are promising for further development. And has some advantages that give it the potential, but low drug load There are many problems starting from bad and becoming unstable in vivo. Specific mark Drug delivery system capable of delivering a moderate dose of therapeutic agent to specific cells is highly desirable. Good. This type of delivery system binds the carrier to the cell through the receptor and then the Releases the drug from the carrier into the intracellular space by activating the mechanism of externalization Must. Also, the carrier must be biodegradable, and It should not elicit any type of immune response or immune response. The delivery system is , Specific, yet highly effective and non-targeted toxicity Must be low. The delivery system is convenient to administer and manufacture, and And both manufacturers must be economical.   Although a large number of various carrier particles have been developed, the biologically active peptide, tampa To attach the protein or drug in a manner that promotes stability in its active configuration. There is a continuing need for carrier particles for both in vivo and in vitro applications. You. For the activation of chemical catalysts and cellular receptors, individual catalysts can destroy their catalytic activity. It is desirable to develop a synthetic surface that can be attached without breaking. Also , Such a surface may have a biochemically reactive pair (BRP), such as a catalytic substrate pair, Useful for immobilization without compromising the performance of those pairs that promote biochemical reactions. It is for.   So far, human gene therapy has been used to transfect tissue in culture dishes. It has been limited to extracorporeal protocols where it is returned to the body first. In-vivo operation is Since it is still in the pre-clinical development stage, and safety and efficacy limitations are issues, Limited to animal models You. Such problems are mainly due to the use of viral vectors for gene transfer. It results from using. Retroviruses are safe for almost 100% of target cells outside the body. Transfection of retroviruses Interest is increasing in the action. Transfected but replication defective Leto The production of rovirus is basically a packaging that cannot produce wild-type virus. Depending on the cell line. However, low titer "wild type" (replicating Viruses have been observed. Spirits using such protocols In long-term animals, the sudden appearance of lymphomas suggests that wild-type It was related to the detection of Ils. In addition to potential pathogenicity, these vectors It is difficult to maintain a useful transfecting titer of a protein. Those Is difficult to purify and concentrate because the envelope is very unstable. Instead, adenovirus has been found to be considerably more stable. further , These viruses transfect quiescent tissues and produce large amounts of gene products. Can live. Unfortunately, viral genomes often remain extrachromosomal, so , Gene expression is often transient expression. Once the vector is replicated, the host Protein synthesis is abnormal, causing harmful effects ranging from tumorigenesis to cytotoxicity. Direct clinical use is problematic as it can lead to clinical consequences.   Considering the practical problem of virus transfection in vivo, the The Ils method is also under development. Currently, the most focused efforts are on receptor-mediated metastasis. Is the law. This is because this method targets DNA (and RNA) in vivo. This is because it can be delivered toward. The receptor-mediated system is recognized by cell receptors on the cell surface. Can To utilize the ligand DNA (and RNA) complex. Internals of this complex Rization is the shape of endocytic vesicles that can be transported into the cytoplasm. Happens through success. However, this endosome destroys the contents of lysosomes. When fused with, a problem occurs. Therefore, transfection of these complexes The rate remains below clinical efficacy. Transfection by some researchers In order to interrupt the production of endosomes that increase the speed, influenza hemoglobin A fusion-inducing peptide of rutin A (Influenza Hemmoglutin A) was used. And also Regardless, in vivo data show that this method only allows transient expression of genes Suggests that.   In addition to the ligand DNA (and RNA) complex, lipofect (lipofect Ion) method was also tried and succeeded to various degrees. Liposomes are especially Lutherant organs are more likely to be taken up and transfect them in vivo Incorporated into peripheral tissues by macrophages that limit the efficiency and specificity of easy.   From the above, cells can be treated with DNA or R in both in vivo and in vitro environments. It is desirable to provide a composition that can be used to transfect with NA Good.                                  Summary of the Invention   According to the invention such as biologically active peptides, proteins or drugs BRP members are attached to core particles to provide a wide variety of bioactive compositions. You. The present invention modifies the surface of ultrafine particles (nanocrystalline particles) with a surface coating. And attaching the bioactive moiety to the structural environment in which the bioactive moiety is naturally present. When it becomes possible to produce a composition that is sufficiently copied to preserve biological activity It is based on the findings. In accordance with the present invention, nanocrystalline particles The coating that attaches the active substance is a basic or modified sugar or oligo. It may be composed of lygonucleotides. Use nanocrystalline particles with basic sugar or When coated with lygonucleotides, these particles will be labeled as bioactive moieties such as BRP. Changes in surface properties such as surface energy that are sufficiently suitable for attaching Occurs.   According to the present invention, ultrafine core particles having a diameter of less than about 1000 nanometers are used. The catalyst particles such as oxygen can be immobilized without denaturing the catalyst. You. Coating the surface of the core particle allows the catalyst to be applied directly to the particle surface. A fixed surface is created which prevents the combined catalyst from substantially changing to another state. Ma The octopus-coated particles can be used as catalyst-substrate without destroying the catalytic activity of BRP. Useful for immobilizing biologically reactive pairs such as (enzyme-substrate) pairs.   The present invention also includes attaching BRP to a macroscopic surface such as a film or solid surface. It also includes dressing. Immobilizing BRP on this type of high surface area system , Activation of chemical catalysts or cell receptors can be achieved by the fine particles provided by the immobilized particles of the nanocrystalline core. Independent of or not required for microgeometry Useful when   In another aspect of the invention, a biologically active peptide, protein or agent is A wide range of bioactive compositions can be obtained by attaching to biodegradable core particles. The present invention , Bioactive by modifying the surface of ultrafine particles (nanocrystalline particles) with a surface coating When attached to a moiety, the naturally-occurring portion of the bioactive moiety preserves bioactivity Based in part on the discovery that it is possible to produce compositions that closely resemble the structural environment ing. Core with surface coated and then bioactive moieties attached The particles also have targeting agents such as bioactive ligands or phospholipid membrane complexes. Coating material.   The present invention also provides a combination of biodegradable core particles with a bioactive agent or drug. A bioactive core can be obtained, and that core is further targeted. Selective targeting of biochemically active cores in vivo by treatment with a membrane or membrane complex. It is based in part on the finding that it can   One feature of the invention is that the nanocrystalline core is composed of crystalline calcium phosphate. It is composed of a brushite. This substance Is a biodegradable and inexpensive substance found in humans as a substrate for bone synthesis. You. Particles of brushite have a size of nanometer (about 5 nm to 150 nm) Can be synthesized. Due to its small size, its drug delivery structure Avoids uptake by the body's reticuloendothelial system (RES), allowing it to Active substances in vivo without non-specific toxicity to macrophages or loss of drug Can be small enough to be delivered in.   The brushite core provides a gradual release of the drug or substance and a physiological environment. Co-crystallize with the drug or substance to protect it Can be On the contrary, the brushcheite core is, as mentioned above, the cellobiose Like sugar or pyridoxal phosphate to improve its surface adhesion properties be able to. This sugar coat does not alter the biological substances such as medicines. It can be bound in active or inactive form. This sugar is on its surface It has the function of retaining the conformation of the drug or substance to be adsorbed. This core structure is Depending on the size of the biological material, Can carry a modest load of substance.   One feature of the invention is that brushite-based particles are used in specific tissues or cells. Targeting the mold. In order to achieve this targeting, The structure is a targeting ligand or sensitized phosphorus that is firmly adsorbed on its surface. Equipped with a lipid membrane (primed phospholipid membrane) ing. This membrane contains proteins, receptors and It may contain carbohydrates. In addition, the above-mentioned membrane has stability and structure of biological material. It also helps maintain the integrity of the body. This membrane is the cell membrane, the viral envelope. Rope (see US Pat. No. 5,178,882) or other special treatment or combination It may be derived from a membrane obtained by culturing. Biodegradable core particle delivery system is large Has a very small size, the multi-layered film can be adsorbed on the core particles for targeting. The efficiency can be increased.   In one aspect of the invention, biodegradable nanocrystalline particles are used to detect viral DN. A decoy virus (deco) in which the core of A or RNA is replaced by fine particles y virus) is manufactured. The fine particles are distributed in the surrounding protein coat. The locus should be approximately the same size as the viral core so that it exactly resembles the natural virus. To be selected. The virus decoy obtained has no infectious behavior, but at the same time It is capable of conducting an immune response to and is otherwise biologically reactive as an antigen.   The bioactive microparticles of the present invention include biodegradable microparticles that are attached to their biodegradable microparticle core. It has a wide range of applications depending on the type of the physically active compound. HIV-derived virus tamper If a protein is attached to the fine particles, AIDS vaccine, diagnostic means or antibody Used as an antigenic agent to generate A decoy virus that can be obtained is obtained. Non-viral protein or antigen coater Selected and constructed for use in generating or producing specific antibodies. It can be used as a disconnecting means. Furthermore, the fine particles have a pharmacological activity. When the compound is attached to the biodegradable core particle, it can function as a drug.   The present invention provides biodegradable core particles having a diameter of less than about 1000 nanometers. It is used to immobilize catalyst particles such as enzymes without denaturing the catalyst. Core particles Coating the surface of the catalyst leaves the catalyst in a different state when directly attached to the particle surface. A fixed surface is obtained which prevents it from changing substantially. Again this coat The particles have a bioreactive pair (BRP), such as a catalyst-substrate (enzyme-substrate) pair, that is It is useful for fixing the catalytic activity of P without destroying it.   In another aspect of the invention, the transfecting DNA or RNA is nanolinked. Crystal core particles and then coated with a targeting ligand or film, A viral transfection system is obtained which can be used for gene therapy. The present invention , The surface of ultrafine particles (nanocrystalline particles) is modified with a surface coating to Attachment of fusing DNA or RNA may preserve biological activity Produces a composition that closely mimics the naturally occurring structural environment of the DNA or RNA It is based in part on the discovery of doing. Surface coated then transfect The core particles with attached DNA or RNA are further labeled with ligands or ligands. Specific cell receptors by coating them with targeting substances such as lipid membrane complexes. To target the DNA or RNA.   A feature of this aspect of the invention is that the nanocrystal core is composed of brushite. That is. This substance is biodegradable and inexpensive, It is found in humans as a substrate for bone synthesis. Brushite particles are nanometer-sized It can be synthesized with a size (about 5 nm to 150 nm). Small size like this Therefore, the DNA / RNA delivery structure is dependent on the body's reticuloendothelial system (RES). DNA / RNA is a specific poison for macrophages, avoiding uptake by Small enough to be delivered to cells in vivo without loss of sex or drug it can.   This DNA / RNA particle structure targets a specific tissue or cell type. To achieve this targeting, the structure is targeted to its surface. Firmly adsorb membranes of ligands or sensitized phospholipids. The film is Contains targeting proteins, receptors and carbohydrates . In addition, this membrane also improves the stability of the transfecting DNA or RNA. It also serves to maintain the integrity of the structure. This membrane is the cell membrane, the viral envelope. (See US Pat. No. 5,178,882) or other special treatment or composition. It may be derived from a membrane obtained by performing. Size of biodegradable core particle delivery system Is very small, the multi-layered film can be adsorbed on the core particles to improve the targeting effect. The rate can be increased. DNA / RNA transfection of the present invention Microparticles are specific DNA or RNA attached to the core of biodegradable microparticles. Has a wide range of uses.   The above and many other features of the present invention, and the attendant advantages, are set forth below. The detailed description will be better understood.                              Detailed description of the invention   The present invention is directed to antigenic substances, biologically reactive pairs (BRP) or others. There are widespread applications for immunological treatments or methods that utilize biologically active portions of. this Vaccination agents in these fields of use; used to make antibodies and then to use for diagnosis And an antigenic compound used as a diagnostic means. Further, according to the present invention The composition may include a pharmaceutical or other bioactive agent that has a specific activity in vivo and in vitro. Used for a wide variety of applications that require targeting this to a cell type be able to.   The compositions of the present invention facilitate the binding of proteins, peptides or pharmaceuticals to particles. Biodegradable nanocrystalline core particles coated with a progressive surface energy modification layer ( Diameter less than 100 nm). The coating is a nanocrystalline core grain It modifies the surface energy of the offspring to produce a wide variety of immunogenic proteins, peptides and Drug adheres to core particles without significant loss or denaturation of antigenic activity Can be able to As a result, it contains a biologically inactive core A bioactive composition is obtained. The end use of the compositions of the present invention (including gene therapy Specific proteins, peptides or pharmaceuticals attached to coated core particles Depends on For example, attach a protein or peptide having antigenic activity. Thus, a composition useful as a means for immunodiagnosis can be provided. Immunogenic activity With a coating of viable viral fragments or proteins A vaccine can be provided. In addition, to attach medicines to treat diseases Useful compositions can be provided. Also, genes useful in treating diseases Segments or antisense fragments can also be attached.   Examples of individual catalysts that can be attached to the coated core particles include: Woven plasminogen activator (whole and partial Domain); trypsin inhibitor; cytochromes; ferredoxin; phosphotra Acyltransferase; papain; LysC; ArgC; Trypsin; coagulation factor V, Xlla, Xla, Vlla; complement factor C3, C3b ; And properdin.   Core particles coated with biologically reactive pair (BRP) such as enzyme-substrate pair Can be attached to the child. A typical enzyme-substrate pair is lysozyme-key. Chin pair (in this case, lysozyme hydrolyzes glycoside bond between NAM and NAG) Ribonuclease-RNA pair (where ribonuclease is RN) Catalyze the hydrolysis reaction of A); carboxypeptidase A-carboxyl terminus A pair of polypeptides (in which case the enzyme is the carboxyl-terminal pair in the polypeptide chain). Catalyzes the hydrolysis reaction of peptide bonds); serine, zinc, thiols and carbo The xyl protease-protein pair (in this case the protease decomposes the protein Catalyze the reaction); NADH-Q reductase-NADH pair (in which case the reduct Tase catalyzes the oxidation reaction of NADH and the reduction reaction of Q); glutathione-seda Cutase-Glutathione pair; Acetylcholinesterase-Acetylcholine pair; LyC; ArgC; acyl and acyltransferase; aspartate and And aspartate carbamoyl transferase; elastase; and There are cytochromes.   Other biochemical reactions that can be immobilized on the coated solid surface of the present invention. Responsive pairs (BRP) include immunological pairs, ligand-receptor pairs, and drug-receptors. Pair, catalyst-reactant pair, catalyst-substrate pair, absorber-absorbent pair, adsorber There are members of the To-adsorbent pair and the toxin-ligand pair. Members like this Limited as Although not done, there are the following. -Immunological pair members: CD1, CD3, CD4, CD8, CD11, CD2 5, a recognition site for an epitope (cell surface antigen) on cells such as CD68 Having FC or Fab fractions, such as those in whole or in part Internal or monoclonal IgG, IgM, IgA, IgE and IgD; EBVgp350, HIVp24, HIVgp120, MS virus coat Viral epitopes, such as protein (bacteriophage) and other viral antigens Bacterial antigens, fungal antigens and known viruses, fungi, bacteria, prions and protozoa . Members of the ligand-receptor pair: eg lectins and FVlll receptors Lectin binding site; HDL and HDL receptor cell receptor site; like estrogen Hormones and estrogen receptor sites; antibodies; ribosomal proteins; FK 506 and FK506 binding protein; lysine and cellular target; phosphotyrosine recognition Region SH2 (RSV) and phosphotyrosine; and (oligo) nucleotide and its Their corresponding antisense nucleopeptides. -Medicine-receptor pair members: epinephrine and adrenergic receptors, methadone And DNA chelating agents such as opiate receptors, adriamycin, etc. Members of the catalyst-reactant pair: iron and superoxide, rhodopsinkiner Ze and rhodopsin, hydrogen peroxide and luminol, horseradish peroxidase and peracid Hydrogen fluoride. Members of the adsorbent-adsorbate pair: eg trypsin-trypsin inhibitor Bitter, biotin-biotin repressor (E. coli) and subtilisin Subtilisin inhibitor. Members of the toxin-ligand pair: eg strychnine and glycine receptor, hemo Globin and carbon monoxide, and organophosphate compounds (sarin, tabun) , Parathion, dimefox, malathion, diazinon) and acetylcholine Sterase; muscarinic receptor and neurotoxin [S. heliantas neurotoxin I from scorpion neurotoxin I]; verotoxin (verotox) in) and colonic mucosal epithelial receptors; enterotoxins and colonic mucosal epithelial receptors.   One or both members of the BRP are first attached to the modified surface. Fermented in general The element or catalyst is first bound and then the substrate or reactant is bound to the enzyme and substrate or The catalyst and the reactants are bound during the actual interaction.   When producing a decoy virus used as a vaccine, the diameter is about 10 to 200. Nanometer particles are preferred. Particles within this size range are More closely resembles the core diameters of DNA and RNA commonly found in This is because that.   Core particles used to immobilize catalyst or BRP are used for decoy virus It may have a particle size range far wider than that of the particles. The particle size depends on the catalytic reaction of BRP Or it should be selected to maximize the enzymatic reaction. Preferred particle size is 50 Within the range of 150 nm. BRP is a film or solid substrate if desired It may also be attached to a macroscopic surface such as the surface of.   Surfaces such as core particles are made of various inorganic materials such as metal or ceramic. Can be manufactured. Preferred metals and alloys include beryllium and silicon , Gallium, copper, gold, titanium, nickel, aluminum, silver, iron, steels, Cobalt-chrome alloys and chi There are tan alloys. Preferred ceramic materials include calcium phosphate and aluminum Na, silica and zirconia. Core particles include carbon (diamond) It can be manufactured with an organic material. Preferred polymer is polystyrene , Silicone rubber, polycarbonate, polyurethanes, polypropylenes, poly Methyl methacrylate, polyvinyl chloride, polyesters, polyethers and There is polyethylene.   Core particles are made of various biodegradable materials including polymers or ceramics. Can be built. A preferred ceramic material is calcium phosphate dihydrate. There are brushites composed of salt, as well as tricalcium phosphate and iron oxide. A preferred biodegradable polymer is polylactide. ), Polygalactide and polylysine. B Particles made of ruschite are particularly preferred.   Are particles made of the above materials with a diameter less than 1000 nm commercially available, or Is a nucleation reaction (colloidal reaction) that proceeds in solution or various physical vapor deposition methods Science vapor deposition method, for example, sputter deposition method (Hayashi, C., J.Vac.Sci.Technol.) A5 (4) Volume 1375-1384, July / August 1987; Hayashi, C., Physics Today , Pages 44-60, December 1987; MRS Bulletin, pages 16-47, 1990. It can be manufactured in January). Acid with dispersed (in water) aggregate particle size of about 140 nm Tin oxide is commercially available from Vaccum Metallurgical Co. (Japan). Desirable set And other commercial particles with a range of particle sizes and sizes are available from Advanced Refractory Technologies, Inc. Company (Buffalo, NY, USA).   Plasma-assisted chemical vapor deposition (PACVD) produces suitable fine particles It is one of the many methods used to do this. PACVD under relatively high atmospheric pressure Producing particles up to 1000 nm in diameter (on the order of 1 torr or more) Useful to do. For example, aluminum nitride particles with a diameter of less than 1000 nm As a reactant, Al (CHThree)ThreeAnd NHThreeCan be synthesized by the PACVD method. Can be. PACVD equipment generally consists of a horizontally mounted quartz tube and It is equipped with an associated pump device and gas supply device. Place the susceptor in the center of the quartz tube. Placed and heated using a 60 KHz radio frequency source. Synthetic aluminum nitride The particles of nickel are collected on the wall of the quartz tube. Al (CHThree)ThreeNitrogen gas as a carrier of Using Al (CH in the reaction chamberThree)Three: NHThreeThe ratio of N enters the reaction chamber2/ Al (CHThree)ThreeAnd NHThreeIt is controlled by changing the gas flow rate. Generally anti Maintaining the pressure in the reaction chamber at a constant pressure of 10 torr, ultra-fine nanocrystalline aluminum nitride Deposit and generate the nickel particles. Other suitable nanocrystalline particles using PACVD Various types can be manufactured.   Surfaces such as core particles are not sufficiently rigid to denature biologically relevant sites. A substance that imparts a threshold surface energy to the surface of particles etc. Coat with In the case of particles, the coating is a solution containing dispersed surface modifiers. Preference is given to carrying out by suspending the particles in the liquid. The coating is It is necessary to make the surface of the particles more accessible for protein or peptide attachment. It is important. The coating on the surface is applied to the meticulously clean area on the surface You.   Suitable coating materials of the present invention include carbohydrates, carbohydrate derivatives, and It has a carbohydrate-like component characterized by being rich in OH (hydroxyl) side groups. There are other macromolecules that do. These co The tings include, but are not limited to, the following. -Short chain carbohydrates: eg glucose, sucrose, cellipose, nice Sugar, triose, dextrose, trehalose, glucose, lactose, Maltose etc. Hydroxyl-rich weak acids: eg citrate, fumarate, succinate, Isocitrate, oxaloacetate, malate, etc. .Nucleotide-like molecules with side groups of carbohydrates or phosphates, eg pi Ridoxyl-5-pyrophosphate, thiamine pyrophosphate, uridine dipho Sulfate-glucose, glucose-1-phosphate, adenosine, nicotine Namide-adenine-diphosphophosphate and the like. -Carbohydrate derivatives: eg nitrocellulose. -Complex polymeric carbohydrates and derivatives: eg dextran, glycogen, etc.   Preferred coating materials include cellobiose, sucrose and pyridoxy. Examples include ru-5-phosphate and citrate.   A typical preference for attaching the stabilizing coat to the solid phase and then attaching the BRP members. The preferred method consists of the following steps. 1. A solid clean surface is obtained on the solid to be coated. ; 2. Immersing the carefully cleaned surface to be coated in an aqueous solution of the coating material; continue 3. Freeze drying the aqueous solvent / dispersant from the surface of the solid; 4. Coated solid surface with biochemically reactive pair (BRP) members Dipping in an aqueous solution / dispersion containing; then 5. Molecule-stabilized film with BRP members bound to it by removing aqueous solvent To obtain a solid coated with;   It consists of steps.   As used in Step 1 above, the term "meticulously clean surface" refers to the solid to be coated. A material that has been cleaned of all substances that are not unique to the materials that make up most of the body Means the surface of. A solid of composition A is already coated with a second solid of composition B. If you want to apply a molecular stabilizing coating to the surface of composition B, The term is meant to be non-unique to the surface B and the materials that make up the majority of B. This Examples of such methods include acid, base, sonic energy, and Suitable for plasma glow discharge process and even mechanical cleaning individually or in combination There is a way to use   As used in step 2 above, the term "immersion" refers to the solution being Means applying an adjacent layer of. Transfer of spraying, dipping, mechanical application, etc. Methods such as copying also allow the surface to be coated with solvent and coating macromolecules. It is included in the term "immersion" as long as it provides an adjacent layer consisting of only.   The term "freeze-drying" when used in step 3 above refers to the partial pressure of the surrounding gas. By lowering is meant removing the aqueous phase from the surface coating. Solid and new The method of applying heat to the surface film that forms well and then removing the heat and cooling is the freeze-drying method. It is a transformation.   The term "immersion", as used in step 4 above, has already modified the coated solid. Means applying an adjacent layer of a solution containing a member of BRP to the surface You. Methods such as spraying, dipping, mechanical coating and other transfer means may also be used. A solvent and BRP member on the already modified surface consisting of a molecularly stabilized coating Included in the term "immersion" as long as it provides an adjacent layer consisting of only one.   As used in step 5 above, the term “removal” refers to (a) By reducing the partial pressure (lyophilization) or (b) dialysis / ultrafiltration, It means removing the aqueous phase from the face coating. Solid and newly generated surface coating The method of applying heat to the film and then removing the heat to cool the film is a modification of the freeze-drying method.   In the case of particles, the particles are suspended in the coating solution. Core particles are suspended The coating solution contains, for example, 1 to 30 w / v% coating material. You. Solute is water distilled twice (ddH2O) is preferred. Suspended in coating solution The amount of turbid core particles depends on the type and size of the particles. Generally 0.1 to A suspension containing 10 w / v% is suitable. About 1 w / v% particle suspension preferable. The core particles have sufficient time to provide uniform coating of the particles, It is kept in dispersion in the coating solution. Sonication keeps dispersion Is the preferred method. 3 at room temperature to give the particles a proper coating. Dispersion times in the range 0 minutes to several hours are usually sufficient. Coating thickness is 5 It is preferably less than a meter. The final core particle covers substantially the entire particle surface. Coating thickness can be varied if it has a uniform coating it can.   After coating, the particles are separated from the suspension and stored for future use. In a solution containing the protein or peptide to be stored or attached to the particles Disperse again. Alternatively, leave the coated particles in suspension and After that, a treatment for attaching a desired protein or peptide may be performed.   The term “biodegradable” as used herein refers to long-term exposure to the in vivo environment of mammals. Core particles that decompose or otherwise break after being crushed. Core particles are living things To be degradable, it is introduced into the body It has to be virtually destroyed within a few weeks.   The proteins or peptides that are applied to the coated particles are different types of proteins. It can be selected from proteins or peptides. If a vaccine is required, this Those proteins or peptides preferably have antigenicity. That tampa Quality of the viral protein coat from the selected virus or its immunogenicity. Good part. Viral protein coats isolate and separate viral proteins It is isolated by a known separation method. Where the viral envelope is the antigenic activity of the virus It is a preferred protein because it is known to be located at. Generally, Ruths are digested or solubilized to produce a mixture of viral proteins . This viral protein can then be isolated by a convenient method such as liquid chromatography. The seed protein particle fraction is separated and then dialyzed to remove impurities.   As a suitable virus capable of separating and isolating viral protein particles Is Epstein-Barr virus, human immunodeficiency virus (HIV), human milk Includes head tumor virus, herpes simplex virus and poxvirus. Ma Formulations of various types of antigen protein materials are available from Micragene Systems, Inc. 6516 Frontage Road, West Haven, Connecticut 40 0), Amgen Corporation (91320-1789, USA) , Thousand Oaks, Oak Terrace Lane 1900), Cetus Corporat ion (53608, Emeryville, Calif. 94608, USA)   1400) and Advanced Biotechnology, Inc. (Co, Maryland, USA) You can purchase it from a supply company such as (Lombia). Against naturally occurring virus particles Corresponding synthetic peptides and / or proteins are also available.   For HIV, virus fragments that are known to elicit an immune response. You can use any of these. A suitable viral fragment is gp12. 0, gp160, gp41 and core proteins (p24). Recombination method Any of the known methods for producing HIV fragments can be used, including.   As other bioactive proteins and peptides that can be attached Are enzymes, hormones, transport proteins and protective proteins. Doctor In addition to the drugs amphotericin, taxol and insulin, human serum transfer Specific examples are the serine, plasminogen activator and aggregation factors.   To attach a protein such as an antigen to the core particle coating, Suspending the coated core particles in an aqueous solution containing. particle The presence of substances in solution that preferentially adhere to the surface is often a disadvantage. For example The dispersant present in the liquid may not be desirable on the suspended particles before the proteins attach. May form a coating. Water such as methanol or ethanol Any solvent miscible with can be used. Aqueous solution containing coated fine particles Stir well to evenly suspend the pups. Generally, the amount of particles in solution is about 0. 5 mg / ml solution to 5 mg / ml solution. Sonicate the coated particles It is a preferred method of uniformly suspending in a solution.   The suspension of coated particles and antigen is self-assembled (self) with proteins attached.   parameter value must be within a certain range to cause assembly Absent. The temperature of the particle-containing solution should be between 1 ° C and 45 ° C. Specific protein Quality and drug can be bound to the coated particles in distilled water. coat Particles, Proteins and other drugs that are unstable or do not readily disperse in distilled water The solution may be ignited with salts to effect the reaction with. Generally, its salt solution Indicates that the ionic balance (expressed in mM) has the following limits Must be mixed so that it does not exceed. That is, K = 300 to 500; Na = 30 ~ 70; Cl = 40-150; Ca = 0.0003-0.001; and Mg = It is 0.0003 to 0.001. Oxygen tension of solution (Oxygen te is first dispersed with helium and then with helium, nitrogen and carbon dioxide. Preference is given to less than 10% in the gassed solution. The pH of the solution is slightly acidic (blood (Compared to the liquid) is advantageous, and the pH value is preferably 6.8 to 7.2. coat A typical solution used to disperse the resulting fine particles and attach proteins is 0.0360 mg / L MgSOFour, 0.060 mg / L of MgCl2・ 6H2O , 0.0441 mg / L CaCl2・ 2H2O, K of 22.823 g / L2HP OFour, 13.609 g / L KH2POFour, 4.455 g / L KCl and 4. An aqueous solution containing 101 g / L of sodium acetate. The pH of this aqueous solution is 6 . Adjusted to 8.   Coated particle cores with attached proteins can be used for ion growth media (ion ic grow medium) and stored for later use Can be The coated particles store the antigenic compound or antibody. It can be stored by any of the conventional methods commonly used in. example The coated particles can be lyophilized or stored as a suspension in a compatible solution. can do. Particles coated with a viral protein coat are When used as an injection, it is injected into the individual according to conventional procedures or otherwise Administered by the law. Solid coated particles When administered to a patient, a solution of a pharmaceutically acceptable carrier or other compound can be used. You. Protein-coated particles for in vitro diagnostic purposes , Suspended in solution and used in the same manner as other antigenic compounds. Protein The same applies when the coated particles are used to generate antibodies. Anti Same protocols and procedures as known protocols and procedures using antigens to prepare the body However, the protein of the present invention is coated in place of the commonly used antigen compound. Used particles are used.   When you want to target coated particles and attached bioactive substances , Particles to membrane complexes of targeting ligands or phospholipids that are reactive with receptors on specific cells. Coat as a unit. HIV coat protein is a typical target ligand (Gp160, 41, 120), coronavirus coat proteins, EB V coat proteins (gp350). Membrane bound ligand / receptor Can be used. These ligands have the above-mentioned bioactive substances attached to them. It is attached to the particle composite in the same way as it is.   The lipids used to coat the material associated with the biodegradable nanocrystalline particles are also , The same lipids normally used to produce liposomes. With the proper lipid For phosphatidylcholine, cholesterol and phosphatidylserine, etc. There are phospholipids. These lipids can also be directly derived from natural sources. You. Such lipids can be biochemically bound to lipids such as viral membranes. There is a sex pair. The lipid layer is described in US Pat. No. 5,306,508. Same as red blood cell substitute (Surrogate red blood cell) Method is applied to the nanocrystalline core particles and bound to the bioactive substance.   The core particle and bound material need not be entirely covered with a lipid layer. Particles The amount of lipid used to coat is preferably sufficient to cover all particles .   In special cases, it is necessary to attach the biochemically active substance directly to the biodegradable core particles. Is desirable. This direct attachment makes the biodegradable core particles a biochemically active substance. It is preferable to perform co-crystallization together. For example, insulin, Taxol or (DNA, RNA) gene fragment with brushite A drug negative that slowly co-crystallizes the drug and protects the drug in vivo. Load particles can be produced. This direct attachment method reduces biological activity You.   The present invention also delivers DNA or RNA to cells in vivo or in vitro. Thus, there are wide applications for procedures and methods of transfecting cells. this Another area of application is gene therapy. The compositions of the present invention are useful in in vivo and in vitro environments. Others that need to target DNA or RNA within a particular cell type within It can be used for a wide range of purposes. The present invention is also an antisense fragment. Can be used to target any other transfection agent . The term "transfection agent", as used herein, refers to in a cell A segment of DNA or RNA that can be transfected into It shall mean an antisense fragment. Typical transfection Examples of the substance include sense DNA, sense RNA, antisense RNA and Tisense DNA is mentioned.   The composition of the present invention comprises a nanocrystal core particle to which a protein, peptide or drug is attached. Coated with a surface energy modification layer that promotes Nanocrystal core particles (diameter less than 1000 mm). This coat The ligation alters the DNA and RNA segments without significant loss of activity or alteration. Nanocrystalline core particles so that they can be attached to the core particles without Modify surface energy. As a result, biosynthesis containing a biochemically inactive core A biologically active composition is obtained. The end use of the composition of the present invention is coated co It depends on the particular transfection substance attached to the particles. For example, DNA segments such as the low density lipid receptor of G. elegans are used in gene therapy. A RNA segments such as antisense mRNA and sense mRNA It is used in the traction method. Antisense fragment such as HIV reverse transcriptase Is used for transfection particles. Preferred particle size is 10 nm to 150 n It is of the order of m.   The core particles and coating are the same as described above. The particles are coated After washing, separate from suspension and store for future use or attach to particles. Redisperse in a solution containing the DNA or RNA to be deposited. Alternatively, The coated particles are left in suspension after which the desired DNA or RNA You may perform the process which makes it adhere.   The core particles can be made of biodegradable ceramics or polymers. The term “biodegradable” as used herein refers to long-term exposure to the in vivo environment of mammals. Core particles that are decomposed or otherwise destroyed. Biodegradable To be, core particles are substantially destroyed within a few weeks of their introduction into the body. It must be. Brushite is the preferred biodegradable core particle material is there.   DNA or RNA applied to coated particles is not undergoing gene therapy A wide range of DNA or RNA cells used to transfect cells during Can be selected from Antisense fragments can also be used.   A typical transfection gene segment is human low density lipid receptor. CDNA, human adenosine deaminase CDNA, human dystrophan CD NA and antisense HIV reversed DNA NA) and these are all subcloned into an appropriate expression vector. DNA or RNA transfection segments are described in Manniatis, T., F ritsch, E.F., and Sambrook, S., Molecular Cloning, ", Cold Spring Laborator. y Press, New York, USA, 1.0-19.0, 1989. It can be manufactured according to a known method such as the method described in the above. Gene segment Are also available from several different manufacturers.   Inherit a segment or antisense fragment to the coating on the core particle The method of attaching Lagment is to coat coated core particles with gene segments. It is carried out by suspending it in the aqueous solution containing it. Substances that preferentially adhere to the surface of the particles Often present in solution is disadvantageous. For example, the dispersion that is present in the solution The agent produces an undesired coating on the suspended particles before the protein attaches. May be formed. A water-miscible solvent such as methanol or ethanol Can be used. The coated fine particle-containing aqueous solution is for uniformly suspending the particles. Stir well. Generally, the amount of particles in solution is about 0.5 g / mL solution to 5 mg / m L solution. Sonication is used to uniformly coat the coated particles in solution. In the preferred way is there.   The suspension of coated particles and gene segments allows for segment attachment and self-assembly. It has to be within a certain parameter value to get a match. Particle-containing solution The temperature of should be between 1 ° C and 45 ° C. Gene segment or antisense The fragment can be bound to the coated particles in distilled water. Dissolution The oxygen tension of the liquid is first dispersed in helium and then in helium, nitrogen and dinitrogen. Less than 10% is preferred in the solution gassed with carbon oxide. The pH of the solution is It is preferably slightly acidic (compared to the liquid) and the pH value is preferably between 6.8 and 7.2. Good. Representative used to disperse coated microparticles and attach DNA A typical solution is 0.0360 mg / L MgSO 4.Four, 0.0609 mg / L Mg Cl2・ 6H2O, 0.0441 mg / L CaCl2・ 2H2O, 22.823g / L K2HPOFour, 13.609 g / L KH2POFour, Kc of 7.455 g / L 1 and an aqueous solution containing 4.101 g / L of sodium acetate. This solution The pH of the liquid is adjusted to 6.8.   Coated with attached gene segment or antisense fragment The particle core can be separated from the ionic growth medium and stored for later use. it can. The coated particle can be a gene segment or antisense segment. Storing by any of the conventional methods commonly used to store Can be. For example, the coated particles can be lyophilized or suspended in a compatible solution. It may be stored as a suspension. When using in gene therapy, The particles coated with the gating layer are injected into the individual according to conventional procedures. Or it is administered by other methods. Administer particles coated with DNA / RNA to an individual However, it is acceptable as a medicine Solutions of other carriers or other compounds may be used. DNA / RNA coated When used in vitro, the particles are suspended in solution and combined with other gene therapy compounds. Used in the same way as for goods. Use antisense coated particles The same applies in cases. Inheritance to introduce genes into cells in vivo and in vitro The same protocols and procedures as are known for child therapy are used, but Replace DNA / RNA / antisense particle constructs of Mitsui with other gene therapy compounds To use.   Coated particles and attached gene support or antisense flakes Targeting contains ligands that are reactive with receptors on specific cells This is accomplished by coating the particles with a phospholipid membrane complex. Representative mark HIV ligand coat proteins (gp160, 41, 120) ), Coronavirus coat proteins, EBV coat proteins (gp 350). Membrane bound ligands / receptors can be used. this The same ligands were used in the same way as the transfection substances described above were attached. To adhere to the particle composite.   Coated with biodegradable nanocrystalline particles and associated transfection material The lipids used to do so are the same as those commonly used to make liposomes. It is a lipid. Suitable lipids include phosphatidylcholine, cholesterol and And phospholipids such as phosphatidylserine. Its lipid layer is Nanoparticles are applied in the same manner as coatings, that is, by adsorbing to the surface. It is applied to the crystalline core particles and bound to the bioactive substance.   The core particles and bound material need not be completely covered by the lipid layer. Particles The amount of lipid used to coat the A sufficient amount is preferred. The layer combining the lipid and targeting ligand is the core Target particles and attached gene segments to the corresponding cellular receptors. It is for changing.   Preferred transfection nanoparticles are typically 1 nm in size on the nanometer scale. A self-assembling complex of particles of the order of 00 nm, It has an inner layer of DNA or RNA and an outer layer of targeting molecules. Target Putting molecules, commonly called ligands, are viruses that It has the function of imparting tissue specificity in the same manner as it is served. That is, the ligand is By binding to the receptor molecule on the cell surface, the transfection nanoparticle Promotes association with the cell surface.   Building transfection nanoparticles is a simple process, with obvious sharing It is done spontaneously with no change in binding. One typical synthesis example is tricalcium phosphate. Dispersion of nanoparticles of TCP (TCP) with 0.750M calcium chloride and 0.25M In an isochoric facing stream of monobasic sodium phosphate To manufacture. The resulting precipitate is sonicated for 30 minutes at room temperature at 175 watts and then sonicated After washing with 20 mM phosphate buffer solution (pH 6.80), purified with cesium chloride Gently agitate transfecting DNA, RNA and antisense While adsorbing on the particle surface at room temperature. Attach the transfection substance Membranes typically produced from retroviral envelopes after the steps are completed A specific ligand was added to the above dispersion and in a stir cell, Adsorb overnight at 4.0 ° C.   The ligand-receptor complex is selected to be unique to the target tissue. It is. Because the tissue is its component cells, This is because they can be distinguished by cell surface receptors and complementary ligands. Interaction When transfection occurs, transfection proceeds by the cell engagement structure, DNA (RNA / antisense) elutes from the particle complex and recombines in a static cell Are expressed. When DNA, RNA or antisense is introduced by this method, It becomes possible to change the phenotype of a specific cell in the target tissue. It ’s used Conformational stability of the ligand used, transfecting DNA RNA / A Antisense integration locus and transfection in target tissues It is caused by the expression performance of DNA (RNA / antisense).   The method of producing a ligand is as diverse as its origin. The ligand is recombinant It can be produced or derived from its natural source. Virus envelope The rope ligands are human immunodeficiency virus, Epstein-Barr virus and And viruses such as ecotropic virus strains of mice are preferred. New Generally, the viral envelope is extracted by known methods and then phosphate buffered Mix with phospholipid in. The obtained solution of virus envelope and phospholipid, Add to suspension of nanoparticles coated with DNA / RNA. Virus envelope The rope and phospholipid are adsorbed by the nanoparticles to form the targeting membrane.   A typical formulation of transfection nanoparticles is spectroscopically measured over time. Measured by standard methods, with DNA (and RNA) at a concentration of about 0.1 μg / μl dispersion can get. If high concentrations are required, add DNA (and RNA) to substrate solution (sub) premix, then core at pH 6.5. Co-precipitate slowly with material. The particle size is determined by adding the membrane ligand over time. Control by adsorbing to the surface and removing the substrate by ultrafiltration / dialysis. Irrespective of the synthetic route chosen, transfection nanoparticles are And by the parenteral route. The dose is the same as the dose used in gene therapy Is the same.   The nanoparticle-DNA / RNA constructs of the invention have receptor-dependent targeting Can be manufactured without a targeting layer if is not required. For example, The structure is a non-cellular receptor such as a DNA / RNA calcium channel engagement. If physical effort is desired, it can be manufactured without the targeting layer. This The small size of these structures allows them to cross the reticuloendothelial system and And the efficiency of transfection is increased.   The following examples further illustrate certain aspects of this invention in more detail. The examples do not limit the invention.Example 1. Production of nanocrystalline tin oxide fine particles   1.5-2.0 mg of ultrafine (nanocrystalline) metal powder was distilled twice with 1.5 ml. Water (ddH2O) in a 1.7 ml microcentrifuge with screw cap. Was. Its ddH2O is filter sterilized by a 0.45 micron rinsed filter Device or acrodisc (Gelman Scient) if)). The metal powder has an average diameter of 14 (according to correlative spectroscopy) It was 0 nm tin oxide. The mixture is vortexed for 30 seconds and then sonicated. It was placed in a waved water bath overnight. The temperature of the sonication bath was fixed at 60 ° C. 24:00 Dispersion obtained by vortexing the sample once for 30 seconds after sonication Was clarified by microcentrifugation at about 16000 rpm for 15 seconds. Particle size analysis Was performed on a Coulter N4MD submicron particle analyzer.   The tin oxide particles are suspended in a stock solution of cellobiose by co-suspending them. Granted The stock solution of cellobiose is 900 ml of ddH.2During O, With a 292 mM solution prepared by dissolving 1.000 g of cellobiose there were. The dissolution was carried out at about 70 ° C. for rapid dissolution. Obtained cell bio The solution is sterilized by filtration through a 0.45 micron rinsed filter. The final volume was adjusted to 10.00 ml.   Add enough cellobiose stock solution to 150 μl of ultrafine tin oxide dispersion. The final tin oxide concentration was 1.00 w / v% or 29.2 mM. Formulation The general volume was 2.0 ml, but use a micropipette to add 4-5 Mixed twice. After mixing, the dispersion was equilibrated for 2 hours. For coating particles Success is the mobility of particles (coated and uncoated) Co measured with an ulter DELSA 440 Doppler energy light scattering analyzer Proven by Coated tin oxide particles become uncoated tin oxide particles The mobility was lower than that of the conventional one. Also, by measuring with various diluted salt concentrations, the mobility can be measured. I confirmed that the fixed value was not wrong. These test results show that the particles are cellobio. It has been proved that it was coated with susu.   The coated particles are then used to bind the protein, peptide or drug of the antigen. Are attached to produce biologically reactive particles.Embodiment 2. FIG. Production of nanocrystalline ruthenium oxide particles   Same procedure except that ruthenium oxide fine particles are used instead of tin oxide particles. The sequence was carried out according to Example 1. Ruthenium oxide particles are Tacuum Metallurgic Obtained from al Company (Japan).Example 3 Preparation of Nanocrystalline Silicon Dioxide and Tin Oxide Particles   Nanocrystalline silicon dioxide is available from Advanced Refractory Technologies, Inc. (According to Buffalo, NY), tin oxide is Vaccum Metallurgical  Purchased from Co. (Japan). In addition, the tin oxide particles convert tin into argon-oxygen. It is produced by a reactive vapor deposition method in a mixture and collected on a cooling substrate. Also Nanocrystalline tin oxide is manufactured by D.W. C. Reactive magnetron sputtering method De) was also synthesized. High-purity tin and 3 "diameter targets of argon and oxygen Sputtered in gas mixture. The ultrafine particles generated in the gas phase are converted into a flowing liquid. Collect on a copper tube cooled to 77 ° K with nitrogen. X-ray diffraction results for all substances Crystallography, Transmission electron microscopy, Photon correlation spectroscopy and Doppler electrophoresis light diffusion Characteristic analysis was performed by the analysis method. The sample for X-ray diffraction is twice the size. It was prepared by placing the powder on glass slides using chipape. Nor Cuka lines were used on an elco automatic diffractometer. The spectrum obtained is tin oxide ASTM standard data (Powder Diffraction File, Card # 21-1250, Joint Com mittee on Power Diffraction Standards, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, USA, 1976). 22-propano Standard (3 m) by dipping into the (UFP) dispersion A sample of (TEM) was collected on a copper mesh coated with m diameter carbon. these Of the above sample under an accelerating voltage of 60 to 80 KV with JEOL-STEM100CX. Inspected.   To prepare a working dispersion of these metal oxides, 1.5-3.0 mg of metal Oxide powder, dust-free microcentrifuge tube with screw cap (Sarsted) It was added to 1.5 ml of double-distilled distilled water and vortexed for 30 seconds. Get The mixed mixture from 16:00 to 24:00 Sonication was followed by a second 30 second vortex. Then fine grain Pellet the pups by microcentrifuging at 16,000 xg for 15 seconds. Thus the submicron fraction was isolated. Next, take out about 1.3 ml of the supernatant, Place in a separate dust-free microcentrifuge tube with screw cap. 50-100 μl Remove the dispersion and place it in a polystyrene cuvette, add ddH2Diluted with O By bringing the final volume to 1.00 ml, photon correlation spectroscopy (Coulter N4MD) and Doppler electrophoresis light scattering method (Coulter delsa 44) Samples for 0) were prepared. The stability of the dispersion remains constant over a 24-hour period. It was found that the result of the measurement by the subsequent measurement was stable. Gradient of solvent Related to prominent salinity (increased conductivity) The stability of the dispersion liquid was measured in the same manner. Stability is improved by increasing salt content of the solvent Was.   5 × 10 rinsed in advanceFiveMolecular weight cut-off type F membrane (Spectra) 8.0 in a 15.0 ml capacity ultrafiltration stirred cell (Spectra) attached. 0 ml of ddH2O and 1.00 ml of 29.2 mM cellobiose stock solution, 0 ml of the above dispersion was mixed and stirred. The sample was then stirred for 15 minutes. After stirring 250 ml dd with a peristaltic pump at a flow rate not exceeding 10.0 ml / min H2Excess cellobio by flushing O through the cell chamber Removed. After cleaning, the furnace liquid was concentrated to about 1.0 ml with pressurized nitrogen gas. Was. Take 500 μl of the treated dispersion and characterize by N4MD analysis. Was analyzed. The average dispersion diameter was measured again at this step. Dispersion of coated particles The stability of the liquid was determined by continuously measuring it for 24 hours. Increasing salinity of solvent (derived Increased electrical conductivity The stability of the dispersion of coated particles relative to (large) was also measured.   The obtained coated nanocrystalline particles are used for various proteins, peptides and pharmaceuticals. Suitable for attaching.Example 4 of P5P coated tricalcium phosphate (TCP) nanocrystalline particles Manufacturing   Use two 60 cc syringes and one T-Luer lock to lock the cap. 50 ml of 0.75 mCaCl in a 120 ml medicine bottle in the Psonicator2When 50 ml of 0.25 mNa2HPOFourInject. Sonicate for 30 minutes at room temperature To produce a suspension of TCP particles.   2. The above TCP preparation was used at 3000 Tpm for 15 minutes using a Bakut rotor. Centrifuge with a centrifuge to remove unreacted components.   3. The resulting TCP particles were resuspended in 50 ml of HPLC grade water. Mix well. Centrifuge at 3000 rpm for 15 minutes. Repeat this step 3 times (× 3) Repeat.   4. 1.0 ml of 100 mg / ml pyridoxal-5-phosphate (P5P ) Is added and then incubated at room temperature for 30 minutes on a rocker arm.   5. Freeze dry overnight.   6. The above P5P-TCP preparation was added to 50 ml of 0.1 n sodium hydroxide solution. Resuspend in. Mix well. Centrifuge for 20 minutes at 3000 rpm. This This removes excess P5P (for all carbohydrates, end this step. It shouldn't be understood. Centrifugation and subsequent washing steps Would be appropriate).   Resuspend in 7.50 ml PBS then spin at 3000 rpm for 1 Centrifuge for 5 minutes. Repeat step 8 three times (x3). Hydroxylation Sodium is removed.   8. Resuspend the pellet in 50 ml of HPLC grade water and then 300 Centrifuge for 15 minutes at 0 rpm. Repeat step 9 three times (x3). to this Therefore, the PBS is removed.   9. The resulting pellet was resuspended in 4.0 ml of HPLC grade water. PH to 7.2 with 1.0 ml of 100 mM sodium citrate solution .   10. Sonicate at room temperature for 15 minutes to allow biochemically active substances to adhere immediately Prepare a suspension of viable particles.Example 5 Preparation of TCP nanocrystalline particles coated with cellobiose   As described in Example 1 except that cellobiose was used instead of P5P. The same procedure was performed. This cellobiose coating makes the particles cellobiose The particles are applied by suspending them in the stock solution of. The stock solution of cellobiose is By dissolving 1.000 g of cellobiose in 9.00 ml of ddH20 It is a 292 mM solution prepared by Melting is about 70 ° C to facilitate rapid melting It was carried out in. The resulting cellobiose solution was rinsed with a 0.45 micron filter. -Sterilize by filtration and adjust the final volume to 10.00 ml.   Sufficient cellobiose stock solution into 150 μl of ultrafine biodegradable particle dispersion Add to bring the final concentration of particles to 1.00 w / v% or 29.2 mM. Made The typical volume of the agent is 2.0 ml and mixed by a micropipette 4-5 times. Combine. After mixing, the dispersion is equilibrated for 2 hours. Couler DELSA 4 Particles (coated and uncoated) on a 40 Doppler energy light scattering analyzer The particle coating has been successfully measured by measuring its mobility. And prove. Coated particles show lower mobility compared to uncoated particles. Ma Measured at various diluted salt concentrations, and the measured values related to mobility are correct. Check.   The coated particles are then used to bind the protein, peptide or drug of the antigen. Are attached to produce biologically reactive particles.Example 6 Preparation of nanoparticles with cellobiose or P5P coating   Nanoparticles of tin oxide, ruthenium oxide and silicon dioxide prepared in Examples 1-3 The particles are coated with cellobiose or P5P in the same manner as TCP.Example 7 Preparation of meticulously normal biodegradable nanoparticles   1.1 6 cleans containing 500 mg biodegradable particles per sonication tube Prepare a simple sonication tube.   2. In the fume hood, fill the sonication tube with about 8 ml / tube of HCl (ION). Refill.   3. Sonicate for 30 minutes [total power (175 watts) / 25 ° C]; 1 sound 3 tubes per wave treatment.   4. Centrifuge at 2000 rpm for 30 minutes.   5. Decant the acidic supernatant (in the fume hood) and place the tube in HPLC gray. And then vortex.   6. Sonicate for 30 minutes (above conditions) and then centrifuge for 30 minutes (supernatant) Centrifugation is complete if the solution becomes clear).   7. Decant the supernatant, then fill the tube with HPLC grade water and then vortex. Roll and stir.   8. Repeat steps 7 and 8 twice.   9. Decant the formulation into a clean glass (Pyrex) baking dish.   Anneal at 10.210 ° C. overnight.   11. Gently dry dry biodegradable crystals using a clean, unpainted spatula Peel off and remove, then transfer to 6 clean glass sonication tubes.   12. Repeat steps 3-8.   13. Prepare a 10ml KD (NMWL) 150ml ultrafiltration cell and use one tube. Fill the cell with empty contents (only 500 mg per filtration operation), Then 20 psi (regulator pressure gauge reading) N2Under pressure head Wash with 500 ml of HPLC grade water through the filter.   14． After washing, reduce the volume of the formulation to 1 using the appropriate volume marking on the side of the cell. Adjust to 00 ml.   15. 1.0 ml of formulation was removed from the cell and the formulation was pre-weighed The concentration is measured by freeze-drying in a 1.7 ml Eppendorf tube. After lyophilization, weigh the tube with its contents and store that value in the empty tube. Subtract from the weight. This gives the initial density of the formulation. Concentration of particles in solution Alternatively, the density is about 10 mg / ml. When the initial density is lower than 10 mg / ml , The solution must be further concentrated in an ultrafiltration cell.Example 8 Carefully clean biodegradable nanoparticle molecular stabilizing coating (cellobiose) Coating by Incubation / lyophilization   1. Carefully clean the biodegradable particles (aqueous dispersion) prepared in Example 7 Temperature treatment with electric power (175 watts) at 25 ° C for 30 minutes I do.   2. Then, as soon as possible, suspend the suspension medium from water (stock) to 500 mM cellobio. The solution is exchanged with a solution for a small volume, but at this time, in the case of a small volume, a tabletop microcentrifuge For 2 seconds at a total rotation speed of 14,000 RPM, or for large volumes, Centrifuge (Model 21K, 50 ml centrifuge tube, up to 2 minutes 8,000 RPM ) Is used. Suspend pelletized particles in 500 mM cellobiose solution and Wave treatment to aid dispersion [full power (175 watts) at 25 ° C for about 5 minutes] Afterwards, the mixture is mounted on a locking plate overnight in a cold room (4 ° C).   3. Next day, divide the mixture and put it in a container of appropriate size and freeze-dry overnight. .   4. Cover those tubes with a paraffin layer around the lid and freeze until the washing step. Keep it in the container.   5. Reconstitute the particles / cellobiose with an appropriate buffer depending on the application. Proper loose The buffer is a low ionic strength phosphate buffer (PRB), water or bicarbonate solution. Reconstitution with buffer was accomplished by vortexing and sonication for 5 minutes (175 watt / 25 ° C). ).   6. Centrifuge [For small volume, tabletop microcentrifuge (30 seconds, total rotation speed 1 4,000 RPM), or for large volumes, floor-top centrifuge (Model 2) 1K, 50 ml centrifuge tube, up to 2 minutes 8,000 RPM)] and in buffer Repeat the resuspension to wash.   Remove 7.1 ml of the suspension and pre-weigh 1.7 ml Eppendorf tube Concentration is measured by placing in and dehydrating in a lyophilizer to clump.   8. Calculate the final volume required to bring the concentration to 1 mg / ml. Particle / cellobi Sufficient buffer is added to bring the concentration of the ose formulation to 1 mg / ml.Example 9 Producing close clean particles of brushite   reagent  0.75M CaCl2: 55.13 g of CaCl2・ 2H2HPL for O Dissolve in grade C water and bring to 0.50 L in a volumetric flask. 0.2 μm filtration Sterilize by filtration in a sterilizer and then place in a sterile 500 ml medium flask. Room Store at warm temperature.   0.25M Na2HPOFour: 17.75 g anhydrous Na2HPOFourHPLC grade Dissolve it in the water of the flask and make 0.500 L in a volumetric flask. 0.2 μm filter sterilization Filter sterilize on equipment and then place in a sterile 500 ml medium flask. also Store at room temperature.   Brushite synthesis  Approximately 30 minutes before performing the synthesis, a cup horn (cup h Prepare the sonicator by cooling the orn). This is the water conden The low temperature thermostat of the sir is adjusted to 4 ° C and the peristaltic (perista) tic) Adjust the dial to the "4" setting of the circulator. If the mark of 4 ℃ is reached, 50.0 ml of 0.75M CaCl2And 50. 0 ml 0.25M Na2H2POFourPrepare and place in a 50 ml syringe. next Place these syringes on the three-way luercock connector so that they are placed on opposite sides of the diameter. To the lure and leave the remaining luer port open for product release. Mixing equipment Once set, place a sterile 120 ml sonication flask in the cup horn. Then, gradually raise the power of the sonicator to 100%. Open lure Position the mixing device so that the port is directly above the sonication flask. Each syringe Fill the contents of the syringe so that the Release rapidly and evenly into the flask. Then quickly polypropylene liner Is placed on a sonication flask and sonicated for an additional 15 minutes.   Brushite cleaning  The formulation is roughly divided into two 50 ml bluetooth Put in a blue top polypropylene tube, 2000 rpm for 10 minutes Pelletization for a period of time (room temperature). Vortex each pellet with sterile HPLC grade water. Reconstitute to 50 ml (or tube volume) by vortexing, then 2 Pellet at 000 rpm for 10 minutes. Repeat this wash three more times and then Reconstitute the last pellet to 50.0 ml. Add the dispersion to polypropylene. Transfer to a sterile 120 ml sonication flask with liner. The flask, Place in a sonicator cup horn pre-cooled to 1 ° C. 60 at 100% power Sonicate for minutes.Example 10 Intimacy with a molecularly stabilized coating of pyridoxyl-5-pyrophosphate Very clean brushite particle coating   Brushite / Piroxidal-5-phosphate (vitamin B6)  Example Transfer 100 ml of the dispersion prepared in step 10 into a 50 ml conical tube with the entire contents. Pellet to allow. Adjust the tube volume to 40.0 ml. Next contents Transfer 10 ml each to 4 15 ml conical tubes. 1000 mg of piroxidal- 5-Phosphate is dissolved in 800 μl 10 N NaOH, then made up to 10 ml with water. Adjust. The clear yellow solution was sterilized by filtration with a 2 μm acrodisc and filtered to 2.5 ml is added to each of the four previously prepared brushite tubes. Each tube for a few seconds Make sure to disperse the contents thoroughly by swirling and stirring. Overnight (approx. Freeze dry for 16 hours. Next morning, in 50 ml aliquots of sterile HPLC grade water 5 more times Suspend. Pellet again and transfer the pellets into 4 conical tubes , Then adjust the volume of the final formulation to 40.0 ml with water.Example 11 Thorough cleaning with a molecular stabilizing coating of citrate Brushite particle coating   Brushite / CitrateTransfer all contents to a 50 ml conical tube Pellet 100 ml of the dispersion prepared in Example 13. Tube volume 40 . Adjust to 0 ml. Next, transfer the contents to four 15 ml conical tubes in 10 ml aliquots. You. Add 10 ml of 100 mM citrate to each of the 15 ml conical tubes. Shake at room temperature for 30 minutes. Freeze-dry overnight (about 16 hours) at a low drying rate setting I do. Next morning, suspend in 50 ml of sterile HPLC grade water 5 more times. . Pellet one more time, transfer the pellets to four 15 ml conical tubes, Adjust final formulation volume with water to 40.0 ml.Example 12 Preparation, isolation and surface of human serum transferrin proteins Adsorption to   Nanocrystalline tin oxide was added to D.I. C. Reactive magnetron sputtering method It was synthesized with. A high-purity tin target of 3 "diameter is mixed with a high-pressure gas mixture of argon and oxygen. Sputtered in the compound. The ultrafine particles produced in the gas phase were washed with flowing liquid nitrogen at 77 Collected in a copper tube cooled to ° K. X-ray diffraction crystallography, selected area electron diffraction, transmission Electron microscopy, photon correlation spectroscopy, and energy dispersive X-ray analysis , The characteristics of all substances were analyzed. The sample for X-ray diffractometry is twice the size of the powder. It was prepared on a slide glass using a touch tape. Norelco automatic times CuK (α) rays were used in the folding device. Got The spectra were compared to ASTM standard data for tin oxide. With transmission electron microscopy The sample for the selected area diffraction method was prepared by dispersing it in a dispersion of nanocrystalline material with 2-propanol. On a standard 3mm diameter carbon coated copper mesh by dipping Collected. These samples were subjected to JEOL-STEM under an acceleration voltage of 60 to 80 KeV. Inspected at 100 CX. A 2-propanol suspension of particles can also be Using N4MD, solve the characteristics by photon correlation spectroscopy at 600 s test time at 22.5 ° C. Was analyzed. The energy dispersive analysis method is based on the Kevex quantex V software. Performed with a JEOL JSM-T330A scanning electron microscope.   Prepare a working dispersion of these metal oxides used to synthesize the compositions of the present invention. Therefore, 0.5 mg of metal oxide powder is added to the dust-free glass bottle with a screw cap. Added to 1.0 ml of 29.2 mM cellobiose phosphate buffered saline solution Then, sonication was performed at 22.5 to 35 ° C for 20 minutes. Then 3 at 16,000 × g Submerge by microcentrifuging for 0 seconds to pellet the giant particles. The Ron fraction was isolated. Approximately 900 μl of supernatant is taken out and screw-cap without dust Placed in a microcentrifuge tube equipped with. Photon correlation spectroscopy (Coult) er N4MD) and Doppler electrophoresis light scattering method (Coulter DELSA)   440). Also, take out a part of the coated particle dispersion Characteristic for stability and increasing salinity of solvent (increased conductivity) over time Was analyzed.   Adsorption of protein to the metal oxide nanocrystal core coated with cellobiose Therefore, the core sample is++And Mg++Phosphate buffered saline (Gibco Company) to 10.0 ml. 40.0 μg of purified human serum transferrin (4 μg / μl) (Gibco) ( Its antigenicity was confirmed by ELISA) and a 10 ml stirred cell (Spectra Company). The sample should then be shaken for 30 minutes, being careful not to create bubbles. It was stirred. After the addition time has passed, 15 ml of Ca++And Mg++Does not contain Through a cell with phosphate buffered saline (Gibco) under a nitrogen gas pressure head of 2 psi Washed. After washing, sample2Concentrate again to 1.00 ml under 1 sample, photon correlation spectroscopy, Doppler electrophoresis light scattering and transmission Analyzed by scanning electron microscopy as detailed below.   Conformational integrity was assessed by measuring the antigenicity of the binding protein. I paid. 50.0 μl of rabbit polyclonal anti-human transfection into the sample cell Phosphoantibody (Dako) (the antigenicity of which was confirmed by ELISA) was concentrated. To 0 ml of reaction product was added at 37.5 ° C. with slow stirring. 30 minutes After incubation, 15 ml Ca++And Mg++Phosphoric Acid Free Flush through the cell with buffered saline (Gibco) under a 2 psi nitrogen gas pressure head. , Then the reaction volume was again reduced to 1.0 ml.   200 μl of blocking agent, ie 1% w in saline without divalent ions / V bovine serum albumin was added and then equilibrated for 10 minutes. Then the secondary Antibodies, ie goat anti-rabbit polyclonal IgG conjugated with 30 nm gold (Zyme (Company d) was added and the reaction mixture was incubated for 30 minutes. Remove the sample and It was chopped on a grid of electron microscopy and dried under vacuum. The mixture is resuspended with 15 ml of divalent ion-free saline under a nitrogen pressure head. And washed and then fixed with glutaraldehyde. Then 1 ml of 3% solid bovine collagen (Collagen Corp.) was added to the mixture and the complex 106After ultracentrifugation at xg for 30 minutes, the resulting pellet is analyzed by transmission electron microscopy. It was processed normally as a biological sample for microscopy. Z sections with a thickness of 10 nm It was observed by eiss transmission electron microscopy. The control sample was used as an intermediate binder for cellobiose. Prepared as above without plying.   Photographs of transmission electron microscopes are available from D.H. C. Tin oxide sputtered with a magnetron , Individual particles with a diameter of 20 to 25 nm, and these particles aggregate to give a diameter of 80 It was shown to be a cluster of 120 nm. By photon correlation spectroscopy , When these same particles were dispersed in distilled water, the coagulation with a size of 154 ± 55 nm was It was found to produce aggregates. Tin oxide particles can be analyzed by electron diffraction and X-ray diffraction. Characteristic analysis revealed that it was sufficiently crystalline. For energy dispersive X-ray analysis Therefore, it was found that no other element was present as an impurity.   The average mobility of tin oxide was 10.8 by Doppler electrophoresis light scattering analysis. 2.177 ± 0.215 μm-cm in aqueous solution in the range ˜20.3 μM NaCl It was found to be / v-s. Surface coating with cellobiose in 1% solution Was conducted, tin oxide was found to exist in an aqueous solution in the range of 0.0 to 21.0 μM NaCl. Showed an average mobility of 1.544 ± 0.241 μm-cm / v-s. Tin oxide Was aggregated at a salt concentration of more than 40.0 μM, and dissolved at an increased cellobiose concentration. Aggregated in the liquid.   After coupling with transferrin, it was measured by photon correlation spectroscopy and transmission electron microscopy. As a result, the size of the crude tin oxide / cellobiose / protein complex was 350 ±. It was 84 nm. With a low concentration of gold antibody The size of the sample dropped by vacuum drying was 35 to 50 nm. Cellobiose The sections dried under reduced pressure without the tie layer were 400-> 1000 nm in size. When It was found that the antibody was bound around. High concentration of immunogold (immunogo ld) labeled and filtered, cellobiose-treated samples have 50 thin sections. The size was -100 nm. Positive gold binding is good Approximately 20% of the coated samples were confirmed to have a negative control (primary rabbit antibody Prepared as described above, except lacking), shows about 1% non-specific binding. did.   As can be seen from the above examples, carbohydrate-treated nanocrystalline metal oxide particles The biological activity of the protein adsorbed on the surface is preserved.   Example 13 Production and characterization of Epstein-Barr virus decoy   decoy  Nanocrystalline tin oxide was prepared as described in Example 1, and D. C. Anti It was manufactured by a reactive magnetron sputtering method.   Elutriated sucrose gradient Purified Epstein-Barr virus (EBV) from the B95-8 cell line From Advanced Biotechnologies Inc. (Columbia, MD, USA) Purchased. About 5.00 × 10TenEach ant of virus containing virus particles / ml The coat was suspended in 10 mM Tris-150 mM NaCl pH 7.5 buffer. (About 0.94 mg / ml protein). 0.75% (V / V) T of virion Solubilized with Ritton × 100 and then the method reported by Wells (Wells, A., Koide, N. , Klein, G .: Two large virion envelope glycoproteins mediate EBV binding to receptor-positive cel ls., J. Virology, 41, 286-297, 1982). The DNA cores were pelleted by ultracentrifugation at 50,000 xg for 60 minutes. After dialysis, the supernatant EBV extract was subjected to SDS-PAGE (denaturation) (Bi orad Mini Gel II, 4-20% gradient gel, 200V x 45 minutes , Silver stain) and size exclusion HPLC method (native) (WISP Auto Injector) Waters 620 system with a vector and a 720 photodiode array detector Wa, 100 mM NaCl / 20 mM Tris pH 9.4 gradient mobile phase ters SW300GFC column at 0.5 ml / min) went.   The control (non-EBV) protein was labeled with lambda phage virus (Pharmacia, USA). Aliquot from Milwaukee, Wisconsin) Extracted using.   An aliquot of tin oxide powder weighing about 1.5 mg is first swirled for a sufficient time. By stirring (Vortex Genie, Scientific Industries, Inc. Bohemia, York), 3.0 ml of 29. in a glass vial without dust. Suspended in 2 mM cellobiose solution. The obtained brownish color was cloudy Sonicate the suspension at 175 W for 10 minutes at a frequency of about 20 KHz at 25 ° C. (Branson 2 "Cup Horn, Branson Ultrasonics Corp., USA) Danbury, Toh). The resulting dispersion was microcentrifuged at 16,000 xg for 15 seconds. It was made transparent by attaching. The residual pellet was discarded, leaving the supernatant. 10 KD nominal molecular weight filtered stirring cell (10KD nominal molecular weight filtered stir cell) (Pharnacia) using 7.5 psiN237 under the gas head . 25 mM phosphate reaction buffer (pH 7.40, 25 mM HP at 5 ° C) OFour 2+/ H2POFour 1-) Cellulose that has not been adsorbed by performing ultrafiltration on 20 ml The biose was removed. Characterization of aliquots of intermediate products by photon correlation spectroscopy And dialysis as described below, followed by Doppler electrophoresis light scattering analysis. The characteristics were analyzed.   The process of viral protein adsorption is 4 in a 10KD nominal molecular weight stirring cell. 250 by performing ultrafiltration against 25 ml of phosphate reaction buffer at ℃ Remove mild Triton detergent from μl aliquot of EBV extract And then adjust the concentration to 1.0 μg / μl or the final The volume was adjusted to about 1.0 ml. Then do not contain 500 μl of Triton 1. The surface-treated tin oxide dispersion liquid obtained by preheating the EBV extract solution to 37.5 ° C.2. It was added rapidly to a MD nominal molecular weight stirred cell containing 0 ml. The resulting mixture Was incubated at 37.5 ° C for 2.0 hours with gentle agitation. I After incubation, the unadsorbed EBV extract was treated with 25 ml of phosphoric acid. It was removed by performing ultrafiltration on the buffer.   A control (non-EBV) device prepared with a viral protein extract of lambda phage. Carp was synthesized using the same method as above.   Intermediate components, final assembled decoy and whole Epstein-Barr virion Doppler electrophoresis light scattering analysis (DELSA 440, Coulter El ectronics Inc., Hialeah, Florida, USA) Their electrophoretic mobility (surface charge) in phase was measured. PH is 4. 59 to 9.06 with a corresponding conductivity of 2.290 to 4.720 mS / cm 9 One phosphate buffer was prepared. Surface-modified acid coated with crude tin oxide or cellobiose Tin oxide, synthetic EBV decoy, and all EBV alico The dialysate was dialyzed against each of the above 9 solutions to determine the mobility of the particles in the dispersion. It was measured under electric field strengths of 4.0, 5.5, 5.5 and 8.0 mA, respectively. Measurement equipment The measured values of mobility obtained at the same time with the 4 angled detector On average, the average of 3 measurements per dispersion was recorded.   The synthesized EBV and control decoys were characterized by immunoaggregation photon correlation spectroscopy. Analysis was performed to measure antibody reactivity on their surface. 15% lactose, 0.9% N aCl, 10 mM HEPES buffer and 0.2% NaNThreeAnti-EBV Ma in Us monoclonal antibodies (anti-EBV-VCA) anti-EBV EA-R, anti- A mixed solution of EBV MA and anti-EBV EA-D (1 μg each) (Dupont, 60 minutes EBV decoy with Wilmington, Delaware, USA at 37.5 ° C Evaluation of positive reactivity by incubating for a period of time did. Background reactivity is EBV decoy unrelated mouse IgG1And Evaluation was carried out by incubating. Specificity is based on the λ phage decoy It was evaluated by reacting with the noclonal anti-EBV mouse antibody. Aggregation is light Measured by 90 degree angle by child correlation spectroscopy (N4MD, Coulter ).   The antibody affinity intensity (antibody affinity intensity) Secondary anti-mouse 30nm gold labeled antibody was added and evaluated by immunogold transmission electron microscopy (Faulk, W., Taylor, G .: Immunocolloid method for electron microscopy, Immu nochemistry, 8: 1081-1083, 1971).   Labeling of EBV decoy (positive reaction) was performed with 20 μl of mouse monoclonal antibody. A mixture of [15% lactose, 0.9 NaCl, 10 mM HEPES buffer and 0.2% NaNThree1 μg of anti-EBV-V in CA and 1 μg of anti-EBV EA-R (Dupont)] in fresh 0.5 ml EB 30 minutes at 37.5 ° C in a stirred cell of 300KD nominal molecular weight with V sample It was carried out by incubating. 5.0 psiN2Under pressure head In addition, unbound antibody was removed by ultrafiltration against 20 ml of phosphate reaction buffer. I left. After cleaning, 30 nm gold sphere [106Particles / ml (Zymed Labor atories, Inc., San Francisco, CA) 50 μl of goat anti-mouse antibody was added to 200 μl of labeled particles in a 1M name molecule stirring cell. And incubated at 37.5 ° C for 30 minutes. 10 ml phosphate reaction buffer The unbound secondary antibody was removed by performing ultrafiltration on the liquid.   Labeling of EBV decoys (negative reaction) was performed using 2.5 μl of mouse polyclonal Specific IgGl (1 μg / μl in 15 mM NaCl pH 7.4 (Sigma Chemical  Corp., located in St. Louis, Missouri, USA), as described above, Incubate with a fresh 0.5 ml sample, then wash and gold label similarly. Performed by performing the steps. λ phage control decoy (negative reaction) The ligation was performed by adding 20 μl of a mixture of mouse monoclonal anti-EBV antibodies to λ phage. With the virus-coated decoy, use the same method as detailed above. It was carried out by incubating.   Immunolabeled particles were prepared for electron microscopy in two ways. Coated with carbon Copper viewing grid (Ted Pella Inc., Calif., USA) (Redding, Fla.) Submerged in the sample for about 5 seconds and then 5% glutar alde The direct immersion method, which is fixed with hydrid for 1 minute, is used for all reactions as a rapid screening method. Was. Glutar Aldehyde is added directly to the reaction solution and the product is then added to 0.5 ml soft agar formulation [in water. 0.7% agarose (Sea Kem, Tamecula, CA) The method of pelletizing at 16,000 × g for 5 minutes was further carried out. Got cold The heavenly plug was embedded in plastic and a 0.1 μm-thick section was prepared for observation.   Both positive and negative control analyzes were performed on pelleted samples of labeled reaction product. It was carried out by examination with scanning electron microscopy. The relative strength of antibody binding is gold Count the number of tin oxide based particles observed to have captured spheres (% positive) Then record the number of gold spheres trapped in a given particle (strength, number / event) Sought by.   The ultrafine tin oxide particles have a diameter of 20 to 25n by transmission electron microscopy. It was found that aggregates having a diameter of 80 to 120 nm were formed. this When the same particles were dispersed in distilled water, they formed aggregates with a size of 154 ± 55 nm. It was proved by photon correlation spectroscopy. Tin oxide particles are electron diffraction or X-ray When the characteristics were analyzed by the diffraction method, it was found to be sufficiently crystalline. Energy dispersive X-ray analysis The method revealed that no other element was present as an impurity.   Characterization of EBV proteins by SDS-PAGE revealed two clear A distinct protein band. First protein suggests variable glycosylation Exists as a dimer and is consistent with the major envelope glycoprotein of EBV. It showed a molecular weight of 350 kd. The second protein is clearly strong on the surface of the virus. It showed a molecular weight of about 67 kd, which is well adsorbed and is consistent with serum albumin. Spectroscopic measurement Maximum absorption at 280 nm, which is consistent with that of the protein, It was confirmed by HPLC that there were two distinct bands showing yield. Its lord The peak required has a chromatographic retention time of 10.30 minutes and is a monochromator. 90% inhibition by anti-VCA. The second smaller peak is bovine serum Chromatographic retention time of 15.75 minutes similar to albumin standard .   A mobility test of the Doppler electrophoresis method described above performed in the pH range 4.5-9.0. The test showed three distinct patterns. First, the decoy and native EB virus are It showed virtually the same mobility of about -1.4 μm-cm / V-s over the pH range. Secondly, untreated tin oxide has a mobility of about -1.0 μm-cm / V-s at pH 4.5. Shows that the mobility rapidly increases to -3.0 μm-cm / V-s at pH values of 5.0 or higher. Rose. Third, tin oxide whose surface has been modified by treatment with cellobiose is about -1. . The mobility of 5 μm-cm / V-s is shown, and the mobility rapidly becomes −2.5 μ at pH 7.5. It rose to m-cm / V-s.   By the above-mentioned photon correlation spectroscopy, the size of the native EBV is about 102 ± 32 nm. And the size of the synthetic EBV decoy was found to be about 154 ± 52 nm. . The synthetic EBV decoy aggregates when reacted with the monoclonal anti-EBV mixture. A lump of 1534 ± 394 nm was generated. Synthetic EBV decoys are nonspecific When reacted with Us IgG, the size increased only slightly and the aggregate diameter was 230 It was ± 76 nm. The decoy of λ phage was mixed with the monoclonal anti-EBV mixture. The size increased only slightly when applied, and the aggregate diameter was 170 ± 35 nm. Was.   Examination of EBV decoy particles labeled with anti-EBV antibody with the transmission electron microscope described above. As a result, the positive gold staining frequency was 23. 51 ± 5.53%, the average staining intensity Turned out to be a 7.41 gold label / event. Labeled with non-specific mouse IgG antibody The tested EBV decoy particles showed a positive gold staining frequency of 5.53 ± 2. At 04%, the average staining intensity was found to be 1.00 gold label / event. Anti-EB When λ phage decoy particles labeled with V antibody were tested, positive gold staining frequency was found. The average staining intensity was 1.06 gold label / event at 7.21 ± 1.26%.Embodiment 14 FIG. In vivo induction of antibody by Epstein-Barr virus decoy   Four sensitizing solutions were prepared, and the sensitized rabbits were about 8 weeks old, and the sensitizing solution was added every other week. Were administered three times by intramuscular injection of 250 μl each. First four Animals of about 10 per injection were dispersed in phosphate reaction buffer.9All EBs V virion (spectrum at 280 nm against 25 μg bovine serum albumin standard) Gp350 estimated by integrating the absorption curve of the method (about 32 μg) Was. The second four animals used the same injection protocol and isolated and purified gp 350 was administered at 32 μg per injection. 1 dose for animals in the third group EBV virus virus synthesized from a starting aliquot of 32 μg gp350 per shot Carp (Example 5) was administered. For the last group of animals, in phosphate reaction buffer Of cellobiose-coated tin oxide dispersed in the above was administered. Injection is horse mackerel It did not contain tubant. Two weeks after each of the three injections, a cardiac puncture was performed. The whole blood was collected by using the aseptic method, and the animal finished the cardiac puncture and then at 6 weeks. It led to lethal sedation. 16000 × g whole blood Serum was extracted by microcentrifugation for 1 minute at room temperature and frozen at -70 ° C until analysis. Stored.   Immunospecific antibody (ABI) against whole EBV virions It was assayed by Method A. About 109Coated with virion / ml phosphate reaction buffer Dilute 1:10 with buffer, then polycarbonate assay plate (Falcon) at 4 ° C. overnight. Rabbit against combined EBV virions Goat demonstrating the affinity of guiserum with p-nitrophenyl phosphate. Measured by colorimetric reaction of anti-rabbit IgG alkaline phosphatase (Sigma) . For the concentration of immunospecific IgG, use nonspecific rabbit IgG as the adsorbed antigen. The sera from rabbits stimulated with tin oxide alone were included compared to the calibration curve. It was determined by subtracting the recorded baseline value from the wells.   Sera collected from four rabbits sensitized with tin oxide were separated by 2 weeks. Anti-EBV exceeding pre-immune serum at any of the three sampling times It showed no increase in activity. The remaining 3 groups received anti-E for 6 weeks. The concentration of BV-specific IgG gradually increased. Sensitized with purified EBV protein Only animals showed a maximal anti-EBV IgG level of about 0.05 μg / μl at 6 weeks. did. In contrast, animals sensitized with whole EBV or decoy EBV were at week 6 Shows a statistically significant 4-fold response of about 0.20 μg / μl of anti-EBV IgG. did. The immunospecific responses to decoy EBV and whole EBV were virtually identical.   As is clear from Examples 5 and 6, EBV deco synthesized according to the present invention. I has the same surface charge as native virus and is specific for monoclonal antibodies. And strongly recognized and elicit immunospecific antibodies with the same potency as the whole virus You. Aggregate the number of aggregated particles under the above three reaction conditions using photon correlation spectroscopy Calculated from measurements of body diameter. These calculation results show that the monoclonal anti-EBV It is shown that the antibody produces an aggregate consisting of an average of 988.0 decoy EBV particles. doing. Is non-specific mouse IgG antibody an average of 3.33 decoy EBV particles? Aggregates, whereas the monoclonal anti-EBV antibody produced an average of 1.35 pairs. Generates agglomerates consisting of illuminating λ phage decoy particles. These measurement results are The measured aggregation capacity of the EBV decoy of the invention is almost three orders of magnitude greater than that of the control. Is shown. Anti-EBV labeled EBV decoy by immunogold transmission electron microscopy It was found that the amount of gold-labeled antibody that stains was 25 to 30 times that of the control. EBV deco The immunospecificity of anti-EBV IgG induced in rabbits by A was determined by ELISA. When analyzed, it is similar to the response elicited by the native virus and is isolated 4 times the response elicited by the purified protein produced. Examples 5 and 6 are Ko ssovsky, N. et al: Nanocrystalline Epstein-Barr Virus Decoys, Journal of Appli ed Biomaterial, Volume 2, pp. 251-259, 1991.Example 15. Manufacture of HIV decoys   Adsorption of HIV membrane antigen to diamond nanocrystal particles using the following procedure I got an HIV decoy.   Adjustment of HIV 1.0 ml of HIV (manufactured by Advanced Biotechnology, Inc. The TCID 50 titer measured by the company is 105.75-107.17Fluctuated between , Dialyzed in PBS by 100KD ultrafiltration and frozen at -70 ° C until needed. Tied. On the day of injection, thaw the virus stock on ice and then in PBS at a 1:25 ratio Diluted at a rate. 100 μl of this formulation was used for injection. 1.0 ml of HIV (105.74 Transforming unit / ml) (ABI) 0.5ml envelope Extraction buffer (1.0% Triton x 100 / 0.2 5 mM DTT / 10 mM Tris pH 7.4 / 1.0 mM MgCl)), Then, it was incubated at room temperature for 1.0 hr. Extract 2 at 100,000 xg . Ultracentrifugation at 4.0 ° C. for 0 hours (35000 rpm, SW50.1 Backman rotor) nucleocapsid was removed. Polystyrene With 300 μl of fine bead slurry (Spectra Gel D2) Triated by incubating and then performing 100KD ultrafiltration against PBS. The envelope protein was concentrated except for tonX. Place to inject 100 μl If so, adjust the volume of the extract to 1.0 ml and then dilute it with PBS at a ratio of 1:25. Or adjust the protein concentration to about 2.5 μg / 100 μl / injection volume Was. Protein quantification was performed by HPLC. The HPLC conditions are as follows. It is Ri. Waters GFC SW 300; mobile phase: 300 mM NaC l, 20 mM phosphate pH 7.4; kept at a flow rate of 0.5 ml / min for about 8.9 minutes. One major peak with retention time; integration is against BSA standard Was.   Manufacture of HIV decoys  The HIV extract was mixed with 20 mM phosphate buffer, pH 7.40. After ultrafiltration, the volume was adjusted to 1.0 ml and 500 mM cellobi was added. 24 hours at 4.0 ° C with 1.0 ml of diamond particles coated with aus. Incubated. The average particle size of the diamond particles was on the order of 50 nm . After adsorption, 300KD ultrafiltration against PBS was performed to Prepare a decoy dispersion for injection by removing the protein, then 1.0% with PBS. The volume was adjusted to ml and divided into 10 injection solutions of 100 μl each.   HIV decoy immunoreactivity  In rabbits, guinea pigs and mice, live virus, Mixed with protein extract, Freund's adjuvant Protein extract or HIV decoy virus. Against all viruses The antibody titer was measured by ELISA and the characteristics were analyzed by Western blotting. Fine Cell-mediated reactivity is It was evaluated in guinea pigs by attacking the dermis with ruth and then taking a biopsy.   Average electrophoretic mobility and average dispersion diameter of these synthetic carriers at physiological pH. (50 nm) closely resembled these infectious counterparts. Mouse, guinea pig Vaccination of rabbits and rabbits with HIV decoy resulted in total The production of antisera showing specific binding to HIV preparations was induced. Decoy Will And histological analysis of the earlobe site of animals sensitized by whole virus Although it showed similar reactions (qualitative and quantitative), it Of animals sensitized with genotype and animals sensitized with purified protein are 1, 2, 7 and And at 24 weeks were significantly different. Binding specificity was determined by Western blotting confirmed.   As can be seen from the above examples, the HIV decoy of the present invention has several characteristics that are unchanged. It is shared with all sexually transmitted HIV viruses. These characteristics include size and surface charge. Load, immunorecognition, ability to induce similar antibody titers, and magnitude of cellular response The characteristics are listed. These characteristics make the decoy virus of the present invention useful as a vaccination agent. It shows that it can function effectively.   Cleaning preformed solids or freshly producing clean solids and surfaces Method for obtaining a clean and clean solid surface by; carbohydrates, carbohydrate derivatives, and Other macromolecules with carbohydrate-like moieties characterized by multiple -OH (hydroxyl) side groups Method of applying solution containing large molecule; lyophilization to obtain molecularly stabilized surface coating Dry method; and Methods for immobilizing BRP members are described in additional examples below.Embodiment 16 FIG. Production of meticulously clean carbon ceramic (diamond) nanoparticles   1. 6 clean sonication tubes containing 500 mg particles per tube prepare.   2. Fill the tube with about 8 ml / tube of HCl (10 N) in the fume hood. .   3. Sonicate for 30 minutes [total power (175 watts) / 25 ° C]; sound once 3 tubes per wave treatment.   4. Centrifuge at 2000 rpm for 30 minutes.   5. Decant the acidic supernatant (in a fume hood) and place an HPLC column on the tube. Fill the screen with water and vortex.   6. Sonicate for 30 minutes (conditions above) and then centrifuge for 30 minutes (supernatant) Centrifugation is complete when the liquid becomes clear).   7. Decant the supernatant and then fill the tube with HPLC grade water and vortex. Roll and stir.   8. Repeat steps 7 and 8 two more times.   9. Decant the formulation into a clean glass (Pyrex) baking dish.   10. Anneal at 210 ° C. overnight.   11. Dry die by gently peeling off with a clean unpainted spatula Remove the Yamond crystals and transfer to 6 clean glass sonication tubes.   12. Repeat steps 3-8.   13. Prepare an ultrafiltration cell of 10 KD (NMWL) 150 ml And empty the contents of only one tube (only 500 mg per filtration operation) Place in cell, then N at 20 psi2Pressure head (regulator pressure gauge Wash with 500 ml of HPLC grade water through the cell under .   14． After washing, add 1 volume of formulation using the appropriate volume markings on the side of the cell. Adjust to 00.0 ml.   15. Remove 1.0 ml of the formulation from the cell and pre-weigh 1.7 ml of the solution. The concentration is measured by freeze-drying in a Schoppendorf tube. After freeze-drying, Weigh the tube with the contents of and subtract that weight from the weight of the empty tube. this Gives the initial density of the formulation. The concentration or density of particles in the solution is about 10 m g / ml is preferred. If the initial density is lower than 10 mg / ml, the solution is ultrafiltered Must be further concentrated in the cell.Example 17 Thoroughly clean, molecularly stabilized coating of diamond nanoparticles (cellobio Coating) Incubation / lyophilization   1. Carefully clean carbon (diamond) prepared in Example 16 (aqueous dispersion ) Is sonicated at full power (175 watts) for 30 minutes at 25 ° C.   2. For small volumes, tabletop microcentrifuge (30 seconds, total rotation speed 14, 000 rpm), or for large volumes, floor-top centrifuge (Model 21 K, 50 ml centrifuge tube, 8,000 rpm for up to 2 minutes) Exchange from water (stock) to a 500 mM cellobiose solution as quickly as possible. Pe Lettized carbon is suspended in 500 mM cellobiose and sonicated to remove To dissipate [total power (175 watts) at 25 ° C for about 5 minutes], then Finally, attach the mixture to a locking plate in a cold room (4 ° C) overnight. .   3. The next day, divide the mixture into appropriately sized containers and lyophilize overnight.   4. Cover the tubes with a layer of paraffin around the lids and then wash the tubes. Keep it in the freezer until the cleaning step.   5. Reconstitute the carbon / cellobiose in the appropriate buffer depending on the application. Appropriate Suitable buffers are low ionic strength phosphate buffer (PRB), water or bicarbonate solution. is there. Reconstitution with buffer was accomplished by vortexing and sonication for 5 minutes (175 watts / 2 5 ° C).   6. Centrifuge [For small volumes, tabletop microcentrifuge (30 seconds, total rotation speed 14,000 rpm), or in the case of a large volume, an on-bed centrifuge (model 21K, 50ml centrifuge tube, 8,000 RPM for up to 2 minutes) Wash by repeated resuspension in buffer.   7. Remove 1 ml of suspension and pre-weigh 1.7 ml of Eppend Dehydrate in a lyophilizer with a freeze dryer and lump.   8. Calculate the final volume required to bring the concentration to 1 mg / ml. Carbon / cello Sufficient buffer is added to bring the concentration of the biose formulation to 1 mg / ml.Example 18. Proper production of clean carbon particles   1. 2 g of GE carbon powder was added to a 250 ml Belco stirred flask (suspension medium). 25 ml of 30% hydrogen peroxide solution + 75 ml of 36) Mixed with N sulfuric acid. The reaction is exothermic and produces caustic vapor I do. Therefore, it is recommended to take the following precautions. 1. Fume Operate in the hood Yes; 2. To the two arms of the jar without completely screwing the Belco jar screw cap Therefore, ventilation is performed. Stir gently for 8 days.   2. Pour the solution into 2 x 50 ml centrifuge tubes (about 40 ml each). Discard the last 15-20% of the solution and save only the white material. 8,000 carbon Pellet by centrifuging at 0 RPM for 1 minute (room temperature). 20 mM pellet Suspend with acid buffer (7.4). Wash three times. In the third wash step The centrifugation period should be extended to 5-10 minutes. Because carbon is pH This is because as the temperature rises, it becomes less likely to precipitate. After the final wash, pellet Suspend in HPLC water and store at room temperature. The obtained particles have an average particle diameter of 260n. m ± 87 nm. ・ Measurement result: average particle diameter 260 ± 87 nm; STD analysis result 282 nm (98%) And 35.2 nm (2%) dust (4%).Example 19. Biochemically reactive to coated, close-clean solid surfaces Immobilization of members of the BRP   1. 1 ml of Epstein-Barr virus EBV (ABI) was added to 4.0 m. l of the extraction buffer (1% Triton x 100 / 0.25 mM diton) Addition to thiothreitol / 10 mM Tris pH 7.4 / 10 mM MgCl) Then incubate at room temperature for 1 hour. The obtained extract is 10 at 4 ° C. Ultracentrifugation at 30,000 xg for 2 hours (35000 rpm, SW50.1   Beckman rotor) nucleocapsid is removed.   2. Discard the pellet, leaving the supernatant.   3. The supernatant was transferred to a 100KD ultrafiltration device cooled with circulating water at 4 ° C. You.   4. A total of 200 ml of fresh sterile PRB (20 mM phosphate, Start continuous dialysis with pH 7.4). Extraction to make 100 μl injection solution Adjust the volume of the solution to a volume of 1.0 ml, then 1: 2 with PBS immediately before injection. 5 or diluted to a protein concentration of about 2.5 μg / 100 μl / Make the injection volume. Protein quantification can be performed by HPLC (HPLC The conditions are as follows: Waters GFC SW300; mobile phase: 300 mM. NaCl, 20 mM phosphate, pH 7.4; about 8.9 at a flow rate of 0.5 ml / ml. One major peak with retention time of minutes; integration against BSA standard I went).   5. The EBV extract was transferred to a 100 kd filter device and prepared in Example 10. Prepared carbon / cellobiose particles are added to a final concentration of 1 mg / ml. Total 2 Continuously permeate with 00 ml of fresh sterile PRB (20 mM phosphate, pH 7.4). Start analysis. Adjust the final volume to 1.0 ml when preparing conjugated HBV for injection Then dilute 1: 100 in PBS for 100 μl of injection. Everything else Bound HBV is stored in PRB at 4 ° C. for all applications.Embodiment 20 FIG. Biochemically Reactive to Coated Closely Clean Solid Surfaces Immobilization of pair (BRP) members   1. Extraction of murine lymphotropic virus (MuLV): MuLV storage ( ABI) to Triton X-100 extraction buffer (1.0% Triton). X-100 / 0.25 mM dithiothreitol / 10 mM Tris pH 7.4 /1.0 mM MgCl) at a ratio of 1: 5 (eg 1 ml of virus storage). Dilute the stock with diluent to a final volume of 5 ml), then incubate overnight at 4 ° C. I did it. The resulting extract is ultracentrifuged at 100,000 xg for 2 hours at 4 ° C. Over (35000 RPM, SW50.1 / B eckman rotor) nucleocapsid was removed.   2. Discard the pellet and leave the supernatant.   3. MuLV Decoy Synthesis: It is desirable to use aseptic technique throughout the synthesis. Yes. Adjust the stirred cell device to tightly control access to the reaction mixture I do. Transfer the MuLV extract to a 100 kd filter device with a volume of 10 ml, Carbon / cellobiose cores are then added to a final concentration of 1 mg / ml. total Continuous with 200 ml of fresh sterile PRB (20 mM phosphate, pH 7.4) Start dialysis. If the decoy is prepared for injection, adjust to a final volume of 1.0 ml. And then diluted 1:25 with PBS to give 100 μl of injection. other Decoys are stored in PRB at 4 ° C for all uses.Embodiment 21 FIG. Carefully clean solid of calcium phosphate dihydrate (brushite) Surface manufacturing   Reagents  0.75M CaCl2: 55.13 g of CaCl2・ 2H2HP for O Dissolve with LC grade water to 0.500 L in a volumetric flask. 0.2 μm Sterilize by filtration on a sterile filter and then place in a sterile 500 ml medium flask. Room Store at warm temperature.   0.25M Na2HPOFour: 17.75 g anhydrous Na2HPOFourHPLC grade Dissolve with water in the flask and make up to 0.500 L in a volumetric flask. 0.2 μm sterile filtration Filter sterilize on device and then place in a sterile 500 ml medium flask. After all room temperature Save with.   Brushite synthesis  Cool the cup horn about 30 minutes before performing the synthesis. Prepare the sonicator by and. This is a low temperature thermistor for water condensers. The temperature to 4 ° C and dial the "4" setting on the peristal circulator. Will be implemented together. 4 ℃ If the mark is reached, 50.0 ml of 0.75M CaCl2And 50.0 ml of 0.25M Na2H2POFourAnd put them in 50ml syringes You. Place these syringes on the opposite side of the diameter so that the three-way luer Connector and leave the remaining luer port open for product release. Good. Once the mixing equipment is adjusted, place a sterile 120 ml sonication flask in the cup horn. Put it in and slowly raise the power of the sonicator to 100% power. Opening Arrange the mixing device so that the set luer port is directly above the sonication flask. Place. Discharge the syringe contents into the flask as quickly and evenly as possible. Empty each syringe at about the same time. Then, quickly, the polypropylene liner Place directly above the sonication flask and sonicate for an additional 15 minutes.   Brushite cleaning  Made in two 50ml blue top polypropylene tubes The agent is roughly divided and then pelleted at 2000 rpm for 10 minutes (room temperature) Become Each pellet is vortexed with sterile HPLC grade water and stirred for 50 m. l (or tube volume) for 10 minutes at 2000 rpm Perform pelletization. Repeat this wash three more times, then reassemble the last pellet. Make up to 50.0 ml. The dispersion was equipped with a polypropylene liner Transfer to a sterile 120 ml sonication flask. Sonicator power that has been cooled to 1 ° C beforehand Place the flask in the uphorn. Sonicate at 100% power for 60 minutes U.Embodiment 22 FIG. With a molecular stabilizing coating of pyridoxyl-5-pyrophosphate, Carefully clean solid surface coating of calcium phosphate dihydrate (brushite) Ning   Brushite / pyridoxyl-5-phosphate (vitamin B 6)   The amount prepared in Example 13 so that the entire contents could be transferred to a 50 ml conical tube. Pellet 100 ml of the dispersion. Adjust the tube volume to 40.0 ml. Then within Transfer the contents to four 15 ml conical tubes in 10 ml aliquots. 1000 mg piroxy Dal-5-phosphate was dissolved in 80 μl of 10 N NaOH and then adjusted with water. To 10 ml. Filter off the clear yellow solution through a 0.2 μm acrodisc. Bacteria and add 2.5 ml of each to each of the four brushite tubes prepared above. Add Vortex each tube for a few seconds to ensure that the contents are well dispersed. Low Freeze-dry overnight (about 16 hours) at a different drying rate setting. The next morning, each 50ml is destroyed Resuspend in fungal HPLC grade water 5 more times. Pelletize it again and Transfer the pellets of 4 to 4 conical tubes and adjust the final volume of the formulation with water to 40.0 Make up to ml.Embodiment 23 FIG. Phosphate with a molecular stabilizing coating of citrate Thoroughly clean surface coating of Lucium dihydrate (Brushite)   Brushite / Citrate  Transfer all contents to a 50 ml conical tube 100 ml of the dispersion prepared in Example 13 are pelletized. Tube volume 40.0 Adjust to ml. Transfer the contents, 10 ml each, into four 15 ml conical tubes. 10 Add 10 ml of 0 mM citrate solution to each 15 ml conical tube for 30 minutes Shake at room temperature. Lyophilize overnight (about 16 hours) at a low drying rate setting. The next morning, resuspend in 50 ml of sterile HPLC grade water an additional 5 times. Already Pellet once, transfer the pellets to 4 15 ml conical tubes, Adjust volume to 40.0 ml with water.Example 24 Immobilization of insulin on brushite   Addition of insulin  Each of the four 10 ml suspensions prepared in Example 15 , 100 units of insulin are added and stirred at 4 ° C. on a orbital shaker.   1) Freeze-drying: Two core preparations and Savant Spe under low drying speed setting Lyophilize overnight (about 16 hours) with ed Vac (SVC100). Next morning, freeze Suspend the dried material to 10 ml with HPLC grade sterile water. Pelletizing and Wash three times with water by resuspension. 1.0 ml each during each wash And the activity is measured by taking out and measuring the absorbance of light having a wavelength of 272 nm. You. If it is determined that there is no activity in the supernatant (carrier), the formulation is 1m for injection. It is about 4.0 units per liter. Typical injection is 500 μl (2.0 units) .   If desired, brushite particles with immobilized insulin may be used. It may be encapsulated with phospholipids as below.   After lyophilizing insulin, each formulation was treated with 10% phosphatidylcholine, 1% Aqueous dispersion of 0% phosphatidylserine and 5% water soluble cholesterol (Si gma Biochemical) to 10.0 ml. Bring the mixture to 4 ° C on a rocker And incubate overnight. The next morning, 19 gauge n without significant foaming Extrude the mixture through seeded. Pellet and resuspend and wash 3 times with water Purify. During each wash, take out 1.0 ml each and absorb the light of 272 nm wavelength. Measure activity to determine activity. If the supernatant (carrier) is determined to be inactive In this case, the formulation is about 4 units per ml for injection. A typical injection solution is about 500 μl ( 2.0 units).   In-vivo tests showed that the immobilized immobilizate on coated brushite particles was used. Injecting phosphorus intravenously has the same physiological activity as solution-phase insulin (suppression of serum glucose). Control). Without coating, insulin would be brushy It loses all biological activity when it is immobilized in the gut.Example 25. Bovine Serum Al for Zinc Selenide Coated with Cellobiose Immobilization of bumin   In this example, the surface of an analyzer used for Fourier transform infrared spectroscopy was modified. explain about. The high energy surface of the carefully cleaned ZnSe sample holder is It is modified by a stabilizing coating of cellobiose. This is the conformation of the protein Provides a unique test surface for the analysis of Is also available.   Sample preparation  The surface coating that coats the ATR sample holder is composed of cellobiose. The subject was bovine serum albumin. 100 mM cellobiose solution (Sigma's D-(+) cellobiose, F W = 342.3 solid form) was prepared with HPLC grade water (Sigma). solid Bovine serum albumin (Sigma, molecular weight 46000) was added to phosphate buffered saline (Sigma). Co., Ltd., Dulbecco's phosphate buffer, pH = 7.2) to obtain the desired concentration of 4% (w / v) was obtained. All solutions should be used within 14 days of preparation and between tests Was stored at 4 ° C.   Manufacture of AIR sample holder  Horizontal ZnSe-45 ° ATR sample holder (Spec Tra-Tech model, dried cellobiose in Stamford, Connecticut, USA Prior to stacking the coating, the plate was 100 mM NaCl and 100 mM NaCH. OThreeAnd then thoroughly washed with HPLC grade water and acetone. 400 μl of 100 mM cellobiose solution was evenly applied and then heat was applied. Lyophilize for 10 minutes without tumbling (Savant SVC100 Lyophilize On the washed surface of its crystals by a vessel, Wesbury, NY, USA The biose coating was adsorbed. Next, 100 μl of 4% BSA solution was added to the cellobiose. Added to the coating. By gently aspirating excess protein solution And then remove the sample from both FTIR chambers with N2And purged for 15 minutes.   When the immobilized BSA was analyzed by ATR-FTIR, the secondary structural component was Unbound aqueous phase BS from the viewpoint of proportional distribution It was found to have the same conformation as A.Example 26 Immobilization of angiotensin converting enzyme on a carbon ceramic core   Carbon nanocrystalline particles coated according to the procedures described in the above examples were angio-loaded. The tensin converting enzyme was immobilized. Substrate decomposition rate in solution phase or BRP production The rate of growth depends on the rate of substrate degradation observed in solution phase for the unfixed enzyme. It turned out to be 5 times. The substrate degradation rate of angiotensin converting enzyme directly bound to uncoated particles is Only 2.5 times that of the non-fixed enzyme.Example 27 Preparation of cellobiose-coated brushite particles and human serum Surface adsorption of transferrin protein   Brushite nanocrystalline particles are prepared as described in Example 9. .   To adsorb proteins to the nanocrystalline core coated with cellobiose, A sample of Ca++And Mg++In phosphate buffered saline (Gibco) that does not contain Dilute to 10.0 ml. Then 40.0 μg of purified human serum transferrin (4 μg / μl) (Gibco) (its antigenicity has been confirmed by ELISA) Is added to a 10 ml stirred cell (Spectra). Be careful not to create bubbles While stirring the sample gently for 30 minutes. 2 psi after adding 15 ml of Ca under the raw gas pressure head++And Mg++Phosphate buffered saline (containing no Gibco) through the cell. After washing, sample21.00 ml under atmosphere Reconcentrate to 500 μl, then remove photon correlation spectroscopy, dop Analysis by Ra-electrophoretic light scattering and transmission electron microscopy .   Conformational integrity is assessed by measuring the antigenicity of the binding protein I do. 50.0 μl of rabbit polyclonal anti-human transfer to sample cell Concentration of Ehrine antibody (Dako) (its antigenicity has been confirmed by ELISA) Add to 1.0 ml of reaction product with stirring at 37.5 ° C. . After incubation for 30 minutes, 15 ml of C under 2 psi nitrogen gas pressure head a++And Mg++Wash through the cell with phosphate buffered saline (Gibco) that does not contain Clean and reduce the reaction volume to 10.0 ml again.   Blocking agent, 1% w / v bovine blood in saline containing no divalent ions Add 200 μl of clear albumin followed by equilibration for 10 minutes. Then the secondary antibody: Add 30 nm gold-conjugated goat anti-rabbit polyclonal IgG (Zymed) Incubate the reaction mixture for 30 minutes. Take out the sample and Dry under reduced pressure by chopping on a microscopy grid. The mixture Under a nitrogen pressure head, wash again with 15 ml of divalent ion-free saline. Fix with glutaraldehyde. To the mixture, 1 ml of 3% solid beef cola Gen solution (Collagen Corp.) was added and the complex was adjusted to 10630 minutes at × g, It is pelleted by ultracentrifugation and the pellet is used for transmission electron microscopy. The samples were processed as usual.   When transferrin is bound, its brushite / cellobiose / tan Pak-zygotes are about 150 nm in size. Nanocrystalline T treated with carbohydrate The biological activity of proteins absorbed on the surface of CP particles is preserved.Example 28 Preparation of meticulously clean biodegradable nanoparticles   1.1 6 clean sonications with 500 mg biodegradable particles per tube Prepare the tube.   2. Fill the tubes with about 8 ml of HCl (10N) in the fume hood. You.   3. Sonicate for 30 minutes [total power (175 watts) / 25 ° C]; sound once 3 tubes per wave treatment.   4. Centrifuge at 2000 rpm for 30 minutes.   5. Decant the acidic supernatant (in a fume hood) and pipe the tube in HPLC gray. It is filled with water and then vortexed.   6. Sonicate for 30 minutes (above conditions), then centrifuge for 30 minutes (top) Centrifugation is complete when the clear liquid is clear).   7. Decant the supernatant, then fill the tube with HPLC grade water and swirl. Stir.   8. Repeat steps 7 and 8 two more times.   9. Decant the formulation into a clean glass (Pyrex) baking dish.   Anneal at 10.210 ° C. overnight.   11. Dry raw by gently peeling off with a clean unpainted spatula The biodegradable crystals are removed and transferred to 6 clean glass sonication tubes.   12. Repeat steps 3-8.   13.10 KD (NMWL) 150ml ultrafiltration cell is prepared, one of the tubes Empty the contents into the cell (only 500 mg per filtration test), Then 20 psi (regulator pressure gauge reading) N2Below pressure head 500 Wash through cell with ml of HPLC grade water.   14． After washing the formulation by using the appropriate volume markings on the side of the cell Adjust the volume to 100.0 ml.   15. 1.0 ml of formulation was removed from the cell and then pre-weighed 1.7 ml The concentration is measured by freeze-drying in an Eppendorf tube. Freeze drying Then, weigh the tube with its contents, and subtract that weight from the weight of the empty tube. Draw. This gives the initial density of the formulation. Concentration or density of particles in solution The degree is preferably about 10 mg / ml. When the initial density is lower than 10 mg / ml If so, the solution must be further concentrated in an ultrafiltration cell.Example 29 Carefully clean biodegradable Na with a molecular stabilizing coating (cellobiose) No particle coating Incubation / lyophilization   1. Carefully clean biodegradable particles (aqueous dispersion) prepared in Example 7 Sonicate with power (175 watts) for 30 minutes at 25 ° C.   2. For a small volume, a tabletop microcentrifuge (30 seconds, total rotation speed 14.0 0 RPM) or in the case of a large volume a floor centrifuge (model 21K, 50 Using a ml centrifuge tube, 8,000 RPM for up to 2 minutes, suspend the suspension medium in water (storage Material) to a 500 mM cellobiose solution as soon as possible. Pelletized The suspended particles are suspended in a 500 mM cellobiose solution and sonicated to promote dispersion. [Total power (175 watts) for about 5 minutes at 25 ° C] and then finally cool the mixture. Attach to locking plate overnight in room (4 ° C).   3. The next day, the mixture is lyophilized overnight in appropriate sized containers.   4. Cover the lid with a layer of paraffin and place the tube in the freezer until the washing step. Put in.   5. Reconstitute the particles / cellobiose with an appropriate buffer depending on the application. Proper loose The buffer is a low ionic strength phosphate buffer (PRB), water or bicarbonate solution. Reconstitution with buffer was vortexed and sonicated for 5 minutes (175 watt / 25 ° C). Done by   6. Centrifuge [Tabletop microcentrifuge for small volume (30 seconds, total rotation speed 14,000 RPM) or in case of a large volume, a floor type centrifuge (Model 2) 1K, 50 ml centrifuge tube, 8,000 RPM for up to 2 minutes) and buffer Repeated resuspension in washing I do.   Take out 7.1 ml of the suspension and use a freeze dryer to pre-weigh 1.7 ml Dehydrate in an Eppendorf tube to produce a lump and measure the concentration.   8. Calculate the final volume required to bring the concentration to 1 mg / ml. Particle / cellobi Add sufficient buffer to bring the concentration of the ose formulation to 1 mg / ml.Example 30 Cellobiose-coated brushite particles with bound hemoglobin Manufacturing of   The hemoglobin-bonded brushite particles of the present invention are described in the following examples. The manufacturing of the child will be described. This manufacturing process uses ultra-fine nanocrystalline brushite particles. The pups were coated with two glassy coatings and then physically adsorbed with purified hemoglobin. It was made up of. The obtained aggregate was coated with phospholipid.   1.00 g of the ultrafine particles produced as in Example 28 were added to 175 w (Branson) 5.0 ml of 10 mM serum by sonication for 10 minutes. It was dispersed in a solution of Robiose (Sigma). Stir the obtained colloid for 10KD Incubated in cell at 4.0 ° C. overnight. Next day freeze this colloid for 24 hours After binding and drying, 1.0 ml of ddH2Reconstructed in O. Unabsorbed cellobiose 10 to 100 ml of 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) (PRB). Removed by KD cell ultrafiltration (UF) (Filtron) and adjusted to 2.0 ml did. For 100 ml of 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) (PRB) ( UF) and adjustment to 2.0 ml.   500 mg human hemoglobin A0Type (Sigma) with 5.0 ml of PBS (pH 6.8) (Gibco) and then stirred with 59KD. 30 psi N in stirred cell2Ultrafiltration against 150 ml PRB at 4.0 ° C Passed. The filtrate was adjusted to 3.0 ml. Then surface modified brushite dispersion Add (2.0 ml) to a 50KD ultrafiltration cell and stir overnight with slow stirring. Incubated (5 psi N2). The filtrate was adjusted to 3.0 ml. Then the surface The modified diamond dispersion (2.0 ml) was added to a 50KD ultrafiltration cell. , Incubated overnight with slow agitation (5 psi N2, 4.0 ℃) . The next morning, 35 μl of phosphatidyldipalmitoylserine (10 mM 6.0 m M NaOH) (Sigma), 50 μl phosphatidyldipalmitoylcholine (6.8 mM stock) (Sigma) and 8.7 μl cholesterol (3. 9 mM stock) (Sigma) was added, stirred, and incubated for about 6.0 hours. Was. 30 psi N final product250 KD for 20 ml PBS using It was filtered again in a filtration cell (pH 7.4, 4.0 ° C., estimated hemoglobin concentration 10). Adjusted to 5.0 ml to g / dl).Embodiment 31 FIG. Preparation of P5P-coated brushite particles bound with hemoglobin Construction   In this example, pyridoxal-5-phosphate was coated with an oxygen carrier. In the same manner as in Example 30, except that it is used as a substitute for cellobiose. Produced a red blood cell substitute.   50 mg of the acid washed particles were sonicated at 175 watts for 10 minutes (Br. anson) dispersed and 75.0 mg of pyridoxal-5-phosphate (Si gma) and then adjusted to 10.0 ml with demineralized water. Distant mixture Heart separated, lyophilized overnight, washed with 4-10 ml of demineralized water, then pH 7.40, 2 Reconstituted with 0 mM phosphate buffer to 25 mg / ml.   Collect 4.0 ml (25 mg / ml) of nanocrystalline core particles Red blood cell lysed hemoglobin Added to 10 ml bottle (26.10 g / dL). The resulting mixture is 20 psi Nitrogen pressure head through a 10KD ultrafiltration cell at 4.0 ° C overnight, 100m Slowly dialyzed into 1 of 0.5 × PRB. The next morning, 34 μl of phosphatidylse Phosphorus (10 mM 6.0 mM NaOH) (Sigma), 50 μl of cholesterol Roll (3.9 mM stock) (Sigma) was added and stirred for about 6.0 hours. Incubated. 30 psiN final product2To 200 ml of PBS using Filter through a 50 KD ultrafiltration cell again to remove free hemoglobin (pH 7.4). , 4.0 ° C), and then adjusted to 1.0 to 2.5 ml so that the estimated hemoglobin concentration is 1 It was set to 0 g / dL.   The above procedure was repeated with different concentrations of pyridoxal-5-phosphate. As a result, 1 mM pyridoxal-5-phosphate and 30 mM pyridoxal-5-phosphate Do not coat the nanocrystalline particles with a solution containing each of monkey-5-phosphate. A red blood cell substitute was produced.   Particle size distribution, electrophoretic migration for red blood cell substitutes prepared in Examples 30 and 31. The properties of oxygen dissociation as well as degree and retained molecular conformation were analyzed. Cellobi The red blood cell substitute coated with aus (Example 30) was about 26-30 mmHg. The oxygen dissociation partial pressure (P50) was shown. Pyroxidal-5-phosphate coating The red blood cell substitute with a ring has an oxygen dissociation partial pressure (P50) of about 37 mmHg. Had. This oxygen dissociation partial pressure is sufficiently comparable to the oxygen dissociation partial pressure of human whole blood of 31 mmHg. I have an enemy. In addition to Example 30 except that the lipid coating was omitted. Hemoglobin-bound nano-grains in the same way Manufactured a child. Oxygen dissociation content of the obtained lipid-free hemoglobin-bound nanocrystalline particles The pressure was about 10 mmHg.   The electrophoretic mobility of the red blood cell substitutes prepared in Examples 30 and 31 was determined by Doppler electrolysis. It was measured by electrophoretic light scattering analysis. (DELSA 440, Coulter Elctronics, In c. Company, located in Hialeah, Florida, USA). Its electrophoretic mobility is p at 25 ° C. It was -1.7 micrometer / Vs in H7.4 PRGB BUFFER.   PR the particle size distribution of the red blood cell substitutes produced in Examples 30 and 31 at 22.5 ° C. By photon correlation spectroscopy (N4MD, Coulter) at 90 ° in B buffer And by transmission electron microscopy (TEM, Zeiss 190) Was. The size of these red blood cell substitutes was about 200 as measured by photon correlation spectroscopy. It was nanometer. For electron microscopy, a 10 μL droplet of the particle-containing solution It is placed on a paraffin surface and the top of the droplet is carbon-stabilized Formvar. GRID (Ted Pella, Inc., Reading, CA, USA) floated . Due to the high surface charge of TEM GRID, red blood cell substitutes will not be absorbed by the grid. The excess solution could be removed by careful blotting. Then similar The particles were stained with 2% phosphotungstic acid using the method of. Stained grits And the red blood cell substitute has a particle size in the range of 50-100 nanometers. It was confirmed that   Conformational integrity of red blood cell substitutes was confirmed by the strength of immunogold antibody affinity . After deposition on a 1 nm TEM copper grid, the protein-bound particles were , Polyclonal rabbit anti-human hemoglobin antibody (Dako) and secondary goat anti-mouse Heron 30 nanometer gold labeled antibody (Zymed Laboratories, Calif. Sanfra, State of A Incubation at 27 ° C. for 1 hour. The gold labeled antibody is Strong adherence to the hemoglobin present in the red blood cell substitute was observed.Example 32 Preparation of P5P-coated brushite particles conjugated with taxol   In this example, taxol was used instead of hemoglobin. The drug delivery vehicle is prepared in the same manner as in Example 30.   50 mg of washed particles were sonicated at 175 watts for 10 minutes (Branson) And mixed with 75.0 mg of pyridoxal-5-phosphate (Sigma). , And then adjusted to 10.0 ml with deionized water. Centrifuge the resulting mixture, Lyophilize overnight, wash with 4-10 ml of deionized water, then 20 m of pH 7.40. Reconstituted with M phosphate buffer to 25 mg / ml.   4.0 ml (25 mg / ml) of nanocrystalline core particles was added to 1.0 ml of solubilized tag. Sole (100mg / 10ml dd H2O). The resulting mixture , 100 psi with a 10 KD ultrafiltration cell under a nitrogen head of 20 psi. Slowly dialyzed against 5 × PRB overnight at 4 ° C., then lyophilized. next morning, 34 μl of phosphatidylserine (10 mM 6.0 mM NaOH) (Sigma ) And 50 μl cholesterol (3.9 mM stock) (Sigma) and added. Stir and incubate for approximately 6.0 hours. Final product again at 30 psi N2 Was filtered through a 50KD ultrafiltration cell against 200 ml PBS (pH 7.4). 4.0 ° C).Example 33 Adhesion of transfection substance   DNA or DNA was added to any of the coated particles described in the previous examples using the following procedure. Or attach a segment of RNA.   40 mg / ml coated nanoparticles with 20 mM phosphate buffer pH 6.80 Make a dispersion. Cesium chloride purified DNA or RNA was added to this dispersion. Add 1.00 μg of the fragment and stir gently at room temperature for about 16 hours. Absorb. The particular DNA fragment used in this example is human deamidation. Nase gene.Example 34 Attachment of targeting ligand and phospholipid membrane   Isolation and attachment of targeting ligands and phospholipid membranes is described in this example. The method used is the method of particle / coating / DNA or RNA described in the above examples. Available for all combinations.   Virus 106The transforming unit of Triton extraction buffer ( 1.0% Triton × 100 / 0.25 mM DTT / 10 mM Tris pH7 . 4 / 1.0 mM MgCl). Then extract 10 Ultracentrifugation at 50,000 xg for 2 hours at 4 ° C (35 rpm, SW50.1   Beckman rotor) nucleocapsid is removed. polystyrene With 300 μl of microbead (Spectra Gel D2) slurry And then 5 mg / ml phosphotidyl coli in phosphate buffer And 100 mg ultrafiltration against 5 mg / ml phosphotidylserine This achieves triton removal and envelope protein enrichment. C An alternative method for Ils extraction is as follows. In 20 mM phosphate buffer pH 7.4 Phosphotidyl choline (5 mg / ml) and phosphotidyl serine (5 mg / ml) The mixture of) is sonicated at 4.0 ° C. for 30 minutes. 10 per 1 ml6Unit of wi Ruth was added to 1.0 ml of the phospholipid mixture, and 3 cycles of 5 seconds per min. Sonicate for 0 minutes at 40 ° C. Nucleocapsid should be ultracentrifuged at 35,000 rpm at 40 ° C. Remove by. The carbohydrate intervening layer is first absorbed by the TCP-DNA / RNA complex. Once deposited, the ligand / membrane components are added.Example 35   One construct is an albumin enhancer and limited ends for genome uptake Adsorption of the first layer consisting of the human deaminase gene in an expression cassette with duplication Composed of brushite core. The structure contains cellobiose Bilayer and third layer of human low density lipid derived membrane protein (LDL receptor ligand) Are adsorbed.   All cited references are incorporated herein by reference in their entirety.   Although representative embodiments of the present invention have been described, only the representative examples are disclosed. , Various other variations, applications and modifications can be implemented within the scope of the present invention. Those of ordinary skill in the art will appreciate. Accordingly, the present invention is exemplified herein. It is not limited to the specific embodiments described above, but only to the claims below.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/16 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/00 38/48 9051−4Ｃ 48/00 39/00 9538−4Ｄ Ｂ０１Ｊ 20/02 Ｃ 48/00 9538−4Ｄ 20/26 Ｚ Ｂ０１Ｊ 20/02 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 20/26 2121−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 11/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５Ｕ Ｃ１２Ｎ 11/00 0276−2Ｊ ５２５Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５ 0276−2Ｊ ５８１Ｕ 0276−2Ｊ ５８１Ｃ ５８１ 0276−2Ｊ 33/553 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/14 33/553 9051−4Ｃ 37/47 (31)優先権主張番号 ０８／１４７，７５１ (32)優先日 1993年11月４日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 スポンスラー エドワード アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91506 バーバンク ウエストアンジェリ ノアベニュー 1021 ナンバー 112 (72)発明者 ゲルマン アンドリュー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90036 ロスアンジェルス ノーススタン レーアベニュー 418 (72)発明者 ナティシン エイチ． ジェイムズ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90024 ロスアンジェルス ケルトンアベ ニュー 1350 ナンバー 303 (72)発明者 ラジュルー サミール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90024 ロスアンジェルス ベテランアベ ニュー 660 ナンバー 303─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI A61K 38/16 9284-4C A61K 39/00 38/48 9051-4C 48/00 39/00 9538-4D B01J 20 / 02 C 48/00 9538-4D 20/26 Z B01J 20/02 8615-4C C07H 21/04 B 20/26 2121-4B C12N 11/00 C07H 21/04 0276-2J G01N 33/543 525U C12N 11 / 00 0276-2J 525C G01N 33/543 525 0276-2J 581U 0276-2J 581C 581 0276-2J 33/553 9051-4C A61K 37/14 33/553 9051-4C 37/47 (31) Priority claim number 08 / 147,751 (32) Priority date November 4, 1993 (33) Priority claiming country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP (72) Inventor Sponsler Edward United States California 91506 Burbank West Angelino Ave 1021 Number 112 (72) Inventor Gelman Andrew United States California 90036 Los Angeles North Stanley Avenue 418 (72) Inventor Natishin H. James United States California 90024 Los Angeles Kelton Avenue 1350 Number 303 (72) Inventor Rajulu Samir United States California 90024 Los Angeles Veteran Avenue 660 Number 303

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．金属、金属合金、ポリマー、セラミック、ガラスまたは金属間化合物から なる表面を有する物品； 生化学的に反応性の対を、変性することなく捕捉するのに充分なしきい表面エ ネルギーを前記表面に与える物質で特に構成されたコーティング；および 前記コートされた表面に捕捉されかつ変性されていない少なくとも一つの生化 学的に反応性の対； を含有してなる組成物。 ２．前記物品が、直径が約１０００ナノメートル未満のコア粒子である請求の 範囲１記載の組成物。 ３．前記生化学的に反応性の対が、リガンド−受容体対、酸素−基質対、医薬 −受容体対、触媒−反応物対、免疫学的対、毒素−リガンド対、吸収剤−アブソ ーベート対、および吸着剤−アドソベート対からなる群から選択される請求の範 囲１記載の組成物。 ４．前記生化学的に反応性の対が、レシチン類とレシチン結合部位、ＨＤＬと ＨＤＬ受容体細胞受容体部位、ホルモン類とホルモン受容体部位、抗体とリボソ ームタンパク質からなるリガンド−受容体対の群から選択される請求の範囲１記 載の組成物。 ５．前記生化学的に反応性の対が免疫学的対のメンバーの群から選択される請 求の範囲１記載の組成物。 ６．前記生化学的に反応性の対が、リゾチーム−キチン対、リボヌクレアーゼ −ＲＮＡ対、カルボキシペプチダーゼＡ−カルボキシル末端ポリペプチド対、セ リン、亜鉛、チオールおよびカルボキシルプロテアーゼ類−タンパク質対、ＮＡ ＤＨ−Ｑレダクターゼ−ＮＡＤＨ対、グルタチオンセダクターゼ−グルタチオン 対、ならびに アセチルコリンエステラーゼ−アセチルコリン対からなる酵素−基質対の群から 選択される請求の範囲１記載の組成物。 ７．前記生化学的に反応性の対が、エピネフリンとアドレナリン受容体類、メ タドンとオピエーと受容体類からなる医薬−受容体対の群から選択される請求の 範囲１記載の組成物。 ８．前記生化学的に反応性の対が、ストリキニーネとグリシン受容体、ヘモグ ロビンと一酸化炭素およびオルガノホスフェート化合物とアセチルコリンエステ ラーゼからなる毒素−リガンド対の群から選択される請求の範囲１記載の組成物 。 ９．直径が約１０００ナノメートル未満の生物分解性コア粒子； 生化学的に活性な物質を、変性させることなく捕捉するのに充分なしきい表面 エネルギーを前記コア粒子に与え、かつそのコア粒子の表面の少なくとも一部を 覆う物質を含んでなるコーティング；ならびに 前記コートされたコア粒子に捕捉され、かつ変性されていない少なくとも一つ の生化学的に活性な物質； を含んでなる組成物。 １０．前記コア粒子が生物分解性のセラミックまたはポリマーを含んでなる請 求の範囲９記載の組成物。 １１．前記コア粒子がブルッシャイト及びリン酸三カルシウムからなる群から 選択される生物分解性セラミックを含んでなる請求の範囲１０記載の組成物。 １２．さらに、標的リガンドを含有するリン脂質の外側コーティングを含んで なる請求の範囲９記載の組成物。 １３．前記生物学的に活性な物質が、生化学的に反応性の対の一方または両方 である請求の範囲９記載の組成物。 １４．前記コーティングが、シトレート、セロビオースまたはピリドキサル− ５−ホスフェートを含んでなる請求の範囲９記載の組成物。 １５．前記生化学的に活性な物質がウイルスタンパク質のフラグメントである 請求の範囲９記載の組成物。 １６．前記生化学的に活性な物質が医薬である請求の範囲１２記載の組成物。 １７．前記生化学的に活性な物質がヘモグロビンである請求の範囲９記載の組 成物。 １８．直径が約１０００ナノメートル未満の生物分解性コア粒子； トランスフェクション物質を、変性させることなく捕捉するのに充分なしきい 表面エネルギーを前記コア粒子に与え、かつそのコア粒子の表面の少なくとも一 部を覆う物質を含んでなるコーティング；ならびに 前記コートされたコア粒子に捕捉され、かつ変性されていない少なくとも一つ のトランスフェクション活性物質； を含んでなる組成物。 １９．前記コア粒子が生物分解性のセラミックまたはポリマーを含んでなる請 求の範囲１８記載の組成物。 ２０．前記コア粒子がブルッシャイトを含んでなる請求の範囲１９記載の組成 物。 ２１．さらに、前記コア粒子の表面の少なくとも一部を覆う標的コーティング を含む請求の範囲１８記載の組成物。 ２２．前記外側標的コーティングがリン脂質とターゲッティングリガンドを含 んでなる請求の範囲２１記載の組成物。 ２３．前記コーティングが、セロビオース、ピリドキサル−５−ホスフェート またはシトレートを含んでなる請求の範囲１８記載の組成物。 ２４．前記トランスフェクション物質がＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントであ る請求の範囲１８記載の組成物。 ２５．前記トランスフェクション物質がアンチセンスフラグメントである請求 の範囲１８記載の組成物。 ２６．前記ターゲッティングリガンドがウイルスのエンベロープである請求の 範囲２２記載の組成物。 ２７．前記コア粒子が生物分解性のセラミックまたはポリマーを含んでなる請 求の範囲２１記載の組成物。 ２８．前記コア粒子がブルッシャイトを含んでなる請求の範囲２１記載の組成 物。 ２９．前記コーティングがセロビオース、ピリドキサル−５−ホスフェートま たはシトレートを含んでなる請求の範囲２１記載の組成物。 ３０．前記トランスフェクション物質がＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントであ る請求の範囲２１記載の組成物。 ３１．前記トランスフェクション物質がアンチセンスフラグメントである請求 の範囲２１記載の組成物。[Claims]   1. From metals, metal alloys, polymers, ceramics, glasses or intermetallics An article having a surface   Threshold surface energy sufficient to capture biochemically reactive pairs without denaturation. A coating specifically composed of a substance that imparts energy to the surface; and   At least one bioavailability trapped on the coated surface and not modified A chemically reactive pair;   A composition comprising:   2. The article is a core particle having a diameter of less than about 1000 nanometers. The composition according to range 1.   3. The biochemically reactive pair is a ligand-receptor pair, an oxygen-substrate pair, a drug. -Receptor pair, catalyst-reactant pair, immunological pair, toxin-ligand pair, absorbent-absolute A pair of claims and a sorbent-adsorbate pair of claims. The composition according to Box 1.   4. The biochemically reactive pair is a lecithin, a lecithin-binding site, and HDL. HDL receptor Cell receptor site, hormones and hormone receptor site, antibody and riboso Claim 1 selected from the group of ligand-receptor pairs consisting of a genomic protein. Composition.   5. A contract in which the biochemically reactive pair is selected from the group of members of the immunological pair. A composition according to claim 1.   6. The biochemically reactive pair is lysozyme-chitin pair, ribonuclease -RNA pair, carboxypeptidase A-carboxyl terminal polypeptide pair, Phosphorus, zinc, thiol and carboxyl proteases-protein pair, NA DH-Q reductase-NADH pair, glutathione seductase-glutathione Pair, and From the group of enzyme-substrate pairs consisting of acetylcholinesterase-acetylcholine pair The composition of claim 1 selected.   7. The biochemically reactive pair is epinephrine and adrenergic receptors, Claims selected from the group of drug-receptor pairs consisting of tadone, opie and receptors. The composition according to range 1.   8. The biochemically reactive pair is strychnine, the glycine receptor, and hemoglobin. Robin and carbon monoxide and organophosphate compounds and acetylcholine ester A composition according to claim 1 selected from the group of toxin-ligand pairs consisting of an enzyme. .   9. Biodegradable core particles less than about 1000 nanometers in diameter;   Threshold surface sufficient to capture biochemically active substances without denaturation Energy is applied to the core particles, and at least part of the surface of the core particles is A coating comprising a covering material; and   At least one that is trapped by the coated core particles and is not modified Biochemically active substance of;   A composition comprising:   10. A contract wherein the core particles comprise a biodegradable ceramic or polymer. A composition according to claim 9 of the present application.   11. The core particles are selected from the group consisting of brushite and tricalcium phosphate. The composition of claim 10 comprising a biodegradable ceramic of choice.   12. Additionally, including an outer coating of phospholipids containing the targeting ligand The composition according to claim 9, which comprises:   13. The biologically active substance is one or both of a biochemically reactive pair. 10. The composition according to claim 9, which is   14． The coating is citrate, cellobiose or pyridoxal- A composition according to claim 9 which comprises 5-phosphate.   15. The biochemically active substance is a fragment of a viral protein The composition according to claim 9.   16. 13. The composition according to claim 12, wherein the biochemically active substance is a drug.   17． 10. The set according to claim 9, wherein the biochemically active substance is hemoglobin. Adult.   18. Biodegradable core particles less than about 1000 nanometers in diameter;   Threshold sufficient to capture the transfection material without denaturing Surface energy is imparted to the core particle and at least one of the surfaces of the core particle is A coating comprising a material covering the part; and   At least one that is trapped by the coated core particles and is not modified Transfection-active substance;   A composition comprising:   19. A contract wherein the core particles comprise a biodegradable ceramic or polymer. 19. A composition according to claim 18.   20. 20. The composition of claim 19, wherein the core particles comprise brushite. Stuff.   21. Further, a targeting coating covering at least a portion of the surface of the core particle 19. The composition of claim 18, which comprises:   22. The outer target coating comprises a phospholipid and a targeting ligand. 22. The composition according to claim 21, which comprises:   23. The coating is cellobiose, pyridoxal-5-phosphate The composition according to claim 18, which further comprises citrate.   24. The transfection substance is a segment of DNA or RNA 19. The composition according to claim 18, which comprises:   25. The transfection substance is an antisense fragment. 19. The composition according to range 18.   26. The targeting ligand is a viral envelope. 23. The composition according to range 22.   27. A contract wherein the core particles comprise a biodegradable ceramic or polymer. A composition according to claim 21.   28. 22. The composition of claim 21, wherein the core particles comprise brushite. Stuff.   29. The coating comprises cellobiose, pyridoxal-5-phosphate or 22. The composition of claim 21, which comprises citrate or citrate.   30. The transfection substance is a segment of DNA or RNA 22. The composition according to claim 21.   31. The transfection substance is an antisense fragment. 22. A composition according to range 21.
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