JPH09504181A

JPH09504181A - How to display protein

Info

Publication number: JPH09504181A
Application number: JP8502436A
Authority: JP
Inventors: フアング，グレイス，ピー; ロード，ピーター，アール; スティンソン，ジェフェリー，アール; ウォン，ヒン，シー
Original assignee: デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1995-06-12
Publication date: 1997-04-28
Also published as: WO1995034648A1; CA2169358A1; AU697865B2; AU2828295A; EP0722495A1; US5516637A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ピリンタンパク質又はその一部と異種のポリペプチド（標的タンパク質）とを含む、融合タンパク質に関する。好ましい一具体例においては、本発明は、線毛を形成する能力のある細菌宿主細胞の外表面に標的タンパク質を表示させるための方法に関する。ある具体例においては、線毛がバクテリオファージ吸着及び感染のための受容体であることが望ましい。Ｆ線毛が好ましい。 (57) Summary The present invention relates to a fusion protein comprising a pilin protein or a part thereof and a heterologous polypeptide (target protein). In a preferred embodiment, the invention relates to a method for displaying a target protein on the outer surface of a bacterial host cell capable of forming pili. In certain embodiments, it is desirable that the pili be a receptor for bacteriophage adsorption and infection. F-hairs are preferred.

Description

【発明の詳細な説明】蛋白のディスプレー方法本発明は一般にはバクテリアの表面にポリペプチドおよび蛋白の輸出およびディスプレーに関する。抗原的に活性な蛋白、特異性結合タンパクおよび酵素活性タンパクを含む、タンパクのディスプレー、修飾、選択および精製のための方法を提供する方法が提供される。本発明の背景バクテリアおよびバクテリアファージの表面上のタンパクの発現は一部は組換え抗体生産の関心のため数年の間追求されて来た。遺伝子工学的な全細胞吸着剤の生産、ペプチドライブラリの構築、細胞結合酵素、そして抗体を発生する生ワクチンまたは免疫原の使用を含む、多数の他の可能な応用が存在する。ＷＯ９２／０１０４７およびＷＯ９３／１０２１４を見よ。バクテリアにおいては、表面発現異質タンパクを得る一つのアプローチは、異質タンパクのための担体として天然膜タンパクの使用であった。一般にバクテリア表面上にタンパクを固定する方法を開発しようとする試みの大部分は、得られるハイブリッドもやはり表面に局在化されるであろうとの希望をもって、所望の組換えポリペプチドを通常細胞外側へ露出している天然タンパクへ融合することに集中していた。しかしながら大部分の場合、異質タンパクは局在化を妨害し、そのため融合タンパクは細胞表面へ到達できない。これらの融合は正確でない細胞位置で終わるか、または周辺質に面する分泌タンパクドメインと膜中でアンカーされるかである。Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：２７３６（１９９０）Ｆｒａｎｃｉｓｃｏｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：２７１３（１９９２）は外側膜の外側に露出したＣ末端を残したｏｍｐＡから得られた配列へ融合したｌｐｐＮ−末端標的配列によりなる表面発現ビヒクルの構築を報告した。これらの融合はβ−ラクタマーゼ、一本鎖Ｆｖ抗体およびセルロース結合タンパクを含む多数の異質タンパクをＥ．ｃｏｌｉへ輸出することが報告されている。ＷＯ９３／１０２１４参照。加えて、Ｆｕｓｃｈｓ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９（１９９１）は、Ｅ．ｃｏｌｉペプチドグリカン関連リボタンパク（ｐａｌ）とリゾチーム結合一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントの間の融合はバクテリアの表面で検出できたと報告した。しかしなからこれらの系においては、ディスプレーされたタンパクは細胞へ付着しており、そのため精製したタンパクを単離するためにはそのタンパクをコードするＤＮＡを他の系へサブクローンしなければならない。抗原および抗体を含む組換えタンパクをフィラメント状バクテリオファージの表面にディスプレーするためのシステムが開発された。ＷＯ９２／０１０４７を見よ。これらシステムにおいては、組換えタンパクは遺伝子III（マイナーコートタンパク）が遺伝子VIII（主コートタンパク）によって発現されるファージコートタンパクへ融合される。ディスプレーファージは組換えタンパクの結合タンパクによって選択的にエンリッチされることができる。加えて、ファージは組換えタンパク／遺伝子III融合の発現のためのベクターを担持し、ディスプレーファージの伝播を許容する。この系の一利益は、Ｆａｂまたは一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントのような種々のタンパクの大きなライブラリをファージ上にディスプレーでき、そしてその結合特性に基いて選定できることである。一つの不利益はそのファージによってディスプレーされる異型タンパク分子の数が低く、そのため選定プロセスを複雑化することである。ファージ系についての他の不利益は、現在のバクテリア系と同様に、エンリッチないし富化プロセスがかなりの量の結合タンパク、例えば抗原を必要とし、低い結合親和性を有する組換えタンパク、例えば一本鎖抗体の単離を発生し得る選定および再増幅の反復ラウンドを含むことである。バクテリアディスプレーおよびファージディスプレーを組合せるディスプレー系は未だ開発されていない。そのような系は非常に望ましいであろう。結合タンパクの富化および精製の必要性をなくすディスプレーおよび選定方法を持つことが望ましいであろう。本発明の概要本発明はピリンタンパクもしくはその一部分と異型ポリペプチド（標的タンパク）を含んでいる融合タンパクに関する。好ましい具体例において、本発明は毛を形成することができるバクテリア宿主細胞の外表面上に標的タンパクをディスプレーする方法に関する。いくつかの具体例において毛はバクテリオファージ付着および感染のためのレセプターであることが望ましい。Ｆ毛が好ましい。融合タンパクは、融合タンパクの分泌を仲介することができるリーダーアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメント、ピリンサブユニットをコードするＤＮＡセグメント例えばｔｒａＡ遺伝子生産物、および標的タンパクをコードするＤＮＡセグメントを有するキメラＤＮＡから発現される。加えて、高い親和性結合タンパクをディスプレーするファージは低親和性結合タンパクをディスプレーするファージよりも高い速度で感染し、複製する。このことは、これらのファージはディスプレーバクテリアの培養物中での継続成育と共に選択的に富化されるため、潜在的な結合タンパクのライブラリーをディスプレーするファージが選択的に富化されることを許容する。特異的結合ペアのメンバーをコードするＤＮＡをその後ディスプレーバクテリア宿主から単離することができる。ここで使用するように、バクテリアファージは融合タンパクをコードするファージミドヘクターを担持するＥ．ｃｏｌｉ宿主から救出したファージを含む。そのようなファージはディスプレーバクテリアを感染させることができるけれども、それらは必要なファージ遺伝子を欠いているため再感染のための粒子を生産することができず、そのため再感染を望む方法には使用することができない。一具体例において、特異性結合ペアのメンバーをコードするＤＮＡは、例えば変異化株の使用によって変異され、そして本発明方法は変えられた親和性、例えば増加した親和性を有する特異性結合ペアのメンバーを選定するために使用される。他の具体例においては、化合物が特異性結合ペア相互作用に影響する、例えば阻害または増強するそれらの能力についてテストされることができる。本発明において有用な標的タンパクは、ペプチド、タンパク例えばホルモン、酵素、阻害剤およびレセプター、抗原、抗体フラグメントを含む抗体、一本鎖抗体および特異性結合ペアのメンバーを含む。代わりに、標的タンパクはそのようなタンパクの誘導体または類縁体でもよい。特異性結合ペアはペアの一方が他の分子へ結合する区域を有する天然に得られる、もしくは合成によって製造した任意の一対の分子を含む。そのような特異性結合ペアの例は、抗原と抗体、ホルモンとホルモンリセプター、リセプターとリガンド、酵素と基質およびＩｇＧとタンパクＡを含む。本発明のタンパクディスプレー方法の他の用途は、例えばエピトープマッピング、抗体ライブラリーのスクリーニング、および生バクテリアワクチンを含む。図面の簡単な説明図１は、ｔｒａＡ発現ベクターｐＰＲ３５の特徴を示す図である。図２は、ｐＰＲ３５の構造を説明する。図３は、ＰＣＲ増幅およびベクター構築に使用されるオリゴヌクレオチド（配列ＩＤＮｏ．１−１６）を説明する。図４は、ｐＰＲ３５ｔｒａＡ融合タンパクのヌクレオチド（配列ＩＤＮｏ．１７）およびアミノ酸配列（配列ＩＤＮｏ．１８）を説明する。図５は、ｐＧＨ２１の構造を説明する。図６は、コロニー免疫ブロッティングによるバクテリア宿主細胞表面上の抗原の検出を示す。図７は、細胞表面上の抗原標識発現を示すグラフである。図８は、細胞表面上の組換え抗体発現う示すグラフである。図９は、細胞表面の抗ＣＫ−ＭＢ活性の検出を示すコロニーブロックである。図１０は、ｆｄ遺伝子IIIタンパク構造機能分析を示す。図１１は、バクテリアファージ／ピリン相互作用系を図示する。図１２は、組換えタンパク／遺伝子IIIｐΔＢＳ融区域を示す。図１３は、π−タンパク遺伝子IIIｐΔＢＳディスプレーファージミド構成のためのスキームを示す。クローニングに使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。図１４は、π−タンパク／遺伝子IIIｐΔＢＳディスプレーファージベクターの構造を示す。図１５は、部分的に精製したＴＡ−１ｓｃＦｖ／ＥＥ標識／ｔｒａＡ融合タンパクのウエスタンブロック分析を示す。ＸＬ１−Ｂ／ｐＧＨ２１細胞（１Ｌ）を発育させ、そしてＴＡ−１／ＥＥ標識／ｔｒａＡ融合タンパク発現を実施例２のようにＩＰＴＧで誘発した。バクテリアピリンタンパクを、Ｍｏｏｒｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｌｏｇｙ，１４６（１）：２５１−２５９（１９８１）に記載されているように、細胞から毛を剪断し、ＰＥＧ沈澱することにより部分精製した。誘発した細胞（細胞溶解質レーン）中および部分精製したタンパク（ＰＥＧ沈澱レーン）はプローブとして抗ＥＥ標識ｍＡｂ−ＨＲＰを使用してウエスタン分析によって検査された。ＴＡ−１／ＥＥ標識／ｔｒａＡ融合タンパクに相当するバンドが示された。積み重ねゲルのトップにある免疫反応性質は分解ゲル中へ入らない凝塊した融合タイパクである。本発明の詳細な説明Ｆ毛はＦプラスミドを担持する細胞表面上に見られるフィラメントである。それらはバクテリア接合の間適切な結合ペアを確立するために必須であり（Ｉｐｐｅｎ−ＩｈｌｅｒａｎｄＭｉｎｋｅｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：５９３−６２４（１９８６）を見よ）、そして３つのクラスのバクテリアファージＲ１７，ＱＢおよびｆｄの結合部位である。Ｐａｒａｎｃｈｙｃｈ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ．８５−１１１（１９７５）参照。毛のトップは受容体細胞（結合ペア生成）または他のドナー細胞（表面排除）の認識に関与するものと考えられており、そしてフィラメント状ファージｆｄの結合部位である。毛の側部はＲ１７およびＱＢに代表される球状ファージの二つのタイプの結合部位である。Ｆ毛の合成はＦプラスミド上の転送区域によってコードされる１３以上の遺伝子産物を必要とする。Ｉｐｐｅｎ−ＩｈｌｅｒａｎｄＭｉｎｋｌｅｙ前出参照。Ｆ毛はｔｒａＡ遺伝子によってコードされる７，２００ダルトンの単一サブユニットより構成される。当初のｔｒａＡ遺伝子産物は５１個アミノ酸リーダー配列を含んでいるプロピリン（１３，２００ダルトン）である。ピリンサブユニットはアミノ末端でアセチル化され、そしてｔｒａＧはこのプロセスに関与すると考えられている。Ｉｐｐｅｎ−ＩｈｌｅｒａｎｄＭｉｎｋｅｙ前出およびＷｉｌｌｅｔｔｓａｎｄＳｋｕｒｒａｙ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２：１１１０−１１３３（１９８７）。Ｆ様プラスミドは血清学的に（ＬａｗｎａｎｄＭｅｙｎｅｌｌＪ．Ｈｙｇ．，６８：６８３−６９４（１９７８）：Ｍｙｎｅｌｌ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＰｉｌｉ，ｐｐ．２０７−２３４（１９７８））により、ファージ感受性パターンまたは表面排除により（ＷｉｌｌｅｔｔｓａｎｄＭａｕｌｅ，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．４７：１−１１（１９８６））区別することができる毛の既知の４タイプをコードする。これらの毛は受容細胞表面上の異なるレセプターを認識するものと考えられている。Ｈａｖｅｋｅｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１５５：１８５−１８９（１９７７）。４タイプからの典型的ピリン遺伝子が配列化され（Ｆｒｏｓｔ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６４：１２３８−１２４７（１９８５））、そしてタンパク配列の変化はアミノ末端に見られ（Ｆｉｎｌａｙ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：３３１−３３５（１９８５））、カルボキシ末端はそのタンパクの抗原性に影響する（Ｆｒｏｓｔ，ｅｔａｌ．前出）。４タイプの毛はＦ特異性ファージへ結合するそれらの能力において異なり（Ｍｅｙｎｅｌｌ前出）、これはピリン配列の違いを反影する。しかしながらアミノ末端は、異なるアミノ末端もｆｄファージへ等しく結合するので（Ｆｒｏｓｔ，ｅｔａｌ．前出およびＦｉｎｌａｙ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：９９０−９９８（１９８６））、ファージ結合に関与しないように見える。ファージ結合に多分影響する配列の変化はタイプIVピリン（Ｒ１００−１プラスミドによって代表される）中の残基１１と１４において、そしてタイプIIIピリン（Ｒ１−１９プラスミドによって代表される）中のカルボキシ末端において起こる。ポリクローナル抗血清（Ｗｏｒｏｂｅｃ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：６６０−６６５（１９８６））およびモノクローナル抗血清（Ｆｒｏｓｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１９２−１９８（１９８６））による研究は、アミノ末端の主要エピトープが毛の端部において先端特異的態様に露出していることを示した。ピリンタンパクのカルボキシ末端に含まれるマイナーエピトープは毛の側部に露出している。本発明方法はバクテリア宿主細胞の外表面上の異型ポリペプチド（標的タンパク）をディスプレーに関する。この方法は、ピリンタンパクまたはその一部分と毛を形成し得るバクテリア宿主細胞中の標的タンパクを含んでいる融合タンパクの発現よりなる。融合タンパクは、融合タンパクの分泌を仲介することができるリーダーアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメントと、ピリンタンパクをコードするＤＮＡセグメントと、そして標的タンパクをコードするＤＮＡセグメントを有するキメラＤＮＡから発現され、これらＤＮＡセグメントは宿主細胞からその表面上に標的タンパクを発現するように作動的に連結される。毛を形成し得る任意のバクテリア株がキメラＤＮＡの発現のためのバクテリア宿主細胞として使用できる。ＦまたはＦ様毛を生成し得る株が好ましい。そのような株はＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｐｐｅｎ−Ｉｈｌｅｒｅｔａｌ．），Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍ〔Ａｒｔｚ．Ｓ．Ｈｏｌｚｓｃｈｕ，Ｄ．Ｂｌｕｍ，Ｐ．，ａｎｄＳｈａｎｄ，Ｒ．（１９８３）Ｇｅｎｅ２６，１４７−１５８〕および他のＦ様プラスミドを担持する他のグラム陰性バクテリアを含む。特に好ましいＥ．ｃｏｌｉ株はＸＬ１Ｂ（Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｗ．Ｏ．ｅｔａｌ．（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ５，３７６−３７８）およびＤ１＋５αＦ’（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，Ｄ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７，３４６９−３４７８）を含む。いくつかの具体例においては毛を過発現するＥ．ｃｏｌｉ株が好ましい。そのような株は例えば抑制されたＦ様プラスミドｐＥＤ２０８を担持するもの（ＦｒｏｓｔＬ．Ｓ．ｅｔａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４，１２３８−１２４７）を含む。キメラＤＮＡの第１の成分は融合タンパクの分泌を仲介する、すなわち融合タンパクを外膜表面へ指向させることができるリーダーアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメントである。そのような配列は、例えば、ｔｒａＡリーダー配列、ｐｈｏＡリーダーまたはｐｅｌＢリーダーを含む。ｔｒａＡリーダー配列が好ましい。ｔｒａＡリーダー配列はＦプラスミド鋳型からＰＣＲ増幅によって得ることができる。Ｆプラスミドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂのようなバクテリア細胞から入手し得る。典型的なｔｒａＡリーダー配列が図４に記載されている。キメラＤＮＡの第２の成分は細胞表面上に標的タンパクをジィスプレーできるピリンタンパクサブユニットもしくはその一部分である。変異分析はアミノ酸１８ないし６８間のピリンサブユニットの区域は毛アセンブリに必要なエレメントを含んでいることを示唆する。Ｆｒｏｓｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１３：１３４−１３９（１９８８）。ｔｒａＡ遺伝子産物が好ましい。Ｆ−ピリン水治法プロフィルは、その分子は４ドメインより組織されることを示唆する。Ｐａｉｖａ，Ｗ．Ｄ．ｅｔａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２６１９１−２６１９７。Ｎ末端ドメインに存在するアミノ酸の数およびタイプの変動性が異なるＦ様ピリンタンパク中に観察され（Ｆｒｏｓｔ，Ｌ．Ｓ．ｅｔａｌ．前出）、この領域は毛アセンブリおよび細胞表面上のディスプレーに除外できることを示唆する。ＴｒａＡ遺伝子がクローンされ、ＦおよびＣｏｌＢ２（グループII）、Ｒ１−１９（グループIII），Ｒ１００−１（グループIV）およびｐＥＤ２０８（グループＶ）を含む多数の関連するＦ様プラスミドから配列化されている。Ｆｉｎｌａｙ，Ｂ．Ｂ．ｅｔａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．１６０：４０２−４０７；Ｆｒｏｓｔ．Ｌ．Ｓ．ｅｔａｌ（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６０：３９５−４０１；Ｆｒｏｓｔ，Ｌ．Ｓ．ｅｔａｌ．（１９８５）；Ｆｉｎｌａｙ，Ｂ．Ｂ．ｅｔａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：９９０−９９８。これら遺伝子は相互に高い相同性を示し、そして異なるＦ様プラスミドを担持する細胞によって混合毛の生成によって強調されるように、形態的および機能的に類似の構造よりなるピリンタンパクをコードする。Ｌａｗｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔａｌ（１９７１）Ａｎｎ．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＰａｓｔｅｕｒｌ２０：３−８。種々のｔｒａＡ遺伝子の配列が入手し得るので、ｔｒａＡ遺伝子産物をコードするＤＮＡは、例えばＦプラスミド鋳型からのＰＣＲ増幅を含む多数のソースから容易に単離することができる。ＰＣＲ増幅の詳細については実施例１を見よ。典型的なＦプラスミドｔｒａＡ遺伝子配列は図４に記載されている。キメラＤＮＡの第３成分によってコードされる標的タンパクは、ペプチド、タンパク例えばホルモン、酵素、阻害剤、レセプター、抗原、抗体フラグメント（例えばＦａｂ，Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂）を含む抗体、１本鎖抗体、および特異性結合ペアのメンバーを含むことができる。代わりに、標的タンパクはそのようなタンパクのどれかの誘導体または類縁体でもよい。特異性結合ペアは天然誘導または合成的に製造した分子の任意のペアを含む。そのような特異結合ペアの例は、例えば抗原と抗体、ホルモンとホルモンレセプター、レセプターとリガンド、酵素と基質、およびＩｇＧとタンパクＡを含む。多数の標的タンパクのヌクレオチド配列は多数のコンピューターデーターベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬおよびスイスＰｒｏｔを通じて容易に入手し得る。これら情報を使用して、所望の標的タンパクをコードするＤＮＡ配列を化学的に合成することができ、またはそのようなＤＮＡ配列はこの分野で日常的な操作、例えはＰＣＲ増幅を使用して得ることができる。ＤＮＡ配列は、融合タンパクの発現が細胞表面上の標的タンパクのディスプレーを招来し、“ディスプレーバクテリア”と称されるものを形成するように位置決めされる。標的タンパクは、細胞表面上に標的タンパクをディスプレーできるピリンタンパクの任意の部分へ融合することができる。ピリンタンパクのアミノ末端領域への融合が好ましい。細胞表面上の標的タンパクの成功的ディスプレーは多数の方法を使用して検出することができ、例えばもし標的ペプチドが膜を通って作用しない操作によって特異的に標識できるならばその細胞表面ディスプレーを容易に示すことができる。これはラクトペルオキシダーゼの存在下チロシル残基のヨード化（¹²⁵Ｉ）によって実施することができる。Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２４：９２１−９２７（１９７１）；ＫｉｎｇａｎｄＳｗａｎｓｏｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：５７５−５８４（１９７８）加えて、標的タンパクが外部からインタクトな細胞へ加えたプロテアーゼへアクセスできるかどうかを検査することができる。プロテアーゼの作用はＳＤＳ− ＰＡＧＥにポリペプチドの***を見ることにより、またはポリペプチドの他の性質が影響されたかどうか（酵素活性、抗原性等）を調べることによってモニターすることができる。もし標的タンパクが酵素活性を示すならば、そのような活性を細胞表面ディスプレーの標示に使用することができる。これはもし外側膜を横切ることができない基質が入手できれば可能である。ニトロセフィンはβ−ラクタマーゼに対するそのような基質である。Ｏ ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１：９６３−９６９（１９７２）；ＫｏｒｎａｃｋｅｒａｎｄＰｕｇｓｌｅｙ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４（７）：１１０１−１１０９（１９９０）。外側膜がハイブリッドタンパクが発現された時基質に対し真に不透過性であることを確かめることが重要である。標的タンパクに対する抗体も使用することができる。しかしながらこれらの方法は制限がある。第１に融合タンパクは標的タンパクが使用した抗体によって検出されないコンホメーション中に拘束され得る。Ｃｈａｒｂｉｔｅｔａｌ．，Ｅｍｂｏ．Ｊ．，５：３０２９−３０３７（１９８６）；Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１９０５３−１９０５９（１９８８）。第２に、もし抗体が標的内の短いペプチド（例えば１０残基以内に含まれるエピトープ）へ標的されれば、結果はこのエピトープ上の情報を与えるのみであり、そのため陽性の結果はこの短いペプチドが露出していることのみを指示し、他方陰性の結果は標的タンパクの何らかの他の部分は露出していないことを意味しない、該エピトープ部分にはアクセスできないことを指示し得る。バクテリアへの抗体の結合は多数の異なる技術で調べることができる。そのような方法は、バクテリア凝集、免疫蛍光、インタクト細胞でのＥＬＩＳＡ，インタクトセルでのＲＩＡ，免疫電子顕微鏡術，および補体の標的作用を含む。Ｍ．Ｈｏｆｍｕｎｇ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，３４：７７（１９９１）を見よ。キメラＤＮＡは宿主細胞染色体中に集積するか、またはベクター内に担持させることができる。ＤＮＡを宿主細胞内に集積するための方法は良く知られており、そして例えば均質組換を含む。Ｗｉｎｏｎａ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６１：２１９−２２１（１９８５）を見よ。キメラＤＮＡは組換えベクター例えばプラスミド中に担持させることができる。組換えベクターが好ましい。本発明の組換えベクターはベクター骨格とキメラＤＮＡを含む。組換えベクターはキメラＤＮＡへ作動的に連結した誘発し得るプロモーターを含むことができる。プロモーターはこの分野では良く知られ、融合タンパクの発現のためにどんな細胞タイプを使用すべきかに応じて容易に選ぶことができる。リーダーをコードするＤＮＡセグメントは好ましくはプロモーター配列の下流に配置される。ｔｒａＡリーダーが好ましい。標的ペプチドをコードするＤＮＡセグメントはリーダー配列の下流に配置される。ｔｒａＡ遺伝子産物をコードするＤＮＡセグメントは好ましくは標的ペプチドをコードするＤＮＡの下流に配置される。ベクター骨格として有用なプラスミドは、宿主細胞と共存し得る種から得たレペリコンおよび制御配列を含んでいるプラスミドを含む。例えは、もしＥ．ｃｏｌｉを宿主細胞として使用すれは、ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１８またはｐＢＲ３２２のようなプラスミドを使用し得る。ＤＮＡセグメント間に標的タンパクをコードするＤＮＡの挿入またはＤＮＡライブラリの挿入を許容するように組入れたクローニング部位を持ったｔｒａＡＤＮＡセグメントとｔｒａＡリーダーＤＮＡよりなるベクターを構成することができる。このベクターは誘発し得るプロモーターおよびマーカー遺伝子、例えば抗生物質抵抗性を含むことができる。本発明の好ましい組換えベクターはプラスミドｐＰＲ３５である。このプラスミドはｔｒａＡリーダーＤＮＡセグメントと、そしてｐＵＣ１９の誘発し得るｌａｃＺプロモーターの下流のｔｒａＡＤＮＡセグメントを含んでいる。Ｎｃｏｌ，ＳｆｉｌおよびＮｏｔｌのためのクローニング部位がｔｒａＡリーダーおよびｔｒａＡタンパク配列の間に組込まれ、標的ペプチドをコードするＤＮＡセグメントの挿入を許容する。加えて、ＥＥ標識抗原をコードするＤＮＡ配列がｔｒａＡリーダーおよびｔｒａＡタンパク配列の間に配置され、融合タンパクの検出および発現ディスプレー系の特徴化を許容する。宿主細胞へキメラＤＮＡの導入は当業者に既知の任意の方法によって実施し得る。例えば、ＤＮＡが組換えベクターに担持されていれば、ベクターは例えばトランスフォーメーション、エレクトロポレーション、ファージトラスフェクション等によって導入することができる。上に述べた検出技術は本発明の方法が稼働すること、すなわち融合ピリンタンパクが発現され、バクテリア細胞表面へ輸送され、そして標的タンパクがアクセスし得る、すなわちディスプレーされるように配向されることを検証するために当初に使用することができる。標的ディスプレーする細胞は、例えばアフィニティー分離技術を使用してディスプレーしないものから分離することができる。そのような技術はアフィニティーカラムクロマトグラフィー、アフィニティーマトリックス材料からのバッチ溶出、および蛍光活性化細胞選別を含む。本発明によって製造されるバクテリアディスプレーライブラリは、丁度ファージと同じようにアフィニティークロマトグラフィーによって分離することができる。バクテリア細胞はもっと大きいので、カラム中の詰まりおよびバクテリアの非特異性保持を防止するようにローディング中注意しなければならない。その後細胞はカラムを通って遊離抗原を通すことにより、または低ｐＨによって溶出することができる。グラム陰性バクテリアはファージのように低ｐＨに対して抵抗性ではないけれども、ｐＨ３．３において少なくとも１０分間は細胞生存の意味ある減少はない。Ｍａｒｔｉｎｅｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１７０（１９９１）。このため低ｐＨによる溶出および急速中和を強い結合クローンの単離のために使用できる。所望の標的タイプをディスプレーする宿主細胞（ディスプレーバクテリア）は、その後さらに培養し、そして融合タンパクを得るために使用し得る。もし望むならば、標的タンパクをピリンタンパクから分離し、当業者には良く知られたピリン精製技術を使用してさらに精製することができる。Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６（１）：２５１−２５９（１９８１）一旦所望の標的タンパクがディスプレーされれば、異型ポリペプチドをコードするＤＮＡを例えば変異剤の使用によって変異させることができ、そして一つ以上の標的へ結合するペプチドを同定し、選定するためのアフィニティー分離技術を使用することができる。本発明のディスプレー方法は組換えタンパクの検出および特徴化のために使用することができる。例えば、この方法は以下の未特徴化エピトープをマップするために使用することができる。（１）ランダムペプチドまたは（２）関心ある免疫反応性タンパクから得られたペプチドのライブラリーをコードする配列は本発明のｔｒａＡ発現ベクター，例えばｐＰＲ３５にクローニングすることができる。Ｆ毛を形成することができるＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（例えばＸＬ１Ｂ）は次にこのベクターバンクで形質転換され、そしてペプチドライブラリーｔｒａＡ融合タンパクはバクテリア細胞表面上にディスプレーされる。固相基質例えばナイロン膜上で成育後、得られたバクテリアは標識した抗体と反応する融合タンパクの発現についてスクリーニングされる。反応性コロニーを次に取り出し、ベクターを単離することができる。ＤＮＡインサートの配列分析はとのクローンしたペプチド配列が抗体によって認識されたエピトープへ対応したかを明らかにするであろう。本発明のディスプレー方法は、組換えタンパク活性、例えば抗体の検出にも使用することができる。例えば、この方法は組換え抗体−ｔｒａＡ融合タンパクのライブラリーをスクリーニングするために容易に適用できる。これらのライブラリーはヘビーおよびライト可変領域遺伝子の組合せ１本鎖遺伝子バンクか、または特異性組換え抗体遺伝子の変異ライブラリーを含むことができる。（Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ＆Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｄ．（１９９１），Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＡＣｏｍｐａｎｉｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２：９７−１０５）。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タンパクが生物学的に活性なコンホメーションに重ねられたことを指示する実施例６および７に述べた結果を基にして、この方法はバクテリア細胞コロニーの表面上にディスプレーされた組換えタンパク活性の検出に一般的適用がある。検出すべき活性は結合活性、触媒活性、阻害活性および変化した構造コンホメーションを含むことができよう。本発明は一次クローニングシステムとして使用することもできる。例えばｃＤＮＡライブラリーを構築することができ、そして本発明のベクター中に挿入し、ライブラリーをリガンドを結合する能力についてスクリーンすることができる。このリガンド／結合分子組合せは相互に特異結合する能力を有する分子の任意のペア、例えばリセプター／リガンド、酵素／基質（もしくは類縁体）、核酸結合タンパク／核酸等を含むことができる。もし相補的ペアの一方が入手し得るならば、これはペアの他方のクローンを単離するための好ましい方法となり得る。上に論じたように、バクテリア表面上のそれらのタンパクのディスプレーについてクローンした遺伝子の集団の多様性を増すこと、または個々のヌクレオチド配列を変異することがしばしば必要であろう。どちらの目的にもインビトロまたはインビボ変異技術を使用することができ、当業者には良く知られている。代わりに変性剤株を使用することができる。変異剤株はその親ＤＮＡに関し変異すべきその中に複製されたＤＮＡを生ずる遺伝子欠陥を含んでいる株である。そのような株はＥＳ１５７８のようなｍｕｔＤ５変異を担持しているものを含む。それ故もし遺伝子の集団がこれらの株に導入されれば、それはさらに多様化され、そして所望によりディスプレーおよび選択のため非変異剤株へ移すことができる。Ｆ毛はＲＮＡバクテリアファージおよびフィラメント状ＤＮＡファージのためのレセプターとして作用するので、本発明のディスプレー方法はファージゲノムをファージによって認識されるタンパクをディスプレーする特定のバクテリア細胞へ標的するためのファージ上の結合タンパクを使用することができる。例えば、ファージが細胞内へ入ることを許容する毛／バクテリオファージ相互作用を持つ代わりに、バクテリオファージが毛と相互作用しそのため細胞中へ入ることを許容するため抗原／抗体相互作用を使用することができる。フィラメント状ファージについては、遺伝子IIIの産物は結合タンパクとして作用し、毛タンパクのＮ末端近くの残基との相互作用によるものと信じられる。遺伝子IIIタンパクは、図１０に示すように、ファージコート中へ組込みに含まれる特異性ドメイン、ファージ形態、バクテリア毛との相互作用、およびバクテリア細胞内へ侵入によって形成される。フィラメント状バクテリオファージに加え、ＱＢ，ＮＳ２，ｆ２およびＲ１７のようなＲＮＡバクテリアファージはＦ毛と特異的に相互作用し、そして細胞を感染する。毛へ吸収する能力はビリオンあたり１コピーで存在する変異タンパクＡ（またはＱβについてＡ₂）によって与えられる。Ｐａｒａｎｃｈｙｃｈ，Ｗ．（１９７５）ＲＮＡＰｈａｇｅｓ，ｅｄ．Ｎ．Ｄ．Ｚｉｎｄｅｒ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．８５−１１２。フィラメント状バクテリオファージの遺伝子IIIタンパクと同様に、ＲＮＡファージ変異Ａタンパクを感染性に影響なく融合の形成に使用することができる。この方法により、特異的結合ペアの一方のタンパクがディスプレーされ、そしてバクテリア感染のための天然レセプターに代わるディスプレーバクテリアが生成される。バクテリアファージもまた、正常のピリン相互作用ドメインが特異的結合ペアの他のメンバーで置換されるように変換される。これはピリン結合ドメインをコードするファージ接合タンパク（例えばフィラメントファージの遺伝子 IIIタンパクまたはＲＮＡファージのＡタンパク）の領域の除去と、そしてその場所へ特異性結合ペアの他のメンバーをコードするＤＮＡの挿入によって達成される。キメラ遺伝子はファージゲノム中へまたは組換えファージミド発現ベクター中へ組込むことができる。該遺伝子は次に適当な株例えばＥ．ｃｏｌｉ中に発現され、そして融合タンパクおよび対応するファージ（またはファージミド）ゲノムはバクテリア粒子中にパッケージされる。ファージは次に標準条件下ディスプレーバクテリアと接触させられる。特異性結合ペアの一方のメンバーをディスプレーするファージは他方のメンバーをディスプレーされたタンパク間の相互作用に基いて認識し、そして感染する。ファージゲノムは次にディスプレーバクテリアにより内部化される。ファージゲノムで感染されたディスプレーバクテリアは例えばファージからディスプレーバクテリアヘ転移されたマーカー遺伝子例えば抗生物質耐性の同定によって選択される。特異性結合ペアのメンバーをコードするＤＮＡは次にディスプレーバクテリア宿主から単離することができる。例えばｆｄファージを使用し、ファージは正常ピリン相互作用ドメイン（例えば遺伝子タンパクIIIのアミノIII１０７から１９７）が除去され、ディスプレーバクテリア上にディスプレーされた標的タンパクへ特異的に結合するポリペプチドによって置換されるように変換される。このためディスプレーファージはディスプレーされた組換えタンパク間の相互作用だけに基いてディスプレーバクテリアを認識し感染する。図１１はこの系の一般的特徴を示す。ファージまたはファージミドゲノムは次に内部化されそして発現される。転写、ほん訳および複製のための制御信号が存在し得る。もしファージまたはファージミドゲノムは所望の標的細胞の選択に有用な配列を含むならばそれは特に有用である。有用な配列は、例えば標的細胞へ抗生物質耐性を与えるものである。本発明の方法に有用なバクテリアファージはピリンタンパクをレセプターとして利用するフィラメントファージおよびＲＮＡファージを含む。そのようなファージはＭＳ２，Ｑβ，Ｍ１３，ｆ１，ｆｄおよびｆｄ−ｔｅｔを含む。加えてそのようなフィラメントファージから得たファージイミド発現ベクターも使用できる。これらベクターはプラスミドおよび複製のファージ源および抗生物質耐性を与える遺伝子を含み得る。好ましいファージはｆｄ−ｔｅｔである（Ｚａｃｈｅｒ，Ａ．Ｎ．，Ｓｔｏｃｋ，Ｃ．Ａ．，ＧｏｌｄｅｎＪ．Ｗ．ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｄ．（１９８０）Ｇｅｎｅ９，１２７−１４０）好ましいファージミドはｐＢＣのようなｆ１ファージの誘導体である。この方法の例として、ＥＥ標識抗原がバクテリオファージ表面上に組換えタンパクがディスプレーれるのを許容するように発達させたファージミド発現ベクターを使用してｔｒａＡ融合としてバクテリア毛上にディスプレーされる。このシステムを使用し、抗ＥＥ標識ｓｃＦｖがピリン結合領域（アミノ酸１０７−１９７）を除去した遺伝子IIIタンパク（このタンパクを図１０に示した遺伝子IIIｐΔＢＳと呼ぶ）との融合物としてバクテリオファージ粒子表面上にディスプレーされる。抗ＥＥ標識抗体とＥＥ標識抗原間の相互作用はディスプレーファージのディスプレーバクテリアを感染する能力によって測定される。ディスプレーバクテリオファージを発生するそして感染を測定する特異性戦略は以下の実施例８に述べられている。他の組換えタンパクもバクテリオファージおよびバクテリア表面上にディスプレーし得る。これらはファージ上にディスプレーされたｓｃＦｖ遺伝子のライブラリーおよびディスプレーバクテリア上の特異性抗原ペプチドを含む。特異性ｓｃＦｖ抗原相互作用のスクリーニングは１）ｓｃＦｖディスプレーファージミド粒子の救出および２）ファージと抗原ディスプレーバクテリアとの混合およびマーカー例えば抗生物質（クロラムフェニコール）含有寒天プレート上の生育上による感性の存在のテストを含む。本発明方法は抗原精製またはエンリッチメントの多数ラウンドおよびファージ増幅ステップを必要としない。ファージまたはファージミドＤＮＡは得られた耐性コロニーから単離され、候補ｓｃＦｖ遺伝子を配列化し得る。バクテリオファージ系システムも組換えタンパクのディスプレーのために構築できる。例えば発現ベクターは正常遺伝子IIIを抗ＥＥ標識遺伝子IIIｐΔＢＳ融合遺伝子（図１３）で置換することによりｆｄ−ｔｅｔファージから構築できる。このシステムは特異性結合ペアに影響する化合物、例えば阻害剤または助因子をスクリーンするために使用することができる。実施例１細菌表面上タンパク質発現のためのｔｒａＡ融合タンパク質ベクターの構築細菌表面のピリンタンパク質のアミノ末端に融合させたポリペプチドの誘導可能な発現とディスプレーとを許容するために、システムを設計した。このシステムにおいては、関係ポリペプチドをコードする遺伝子がｔｒａＡベクター中にクローンされそしてＦ⁺細菌株において発現された。ｔｒａＡ発現ベクターは図１に示した特徴を有するマルチコピーｐＵＣ19ベクターに基づいている。ｔｒａＡリーダー及びｔｒａＡタンパク質（ピリン）ＤＮＡフラグメントはこの誘導可能なｐＵＣ19のｌａｃＺプロモーターの下流にクローンされた。ｔｒａＡリーダーは、ピリン融合タンパク質の正しい加工及びディスプレーを許容する。外来のＤＮＡ配列の挿入を許容するよう、ＮｃｏＩ，ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩのためのクローニング部位は、ｔｒａＡリーダーとピロンポリペプチド配列との間に導入した。加えて、融合タンパク質の検出と発現−ディスプレー系の特徴付けを許容するために、ＥＥタッグ抗原をコードするＤＮＡ配列を、ｔｒａＡリーダーとｔｒａＡタンパク質配列との間にクローンした。ｐＰＲ35ベクターを構築するに必要なステップは、図２に示されそして次に詳述されている。ｔｒａＡリーダー及びｔｒａＡタンパク質遺伝子フラグメントは、Ｆプラスミド鋳型からＰＣＲによって別々に増幅された。増幅に使用されたプライマーは、図２及び図３に示されている。典型的なＰＣＲ増幅反応（100μｌ）は、鋳型ＤＮＡとしてのＦプラスミドを担持する１０⁵の煮沸ＸＬ１Ｂ細菌細胞、１０ｐｍｏｌの適当なプライマー、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ、100 μＭのｄＮＴＰ，５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．３、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０１％のゼラチンを含んだ。鋳型は、９６℃にて５分間の初期インキュベーションによって変性させ、その間Ｔａｑポリメラーゼを、反応を熱開始させるために加えた。望みの産生物は、５５℃１分間、７０℃１分間及び９６℃１分間の１０回の熱サイクルによって増幅され、つづいて７０℃１分間及び９６℃１分間の２０ステップのサイクルを行った。プライマーによる増幅は、ＮｃｏＩの５’末端へのＥｃｏＲＩ部位の、及びｔｒａＡリーダーフラグメントの３’末端へのＢａｎＨＩ部位の、及び５’へのＫａｓＩ部位の、及びｔｒａＡタンパク質フラグメントの３’末端へのＸｂａＩ部位の付加をもたらした。５つの反応からのＰＣＲ産物をプールし、２倍液量のエタノール／０．３Ｍ酢酸ナトリウムで沈殿させ、得られた産物（約０．２μｇのＤＮＡ）を水に再懸濁した。ｔｒａＡリーダーＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ及びＢａｎＨＩで消化し、そしてｔｒａＡタンパク質ＰＣＲフラグメントはＢａｎＨＩ及びＸｂａＩで消化した。消化したフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分け、アガロースゲルからの溶出により精製した。これらのフラグメントをクローンするために、ＰＵＳ１８ＤＮＡをＫｓａＩで消化し、該部位をＫｌｅｎｏｗＤＮＡによってフィル・インし、鈍端でリゲーションすることにより、ｐＰＲ５とよぶベクターを作った。精製された消化されたＰＣＲ産物を次いでＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化したｐＰＲ５にリゲーションした。このリゲーション混合物により形質転換された細菌をこれら３つのフラグメントリゲーション上の産物について選別した。図２にしめされているように、このベクターはｐＰＲ２と呼ばれる。最後に、アニーリングされた、５’末端にＮｃｏＩ接着性末端及ひ３’末端にＫａｓＩ粘着性末端を有する２つの相補的オリゴヌクレオチドによって、ＥＥタッグリンカー配列が作られた。このアニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ＮｃｏＩ／ＫａｓＩ消化されたｐＰＲ２にリゲーションされてｔｒａＡ融合ベクター、ｐＰＲ３５を与えた。ｐＰＲ３５の配列は図４に示されている。実施例２一本鎖抗体遺伝子の単離及びｔｒａＡ融合ベクター中へのクローニングｔｒａＡ融合ベクターは、ＥＥ抗原のようなペプチド抗原並びに一本鎖抗体のような他の組換えタンパク質の両方を発現するように設計された。この実施例の目的のために、特定のモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖可変領域が柔軟なポリペプチドリンカーによって繋げられているものである、一本鎖抗体遺伝子が作られた。プロトロンビンポリペプチドＦ１．２に対するモノクローナル抗体（ＴＡ１）から、及びクレアチンキナーゼ−ＭＢ（α−ＣＫＭＢ）に対するモノクローナル抗体から、如何に記述されそして図５に概要がしめされているようにして、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）遺伝子が作られた。ＴＡ１−ＳｃＦｖについては、最初のステップは、製造業者の手順に従ってＦａｓｔ−ｔｒａｃｋＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによるＴＡ１ハイブリドーマ細胞からのポリ−Ａ単離を伴った。このＲＮＡ（単離されたｍＲＮＡの１／１０を用いた）は、製造業者の手順に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）及びオリゴｄＴ特異的プライミングを用いてｃＤＮＡへと変換された。ｃＤＮＡの２０μｌのうち２μ ｌをＰＣＲのための鋳型ＤＮＡとして使用した。ＴＡ１ｍＡＢのＨ鎖及びＬ鎖可変領域遺伝子を増幅するためのこのＰＣＲプライマーは、図２に示されているようにそれぞれＪＳ１３５／ＪＳ１３４及びＪＳ１３３／ＪＳ１５３である。ＰＣＲ緩衝液条件は、実施例１に示したのと^｜じである。鋳型は、最初に９６℃で５分間インキュベーションすることにより変性させ、その間Ｔａｇポリメラーゼが反応を熱開始させるために加えられた。このイムノグロブリンの可変領域遺伝子フラグメントは、４８℃１分間、７０℃１分間及び９６℃１分間の１０回の熱的サイクルによって増幅され、これに７０℃１分かン及び９６℃１分間の２５ステップのサイクルが続いた。望みの産物（約２６０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動により分け、アガロースゲルから溶離させることにより精製した。これらのフラグメントは次いで、Ｈ鎖の３’末端及びＬ鎖可変領域遺伝子の５’末端に４５塩基対のリンカー配列を取り付けるために、ＰＣＲにおけるＤＮＡ鋳型として使用され、該可変領域ポリペプチドに追加の柔軟な１５アミノ酸ペプチドリンカーをもたらした。リンカー取付けに用いたＰＣＲプライマーは、Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域フラグメントにつき、それぞれ、ＪＳ１３５／ＪＳ１３９及びＪＳ１３７／ＪＳ１５３である。ＰＣＲ条件は、４８℃１分間、７０℃１分間及び９６℃１分間の１０回の熱的サイクル及びこれに続く７０℃１分間及び９６℃１分間の２５ステップのサイクルであった。アガロースゲル電気泳動による分離に続き、望みの産物（約４００ｂｐ）をアガロースゲルからの溶離により精製した。Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域遺伝子フラグメントをリンクするために、先ずＨ鎖＋Ｌ鎖可変領域＋リンカー遺伝子フラグメントを５２℃１分間、７０℃１分間及び９６℃１分間のサイクルでアニーリングしそして延長することにより、配列重複延長ＰＣＲ（sequence-overlap extenshon PCR）を使用した。リンクされたフラグメントを次いで、ＪＳ１３５／ＪＳ１５３の添加及び７０℃１分、及び９６℃ １分の１５の追加のステップサイクルによって、増幅した。望みの産物（約７２０ｂｐ）を、上述のようにして精製した。最初に、ＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子フラグメントをＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで消化し、そしてＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで消化したｐＪＳ１０２クローニングベクター中にリゲーションした。それがＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子を含むことを検証するために、得られた構造を、配列決定した。次いでこのｐＪＳ１０２３／ＴＡ１ｓｃＦｖプラスミドを、Ｌ鎖可変遺伝子の３’末端にＮｃｏＩ部位を加えるためにＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子フラグメントをＰＣＲするための鋳型ＤＮＡとして使用した。使用したプライマーはＪＳ１３５／ＪＳ１５３であり、ＰＣＲ条件は、４８℃１分、７０℃１分及び９６℃１分の１０回の熱的サイクルに続き７０℃１分及び９６℃１分の２５ステップのサイクルであった。望みの産物（約７２０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動で分け、アガロースゲルからの溶離により精製した。このＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子フラグメントは、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化され、そしてＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化されたｐＰＲ３５ｔｒａＡ発現ベクター中にリゲーションされ、ＴＡ１ｓｃＦｖ／ＥＥタッグ／ｔｒａＡ融合ベクター、ｐＧＨ２１をつくり出した。Ｃｏｎａｎ α−ＣＫＭＢハイブリドーマ細胞株から可変領域遺伝子を単離するため及びα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ遺伝子を構築するために、同じ戦略を用いた。対応するＨ鎖及びＬ鎖ＰＣＲプライマーは、図３に示されている。配列重複発現ＰＣＲステップにより、α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ遺伝子フラグメントをＮｃｏＩ及びＳｐｅＩで消化しそしてＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで消化したｐＧＨ２１ｔｒａＡ発現ベクター中にリゲーションし、これにより本質的に、ＴＡ１ｓｃＦｖ遺伝子をα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ遺伝子と交換した。得られた構造はｐα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡと呼ばれる。実施例３ｔｒａＡ融合タンパク質の製造ｔｒａＡ発現系は、幾つかの仕方で特徴づけられた。第１にＴＡ１ｓｃＦｖ− ＥＥタッグ−ｔｒａＡ又はαＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合タンパク質の細菌での発現が、イムノブロット分析により試験された。ｐＧＨ２１及びｐα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡベクターが、Ｆプラスミドを担持するＸＬ１Ｂ細胞内へ形質転換された。正確な候補は、アルカリ性ＳＤＳミニプレップＤＮＡ制限分析により選別しそしてＤＮＡ配列決定により検証した。ｔｒａＡ融合タンパク質の発現を誘導するために、３ｍｌの２ｘＬＢ培地、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンに摂取するのに、６０μｌの終夜培養物を用いた。３６℃２時間のインキュベーションに続いて、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）が最終濃度２ｍＭで加えられた。３７℃にて４時間の後、培養物のＯＤ₆₀₀が測定されそして培養物の２ｍｌを５分間の微量遠心のための収穫した。細胞ペレットを−７０℃にて凍結し次いで冷ＴｘＴＢＳ（０．１％のＴｒｉｔｏｎＣ−１００，１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．４，０．１５ｍのＮａＣｌ）中に１０ＯＤ／ｍｌになるよう再懸濁させた。細胞を３乃至５分超音波処理し、細胞残滓を４℃にて１０，０００×ｇ１０分間の微量遠心で除去した。上澄（１０μｌ）をＳＤＳ／β−メルカプトエタノール負荷緩衝液と混合し、タンパク質を変性させるため５分間煮沸した。サンプルを１２．５％のポリアクリルアミドゲル上においてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分けた。ゲル中のこの材料を、半乾燥トランスブロット装置を用いてＰＶＤＦナイロン膜に移した。この膜を、２０ｍｌのブロック緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＮＰ −４０，０．５％脱脂粉乳）により４℃にて終夜ブロックし、そして、西洋ワサビペルオキシダーゼを接合した４３ｎｇ／ｍｌの抗ＥＥタッグモノクローナル抗体（抗ＥＥｔａｂモノクローナル抗体−ＨＲＰ）の２０ｍｌでプローブした。この抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰは、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって検出された。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タンパク質に対する信号は、予期した分子量である４０ｋＤに検出され、一方ＸＬ１Ｂ／ベクターのみからの溶解物はなんら信号を示さなかった。しかし、ＴＡ１ｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タンパク質は４６ｋＤに移動し、ＴＡ１ｓｃＦｖタンパク質はＳＤＳ− ＰＡゲルを通って予想よりも大きい分子量まで移動した。ＴＡ１ｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タンパク質はまた、増殖培地中にも検出され、これは、Ｆピリが細胞表面から脱落して培地中に見いだされ得ることに合致する。ＸＬ１−Ｂ／ｐＧＨ２１細胞（１Ｌ）は増殖し、そしてＴＡ１−１／ＥＥタッグ／ｔｒａＡ融合タンパク質発現は、実施例２に記述したようにしてＩＰＴＧによって誘導された。細菌の線毛ンタンパク質は、細胞から線毛を刈りＭｏｏｒ，ｅｔａｌ．，〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１４６（１）：２５１−２５９（１９８１）〕に記述されているようにＰＥＧ沈殿することにより精製された。誘導された細胞中（細胞溶解物レーン）に存在する融合タンパク質及び部分的に精製されたタンパク質（ＰＥＧｐｐｔレーン）を、抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰをプローブとして用てウエスタン分析により試験した。図１５を参照。ＴＡ−１／ＥＥタッグ／ｔｒａＡ融合タンパク質に対応するバンドが示されている。積重ねゲルの最上部にある免疫反応性の材料は、分離ゲル中に入らい凝集した融合タンパク質である。実施例４組換えタンパク質の検出のための改善された方法を開発するためにｔｒａＡ発現システムを用いた。抗原−ｔｒａＡ融合タンパク質が細菌細胞表面上にディスプレーされているか否かを試験するために、２つの簡単な検出方法を実施した。第１は、ナイロン膜上で増殖した細菌のコロニーをスクリーニングするための免疫検出法であった。ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合タンパク質を発現しているＸＬ１Ｂ株を、ナイロン膜上に播種し、膜を、ベクターとＸＬ１Ｂをそれぞれ選択するために５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ｘＬＢ寒天プレート上に置いた。ｔｒａＡ融合遺伝子発現の誘導のために、膜を予め１０ｍＭのＩＰＴＧで濡らした。３７℃にて終夜インキュベーションの後、膜をプレートから除去して冷イミダゾール緩衝食塩水（ＩＢＳ−４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０，０．１５ＭのＮａＣｌ）で３回洗浄した。膜を０．５％のミルク−ＰＢＳで、４℃にて１時間攪拌することによりブロックし、次いでＩＢＳ中４℃にて４３ｎｇ／ｍｌの抗ＥＥタッグ−ＨＲＰと１乃至２時間インキュベートした。４℃にてＩＢＳで５回洗浄した後、膜をＥＣＬ試薬と反応させそして免疫反応性の材料を検出した。このコロニーイムノブロット法により、抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰがＩＰＴＧ誘導されたＸＬ１Ｂ／ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡコロニーを認識したが、誘導されていないＸＬ１Ｂ／ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡコロニーは認識しなかった。対照ベクターを有するＸＬ１Ｂ細胞（ＥＥタッグ−ｔｒａＡ不含）は、いかなる信号をも与えなかった。細胞表面への抗ＥＥタッグモノクローナル抗体の結合の特異性もまた、該コロニー膜を、異なったペプチドのタッグ（ＫＴ３）に対する抗体とインキュベートすることにより決定された。これらの膜上には如何なる信号も検出されなかった。細菌コロニー免疫検出法もまた、エピトープマッピング分析に適用された。この方法を試験するために、ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ又は対照ベクター（ＥＥタッグ−ｔｒａＡ不含）を担持するＸＬ１Ｂ細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ｘＬＢ寒天プレート上で終夜増殖させた。コロニーをナイロン膜上にレプリカ播種し、１０ｍＭのＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ｘＬＢ寒天プレート上に置いた。３７℃での増殖の後、膜上のコロニーを抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰにより上記と同様にしてプローブした。ＩＰＴＧ誘導されたサンプルにおいては、図６に示したように、単一のコロニーについての明確な信号が検出された。対応するコロニーは、特徴付けのためにマスタープレートから採られ、ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡベクターを担持することが見いだされた。実施例５細菌表面に発現された抗原を検出するための全細胞ＥＬＩＳＡ細菌表面上の抗原−ｔｒａＡ融合タンパク質のアクセス可能性を試験する第２の方法は、無傷細胞によるＥＬＩＳＡ法であった。初期長期相まで増殖させた細胞をＩＰＴＧにより３７℃で４時間誘導した。細胞を収穫して1.0 ＯＤ₅₉₅に冷ＰＢＳに再懸濁させた。このステップは、培地中に存在する、該細胞に関連しない如何なるｔｒａＡ融合タンパク質をも除去するであろう。マイクロタイタープレートを、ウェルあたり１００μｌの細菌希釈液で被覆した。４℃で終夜インキュベーションの後、付着しなかった細胞は捨てられ、ウェルは１％の牛血清アルブミンを含有するＰＢＳで４℃にて１時間ブロックされた。このブロッキング・ステップに続いて、ウェルを１００μｌの０．３４μｇ／ｍｌの抗ＥＥタッグ抗体ＨＲＰと共にインキュベートした。ＰＢＳによる５回の洗浄の後、抗原−抗体複合体がＨＲＰ−ＥＬＩＳＡ基質によって現像された（Ｈ₂Ｏ₂，ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質）。反応値がＥＬＩＳＡリーダーによって記録された。ＯＤ₄₅₀ 読み取り値は、各ウェルに捕獲された抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰ活性を示し、そして細胞表面上に発現されたＥＥタッグ融合タンパク質の量に相関する。図７に示したように、誘導されたＸＬ１Ｂ／ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡサンプルは、無誘導のサンプル又はＸＬ１Ｂ／対照ベクター（ＥＥタッグ− ｔｒａＡ不含）サンプルの６倍高い読み取り値を示し、このことはこの方法が細胞表面上に存在する抗原を特異的に検出するのに適用できることを示している。該結合反応に既知量のペプチド抗原及び抗体をを加えることにより、この方法は、定量的抗体／抗原結合に使用できよう。加えて、該ペプチドは、抗体／抗原−ｔｒａＡ融合タンパク質相互作用に対する異なったペプチドの効果がが測定されるものである比較ＥＬＩＳＡアッセイ方式において特徴付けることができよう。実施例６細菌表面上にディスプレーされた組換え抗体の活性の検出のための全細胞ＥＬＩＳＡ実施例４及び５からの結果は、ｔｒａＡに融合させた抗原が細菌表面上にディスプレーされることができそして対応する抗体によって特異的に検出し得ることを示している。機能的組換えタンパク質が細菌表面上にディスプレーされ得るか否かを判断するために、同様の実験が以下に記述するように行われた。細菌細胞表面上にディスプレーされた組換え一本鎖抗ＣＫＭＢ抗体の活性を検出するために、無傷の細胞を用いたＥＬＩＳＡ法が行われた。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合ベクター又は対照ベクター（ＴＡ１−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合ベクター又は挿入体を有しないベクター）の何れかを担持した細胞を３７ ℃にて初期長期相まで増殖させた。その点において、融合タンパク質の発現が、０．２ｍＭのＩＰＴＧの３７℃４時間の添加によって誘導された。細胞が収穫されそして冷ＰＢＳ中に10.0ＯＤ₅₉₅／ｍｌに再懸濁された。マイクロタイタープレートが、被覆緩衝液（０．１Ｍのトリス塩酸、ｐＨ８．５）中の１００μｇ／ｍｌの抗ＣＫ−ＢＢモノクローナル抗体によって被覆され、そして４℃にて終夜インキュベーションされた。付着しなかった抗ＣＫ−ＢＢモノクローナル抗体は捨てられ、ウェルは洗浄緩衝液（０．１Ｍのトリス塩酸、ｐＨ７．４、１．０ＭのＮａＣｌ，０．１％ＮａＮ₃）で１回洗浄された。ウェルは、希釈緩衝液（０．０１Ｍトリス塩酸、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．３中、２％ゼラチン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１００μｌの０．３μｇ／ｍｌのＣＫ−ＭＧとともに、室温にて１時間攪拌しつつインキュベートされた。ウェルを濯ぎ緩衝液（０．０１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．３、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ＮａＮ₃）で１回洗浄した。１００μｌの細胞懸濁液を各ウェルに加え、プレートを室温にて１時間、攪拌しつつインキュベートした。付着しなかった細胞を捨て、ウェルを濯ぎ緩衝液で２回洗浄した。ウェルを希釈緩衝液中において１００μｌの０．３４μｇ／ｍｆの抗ＥＥタッグモノクローナル抗体−ＨＲＰ接合体と共に、室温で、攪拌しつつ１時間インキュベートした。ウェルを濯ぎ緩衝液で２回洗浄した後、ＨＲＰ−ＥＬＩＳＡ基質（Ｈ₂Ｏ₂、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質）を加え、２０分間現像させた。ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにて測定した発色の量は、ウェル中に検出されたｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合タンパク質に対応する。これらの値は、固定化されたＣＫ−ＭＧによって捕獲された細胞の表面にディスプレーされた抗ＣＫＭＢｓｃＦｖ活性の量に相関する。典型的な結果が図８に示されている。ＩＰＴＧ−誘導されたＸＬ１Ｂ／α−ＣＫＭＢｓｃＦｖタッグ−ｔｒａＡプラスミドサンプルは、ＣＫ−ＭＢを認識しない種々の組換え抗体を発現する無誘導のＸＬＩＢ／ＴＡＩ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ細胞に比して、捕獲されたα−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ −ｔｒａＡ融合タンパク質の２９倍高いレベルを示した。対照ベクターを担持するＸＬ１Ｂ細胞は、ＥＥタッグ−ｔｒａＡタンパク質を発現せず、このアッセイにおいて活性を示さなかった。これらの実験の結果は、融合タンパク質のα−ＣＫＭＢｓｃＦｖドメインが、生物学的に活性なコンフォメーションへと折り畳まれ、細胞の表面上にディスプレーされていることを示している。同じディスプレーされるタンパク質上の一本鎖抗体とＥＥ抗原タッグとのＴみ合わせは、ＥＬＩＳＡ方式の開発の多様性を許容する。本実施例において用いられたサンドイッチ捕獲ＥＬＩＳＡ方式は、これら多くの可能性の１つであるに過ぎない。実施例７コロニースクリーニングによる細菌表面の機能的一本鎖活性の検出この実施例は、細菌細胞コロニーの表面に発現された組換えタンパク質活性の成功裏の検出を実証する。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合ベクターを担持するＸＬ１Ｂ株及びＴＡ１−３３タッグ−ｔｒａＡ融合ベクターを担持する株が、ナイロン膜上に均一に播種された。膜を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ｘＬＢ寒天上に置き、３７℃にて、小さな細菌コロニーが出現するまでインキュベートした。このとき、マスター膜に新たな膜ヲ重ねることにより、レプリカ膜を作った。このレプリカ膜を次いで除去し、半分に切断した。一方の半分を、１０ｍＭのＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ｘＬＢ寒天プレート上でインキュベートし、そして他の半分を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンのみを含有する２ｘＬＢ寒天プレート上でインキュベートとした。３７℃にて終夜インキュベーションの後、ＩＰＴＧ誘導及び無誘導膜を除去してＩＢＳで３回洗浄した。２０ｍｌの０．５％ミルク−ＩＢＳによって、４℃にて攪拌しつつ１時間ブロックし、次いで、希釈緩衝液中で２０ｍｌの０．３μｇ／ｍＥのＣＫＭＢと共に４℃にて一時間インキュベートした。冷ＩＢＳによる３回の洗浄の後、膜を４ ℃にて１時間、そしてアルカリ性ホスファターゼに接合させた抗ＣＫ−ＢＢモノクローナル抗体によりブロックした。冷ＩＢＳによる５回の洗浄の後、膜をＬｕｍｉｐｈｏｓ５３（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈａｉｍ）と反応させた。免疫反応性の材料は、フルオログラフィーにより検出され、典型的な結果を図９に示してある。単一のコロニーに対応する強い明確な信号が、ＰＩＴＧ誘導サンプル中に検出された。これらのコロニーがマスタープレートから採取され、α −ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ＥＥタッグ−ｔｒａＡベクターを担持することが見いだされた。フィルム上の陰性信号に対応するコロニーは、対照ベクターを含んだ。この結果は、α−ＣＩＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タンパク質が細菌表面上にディスプレーされそして一本鎖抗体が生物学的に活性なコンフォメーションへと折り畳まれていることを示している。この方法は、組換え一本鎖抗体活性を検出するための容易且つ迅速な手順を提供する。それは直ちに、組換え抗体ｔｒａＡ融合タンパク質のスクリーニングライブラリーに適用できよう。これらのライブラリーは、Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域の組み合わせの一本鎖遺伝子バンク、又は特定の組換え抗体インキュベートの突然変異ライブラリーを含むことができる。α−ＣＫＭＢｓｃＦｖ−ｔｒａＡ融合タンパク質が生物学的に活性なコンフォメーションへと折り畳まれていることを示すこの結果に基づいて、この方法は、細菌細胞コロニー表面上に発現された組換えタンパク質活性の検出に一般的に適用できよう。検出される活性としては、結合活性、触媒活性、阻害活性及び変化した構造的コンフォメーションが含まれよう。実施例８バクテリオファージ／ピリン相互作用系バクテリオファージ粒子の表面上のｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タンパク質の発現及びディスプレーのために、ファージミド（phagemid）ベクターが設計された。該ファージミドベクターは、図１２に示した特徴を有するｐＢＣファージミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づく。このベクターは、プラスミド増殖のためのＣｏＩＥ１転写オリジン、ヘルパーファージによる同時感染後のファージミドＤＮＡの回収のためのｆ１線状ファージ複製オリジン、及び抗生物質による選択のためのクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を担持する。ｐｅ１Ｂリーダー及びｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳのＤＮＡフラグメントが、ｐＢＣの誘導可能ｌａｃＺプロモーターの下流にクローンされた。ｐｅ１Ｂリーダーは、適当な加工とバクテリオファージ上への融合タンパク質の配列を許容するために消化された。外来ＤＮＡ配列の挿入を許容するために、ＮｃｏＩ，ＳｆｉＩ，ＳｐｅＩ，及びＮｏｔＩについてのクローニング部位を、ｐｅ１Ｂリーダー及びｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ配列の間に導入した。該ステップは、このベクター（ＬＥ２という）の構築に関わるステップは図１２に示されている。抗ＥＥタッグｓｃＦｖ遺伝子が、実施例２に概説したようにして、モノクローナルハイブリドーマｍＲＮＡより単離されＬＥ２の、ＮｏｔＩ及ひＳｅｐＩ部位に挿入された。３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する培地中でこれらのベクターを増殖させるために、Ｆ’宿主株、ＤＨ５−αＦ’〔Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，Ｄ：Ｍ．ｅｔａｌ．（１９８９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７，３４６９−３４７８〕が使用された。ファージミド粒子を救出するために、ファージミド発現ベクターを担持したＤＨ５−αＦ’細胞を、テトラサイクリン耐性に関するｆＫＮ１６ファージＤＮＡで形質転換した。このｆＫＮ１６ファージ誘導体は、ｇｅｎｅＩＩＩの５０７ｂｐセグメントを除去することによって、テトラサイクリン耐性ファージ，ｆｄ− ｔｅｔより構築した（Ｎｅｌｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１０８：３３８−３５０（１９８１））。該ファージはｇｅｎｅＩＩＩ除去のために非感染性であるが、ファージミド発現ベクターの複製及びパッケージングに必要なヘルパーファージタンパク質を供給する。該ファージミド発現ベクターとｆＫＮ１６との両方を担持したＤＨ５−αＦ’細胞を、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１００ｍｌの２ｘＹＴ培地中で終夜増殖させた。細胞を遠心により除去し、培養培地中のファージ粒子を５％ＰＥＧ及び０．５ＭＮａＣｌにより沈殿させることにより濃縮した。得られたファージ粒子はｆＫＮ１６ファージ（ｔｅｔ^r）又はｇｅｌｅＩＩＩｐΔ ＢＳファージミドベクター（ｃｈｌ^r）の何れも担持している。欠損のあるｆＫＮ１６遺伝子タンパク質及ひ抗ＥＥタッグｓｃＦｖ−ｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タンパク質の両方が、バクテリオファージ表面上に配列される。救出されたファージは、ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合ベクターを担持したＸＬ−１Ｂ細胞を感染させるのに使用される。これらの細胞がその線毛上にＥＥタッグ抗原を発現することから、抗ＥＥタッグｓｃＦｖ−ｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タンパク質を配列したバクテリオファージは、ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合タンパク質と結合し、これらの細胞に感染して、ファージミド発現ベクターを担持したクロラムフェニコール耐性クローンをもたらす。バクテリオファージに基づく系はまた、組換えタンパク質の配列のために構築することもできる。発現ベクターは、図１４に概説したように、通常のｇｅｎｅＩＩＩを抗ＥＥタッグｓｃＦｖ−ｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タンパク質で置き換えることにより、ｆｄ−ｔｅｔファージから構築することができる。ＤＨ５− αＦ’細胞は、該ファージ発現ベクターによってテトラサイクリン耐性へと形質転換される。形質転換された細胞は、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１００ｍｌの２ｘＹＴ培地中で終夜インキュベートされる。細胞は、遠心によって除去されそして培養培地中のファージ粒子が、５％ＰＥＧ及び０．５ＭＮａＣｌによる沈殿によって濃縮されるであろう。得られるファージ粒子は、ｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳファージベクターを担持し、抗ＥＥタッグｓｃＦｖ−ｇｅｎｅＩＩＩｐΔＢＳ融合タンパク質をバクテリオファージ表面上に配列させているであろう。これらのファージ粒子は、ＥＥタッグ−ｔｒａＡ融合ベクターを担持したＤＨ５−αＦ’細胞を感染させるために使用されよう。次いで、ファージミド系に関して記述したようにして、寒天プレート上におけるテトラサイクリン耐性コロニー選択によって、感染性を試験することができる。代わりとして、該発現ファージが複製可能でありＥＥタッグを配列している細菌に再感染可能であることから、感染性は、この配列させた細菌の芝の上のプラーク形成によって、又はこの配列させた細菌の液体培地中におけるファージ増殖によって、特徴付けることができる。プラークサイズ又は液体培地中のファージタイターは、ファージの感染性及び増殖を受け持つ組換えタンパク質−タンパク質相互作用の強さの指標を提供する。換言すると、該配列ファージと該配列細菌との間の最も強い親和性の組換えタンパク質−タンパク質相互作用は、最も強い感染率を与える。感染の特異性もまた、ＥＥタッグ抗原を配列させない細胞を用いて試験することができる。この系は、ｓｃＦｖのような組換えタンパク質のライブラリーをスクリーニングするのに有用である。高親和性のｓｃＦｖを配列させるファージは、該抗原を配列させる細菌に、低親和性ｓｃＦｖを配列させるファージに比して一層高率で感染しその中で複製するであろう。こうして、高親和性のｓｃＦｖを配列させるファージは、培地中における連続培養によって選択的に濃厚化されるであろう。得られるファージＤＮＡは、単離され、そして候補ｓｃＦｖ遺伝子及びタンパク質が配列決定及び親和性分析によりさらに特徴付けられることが出来よう。ここに記述した実施例及び具体例が説明のみのためのものであり、それに照らし種々の修正又は変更が当業者に示唆されているということを理解しなければならない。 Detailed Description of the Invention How to display protein The present invention is generally directed to export and decoupling of polypeptides and proteins on the surface of bacteria. Display. Antigenically active proteins, specific binding proteins and enzymatic activities Methods for display, modification, selection and purification of proteins, including proteins A method of providing is provided.Background of the invention Expression of proteins on the surface of bacteria and bacteriophage is partially recombinant It has been pursued for several years because of the interest in antibody production. Genetically engineered whole cell adsorbent Production, peptide library construction, cell-binding enzymes, and antibody-producing live cells. There are numerous other possible applications, including the use of cutin or immunogens. WO92 See / 01047 and WO93 / 10214. In bacteria, one approach to obtaining surface-expressed foreign proteins is The use of natural membrane proteins as carriers for the quality proteins. Generally bacteria Most of the attempts to develop methods to immobilize proteins on the surface have been The desired hybrid with the hope that it will also be localized on the surface. Fusing a recombinant polypeptide to a naturally-occurring protein normally exposed to the outside of the cell Was concentrated on. However, in most cases, the foreign proteins interfere with localization and Therefore, the fusion protein cannot reach the cell surface. These fusions are not precise Cell position or facing the periplasm It is anchored in the membrane with the secretory protein domain. Murphy et al. J. Bacteriol. , 172: 2736 (1990) Francisco et al. Proc. Natl. Acad. Sci . , 89: 2713 (1992) left an exposed C-terminus on the outside of the outer membrane. A surface-expressing virus consisting of the lpp N-terminal target sequence fused to the sequence obtained from pA. Reported construction of Hickle. These fusions consist of β-lactamase, single chain Fv antibody and And a number of foreign proteins, including cellulose-binding proteins. export to E.coli Has been reported. See WO93 / 10214. In addition, Fuschs, et al. , Bio / Technology, 9: 1369 (1991), E. FIG. E. coli peptidoglycan-related riboprotein (pal) and lysozyme binding Reported that the fusion between the full-chain Fv antibody fragments could be detected on the bacterial surface Was. However, in these systems, the displayed protein is It is attached and therefore the isolated protein must be isolated in order to isolate the purified protein. The encoded DNA must be subcloned into another system. Recombinant proteins containing antigens and antibodies for filamentous bacteriophage A system for displaying on the surface was developed. WO92 / 01047 Look. In these systems, the recombinant protein is gene III (minor code). Protein) expressed by gene VIII (main coat protein) Is fused to the autoprotein. Display phage is a recombinant protein binding protein. It can be selectively enriched by Park. In addition, fur Di carries the vector for expression of the recombinant protein / gene III fusion and Allow the spread of pre-phage. One benefit of this system is Fab or single chain Fv Large libraries of various proteins, such as antibody fragments, are loaded onto phage. Display and selection based on its binding characteristics. One wrong The benefit is the low number of atypical protein molecules displayed by the phage, Therefore, the selection process is complicated. Other disadvantages of the phage system The benefit is that, as with current bacterial systems, the enrichment or enrichment process is significant. Recombinant proteins that require high amounts of binding protein, eg, antigen, and have low binding affinity Park, for example, iterative rounds of selection and reamplification that can occur to isolate single chain antibodies. It is to include. A display that combines a bacterial display and a phage display The system has not yet been developed. Such a system would be highly desirable. A display and selection method that eliminates the need for binding protein enrichment and purification. It would be desirable to haveOverview of the present invention The present invention relates to a pilin protein or a part thereof and an atypical polypeptide (target protein). ) Is included in the fusion protein. In a preferred embodiment, the invention provides hair Target protein on the outer surface of a bacterial host cell capable of forming Regarding how to play. In some embodiments, the hair is bacteriophage It is desirable to be a receptor for attachment and infection. F hair is preferred. The fusion protein is a ligand capable of mediating secretion of the fusion protein. DNA segment that encodes the leader amino acid sequence, the pilin subunit Target DNA segment such as traA gene product and target protein It is expressed from a chimeric DNA having a DNA segment that encodes it. In addition, high Phage displaying affinity binding proteins will display low affinity binding proteins. It infects and replicates at a higher rate than the sprayed phage. This is these Phages selectively enriched with continued growth in the culture of display bacteria. To display a library of potential binding proteins, Allow the di to be selectively enriched. Encodes a member of a specific binding pair DNA can then be isolated from the display bacterial host. As used herein, a bacteriophage is a phage that encodes a fusion protein. -E. E. coli containing the rescued phage. So Although phages like can infect display bacteria Produce particles for reinfection, because they lack the required phage gene Therefore, it cannot be used in any method that requires reinfection. In one embodiment, the DNA encoding a member of a specific binding pair is, eg, Mutated by the use of a mutagenized strain, and the method of the invention has altered affinity, eg Used to select members of a specific binding pair with increased affinity. You. In other embodiments, the compound affects a specific binding pair interaction, for example, For example, they can be tested for their ability to inhibit or enhance. Target proteins useful in the present invention include peptides, proteins such as hormones, Enzymes, inhibitors and receptors, antigens, antibody fragments Antibodies, single chain antibodies and members of specific binding pairs. instead of , The target protein may be a derivative or analogue of such a protein. Specificity A matched pair is a naturally-occurring, or naturally-occurring, one that has an area in which one of the pair binds to another Includes any pair of molecules produced synthetically. Of such specific binding pairs Examples are antigens and antibodies, hormones and hormone receptors, receptors and ligands, enzymes. Includes substrate and substrate and IgG and protein A. Other uses of the protein display method of the present invention include, for example, epitope mapping. , Antibody library screening, and live bacterial vaccines.Brief description of the drawings FIG. 1 is a diagram showing the characteristics of the traA expression vector pPR35. FIG. 2 illustrates the structure of pPR35. Figure 3 shows the oligonucleotides used in PCR amplification and vector construction. Column ID No. 1-16) will be described. FIG. 4 shows the nucleotides of the pPR35 traA fusion protein (SEQ ID NO: . 17) and the amino acid sequence (Sequence ID No. 18) are described. FIG. 5 illustrates the structure of pGH21. Figure 6. Antigen on the surface of bacterial host cells by colony immunoblotting. Detection of. FIG. 7 is a graph showing the expression of an antigen label on the cell surface. FIG. 8 is a graph showing recombinant antibody expression on the cell surface. FIG. 9 is a colony block showing the detection of anti-CK-MB activity on the cell surface. It is. FIG. 10 shows the structure-function analysis of the fd gene III protein. FIG. 11 illustrates the bacteriophage / pilin interaction system. FIG. 12 shows the recombinant protein / gene IIIpΔBS fusion zone. FIG. 13 shows the construction of π-protein gene IIIpΔBS display phagemid. The scheme for is shown. The oligonucleotides used for cloning are as follows. FIG. 14 is a π-protein / gene IIIpΔBS display phage vector. Shows the structure of. FIG. 15 shows partially purified TA-1 scFv / EE labeled / traA fusion tag. 3 shows a Western block analysis of the compaction. XL1-B / pGH21 cells (1L) And TA-1 / EE labeling Expression of the / traA fusion protein was induced with IPTG as in Example 2. Bacteria Apirin protein was prepared according to Moore et al. J. Bacterology , 146 (1): 251-259 (1981). The fluff was sheared and partially purified by PEG precipitation. Induced cells (cytolysis (Degradation lane) and partially purified protein (PEG precipitation lane) And tested by Western analysis using anti-EE labeled mAb-HRP. A band corresponding to the TA-1 / EE labeled / traA fusion protein was shown. Pile The immunoreactive properties at the top of the overlaid gel are agglomerated fusion ties that do not go into the degradation gel. It's Park.Detailed Description of the Invention F hairs are filaments found on the cell surface that carry the F plasmid. So They are essential for establishing proper binding pairs during bacterial mating (Ipp en-Ihler and Minkey, Ann. Rev .. Genet. , 2 0: 593-624 (1986)), and three classes of bacterial bacteria. It is the binding site for rage R17, QB and fd. Paranchych, Co ld Spring Harbor Laboratory, pp. 85-11 1 (1975). The top of the hair is the recipient cell (forming a binding pair) or other donor -Believed to be involved in cell (surface exclusion) recognition, and filamenta It is a binding site for the bacteriophage fd. The side of the hair is represented by R17 and QB There are two types of binding sites on globular phage. F hair synthesis is more than 13 genes encoded by transfer regions on the F plasmid Need child products. Ippen-Ihler an d Minkley See above. F hair is encoded by the traA gene 7, It consists of a single subunit of 200 Daltons. Original traA gene product Is a propilin (13,200 daltons) containing a 51 amino acid leader sequence. ). The pilin subunit is acetylated at the amino terminus and traG Are believed to be involved in this process. Ippen-Ihler and Minkey, supra and Willetts and Skurray, Ame rican Society for Microbiology, 2: 111 0-1133 (1987). The F-like plasmid is serologically (Lawn and Meynell J. Hy. g. , 68: 683-694 (1978): Mynell, Internati. onal Conference on Pili, pp. 207-234 (1 978)) by a phage sensitivity pattern or surface exclusion (Wille tts and Maure, Genet. Res. 47: 1-11 (1986) )) Encodes four known types of hair that can be distinguished. These hairs are receptive It is believed to recognize different receptors on the cell surface. Haveke s et al. , Mol. Gen. Genet. , 155: 185-189 ( 1977). Typical pilin genes from 4 types have been sequenced (Frost, e t al. J. Bacteriol. , 164: 1382-1247 (198). 5)), and changes in protein sequence are found at the amino terminus (Finlay, et al. al. J. Bacteriol. 163: 331-335 (1985)), The carboxy terminus affects the antigenicity of the protein (Frost, et al. Supra). 4 types of hair is F Different in their ability to bind to specific phage (Meynell, supra) , Which reflects the differences in pilin sequences. However, the amino terminus has a different amino Since the N-terminus also binds to the fd phage equally (Frost, et al. Supra. And Finlay, et al. J. Bacteriol. 168: 990-9 98 (1986)), does not appear to be involved in phage binding. For phage binding Perhaps the affected sequence changes are replaced by the type IV pilin (R100-1 plasmid. Represented) at residues 11 and 14 and in a type III pilin (R1-19 (Represented by a plasmid). Polychrome Internal antiserum (Worobec, et al., J. Bacteriol. 16). 7: 660-665 (1986)) and monoclonal antisera (Froste). t al. J. Bacteriol. 168: 192-198 (1986)). Have shown that the major amino-terminal epitope is apical-specific in the hair ends. It was shown to be exposed. Myrin contained in the carboxy terminus of pilin protein The nae epitope is exposed on the side of the hair. The method of the invention involves the application of a heterologous polypeptide (target protein) on the outer surface of a bacterial host cell. Regarding the display. This method uses pilin protein or a part of it A fusion protein containing a target protein in a bacterial host cell capable of forming hair Expression. The fusion protein can mediate secretion of the fusion protein Coding the DNA segment encoding the leader amino acid sequence with the pilin protein And the DNA segment that encodes the target protein Expressed from a chimeric DNA having Fragment is operably linked to express the target protein on its surface from the host cell. Is tied. Any bacterial strain capable of forming hair can be used for expression of chimeric DNA. It can be used as a host cell. Strains capable of producing F or F-like hair are preferred. That's it Una strain is E. coli (Ippen-Ihler et al.), Salmo nella typhimirium [Artz. S. Holzschu, D .; Blum, P.M. , And Hand, R .; (1983) Gene 26, 14 7-158] and other Gram-negative bacteria carrying other F-like plasmids. Including. Particularly preferred E. The E. coli strain is XL1B (Bullock, WO et al. al. (1987) Bio / Techniques 5, 376-378). And D1 + 5αF '(Woodcock, DM et al. (1989) N. ucleic Acids Res. 17, 3469-3478). Go In some embodiments, E. coli that overexpress hair. E. coli strains are preferred. like that Strains carrying, for example, the repressed F-like plasmid pED208 (Frost L. S. et al. (1985) J. Amer. Bacteriol. 164,123 8-1247). The first component of the chimeric DNA mediates secretion of the fusion protein, ie the fusion tag. Encodes a leader amino acid sequence that can direct the protein to the outer membrane surface It is a DNA segment. Such sequences are, for example, traA leader sequences, Includes phoA or pelB readers. traA leader sequence preferred New The traA leader sequence is obtained from the F plasmid template by PCR amplification. Can be. The F plasmid is, for example, E. coli XL1B Such bacterial cells. A typical traA leader sequence is shown in Figure 4. Have been described. The second component of the chimeric DNA can display the target protein on the cell surface It is a pilin protein subunit or a part thereof. Mutation analysis is amino acid 1 The area of the pilin subunit between 8 and 68 is a necessary element for hair assembly Is suggested to be included. Frost et al. , Mol. Gen. G enet. 213: 134-139 (1988). traA gene product is preferred Yes. The F-pyrine hydrology profile indicates that the molecule is organized into four domains. Suggest. Paiva, W.A. D. et al. , (1992) J. Biol. C hem. 267, 26191-26197. Amino acids present in the N-terminal domain Variability in the number and type of spores was observed in F-like pilin proteins t, L .; S. et al. Supra), this area is on the hair assembly and cell surface. Suggest that it can be excluded in the display. The TraA gene was cloned and F And ColB2 (group II), R1-19 (group III), R100-1 Numerous related F-like profiles including (Group IV) and pED208 (Group V) Sequenced from Lasmid. Finlay, B.M. B. et al. (198 4) J. Bactriol. 160: 402-407; Frost. L. S. e t al (1984) J. Am. Bacteriol. 160: 395-401; Fr. ost, L.D. S. et al. (1985); Finlay, B .; B. et a l. (1986) J. Am. Bacteriol. 168: 990-998. These remains Genes show high homology with each other And by the production of mixed hairs by cells carrying different F-like plasmids As emphasized, the pilin protein consisting of morphologically and functionally similar structures To code. Lawn, A .; M. et al (1971) Ann. Instit ute Pasteur 20: 3-8. Sequences of various traA genes are available Thus, the DNA encoding the traA gene product may be obtained, for example, from the F plasmid template. It can be easily isolated from a number of sources including PCR amplification from. PCR See Example 1 for amplification details. Typical F plasmid traA gene layout The columns are listed in FIG. The target protein encoded by the third component of the chimeric DNA is a peptide, For example hormones, enzymes, inhibitors, receptors, antigens, antibody fragments ( For example, Fab, Fab 'and F (ab')₂) Containing an antibody, a single chain antibody, and And members of a specific binding pair. Instead, the target protein It may be any derivative or analogue of a protein such as Specific binding pair is heaven It includes any pair of naturally derived or synthetically produced molecules. Such a specific binding pair Examples of a are, for example, antigen and antibody, hormone and hormone receptor, receptor and receptor. Includes Gand, enzyme and substrate, and IgG and protein A. Nucleotide sequences of many target proteins are available in many computer databases. Readily available through e.g. GenBank, EMBL and Swiss Prot I can do it. This information can be used to determine the DNA sequence encoding the desired target protein. It can be chemically synthesized, or such DNA sequences are routine in the art. Various manipulations, such as PCR amplification, can be used. The DNA sequence is such that the expression of the fusion protein causes the display of the target protein on the cell surface. Position to form what is called a "display bacterium" To be decided The target protein is pyrintan, which can display the target protein on the cell surface. It can be fused to any part of the park. To the amino-terminal region of pilin protein Is preferred. Successful display of target protein on cell surface detected using multiple methods Can be, for example, if the target peptide does not act across the membrane If it can be specifically labeled, it can easily show its cell surface display . This is the iodination of tyrosyl residues in the presence of lactoperoxidase (¹²⁵I) Therefore, it can be implemented. Marchalonis, et al. J. B iochem. 124: 921-927 (1971); King and Sw. anson, Infect. Immunol. 21: 575-584 (1978) ) In addition, the target protein is linked to the protease added from outside to intact cells. You can check whether you can access. The action of protease is SDS- By seeing the division of the polypeptide in the PAGE, or other sex of the polypeptide Monitor by checking if quality is affected (enzyme activity, antigenicity, etc.) can do. If the target protein exhibits enzymatic activity, such activity may be cell surface dissociated. Can be used as a play indicator. It ’s not possible to cross the outer membrane It is possible if a good substrate is available. Nitrocefin is directed against β-lactamase Such a substrate. O 'Callaghan, et al. Res. Microbiol. , 141: 963-969 (1972); Kornacker and Pugsley, Mol. Microbiol. , 4 (7): 1101-1109 (1990). The outer membrane must be truly impermeable to the substrate when the hybrid protein is expressed. It is important to make sure that Antibodies to the target protein can also be used. However, those who The law is limited. First, the fusion protein is detected by the antibody used for the target protein. You may be restrained during an unconfirmed conformation. Charbit et al. , Embo. J. , 5: 3029-3037 (1986); Maclntyre. , Et al. J. Biol. Chem. , 263: 19053-19059. (1988). Second, if the antibody is a short peptide within the target (for example within 10 residues) Targeting to an epitope contained in Therefore, the only positive result is the exposure of this short peptide. , While a negative result does not expose some other part of the target protein It does not mean that the epitope part can be inaccessible. The binding of antibodies to bacteria can be examined by a number of different techniques. That's it Such methods include bacterial aggregation, immunofluorescence, ELISA on intact cells, in vitro Includes RIA on tact cells, immunoelectron microscopy, and targeting of complement. M. Hofmung, Methods in Cell Biology, 34: 7. See 7 (1991). The chimeric DNA may be integrated in the host cell chromosome or may be carried in the vector. Can be Methods for accumulating DNA in host cells are well known , And include, for example, homologous recombination. Winona, et al. J. Bacte riol. 161: 219-221 (1985). Chimeric DNA is recombinant It can be carried in a vector such as a plasmid. Recombinant vector preferred New The recombinant vector of the present invention contains a vector backbone and chimeric DNA. Recombinant vector May include an inducible promoter operably linked to the chimeric DNA You. Promoters are well known in the art and are commonly used for expression of fusion proteins. Different cell types can be easily selected depending on whether to use. Coach the leader The DNA segment to be linked is preferably located downstream of the promoter sequence. t The raA reader is preferred. The DNA segment encoding the target peptide is It is located downstream of the array. DNA segment encoding the traA gene product Is preferably located downstream of the DNA encoding the target peptide. Plasmids useful as vector backbones are derived from species compatible with the host cell. Includes plasmids containing the pericone and control sequences. For example, if E. co If li is used as a host cell, pUC19, pUC18 or pBR322 A plasmid such as can be used. Insertion of DNA encoding the target protein between DNA segments or DNA sequence TraA with a cloning site incorporated to allow insertion of burberry DNA segment and traA leader D A vector consisting of NA can be constructed. This vector is an inducible pro Motors and marker genes can be included, such as antibiotic resistance. A preferred recombinant vector of the present invention is plasmid pPR35. This plus Mid with the traA leader DNA segment and with pUC19 inducible l It contains a traA DNA segment downstream of the acZ promoter. Ncol , Sfil and Notl have cloning sites for the traA leader and A DNA segment that integrates between the traA protein sequences and encodes the target peptide. Allows the insertion of a component. In addition, the DNA sequence encoding the EE-labeled antigen is tra It is placed between the A leader and traA protein sequences to detect fusion proteins. And allows the characterization of expression display systems. Introduction of the chimeric DNA into the host cell may be carried out by any method known to those skilled in the art. You. For example, if the DNA is carried on a recombinant vector, the vector is Lance formation, electroporation, phage transfection It can be introduced by The detection technique described above is based on the fact that the method of the invention is working, namely a fused pyrintane Park is expressed, transported to the bacterial cell surface, and the target protein is accessible. To verify that it is oriented so that Can be used initially. Cells for targeted display can be displayed using, for example, affinity separation techniques. Can be separated from non-spray. That Techniques such as affinity column chromatography and affinity matrix Includes batch elution from x-material and fluorescence activated cell sorting. The bacterial display library produced by the present invention is just Can be separated by affinity chromatography in the same way as You. Bacterial cells are larger, which can block the Care must be taken during loading to prevent nonspecific retention. afterwards Cells elute by passing free antigen through the column or by low pH Can be Gram-negative bacteria, like phage, resist low pH Meaning of cell survival for at least 10 minutes at pH 3.3, although not sex There is no reduction. Martineul, et al. , Bio / Technol Ogy, 9: 170 (1991). Therefore, elution and rapid neutralization at low pH It can be used for the isolation of strong binding clones. The host cells (display bacteria) that display the desired target type are , Then further cultured and used to obtain the fusion protein. If you want Then, the target protein is separated from the pilin protein, and the pirin protein is well known to those skilled in the art. It can be further purified using phosphorus purification techniques. J. Bacteriol . 146 (1): 251-259 (1981). Once the desired target protein is displayed, it encodes the atypical polypeptide Can be mutated by, for example, the use of a mutagen and Affinity separation technology to identify and select peptides that bind to the above target Can be used. The display method of the present invention is used for the detection and characterization of recombinant proteins. can do. For example, this method maps the following uncharacterized epitopes Can be used for (1) Random peptide or (2) Interesting immunity The sequence encoding the library of peptides obtained from epidemiologically reactive proteins was Can be cloned into a clear traA expression vector, eg pPR35 . E. F. capable of forming hair. E. coli host cells (eg XL1B) This vector bank was transformed and the peptide library traA fusion The protein is displayed on the surface of bacterial cells. Solid phase substrates such as Nairo After growth on the membrane, the resulting bacterium is a fusion protein that reacts with the labeled antibody. Screened for expression. The reactive colonies are then picked and the vector Can be isolated. Sequence analysis of the DNA insert with cloned pep Will reveal whether the tide sequence corresponds to the epitope recognized by the antibody. Would. The display method of the invention can also be used to detect recombinant protein activity, eg antibodies. Can be used. For example, this method uses recombinant antibody-traA fusion protein It can be easily applied to screen libraries. These libraries Lee is a combined single-strand gene bank of heavy and light variable region genes, or Can include a mutant library of specific recombinant antibody genes. (Whit low, M & Filpra, D.L. (1991), Methods: AC opportunity to Methods in Enzymology 2: 97-105). α-CKMB scF v-traA fusion protein overlaid in a biologically active conformation Based on the results described in Examples 6 and 7 indicating that Common for detecting recombinant protein activity displayed on the surface of cell colonies There is application. The activities to be detected include binding activity, catalytic activity, inhibitory activity and altered activity. It could include construction conformations. The present invention can also be used as a primary cloning system. For example, cd NA libraries can be constructed and inserted into the vector of the invention, The library can be screened for its ability to bind a ligand. This ligand / binding molecule combination can be any molecule of the ability to specifically bind to each other. Pairs, eg receptor / ligand, enzyme / substrate (or analog), nucleic acid binding It can include proteins / nucleic acids and the like. If one of the complementary pairs is available If so, this could be the preferred method for isolating the other clone of the pair. As discussed above, the display of those proteins on the bacterial surface Increase the diversity of the population of cloned genes, or individual nucleotides. It will often be necessary to mutate the sequence. In vitro for both purposes Can use in vivo mutagenesis techniques and are well known to those skilled in the art. Substitute Any denaturant strain can be used. Mutant strains should be mutated with respect to their parent DNA. It is a strain containing a genetic defect that produces replicated DNA in the mushroom. That's it Una strains include those carrying a mutD5 mutation such as ES1578. That So if a population of genes were introduced into these strains, it would become more diverse and And, if desired, display And can be transferred to a non-mutagenic strain for selection. F hair is for RNA bacteriophage and filamentous DNA phage Since it acts as a receptor for the phage genome, Specific bacterial cells that display proteins recognized by phage. Binding proteins on phage can be used to target cells. For example , Have hair / bacteriophage interactions that allow phages to enter cells Instead, it allows bacteriophage to interact with hair and thus enter cells. Antigen / antibody interactions can be used to allow. Filamentous filament The gene III product acts as a binding protein and It is believed to be due to interaction with residues near the N-terminus. Gene III protein , A specificity domain involved in integration into the phage coat, as shown in FIG. By phage morphology, interaction with bacterial hair, and entry into bacterial cells Is formed. In addition to filamentous bacteriophage, QB, NS2, f2 and R17 RNA bacteriophages, such as, specifically interact with F hair and Get infected. The ability to absorb into hair is a mutant protein that is present in one copy per virion A (or A for Qβ₂). Paranchych, W . (1975) RNA Phases, ed. N. D. Zinder, Cold Spring Harbour Laboratory: New York, p. p. 85-112. Filamentous bacteriophage gene III protein Similarly, RNA phage mutant A protein can be used to form fusions without affecting infectivity. Can be This method displays one of the proteins in the specific binding pair and To replace the natural receptor for bacterial infection Is made. Bacteriophages are also specific for the normal pilin interaction domain Converted to be replaced by another member of the binding pair. This is a pilin-bonded domain Phage conjugating protein that encodes in (for example, the gene of filament phage Removal of the region of III protein or A protein of RNA phage, and Achieved by inserting DNAs encoding the other members of the specific binding pair into place. It is. Chimeric genes can be integrated into the phage genome or recombinant phagemid expression vector -Can be incorporated into The gene is then transformed into a suitable strain such as E. Departure during coli The fusion protein and the corresponding phage (or phagemid) gene The nom is packaged in bacterial particles. The phage is then washed under standard conditions. Contacted with pre-bacterium. Displace one member of a specific binding pair Playing phages interact with the other members of the displayed protein. Recognize and infect on the basis of use. The phage genome is then displayed Internalized by the rear. Display Bacteria Infected with Phage Genome Is a marker gene transferred from a phage to a display bacterium. For example, selected by identification of antibiotic resistance. Code members of a specific binding pair The resulting DNA can then be isolated from the display bacterial host. For example, using the fd phage, the phage uses the normal pilin interaction domain (eg For example, Amino III 107 to 197) of gene protein III was removed, Target target displayed on bacteria Is converted to be replaced by a polypeptide that specifically binds to the protein. Therefore, display phages interact with the displayed recombinant proteins. Recognizes and infects display bacteria based only on use. Figure 11 shows an example of this system It shows general characteristics. The phage or phagemid genome is then internalized and expressed. Will be revealed. There may be control signals for transcription, translation and replication. If fur If the di- or phagemid genome contains sequences useful for the selection of the desired target cells It is especially useful. Useful sequences confer antibiotic resistance to target cells, for example Things. The bacteriophage useful in the method of the present invention uses the pilin protein as a receptor. It includes filament phages and RNA phages utilized as Such fa Page includes MS2, Qβ, M13, f1, fd and fd-tet. In addition A phageimide expression vector obtained from filament phage such as You. These vectors provide a plasmid and phage source of replication and antibiotic resistance. It may contain the gene to be given. A preferred phage is fd-tet (Zache r, A. N. Stock, C.I. A. , Golden J .; W. and Smi th, G. D. (1980) Gene 9, 127-140) Preferred phage Mid is a derivative of f1 phage such as pBC. As an example of this method, EE-labeled antigen is a recombinant protein on the surface of bacteriophage. Phagemid expression vector developed to allow Park to be displayed Is used to display on bacterial hair as a traA fusion. This Using the stem, the anti-EE labeled scFv was used to detect the 7) removed Gene III protein (this protein is called gene IIIpΔBS shown in FIG. 10) ) On the surface of bacteriophage particles. Anti-E Interaction between E-labeled antibody and EE-labeled antigen is displayed on phage display It is measured by the ability to infect bacteria. Display Bacteria Offer A specificity strategy for generating dysbiosis and measuring infection is described in Example 8 below. You. Other recombinant proteins also disperse on bacteriophage and bacterial surfaces. You can These are live scFv genes displayed on phage. Includes specific antigenic peptides on rally and display bacteria. Specificity s Screening for cFv antigen interaction is 1) scFv display phagemid Particle rescue and 2) mixing of phage with antigen display bacteria and For example, on agar plates containing antibiotics (chloramphenicol) Includes a test for the presence of sensibilities. The method of the present invention is used for antigen purification or enrichment. Does not require multiple rounds of and phage amplification steps. Phage or phagemid DNA was isolated from the resulting resistant colonies and The complementary scFv gene can be sequenced. Bacteriophage system also constructed for recombinant protein display it can. For example, in the expression vector, the normal gene III is the anti-EE marker gene IIIpΔBS fusion It can be constructed from the fd-tet phage by substituting the combined gene (Fig. 13). . This system allows compounds, such as inhibitors or cofactors, to influence the specific binding pair. Can be used to screen. Example 1Construction of traA fusion protein vector for protein expression on bacterial surface Inducible polypeptide fused to the amino terminus of the bacterial surface pilin protein The system was designed to allow efficient display and display. This system In this case, the gene encoding the relevant polypeptide is cloned into the traA vector. Loaned and F⁺Expressed in bacterial strains. Figure 1 shows the traA expression vector. It is based on the multicopy pUC19 vector with the characteristics shown in. traA Leader and traA protein (pilin) DNA fragments can induce this Was cloned downstream of the lacZ promoter of pUC19. traA leader Allows the correct processing and display of the pilin fusion protein. Outpatient D Closing for NcoI, SfiI and NotI to allow insertion of NA sequences. A burning site was introduced between the traA leader and the pyrone polypeptide sequence. . In addition, allows detection of fusion proteins and characterization of expression-display systems For this purpose, the DNA sequence encoding the EE tag antigen was added to the traA leader and tra It was cloned between the A protein sequence. The steps required to construct the pPR35 vector are shown in Figure 2 and are detailed below. Has been described. The traA leader and the traA protein gene fragment are , F plasmid templates were separately amplified by PCR. The amplifier used for amplification The Limer is shown in FIGS. 2 and 3. Typical PCR amplification reaction (100 μl ) Carries 10 F plasmid as template DNA^FiveBoiling XL1B bacterial cells Cell, 10 pmol of the appropriate primer, 2.5 units of Taq polymerase, 100 μM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1. 5 mM MgCl₂, 0.01% gelatin. Mold at 96 ° C for 5 minutes Denaturation by an initial incubation during which Taq polymerase was The reaction was added to heat it up. The desired product is 55 ° C for 1 minute, 70 ° C for 1 minute Amplified by 10 heat cycles of 1 minute at 96 ° C and then at 70 ° C for 1 minute. 20 cycles of 1 minute and 96 ° C. for 1 minute were performed. Increase with primer The width is of the EcoRI site to the 5'end of NcoI and the traA leader flag. Of the BanHI site to the 3'end and 5'to the KasI site, and t resulted in the addition of an XbaI site to the 3'end of the raA protein fragment . PCR products from 5 reactions were pooled and double volume of ethanol / 0.3M vinegar Precipitate with sodium acidate and resuspend the resulting product (about 0.2 μg DNA) in water did. The traA leader PCR product was digested with EcoRI and BanHI and The traA protein PCR fragment was digested with BanHI and XbaI. Was. Digested fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and Purified by elution. To clone these fragments, use PUS 18 DNA was digested with KsaI and the site was filled in with Klenow DNA. And then ligated at the blunt end to create a vector called pPR5. . The purified digested PCR product was then digested with EcoRI / XbaI digested pP Ligated to R5. Bacteria transformed with this ligation mixture Selected for products on these three fragment ligations . As shown in Figure 2, this vector is called pPR2. Finally, The annealed NcoI adhesive end at the 5'end and the KasI sticky end at the 3'end. Two complementary oligonucleotides with sticky ends allow the EE tag linker to -The array has been created. This annealed oligonucleotide has NcoI / Ligated to KasI digested pPR2 to traA fusion vector, pP R35 was given. The sequence of pPR35 is shown in Figure 4. Example 2 Isolation of single chain antibody gene and cloning into traA fusion vector The traA fusion vector comprises a peptide antigen such as an EE antigen as well as a single chain antibody. It was designed to express both other recombinant proteins such as. Of this example For the purpose, the H chain and L chain variable regions of specific monoclonal antibodies are A single-chain antibody gene that is linked by a peptide linker is created Was. Monoclonal antibody to prothrombin polypeptide F1.2 (TA From 1) and against creatine kinase-MB (α-CKMB) From the null antibody, as described and outlined in Figure 5, A single chain antibody (scFv) gene was created. For TA1-ScFv, first The Fast-track RNA isolation kit follows the manufacturer's procedure. From TA1 hybridoma cells by using (Invitrogen) With poly-A isolation. This RNA (using 1/10 of the isolated mRNA) Is according to the manufacturer's procedure Superscript-MLV reverse transcriptase (GI BCO-BRL) and oligo dT specific It was converted to cDNA using priming. 2μ of 20μl of cDNA 1 was used as template DNA for PCR. TA1mAB H and L chains are available This PCR primer for amplifying the variable region gene is shown in FIG. It is JS135 / JS134 and JS133 / JS153, respectively. PC The R buffer conditions are as shown in Example 1.^｜The same. Template should be 5 at 96 ° C Denature by incubating for a minute, during which Tag polymerase Added to heat start the reaction. This immunoglobulin variable region gene The fragments were subjected to 10 thermal cycles of 48 ° C for 1 minute, 70 ° C for 1 minute and 96 ° C for 1 minute. It was amplified by cycling and was added to this at 70 ℃ for 1 minute and 96 ℃ for 1 minute at 25 The cycle of ups continued. Agarose gel electrophoresis of desired product (about 260 bp) It was separated by kinetics and purified by eluting from an agarose gel. These f The lagment then binds to the 3'end of the H chain and the 5'end of the L chain variable region gene at Used as a DNA template in PCR to attach base pair linker sequences. Flexible 15 amino acid peptide linker used to add to the variable region polypeptide Brought. PCR primer used for linker attachment is variable in H chain and L chain For each region fragment, JS135 / JS139 and JS137 / It is JS153. PCR conditions are 48 ° C for 1 minute, 70 ° C for 1 minute and 96 ° C for 1 minute 10 thermal cycles between, followed by 25 minutes at 70 ° C. for 1 minute and 96 ° C. It was a cycle of steps. Following separation by agarose gel electrophoresis, The product (about 400 bp) was purified by elution from an agarose gel. H chain and In order to link the light chain variable region gene fragment, first the heavy chain + L chain variable region + linker gene fragment at 52 ° C for 1 minute, 70 ° C for 1 minute and Sequence duplication by annealing and extending at 96 ° C for 1 minute cycle An extension PCR (sequence-overlap extenshon PCR) was used. Linked hula Then added JS135 / JS153 and 1 minute at 70 ° C, and 96 ° C. Amplification was performed by an additional step cycle of 15 / min. Desired product (about 72 0 bp) was purified as described above. First, the TA1scFv gene flag Menthol was digested with NcoI and SpeI, and with NcoI / SpeI Ligation into the pJS102 cloning vector. That is TA1scF The resulting structure was sequenced to verify that it contained the v gene. Then This pJS1023 / TA1scFv plasmid was cloned into the 3'end of the L chain variable gene. PCR TA1 scFv gene fragment to add NcoI site to Used as template DNA for The primers used are JS135 / JS15 3 and PCR conditions are 48 ° C. for 1 minute, 70 ° C. for 1 minute, and 96 ° C. for 1 minute 10 times 25 cycles of 1 minute at 70 ° C and 1 minute at 96 ° C. . The desired product (about 720 bp) was separated by agarose gel electrophoresis and Purified by elution from the gel. This TA1scFv gene fragment is Nc pPR3 digested with oI and NotI and digested with NcoI / NotI Ligated into 5traA expression vector, TA1scFv / EE tag / The traA fusion vector, pGH21, was created. Isolation of variable region genes from Conan α-CKMB hybridoma cell line In order to construct the α-CKMBscFv gene The same strategy was used for this. The corresponding H and L chain PCR primers are shown in Figure 3. Have been. Sequence overlapping expression by PCR step, α-CKMBscFv gene Fragment digested with NcoI and SpeI and NcoI / SpeI Ligated into the expressed pGH21traA expression vector, which essentially , TA1 scFv gene was exchanged for α-CKMBscFv gene. The structure obtained The structure is called pα-CKMBscFv-traA. Example 3 Production of traA fusion protein The traA expression system has been characterized in several ways. First, TA1scFv- EE tag-traA or αCKMBscFv-EE tag-traA fusion tan Expression of the protein in bacteria was tested by immunoblot analysis. pGH21 and And pα-CKMBscFv-traA vector is XL carrying the F plasmid. Transformed into 1B cells. Exact candidate is alkaline SDS miniprep D Selected by NA restriction analysis and verified by DNA sequencing. traA fusion To induce protein expression, 3 ml of 2xLB medium, 50 μg / ml Ampicillin, 60 μl for intake on 15 μg / ml tetracycline An overnight culture was used. Following incubation at 36 ° C for 2 hours, isopropyl Le-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) was added at a final concentration of 2 mM. Was. OD of cultures after 4 hours at 37 ° C₆₀₀Is measured and 2 ml of culture Were harvested for a 5 minute microcentrifuge. Freeze the cell pellet at -70 ° C and then Cold TxTBS (0.1% Triton C-100, 10 mM Tris-HCl) , PH 7.4, 0.15m NaCl) to 10 OD / ml. Cells for more than 3 to 5 minutes Sonicate and remove cell debris by microcentrifugation at 10,000 xg for 10 minutes at 4 ° C. Was. The supernatant (10 μl) was mixed with SDS / β-mercaptoethanol loading buffer. Boiled for 5 minutes to denature the protein. Sample 12.5% poly Separation by SDS polyacrylamide gel electrophoresis on a chloramide gel. I did. This material in the gel was PVDF neat using a semi-dry transblot apparatus. Transferred to Ron membrane. This membrane was mixed with 20 ml of blocking buffer (0.5% NP in PBS). -40, 0.5% nonfat dry milk) at 4 ° C. overnight and horseradish 43 ng / ml anti-EE tag monoclonal antibody conjugated with biperoxidase Body (anti-EEtab monoclonal antibody-HRP) was probed with 20 ml. This Anti-EE Tag Monoclonal Antibody-HRP from ECL Reagent (Amersham ) Detected. for α-CKMBscFv-traA fusion protein Signal was detected at the expected molecular weight of 40 kD, while XL1B / vector Lysate from only showed no signal. However, TA1scFv-tr The aA fusion protein migrates to 46 kD and the TA1scFv protein migrates to SDS- It migrated through the PA gel to a higher molecular weight than expected. TA1scFv-tr The aA fusion protein was also detected in the growth medium, which indicated that Consistent with what can be shed from the surface and found in the medium. XL1-B / pGH21 cells (1L) proliferated and TA1-1 / EE cells. Expression of the GU / traA fusion protein was performed on IPTG as described in Example 2. Therefore it was induced. Bacterial pili tamtampa Cleavage was performed by clipping pili from the cells, Moor, et al. , [J. Bacterio logy, 146 (1): 251-259 (1981)]. It was purified by PEG-precipitation. Induced cells (cell lysate lane And the partially purified protein (PEGppt Lane) using the anti-EE tag monoclonal antibody-HRP as a probe. Tested by Estan analysis. See FIG. TA-1 / EE tag / traA The band corresponding to the fusion protein is indicated. At the top of the stack gel Epidemi-reactive material is a fusion protein that aggregates into a separating gel. Example 4 In order to develop an improved method for the detection of recombinant proteins, The current system was used. Antigen-traA fusion protein is dissociated on the bacterial cell surface. Two simple detection methods were performed to test if they were played. The first is an immunity for screening bacterial colonies grown on nylon membranes. It was a quarantine detection method. Expressing the TA1-EE tag-traA fusion protein XL1B strain was seeded on a nylon membrane, and the membrane was loaded with vector and XL1B respectively. 50 μg / ml ampicillin and 15 μg / ml tetracylate for selection Plated on 2xLB agar plates containing clean. of traA fusion gene expression Membranes were pre-wetted with 10 mM IPTG for induction. Ink at 37 ℃ overnight After incubation, the membrane is removed from the plate and cold imidazole buffered saline (IB S-40 mM imidazole, pH 7.0, 0.15M NaCl), washed 3 times Was. Membrane in 0.5% milk-PBS at 4 ° C for 1 hour Block by agitating for a short period of time, then incubate at 43 ng / ml anti-antibody in IBS at 4 ° C. Incubated with EE Tag-HRP for 1-2 hours. 5 times with IBS at 4 ° C After washing, the membrane was reacted with ECL reagent and immunoreactive material was detected. This -EE tag monoclonal antibody-HRP by colony immunoblotting of Recognizes IPTG-induced XL1B / TA1-EE tag-traA colonies However, the uninduced XL1B / TA1-EE tag-traA colonies I did not recognize. XL1B cells with control vector (no EE tag-traA Did not give any signal. Anti-EE tag monochrome on cell surface The specificity of the binding of the null antibody also depends on the colony membranes for different peptide tags ( It was determined by incubating with an antibody against KT3). These membranes No signal was detected above. Bacterial colony immunodetection methods were also applied for epitope mapping analysis. This To test the method of TA1-EE Tag-traA or control vector (E XL1B cells harboring E-tag-traA) were treated with 50 μg / ml ampicillin. 2xLB agar plates containing syrin and 15 μg / ml tetracycline Grow overnight above. A colony was replica-plated on a nylon membrane and 10 mM I PTG, 50 μg / ml ampicillin and 15 μg / ml tetracycline Were placed on 2xLB agar plates containing. Coat on the membrane after growth at 37 ° C The knee was probed with anti-EE tag monoclonal antibody-HRP in the same manner as above. I did In the IPTG-induced sample, as shown in FIG. A clear signal for colonies was detected. Corresponding colonies are characterized To remove the TA1-EE tag-traA vector from the master plate It was found to carry. Example 5 Whole cell ELISA for detecting antigens expressed on the surface of bacteria Second to test accessibility of antigen-traA fusion protein on bacterial surface The method was an ELISA method using intact cells. Fine cells grown to the initial long-term phase Vesicles were induced with IPTG for 4 hours at 37 ° C. Harvest cells to 1.0 OD₅₉₅To cold Resuspended in PBS. This step does not involve the cells present in the medium. It will remove any traA fusion protein. Micro titer The rate was coated with 100 μl of bacterial dilution per well. Ink at 4 ° C overnight After incubation, the non-adherent cells were discarded and the wells were filled with 1% bovine serum albumin. Blocked with PBS containing bumin for 1 hour at 4 ° C. This blocking Following the step, 100 μl of 0.34 μg / ml anti-EE tag anti- Incubated with body HRP. Antigen-antibody after 5 washes with PBS The complex was developed by HRP-ELISA substrate (H₂O₂, ABTS Peru Xydase substrate). Response values were recorded by an ELISA reader. OD₄₅₀ The readings are the anti-EE tag monoclonal antibody-HRP captured in each well. The amount of EE tag fusion protein that was active and expressed on the cell surface Related. As shown in FIG. 7, induced XL1B / TA1-EE tag-tr. The aA sample was either an uninduced sample or XL1B / control vector (EE tag- 6 times higher readings of the sample (without traA), which indicates that the method is finer. Specific detection of antigens present on the cell surface It shows that it can be applied to get out. A known amount of the peptide antigen and the binding reaction And the addition of antibodies, this method can be used for quantitative antibody / antigen binding. U. In addition, the peptide is capable of binding to the antibody / antigen-traA fusion protein interaction. Comparative ELISA assay in which the effect of different peptides to be measured is measured It could be characterized in the scheme. Example 6 Whole cell EL for detection of activity of recombinant antibody displayed on bacterial surface ISA The results from Examples 4 and 5 show that the antigen fused to traA was detected on the bacterial surface. Capable of being sprayed and specifically detected by the corresponding antibody Is shown. Can functional recombinant proteins be displayed on the bacterial surface? Similar experiments were performed as described below to determine whether or not. Bacterial cell To detect the activity of recombinant single chain anti-CKMB antibody displayed on the surface Then, an ELISA method using intact cells was performed. α-CKMBscFv-EE Tag-traA fusion vector or control vector (TA1-EE tag-tra A cell carrying either the A fusion vector or the vector without insert) Grow to initial long-term phase at ° C. In that regard, the expression of the fusion protein is It was induced by the addition of 0.2 mM IPTG for 4 hours at 37 ° C. Cells harvested 10.0 OD in cold PBS₅₉₅/ Ml. Micro titer The rate is 100 μg / in coating buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 8.5). Coated with ml of anti-CK-BB monoclonal antibody and overnight at 4 ° C. Incubated . The non-attached anti-CK-BB monoclonal antibody was discarded and the wells were washed gently. Immersion solution (0.1 M Tris-HCl, pH 7.4, 1.0 M NaCl, 0.1% Na N_Three) Washed once. Wells were loaded with dilution buffer (0.01 M Tris-HCl, 0. In 15% NaCl, pH 7.3, 2% gelatin, 0.1% Tween20) Stir with 100 μl 0.3 μg / ml CK-MG for 1 hour at room temperature. One was incubated. Wells are rinsed with buffer (0.01 M Tris-HCl, pH 7 . 3, 0.15M NaCl, 0.2% BSA, 0.05% Tween 20, 0 . 2% NaN_Three) Washed once. Add 100 μl of cell suspension to each well, The plates were incubated at room temperature for 1 hour with agitation. Thin that did not adhere The cells were discarded and the wells were washed twice with rinsing buffer. Wells in dilution buffer 100 μl of 0.34 μg / mf anti-EE tag monoclonal antibody-HRP contact Incubated with coalescence for 1 hour at room temperature with agitation. Rinse wells with buffer After washing twice with liquid, HRP-ELISA substrate (H₂O₂, ABTS Peroxida Substrate) and developed for 20 minutes. At 450 nm with an ELISA reader The amount of color development measured is the scFv-EE tag-traA fusion detected in the wells. Corresponds to the combined protein. These values are captured by immobilized CK-MG Correlates with the amount of anti-CKMBscFv activity displayed on the surface of exposed cells . Typical results are shown in FIG. IPTG-induced XL1B / α-C The KMBscFv Tag-traA plasmid sample does not recognize CK-MB. Inducible XLIB / TAI-EE tag-tra expressing various recombinant antibodies Captured α-CKMBscFv-EE tag compared to A cells -Showed a 29-fold higher level of the traA fusion protein. Carry a control vector XL1B cells do not express the EE tag-traA protein and this assay Showed no activity in. The results of these experiments show that the fusion protein α-CKMBscFv domain Folds into a biologically active conformation and disperses on the surface of cells It has been recorded. One on the same displayed protein T-matching of chain antibody and EE antigen tag allows diversity of development of ELISA method Accept. The sandwich capture ELISA method used in this example is It is just one of many possibilities. Example 7Detection of functional single-stranded activity on the surface of bacteria by colony screening This example demonstrates the activity of recombinant proteins expressed on the surface of bacterial cell colonies. Demonstrate successful detection. α-CKMBscFv-EE tag-traA fusion vector The XL1B strain carrying the vector and the TA1-33 tag-traA fusion vector The carrying strain was evenly seeded on the nylon membrane. The membrane is washed with 50 μg / ml Place on 2xLB agar containing picillin and 15 μg / ml tetracycline. And incubated at 37 ° C. until the appearance of small bacterial colonies. this At this time, a replica film was made by stacking a new film on the master film. This The plica membrane was then removed and cut in half. One half is 10 mM IPTG , 50 μg / ml ampicillin and 15 μg / ml tetracycline 2 x LB agar plate, and the other half at 50 μg / ml ampicillin and 15 μg / ml tetracycline only Incubated on 2xLB agar plates containing. Overnight at 37 ℃ After incubating, the IPTG-induced and non-induced membranes were removed and washed 3 times with IBS. Was. With 20 ml of 0.5% milk-IBS, stir for 1 hour at 4 ° C with stirring. Lock and then co-dissolve with 20 ml of 0.3 μg / mE CKMB in dilution buffer. And incubated at 4 ° C for 1 hour. After 3 washes with cold IBS, the membrane is washed 4 times. Anti-CK-BB mono conjugated to alkaline phosphatase for 1 hour at Blocked with clonal antibody. After 5 washes with cold IBS, the membrane was Lu washed. Reacted with miphos 53 (Boehringer Mannheim) . Immunoreactive material was detected by fluorography, with typical results. It is shown in FIG. A strong clear signal corresponding to a single colony indicates that PITG-induced Detected during the sample. These colonies were picked from the master plate and Found to carry the -CKMBscFv-EE tag-traA vector Was. Colonies corresponding to the negative signal on the film contained the control vector. This The results show that the α-CIMBscFv-traA fusion protein was detected on the bacterial surface. Sprayed and the single-chain antibody folds into a biologically active conformation. It is shown to be folded. This method provides an easy and rapid procedure for detecting recombinant single chain antibody activity. Offer. It immediately screens for recombinant antibody traA fusion proteins. It could be applied to ibary. These libraries contain heavy and light chain variable regions. Sudden combination single-stranded gene bank or specific recombinant antibody incubation Mutation libraries can be included. α-CKMBscFv-traA fusion tag Shows that the protein is folded into a biologically active conformation On the basis of this result, this method was applied to the recombinant cells expressed on the surface of bacterial cell colonies. It could be applied generally to the detection of protein activity. The activity detected is Include synergistic, catalytic, inhibitory activities and altered structural conformations U. Example 8 Bacteriophage / pilin interaction system Of the gene IIIpΔBS fusion protein on the surface of bacteriophage particles Phagemid vectors designed for expression and display Was. The phagemid vector is a pBC phage vector having the characteristics shown in FIG. Based on the Do Vector (Stratagene). This vector is CoIE1 transcription origin for replication, fa -F1 linear phage replication origin for recovery of dimid DNA, and antibiotics Carries a chloramphenicol resistance gene for selection by. pe1B Lee And the gene fragment of gene IIIpΔBS are inducible in pBC. It was cloned downstream of the acZ promoter. pe1B reader is suitable processing And digested to allow the sequence of the fusion protein on the bacteriophage . To allow the insertion of foreign DNA sequences, NcoI, SfiI, SpeI, and And the cloning sites for NotI are pe1B leader and geneII. It was introduced between the IpΔBS sequences. This step uses this vector (LE2) The steps involved in building the are shown in FIG. The anti-EE tag scFv gene was cloned as outlined in Example 2. , Not2 and LE of LE2 isolated from monoclonal hybridoma mRNA. It was inserted at the SepI site. Contains 30 μg / ml chloramphenicol To grow these vectors in culture, the F'host strain, DH5-αF '[ Woodcock, D: M. et al. (1989), Nucl. Acids . Res. 17, 3469-3478] was used. D carrying a phagemid expression vector to rescue phagemid particles H5-αF 'cells were treated with fKN16 phage DNA for tetracycline resistance. It was transformed with. This fKN16 phage derivative is 507b of gene III. By removing the p segment, the tetracycline resistant phage, fd- constructed from tet (Nelson, et al., Virology, 108). : 338-350 (1981)). The phage was not removed for gene III removal. Infectious but required for replication and packaging of the phagemid expression vector Provides helper phage protein. The phagemid expression vector and fKN DH5-αF 'cells bearing both 16 and 30 were added to 30 μg / ml chloramphene. 100 ml 2xY containing nicol and 15 μg / ml tetracycline Grow overnight in T medium. Cells are removed by centrifugation and phage particles in culture medium Pups were concentrated by precipitation with 5% PEG and 0.5M NaCl. Profit The resulting phage particles were fKN16 phage (tet^r) Or geleIIIpΔ BS phagemid vector (chl^r). FK with a defect N16 gene protein and anti-EE tag scFv-geneIIIpΔBS fusion Both of the combined proteins are arrayed on the bacteriophage surface. The rescued phage was XL-1 carrying the EE tag-traA fusion vector. Used to infect B cells. These cells have EE-tag resistance on their pili. Since it expresses the raw material, the anti-EE tag scFv-geneIIIpΔBS fusion tag is expressed. The bacteriophage in which the protein is arranged is EE tag-traA fusion protein. Quality of the cells, infecting these cells and carrying the phagemid expression vector. This results in a loramphenicol resistant clone. Bacteriophage-based systems have also been constructed for recombinant protein sequences. You can also. The expression vector is a conventional gene, as outlined in Figure 14. Place III with anti-EE tag scFv-geneIIIpΔBS fusion protein Alternatively, it can be constructed from the fd-tet phage. DH5- αF 'cells are transformed into tetracycline resistance by the phage expression vector. Is converted. Transformed cells contain 15 μg / ml tetracycline Incubate overnight in 100 ml of 2xYT medium. Cells in a centrifuge Thus, the phage particles removed and in the culture medium were 5% PEG and 0.5 MN It will be concentrated by precipitation with aCl. The resulting phage particles are ge Carrying neIIIpΔBS phage vector, anti-EE tag scFv-gen Aligning the eIIIpΔBS fusion protein on the surface of bacteriophage Will. These phage particles carry the EE tag-traA fusion vector. Used to infect infected DH5-αF 'cells. Then place on agar plates as described for the phagemid system. Infection by selection of tetracycline-resistant colonies Sex can be tested. Alternatively, the expressing phage is replicable and Since it is possible to reinfect a bacterium that sequences the E tag, infectivity is determined by this sequence. By liquid plaque formation of the arrayed bacteria, or by plaque formation on the grass. It can be characterized by the proliferation of phage in the ground. Plaque size Alternatively, the phage titer in the liquid medium is the set that is responsible for infectivity and growth of the phage It provides an indication of the strength of the protein-protein interaction. In other words, Recombinant protein with the strongest affinity between sequence phage and sequence bacteria-tamper The quality interaction gives the strongest infection rate. The specificity of the infection also depends on the EE tag resistance. It can be tested with cells that do not have the original sequenced. This system screens a library of recombinant proteins such as scFv for screening. It is useful for A phage that arranges a high-affinity scFv binds the antigen. The bacterium to be arrayed has a higher rate than the phage to which the low-affinity scFv is arrayed. It will be infected and will replicate in it. Thus, the high-affinity scFv is arranged. Phage will be selectively enriched by continuous culture in medium. The resulting phage DNA was isolated and candidate scFv genes and proteins Quality could be further characterized by sequencing and affinity analysis. The examples and embodiments described herein are for illustration purposes only However, it should be understood that various modifications or changes are suggested to those skilled in the art. No.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 0276−2Ｊ 33/569 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者スティンソン，ジェフェリー，アールアメリカ合衆国33331フロリダ、デイビー、ダーハムレーン15030 (72)発明者ウォン，ヒン，シーアメリカ合衆国33332フロリダ、フォートローダーデイル、ウェントワース 2966─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI G01N 33/53 0276-2J G01N 33/53 D 33/569 0276-2J 33/569 B // (C12N 1 / 21 C12R 1:19) (72) Inventor Stinson, Jeffery, Earl United States 33331 Florida, Davy, Durham Lane 15030 (72) Inventor Wong, Hin, Sea United States 33332 Florida, Fort Lauderdale, Wentworth 2966

Claims

【特許請求の範囲】１．標的タンパク質を細菌宿主細胞上にディスプレーさせるための方法であって、線毛を形成する能力のある細菌宿主中において、融合タンパク質であって、当該融合タンパク質の分泌を媒介する能力のあるリーダーアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメントと、該線毛を形成する能力のあるピリンサブユニットをコードするＤＮＡセグメントと、そして該標的タンパク質をコードするＤＮＡセグメントとを含むキメラ性ＤＮＡによってコードされており、該宿主細胞が該標的タンパク質をその表面にディスプレーするようにこれらのＤＮＡセグメントが作動可能に連結しているものである融合タンパク質を発現させることを含む方法。２．該線毛がバクテリオファージの接着及び感染のためのレセプターである、請求項１の方法。３．該線毛がＦ線毛である、請求項２の方法。４．リーダーセグメントをコードしている該ＤＮＡセグメントがｔｒａＡリーダー配列をコードしているものである、請求項３の方法。５．該ピリンサブユニットをコードしている該ＤＮＡセグメントがｔｒａＡ遺伝子産物をコードしているものである、請求項３の方法。６．該標的タンパク質をコードしている該ＤＮＡセグメントが該リーダーをコードしているＤＮＡセグメントと該ピリンサブユニットをコードしているＤＮＡ配列の５’末端との間に連結しているものである、請求項１の方法。７．該細菌宿主がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１の方法。８．該キメラ性ＤＮＡがこれに作動可能に連結した誘導可能プロモーターを更に含むものである、請求項１の方法。９．該キメラ性ＤＮＡが組換えベクター内に担持されているものである、請求項１の方法。１０．組換え標的タンパク質を該組換え標的タンパク質をコードするＤＮＡ含んだＤＮＡライブラリーから選択するための方法であって（ａ）該ＤＮＡライブラリーによってコードされた該組換えタンパク質を請求項１の方法によってディスプレーさせ、そして（ｂ）該望みの標的組換えタンパク質をディスプレーした細菌宿主細胞を選択することを含む方法。１１．該細菌宿主が、該標的タンパク質中に遺伝子的多様性を導入するミューテーター株である、請求項１又は１０の方法。１２．該標的タンパク質が抗原決定ポリペプチドである、請求項１０の方法。１３．該望みの標的組換えタンパク質をディスプレーしている該細菌宿主細胞が、抗体に対する免疫反応性によって選択されるものである、請求項１０の方法。１４．特異的結合対の一方のメンバーを単離するための方法であって、（ａ）バクテリオファージの接着と感染のためのレセプターである線毛を形成する能力のある細菌宿主中において、融合タンパク質であって、当該融合タンパク質の分泌を媒介する能力のあるリーダーアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメントと、該線毛を形成する能力のあるピリンサブユニットをコードするＤＮＡセグメントと、そして該メンバーをコードするＤＮＡセグメントとを含むキメラ性ＤＮＡによってコードされているものである融合タンパク質を発現させ、（ｂ）ステップ（ａ）の該細菌ホストを、該ピリン相互作用ドメインが該特異的結合対の他方のメンバーをコードするＤＮＡで置換されたものであるピリン相互作用ドメインを有する接着タンパク質をディスプレーしたバクテリオファージと接触させ、（ｃ）該バクテリオファージによって認識される細菌宿主細胞を選択することを含む方法。１５．該線毛がＦ線毛である、請求項１４の方法。１６．該ファージが線状ファージ又はＲＮＡバクテリオファージである、請求項１５の方法。１７．該ファージがｆｄファージである、請求項１６の方法。１８．該一方のメンバーをコードする該ＤＮＡがＤＮＡライブラリーからのものである、請求項１４の方法。１９．該他方のメンバーをコードする該ＤＮＡがＤＮＡライブラリーからのものである、請求項１４の方法。２０．該一方のメンバーをコードするＤＮＡが抗原決定基をコードしそして該他方のメンバーをコードする該ＤＮＡが抗体をコードするものである、請求項１４の方法。２１．該一方のメンバーをコードする該ＤＮＡが抗体をコードしそして該他方のメンバーをコードする該ＤＮＡが抗原決定基をコードするものである、請求項１４の方法。２２．該バクテリオファージ接着タンパク質がｇｅｎｅＩＩＩタンパク質である、請求項１７の方法。２３．該ファージによって認識される該細菌宿主が該ファージから該宿主に移転されたマーカー遺伝子の同定によって選択されるものである、請求項１４の方法。２４．該特異的結合対の一方のメンバーをコードする該ＤＮＡが突然変異化されておりそして増大した親和性を有する特異的結合対が選択されるものである、請求項１４の方法。２５．特異的結合対相互作用に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするための方法であって、（ａ）その表面上にディスプレーされた特異的結合対−ピリン融合タンパク質を有する細菌細胞を、該ピリン相互作用ドメインが該特異的結合対の該他方のメンバーによって置換されるように変更されたバクテリオファージと接触させ、（ｂ）試験化合物を加え、そして（ｃ）該ファージ／細菌細胞相互作用に対する該試験化合物の効果を測定することを含む方法。２６．ファージ細菌細胞相互作用に対する該試験化合物の効果が該ディスプレーファージの感染性に対する該試験化合物の効果を測定することによって測定されるものである、請求項２５の方法。２７．増大した結合親和性を有する特異的結合対の一方のメンバーについてのスクリーニング方法であって、（ａ）一方のピリン−特異的結合メンバー融合をディスプレーしたディスプレー細菌を、正常なピリン結合ドメインが該特異的結合対の他方のメンバーを含んだタンパク質のライブラリーで置換されているように変更されたバクテリオファージとファージ感染を許容する条件下に接触させ、そして（ｂ）増大した感染頻度を有するバクテリオファージを同定することによって、増大した結合親和性を有する特異的結合対を同定することを含む方法。２８．標的タンパク質−ピリン融合物をディスプレーしている細菌宿主細胞。２９．該宿主がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２８の細菌宿主細胞。[Claims] 1. A method for displaying a target protein on a bacterial host cell. hand, A fusion protein in a bacterial host capable of forming pili, Encodes a leader amino acid sequence capable of mediating secretion of the fusion protein And the pilin subunit capable of forming the pilus. And a DNA segment that encodes the target protein. Is encoded by a chimeric DNA containing These DNA segments are engineered to display proteins on their surface. A method comprising expressing a fusion protein that is operably linked. 2. The pili are receptors for bacteriophage adhesion and infection, The method of claim 1. 3. The method of claim 2, wherein the pili are F pili. 4. The DNA segment encoding the leader segment is traA The method of claim 3, wherein the method encodes a Dahder array. 5. The DNA segment encoding the pilin subunit is traA The method of claim 3, wherein the method encodes a gene product. 6. The DNA segment encoding the target protein encodes the leader. DNA segment encoding the DNA and DNA encoding the pilin subunit Also linked to the 5'end of the sequence The method of claim 1, wherein: 7. The bacterial host is E. 2. The method of claim 1, which is E. coli. 8. An inducible promoter operably linked to the chimeric DNA is added to the inducible promoter. The method of claim 1, comprising: 9. The chimeric DNA is carried in a recombinant vector. Item 1 method. 10. The recombinant target protein comprises a DNA encoding the recombinant target protein. A method for selecting from different DNA libraries (A) contracting the recombinant protein encoded by the DNA library Display by the method of claim 1, and (B) Selection of bacterial host cells displaying the desired target recombinant protein Choose A method that includes: 11. The bacterial host introduces a genetic diversity in the target protein. The method according to claim 1 or 10, which is a tater strain. 12. 11. The method of claim 10, wherein the target protein is an antigenic determinant polypeptide. 13. The bacterial host cell displaying the desired target recombinant protein 11. The method of claim 10, wherein is selected by immunoreactivity to the antibody. . 14． A method for isolating one member of a specific binding pair, the method comprising: (A) Shape pili, a receptor for bacteriophage adhesion and infection Fusion protein in a competent bacterial host Quality leader amino acids capable of mediating secretion of the fusion protein A DNA segment encoding a sequence and a pilin subcapsule capable of forming the pilus A DNA segment encoding a unit, and a DN encoding the member A fusion encoded by a chimeric DNA containing an A segment Express the protein, (B) the bacterial host of step (a) is characterized in that the pilin interaction domain Pyrin substituted by the DNA encoding the other member of the heterologous binding pair Bacteriophage displaying an adhesion protein having an interaction domain Contact with (C) selecting a bacterial host cell recognized by the bacteriophage A method that includes: 15. 15. The method of claim 14, wherein the pili are F pili. 16. The phage is a filamentous phage or an RNA bacteriophage. Item 15 method. 17． 17. The method of claim 16, wherein the phage is fd phage. 18. The DNA encoding the one member is from a DNA library 15. The method of claim 14, wherein: 19. The DNA encoding the other member is from a DNA library. 15. The method of claim 14, wherein: 20. The DNA encoding the one member encodes an antigenic determinant and The DNA encoding the other member encodes an antibody. Method 4. 21. The DNA encoding the one member encodes an antibody And the DNA encoding the other member encodes an antigenic determinant 15. The method of claim 14, wherein. 22. The bacteriophage adhesion protein is a gene III protein 18. The method of claim 17, wherein 23. The bacterial host recognized by the phage is transferred from the phage to the host. 15. The method according to claim 14, which is selected by identifying the transferred marker gene. Law. 24. The DNA encoding one member of the specific binding pair is mutated. A specific binding pair is selected which has a high affinity and increased affinity, The method of claim 14. 25. To screen for compounds that affect specific binding pair interactions The method of (A) Specific binding pair-pyrin fusion protein displayed on its surface The bacterial cell having a quality such that the pilin-interaction domain binds to the other of the specific binding pair. Contact with a bacteriophage modified to be replaced by a member, (B) adding a test compound, and (C) measuring the effect of the test compound on the phage / bacterial cell interaction To A method that includes: 26. The effect of the test compound on the phage-bacterial cell interaction depends on the display. -Determined by measuring the effect of the test compound on the infectivity of the phage. 26. The method of claim 25, which is: 27. For one member of a specific binding pair with increased binding affinity A screening method, (A) Display displaying one pilin-specific binding member fusion Leybacterium, the normal pilin-binding domain contains the other member of the specific binding pair. Bacteria modified to be replaced in a library of different proteins Contact with the phage under conditions that allow phage infection, and (B) by identifying bacteriophages with increased infection frequency Identify specific binding pairs with increased binding affinity A method that includes: 28. Bacterial host cells displaying the target protein-pilin fusion. 29. The host is E. 29. The bacterial host cell of claim 28, which is E. coli.