JPH09503198A - ペプチド核酸の高次構造および結合 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチド核酸およびペプチド核酸の類似体を用いて、核酸とともにデュープレックス、トリプレックス、および他の構造を形成し、核酸を修飾する。また、ペプチド核酸およびその類似体を用いて、転写休止、転写阻害および核酸の部位特異的切断等を介して蛋白質の活性を変調する。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド核酸の高次構造および結合 関連出願 本出願は、１９９３年４月２６日出願の米国特許出願第０８／０５４，３６３ 号の一部継続出願であり、該出願は、１９９２年５月１９日に出願され、１９９ ２年１１月２６日にＷＯ９２／２０７０２として公表されたＰＣＴ ＥＰ９２／ ０１２１９の一部継続出願である。上述のそれぞれの出願の内容の全てを、本明 細書の一部としてここに引用する。 発明の分野 本発明は、一本鎖および二本鎖核酸とともに三本鎖構造を形成する化合物に関 する。本発明はさらに、そのような化合物を用いて、二本鎖核酸において鎖置換 （ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を生じさせることに関する。本発 明はさらに、そのような鎖置換を用いて二本鎖核酸を修飾する方法に関する。そ のような二本鎖核酸を修飾する方法には、核酸鎖（一本または複数）の切断が含 まれる。特に、そのような切断には、通常は配列非特異的なヌクレアーゼを用い る二本鎖核酸の配列特異的切断が含まれる。そのような方法にはまた、転写の阻 害または停止（ａｒｒｅｓｔ）、ならびに転写開始が含まれる。本発明の方法は 、特に、ポリアミド主鎖に共有結合している天然に生ずる核塩基（ｎｕｃｌｅｏ ｂａｓｅ）または他の核塩基結合部分を含む化合物を用いて行われる。 発明の背景 遺伝子の機能は、その情報がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される ことにより始まる。ｍＲＮＡは、リボソーム複合体との相互作用により、その配 列によりコードされる蛋白質の合成を指示する。合成プロセスは、翻訳として知 られている。翻訳には、種々のコファクターおよびビルディングブロック、すな わちアミノ酸、およびそれらのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が必要であり 、これらはすべて正常な細胞中に存在する。 転写開始には、ＲＮＡ合成酵素であるＲＮＡポリメラーゼによるプロモーター ＤＮＡ配列の特異的認識が必要である。原核細胞の多くの場合、および真核細胞 のおそらく全ての場合において、この認識の前に、蛋白質転写因子がプロモータ ーに配列特異的に結合する。プロモーターに結合するがその結合がＲＮＡポリメ ラーゼの作用を妨害する他の蛋白質は、リプレッサーとして知られている。この ように、遺伝子活性化は、典型的には転写因子により正に、そしてリプレッサー により負に制御されている。 ほとんどの一般的な薬剤は、１またはそれ以上の標的内因性蛋白質、例えば酵 素と相互作用し、これを変調することにより機能する。薬剤の典型的な１日用量 は、１０^-5−１０^-1ミリモル／ｋｇ体重、または体重１００ｋｇの者に対して１ ０^-3−１０ミリモルである。この変調がｍＲＮＡとの相互作用またはその不活性 化により行われるならば、薬剤の必要量を著しく減少させ、かつ副作用も対応し て減少させることができるであろう。そのような相互作用を部位特異的とするこ とができれば、さらに減少させることができる。機能遺伝子が連続的にｍＲＮＡ を生成すると仮定すると、遺伝子転写を完全に停止させることができればさらに 有利であろう。 一本鎖および特に二本鎖核酸に配列選択的に結合する合成試薬は、遺伝子標的 化薬および他の配列特異的遺伝子変調剤の開発の道具を提供しうるため、分子生 物学および医療／化学において多大な興味が持たれている。これまでのところ、 オリゴヌクレオチドおよびそれに近い類似体が、そのような試薬の最良の候補を 提示してきた。 １００塩基対（ｂｐ）もの長さのオリゴデオキシリボヌクレオチドが、市販の 完全に自動化された合成機を用いて、固相法により日常的に合成されている。し かし、オリゴリボヌクレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチドよりはるかに 安定性が低い。この事実のため、例えば遺伝子治療または転写もしくは翻訳の制 御に向けられた医療および生物学研究において、オリゴデオキシリボヌクレオチ ドがより広く用いられている。合成オリゴデオキシリボヌクレオチドをアンチセ ンスプローブとして用いて、ｍＲＮＡを遮断し、最終的にはこれを破壊すること が研究されている。 また、例えばオリゴヌクレオチドまたは他のＤＮＡ認識剤を用いて三重らせん を形成することにより、動物のゲノムを変調することも可能であろう。しかし、 オリゴヌクレオチド三重らせん形成には多くの欠点がある。例えば、三重らせん 形成は一般にホモプリン配列を用いた場合にのみ得られており、非生理学的に高 いイオン強度および低いｐＨを必要とする。アンチセンス試薬またはトリプレッ クス形成構造のいずれとして用いる場合にも、非修飾オリゴヌクレオチドはイン ビボ半減期が短いために実用的ではない。これを阻止するために、オリゴヌクレ オチド類似体が用いられてきた。 これらの問題のため、改良および代替物について多くの研究が行われてきた。 例えば、三重らせん形成を介する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）認識に関して生ず る問題は、巧みな「スイッチバック」化学結合により減少し、このことにより１ つの鎖上のポリプリンの配列が認識され、そして「スイッチングバック」により 、他方の鎖上のホモプリン配列が認識されうる。例えば、ＭｃＣｕｒｄｙ，Ｍｏ ｕｌｄｓ，ａｎｄ Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｎｕｒｅｏｓｉｄｅｓ（印刷中）を参照 のこと。また、らせん形成は、人工的塩基を用いることにより得られており、こ のことによりイオン強度およびｐＨに関する結合条件が改良される。 半減期ならびに膜透過性を改良するために、ポリヌクレオチド主鎖中の多数の 変更が行われてきた。これらの変更としては、メチルホスホネート、モノチオホ スフェート、ジチオホスフェート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル 、架橋ホスホロアミデート、架橋ホスホロチオエート架橋メチレンホスホネート 、および、シロキサン架橋、カーボネート架橋、カルボキシメチルエステル架橋 、アセトアミド架橋、カルバメート架橋、チオエーテル、スルホキシ、スルホノ 架橋を有するデホスホヌクレオチド間類似体、種々の「プラスチック」ＤＮＡ、 α−アノマー架橋、およびボラン誘導体の使用が挙げられる。これらの主鎖修飾 の大部分は、Ｔｍ値を測定することによりアッセイして、修飾オリゴヌクレオチ ドとその相補的天然オリゴヌクレオチドとの間に形成されるハイブリッドの安定 性の減少をもたらす。したがって、主鎖修飾はそのようなハイブリッドを非安定 化させ、すなわちより低いＴｍ値をもたらし、最小限に維持すべきであることは 、当該技術分野において一般に理解されている。 配列特異的エンドヌクレアーゼ（制限酵素）の発見は、バイオテクノロジーの 発展において必須の段階であり、特定の塩基配列を含む厳密に特定された位置に おいてＤＮＡを切断することを可能とした。しかし、現在知られている制限酵素 の範囲は広いが、依然として、二本鎖核酸中の特定の配列を認識し、認識した位 置またはその付近において特異的に核酸を切断する能力においてより高い柔軟性 を得ることが必要とされている。 ほとんどの制限酵素は４つまたは６つのＤＮＡ配列を認識し、非常にわずかの もののみが認識に８つの配列を必要とする。しかし、制限酵素は、これらの束縛 中のすべての可能な配列の小さなサブセットについてのみ同定され単離されてい る。特に、一般には大きなゲノムＤＮＡ分子の研究に関して、特にヒトゲノム計 画において、よりまれに生ずる部位、例えば約１５塩基対により定義される部位 においてＤＮＡ分子を認識し特異的に切断することが必要とされている。 したがって、この目的のために、人工的「制限酵素」を創造し、または現存の 制限酵素を用いる方法を変更する努力がなされてきた。研究された方法には、Ｄ ＮＡを切断しうる化学基（例えば光化学基）または非特異的ＤＮＡ切断酵素を付 けた、三重らせん形成を介して二本鎖ＤＮＡと配列特異的に結合しうるオリゴヌ クレオチドの開発、および「アキレスのかかと」の一般的方法と一致する他の修 飾が含まれる。そのような方法は、Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ． ，ＰＮＡＳ ８６，９７０２−９７０６（１９８９）；Ｐｅｒｒｏｕａｕｌｔ， Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４，３５８−３６０（１９９０）；Ｓ ｔｒｏｂｅｌ，Ｓ．Ａ．＆ Ｄｅｒｖａｎ Ｐ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９ ，７３−７５（１９９０）；Ｐｅｉ，Ｄ．，Ｃｏｒｅｙ Ｄ．Ｒ．＆ Ｓｃｈｕ ｌｔｚ Ｐ．Ｇ．，ＰＮＡＳ ８７，９８５８（１９９０）；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ ．＆ Ｄｅｒｖａｎ Ｐ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１，１３６０（１９９１ ）；Ｈａｎｖｅｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｍ．＆ Ｗｅｌｌｓ Ｒ．Ｄ． ，ＮＡＲ １８，１５７−１６１（１９９０）；Ｋｏｏｂ，Ｈ．＆ Ｓｚｙｂａ ｌｓｋｉ Ｗ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０，２７１（１９９０）；Ｓｔｒｏｂｅ ｌ，Ｓ．Ａ．＆ Ｄｅｒｖａｎ Ｐ．Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，＃５０，１７２（１ ９９１）；およびＦｅｒｒｉｎ，Ｌ．Ｊ．＆ Ｃａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ Ｒ． Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９４−１４９７（１９９１）に記載されて いる。 国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２２０およびＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２１９ （いずれも１９９２年５月２２日出願）において、我々は、強い配列特異的ＤＮ Ａ結合活性を有するある種の核酸類似体化合物を記載した。そのような化合物の 例はまた、我々により、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５４，１４９７−１５０ ０において開示された。我々は、１０塩基を含むこのタイプの核酸類似体が二本 鎖ＤＮＡの非末端領域にハイブリダイズし、核酸類似体に非相補的なＤＮＡ鎖を Ｓ₁ヌクレアーゼ分解に対して感受性にすることを示した。核酸類似体に相補的 なＤＮＡ鎖の切断の増加は見られず、したがって二本鎖ＤＮＡは切断されなかっ た。 発明の目的 本発明の目的は、ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖に結合する化合物を提供することであ る。 本発明の別の目的は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖とこれらの化合物との間のトリプ レックス構造を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、二本鎖ポリヌクレオチドの１つの鎖に結合して他 の鎖と置き換わることができる、ＲＮＡ以外の化合物を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、そのような化合物を用いる、治療、診断、および 予防の方法を提供することである。 発明の概要 細胞中においては、ＤＮＡは二本鎖構造として存在する。細胞のあるできごと 、例えば転写の間に、または細胞***の間に、二本鎖ＤＮＡの一部は一時的に一 本鎖に変性される。さらに、ＤＮＡを細胞の外で単離し、故意に変性して一本鎖 ＤＮＡにすることができる。ＲＮＡは一般に一本鎖構造として存在する。しかし 、ＲＮＡの二次構造の局所的部分、例えばステムループ構造のステムにおいては 、ＲＮＡは二本鎖構造として存在しうる。 我々は、アミノエチルグリシン主鎖およびポリアミド、ポリチオアミド、ポリ スルフィンアミドおよびポリスルホンアミドを含む他の同様の主鎖に結合してい る核塩基を有するある化合物（我々はこの化合物をペプチド核酸またはＰＮＡと 称する）が、驚くべきことにＲＮＡおよびＤＮＡの双方に強くかつ配列選択的に 結合することを見いだした。 我々は、驚くべきことに、これらのＰＮＡ化合物が、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮ Ａ）を配列選択的かつ鎖選択的に認識してこれに結合することを見いだした。我 々は、二本鎖ＤＮＡへの結合は、鎖置換を介して行われ、ここでＰＮＡはワトソ ン−クリック結合を介してその相補鎖に結合し、他の鎖を事実上一本鎖コンフォ メーションで追い出すことを見いだした。我々はまた、驚くべきことに、これら のＰＮＡ化合物が一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）およびＲＮＡを配列選択的に認識 してこれと結合することを見いだした。 ＰＮＡによる、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの認識は、少なくとも５ 塩基長さの配列において生ずる。より好ましい認識配列の長さは５−６０塩基対 の長さである。１０から２０塩基の間の配列は、この範囲において原核生物およ び真核生物のユニークＤＮＡ配列が見いだされるため、特に興味深い。１７−１ ８塩基の配列は、これがヒトゲノムにおけるユニーク配列の長さであるため、特 に興味深い。 我々はさらに、驚くべきことに、ＰＮＡ化合物がｄｓＤＮＡとともに三重らせ んを形成しうることを見いだした。我々は、ＰＮＡ化合物がＲＮＡおよびｓｓＤ ＮＡとともに三重らせんを形成しうることを見いだした。得られるトリプレック ス、例えば（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡまたは（ＰＮＡ）₂／ＲＮＡは、驚くべきことに 、非常に高い熱安定性を有する。ＰＮＡはいずれの向き（すなわち、ＰＮＡのア ミノ末端が核酸の３’末端に面しているアンチパラレル方向またはＰＮＡのアミ ノ末端が核酸の５’末端に面しているパラレル方向）においてもＤＮＡまたはＲ ＮＡと結合することが見いだされた。ＰＮＡは、第１のＰＮＡ鎖がＲＮＡまたは ｓｓＤＮＡと結合し、第２のＰＮＡ鎖が得られる二重らせんまたは第１のＰＮＡ 鎖と結合して三重らせんを形成することができる。 我々はさらに、ＰＮＡ化合物が、第１のＰＮＡ鎖がｓｓＤＮＡまたはＲＮＡと 結合し、またはｄｓＤＮＡの一方の鎖と結合してそのことにより他方の鎖を置き 換え、次に第２のＰＮＡ鎖が得られる二重らせんと結合して、三重らせんを形成 しうることを見いだした。我々は理論に拘束されることを望むものではないが、 さらに、単一のＰＮＡ鎖が２つの一本鎖の核酸鎖と結合している他の三重らせん が形成されるかもしれないと考えられる。核酸との結合においては、ワトソン− クリックおよびホーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）結合の両方が利用され る。さらに、ＰＮＡはまた逆ホーグスティーン結合を介して結合するかもしれな いと考えられる。 我々はさらに、驚くべきことに、ＰＮＡ化合物がＲＮＡおよびｓｓＤＮＡとと もに二重らせんを形成することを見いだした。そのような二重らせんは、ＰＮＡ とそれぞれの核酸との間のヘテロデュープレックス構造である。そのような二重 らせんは、好ましくは、ＰＮＡ鎖がピリミジンおよびプリン核塩基の両方の混合 物を含む場合に形成されるらせんである。 ＰＮＡ化合物の治療的使用のためには、ＰＮＡ化合物の標的は一般に二本鎖Ｄ ＮＡおよびＲＮＡであろう。ＤＮＡが細胞外で単離される診断的使用、研究方法 および試薬のためには、ＤＮＡを変性して一本鎖ＤＮＡにすることができ、ＰＮ Ａ化合物はそのような一本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡを標的として使用されるであ ろう。 ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡに結合してデュープレックスおよびトリ プレックス複合体を形成するのに有用なＰＮＡ化合物は、ある意味では、主鎖に 沿って間隔をおいて位置している複数のリガンドを有するポリアミド、ポリチオ アミド、ポリスルフィンアミドまたはポリスルホンアミド主鎖から形成されるポ リマー性鎖である。少なくともいくつかのリガンドは、化合物または核酸リガン ドのいずれかの上の他のリガンドと水素結合することができる。 本発明にしたがうより好ましいＰＮＡ化合物は式： ［式中、ｎは少なくとも２であり； Ｌ¹−Ｌⁿのそれぞれは、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に 生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカレーター 、核塩基結合基、複素環部分、およびレポーターリガンドからなる群より独立し て選択され； Ｃ¹−Ｃⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_y［式中、Ｒ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然に生 ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選択され、またはＲ⁶およびＲ⁷は独立して 、水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒド ロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ＮＲ³Ｒ⁴および ＳＲ⁵［式中、Ｒ³およびＲ⁴は上で定義したとおりであり、Ｒ⁵は水素である］、 （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはヒドロキシ置換、アルコキシ置換もしくはアルキ ルチオ置換された（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルからなる群より選択され、または、Ｒ⁶ およびＲ⁷は一緒になって脂環式または複素環式系を形成する］であり； Ｄ¹−Ｄⁿのそれぞれは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_z［式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は上で定義したと おりである］であり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は、 ２より大きいが１０以下であり； Ｇ¹−Ｇ^n-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ− 、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−［式中、Ｒ³は上で定義したとおりである ］であり； Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿのそれぞれは、 （ａ） Ａは式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）または（IIｄ）の基であり、かつ ＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺である；または （ｂ） Ａは式（IIｄ）の基であり、かつＢはＣＨである： ［式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０以 下であり； ｒおよびｓのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０以 下であり； Ｒ¹およびＲ²のそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシまたはアルコキシまた はアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ、ア ルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選択され； Ｒ³およびＲ⁴のそれぞれは、独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキ シまたはアルコキシまたはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）ア ルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノからなる群より選 択される］ ように選択され； Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ₃Ｈもしくは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ"、また は−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；そして Ｉは−ＮＨＲ'"Ｒ""または−ＮＲ'"Ｃ（Ｏ）Ｒ""［式中、Ｒ'、Ｒ"、Ｒ'"および Ｒ""は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、イン ターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、ステロイド 、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドト リホスフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および溶解性およ び不溶性ポリマーからなる群より選択される］ を有する。 上述の構造においてＲ'、Ｒ"、Ｒ"'およびＲ""がオリゴヌクレオチドまたはオ リゴヌクレオシドであるとき、そのような構造はＰＮＡ化合物とオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオシドとの間のキメラ構造であると考えることができる 。ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡに結合してトリプレックス構造を形成す るのに有用な好ましいＰＮＡ含有化合物は、式III、IVまたはＶ： ［式中、それぞれのＬは、独立して、水素、フェニル、複素環式部分、天然に生 ずる核塩基、および天然に生じない核塩基からなる群より選択され； それぞれのＲ７'は、独立して、水素および天然に生ずるαアミノ酸の側鎖から なる群より選択され； ｎは１より大きい整数であり； ｋ、ｌおよびｍのそれぞれは、独立して、０または１から５の整数であり； それぞれのｐは０または１であり； Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そして ＲⁱはＨまたはＣＯＣＨ₃である］ の化合物である。 本発明のＰＮＡ化合物の、一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡとの改良された結合のた め、これらはアンチセンス剤として有用である。さらに、二本鎖ＤＮＡへの結合 のため、これらの化合物は、種々のメカニズムを介する遺伝子阻害に有用である 。さらに、二本鎖ＤＮＡへの結合のため、これらの化合物は転写を開始させる遺 伝子活性化剤として有用である。 一つの態様においては、本発明は、生物の細胞内において特定の遺伝子の発現 を阻害する方法を提供し、この方法は、該遺伝子の配列に特異的に結合する上で 定義した試薬を、該生物に投与することを含む。 別の態様においては、本発明は、生物の細胞内において特定の遺伝子の転写お よび／または複製を阻害する、または例えば二重鎖ＤＮＡの特定の領域の分解を 誘導することにより二本鎖ＤＮＡを修飾する方法を提供し、この方法は、上で定 義した試薬を該生物に投与することを含む。 さらにべつの態様においては、本発明は、細胞またはウイルスを殺す方法を提 供し、この方法は、該細胞またはウイルスを、該細胞またはウイルスのゲノムの 配列と特異的に結合する上で定義した試薬と接触させることを含む。 二本鎖ＤＮＡの配列選択的切断のための新規な方法が記載される。近くに位置 する２つのホモピリミジンストレッチ（７−１０塩基の、および好ましくは反対 の鎖上の）を同定することができる場合には、これは、このＤＮＡ配列の２つの 部分に相補的でありかつ数塩基対離れているＰＮＡの対を合成することにより行 うことができる。次に、これらのＰＮＡ分子をｄｓＤＮＡと反応させ、得られる 複合体をエンドヌクレアーゼと反応させる。 本発明のある態様の実施においては、ＰＮＡ化合物は１つの鎖を置換すること によりデュープレックスＤＮＡを認識し、このことによりおそらくはもう一方の 鎖とヘテロデュープレックスを生成することができる。このような認識は、長さ ５−６０塩基対のｄｓＤＮＡ配列に対して起こる。１０から２０塩基の間の配列 は、この範囲において原核生物および真核生物のユニークＤＮＡ配列が見いださ れるため、興味深い。１７−１８塩基を認識する試薬は、これがヒトゲノムにお けるユニーク配列の長さであるため、特に興味深い。 ＰＮＡ化合物は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡとともに三重らせんを 、ＲＮＡまたはｓｓＤＮＡとともに二重らせんを形成することができる。本発明 の１つの態様においては、ＰＮＡ化合物は、第１のＰＮＡ鎖が核酸鎖と結合して ヘテロデュープレックスを形成し、次に第２のＰＮＡ鎖が得られるヘテロデュー プレックスと結合している三重らせんを形成する。本発明の他の態様においては 、ＰＮＡ化合物またはＰＮＡキメラ化合物は、単一のＰＮＡ鎖またはＰＮＡキメ ラ鎖が２つの核酸鎖と、１つの核酸鎖および１つのＰＮＡキメラ鎖と、または２ つのキメラＰＮＡ鎖と結合している三重らせんを形成する。 本発明はさらに、核酸中の制限部位において制限酵素の作用を阻害する方法を 提供する。このような方法は、核酸を、上で定義した試薬が制限部位の近傍にお いて核酸に結合するのに有効な条件下で該試薬と接触させることを含む。 本発明はさらに、ＤＮＡを制限部位の近傍において上で定義した試薬と結合さ せ、ＤＮＡを制限酵素で切断し、切断された生成物を同定することによる、ＤＮ Ａのシークエンス方法を提供する。 本発明はさらに、細胞または生物中において転写を開始させる方法を提供し、 該方法は、生物に、そのような細胞または生物において遺伝子の転写を開始させ る上で定義した試薬を投与することを含む。 本発明はさらに、ｄｓＤＮＡをそのＤＮＡと結合する上で定義した試薬と結合 させ、次にそのようにして形成された複合体をＲＮＡポリメラーゼに露出するこ とによる、ＲＮＡポリメラーゼのｄｓＤＮＡへの結合を変調させる方法を提供す る。 本発明はさらに、遺伝子を、遺伝子と相互作用する上で定義した試薬と結合さ せ、遺伝子の二本鎖ＤＮＡを融解させて転写伸長ループを形成することによる、 遺伝子の転写を開始させる方法を提供する。 本発明はさらに、ｄｓＤＮＡを、ＤＮＡと相互作用しうる上で定義した試薬と 接触させ、次にそのようにして形成された複合体をＲＮＡポリメラーゼに露出す ることによる、ＲＮＡポリメラーゼをｄｓＤＮＡに結合させる方法を提供する。 特に、相互作用は該ｄｓＤＮＡへの結合を介するものである。 本発明はさらに、転写を変調するためのハイブリッド複合体を形成し、ここで 該複合体はｄｓＤＮＡおよびそのｄｓＤＮＡと結合する上で定義した試薬、およ びＲＮＡトランスフェラーゼを含む。 本発明はさらに、ｄｓＤＮＡおよびそのｄｓＤＮＡと相互作用しうる上で定義 した試薬を含む、合成転写因子を提供する。特に、相互作用は該ｄｓＤＮＡへの 結合を介するものである。 本発明はさらに、遺伝子の選択されたＤＮＡ領域に結合する特定の配列を有す る上で定義した第１および第２の鎖を含む、特異的遺伝子活性化剤を提供する。 本発明はさらに、ＰＮＡおよびＤＮＡまたはＲＮＡを含むキメラ構造を提供す る。このようなキメラ構造を、正常なＰＮＡ鎖の代わりにもしくはそれに加えて 用いて、デュープレックス形成、トリプレックス形成、核酸結合または蛋白質結 合を行うことができる。 図面の簡単な説明 図１は、Ｓ₁ヌクレアーゼおよび核酸類似体とハイブリダイズするための単一 の部位を有する二本鎖ＤＮＡの核酸類似体による、配列特異的様式での切断を示 す臭化エチジウム染色ゲルである（実施例１）。 図２は、同一のＤＮＡ鎖上に核酸類似体にハイブリダイズするための２つの非 常に近接した部位を有する二本鎖ＤＮＡの同様の切断を示す、臭化エチジウム染 色ゲルである（実施例２）。 図３は、反対のＤＮＡ鎖上に核酸類似体にハイブリダイズするための２つの非 常に近接した部位を有する二本鎖ＤＮＡの同様の切断を示す、臭化エチジウム染 色ゲルである（実施例３）。 図４は、ＰＮＡ−Ｔ₁₀、−Ｔ₉Ｃおよび-Ｔ₈Ｃ₂が高い配列特異性をもって二本 鎖ＤＮＡに結合することを示すＰＡＧＥオートラジオグラフである。 図５は、ＰＮＡが制限酵素認識部位の近傍に結合したときにＤＮＡに対する制 限酵素活性が阻害されることを示す電気泳動ゲル染色である。 図６は、ＰＮＡ−Ｔ₁₀の二本鎖標的に対する結合の動力学を示す、ＰＡＧＥオ ートラジオグラフの密度スキャンに基づくグラフである。 図７は、Ａ₁₀／Ｔ₁₀二本鎖ＤＮＡ標的に結合した種々の長さのＰＮＡの熱安定 性を示す、ＰＡＧＥオートラジオグラフの密度スキャンに基づくグラフである。 図８は、ホーグスティーンおよびワトソンクリック水素結合を有するＣ⁺Ｇ− ＧおよびＴ Ａ−Ｔトリプレットの図式的モデルである。 図９は、ＰＮＡ（Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄）の二本鎖ＤＮＡ標的への結合の図式的モデ ルである。 図１０は、ＰＮＡのダイマー標的に対する結合のフットプリント実験を示す。 図１１は、ＰＮＡのモノマー標的に対する結合のフットプリント実験を示す。 図１２は、チミン／シトシン含有ＰＮＡの二本鎖ＤＮＡに対する結合に及ぼす ｐＨおよび塩の影響を示すフットプリント実験である。 図１３は、ＰＮＡ二本鎖ＤＮＡ複合体の電子顕微鏡写真である。 図１４は、図１３の実験において得られた結果のヒストグラム表示である。 図１５は、ＰＮＡ結合に伴うＤＮＡの巻き戻し（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）を示す 一次ゲル電気泳動実験である。 図１６は、ＰＮＡ結合に伴うＤＮＡの巻き戻しを示す二次ゲル電気泳動実験で ある。 図１７ａは、ゲル電気泳動実験におけるＰＮＡの塩依存性結合を示す。 図１７ｂは、ゲル電気泳動実験におけるＰＮＡ−ＤＮＡ複合体の塩耐性を示す 。 図１８は、ＰＮＡによる配列選択的転写阻害を示すオートラジオグラムである 。 図１９は、ＰＮＡによるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの配列特異的阻害を示す オートラジオグラムである。 図２０は、ＰＮＡ Ｔ₁₀による転写阻害の濃度依存性を示すオートラジオグラ ムである。 図２１は、ＰＮＡ Ｔ₄ＣＴ₂ＣＴ₂を用いた、図２０と同様の図である。 図２２は、図２０および２１の結果の定量的表示である。 図２３は、種々のＰＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼを用いた転写停止の結果を 示すオートラジオグラムである。 図２４は、図２３の続きである。 図２５は、鋳型鎖対非鋳型鎖に結合したＰＮＡの転写に及ぼす特異的影響を示 すオートラジオグラムである。 図２６は、短い（Ｔ₆およびＴ₈）ＰＮＡによる転写停止を示すオートラジオグ ラムである。 図２７は、ＰＮＡ−ＤＮＡ転写開始複合体の概要図である。 図２８は、ＰＮＡによる転写開始を示すオートラジオグラムである。 図２９は、「ＰＮＡプロモーター」対強いｌａｃＵＶ５プロモータの有効な競 合を示すオートラジオグラムである。 図３０は、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の図式的構造およびＰＮＡ標的の配列を示す 。 図３１は、プラスミド地図である。 図３２は、インビトロ転写の部位特異的終結を示すＰＡＧＥオートラジオグラ フである。 図３３は、インビトロ転写のＰＮＡ介在終結に及ぼす標的部位の向きの影響を 示すＰＡＧＥオートラジオグラフである。 図３４は、ＰＮＡ活性に及ぼす塩濃度の影響を示すＰＡＧＥオートラジオグラ フである。 図３５は、ＰＮＡ活性に及ぼすｐＨの影響を示すＰＡＧＥオートラジオグラフ である。 図３６は、ＰＮＡの相補体に対するインビトロ結合における、Ｋ_D対ｐｈおよ びＫ_D対イオン強度をプロットしたチャートである。 図３７は、ハイブリッドデュープレックス結合の融解温度を示すチャートであ る。 図３８は、ハイブリッドデュープレックス結合の融解温度を示すチャートであ る。 図３９は、ＰＮＡの末端標識オリゴヌクレオチドに対するゲルシフト結合によ る滴定を示すＰＡＧＥオートラジオグラフである。 図４０は、円偏光二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）スペクト ルである。 図４１は、別の円偏光二色性スペクトルである。 図４２は、化学スキームである。 図４３は、別の化学スキームである。 発明の詳細な説明 本発明の目的のためには、「プリンリッチ」との用語は、プリン塩基が優勢で ある（すなわち、５０％より多い）ことを意味し、好ましくは約６５％より多く 、最も好ましくは約９０％より多い。また、「修飾する」との用語は、その結果 が修飾されるものとは本質的に異なるように、加え、減じ、切断し、または他の ことにより特性を変化させることを意味する。「変調させる」との用語は、特性 の大きさを変化（すなわち増加または減少）させることを意味する。 本発明に従えば、リガンドＬは、主として、天然に見いだされる位置、すなわ ち、アデニン、グアニンまたはイノシンを含むプリンについては９位において、 チミン、ウリジンまたはシトシンを含むピリミジンについては１位において結合 している、天然に生ずる核塩基である。あるいはまた、Ｌは天然に生じない核塩 基（核塩基類似体）、他の塩基結合部分、芳香族部分、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイ ル、ヒドロキシ、または水素であってもよい。核塩基との用語は、除去しうる保 護基を有する核塩基を含むことが理解されるであろう。いくつかの典型的な核塩 基リガンドおよび例示的合成リガンドは、ＷＯ９２／２０７０２の図２に示され る。２つの特別の核塩基リガンドである、５−プロピニルチミンおよび３−デア ザウラシルは、オリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチドへの結合親和性を増加さ せることが示されている（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９２，３３，５３０７−５３１０および 米国特許第５，１３４，０６６号を参照のこと）。他の同様の類似体は、Ｓａｇ ｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９３， ３４：２１９１−２１９４に記載されている。これらの核塩基を取り込ませて、 ＰＮＡ生成物の核酸標的との結合親和性を増加させることができる。別の有用な 天然に生じない核塩基には、６−チオグアニン（すなわち、プリン−６（１Ｈ） −チオン）が含まれ、ピラゾロ［４，３ｄ］−ピリミジンはトリプレックス形成 塩基として特に有用である（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４７９５を参照のこ と）。 さらに、Ｌは、ＤＮＡインターカレーター、レポーターリガンド、例えばフル オロフォア、放射性標識、スピン標識、ハプテン、またはビオチン等の蛋白質認 識リガンドでありうる。モノマーシントンにおいては、Ｌは、ＷＯ９２／２０７ ０２の図４に図示されるように、保護基により保護されていてもよい。 リンカーＡは、−ＣＲ¹Ｒ²ＣＯ−、−ＣＲ¹Ｒ²ＣＳ−、−ＣＲ¹Ｒ²ＣＳｅ−、 −ＣＲ¹Ｒ²ＣＮＨＲ³−、−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ＝ＣＨ₂−および−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ＝Ｃ（ＣＨ₃ ）₂−［式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は上で定義したとおりである］等の、広範な 基でありうる。好ましくは、Ａは、メチレンカルボニル（−ＣＨ₂ＣＯ−）、ア ミド（−ＣＯＮＲ³−）、またはウレイド（−ＮＲ³ＣＯＮＲ³−）である。Ａは また、プロパノイル、ブタノイルもしくはペンタノイル、またはＯがＸの他の値 で置換されているかまたは鎖がＲ¹Ｒ²で置換されているかもしくはＹを含むヘテ ロジニアスなものである対応する誘導体等の、より長い鎖の部分でありうる。さ らに、Ａは、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキレン鎖、またはＲ¹Ｒ²で置換されている（Ｃ₂ −Ｃ₆）アルキレン鎖またはＹを含むヘテロジニアスなものでありうる。特定の 場合においては、Ａは単なる単結合でありうる。 本発明の１つの好ましい形態においては、Ｂは窒素原子であり、このことによ りアキラル主鎖の可能性を提示している。Ｂはまた、Ｒ³Ｎ⁺（ここでＲ³は上で 定義したとおりである）またはＣＨである。 本発明の好ましい形態においては、Ｃは−ＣＲ⁶Ｒ⁷−であるが、二炭素単位、 すなわち−ＣＨＲ⁶ＣＨＲ⁷−または−ＣＲ⁶Ｒ⁷ＣＨ₂−（ここでＲ⁶およびＲ⁷は 上で定義したとおりである）であってもよい。Ｒ⁶およびＲ⁷はまた、例えばピロ リル、フリル、チエニル、イミダゾリル、ピリジル、ピリミジニル、インドリル 等のヘテロアリール基であってもよく、または一緒になって、１，２−シクロブ タンジイル、１，２−シクロペンタンジイルまたは１，２−シクロヘキサンジイ ル等の脂環系を完成してもよい。 本発明の好ましい形態においては、モノマーシントン中のＥは、ＣＯＯＨまた はその活性化誘導体であり、オリゴマー中のＧは−ＣＯＮＲ³−（アミド）であ る。上で定義したように、Ｅはまた、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ₂ＯＨまたはそ れらの活性化誘導体であってもよく、したがって、オリゴマー中のＧはそれぞれ 、−ＣＳＮＲ³−（チオアミド）、−ＳＯＮＲ³−（スルフィンアミド）および− ＳＯ₂ＮＲ³−（スルフォンアミド）となる。基Ｇはいずれの向きであってもよい 。例えば、アミドについては−ＣＯＮＲ₃−または−Ｒ₃ＮＣＯ−である。活性化 は、酸無水物または活性エステル誘導体を用いて行うことができ、ここでＥによ り表される基の水素は、成長しつつある主鎖を生じさせるのに適当な脱離基によ り置き換えられている。 主鎖を形成するアミノ酸は、同一であっても異なっていてもよい。２−アミノ エチルグリシン系のものが特に本発明の目的に適していることが見いだされた。 場合によっては、いずれかの末端（Ｑ，Ｉ）にリガンドを結合させて、ＰＮＡ の結合特性を変調させることも興味深い。代表的なリガンドとしては、ｄｓＤＮ Ａ結合を改良するＤＮＡインターカレーター、または静電気的相互作用によりＰ ＮＡの結合を強くするリシンまたはポリリシン等の塩基性基が挙げられる。負に 荷電した基を減少させるために、カルボキシおよびスルホ基等を用いることがで きる。シントンの設計により、さらにそのような他の部分を非末端に位置させる ことができる。オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオシドを、末端 位置ＱまたはＩに共有結合させて、ＰＮＡ部分およびオリゴヌクレオチドおよび ／またはオリゴヌクレオシド部分を含むキメラを形成することができる。ヌクレ オシドおよび／またはヌクレオチド（モノ、ジまたはトリホスフェート）もまた 、末端位置に結合させることができる。 本発明のさらに別の観点においては、ＰＮＡオリゴマーを、低分子エフェクタ ーリガンド、例えばヌクレアーゼ活性もしくはアルキル化活性を有するリガンド またはレポーターリガンド（蛍光、スピン標識、放射活性、ビオチンまたはハプ テン等の蛋白質認識リガンド）とコンジュゲートさせる。本発明のさらに別の態 様においては、ＰＮＡをペプチドまたは蛋白質とコンジュゲートさせ、ここでペ プチドはシグナリング活性を有し、蛋白質は例えば酵素、転写因子または抗体で ある。また、ＰＮＡを水溶性または水に不溶性のポリマーに結合させてもよい。 本発明の他の観点においては、ＰＮＡをオリゴヌクレオチドまたは炭水化物とコ ンジュゲートさせる。許容される場合には、ＰＮＡオリゴマーは固体支持体に結 合したある部分（例えば、ペプチド鎖、レポーター、インターカレーターまたは 他のタイプのリガンド含有基）の上で合成してもよい。 そのようなコンジュゲートは、遺伝子変調（例えば、遺伝子を標的とする薬剤 ）に、診断に、バイオテクノロジーに、および科学的目的のために用いることが できる。 本発明のさらに別の観点として、ＰＮＡを用いてＲＮＡおよびｓｓＤＮＡを標 的化し、アンチセンスタイプ遺伝子制御部分および核酸の同定及び精製用のハイ ブリダイゼーションプローブの両方を製造することができる。さらに、ＰＮＡを ｄｓＤＮＡとともに三重らせんを形成するように修飾することもできる。配列特 異的にｄｓＤＮＡに結合する試薬は、遺伝子を標的とする薬剤としての適用を有 する。これらは、癌、ＡＩＤＳおよび他のウイルス感染等の疾患を治療するため に非常に有用な薬剤として予見され、また、いくつかの遺伝的疾患の治療にも有 効であろう。さらに、これらの試薬は、特定の核酸の検出及び単離のために、研 究および診断において用いられるだろう。 オリゴヌクレオチドがｄｓＤＮＡとともにトリプレックス形成する三重らせん 形成は、ｄｓＤＮＡの配列特異的認識のための、当該技術分野において知られる 唯一の手段であると考えられる。しかし、三重らせん形成は、ホモプリン−ホモ ピリミジン配列の認識にほぼ限定されている。本発明のＰＮＡを用いる鎖置換を ともなうトリプレックス形成は、４つの天然塩基を用いていかなる配列の認識を も可能にする点において、オリゴヌクレオチド−ｄｓＤＮＡ三重らせん認識より も優れている。 遺伝子を標的とする薬剤は、標的遺伝子の制御領域（プロモーター）に相補的 な核塩基配列（１０−２０単位を含む）を用いて設計される。従って、薬剤を投 与すると、それはプロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼがそれに接近する ことを遮断する。その結果、ｍＲＮＡは製造されず、従って遺伝子産物（蛋白質 ）は製造されない。ウイルスの場合、標的がウイルス遺伝子内にあれば、生存可 能なウイルス粒子は製造されないであろう。あるいはまた、プロモーターの下流 を標的とすると、ＲＮＡポリメラーゼはこの位置において終止し、切断されて機 能を有しないｍＲＮＡ／蛋白質が形成される。 塩基相補的ハイブリダイゼーションによるｓｓＤＮＡの配列特異的認識から、 特定の遺伝子及びウイルスの標的化を引き出すことができる。この場合、標的配 列は、薬剤の標的への結合がリボソームの作用およびその結果としてのｍＲＮＡ から蛋白質への転写を隠すように、ｍＲＮＡ中に含まれる。本発明のペプチド核 酸は、相補的ｓｓＤＮＡに対して著しく高い親和性を有している点において、従 来の薬剤より優れている。ＰＮＡは、リシン部分等の荷電種を加えることもでき るが、電荷を有さず、水溶性であり（細胞への取り込みがより容易になる）、こ れらは非生物学的アミノ酸のアミドを含む（生物学的に安定となり、プロテアー ゼ等の酵素による分解に対して耐性となる）。さらに、これらは、ｍＲＮＡとと もにトリプレックスを形成することができる。 本発明において用いられるＰＮＡ化合物は、ＷＯ９２／２０７０２、ＷＯ９２ ／２０７０３および上述の代理人書類番号ＩＳＩＳ−１０１７を有する米国特許 出願に開示される方法論により合成することができる。これらの開示にしたがう モノマーシントンを、標準的な方法を用いてカップリングさせ、所望のＰＮＡオ リゴマー配列を得る。別の合成モノマーの合成は、本明細書の実施例３３から４ ５に記載されている。 鎖置換を伴うＰＮＡ化合物の二本鎖ＤＮＡへの結合は、酵素的および化学的プ ロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）の両方により、本明細書中の例示的実施例に示さ れている。これらの例示的実施例は、ＰＮＡ化合物がワトソン−クリック結合を 介してその相補鎖に結合し、他の鎖を実質的に一本鎖コンフォメーションで追い 出すことを示している。 ＰＮＡ化合物を用いてＤＮＡデュープレックスを局所的に巻き戻し、鎖置換を 行うことにより、置換されたＤＮＡ鎖を切断（例えばＳ₁ヌクレアーゼによる切 断）に対して感受性にすることができる。このことは、ＰＮＡ結合部位における 高い収量の二本鎖ＤＮＡ破壊を与えるかまたは誘導する。Ｓ₁ヌクレアーゼによ るＰＮＡ指示性かつＰＮＡ誘発性の二本鎖ＤＮＡ切断は、２つの隣接するＰＮＡ 部位を標的とする場合に特に有効であり、標的部位の二本鎖破壊への定量的変換 を生ずる。 人工的制限酵素としての使用の例示的実施例として、標的をｐＵＣ１９ポリリ ンカー中にクローニングして、プラスミドをＣｆｒ１０Ｉ制限酵素で線状にする 。線状ＤＮＡにおいては、得られるポリリンカー領域は中程（一方の末端から１ ．３３ｋｂであり、他方の末端から１．３６ｋｂ）にある。次に、既知の配列を 有するＰＴ１０プラスミドを、ポリリンカー中の単一のＢａｍＨＩ部位に挿入す る。これを相補的ＰＮＡ化合物とともに複合体化し、Ｓ₁ヌクレアーゼで処理す る。得られるフラグメントのゲル電気泳動に示されるように、ヌクレアーゼ処理 によってＤＮＡの有意のフラクションが切断される。交差反応性試験は、標的化 が配列特異的であることを示す。すなわち、対応するＰＮＡのみが標的の切断を 介在した。消化された分子の収量は高く、ヌクレアーゼへの露出を増加させるこ とによって定量的消化に達することができる。 このような処理の結果は、二本鎖ＤＮＡの配列選択的切断の新規な方法を実証 する。近くに位置する２つのホモピリミジンストレッチ（例えば７−１０塩基、 好ましくは反対側の鎖の上の）を同定することができれば、このことは、このＤ ＮＡ配列の２つの部分に相補的でありかつ数塩基対離れているＰＮＡの対を合成 することにより行うことができる。この鎖置換結合モードを、チミンおよびシト シンを含むＤＮＡ配列を認識するＰＮＡを含むように広げれば、この方法により １０−２０塩基対のいかなる所望の配列をも標的化しかつ特異的に切断すること ができる。そのような切断を行う場合には、２つのＰＮＡ鎖（１つは「ワトソン −クリック」であり１つは「ホーグスティーン」である）および１つのＤＮＡ鎖 からなるＰＮＡ−ＤＮＡ複合体の高い安定性、ならびに「ホーグスティーン様」 鎖の配列を考慮しなければならない。 我々は、ホモピリミジンＰＮＡと相補的オリゴヌクレオチドとの間の複合体が ２：１の化学量論を示すことを見いだした。さらに、我々は、シトシン含有ホモ ピリミジンＰＮＡと相補的オリゴヌクレオチドとの間のトリプレックスの熱安定 性が強いｐＨ依存性を有することを見いだした。このことは、（ＰＮＡ）₂／Ｄ ＮＡトリプレックスにＣ⁺Ｇ−Ｃホーグスティーン水素結合が関与することを示 す。さらに、我々はいかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではない が、ホモピリミジンＰＮＡのｄｓＤＮＡへの鎖置換結合は、ｄｓＤＮＡ標的の相 補的鎖とのそのような（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡトリプレックスの形成に依存してい ると考えられる。現在のところ、鎖置換複合体の形成は、ＤＮＡ／ＰＮＡワトソ ン−クリックデュープレックスを介して進行し、次に、Ｃ⁺−Ｇホーグスティー ン水素結合を有しホーグスティーン結合している第２の鎖により安定化されると 考えている。 トリプレックス形成および鎖置換のさらなる研究においては、シトシン含有ホ モピリミジンＰＮＡ（Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂；配列番号１）を用いて、ダ イマー標的に対するその結合を研究した。複合体の安定性は、ジメチルサルフェ ート（ＤＭＳ）プロービングおよびＫＭｎＯ₄プロービングの両方により調べた 。これらの研究において、我々は、三本鎖形成にはホーグスティーン水素結合が 関与することを見いだした。このことは、我々が、標的のグアニンのＮ７原子が 塩基対形成に関与し、したがって、ＰＮＡのトリプレックス形成結合の際にＤＭ Ｓとの反応から保護されることを示したことにより証拠づけられた。このトリプ レックス形成結合のモデルは図８および図９に示される。 我々はまた、電子顕微鏡を用いて鎖置換を確認した。これらの実施例において は、標的とともにＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を形成した。標的を完全に占領すると、 電子顕微鏡により検出して９０−１００塩基の鎖置換ループが生じた。ＤＮＡ分 子は「目」の形態のオープン領域を有する。すべての場合において、オープン領 域中の２つの鎖の一方は他方より太く、正常なＤＮＡデュープレックスと同様の 太さを有する。太い方の鎖は、ＰＮＡにより覆われている鎖に対応し、細い方の 鎖は置換された鎖に対応する。ＰＮＡを加えずに実施した対照実験においては、 置換された構造は観察されない。 また、標識ＤＮＡフラグメントを用いて種々のＰＮＡ化合物で試験することに より、標的への結合におけるＰＮＡ化合物の区別を観察した。ＰＮＡ化合物は高 い優先性をもって相補的標的に結合することが示された。標的中のミスマッチの 増加に伴って、結合は減少する。１つのミスマッチを含む標的への結合は、完全 に相補的な標的への結合よりも弱く、２つのミスマッチを含む標的については結 合は観察されなかった。 我々はさらに、複合体の熱安定性により測定して、オリゴヌクレオチドの相補 鎖に対する塩基対特異的ハイブリダイゼーションに関して、ＰＮＡ化合物が真に ＤＮＡを模倣することを見いだした。ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスの形成が ＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックス形成の場合とほぼ同一のエントロピーの減少を 示すこと、およびこれがＤＮＡ／ＤＮＡの形成と同様に強いエンタルピー推進性 であることが示された。このことから、一本鎖ＰＮＡは一本鎖ＤＮＡと同一の程 度の塩基スタッキングを有するに違いなく、したがって高度に構造化されている ようであることが推論される。さらに、我々は、ＰＮＡ／ＲＮＡデュープレック スのハイブリダイゼーション速度が、少なくとも２’−Ｏ−メチルＲＮＡ／ＲＮ ＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックス形成と同程度に早いことを見いだした 。このことは、一本鎖ＰＮＡは少なくともＤＮＡまたはＲＮＡと同程度に、デュ ープレックス形成のために前構造化（ｐｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）されている という我々の知見を支持する。 さらに、我々は、ＤＮＡまたはＲＮＡとは対照的に、ＰＮＡ化合物は２つの方 向（パラレル方向またはアンチパラレル方向）の一方において相補的ＤＮＡまた はＲＮＡに結合することを見いだした。我々はさらに、ＰＮＡ化合物がパラレル 方向（ＰＮＡ鎖のアミノ末端が核酸の５’末端と相補的である）よりもアンチパ ラレル方向（ＰＮＡ鎖のアミノ末端が核酸の３’末端と相補的である）を好むこ とを見いだした。 我々の研究において、我々は、ホモピリミジンＰＮＡがｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮ ＡまたはＲＮＡに２：１の化学量論で強く結合（トリプレックス形成）し、ｄｓ ＤＮＡと安定な鎖置換複合体を形成することを示してきた。さらに、プリン−ピ リミジンＰＮＡはワトソン−クリック相補的オリゴヌクレオチド（ＲＮＡまたは ＤＮＡのいずれか）に１：１の化学量論で結合する。本発明の１つの態様は、こ れらの知見を利用して、ＰＮＡ化合物をＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの伸長 活性の有効な阻害剤として用いることに関する。このことにより、オリゴヌクレ オチドとは対照的に、ＰＮＡ化合物を、ゲノムのプロモーターまたは制御領域の みならず他の領域をも標的として用いることが可能となる。さらに、ＰＮＡのｄ ｓＤＮＡへの有効な結合にはデカマー標的のみが必要である。したがって、適当 なＰＮＡ標的を同定することは、オリゴヌクレオチド三重らせん標的と比較して 容易である。 さらに、我々は、ＰＮＡ化合物が、原核生物系および真核生物系の両方におい て、転写に対してある影響を有することを見いだした。プラスミドｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ ＫＳ⁺Ｔ₃またはＴ₇プロモーターの下流に位置したｄｓＤＮＡ標的 Ａ₁₀（配列番号３）、Ａ₅ＧＡ₄（配列番号４）およびＡ₂ＧＡ₂ＧＡ₄（配列番号 ５）に結合したＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）およびＴ₂ＣＴ₂ＣＴ₄ −ＬｙｓＮＨ₂（配列番号１）の、ＲＮＡポリメラーゼＴ₃またはＴ₇による転写 を研究した。以下の例示的実施例に示されるように、転写伸長は鋳型鎖へのＰＮ Ａの結合の部位において停止し、一方、非鋳型鎖へのＰＮＡの結合の部位におい てはわずかの影響しか観察されなかった。ＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番 号２）については、転写停止はＰＮＡ結合部位の第１の塩基において生じたが、 ＰＮＡ Ｔ₅ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号６）による停止は、ＰＮＡ結合部位 の２−３塩基内側で起こった。ＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙＳＮＨ₂（配列番号 １）の場合には、停止はより効果が低く、結合部位の最後の１−３塩基において 生じた。 転写停止はまた、ＰＮＡ Ｔ₆−ＬｙｓＮＨ₂（配列場合７）およびＴ₈−Ｌｙ ｓＮＨ₂についても示されたが、より長いＰＮＡ化合物と比較して有効性はより 低かった。これらの結果は、有効な転写伸長停止は、ＰＮＡを転写される鎖に標 的化することによって得ることができ、ポリメラーゼによる「リードスルー」は 配列依存的様式で起こることを示す。 ＰＮＡ化合物について、真核生物系における転写停止をさらに示した。これら の研究においては、ウイルスＤＮＡ配列の転写を推進するＣＭＶ ＩＥ １プロ モーターを含むプラスミドを構築した。ＰＮＡのためのホモプリン標的部位を含 むウイルスＤＮＡ配列を、ＣＭＶ ＩＥ １プロモーターの下流にクローニング した。プラスミドをＰＮＡオリゴマーとともに種々の条件下でインキュベートし 、次に真核生物核抽出物に加えて、インビトロ転写を開始させた。転写物はＰＮ Ａ結合部位において特異的にトランケートされた。この効果は、ＰＮＡの鋳型鎖 に対するハイブリダイゼーションに依存し、すなわち、転写の阻害は配列特異的 であった。結合親和性は、イオン強度または結合緩衝液のｐＨを低くすることの いずれかにより増加した。これらの結果は、ホモピリミジンＰＮＡがデュープレ ックスＤＮＡに侵入して相補的ＤＮＡ鎖と結合し非相補鎖を置き換えるＰＮＡ結 合と一致する。次に第２のＰＮＡがＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスと相互作用 して安定な三本鎖構造を形成し、これは、ＲＮＡポリメラーゼIIを遮断して転写 を終結させ、したがって真核生物遺伝子の発現を特異的に阻害することができる 。このような真核生物遺伝子発現の阻害におけるＰＮＡ化合物の使用により、Ｐ ＮＡ化合物は抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）治療に有用となる。 本発明の別の態様においては、我々は、ＰＮＡ化合物はまた配列特異的遺伝子 活性化剤および合成転写因子として用いうることを見いだした。ＲＮＡポリメラ ーゼによる転写開始には、ポリメラーゼそれ自身によるかまたは補助的転写因子 による二本鎖ＤＮＡプロモーターの配列特異的認識が関与する。次に、転写開始 オープン複合体が形成され、ここではＤＮＡらせんの約１２塩基対が融解してい る。これは鋳型鎖の塩基を、合成されつつあるＲＮＡ鎖との塩基対形成のために 露出する。大腸菌ファージＴ₇ＲＮＡポリメラーゼが、転写伸長のために、ＲＮ Ａ／ＤＮＡデュープレックスおよび一本鎖ＤＮＡ Ｄ−ループを含む合成「ＲＮ Ａ／ＤＮＡバブルデュープレックス」複合体を使用しうることが示されている。 我々は、ホモピリミジンＰＮＡもまた、鎖置換により相補的二本鎖ＤＮＡに結合 するときにＤ−ループ構造を形成することを見いだした。これらの構造はＲＮＡ ／ＤＮＡオープン複合体構造と同様にふるまい、ＲＮＡポリメラーゼにより認識 されると考えられる。 以下の例示的実施例においては、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼが実際にＰＮＡ／ ｄｓＤＮＡ鎖置換複合体に結合し、ここからＲＮＡ転写を開始させることが示さ れる。これらの実施例の結果はさらに、転写開始および伸長に際して、一本鎖Ｄ ＮＡループがＲＮＡポリメラーゼの主要な構造的決定因子であることを示唆する 。これらの実施例の結果はまた、ＲＮＡポリメラーゼの作用のメカニズムを説明 するための暗示を有する。 本発明の別の態様においては、ＰＮＡとＲＮＡまたはＤＮＡとの間にキメラ鎖 を形成する。次に、このようなキメラ鎖を上述の「ホモ」ＰＮＡ鎖と同様に用い ることができる。したがって、このようなキメラ構造を、上述のように、結合、 デュープレックス形成、トリプレックス形成等に用いることができる。１つの特 に好ましい使用においては、ＰＮＡ鎖またはＰＮＡ含有キメラ鎖を用いて、細胞 中の蛋白質に結合させ、またはこれを変調させることができる。そのような蛋白 質には、転写因子および他の制御蛋白質が含まれる。 ＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のキメラ構造を、正常なＰＮＡ鎖の代わり にまたはそれに加えて用いて、デュープレックス形成、トリプレックス形成、核 酸結合または蛋白質結合を生じさせることができる。このようなキメラ構造のＲ ＮＡまたはＤＮＡ核酸部分は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホ ロジチオエート、アルキルホスホネート、水素ホスホネート、ホスホトリエステ ル、ホスホルアミダイトおよび他の同様のリン酸連結を介して連結された核酸を 含む。これらはさらに、リボース糖の２’位における置換等の他の置換を含むこ とができる。特に好ましいものは、キメラの核酸部分の他の核酸に対する親和性 を増加させるため、２’−デオキシ−２’−フルオロであり、また、核酸鎖にヌ クレアーゼ耐性を与えるため、２’−Ｏ−アルキル、特に２’−Ｏ−プロピル、 ２’−Ｏ−アリル等である。 以下の実施例は本発明を例示するために示されている。これらの実施例は例示 目的のためであり、本発明を制限することを意図するものではない。 実施例１ ＰＮＡオリゴマーの合成の一般的方法 ＰＮＡオリゴマー性化合物は、一般にＷＯ９２／２０７０２、ＷＯ９２／２０ ７０３および代理人書類番号ＩＳＩＳ−１０１７を有する上述の米国特許出願に 開示される方法にしたがって製造した。他のＰＮＡモノマーは、以下の実施例３ ４−４６のように製造した。簡単には、ベンジヒドリルアミン樹脂（最初に０． ２８ｍｍｏｌ／ｇｍをＢｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（２−クロロベンジルオキシカルボニ ル）とともに負荷）をＤＭＦ中に膨潤させ、カップリングされるべきモノマーを 過剰に加え、次にジシクロヘキシルカルボジイミド（ジクロロメタン中５０％Ｄ ＭＦ中０．１５Ｍ）を加えた。トリフルオロ酢酸処理によりＢｏｃを脱保護した 。カップリング反応の進行は、定性的または定量的ニンヒドリン分析によりモニ ターした。無水ＨＦまたはトリフルオロメチル硫酸を用いて、標準的な条件下で ＰＮＡを樹脂からはずした。アセトニトリル−水（０．１％ＴＦＡ）勾配を用い るＨＰＬＣにより生成物を精製し、高速原子衝撃質量分析により構造を確認した 。 これらの方法により合成された代表的な配列は、以下の配列並びに種々の実施 例において記載される配列を含む： ＰＮＡはアミノ末端からカルボキシ末端へと書かれている。ＬｙｓＮＨ₂はＰ ＮＡに結合するリシンアミドを表示し、そしてＮＨ₂はリシンを含まない遊離の Ｃ−末端カルボキシアミドを示す。 実施例２Ｃｆｒ ｌＯＩ制限酵素で線状とし、かつＰＮＡと複合体形成させてあるｐＴｌＯ プラスミド（二本鎖標的）の部位特異的Ｓ₁ヌクレアーゼ消化 ＰＮＡ Ｈ−Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）を実施例１に記載される要領 で合成した。ｐＴｌＯプラスミドは、Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａ ．Ｃ．Ｓ． １９９２ １１４：１８９５−１８９７、の方法により、ｄＡ₁₀／ ｄＴ₁₀（配列番号３）配列をポリリンカーのＢａｍＨＩ部位内に挿入することに よりｐＵＣ１９プラスミドから調製した。このｐＴｌＯプラスミドをユニーク部 位でＣｆｒｌＯＩ制限酵素で線状とした。ＰＮＡとの複合体を形成するために、 約０．１μｇの線状化プラスミドを３μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−Ｈ Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の２ｏ．ｕ．／ｍｌのＰＮＡと共に３ ７℃でインキュベートした。Ｓ₁ヌクレアーゼ反応を実施するために、１０μｌ のＮａ−酢酸塩緩衝液（３３ｍＭのＮａＡｃ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの ＺｎＳＯ₄、０．５％のグリセロール、ｐＨ４．６）および１４５単位のＳ₁ヌク レアーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を添加し、そして室温で様々な時間インキュベートし た。この反応は１μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加および−２０℃への冷却によ り停止させた。電気泳動をＴＢＥ緩衝液中で１％アガロースゲル中で実施し、そ の後に臭化エチジウムで染色した。この実施例の結果を図１に示す。図中、マー カーのサイズおよびインキュベーション時間が示される。レーン１：対照−ＤＮ ＡとＰＮＡとの予備インキュベーションを複合体形成には好ましくない条件下（ ２００ｍＭのＮａＣｌ）で実施した。レーン２：ＢａｍＨＩ制限酵素での消化に より取得された対照バンド。レーン３：ＢｇｌＩ制限酵素での消化により取得さ れた対照バンド。レーン４、５：ＤＮＡ−ＰＭA複合体の様々な時間のＳ₁ヌクレ アーゼ消化の結果。 この実施例に示されるように、標的をｐＵＣ１９ポリリンカー内にクローニン グした。このプラスミドをＣｆｒｌＯＩ制限酵素で線状とした。線状ＤＮＡ中で は取得されたポリリンカー領域は中程に存在する（一方の末端からは１．３３ｋ ｂであり、そしてもう一方の末端からは１．３６ｋｂである）。直接的方法を利 用して、配列ｄＡ₁₀ｄＴ₁₀（配列番号３１）を有するｐＴ１０プラスミドをその ポリリンカー中のユニークＢａｍＨＩ部位内に挿入した。これをＰＮＡ Ｈ−Ｔ₁₀ −ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）と複合体形成させ、そしてＳ₁ヌクレアーゼで処 理した。室温において１４５単位のＳ₁ヌクレアーゼで処理した後に、ＤＮＡの 有意のフラクションが切断された。得られる断片のゲル電気泳動による移動度は 、制限酵素ＢａｍＨＩでの切断により取得された断片の移動度に非常に接近して いた。類似の結果が、Ｈ−Ｔ₅ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号６）およびＨ−Ｔ₂ ＣＴ₂ＣＴ−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号５１）のＰＮＡについて、ならびにｄ（Ａ₅ ＧＡ₄）／ｄ（Ｔ₄ＣＴ₅）（配列番号４）およびｄ（Ａ₄ＧＡ₂ＧＡ₂）／ｄ（Ｔ₂ ＣＴ₂ＣＴ₄）（配列番号４４）の挿入断片を保持する対応プラスミドについて取 得された。交差反応性実験は、この標的化は配列特異的であり、対応するＰＮＡ のみが標的の切断を媒介することを示した。２本の非常に弱いバンドがレーン４ 、５に観察され、これらは２．３２ｋｂおよび０．９８ｋｂの長さに相当した。 これらのバンドはＰＮＡ−ＴＩＯのｐＵＣ１９本来の部位ｄ（ＴＴＧＴ３）／ｄ （Ａ３ＣＡＴ）への弱い結合に起因するものであり、この部位はＣｆｒｌＯＩ制 限部位から０．３７ｋｂ離れている。このことは、ミスマッチの導入がＤＮＡに 対するＰＮＡの親和性を劇的に低下させることを示す先の実施例３の結果と一致 する。 この実施例からは、酵素は最初に置換鎖を消化し、次にある程度ギャップを拡 張し、この後に反対の鎖がその酵素の基質になるものと考えられる。その結果と して、二本鎖の切断が作成される。消化分子の収率は高く、そしてＳ₁ヌクレア ーゼへの露出を増加することにより定量的消化に到達することが可能である（デ ータ未公開）。しかしながら、ＢａｍＨＩ制限酵素での消化後にはこの２本の断 片はよく分離しないが、Ｓ₁ヌクレアーゼによるＰＮＡ媒介的消化は鮮明な二重 線を誘導する。理論に拘束されることを望むものではないが、我々は、これは恐 らくはＳ₁ヌクレアーゼによるギャップの拡張ならびにＣｆｒｌＯＩ部位の末端 からの消化を反映するものと考えている。処理時間を長くすると、二重線の下方 向へのシフトは顕著になる（レーン５を参照せよ）。従って、定量的消化は明ら かに断片の切断を伴う（約１００塩基対までの切断）。天然の制限酵素により示 されるものと比較して一層厳密な切断を取得するために、もともとの研究方法を 以下の実施例４によるように改変する。 ＰＮＡを用いるプラスミドの別の部位特異的Ｓ₁ヌクレアーゼ消化 別の標的として、挿入断片 をｐＵＣ１９プラスミドのＳａｌ１部位内にクローニングした。このプラスミド は６塩基対離れているＰＮＡ Ｈ−Ｔ₅ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号６）のた めの２つの結合部位を含み、これをｐＴ９ＣＴ９Ｃと表示した。この２つのＴ₅ ＣＴ₄部位内での鎖置換は、配列 ＧＴＣＧＡＣ／ＧＡＣＧＡＣ を含む全領域 のオープン化を誘導し、両方の鎖中にＳ₁ヌクレアーゼのための基質を提供した 。対照としてｐＴ９Ｃ−５プラスミドを用いたが、このプラスミドはｐＵＣ１９ プラスミドのＳａｌＩ部位内にクローニングされたＴ₅ＣＴ₄挿入断片を１つのみ 保持していた。 実施例３Ｃｆｒ ｌＯＩ制限酵素により線状とし、かつＰＮＡ Ｈ−Ｔ₅ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂ と複合体形成させてあるｐＴ９Ｃプラスミドの部位特異的Ｓ₁ヌクレアーゼ消化 この実施例は、制限部位を特定するための、標的ＤＮＡにハイブリダイズする 一分子のＰＮＡの使用を説明する。 ＰＮＡ１、２、および３を実施例１の要領で合成し、そしてその結果を図２に 示す。ｐＴ９Ｃプラスミドは、ｐＵＣ１９ポリリンカーのＳａｌＩ部位内にクロ ーニングされた挿入断片 を保持していた。ｐＴ９Ｃ−５プラスミドは同一部位内にクローニングされた単 一の挿入断片Ａ₅ＧＡ₄／ＣＴ₅を保持していた。このＰＮＡ−ＤＮＡ複合体は実 施例２に記載される要領で調製したが、唯一の違いはインキュベーションの継続 期間が２時間であったことである。３０単位のＳ₁ヌクレアーゼによる消化を実 施例２に記載されるのと同一緩衝液中で実施したが、ただしレーン２および４の ２つは異なった。レーン２では１５単位の酵素を用い、レーン４では２００ｍＭ のＮａＣｌおよび１ｍＭのＺｎＳＯ₄をその緩衝液に添加した。レーン１：Ｃｆ ｒ ｌＯＩ制限酵素により線状としたｐＵＣ１９プラスミドのＢａｍＨＩ 制限酵 素での消化により取得される対照バンド。レーン２〜４：ＰＮＡ Ｈ−Ｔ₅ＣＴ₄ −ＬｙｓＮＨ₂（配列番号６）と複合体形成させた線状化ｐＴ９Ｃプラスミドの Ｓ₁ヌクレアーゼによる部位特異的消化。レーン５〜７：様々な対照。レーン８ ：レーン３と同一の実験であるが、ただしＴ₄ＣＴ₅（配列番号８）の代わりにＰ ＮＡ Ｔ₁₀（配列番号２）を用いた。レーン９：レーン３と同一の実験であるが 、ただしＴ₄ＣＴ₅（配列番号８）の代わりにＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄（配列番号 １）を用いた。レーン１０：レーン３と同一の実験であるが、ただしｐＴ９Ｃの 代わりにｐＴ９Ｃ−５プラスミドを用いた。ヘッダーではＰＮＡ Ｔ₅ＣＴ₄（配 列番号６）を１として、Ｔ₁₀（配列番号２）を２として、そしてＴ₂ＣＴ₂ＣＴ₄ （配列番号１）を３として表示する。 この実施例は、ＣｆｒｌＯＩ制限酵素により線状とし、かつＰＮＡ Ｈ−Ｔ₅ ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号６）と複合体形成させであるｐＴ９ＣＴ９Ｃプラ スミドを３０単位のＳ₁ヌクレアーゼで処理すると、全長ＤＮＡ分子は半分の長 さの断片に完全に転化することを示す。ゲル電気泳動により観察されるバンドはＢａｍ ＨＩ制限酵素により作成されるバンドと同一の位置および幅を有する。こ の人工的「制限酵素」の配列特異性は、ＰＮＡ Ｈ−Ｔ₅ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂（ 配列番号６）の存在下でプラスミドの定量的切断をもたらす条件下において、Ｐ ＮＡ Ｈ−Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）およびＨ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−Ｌｙｓ ＮＨ₂（配列番号１）と複合体形成させた場合に、ｐＴ９Ｃプラスミドの消化 が非常に弱いことにより確認された（レーン８、９を参照せよ）。その上、ｐＴ ９ＣＴ９Ｃについてのデータを作成するのに必要な一層緩和なＳ₁ヌクレアーゼ 処理下では、ｐＴ９Ｃ−５プラスミド中の二本鎖切断の収率は極端に低かった（ レーン１０）。 実施例４ ＰＮＡ Ｔ₄ＣＴ₅−ＬｙｓＮＨ₂により標的化されたプラスミドｐＴ９Ｃ−５、 ｐＴ９ＣＴ９Ｃ、およびｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳ（ＳｃａＩで線状としてある）の部 位特異的Ｓ₁ヌクレアーゼ開裂 この実施例は、ＤＮＡ標的の反対の鎖に結合する２分子のＰＮＡの使用を説明 する。更に別のプラスミドｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳを、挿入断片 ＧＴＣＧＡＣＡ₅ ＧＡ₄ＧＴＣＧＡＣＴ₄ＣＴ₅ＧＴＣＧＡＣ （配列番号３２）をｐＵＣ１９のＳ ａｌ Ｉ部位にクローニングし、そしてＳｃａＩ制限酵素で線状とすることにより 作成した。この線状化プラスミドは、反対の鎖上に６塩基対離れているＰＮＡＨ −Ｔ₄ＣＴ₅−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号８）のための２つのハイブリダイゼーショ ン部位を有する。実施例３のプロトコールを用いたが、ただし試料は１Ｕ／μｌ のＳ₁を用いて３７℃での１５分のインキュベーションにより処理した。結果を 図３に示す。レーン１〜４：ｐＴ９Ｃ−５、レーン５〜８：ｐＴ９ＣＴ９Ｃ、レ ーン９〜１２：ｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳ。レーン１、５および９：ＰＮＡ無し、レー ン２、６および１０：５０μＭ、レーン３、７、１１：５００ｐＭ、レーン４、 ８、１２：５ｍＭ。 実施例５ 選択的に大ＤＮＡ分子を切断するためのＰＮＡ／ヌクレアーゼの使用 標準株ラムダｃＩ ｉｎｄｌ ｔｓ８５７ Ｓａｍ７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ ｄ Ｂｉｏｌａｂ社）を用いた。ＰＮＡ二重標的はＴ₇Ｎ₆Ｔ₇（配列番号３３） であり、これは開裂の際に６．１ｋｂの断片を生じるはずである。ＰＮＡはＰＮ Ａ （Ｔ₇）₂であり、条件は以下のとおりであった。０．１μｇのＤＮＡおよび １〜２ＯＤ単位のＰＮＡを５μｌのＴＥ緩衝液中で１０分間、３７℃でインキュ ベートした。５μｌの緩衝液（３３ｍＭのＮａＡｃ、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ μＭのＺｎＳＯ₄、ｐＨ４．５）および２０Ｕのヤエナリのヌクレアーゼを添加 し、そしてこの混合物を５分間、室温でインキュベートした。ＴＢＥ緩衝液中の ０．５％アガロース中の電気泳動により分析すると、サイズマーカーとしてラム ダ×ＨｉｎｄＩＩＩもしくはＳａｌＩを用いて、６ｋｂおよび４２ｋｂのサイズ の断片が観察された。ＰＮＡを添加しないとバンドは全く観察されなかった。 この実施例は、選択的に大ＤＮＡ分子（実施例１〜３０において用いられる一 層小さなプラスミドと比較して）を切断するＰＮＡ／ヌクレアーゼの能力を示す 。 実施例６ 二本鎖ＤＮＡ標的Ａ₁₀／Ａ₉Ｇ／Ａ₈Ｇ₂へのＰＮＡ−Ｔ₁₀／Ｔ₉Ｃ／Ｔ₈Ｃ₂の結合 １００μｌの緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ−酢酸塩、ｐＨ ４．５、１ｍＭのＺｎＳＯ₄）中の、指示されるプラスミドの ³²Ｐ−ラベル化Ｅｃｏ ＲＩ−ＰｖｕＩＩ断片（ＥｃｏＲＩ部位の３’−末端でラージフラグメン トによりラベル化）２００ｃｐｓ、０．５μｇの担体用ウシ胸腺ＤＮＡ、および ３００ｎｇのＰＮＡの混合物を３７℃で１２０分間インキュベートした。ヌクレ アーゼＳ₁の５０単位部を添加し、そして２０℃で５分間インキュベートした。 ３μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、そしてＤＮＡをエタ ノール中の２５０μｌの２％酢酸カリウムの添加により沈殿させた。ＤＮＡを１ ０％のポリアクリルアミド配列決定用ゲル中での電気泳動により分析し、そして 放射ラベル化ＤＮＡバンドをオートラジオグラフィーにより可視化させた。 ｐＵＣ１９内に適切なオリゴヌクレオチドをクローニングすることにより標的 プラスミドを調製した。標的Ａ₁₀：ＢａｍＨＩ部位内にクローニングされたオリ ゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＡ₁₀Ｇ（配列番号３４）およびＧＡＴＣＣＴ₁₀Ｇ（配 列番号３５）（ｐＴ１０と表示されるプラスミド）。標的Ａ₅ＧＡ₄：ＳａｌＩ部 位内にクローニングされたオリゴヌクレオチドＴＣＧＡＣＴ₄ＣＴ₅Ｇ（配列番号 ３６）およびＴＣＧＡＣＡ₅ＧＡ₄Ｇ（配列番号３７）（プラスミドｐＴ９Ｃ）。 標的Ａ₂ＧＡ₂ＧＡ₄：ＰｓｔＩ部位内にクローニングされたオリゴヌクレオチド ＣＡ₂ＧＡ₂ＧＡ₄ＣＴＧＣＡ（配列番号３８）およびＧＴ₄ＣＴ₂ＣＴ₂ＣＴＧＣＡ （配列番号３９）（プラスミドｐＴ８Ｃ２）。結果を図４に示す。ゲル中の標的 の位置を左側の棒線により示す。Ａ／Ｇは標的Ｐ１０のＡ＋Ｇ配列ラダーである 。 実施例７ ＰＮＡによる制限酵素開裂の阻害（図５） プラスミドｐＴ１０の２μｇ部を２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス− ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の表示される量のＰＮＡ−Ｔ₁₀（配 列番号２）と混合し、そして３７℃で１２０分間インキュベートし、２μｌの１ ０×緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、 ５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）、ＰｖｕＩＩ（２単位）、およびＢａｍ ＨＩ（２単位）を添加し、そしてインキュベーションを６０分間継続させた。Ｄ ＮＡを５％のポリアクリルアミド中のゲル電気泳動により分析し、そしてそのＤ ＮＡを臭化エチジウム染色により可視化させた。このゲルを図５に示す。 実施例８ ＰＮＡ−Ｔ₁₀−ｄｓＤＮＡ鎖置換複合体形成の速度 １００μｌの緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ−酢酸塩、ｐＨ ４．５、１ｍＭのＺｎＳＯ₄）中の、ｐＴ１０の ³²Ｐ−ラベル化ＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕ ＩＩ断片（ＥｃｏＲＩ部位の３’一端でラージフラグメントによりラベル 化）２００ｃｐｓ、０．５μｇの担体用ウシ胸腺ＤＮＡ、および３００ｎｇのＰ ＮＡ−Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）の混合物を３７℃でインキュベートし た。指示される時間に５０ＵのＳ₁ヌクレアーゼを７つの試料の各々に添加し、 そしてインキュベーションを２０℃で５分間継続させた。次にこのＤＮＡをエタ ノール中の２５０μｌの２％Ｋ−酢酸塩の添加により沈殿させ、そして１０％の ポリアクリルアミド配列決定用ゲル中での電気泳動により分析した。鎖置換複合 体の量は、オートラジオグラフのスキャン式デンシトメトリーにより測定される 標的配列におけるＳ₁開裂の強度から算出した。この結果を図６に示す。 実施例９ ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の安定性 ２００ｃｐｓの ³²Ｐ−ｐＴ１０断片、０．５μｇのウシ胸腺ＤＮＡ、および ３００ｎｇの所望のＰＮＡ（Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）、Ｔ₈−ＬｙｓＮ Ｈ₂（配列番号４０）、もしくはＴ₆−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号７）のいずれか） の混合物を、１００μｌの２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ−酢酸塩、ｐ Ｈ４．５、１ｍＭのＺｎＳＯ₄中、３７℃で６０分インキュベートした。オリゴ ヌクレオチドＧＡＴＣＣＡ₁₀Ｇ（配列番号３４）の２μｇ部を添加し、そして各 試料を指示される温度で１０分間加熱し、氷中で１０分間冷却し、そして２０℃ に暖めた。Ｓ₁ヌクレアーゼの５０Ｕ部を添加し、そして試料を処理および分析 し、そして図７に示されるように結果を定量化した。 実施例１０ ＰＮＡの生物学的安定性 ４０μｌの５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の、ＰＮＡ−Ｔ₅（配列 番号４１）（１０μｇ）および対照である「正常」ペプチド（１０μｇ）の混合 物を、種々の量のブタ腸粘膜からのペプチダーゼもしくはストレプトミセス カ エスピトゥスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）からの プロテアーゼで、３７℃で１０分間処理した。ＰＮＡおよびペプチドの量はＨＰ ＬＣ分析により決定した（逆相Ｃ−１８カラム：０〜６０％のアセトニトリル、 ０．１％のトリフルオロ酢酸）。 ペプチドの完全な分解が観察される（ＨＰＬＣでピークを示さない状態）ペプ チダーゼ／プロテアーゼ濃度では、ＰＮＡは依然として無傷であった。 実施例１１ 遺伝子発現の阻害 パピローマウイルスのＥ２ ｍＲＮＡの発現を阻害するペプチド核酸の能力を 試験するのに好ましいアッセイは、詳細に報告されているＥ２のトランス活性化 特性に基づく。Ｓｐａｌｈｏｌｔｚ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８ ７、６１、２１２８−２１３７。レポータープラスミド（Ｅ２ＲＥＣＡＴ）をＥ ２応答性要素を含むように構築したが、これはＥ２依存的エンハンサーとして機 能する。Ｅ２ＲＥＣＡＴはＳＶ４０初期プロモーター、初期ポリアデニル化シグ ナル、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ ）をも含む。このプラスミドに関しては、ＣＡＴ発現はＥ２の発現に依存する。 Ｅ２の存在下についてのＣＡＴ発現の依存性は、ＢＰＶ−１によりトランスフォ ームしたＣ１２７細胞、非感染化Ｃ１２７細胞、ならびにＥ２ＲＥＣＡＴおよび Ｅ２発現ベクターで同時トランスフェクトさせたＣ１２７細胞内にこのプラスミ ドをトランスフェトすることにより試験した。 Ａ． ＢＰＶ−１ Ｅ２発現の阻害 ＢＰＶ−１形質転換化Ｃ１２７細胞を１２ウエルプレート中でプレート培養す る。Ｅ２ＲＥ１でのトランスフェクションの２４時間前に、増殖培地にアンチセ ンスＰＮＡを５、１５、および３０ｍＭの最終濃度で添加することにより細胞を 前処理する。次の日に細胞を、リン酸カルシウム沈殿により１０μｇのＥ２ＲＥ １ＣＡＴでトランスフェクトする。１０μｇのＥ２ＲＥ１ＣＡＴおよび１０μｇ の担体ＤＮＡ（ＰＵＣ１９）を、最終容量２５０μｌのＨ₂Ｏ中の６２μｌの２ Ｍ ＣａＣｌ₂と混合し、次に２５０μｌの２×ＨＢＳＰ（１．５ｍＭのＮａ₂Ｐ Ｏ₂、１０ｍＭのＫＣｌ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのグルコース、およ び５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）を添加し、そして室温で３０分間インキ ュベートする。この溶液の１００μｌを各テストウエルに添加し、そして３７℃ で４時間インキュベートする。インキュベーション後に、０．７５ｍＭのＮａ₂ ＰＯ₂、５ｍＭのＫＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのグルコース、および ２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中の１５％グリセロールを用いるグリセロー ルショックを細胞に室温で１分間施す。ショックを施した後に細胞を無血清ＤＭ ＥＭで２度洗浄し、そして１０％のウシ胎仔血清およびもとの濃度でのアンチセ ンスオリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭを与える。トランスフェクション後４８ 時間の細胞を回収し、そしてＣＡＴ活性についてアッセイする。 ＣＡＴ活性の決定のためには、細胞をリン酸緩衝化食塩水で２度洗浄し、そし て掻き取ることにより回収する。細胞を１００μｌの２５０ｍＭ トリス−ＨＣ ｌ、ｐＨ８．０中に再懸濁させ、そして凍結−解凍を３回行うことにより破壊す る。２４μｌの細胞抽出物を各アッセイに用いる。各アッセイについては以下の ものを一度に１．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）試験管中に混 合し、そして３７℃で１時間インキュベートする。２５μｌの細胞抽出物、５μ ｌの４ｍＭアセチルコエンザイムＡ、１８μｌのＨ₂Ｏ、および１μｌの¹⁴Ｃ− クロラムフェニコール、４０〜６０ｍＣｉ／ｍＭ。インキュベーション後にクロ ラムフェニコール（アセチル化形態および非アセチル化形態）を酢酸エチルで抽 出し、蒸発乾固させた。試料を２５μｌの酢酸エチル中に再懸濁させ、ＴＬＣプ レート上にスポットし、そしてクロロホルム：メタノール（１９：１）中でクロ マトグラフにかける。クロマトグラフをオートラジオグラフィーにより分析する 。アセチル化および非アセチル化¹⁴Ｃ−クロラムフェニコールに相当するスポッ トをＴＬＣプレートから切り出し、液体シンチレーションにより計数してＣＡＴ 活性を定量する。用量依存的様式でＣＡＴ活性を抑制するペプチド核酸を陽性と みなす。 Ｂ． ＨＰＶ Ｅ２発現の阻害 ペプチド核酸によるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｅ２の阻害について のアッセイは、本質的にはＢＰＶ−１ Ｅ２についてのものと同様である。ＨＰ Ｖアッセイについては適切なＨＰＶを、先に記載するリン酸カルシウム方法を用 いてＰＳＶ２ＮＥＯと共にＣＶ−１もしくはＡ４３１のいずれかの細胞中に同時 トランスフェクトさせる。ＤＮＡを取り込む細胞を、抗生物質Ｇ４１８を含む培 地中で培養することにより選択する。次にＧ４１８−耐性細胞をＨＰＶ ＤＮＡ およびＲＮＡについて分析する。Ｅ２を発現する細胞をアンチセンス研究の標的 細胞として用いる。各ＲＮＡについて、細胞を先の要領で前処理し、Ｅ２ＲＥ１ ＣＡＴと共にトランスフェクトさせ、そして先の要領でＣＡＴ活性について分析 する。ペプチド核酸は、それらが用量依存的様式でＣＡＴ活性を抑制することが 可能である場合には陽性効果を有するとみなす。 実施例１２ ＰＮＡの核酸へのトリプレックス形成−プロービングプロトコール プロービングは、約２００ｃｐｓ ³²Ｐ−ラベル化ＤＮＡ断片、０．５μｌの ウシ胸腺ＤＮＡ、および所望の量のＰＮＡを含む１００μｌの緩衝液（Ｓ１：１ ００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＺｎＳＯ₄、５０ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５、 ＫＭｎＯ₄／硫酸ジメチル（ＤＭＳ）：１０ｍＭのＮａ−カコジル酸塩、１ｍＭ のＥＤＴＡ、ｐＨ７．０、もしくは他に記載があればそのとおりのもの）中で実 施した。３７℃で６０分間予備インキュベーションした後にプロービング試薬を 添加し、そしてインキュベーションを室温で継続した。この反応をストップ緩衝 液の添加により停止させた。ＤＮＡを９６％ＥｔＯＨ中の２００μｌの２％ＫＡ ｃの添加により沈殿させ、そして１０％のポリアクリルアミド配列決定用ゲル中 での電気泳動により分析した。放射活性ＤＮＡバンドを、増感用スクリーンおよ びＡｇｆａ ｃｕｒｉｘ ＲＰＡ Ｘ−線フィルムを用いて−７０℃で露出させ るオートラジオグラフィーにより可視化させた。 プロービング条件は、Ｓ１：０．５Ｕ／μｌ、５分、３μｌの１Ｍ ＥＤＴＡ での反応停止、ＫＭｎＯ₄：１ｍＭ、１５秒、５０μｌの１Ｍ ６−メルカプト エタノール、１．５Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ７．０での反応停止、ＤＭＳ：１％のＤ ＭＳ、１５秒、ＫＭｎＯ₄プロービングに関するものと同様の反応停止。ＤＭＳ もしくはＫＭｎＯ₄でプロービングした試料はゲル分析前にピペリジン（０．５ Ｍ、９０℃、２０分間）で処理した。 実施例１３ ｐＴ８Ｃ２Ａ８Ｇ２へのＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂の結合の酵素的お よび化学的プロービング この実施例については、ＥｃｏＲＩ部位で３’−³²Ｐ−末端ラベル化したｐＴ ８Ｃ２Ａ８Ｇ２の２６４ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ断片を用いた。プロービ ングは実施例１６のプロトコールにより実施した。結果を図１０に示す。レーン １はＳ₁ヌクレアーゼ無し、かつＰＮＡ無しのＳ１緩衝液中の対照である。レー ン２〜５はＳ１プロービングを行ったものであり、レーン６〜９はＫＭｎＯ₄プ ロービングを行ったものであり、そしてレーン１０〜１３はＤＭＳプロービング を行ったものである。以下の濃度のＰＮＡを用いた。０μＭ（レーン２、６およ び１０）、０．２５μＭ（レーン３、７および１１）、２．５μＭ（レーン４、 ８および１２）、もしくは２５μＭ（レーン５、９および１３）。レーンＳはＡ ＋Ｇ配列マーカーである。 プラスミドｐＴ８Ｃ２Ａ８Ｇ２はＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄（配列番号１）のた めの２つの標的を反対の向きに含む。従ってＫＭｎＯ₄（ピリミジン鎖のチミン ）およびＤＭＳ（プリン鎖のグアニン）の両プロービングを同一のＤＮＡ断片上 で実施した。一本鎖特異的ヌクレアーゼＳ₁でのプロービングは、ＰＮＡの結合 の際にＰＮＡ標的のプリン鎖ではなくピリミジン鎖がＳ₁による攻撃に感受性を 示すことを証明した（図１０、レーン２〜５）。しかしながら興味深いことに、 ＰＮＡの非存在下では、Ｓ₁はプリン鎖を攻撃する（レーン２）。このことは分 子内三重らせん（Ｈ−ＤＮＡ）の形成に起因することにまちがいなく、これは詳 細に特徴決定が行われているこのようなポリプリン／ピリミジン鏡映繰り返し体 の特性である。ＰＮＡの存在下ではＳ1感受性は２つのＰＮＡ標的の間のリンカ ーにまで拡張することも観察される。このことは両方のＰＮＡ標的が占領され、 それにより標的間のＤＮＡ領域が一本鎖である複合ループが形成される場合に説 明がつく。この種の結合は更に、ＰＮＡを用いてＳ₁により二本鎖ＤＮＡを開裂 させることができることを説明する。 ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体のＫＭｎＯ₄プロービングは、標的の全てのチミジ ンがＫＭｎＯ₄により酸化されることを示す（図１２、レーン８〜９）。ＫＭｎ Ｏ₄感受性の出現と同時に（ＰＮＡ濃度の見地により）、反対側のＰＮＡ標的の ２つのグアニンで、ＤＭＳとの反応に対する実質上完全な保護が観察される（図 １０、レーン１２〜１３を参照せよ）。これらの結果は、ＤＮＡ標的のピリミジ ン鎖の置換がＰＮＡの結合の際に主要溝の保護を伴うことを示し、このことは２ つのＰＮＡ鎖がＰＮＡ−ＤＮＡ複合体形成に関与して、ＰＮＡ ＤＮＡ−ＤＮＡ トリプレックスを形成するというモデルを支持する。 実施例１４ ｐＡ８Ｇ２へのＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂の結合の化学的プロービン グ この実施例については、ＥｃｏＲＩ部位で³²−Ｐ−末端ラベル化した（（５’ −ラベル化、レーン１〜５）もしくは３’−ラベル化、レーン６〜９））ｐＡ８ Ｇ２の２４８ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ断片を用いた。プロービングは実施 例１２のプロトコールにより実施した。結果を図１１に示し、この図中、レーン １はＳ₁ヌクレアーゼ無し、かつＰＮＡ無しのＳ１緩衝液中の対照である。レー ン２〜５：ＫＭｎＯ₄プロービング、およびレーン６〜９：ＤＭＳプロービング 。以下の濃度のＰＮＡを用いた。０μＭ（レーン２および６）、０．２５μＭ（ レーン３および７）、２．５μＭ（レーン４および８）、もしくは２５μＭ（レ ーン５および９）。レーンＳはＡ＋Ｇ配列マーカーである。 この実施例では、これらの結果が二量体標的のアーティファクトではないこと を確認する目的で、実施例１３のものに類似する実験を実施し、ただし単一のＰ ＮＡ標的のみを有するプラスミド（ｐＡ８Ｇ２）を用いた。図１４に示されるよ うに、実施例１３の二量体標的に関するものと実質的に同一の結果が単一標的の ＫＭｎＯ₄およびＤＭＳプロービングに関して得られた。 実施例１５ ｐＴ８Ｃ２Ａ８Ｇ２へのＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂の結合に及ぼすｐ Ｈおよびイオン強度の影響 この実施例については、ＥｃｏＲＩ部位で３’−³²Ｐ−末端ラベル化したｐＴ ８Ｃ２Ａ８Ｇ２の２６４ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ断片を用いた。プロービ ングは実施例１２のプロトコールにより実施した。結果を図１２に示し、この図 中、レーン１および９はＰＮＡ無しでの対照である。レーン１〜７はＫＭｎＯ₄ プロービングであり、レーン９〜１５はＤＭＳプロービングである。レーン２〜 ７および９〜１５の試料は５μＭのＰＮＡを含んでいた。レーン３、５、７、１ １、１３および１５の試料は１０ｍＭのＮａリン酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液 中に１００ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。この緩衝液のｐＨは、７．５（レーン ２、３および１０、１１）、６．５（レーン４、５および１２、１３）、あるい は５．５（レーン６、７および１４、１５）であった。レーンＳはＡ＋Ｇ配列マ ーカーである。 この実施例は、グアニンに対するシトシンのホーグスティーン水素結合がシト シンのＮ３のプロトン化を必要とし、そしてその結果Ｃ⁺−Ｇ ホーグスティー ン塩基に関わる相互作用は培地の酸性度に対する感受性が非常に高くなることを 示す。このことはＤＮＡ三重らせんに関して他の研究者により広範囲に研究され ており、オリゴヌクレオチドを用いる（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡトリプレックスにつ いても見いだすことができる。 図１２に示される結果はまた、ｐＴ８Ｃ２Ａ８Ｇ２の標的に対するＰＮＡ Ｔ₂ ＣＴ₂ＣＴ₄（配列番号１）の鎖置換結合もｐＨに対して感受性であることを示 す。ｐＨ６．５（レーン４および１２）および５．５（レーン６および１４）と 比較してｐＨ７．５（レーン２および１０）ではほとんど結合が観察されない。 ＫＭｎＯ₄およびＤＭＳプロービング結果の間にも完全な一致が観察され、この ことは鎖置換とホーグスティーンタイプのＰＮＡの結合との間の明白な相関関係 を示す。我々はこれまでに、中程度のイオン強度（５０〜１００ｍＭ Ｎａ⁺） が二本鎖ＤＮＡへのＰＮＡの鎖置換結合を阻害することを示している。図１２（ レーン３、５、７）に示される結果はこのことと完全に一致する。通常のＰＮＡ ＤＮＡ−ＤＮＡ三重らせんとしてのＤＮＡへのＰＮＡの結合は極度に塩依存的 であるはずであるということの物理化学的考察に基づく理由は全く存在しない。 従って鎖置換に不利な塩条件下ではこのような複合体を考えることができる。し かしながら我々はこのことが生じ得るという証拠は全く掴んでおらず、それは「 高塩」条件下ではＤＭＳフットプリントが全く観察されないためである（図１２ 、レーン１１、１３および１５）。 実施例１３、１４、および１５、ならびに本明細書の他の実施例から、二本鎖 ＤＮＡへのＰＮＡの配列特異的結合には、認識のために通常のホーグスティーン およびワトソン−クリック塩基対水素結合を利用するＰＮＡ ＤＮＡ−ＤＮＡト リプレックスが関与すると我々は結論付ける。 実施例１６ 電子顕微鏡 ｐＵＣ１９プラスミドのポリリンカーのＰｓｔＩ部位内にＡ₉₈／Ｔ₉₈（配列番 号４２）挿入断片を含むｐＡ９８プラスミドを用いた。ＣｆｒｌＯＩ制限酵素に より線状とした０．１μｇのｐＡ９８プラスミドを、１０μＬのＴＥ緩衝液（１ ０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＮａ₃ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中、３７℃で ３時間、０．１５μｇのＰＮＡ Ｈ−Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂と共にインキュベート した。この複合体を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７ ．５を含む緩衝液で０．２〜０．５μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度に希釈し、そし てＤｕｏｃｈｅｔ，Ｊ．，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ．Ｒｅｓ．、１９７１ ３５ 、１４７−１６７、に記載される要領で、トリプロピルアミン中でグロー放電さ せた炭素格子表面に２分間吸着させた。この格子を酢酸ウラニルの０．１〜０． ５％水溶液中で1０〜１５秒間染色し、そして乾燥させた。Ｐｔ／Ｃ（９５／５ ）で試料に陰影を付け、これを４０ｋＶの加速電圧下でＰｈｉｌｉｐｓ ４００ 電子顕微鏡で調べた。ＤＮＡ分子の長さを測定し、そしてヒストグラムを、Ｍｉ ｃｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ Ａｃｔａ、２２、２１３−２２１（１９ ９１）中にＡ．Ｖ．Ｋｕｒａｋｉｎにより記載される要領でプロットした。巻き 戻された領域の長さを太い方の鎖から測定したが、この鎖については単位長さ当 たりの塩基対数をＤＮＡデュープレックスについてのものと同様であると仮定し た。ヒストグラムの使用による分析については、ループの左側境界部が分子の末 端により接近するような様式で分子を配向させた。 ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体の電子顕微鏡は、ＣｆｒｌＯＩ制限酵素で線状とし、か つＰＮＡ Ｈ−Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）を対抗させてあるスーパーコ イルプラスミドｐＡ９８内に含まれるＡ₉₈／Ｔ₉₈（配列番号４２）標的について 実施した。標的の完全な占領により９０〜１００塩基の鎖置換ループが生じ、こ れは図１３に示されるように検出された。このヒストグラムプロットを図１４に 示す。図１３に見られるように、ＤＮＡ分子は「目」の形のオープン領域を保持 している。全ての場合において、そのオープン領域内の２本の鎖の内の一本はも う一方のものよりも太く、かつ正常なＤＮＡデュープレックスと同じ太さを有す る。この太い方の鎖はＰＮＡで覆われているＡ−鎖に相当し、細い方の鎖は置き 換えられたＴ−鎖に相当する。ループの２つの分岐点の位置は４７．１％および ５１．２％であり、これはＥＭ−測定の誤差範囲内（０．５％）でＡ９８／Ｔ９ ８挿入断片の末端と一致した（４７．５％および５１．０％）。ループの平均サ イズは４．１％、すなわち１１４ｂｐであり、これもやはりその挿入断片の長さ と非常に良く一致している（標準誤差は１７ｂｐである）。ＰＮＡの添加無しで 実施した対照実験では、目のような構造は観察されなかった。 実施例１７ ＰＮＡを用いる閉環ＤＮＡの巻き戻し Ｖ．Ｉ．Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒ ｕｃｔ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ、３、３２７−３３８（１９８５）により記載される 要領で、ＤＮＡトポイソメラーゼＩを含む抽出物で通常のスーパーコイル型プラ スミドＤＮＡを処理することにより、リラックス型環状ＤＮＡを調製した。ＤＮ Ａ−ＰＮＡ複合体は、０．４光学単位／ｍＬのＰＮＡと共に５〜２０μＬのＴＥ 中の１〜２μｇのＤＮＡを２０〜２２℃で４時間インキュベートすることにより 取得した。これは可能な結合部位に対して約１０倍モル過剰なＰＮＡに相当して いた。アガロース（１．５％）ゲル電気泳動を、１μｇ／ｍＬのクロロキンを含 むＴＡＥ緩衝液中、１０℃で、１５時間、１．５Ｖ／ｃｍで実施した。２次元ゲ ル電気泳動を、ＴＡＥ緩衝液中で第一方向（上端から底辺）へ、次いで１μｇ／ ｍＬのクロロキンが添加されている同一緩衝液中で第二方向（左から右）へ実施 した。 この実施例では、ＤＮＡデュープレックス内へのＰＮＡ Ｔ１０取り込みおよ び溶液中のＤＮＡ Ｔ−鎖の置換の効率を、ＰＮＡによる閉環ＤＮＡの巻き戻し により示した。ｐＡ９８プラスミド（実施例１６）をリラックス型環状の形態（ ｒｃＤＮＡ）で調製した。ＰＮＡとの複合体形成はＤＮＡデュープレックスを約 １０回転巻き戻すであろうことが予測された。幾何学的拘束のため（ｒｃＤＮＡ 中の２本の鎖は閉じており、そしてそのため幾何学的に連結されている）、この 巻き戻しによりｒｃＤＮＡ分子はあたかもそれらが１０回のスーパーターンに より正のスーパーコイルを形成するかのように振る舞うであろう。このことはＰ ＮＡ無しでの同一緩衝液中で予備インキュベートした対照ｒｃＤＮＡと比較する と、その複合体の電気泳動的移動度の増加により明らかになる。電気泳動的移動 度のこの増加を図１５に示す。この図は低塩ＴＥ緩衝液中でＰＮＡと共に２０℃ で４時間インキュベーションした後には、実質的に全てのｒｃＤＮＡ分子がそれ らの移動度を有意に増加させ、かつそれらが高度にスーパーコイルを形成してい るかのごとく移動したことを示す。２次元ゲル電気泳動のゲル（図１６）は、こ れらの分子が実際に正のスーパーコイル型の分子と同様の挙動を示すことを示す 。この技術を用いて個々の位相異性体を分析する。対照として広い分布の位相異 性体を含む試料を用いることにより、図１６では平均８〜１０回転の二重らせん がＰＮＡの結合時に解けたことが明白に示される。これらの結果は、ＴＥ緩衝液 中ではＰＮＡはＤＮＡデュープレックスの利用可能な結合部位の全てを占領して 、Ａ９８／Ｔ９８（配列番号４２）挿入断片中のＤＮＡ Ｔ−鎖を効率良く置換 することを示している。ＮａＣｌをこのインキュベーション緩衝液に添加する場 合には、ｒｃＤＮＡの迅速に移動する種への転化の程度は、図１７のパネルＡに 見られるように、２０ｍＭと４０ｍＭのＮａＣｌの間の狭い範囲内で劇的に減少 した。このことは、ＰＮＡ取り込みの塩濃度に対する強い感受性を強調する。し かしながら低塩で形成された後にはその複合体は顕著な安定性を示し、かつ少な くとも５００ｍＭのＮａＣｌまでの増加塩濃度に耐性を示した（図１７、パネル Ｂ、レーン４）。この複合体はアルカリ処理により解離させることができた（図 １７、パネルＢ、レーン５）。 実施例１８ ＰＮＡによるＲＮＡポリメラーゼＴ₃転写伸長の阻害 ＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）（１もしくは１０μＭ）と、制限 酵素ＰｖｕＩＩ、ＸｂａＩ、もしくはＢａｍＨＩで開裂させたｐＡＩＯＫＳ（ｐ ＴＩＯに類似する、ｄ（Ａ₁₀）標的がＢａｍＨＩ部位内にクローニングされてい るｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ⁺）（１００ｎｇ）との間の複合体を、１４μｌ の１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）緩衝液中で、３ ７℃で６０分間インキュベーションすることにより形成させた。次に４μｌの５ ×濃縮ポリメラーゼ緩衝液（０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２５ｍ ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのスペルミジン）を、１５Ｕの Ｔ₃ ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＡＴＰ（１０ｍＭ）、ＣＴＰ（１０ｍＭ） 、ＧＴＰ（１０ｍＭ）、ＵＴＰ（１ｍＭ）、および³²Ｐ−ＵＴＰ（０．１μＣｉ ）と共に添加し、そしてインキュベーションを１０分間継続した。エタノール沈 殿後に、ＲＮＡを配列決定用ゲル内での電気泳動により分析し、そして放射ラベ ル化バンドを増感用スクリーンを用いるオートラジオグラフィーにより可視化さ せた。この結果を図１８に示す。レーン１：ｐＴＩＯＫＳをＰｖｕＨで切断し、 かつＰＮＡは存在しなかった。レーン２；ｐＴＩＯＫＳをＢａｍＨＩで切断し、 かつＰＮＡは存在しなかった。レーン３：ｐＴＩＯＫＳをＸｂａＩで切断し、か つＰＮＡは存在しなかった。レーン４：レーン１と同様であるが、ただしＰＮＡ の存在下（１μＭ）。レーン５：レーン３と同様＋ＰＮＡ（１μＭ）。レーン６ ：レーン１と同様＋ＰＮＡ（１０μＭ）。レーン７：レーン３と同様＋ＰＮＡ（ １０μＭ）。 図１８に見られるように、ＰＮＡの非存在下では予想されたランオフ転写産物 が観察される（レーン１、２および３）。ＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番 号２）と鋳型との間の予め形成させてあった複合体を用いた場合には、ＰＮＡの 遭遇時の転写停止に相当する長さの転写産物、すなわちＢａｍＨＩ部位でのラン オフ産物（レーン３）よりも１ヌクレオチド長いものが生成する（レーン４〜７ ）。このことは、ＲＮＡポリメラーゼＴ₃による転写伸長が鋳型鎖に結合したＰ ＮＡにより効率良く遮断されることを示す。ＰＮＡが鋳型でない鎖に結合する場 合には、ＰＮＡによる遮断に相当する転写産物は全く観察されなかった。また、 ＲＮＡポリメラーゼＴ₇を用いて類似の結果が取得された（データ未公開）。こ の実験では、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体を、酵素作用に必要な緩衝液を添加する前に 低塩緩衝液中で形成させてあり、それはｄｓＤＮＡへのＰＮＡの結合が高い塩濃 度（＞５０ｍＭのＮａ⁺）により阻害されるためである。いったん形成されれば 、この複合体はこれらの条件に対して極めて安定である。 実施例１９ ＰＮＡによるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼプライマー伸長の阻害 １０μｌの緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣ ｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍｌのゼラチン）中の、１００〜５ ００ｎｇのＰｖｕＩＩ開裂化プラスミドｐＡＩＯＫＳ、０．１μｇのＭ１３逆向 きプライマー、および１μｇのＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）の混 合物を９０℃で５分間、次いで３７℃で６０分間インキュベートした。次に１Ｕ のＴａｑポリメラーゼ、１μｌのｄＣＴＰ（１００μＭ）、ｄＧＴＰ（１００μ Ｍ）、ｄＴＴＰ（１００μＭ）、および³²Ｐ−ｄＡＴＰ（１μＣｉ）を添加し、 そしてインキュベーションを２０℃で５分間継続させた。２μｌのｄＡＴＰ、ｄ ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（各１ｍＭ）を添加した後に、試料を６０℃で１５ 分間インキュベートした。このＤＮＡをエタノールで沈殿させ、そしてこの試料 を実施例１８に記載される要領で処理した。結果を図１９に示す。レーン１：ｐ ＴＩＯＫＳをＰｖｕＩＩで切断し、かつＰＮＡが存在しなかった。レーン２：レ ーン１と同様であるが、ただしＰＮＡが存在した。レーン３：ＰＮＡは存在せず 、かつｐＴＩＯＫＳをＢａｍＨＩで切断した。 この実施例に示されるように、ＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）、 一本鎖標的および標的配列の下流にあるプライマーとの間に予備形成させた複合 体を用いるプライマー伸長実験では、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによりＰＮＡ での遮断に相当する長さの産物が生成した（図１９、レーン２）。ＰＮＡの非存 在下では産物は全く検出されなかった（レーン３）。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） のＤＮＡポリメラーゼの巨大断片（クレノー断片）を用いて類似の結果が得られ た（データ未公開）。このことはＤＮＡポリメラーゼによる伸長がＰＮＡにより 遮断されることを示す。 実施例２０ ＰＮＡによる転写の阻害 ＰＮＡオリゴマー Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）、Ｔ₅ＣＴ₄−ＬｙｓＮ Ｈ₂（配列番号６）、およびＴ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙＳＮＨ₂（配列番号１）を実施 例１に記載される要領で合成した。標的配列を含むプラスミドを、ベクターｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ⁺内への適切なオリゴヌクレオチドのクローニングによ り取得した。ｐＴ１０ＫＳおよびｐＡ１０ＫＳを取得するためには、１６量体の ５’−ＴＣＧＡＣＴ₄ＣＴ₅Ｇ（配列番号３６）および５’−ＧＡＴＣＣＡ₁₀Ｇ（ 配列番号３４）をＢａｍＨＩ部位内にクローニングし、そしていずれかの向きで その挿入断片を含むクローンを単離した。ｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳは、ＳａｌＩ部位 内に５’−ＴＣＧＡＣＴ₄ＣＴ₅Ｇ（配列番号３６）および５’−ＴＣＧＡＣＡ₅ ＧＡ₄Ｇ（配列番号３７）をクローニングすることにより取得し、そしてｐＴ８ Ｃ２ＫＳおよびｐＡ８Ｇ２ＫＳは、ＰｓｔＩ部位内に５’−ＧＴ₄ＣＴ₂ＣＴ₂Ｃ ＴＧＣＡ（配列番号３９）および５’−ＧＡ₂ＧＡ₂ＧＡ₄ＣＴＧＣＡ（配列番号 ３８）をクローニングすることにより取得した。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ １０３を全ての事例における宿主として用い、そしてクローンの形質転換および 単離を標準方法により実施した。プラスミドをＣｓＣｌ濃度勾配液中の浮遊密度 遠心分離により精製し、そしてジデオキシ配列決定による特徴決定を行った。 ＰＮＡによるＲＮＡポリメラーゼ転写伸長の阻害 所望されるＰＮＡと、所望される制限酵素で開裂させた所望されるＤＮＡ（１ ００ｎｇ）との間の複合体を、１４μＬの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭの ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）緩衝液中、３７℃で６０分間インキュベーションするこ とにより形成させた。次に４μＬの５×濃度のポリメラーゼ緩衝液（０．２Ｍの トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２５ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＭｇＣｌ₂、 １０ｍＭのスペルミジン）を、１５ＵのＲＮＡポリメラーゼ、ならびにＡＴＰ（ １０ｍＭ）、ＣＴＰ（１０ｍＭ）、ＵＴＰ（１ｍＭ）、および³²Ｐ−ＵＴＰ（０ ．１μＣｉ）と共に加えた。インキュベーションを１０分間継続させた。エタノ ール沈殿後にＲＮＡをポリアクリルアミド配列決定用ゲル内での電気泳動により 分析し、そして放射ラベル化ＲＮＡバンドをオートラジオグラフィーにより可視 化させた（Ａｇｆａ Ｃｕｒｉｘ ＲＰＩ Ｘ−線フィルムおよび増感用スクリ ーンを用いる）。定量化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のレーザ ースキャナーおよびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）のソフトウエアーを用い るスキャン式デンシトメトリーにより実施した。 図２０は、ＸｂａＩで開裂したｐＡ１０ＫＳと、以下の濃度のＰＮＡ Ｔ₁₀− ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）：０、０．２、０．３５、０．７、１、１．４、１ ．７５、２．１、２．８、３．５、４．３、もしくは５μＭ（レーン１〜１２） 、との複合体間の所定の濃度依存性を示す。これらの複合体はＴＥ緩衝液中で３ ７℃で６０分間インキュベーションすることにより形成させた。この緩衝液を転 写条件に調節し、そして各ＮＴＰ、³²Ｐ−ＵＴＰ、およびＴ₃ ＲＮＡポリメラ ーゼの添加後に、３７℃で５分間転写を進行させた。転写産物を１０％のポリア クリルアミド／７Ｍ尿素ゲル中での電気泳動により分析し、そしてオートラジオ グラフィーにより可視化させた。 図２１に示される結果は、図２０の結果と同様であるが、ただしプラスミドｐ Ａ８Ｈ２ＫＳをＢａｍＨＩで開裂し、そしてＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙｓＮ Ｈ₂（配列番号１）は以下の濃度：０、０．６、１．２、２．４、３．６、４． ８、６、７．２、９．６、１４．４、もしくは１６．７μＭ（レーン１〜１２） である。 図２２は、図２０および２１に示される結果の定量表示を示す。この図中、各 々以下の記号が利用されている。白四角：ｐＡ１０ＫＳ × ＸｂａＩおよびＰ ＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）、白丸：ｐＡ８ＧＫＳ × ＢａｍＨ ＩおよびＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号１）。黒四角：トラン ケート転写産物の相対量、黒丸：転写産物の総量。 この実施例は、ファージＴ₃およびＴ₇ ＲＮＡポリメラーゼを非常に効率良く かつ丈夫な転写のためのモデル系として使用することが可能であることを示す。 この実施例では、鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ⁺プラスミドのポリリン カー中に適切なＰＮＡ標的をクローニングすることにより構築した。この標的を 両方の向きでＢａｍＨＩ部位内にクローニングし、すなわちいずれかの構築物お よびＴ₃−もしくはＴ₇−のいずれかのプロモーターを用いて４つの転写実験を実 施した。図２０、２１、および２２に示される結果は、Ｔ₃ ＲＮＡポリメラー ゼを用いるＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）もしくはＴ₂ＣＴ₂ＣＴ₄− ＬｙｓＮＨ₂（配列番号１）によるｐＡ１０ＫＳ（図２０）もしくはｐＡ８Ｇ２ ＫＳ（図２１）の転写の用量依存的阻害を示す。濃度が上昇すると全長転写産物 の量が減少し、かつトランケート産物の量が増加することが観察され、このこと は配列特異的転写停止が生じることを示唆する。しかしながら転写産物の総量も 減少することから、転写の一般的阻害も生じていることが示される。 実施例２１ Ｔ₃もしくはＴ₇ ＲＮＡポリメラーゼを用いるＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂およ びＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂による転写伸長停止の配列特異性 実施例２０について用いられたものと同一の試料をポリアクリルアミド配列決 定用ゲル内での電気泳動により分析した。結果を図２３に示す。図中、レーン１ 〜４：ｐＡ１０ＫＳ／Ｔ₃ ＲＮＡポリメラーゼ、レーン５〜８：ｐＴ１０ＫＳ ／Ｔ₇ ＲＮＡポリメラーゼ、レーン９〜１２：ｐＡ８Ｇ２ＫＳ／Ｔ₃ ＲＮＡポ リメラーゼ、レーン１３〜１６：ｐＴ８Ｃ２ＫＳ／Ｔ₇ ＲＮＡポリメラーゼ。 レーン１〜３の試料中において用いたプラスミドはＸｂａＩで開裂し、レーン６ 〜８のものはＰｓｔＩで、レーン９〜１１のものはＢａｍＨＩで、そしてレーン １４〜１６のものはＨｉｎｄＩＩＩで開裂した。レーン１、８、９および１６は ＰＮＡ無しの対照である。レーン４、５、１２および１３はＰＮＡ標的部位の近 傍、すなわちＢａｍＨＩ（レーン４および５）もしくはＰｓｔＩ（レーン１２お よび１３）で開裂した対照である。レーン２、３、６および７の試料はＰＮＡＴ₁₀ −ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２）と共に予備インキュベートし、そしてレーン１ ０、１１、１４および１５のものはＰＮＡ Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂（配列 番号１）と共に予備インキュベートした。 この実施例では転写停止の位置を決定する目的で、ＲＮＡ転写産物を高分解能 配列決定用ゲル上で分析した。結果は、特異的ＲＮＡ転写産物がＰＮＡ Ｔ₁₀ （配列番号２）の存在下でＴ₃ ＲＮＡポリメラーゼにより産生されることを示 し、この産物はＰＮＡ標的の１ヌクレオチド前で終了する鋳型（ＢａｍＨＩ開裂 させたもの）を用いて産生されたランオフ転写産物と比較して１ヌクレオチド分 長い（図２３、レーン２〜４）。従って転写はＰＮＡとの水素結合に必要とされ る第一ヌクレオチドに向かって進行するが、これを含まない。Ｔ₇ ＲＮＡポリ メラーゼに関して取得された結果はＴ₃ ＲＮＡポリメラーゼに関するものに類 似している（図２３、レーン５〜８）。しかしながら興味深いことに、この場合 には転写産物はＴ₃ ＲＮＡポリメラーゼに関して取得される転写産物と比較す ると長さの点での均一性がより低く、そしてその転写産物の長さは、ポリメラー ゼがＰＮＡ標的内まで転写することが可能であることを示す。これらの結果は、 このポリメラーゼは結合したＰＮＡを転写中にある程度置換することができるが 、ポリメラーゼ−ＰＮＡの遭遇は時としては鎖停止をもたらす可能性があること を示す。混合化Ａ／Ｇ ＰＮＡ標的を用いると、図２３、レーン９〜１６に示さ れる結果が生じた。Ａ₄ＧＡ₅（配列番号４３）標的およびＴ₄ＣＴ₅−ＬｙｓＮＨ₂ （配列番号８）ＰＮＡによる転写停止は標的の１〜２ヌクレオチド内側で生じ るが、Ａ₄ＧＡ₂ＧＡ₂（配列番号４４）標的およびＴ₄ＣＴ₂ＣＴ₂−ＬｙｓＮＨ₂ （配列番号９）ＰＮＡによる転写停止は効率がかなり低く（実施例２２の結果と 比較する際）、かつ標的の末端で生じる（図２３、レーン１０、１１、１４およ び１５）ことは特筆に値する。 実施例２２ ｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳプラスミドにおける転写停止 図２４では、ｐＴ１０ＫＳ（レーン１〜３）およびｐＡ１０ＫＳ（レーン４お よび５）のＴ₇ ＲＮＡポリメラーゼ転写に及ぼすＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（ 配列番号２）（レーン１、２、４および５）の影響、ならびにｐＴ９ＣＡ９ＧＫ Ｓ（レーン６〜１１）のＴ₃もしくはＴ₇ ＲＮＡポリメラーゼ転写に及ぼすＰＮ Ａ Ｔ₅ＣＴ₄−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号６）（レーン６、７、１０および１１） の影響を示す。レーン１、２、４〜７、１０および１１中の試料のプラスミドはＰｖｕ ＩＩで切断し、レーン３の試料についてはＢａｍＨＩを用い、そしてレー ン８および９の試料についてはＳａｌＩを用いた。ＰＮＡ濃度は５μＭであった 。 この実施例に示されるように、ｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳプラスミドおよびＴ₃もし くはＴ₇ ＲＮＡポリメラーゼを用いる実験は（図２６、レーン５〜１１）、こ のＰＮＡ標的における転写停止はこの標的の２〜３塩基内側で生じることを示し た。ゲル遅延アッセイを利用すると、ＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２ ） 、Ｔ₄ＣＴ₅−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号８）、もしくはＴ₄ＣＴ₂ＣＴ₂−ＬｙｓＮＨ₂ （配列番号９）とそれらの相補的ｄｓＤＮＡ標的との間の複合体は、ＴＥ緩衝 液から転写アッセイ用緩衝液と移す際には少なくとも１５分間は安定であること が確かめられ、すなわちＰＮＡが転写中に自発的に解離していたことの可能性を 除外した。これらの結果は、標的のＧ−含有量の増加、およびそれに従うＰＮＡ のＣ−含有量の増加は、リードスルーにより、転写停止の効率を減少させること を示す。全ての場合において、高濃度のＰＮＡはＴ₃もしくはＴ₇ ＲＮＡポリメ ラーゼによる転写の非特異的阻害をもたらすことも観察される。この効果がポリ メラーゼに対するＰＮＡの直接的な阻害効果に起因するのかどうか、あるいはこ の効果がＤＮＡ鋳型上の他の部位（例えばプロモーター）へのＰＮＡの結合によ り生じるのかどうかは不明である。 実施例２３ ＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂による転写伸長停止の配列特異性 この実施例では、ＰＮＡの鋳型結合 対 非鋳型結合を調べた。これらの実験 は本質的には実施例２１について記載される要領で実施した。プラスミドｐＡ１ ０ＫＳ（ａおよびｃ）、あるいはＰｖｕＩＩ（レーン１および４）、ＸｂａＩ（ レーン２および５）、もしくはＢａｍＨＩ（レーン３）で開裂したｐＡ１０ＫＳ （ｂ）を用いた結果を図２５に示す。ＰＮＡ Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号２ ）はレーン４および５の試料中に３．３μＭで存在していた。パネルｃはパネル ａを更に長く露出したものである。 図２５に示すように、ＰＮＡが非鋳型鎖に結合する場合には転写は実質的に停 止されない（図２５、図２４、レーン１〜５）。オートラジオグラムを更に長く 露出すると、ＰＮＡ標的の末端での停止に相当する非常に弱いバンドを検出する ことができる（図２５、パネルｃ、レーン４、５）。これらの所見は、共有結合 的ソラーレン付加物で特異的に改変させたＤＮＡ鋳型部位に関して報告される結 果に類似している。 実施例２４ ｐＡ１０ＫＳ／Ｔ₃ ＲＮＡポリメラーゼを用いるＰＮＡ Ｔ₆、Ｔ₇、もしくは Ｔ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂による転写伸長停止の配列特異性 この実施例では、１０量体以下のＰＮＡでの転写停止を調べた。図２６に示さ れる結果については、全ての場合においてプラスミドをＸｂａＩで開裂し、そし てＰＮＡ Ｔ₆−ＬｙｓＮＨ₂（配列番号６）（μＭ、レーン２）、Ｔ₇−Ｌｙｓ ＮＨ₂（配列番号４５）（μＭ、レーン３）、もしくはＴ₁₀−ＬｙｓＮＨ₂（配列 番号２）（μＭ、レーン４）と共に予備インキュベートした。レーン１はＰＮＡ 無しの対照である。 図２６に示される結果は、８量体ＰＮＡ、および効力はやや劣るが６量体でさ えも、Ｔ₃−ＲＮＡポリメラーゼによる転写を停止することが可能なことを示す 。この結果は更に、この停止は標的の遠い方の末端にＰＮＡが結合すると生じる ことを示し、このことはＰＮＡが浮遊様式で１０量体標的に結合すること、およ びＲＮＡポリメラーゼがＰＮＡを「押しのける」ことを示す。 実施例２５ ＰＮＡ−ＤＮＡ置換ループからの転写開始 ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、図２７に概略的に示されるように、相補的二本鎖 ＤＮＡに結合する際に（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡ，ＤＮＡトリプレックス−Ｄループ 構造を形成する。２つの接近するＰＮＡ部位がシスもしくはトランスで存在する 場合には（この場合、シスは２つのＰＮＡが同一鎖上で互いに接近して結合する 場合であり、そしてトランスは２つのＰＮＡが相対する鎖上に結合する場合であ る）、図２７のｂ、ｃに示される種類の構造が形成される。これらの構造が転写 伸長ループに類似するため、この実施例では、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＲＮＡ ポリメラーゼがこのようなＰＮＡ／ＤＮＡループを認識し、かつそれに結合する かどうかを試験した。 ３つのプラスミド ｐＴ９Ｃ、ｐＴ９ＣＴ９Ｃ（ｐＵＣ１９の誘導体）、およ びｐＴ９ＣＡ９ＧＫＳ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔの誘導体）をこのインビトロ転写 実験に使用した。制限断片をＰｖｕＩＩでの消化およびポリアクリルアミドゲル 上で単離し、このことにより図２８に示される断片を生成した。さらに、ｐＫＳ Ｔ９Ｃからの単離されたＰｖｕＩＩ断片をＰＮＡハイブリダイゼーション前にＸ ｂａ ＩもしくはＳａｃＩで制限消化させて「ＰＮＡ−プロモーター」からの短い 転写産物を取得した。ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体は、総容量２５μＬの１０ｍＭのト リス−ＨＣｌ ｐＨ８．０および０．１ｍＭのＥＤＴＡ中で０．３μｌのＰＮＡ （５０ ＯＤ）をＤＮＡ断片と３７℃で１時間混合することにより形成させた。 転写は、５０〜１００ｍＭの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼホロ 酵素であるＴ３およびＴ７の添加により開始させた。この反応混合物は以下の最 終濃度のものを含んでいた。４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１２０ｍ ＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭのＤＴＴ、ならびに１ｍＭのＡＴ Ｐ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、および０．１ｍＭのＵＴＰ、および³²Ｐ ＵＴＰ。３０μ ｌの完全な混合物を３７℃で２０分間インキュベートし、その後にエタノール沈 殿を行った。ＲＮＡ転写産物を８％の変性ポリアクリルアミドゲル上で分析し、 そしてオートラジオグラフィーにより可視化させた。ＲＮＡｓｅ Ｈ実験は、相 補的オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡにハイブリダイズさせて、ＲＮＡｓｅ Ｈの ための二本鎖標的を合成することにより実施した。 実施例２６ ＰＮＡプロモーターとｌａｃＵＶ５との間のシス競合 単一もしくは３重のＰＮＡ結合部位をｌａｃＵＶ５プロモーターと共に含むＰ ｖｕ ＩＩ断片を単離した。このＤＮＡをＰＮＡの増加量と共に１時間インキュベ ートした。転写を実施例２５に記載される要領で実施した。図２９に示されるゲ ルシフトにより示されるように、標的ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼとの間のより 遅く移動する複合体は、この標的へのＰＮＡの結合がＤＮＡへの事前結合として 形成される場合にのみ形成される。 実施例２７ ＲＮＡポリメラーゼフットプリント形成 この実施例では、ＤＮＡ断片上のどこで結合が生じるかを確実に特定するため 、 ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント形成実験を行う。図３０に示される長さのＤＮＡ 断片をクレノーポリメラーゼおよび³²Ｐ−ｄＸＴＰで３’末端にラベル化する。 ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を先の実施例２６に記載される要領で形成する。ＲＮＡポ リメラーゼ−ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は、実施例２６について記載される反応緩衝 液中で、２μｇ／ｍｌのウシ胸腺ＤＮＡを添加して１００μｌの総容量で形成さ せる。３７℃での１５分のインキュベーション後に試料を０．０３μＬのＮＡｓ ｅ（１ｍｇ／ｍｌ）で３分間消化させ、その後にエタノール沈殿および８％の変 性ＰＡＧＥによる分析を行う。この実施例の予想結果は図２９にも示される。Ｐ ＮＡの存在下、ＲＮＡポリメラーゼの非存在下では、標的へのＰＮＡ結合に相当 する弱いフットプリントのみが観察される。しかしながら、大腸菌（Ｅ． ｃｏ ｌｉ ）ＲＮＡポリメラーゼを添加すると明確なフットプリントが観察される。 実施例２８ ゲルシフトアッセイ 実施例２７のフットプリント実験に関してはＰＮＡ−ＤＮＡ複合体が形成され る。１５分、３７℃のインキュベーション後に試料を５％ＰＡＧＥ上で分析する 。ゲルシフトおよびＤＮａｓｅ Ｉフットプリントの結果は、大腸菌（Ｅ． ｃ ｏｌｉ ）ＲＮＡポリメラーゼがＰＮＡ／ｄｓＤＮＡ鎖置換ループに結合すること を示すはずである。この結合は転写開始複合体および転写伸長複合体においてＲ ＮＡポリメラーゼについて観察されるものとは明らかに異なるはずである。ＰＮ Ａ／ＤＮＡ複合体の場合の結合は恐らくＤＮＡループに限定されるであろうし、 そして周辺の二本鎖ＤＮＡ内にはさほど及んでゆかないであろう。 （ＰＮＡ）₂／ＤＮＡ，ＤＮＡトリプレックス−Ｄループは構造的にＲＮＡ転 写伸長ループに類似するが、一つの重要な側面において異なっている。すなわち 、ＰＮＡはＲＮＡポリメラーゼのための伸長基質として使用されるべき３’−ヒ ドロキシル基を含まない。それにもかかわらずＰＮＡ依存的転写はＰＮＡ標的を 含むＤＮＡ分子から観察される。その上、得られる転写産物の長さは、図２７ａ に例示されるように、結合したＰＮＡの位置で開始されるランオフ転写産物に相 当するはずである。シス配置の場合には約３０塩基（図２７ｂ）、およびトラン ス 配置の場合には約１６塩基（図２７ｃ）のループを生じる２重のＰＮＡ標的を用 いれば、転写はより効率良くなるはずである。後者の場合には２つの異なるサイ ズの転写産物が生成されるはずであり（図２７ｃ）、これらは長さの点で、両方 のＰＮＡ標的で開始し、かつ反対方向に進行する産物に相当する（図２７ｃ）。 ＰＮＡ依存的転写開始の強度を推定するために、２つの実験を行うことができ る。一つの実験では、ＰＮＡ標的と強力なＣＡＰ非依存的ＵＶ５プロモーターの 両方が同一ＤＮＡ断片上に存在する。ＰＮＡで滴定すると、ＵＶ５プロモーター からの完全なランオフ転写産物が阻害されるが、ＰＮＡ部位での転写停止に相当 する新規の転写産物が出現する。ＰＮＡ部位で開始される転写に相当する長さの 非常に微弱なバンドも観察される。しかしながら３重のＰＮＡ結合部位を含むＤ ＮＡ断片を用いる場合には、この「ＰＮＡ−プロモーター」からの転写はＵＶ５ プロモーターと完全に競合することが可能であるはずである。ＰＮＡ濃度を上昇 させるとＵＶ５プロモーターからの転写は減少し、それと同時にどちらの場合に も「ＰＮＡ−プロモーター」からの転写について予想される産物に相当する長さ の２つの転写産物の量が増加する。ＵＶ５含有性ＤＮＡ断片と、単一、あるいは シスもしくはトランスの二重ＰＮＡ標的を含むＤＮＡ断片のいずれかのものとの 混合物を用いる類似実験をトランスで実施するべきである。これらの実験の結果 は、単一のＰＮＡ１０量体標的はＵＶ５プロモーターと競合することができない が、ダイマー標的は両方とも非常に効率良く競合することを証明するはずである 。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、一本鎖ＤＮＡ ループは転写開始および伸長の際のＲＮＡポリメラーゼのための主要な構造的決 定因子であることを示唆するはずである。 実施例２９ 真核生物核抽出物におけるインビトロ転写の部位特異的停止 ＰＮＡ ＴＴＴＴＣＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１６）、ＴＴＣＣＣＴＴＣ Ｃ−ＬｙｓＮＨ₂ （配列番号１２）、ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−Ｎ Ｈ₂ （配列番号１８）、ＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−ＮＨ₂ （配列番号２０）、お よび ＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣ−ＮＨ₂ （配列番号１９）を実施例１の要領で合 成した。ホスホジエシテルオリゴヌクレオチドは、例えばＶｉｃｋｅｒｓ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９１、１ ９、３３５９−３３６８、の標準的なプロトコールを用いて合成した。ウイルス ＤＮＡ配列の転写を稼働させるＣＭＶ ＩＥ １プロモーターを含むプラスミド を構築した。プラスミドｐＩＥ７２はＣＭＶ ＩＥ ｃＤＮＡクローンであり、 これはＳｔｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３、６ ４、１５５６−１５６５、により記載される要領で構築した。ｐＣＨ４９５は、 プラスミドｐＢＨ１０（Ｈａｈｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９８４ 、３１２、１６６−１６９、を参照せよ）からの４９５ｂｐのＳａｌＩ／Ｅｃｏ ＲＩ断片を、同一の２つの酵素での消化により調製されたベクターｐＵＣ−ＣＭ Ｖ中に連結させることにより構築した。ｐＣＩＮは、ゲノムＣＭＶクローンであ るプラスミドｐＳＶＣＣ３（Ｄｅｐｅｔｏ，Ａ．Ｓ．ａｎｄ Ｓｔｅｎｂｅｒｇ ，Ｒ．Ｍ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８９、６３、１２３２−１２３８）からの ４６３ｂｐのＰｖｕＩＩ断片をＰｖｕＩＩ部位で線状化したベクターｐＣＥＰ− ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内に連結することにより構築した。ｐＣＩＮｒを 同様の様式で構築したが、挿入断片を反対の向きにクローニングした。これらの プラスミドを図３１に示す。全てのプラスミドは、ホモピリミジンＰＮＡによる 標的化のためのホモプリン部位を含む配列の転写を稼働させるＣＭＶ ＩＥ１プ ロモーター（白抜き部分）を含むように構築した。ｐＣＨ４９５は、ｐＢＨ１０ からの４９５ｂｐのＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ＨＩＶ−１ゲノムの３７３８〜 ４２３３）を含む。プラスミドｐＣＩＮは、ゲノムＣＭＶクローンであるプラス ミドｐＳＶＣＣ３からサブクローニングされた４６３ｂｐのＰｖｕＩＩ断片を含 む。ｐＣＩＮｒは同一断片を反対向きで含む。ｐＩＥ７２はＣＭＶ ＩＥ１のｃ ＤＮＡクローンである。模様付き部分は各線状化プラスミドの転写される領域を 表す。予想される転写産物の長さを各々の３’末端に示す。また、ＰＮＡ標的部 位の配列および転写産物の末端に対応する位置も示される。 インビトロ転写 １００ｎｇ／μｌの線状化プラスミドを１０μｌの容量での様々な濃度のＰＮ Ａと共に、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ６．８で緩衝化されたＫＣｌ中、室温で ３時間予備インキュベートした。ｐＨ依存性について調べるために、ＫＣｌを１ ０ｍＭのトリスＯＡｃ、ｐＨ５．１もしくは１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７ ．９で緩衝化させた。ＫＣｌは０．５〜１００ｍＭの濃度範囲内であった。予備 インキュベーション後に２μｌのＰＮＡ結合化プラスミドをＨｅＬａ核抽出物（ Ｐｒｏｍｅｇａ社）中、製造業者のプロトコールに従って転写させた。転写させ たＲＮＡを沈殿させ、次に１５Ｗで２時間泳動させる５％の変性アクリルアミド ゲルを通しての電気泳動により分離させた。次にゲルを乾燥させ、フィルムに露 出させた。露出されたフィルム上のバンドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ ｃｓ社のレーザーデンシトメーターを用いて定量化した。 配列 ＴＴＴＴＣＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１６）を有するＰＮＡおよび 非相同ＰＮＡ対照を表示される濃度で、２００ｎｇのＥｃｏＲＩ線状化プラスミ ドｐＣＨ４９５と共に、１０μｌの１０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．８中、２２℃で ３時間予備インキュベートした（全ての結合用緩衝液にはカリウム塩が用いられ ているが、それはカリウム塩が転写抽出物に最も良く適合するためである）。予 備インキュベーション後、ＰＮＡ結合化プラスミドを³²Ｐ ＧＴＰを含むＨｅＬ ａ細胞核溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中で転写させた。転写させたＲＮＡ産物は 、その後に５０％ ｗ／ｖ尿素を含む５％アクリルアミドゲル上での電気泳動に かけ、次いでそれを乾燥させ、フィルムに露出した。予想されたサイズの全長ラ ンオフ転写産物およびＰＮＡトランケート転写産物を図３１に示す。５０％の転 写産物がトランケートされる濃度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社 のデンシトメーターを用いる露出化フィルムからのバンドの定量化により約８０ μＭと決定された。結果を図３２に示す。ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩでのプラ スミドの線状化により、予想されるランオフ転写産物が各々４９５（レーン１） および１９０（レーン２）ヌクレオチドである転写鋳型を得た。相補的ＲＮＡの 存在下では、ＥｃｏＲＩ線状化プラスミドは２つの異なる転写産物を生成し、一 つはランオフ転写産物に、そして第二のものはＰＮＡ結合部位でのトランケート が生じる場合に予想される３７３ヌクレオチドの産物に一致する分子量を有する トランケート転写産物に相当する。トランケートヌクレオチド産物の相対比は、 予 備インキュベーション中のＰＮＡの濃度の増加に伴って増加する。同一配列（５ ’−ＴＴＴＴＣＴＴＴＴ−３’）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＰＮＡの代わり に用いる場合にはトランケート産物は全く観察されなかった（データ未公開）。 この実験を、図３１に示す他のＰＮＡ標的部位について繰り返した。これらの結 果を表Ｉに示し、そしてＩＶＴ₅₀、すなわち５０％の転写産物が特異的にトラン ケートされるＰＮＡ濃度として示した。全ての予備インキュベーションは、ｐＨ ５．１、６．８、もしくは７．９で１０ｍＭのＫＣｌ中で実施した。全ての場合 において、全長およびトランケートの両方の転写産物の量はＰＮＡ濃度の上昇に 従って減少し、このことはＰＮＡによる転写の非特異的阻害を示唆する。この効 果はＰＮＡ中のシトシン残基のパーセンテージが増加するにつれて一層顕著にな るように思われる。例えば、１ｍＭのＰＮＡ濃度では転写産物の総収量は、ＰＮ Ａ ＴＴＴＴＣＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１６）の存在下では約６３パーセ ント、ＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−ＮＨ₂ （配列番号２０）の存在下では８４パー セント減少し、そして ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番 号１８）の存在下では完全になくなる（図３２および図３３中の１ｍＭのレーン と比較して）。ＰＮＡを転写用抽出物に直接添加した場合には、トランケート産 物は生成しなかった（データ未公開）。 実施例３０ インビトロ転写のＰＮＡ媒介的停止における標的部位の向きの効果 プラスミドｐＣＩＮおよびｐＣＩＮｒをＨｉｎｄＩＩＩで線状とし、次に、実 施例２９について記載される条件下で、図３３に示される濃度の配列 ＣＣＣＣ ＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１８）をＰＮＡと共に予備イン キュベートした。ＩＶＴの後、ＰＮＡが鋳型鎖に結合するｐＣＩＮについてはト ランケート産物が明白に観察された。しかしながらＰＮＡが非転写鎖に結合する ｐＣＩＮｒについては、僅かな量の予想サイズのトランケート産物のみが観察さ れた。プラスミドｐＣＩＮおよびｐＣＩＮｒは、ＣＭＶプロモーターの転写調節 下に反対向きにクローニングされたＣＭＶ遺伝子断片を含む。ｐＣＩＮは鋳型鎖 上にＰＮＡ ＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１８）の ための結合部位を含み、ｐＣＩＮｒは非転写鎖上に同一の標的部位を含む。ＰＮ Ａを、実施例２９にしたがってインビトロ転写を実施する能力について試験した 。この結果を図３３に示す。両方のプラスミドは試験したＰＮＡの最高濃度で（ １ｍＭ）インビトロ転写の非特異的阻害を示す。しかしながらＰＮＡ濃度を１０ ０μＭに減少させると、ｐＣＩＮ鋳型に関しては生成したＲＮＡの約半分がＰＮ Ａトランケート産物について予想されるサイズ（２０９ヌクレオチド）に相当し た。それとは対照的に、ｐＣＩＮｒは同一濃度では、わずかの正しいサイズのト ランケート産物を示す。 実施例３１ 転写のＰＮＡ媒介的停止に及ぼすイオン強度およびｐＨの影響 ２５μＭのＰＮＡ ＴＴＴＴＣＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１６）をｐＣＨ ４９５と共に３時間、ｐＨ６．８で、０．５〜１００ｍＭのＫＣｌ緩衝液中で予 備インキュベートした。予備インキュベーション後、線状としたプラスミドを実 施例２９に詳細が記載される要領で転写させた。結果を図３４に示し、ＰＮＡト ランケート産物のパーセンテージを各レーンの下に示した。全長転写産物に対す るトランケート産物の比率は、塩濃度が減少するにつれて増加する。 同一のＰＮＡおよびプラスミド鋳型を用いて、転写を実施するＰＮＡの能力に ついてのｐＨの影響を決定した。１０もしくは１００μＭの濃度のＰＮＡを、ｐ Ｈ５．１、６．８、もしくは７．９の１０ｍＭのＫＣｌ緩衝液中で鋳型と共に予 備インキュベートし（実施例２９に記載される要領で）、次にＨｅＬａ細胞抽出 物中で転写を行った。得られる転写産物を図３５に示し、トランケート産物のパ ーセンテージを各レーンの下に示す。試験した最高のｐＨ、７．９では１００μ ＭのＰＮＡ濃度下でさえも特異的にトランケートされた産物はほとんど観察され ない。６．８へのわずかなｐＨの減少により１００μＭのＰＮＡ濃度下で生成す るトランケートメッセージの量は劇的に増加するが、１０μＭのＰＮＡ濃度では トランケートメッセージは全く観察されない。しかしながらｐＨを５．１に減少 させると、少量のトランケート産物が低い方のＰＮＡ濃度でさえも観察され、よ り高いＰＮＡ濃度で増加する。 また、他のＰＮＡを用いてこれらの実験を実施した。各々についてのＩＶＴ₅₀ を先の表Ｉに列挙した。ＰＮＡ結合におけるｐＨの影響はＰＮＡオリゴマー中の シトシン残基のパーセンテージが増加するにつれて一層増強されるように思われ 、これは恐らくシトシンのプロトン化による結合の増強に起因するものと思われ る。ｐＨ５．１では、あるＰＮＡ ＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣ−ＮＨ₂ （配列番号 １９）は試験した最高の濃度でも少量のトランケート産物のみを示した。より高 いｐＨではトランケート産物は全く観察されなかった。非特異的効果は一般的に 、シトシン／チミジン比がより大きいオリゴマーの場合に一層顕著であった。 インビトロでの転写を阻害するＰＮＡの能力は、抗遺伝子療法剤としてのその 使用を支持する。抗遺伝子剤としてＰＮＡを使用する際には、ｐＨおよびイオン の両障害が考慮されるであろう。ｐＨの影響はｄＧ／ｄＣデュープレックスを回 避してアデノシンに富む領域を標的とすることにより軽減される。あるいは、メ チルシトシン等の修飾残基により結合を容易にすることができる。この実施例で は、インビトロ転写の阻害は、細胞内で典型的に見いだされるものより弱いイオ ン強度で最も効率がよかった。従って、速度論的障害に打ち勝つ十分な時間が与 えられれば、ＰＮＡは生理学的条件下で鎖攻撃を行うことが可能である。さらに 、鎖攻撃の速度を増強させるためには、ゲノムの代謝的活性領域が標的とされる であろう。 実施例３２ 標的へのＰＮＡのインビトロ結合 デュープレックスＤＮＡのインビトロ結合のための標的は２本の５０塩基ＤＮ Ａオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより調製し、そのオリゴヌクレ オチドではＰＮＡ ＴＴＴＴＣＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１６）のための結 合部位が中央に存在する（５’−ＡＡＡＣＡＧＧＧＣＡ ＧＧＡＡＣＡＧＣＡ ＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴ ＴＡＡＡＡＴＴＡＧＣ ＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’お よび ５’−ＣＣＡＴＣＴＴＣＣ ＴＧＣＴＡＡＴＴＴＴ ＡＡＡＡＧＡＡＡＡ Ｔ ＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣ ＣＴＧＣＣＣＴＧＴＴＴ−３’ （配列番号４６） ）。この標的を³²Ｐ末端ラベルし、次に約５００ｎＭで様々な濃度のＰＮＡと共 に既述の緩衝液中で、室温で４時間インキュベートした。ＰＮＡ結合化デュープ レックスを、ＴＢＥ中の５％非変性アクリルアミドゲル上での電気泳動により遊 離のものから分離した。次にゲルを乾燥させ、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙ ｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ上に露出した。Ｋ_dはラベル化標的 の半分が結合するＰＮＡ濃度として示される。ＤＮＡオリゴヌクレオチド相補物 に対するＰＮＡのゲルシフトを同一緩衝液中、配列 ５−ＡＡＡＡＧＡＡＡＡ− ３’（これは１ｎＭで各ハイブリダイゼーション混合物中に存在していた）を有 する末端ラベル化ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて実施した。結合したＤＮＡ オリゴヌクレオチドをＴＢＥ中の１２％非変性アクリルアミドゲル上での電気泳 動により遊離のものから分離した。 先のプロトコールに従って、ＤＮＡへのＰＮＡのインビトロ結合をゲル移動度 シフトアッセイにより評定した。ＰＮＡ ＴＴＴＴＣＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列 番号１６）のための５０塩基対デュープレックスＤＮＡ標的を、ＰＮＡ ＴＴＴ ＴＣＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１６）のための結合部位がその断片の中央に 来るように調製した。ＤＮＡ相補物（５’−ＡＡＡＡＧＡＡＡＡ−３’）を合成 し、そして末端ラベル化を施した。ＰＮＡを、一本鎖相補物またはデュープレッ クスＤＮＡ標的のいずれかと共に、２０ｍＭのＫＣｌ緩衝液中、ｐＨ５．１、６ ．８、もしくは７．９でインキュベートした。次にＰＮＡ結合化ＤＮＡを非変性 アクリルアミドゲル上で遊離のものから分離した。図３６ａは、一本鎖およびデ ュ ープレックス標的の両方へのＰＮＡ結合は結合用緩衝液のｐＨによる影響を受け ることを示す。一本鎖およびデュープレックスＤＮＡ相補物に対する結合親和性 （Ｋ_d、標的の半分が移動度を変化させるＰＮＡ濃度）を、ゲルシフトアッセイ により決定した。ｐＨが減少するにつれて親和性は増加する。一本鎖標的に対す るＰＮＡの親和性は、デュープレックス標的についてのものよりもかなり高く、 これは恐らく２０ｍＭのＫＣｌ中でのＤＮＡデュープレックスの安定性に起因す るものと思われる。他のＰＮＡオリゴマーの結合親和性を決定するための他の実 験は、結合におけるｐＨの影響はシトシンに富むＰＮＡに関して一層顕著である ことを示した（データ未公開）。 また、標的へのＰＮＡの結合を利用して、ＰＮＡ ＴＴＴＴＣＴＴＴＴ−ＮＨ₂ （配列番号１６）をその一本鎖もしくはデュープレックス標的と共に、１、 １０、もしくは１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液中、ｐＨ６．８でインキュベー トすることにより、ＰＮＡ結合における塩濃度の影響を調べた。結果を図３６ｂ に示す。塩濃度はデュープレックスＤＮＡと結合するＰＮＡの能力については大 きな影響を有するが、一本鎖相補物への結合については塩の影響はほとんど存在 しない。ＰＮＡ ＴＴＣＣＣＴＴＣＣ−ＬｙｓＮＨ₂ （配列番号１２）を試験 した際にも類似の効果が得られた（データ未公開）。 実施例３３ ＰＮＡ−ＤＮＡ塩基対認識 ４つ全ての天然の核塩基を含むＰＮＡが相補的オリゴヌクレオチドへの塩基対 特異的ハイブリダイゼーションという観点での真のＤＮＡ模倣体であるかどうか を試験するために、１５量体のＰＮＡをほぼ同数のピリミジンおよびプリンを含 むが、ただし２個を上回るプリンもしくはピリミジンが並置されることのないよ うに設計した。このＰＮＡは同数のチミジンおよびシトシン、ならびに単一のグ アニンを含む。さらに、この１５量体の配列は非自己相補的であり、かつ中央に ＧＴＣＡ配列を含む。このＰＮＡ１５量体とワトソン−クリック相補的オリゴヌ クレオチド、ならびに４つの中央ヌクレオ塩基の一つに単一塩基のミスマッチを 各々有する他の１２個のオリゴヌクレオチドとの間の複合体の熱安定性を測定す ることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡ塩基対認識についての情報を取得した。最後に、 トリプレックス形成を非常に嫌う（禁止されないまでも）ようにピリミジンのス トレッチを全く含まないＰＮＡを設計した。 １５量体 Ｈ−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−ＮＨ₂ （配列番号１０） と相補的デオキシオリゴヌクレオチド ３’−ＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴ （配列番号４７）（アンチパラレル配向と称される：ＰＮＡのアミノ末端がオ リゴヌクレオチドの３’−末端に相補的である）との間の複合体の融解温度Ｔ_m として測定される熱安定性は６９．５℃であった（表ＩＩを参照せよ）。一方、 パラレル配向での対応するＰＮＡ−ＤＮＡ複合体のＴ_mは５６．１℃であった。 ＰＮＡ−ＲＮＡ複合体についてのＴ_mは各々７２．３および５１．２℃であった （表ＩＩを参照せよ）。２つの１０量体ＰＮＡを用い、そしてこれらを両方の配 向で相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより配向優先性を 更に詳しく決定した。アンチパラレルの配向が全ての場合で優先された（表ＩＩ を参照せよ）。さらに、いずれの鎖がＰＮＡであり、いずれがＤＮＡであるかに かかわらず、実質的に同一のＴ_mが得られたことは特筆に値する（表ＩＩ、第２ 列および第３列を参照せよ）。これらの結果は、末端リシンアミドの存在（所定 のＰＮＡに添加してオリゴチミンＰＮＡの凝集を減少させる）はＤＮＡと比較し てＰＮＡの優先的配向に影響を与えないことも示す。 ワトソン−クリック塩基対ミスマッチを１５量体中の４つの中央ＰＮＡ核塩基 （ＧＴＣＡ）に面するいずれかの位置でオリゴヌクレオチド内に導入すると、Ｔ_m の大きな増加（８〜２０℃、図３７）が観察され、このことによりＰＮＡ−Ｄ ＮＡ認識がワトソン−クリック塩基対形成、すなわちＡ−ＴおよびＧ−Ｃ塩基対 形成により生じることの強い証拠が提供された。定性的に類似した結果がパラレ ル配向でのオリゴヌクレオチドを用いて得られた。ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の熱安 定性に及ぼす塩基対ミスマッチの影響を図３７に示す。ＰＮＡおよびＤＮＡの配 列が相補的である場合の、ＰＮＡ Ｈ−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−ＮＨ₂ （配列番号１０）と１３個のオリゴヌクレオチド ３’−ｄ（ＡＣＡＴＧＸＹ ＺＶＧＴＴＧＡＴ）［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｖ＝Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔである］との間の 複合体の熱安定性が示される。他の１２個のオリゴヌクレオチドの各々では、３ つの塩基（Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｖ）は相補的であるが、４番目のものは３つの非相補的 ヌクレオ塩基の内の一つであった。例えば、（Ｘ＝Ｔ、Ｙ＝Ｇ、Ｚ＝Ａ）である とき、Ｖ＝Ａ、もしくはＣ、もしくはＧである。従ってこの１２個のオリゴヌク レオチドの各々はＰＮＡ１５量体に対して１２の可能な塩基対ミスマッチの一つ を含む。これらの複合体のＴ_mは図３７中の黒塗り棒として表示される。比較の ために、ＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスを用いて実施された類似実験の結果を 示す（斜線棒）。ハイブリダイゼーションは、１０ｍＭのＮａ−リン酸塩、ｐＨ ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂中で実施した。 また、比較のために、図３８に示されるように対応するＤＮＡ／ＤＮＡデュー プレックスの熱安定性も測定した。ミスマッチについての△Ｔ_m値を図３８に示 す。ハイブリダイゼーションは図３７についての要領で実施した。 ミスマッチを形成する実質的に全ての塩基対について、安定性の減少はＤＮＡ ／ＤＮＡ複合体についてよりもＰＮＡ／ＤＮＡ複合体についてのほうが一層大き いことは特筆に値し（図３８を参照せよ）、このことにより配列識別はどちらか といえばＤＮＡを認識するＤＮＡについてよりはＤＮＡを認識するＰＮＡについ ての方が一層効率がよいことが示される。 ワトソン−クリック塩基対形成についての明確な証拠は、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合 体はホモピリミジンＰＮＡに関して以前に観察された（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡトリ プレックスよりはむしろデュープレックスであることを示唆する。この結論は、 ゲル遅延アッセイ中において³²Ｐ−ラベル化オリゴヌクレオチドを用いる滴定実 験により確認した。図３９に示されるように、完全な複合体形成が［ＰＮＡ］対 ［ＤＮＡ］の１：１の化学量論で観察された。類似の結果が、複合体形成の検出 用に円偏光二色性を用いて得られた（データ未公開）。この実施例ではＰＮＡＨ −ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−ＮＨ₂ （配列番号１０）の５’−末端ラ ベル化オリゴヌクレオチド ３’−ｄ（ＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴ）（配 列番号４７）への結合のゲルシフトによる滴定を実施した。このオリゴヌクレオ チドは標準方法²²を用いて５’−末端を³²Ｐでラベル化した。オリゴヌクレオチ ド（１ｎｍｏｌ、１０³ｃｐｍ）を、１０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍ ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中の様々な量のＰＮＡ（０〜５ｎｍｏｌ）と共に３７ ℃で１時間インキュベートした。これらの試料を２０％のポリアクリルアミドゲ ル中の電気泳動により分析し（ＴＢＥ緩衝液＝８９ｍＭのトリス−ホウ酸、ｐＨ ８．３、１ｍＭのＥＤＴＡ）、そして放射ラベル化ＤＮＡをオートラジオグラフ ィーにより可視化させた。オリゴヌクレオチドおよびＰＮＡの濃度を測光法によ り測定した。類似の結果が、逆の極性（５’−ｄ（ＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＴＧ ＡＴ）（配列番号５２）の相補的オリゴヌクレオチドを用いて取得された。 実施例３４ ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスの構造 Ｔ_mデータ（先の表ＩＩ）は、ＤＮＡもしくはＲＮＡとは対照的にＰＮＡはい ずれの配向でも相補的ＤＮＡもしくはＲＮＡに結合しうるが、アンチパラレル配 向が優先されることを示す。ＰＮＡ主鎖はアキラルであるために、この配向はそ れのみではらせんの巻き込みにいかなる立体的拘束、すなわち左回りもしくは右 回りのらせん性を課することもなく、そしてコンピューターモデルも両方の結合 配向が可能であることを示す。 二次構造についての情報は円偏光二色性（ＣＤ）測定から取得することが可能 であり、これはこれらがらせん内の塩基対の形状に対する感受性を示すためであ る。図４０は、ＰＮＡ／ＤＮＡ、ＰＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、およびＤＮ Ａ／ＲＮＡデュープレックスのＣＤスペクトルを示す。ＰＮＡ／ＤＮＡ（ａ：ア ンチパラレル、ｂ：パラレル）、ＰＮＡ／ＲＮＡ（ｃ：アンチパラレル、ｄ：パ ラレル）、ＤＮＡ／ＤＮＡ（ｅ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡ（ｆ）複合体の円偏光 二色性スペクトルが図４０に示される。これらの複合体は、蒸留水中で等モル量 の２つの相補物を混合することにより形成させた。円偏光二色性スペクトルはＪ ａｓｃｏ ７００装置上で、室温で、１ｍｍの光路を用いて記録した。全ての測 定値は１０回の平均をとり、そして平滑化を行った。全てのスペクトルは非常に 類似しており、ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡデュープレックスは右回り らせんであり、塩基対の形状はＢ−もしくはＡ−ＤＮＡらせん内に見いだされる ものと劇的に異なるわけではないことを示唆する。しかしながら、ＰＮＡ／ＤＮ Ａ（もしくはＰＮＡ／ＲＮＡ）デュープレックスのＣＤ−スペクトル、すなわち 構造は、パラレルおよびアンチパラレル複合体を比較した場合には明らかに異な る。対照ＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスはＢ−様らせんをとることが予想され 、ＲＮＡ／ＤＮＡデュープレックスはよりＡ−様らせんをとることが予想される が、これらの短いデュープレックスのいずれのＣＤ−スペクトルも典型的なＢ− もしくはＡ−様の特徴を示していない。従ってこれらの結果からは、ＰＮＡ／Ｄ ＮＡもしくはＰＮＡ／ＲＮＡらせんが優先的にＡ−もしくはＢ−様らせんとなる かどうかを結論付けることはできない。 実施例３５ ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックス形成の熱力学 ハイブリダイゼーションについての熱力学的パラメーターは、熱安定性測定値 が様々な濃度の複合体で実施されている場合にはそれらの測定値から、あるいは 熱変性曲線の形から得ることができる。両方法を使用して、ＰＮＡ／ＲＮＡ、Ｄ ＮＡ／ＲＮＡ、ＰＮＡ／ＤＮＡ、およびＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスの形成 についての△Ｈ°、△Ｓ°、および△Ｇ°を決定した（表ＩＩＩ）。エントロピ ーの減少がＤＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスの形成につい てほぼ同一であること、および両方の反応が強力なエンタルピー稼働性であるこ とが顕著である。 △Ｈ°および△Ｓ°がＰＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックス の形成については類似するという所見は、ＣＤ結果によるＰＮＡ／ＤＮＡおよび ＲＮＡ／ＤＮＡデュープレックス構造は類似のスタッキングを有するという所見 と合わせると、一本鎖ＰＮＡは一本鎖ＤＮＡとほぼ同一の塩基スタッキングの程 度を有するはずであり、したがって高度に構造化されているように見えることを 示す。ＰＮＡ／ＲＮＡデュープレックス形成の速度も測定し、そしてその結果は 、ハイブリダイゼーションの速度は２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＤＮ Ａ／ＤＮＡデュープレックス形成と少なくとも同じ程度の速さであることを示す （表ＩＶ）。また、一本鎖ＲＮＡは少なくともＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）と同程 度にデュープレックス形成のために前構造化されていることの示唆と完全に一致 する。 以下の化学合成をスキームＩおよびＩＩに示す。 スキームＩ 実施例３６ 二塩酸モノＢｏｃ−ジエチレントリアミン（１） ＣＨＣｌ₃（４００ｍｌ）中の炭酸ｔ−ブチル−ｐ−ニトロフェニル（１０ｇ 、０．０４１８ｍｏｌ）の溶液をＣＨＣｌ₃（２５０ｍｌ）中のジエチレントリ アミン（４５ｍｌ、０．０４１７ｍｏｌ）の溶液に、０℃で３時間にわたり加え た。この反応混合物を一晩室温で撹拌した。出現する沈殿物を濾過し、そしてＣ ＨＣｌ₃中で洗浄した。溶媒を、まず水流式アスピレーターを用い、次いで油圧 式ポンプ（０．０５ｍｍＨｇ、５０℃）を用いて減圧下で蒸発させた。残渣を酢 酸エチル（５０ｍｌ）／Ｈ₂Ｏ（５０ｍｌ）の混合物中に溶解し、そしてこの溶 液をＨＣｌ ４ＮでｐＨ４に酸性化させ、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出し た。この水溶液をＮａＯＨ ２ＮでｐＨ９に調節し、そして酢酸エチル（３×５ ０ｍｌ）で抽出した。水相をｐＨ１１．５に調節し、そして酢酸エチル（１０× ５０ｍｌ）で抽出した。最終抽出の合わせた有機相を減圧下で蒸発させ、そして 得られる油状物を水（５０ｍｌ）中に溶解し、そしてｐＨ５に酸性化した。水の 蒸発により薄黄色固体が生じ、これをエーテルで十分に洗浄した（収量：６．４ １ｇ、５５％）。 実施例３７ 塩酸Ｂｏｃ−、Ｚ−ジエチレントリアミン（２） ｐＨ１１に調節してあるジオキサン（５０ｍｌ）／水（５０ｍｌ）中の１の溶 液（５．５ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）に、ジオキサン（５０ｍｌ）中の炭酸ベンジ ルニトロフェニル（５．４４ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃で１時間に わたり、ＮａＯＨ ２ＮでｐＨを１１に維持しながら加えた。その後にこの反応 混合物を室温で１．５時間撹拌した。その後に酢酸エチル（１００ｍｌ）を加え 、そしてこの反応混合物を０℃に冷却し、そしてＨＣｌ ４ＮでｐＨ４に酸性化 させた。沈殿が有機相に出現した。これらの２相を分離させ、そして有機相を濾 過した。この手順（酢酸エチルの添加、２相の分離、および有機相の濾過）を３ 回繰り返して３．０５ｇの白色固体を取得した。追加的１．３８ｇを全ての有機 相を合わせ、そしてエーテルを加えることにより取得した（収量：４．４２７ｇ 、５９％）。 実施例３８２ とＮ−１−カルボキシメチルチミンとのカップリング 化合物２（４ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（１ ．９７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（１．７５ｇ、１０．７ｍｍｏｌ ）、およびＤＩＥＡ（１．２ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ） ／ＤＭＦ（５０ｍｌ）の混合物中に溶解した。０℃での冷却の後にＤＣＣ（２． ２ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの反応混合物を０℃で１／２時間、 次いで室温で２．５時間撹拌した。ＤＣＵを濾過し、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１ ００ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機相をＮａＨＣＯ₃ １Ｍ（３×１００ｍｌ ）、ＫＨＳＯ₄ １Ｍ（３×１００ｍｌ）、Ｈ₂Ｏ（２×１００ｍｌ）で洗浄し、 Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして減圧下で蒸発させた。得られる油状物をク ロロホルム／エーテル中で結晶化させて４．０４ｇ（７５％）の生成物を生じた 。 実施例３９３ の４への水素化分解 化合物３（４ｇ、７．９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）中に溶解した。 ０℃下で１０％のＰｄ／Ｃ（１．４ｇ）を加えた。この反応混合物を０℃下で１ 時間水素化し、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通して濾過し、そして溶媒を減圧下 で除去して３．０ｇ（１００％）の４を取得した。 実施例４０ 塩酸Ｎ−（酢酸ベンジル）−グリシンエチルエステル（５） 室温でブロモ酢酸ベンジル（５．７ｍｌ、３６ｍｍｏｌ）を１０分間にわたり 、純粋ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）中に溶解した塩酸グリシンエチルエステル（５ｇ 、３６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０．４３ｍｌ、０．０７２ｍｏｌ ）の溶液に加えた。室温で４日置いた後に溶媒を減圧下で除去した。残渣を酢酸 エチル（５０ｍｌ）／Ｈ₂Ｏ（２５ｍｌ）中に溶解した。２つの相の分離後に有 機相を水（８×２５ｍｌ）で十分に洗浄した。溶媒の蒸発後に得られる油状物を エーテル（２０ｍｌ）／水（３０ｍｌ）中に溶解し、そしてｐＨ４．５に酸性化 させた。２相の分離後に水相を濃縮し、そして得られる油状物を冷エーテル中で 結晶化させて４ｇ（３９％）の生成物を生じた。 実施例４１５ とＮ−１−カルボキシメチルチミンをカップリングさせて６を得る 化合物５（２．８ｇ、９．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（ １．７９ｇ、９．７ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（１．６ｇ、９．７ｍｍｏｌ）、 およびＤＩＥＡ（１．７ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）／ＤＭ Ｆ（３０ｍｌ）の混合物中に溶解した。０℃での冷却後にＤＣＣ（２．０ｇ、９ ．７ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの反応混合物を０℃で１／２時間、次いで室温 で４時間撹拌した。ＤＣＵを濾過し、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂（１２０ｍｌ）で洗浄し た。合わせた有機相をＮａＨＣＯ₃ １Ｍ（３×６０ｍｌ）、ＫＨＳＯ₄ １Ｍ（ ３×６０ｍｌ）、Ｈ₂Ｏ（２×６０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過 し、そして減圧下で蒸発させた。得られる油状物をクロロホルム（６０ｍｌ）／ 石油エーテル（１２０ｍｌ）中で結晶化させて３．２３５ｇ（８０％）の６を生 じた。 実施例４２６ の７への水素化分解 化合物６（４ｇ、９．６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１００ｍｌ）／ＤＭＦ（２５ ｍｌ）中に溶解した。０℃で１０％Ｐｄ／Ｃ（１．６ｇ）を加えた。この反応混 合物を０℃で１時間水素化し、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通して濾過し、そし て溶媒を減圧下で除去して３．１２ｇ（９９％）の７を取得した。 実施例４３４ および７をカップリングさせて８を得る 化合物４（２．８ｇ、７．６ｍｍｏｌ）、７（２．５ｇ、７．６ｍｍｏｌ）、 ＤｈｂｔＯＨ（１．２４ｇ、７．６ｍｍｏｌ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）／ＤＭ Ｆ（５０ｍｌ）の混合物中に溶解した。０℃での冷却の後にＤＣＣ（１．５６ｇ 、７．６ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの反応混合物を０℃で１／２時間、次いで 室温で一晩撹拌した。ＤＵＣを濾過し、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍｌ）で洗浄 した。合わせた有機相をＮａＨＣＯ₃ １Ｍ（３×１００ｍｌ）、ＫＨＳＯ₄ １ Ｍ（３×１００ｍｌ）、Ｈ₂Ｏ（２×１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥 し、濾過し、そして減圧下で蒸発させた。得られる油状物をクロロホルム（３０ ｍｌ）／石油エーテル（６０ｍｌ）中で結晶化させた。この物質をクロロホルム （３０ｍｌ）／石油エーテル（２５ｍｌ）中で再結晶化させて０．６０８ｇ（１ ２％）の８を取得した。 実施例４４８ を加水分解して９を得る 化合物８（２５ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を純粋エタノール（５ｍｌ）中に 溶解した。その後にＮａＯＨ １Ｍ（１ｍｌ）を加えた。この反応混合物を室温 で３５分間撹拌し、そして冷却後にＤｏｗｅｘ ５０Ｗ（約１ｇ）で中性化した 。濾過および溶媒の蒸発後に、酸９を白色固体として取得した（収量１８ｍｇ（ ８２％））。 スキームＩＩ 実施例４５ アラニンベンジルエステル（１０） 塩化チオニル（９．８ｍｌ、１３５ｍｍｏｌ、１．２等量）を１５分間にわた り滴下により、窒素下で撹拌され、かつ−１０℃に冷却されるベンジルアルコー ル（２１０ｍｌ）に加えた。アラニン（１０．０ｇ、１１２ｍｍｏｌ、１．０等 量）を１０分間にわたり数回に分けて加えた。反応混合物を６０−７０℃で一晩 加熱した。この反応混合物を減圧下で蒸発させ、そして残渣を水（１５０ｍｌ） 中に溶解した。４Ｎ ＨＣｌ（水溶液）を加えてｐＨを１〜２に調節し、そして 水相をジクロロメタン（２×２００ｍｌ）で抽出した。有機相を塩酸（ｐＨ１、 １×５０ｍｌ）で洗浄した。水相を回収し、２Ｎ ＮａＯＨ（水溶液）を加えて アルカリ化させ（ｐＨ９〜１０に）、そしてその後にジクロロメタン（２×２０ ０ｍｌおよび１×１００ｍｌ−アルカリ性抽出物）で抽出した。このアルカリ性 抽出物を乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、そして減圧下で蒸発させて１３．３９ ｇ（６７％）の表題化合物を無色油状物として取得した。この生成物をその塩酸 塩として特徴決定を行った。生成物（０．５０ｇ、２．８ｍｍｏｌ）をエーテル （５ｍｌ）中に溶解し、そしてエーテル（２ｍｌ）中のＨＣｌを加えた。沈殿物 を濾過により回収し、そしてエーテル（２×５ｍｌ）で洗浄して０．５７ｇ（９ ５％）の白色結晶の塩酸アラニンベンジルエステルを生じた。 実施例４６ 塩酸Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）アラニンベンジルエステル（１１） アラニンベンジルエステル（１０、８．８２ｇ、４９ｍｍｏｌ、１等量）をＭ ｅＯＨ（１００ｍｌ）中に溶解し、そして氷酢酸（１０．３４ｇ、１７２ｍｍｏ ｌ、３．５等量）を加えた。この混合物を０℃、窒素下で撹拌し、そしてシアノ ホウ水素化ナトリウム（１０．８２ｇ、１７２ｍｍｏｌ、３．５等量）を加えた 。ＭｅＯＨ（２００ｍｌ）中のＢｏｃ−アミノアセトアルデヒド（１５．６７ｇ 、９８ｍｍｏｌ、２等量）を２時間にわたり滴加した。この反応混合物を０℃で ３５分間、次いで４〜５℃で一晩撹拌した。水（３００ｍｌ）をこの反応混合物 に加え、そしてｐＨを固形炭酸ナトリウムを加えることにより９に調節した。こ の飽和溶液を濾過し、そしてその後にエーテル（３×５００ｍｌ）で抽出した。 有 機相を塩化ナトリウムと重炭酸ナトリウムの飽和水溶液の１：１混合物（１×４ ５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、そして減圧下で蒸発させ て２２．６０ｇの粗製Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノ−エチル）アラニンベンジルエ ステルを薄黄金色油状物として取得した。この粗生成物を乾燥エーテル（５００ ｍｌ）中に溶解し、そして０℃で撹拌した。その後にエーテル（６０ｍｌ）中の ＨＣｌをこの溶液に加え、そして得られる沈殿物を濾過により回収し、そして冷 乾燥エーテル（３×２０ｍｌ）で洗浄して７．２１ｇ（４１％）の１１を白色結 晶として取得した。母液を一晩冷蔵庫内に保持することにより２．１２ｇ（１２ ％）の第二収穫物を白色半結晶状物質として回収することができた。この第二収 穫物は第一収穫物よりもやや純度が劣っていた。 実施例４７ Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセチル）アラニンベ ンンジルエステル（１２） 塩酸Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）アラニンベンジルエステル（１１、３ ．００ｇ、８．４ｍｍｏｌ、１．０等量）を乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）中 に溶解し、そして０℃、窒素下で撹拌した。ＤＩＥＡ（１．５ｍｌ、８．４ｍｍ ｏｌ、１．０等量）、ジクロロメタン（３０ｍｌ）中のＤＨＢｔＯＨ（１．５０ ｇ、９，２ｍｍｏｌ、１．１等量）、ジクロロメタン（３０ｍｌ）中の酢酸１− チミニル（１．６９ｇ、９．２ｍｍｏｌ、１．１等量）、およびジクロロメタン （４０ｍｌ）中のＤＣＣ（２．０７ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、１．２等量）をこの 順で加えた。この反応混合物を０℃で１時間、次いで４〜５℃で一晩撹拌した。 沈殿したＤＣＵを濾過して取り出し、そしてジクロロメタン（３×１５ｍｌ）で 洗浄 した。濾液をその５倍容量に希釈されている飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３× １５０ｍｌ）、その３倍容量に希釈されている飽和硫酸水素カリウム水溶液（２ ×１５０ｍｌ）、飽和塩化ナトリウム水溶液（１×１５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥 し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濾過し、そして最後に減圧下で蒸発させて３．８３ｇの粗生 成物をピンク色のガラス質泡状物として生じた。この粗生成物を、溶出液として ＭｅＯＨ／ジクロロメタン（最初の分画が出現するまでは３／９７、ｖ／ｖ、次 いで５／９５、ｖ／ｖ）を用いてクロマトグラフィー（シリカ、０．０６３〜０ ．２００ｍｍ）にかけて２．８７ｇ（７０％）の１２の白色のガラス質泡状物を 取得した。１２は２つの配座異性体の混合物として単離され、それはアミド結合 のまわりの回転が制限されることに起因する。その結果ＮＭＲスペクトルのシグ ナルの幾つかのものは主要構成成分と微小構成成分とに別れた。以下に提示され る値は主要構成成分についてのものである。 実施例４８ Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセチル）アラニン（１３ ） Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセチル）アラニン ベンジルエステル（１２、２．０２ｇ、４．１ｍｍｏｌ、１等量）をＭｅＯＨ （１００ｍｌ）中に溶解し、そして０℃、窒素下で撹拌した。活性炭（１．７ｇ ）上の１０％パラジウムを加え、そしてこの混合物を大気圧下、０℃で１時間水 素化させ、この時に水素の取り込みは終了した（９１ｍｌ、４．１ｍｍｏｌ、１ 等量が消費された）。この反応混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通して濾過 し、これをＭｅＯＨで十分に洗浄した。回収した濾液を蒸発させて１．６５ｇ（ １００％）の１３を白色ガラス質泡状物として取得した。１３は２つの配座異性 体の混合物として単離され、それはアミド結合のまわりの回転が制限されること に起因する。その結果ＮＭＲスペクトルのシグナルの幾つかのものは主要構成成 分と微小構成成分とに別れた。以下に提示される値は主要構成成分についてのも のである。 実施例４９ ２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド部分の３’末端に結合し たペプチド核酸部分を有するキメラ高分子 ペプチド核酸の第一部分はＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ／０１２１９号によ り製造した。このペプチド核酸は保護化アミン基を有する単量体を用いてＣ末端 からＮ末端へと製造した。ペプチド領域の完成後に末端アミン保護基を除去し、 そして得られるアミンを、Ｖａｓｓｅｕｒ，ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ ．Ｓｏｃ． １９９２、１１４、４００６、の方法により製造された３’−Ｃ− （ホルミル）−２’，３’−ジデオキシ−５’−トリチルヌクレオチドと反応さ せた。このアミンとＣ−ホルミルヌクレオシドのアルデヒド部分との縮合をＶａ ｓｓｅｕｒ（既出）の条件により実施して中間体のオキシム結合を生じた。この オキシム結合をＶａｓｓｅｕｒ（既出）の還元的アルキル化条件下でＨＣＨＯ／ ＮａＢＨ₃ＣＮ／ＡｃＯＨを用いて還元して、メチルアルキル化アミン結合を介 してペプチド核酸に連結するヌクレオシドを生じた。その後に内部の２’−デオ キシホスホロチオエートヌクレオチド領域を、標準的な自動化ＤＮＡ合成プロト コール（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａ ｐｒａｃ ｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１ ９８４、を参照せよ）によりこのヌクレオシドから継続させる。 実施例５０ ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド部分の５’末端に結合したペプチド核酸 部分を有するキメラ高分子 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、標準的なプロトコール（Ｏｌｉｇ ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｅｄ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１ ９９１、を参照せよ）により固体支持体上での標準方法で製造する。このヌクレ オチド上のジメトキシトリチル保護基を標準様式で除去する。ペプチド領域のた めのペプチド合成は、この領域の第一ペプチド核酸のカルボキシル末端を、ＤＮ Ａ領域の最終ヌクレオチドの５’ヒドロキシと反応させることにより開始する。 カップリングをピリジン中のＤＥＡを介して実施して、ペプチドとヌクレオシド との間のエステル結合を形成する。その後にペプチド合成を特許出願第ＰＣＴ／ ＥＰ／０１２１９号の様式で継続させてペプチド核酸領域を完成させる。 実施例５１ キメラ鎖を含む二本鎖デュープレックス構造およびキメラ鎖を含む三本鎖トリプ レックス構造 デュープレックスおよびトリプレックス構造は、先の実施例の他のプロトコー ルにより実施例４２および４３のキメラ鎖を用いて形成されるであろう。デュー プレックス構造は、ＰＮＡ−ＲＮＡもしくはＰＮＡ−ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖との間 、 ＰＮＡ−ＲＮＡもしくはＰＮＡ−ＤＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間、ＰＮＡ−ＲＮＡも しくはＰＮＡ−ＤＮＡ鎖とＰＮＡ鎖との間、あるいはＰＮＡ−ＲＮＡもしくはＰ ＮＡ−ＤＮＡ鎖と更に別のＰＮＡ−ＤＮＡもしくはＰＮＡ−ＲＮＡキメラ鎖との 間のデュープレックスを含みうる。トリプレックス構造は、ｄｓＤＮＡもしくは 二本鎖ＰＮＡ構造とトリプレックス形成したＰＮＡ含有性キメラ鎖を含みうる。 更に別のトリプレックス構造は、単一のＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖とトリプレック ス形成した２本のＰＮＡ含有性キメラを含みうる。さらに別のトリプレックス構 造は、追加のＰＮＡ含有性キメラ、追加のＰＮＡ鎖、あるいはＤＮＡもしくはＲ ＮＡ鎖とトリプレックス形成したＰＮＡを単一のＰＮＡ含有性キメラに加えて含 みうる。 実施例５２ 一本鎖ＰＮＡ含有性キメラと転写因子もしくは他の蛋白質との間の結合 ＰＮＡ含有性キメラ鎖を用いて一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、転写因 子、もしくは他の蛋白質への結合を行うか、あるいは別の場合ではそれらを変調 させることができるであろう。ＰＮＡ含有性キメラの使用の際には、そのキメラ と転写因子もしくは他の蛋白質との間の結合の一部は、そのキメラのＤＮＡもし くはＲＮＡ部分の糖−リン酸エステル主鎖との間の結合、およびそのキメラのＰ ＮＡ部分のリガンド（例えば核塩基）間の水素結合であろう。糖−ホスフェート 主鎖への結合には、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、あるいは ＤＮＡもしくはＲＮＡの主鎖として用いることができる他の結合が含まれる。他 の例では、結合は、そのキメラのＰＮＡ部分のリガンド（核塩基を初めとする） もしくはそのキメラの核酸部分の核塩基上の疎水性基と、結合しつつある蛋白質 上の同様の疎水性基との間の疎水性接触を含みうる。キメラ鎖上のこのような疎 水性基にはチミン核塩基上のメチル基が含まれる。 実施例５３ 「逆」単量体を有するＰＮＡ二量体（ｄｅｔＴ−ｉｄａＴ） Ａ． 二塩酸モノＢｏｃ−ジエチレントリアミン ＣＨＣｌ₃（４００ｍｌ）中の炭酸ｔ−ブチル−ｐ−ニトロフェニル（１０ｇ 、０．０１４８ｍｏｌ）の溶液を、ＣＨＣｌ₃（２５０ｍｌ）中のジエチレント リアミン（４５ｍｌ、０．４１７ｍｏｌ）の溶液に０℃で３時間にわたり加えた 。その後にこの反応混合物を室温で一晩撹拌した。 出現する沈殿物を濾過し、そしてＣＨＣｌ₃で洗浄した。溶媒を蒸発させ、最 初に水流式アスピレーターを用い、次いで油圧ポンプを用いて（０．０５ｍｍＨ ｇ、５０℃）減圧下で蒸発させた。 残渣を酢酸エチル（５０ｍｌ）とＨ₂Ｏ（５０ｍｌ）の混合物中に溶解した。 この溶液を４ＮのＨＣｌでｐＨ４に酸性化し、そして酢酸エチルで抽出した（３ ×５０ｍｌ）。この水溶液を２ＮのＮａＯＨでｐＨ９に調節し、そして酢酸エチ ル（３×５０ｍｌ）で抽出した。その後に水相をｐＨ１１．５に調節し、そして 酢酸エチル（１０×５０ｍｌ）で抽出した。最終抽出の合わせた有機相を減圧下 で蒸発させ、そして得られる油状物を水（５０ｍｌ）中に溶解し、そしてｐＨ５ に酸性化した。水の蒸発により薄黄色固体が生じ、これをエーテルで十分に洗浄 した（収量：６．４１ｇ、５５％）。 Ｂ． 塩酸Ｂｏｃ−，Ｚ−ジエチレントリアミン 実施例５３Ａの生成物（５．５ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）を含み、ｐＨ１１に調 節してあるジオキサン（５０ｍｌ）／水（５０ｍｌ）の溶液に、ジオキサン（５ ０ｍｌ）中の炭酸ベンジル−ニトロフェニル（５．４４ｇ、１９．９ｍｍｏｌ） の溶液を０℃で７０分間にわたり、２ＮのＮａＯＨで１１にｐＨを維持しながら 加えた。その後にこの反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。 その後に酢酸エチル（１００ｍｌ）を加え、そしてこの反応混合物を０℃に冷 却し、そして４ＮのＨＣｌでｐＨ４に酸性化した。沈殿物が有機相に出現した。 ２つの相を分離させ、そして有機相を濾過した。 これらの操作（酢酸エチルの添加、２相の分離、および有機相の濾過）を３回 繰り返した。このようにして白色固体（３．０５ｇ）を回収した。追加的な１． ３８ｇは、全ての有機相を合わせ、そしてエーテルを加えることにより取得した 。（収量：４．４２７ｇ、５９％）。 Ｃ． Ｎ−１−カルボキシメチルチミンとのカップリング 実施例５３Ｂの生成物（４ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−１−カルボキシメチ ルチミン（１．９７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（１．７５ｇ、１０ ．７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（１．９ｍｌ、１１．２ｍｍｏｌ）を、ＣＨ₂ Ｃｌ₂（５０ｍｌ）／ＤＭＦ（５０ｍｌ）の混合物中に溶解した。０℃での冷却 後にＤＣＣ（２．２ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの反応混合物を０ ℃で０．５時間、次いで室温で２．５時間撹拌した。その後にＤＣＵを濾過し、 そしてＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１００ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機相を１ＭのＮａ ＨＣＯ₃（３×１００ｍｌ）、１ＭのＫＨＳＯ₄（３×１００ｍｌ）、Ｈ₂Ｏ（２ ×１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして減圧下で蒸発さ せた。得られる油状物をクロロホルム／エーテル中で結晶化させた。（収量：４ ．０４ｇ、７５％）。 Ｄ． 水素化分解 実施例５３Ｃの生成物（４ｇ、７．９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）中 に溶解した。０℃で１０％のＰｄ／Ｃ（１．４ｇ）を加えた。この反応混合物を ０℃で１時間水素化し、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通して濾過し、そして溶媒 を減圧下で除去して４を取得した（収量：３．０ｇ、１００％）。 Ｅ． 塩酸Ｎ−（酢酸ベンジル）−グリシンエチルエステル 室温でブロモ酢酸ベンジル（５．７ｍｌ、３６ｍｍｏｌ）を１０分間にわたり 、純粋エタノール（１００ｍｌ）中に溶解した塩酸グリシンエチルエステル（５ ｇ、３６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０．４３ｍｌ、０．０７２ｍｏ ｌ）の溶液に加えた。室温で４日置いた後に溶媒を減圧下で除去した。残渣を酢 酸エチル（５０ｍｌ）／Ｈ₂Ｏ（２５ｍｌ）中に溶解した。２つの相の分離後に 有機相を水（８．２５ｍｌ）で十分に洗浄した。溶媒の蒸発後に得られる油状物 をエーテル（２０ｍｌ）／水（３０ｍｌ）中に溶解し、そしてｐＨ４．５に酸性 化した。２つの相の分離後に水相を濃縮し、そして得られる油状物を冷エーテル 中で結晶化した。（収量４ｇ、３９％）。 Ｆ． Ｎ−１−カルボキシメチルチミンのカップリング 実施例５３Ｄの生成物（２．８ｇ、９．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−１−カルボキシメ チルチミン（１．７９ｇ、９．７ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（１．６ｇ、９．７ ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（１．７ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（３ ０ｍｌ）／ＤＭＦ（３０ｍｌ）の混合物中に溶解した。０℃での冷却後にＤＣＣ （２．０ｇ、９．７ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの反応混合物を０℃で０．５時 間、次いで室温で４時間撹拌した。その後にＤＣＵを濾過し、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂ （１２０ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機相を１ＭのＮａＨＣＯ₃（３×６０ｍ ｌ）、１ＭのＫＨＳＯ₄（３×６０ｍｌ）、Ｈ₂Ｏ（２×６０ｍｌ）で洗浄し、Ｎ ａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして減圧下で蒸発させた。得られる油状物をクロ ロホルム（６０ｍｌ）／石油エーテル（１２０ｍｌ）中で結晶化させた。（収量 ：３．２３５ｇ、８０％）。 Ｇ． 水素化分解 実施例５３Ｅの生成物（４ｇ、９．６ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍｌ） ／ＤＭＦ（２５ｍｌ）中に溶解した。０℃で１０％のＰｄ／Ｃ（１．６ｇ）を加 えた。この反応混合物を０℃で１時間水素化し、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通 して濾過し、そして溶媒を減圧下で除去した。（収量＝３．１２ｇ、９９％）。 Ｈ． カップリング 実施例５３Ｄの生成物（２．８ｇ、７．６ｍｍｏｌ）および５３Ｆの生成物（ ２．５ｇ、７．６ｍｍｏｌ）、 ならびにＤｈｂｔＯＨ（１．２４ｇ、７．６ｍ ｍｏｌ）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）／ＤＭＦ（５０ｍｌ）の混合物中に溶解し た。０℃での冷却後にＤＣＣ（１．５６ｇ、７．６ｍｍｏｌ）を加え、そしてこ の反応混合物を０℃で０．５時間、次いで室温で一晩撹拌した。その後にＤＣＵ を濾過し、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機相を１Ｍ のＮａＨＣＯ₃（３×１００ｍｌ）、１ＭのＫＨＳＯ₄（３×１００ｍｌ）、Ｈ₂ Ｏ（２×１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして減圧下 で蒸発させた。得られる油状物をクロロホルム（３０ｍｌ）／石油エーテル（６ ０ｍｌ）中で結晶化させた。この物質をクロロホルム（３０ｍｌ）／石油エーテ ル（２５ｍｌ）中で再結晶させて純粋な化合物を取得した。（収量：０．０６ｇ 、１２％）。 Ｉ． 加水分解 実施例５３Ｇの生成物（５２９ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を純粋エタノール（１ ００ｍｌ）中に溶解した。その後にＮａＯＨ １Ｍ（２０ｍｌ）を加えた。この 反応混合物を室温で３０分間撹拌し、そして冷却後にＤｏｗｅｘ ５０Ｗ（約１ ３ｇ）で中性化した。濾過、Ｈ₂Ｏ、エタノールでの洗浄、および溶媒の除去後 に残渣をエーテル中に懸濁させ、そして濾過した。ＨＰＬＣで純粋である酸性生 成物を白色固体として取得した（収量４５０ｍｌ、８６％）。 実施例５４ 「逆」単量体を有するＰＮＡオリゴマー 実施例５３で製造した二量体を、一般的には実施例１に従ってＰＮＡ Ｈ−Ｔ Ｔ（ｄｅｔＴ−ｉｄａＴ）ＣＣＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨ₂ （配列番号５３）中に 取り込ませた。このＰＮＡと、１０量体 ５’ｄ（ＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧ） （ 配列番号５４）および ５’ｄ（ＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡ） （配列番号５５）と の間の複合体の融解温度Ｔ_mは、ｐＨ７ではそれぞれ５５℃および４３．５℃で あった。比較により、一般的に実施例１に従って製造されるＰＮＡ Ｈ−ＴＴＴ ＣＣＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨ₂ （配列番号５６）とこれらの１０量体との間の複 合体のＴ_mは、ｐＨ７ではそれぞれ５８．５℃および４０．５℃であった。 当業者は、本発明の好ましい態様に対する多数の変化および改変が可能である こと、ならびにそのような変化および改変は本発明の精神から逸脱することなく 行うことができることを認識するであろう。従って、添付される請求の範囲は、 本発明の真の精神および範囲内に含まれるこのような等価的変異物の全てを含有 することを意図するものである。

【手続補正書】 【提出日】１９９６年２月２日 【補正内容】 請求の範囲 １．第１の核酸鎖および第２および第３の鎖を含む複合体であって、 前記第２および第３の鎖は独立して、連結部分により共有結合している一連のリ ガンドを含み； 前記第２の鎖の連結部分の少なくとも１つは、アミド、チオアミド、スルフィン アミドまたはスルホンアミド連結を含み、前記第２の鎖上の複数の前記リガンド は前記第１の鎖と相互作用し；そして 前記第３の鎖の連結部分の少なくとも１つは、アミド、チオアミド、スルフィン アミドまたはスルホンアミド連結を含み、前記第３の鎖上の複数の前記リガンド は前記第１の鎖とまたは前記第２の鎖上の前記リガンドと相互作用する； ことを特徴とする複合体。 ２．前記第２の鎖と前記第３の鎖のそれぞれが、独立して、アミド、チオアミド 、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結を介して連結している複数のモノ マー性単位を含む、請求項１記載の複合体。 ３．前記第１の鎖がＤＮＡ鎖である、請求項１記載の複合体。 ４．前記第１の鎖がＲＮＡ鎖である、請求項１記載の複合体。 ５．前記モノマー性単位がアミノエチルグリシン単位を含む、請求項２記載の複 合体。 ６．前記第２および前記第３の鎖が、独立して、式： ［式中、ｎは少なくとも２であり； Ｌ¹−Ｌⁿのそれぞれは、水素、ヒドロキシ、（Ｃ¹−Ｃ⁴）アルカノイル、天然に 生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカレーター 、 核塩基結合基、複素環部分、およびレポーターリガンドからなる群より独立して 選択され； Ｃ¹−Ｃⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_y［式中、Ｒ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然に生 ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選択され、またはＲ⁶およびＲ⁷は独立して 、水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒド ロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ＮＲ³Ｒ⁴および ＳＲ⁵［式中、Ｒ³およびＲ⁴は上で定義したとおりであり、Ｒ⁵は水素である］、 （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはヒドロキシ置換、アルコキシ置換もしくはアルキ ルチオ置換された（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルからなる群より選択され、または、Ｒ⁶ およびＲ⁷は一緒になって脂環式または複素環式系を形成する］であり； Ｄ¹−Ｄⁿのそれぞれは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_z［式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は上で定義したと おりである］であり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は、 ２より大きいが１０以下てあり； Ｇ¹−Ｇ^n-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ− 、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−［式中、Ｒ³は上で定義したとおりである ］であり； Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿのそれぞれは、 （ａ） Ａは式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）または（IIｄ）の基であり、かつ ＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺である；または （ｂ） Ａは式（IIｄ）の基であり、かつＢはＣＨである： ［式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０以 下であり； ｒおよびｓのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０以 下であり； Ｒ¹およびＲ²のそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコキシも しくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ 、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選択され； Ｒ³およびＲ⁴のそれぞれは、独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキ シもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄ ）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノからなる群よ り選択される］ ように選択され； Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ₃Ｈもしくは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ"、また は−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；そして Ｉは−ＮＨＲ'"Ｒ""または−ＮＲ'"Ｃ（Ｏ）Ｒ""［式中、Ｒ'、Ｒ"、Ｒ'"および Ｒ""は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、イン ターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、ステロイド 、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドト リホスフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および溶解性およ び不溶性ポリマーからなる群より選択される］ の化合物を含む、請求項１記載の複合体。 ７．前記第２の鎖および前記第３の鎖が、独立して、式III、IVまたはＶ： ［式中、それぞれのＬは、独立して、水素、フェニル、複素環式部分、天然に生 ずる核塩基、および天然に生じない核塩基からなる群より選択され； それぞれのＲ７'は、独立して、水素および天然に生ずるαアミノ酸の側鎖から なる群より選択され； ｎは１より大きい整数であり； ｋ、ｌおよびｍのそれぞれは、独立して、０または１から５の整数であり； それぞれのｐは０または１であり； Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そして ＲⁱはＨまたはＣＯＣＨ₃である］ の化合物を含む、請求項１記載の複合体。 ８．前記第１の鎖と第２の鎖との間の前記相互作用が、前記第１の鎖の複素環塩 基と前記第２の鎖上のリガンドとの間で生じ； 前記第１の鎖と第３の鎖との間の前記相互作用が、前記第１の鎖の複素環塩基と 前記第３の鎖上のリガンドとの間で生じ；そして 前記第２の鎖のリガンドと前記第１の鎖の複素環塩基との前記相互作用がワトソ ン−クリック水素結合を介するものであり、前記第２の鎖のリガンドと前記第１ の鎖の複素環塩基との前記相互作用がワトソン−クリック水素結合またはホーグ スティーン水素結合の１つを介するものである、請求項１記載の複合体。 ９．第１の核酸鎖、第２の核酸鎖および第３の鎖を含む複合体であって、 前記第３の鎖は連結部分により共有結合している一連のリガンドを含み、ここで 複数の前記リガンドは前記第１の鎖および前記第２の鎖の少なくとも１つと相互 作用し；そして 前記第３の鎖の連結部分の少なくとも１つは、アミド、チオアミド、スルフィン アミドまたはスルホンアミド連結を含む； ことを特徴とする複合体。 １０．前記第３の鎖が、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホン アミド主鎖連結を介して連結している複数のモノマー性単位を含む、請求項９記 載の複合体。 １１．前記相互作用が、前記第１の鎖または前記第２の鎖の複素環塩基と前記第 ３の鎖上のリガンドとの間で生ずる、請求項９記載の複合体。 １２．前記第１の鎖および前記第２の鎖がＤＮＡ鎖である、請求項９記載の複合 体。 １３．前記ＤＮＡ鎖が相補的ＤＮＡ鎖である、請求項１２記載の複合体。 １４．前記モノマー性単位がアミノエチルグリシン単位を含む、請求項１０記載 の複合体。 １５．前記第３の鎖が、式： ［式中、ｎは少なくとも２であり； Ｌ¹−Ｌⁿのそれぞれは、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に 生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカレーター 、核塩基結合基、複素環部分、およびレポーターリガンドからなる群より独立し て選択され； Ｃ¹−Ｃⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_y［式中、Ｒ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然に生 ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選択され、またはＲ⁶およびＲ⁷は独立して 、水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒド ロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ＮＲ³Ｒ⁴および ＳＲ⁵［式中、Ｒ³およびＲ⁴は上で定義したとおりであり、Ｒ⁵は水素である］、 （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはヒドロキシ置換、アルコキシ置換もしくはアルキ ルチオ置換された（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルからなる群より選択され、または、Ｒ⁶ およびＲ⁷は一緒になって脂環式または複素環式系を形成する］であり； Ｄ¹−Ｄⁿのそれぞれは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_z［式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は上で定義したと おりである］であり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は、 ２より大きいが１０以下であり； Ｇ¹−Ｇ^n-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ− 、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−［式中、Ｒ³は上で定義したとおりである ］であり； Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿのそれぞれは、 （ａ） Ａは式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）または（IIｄ）の基であり、かつ ＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺である；または （ｂ） Ａは式（IIｄ）の基であり、かつＢはＣＨである： ［式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０以 下であり； ｒおよびｓのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０以 下であり； Ｒ¹およびＲ²のそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコキシも しくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ 、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選択され； Ｒ³およびＲ⁴のそれぞれは、独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキ シもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄ ）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノからなる群よ り選択される］ ように選択され； Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ₃Ｈもしくは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ"、また は−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；そして Ｉは−ＮＨＲ'"Ｒ""または−ＮＲ'"Ｃ（Ｏ）Ｒ""［式中、Ｒ'、Ｒ"、Ｒ'"および Ｒ""は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、イン ターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、ステロイド 、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドト リホスフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および溶解性およ び不溶性ポリマーからなる群より選択される］ の化合物を含む、請求項９記載の複合体。 １６．前記第３の鎖が、式III、IVまたはＶ： ［式中、それぞれのＬは、独立して、水素、フェニル、複素環式部分、天然に生 ずる核塩基、および天然に生じない核塩基からなる群より選択され； それぞれのＲ７’は、独立して、水素および天然に生ずるαアミノ酸の側鎖から なる群より選択され； ｎは１より大きい整数であり； ｋ、ｌおよびｍのそれぞれは、独立して、０または１から５の整数であり； それぞれのｐは０または１であり； Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そして ＲⁱはＨまたはＣＯＣＨ₃である］ の化合物を含む、請求項９記載の複合体。 １７．二本鎖ＤＮＡを修飾する方法であって、 前記二本鎖ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンア ミド連結部分により共有結合している一連のリガンドを含む化合物と接触させ、 ここで複数の前記リガンドは前記二本鎖ＤＮＡと相互作用し、このことにより前 記ＤＮＡ鎖の一方を置き換え；そして 前記置き換えられた鎖を修飾する； の各工程を含む方法。 １８．前記置き換えられた鎖の修飾が前記鎖の切断を含む、請求項１７記載の方 法。 １９．前記切断が酵素により行われる、請求項１８記載の方法。 ２０．前記化合物が前記二本鎖ＤＮＡの１つの鎖とワトソン−クリック水素結合 を形成する、請求項１７記載の方法。 ２１．前記化合物の第１の分子が前記二本ＤＮＡの第１の鎖とワトソン−クリッ ク水素結合を形成し、前記化合物の第２の分子が前記第１の鎖とホーグスティー ン水素結合を形成する、請求項１７記載の方法。 ２２．前記置き換えられた鎖が、前記置き換えられた鎖への結合部分の共有結合 化により修飾され、このことにより、前記置き換えられた鎖を消化する細胞性修 復機構を開始させる、請求項１７記載の方法。 ２３．遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記遺伝子を、アミド、チオアミ ド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連の リガンドを含む化合物と接触させることを含み、ここで複数の前記リガンドが前 記遺伝子と相互作用することを特徴とする方法。 ２４．遺伝子の発現の阻害が転写妨害を含む、請求項２３記載の方法。 ２５．前記転写妨害がＲＮＡポリメラーゼ休止を含む、請求項２４記載の方法。 ２６．ＤＮＡ制限部位において制限酵素の活性を変調させる方法であって、前記 ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部 分により共有結合した一連のリガンドを含む化合物と接触させ、このことにより 複数の前記リガンドを前記制限部位の近傍の前記ＤＮＡと結合させることを含む 方法。 ２７．ＤＮＡをシークエンスする方法であって、 前記ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連 結部分により共有結合した一連のリガンドを含む化合物と接触させ、このことに より複数の前記リガンドをＤＮＡ制限部位の近傍の前記ＤＮＡと結合させ； 前記ＤＮＡを、前記ＤＮＡを前記制限部位において認識して切断する制限酵素で 処理し；そして 前記切断の少なくとも１つの生成物を同定する ことを含む方法。 ２８．ＤＮＡの転写を阻害する方法であって、 その転写が阻害されるべきＤＮＡを選択し；そして 前記ＤＮＡおよび前記ＤＮＡのための転写因子を含む混合物に、アミド、チオア ミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連 のリガンドを含む化合物を加え、このことにより、複数の前記リガンドを前記転 写因子に結合させる ことを含む方法。 ２９．ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖ＤＮＡへの結合を変調させる方法であって、 前記ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連 結部分により共有結合した一連のリガンドを含む化合物と接触させ、このことに より複数の前記リガンドを前記ＤＮＡに結合させ；そして 前記複合体をＲＮＡポリメラーゼにさらす ことを含む方法。 ３０．遺伝子の転写を開始させる方法であって、前記遺伝子を、アミド、チオア ミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連 のリガンドを含む化合物と接触させ、ここで複数の前記リガンドは前記遺伝子と 相互作用して前記遺伝子の二本鎖ＤＮＡを融解させ、このことにより前記ＤＮＡ の鋳型鎖をＲＮＡポリメラーゼによる認識にさらす ことを含む方法。 ３１．前記遺伝子を、前記ＤＮＡの非コード鎖とハイブリッド鎖を形成する条件 下において前記化合物と接触させる、請求項３０記載の方法。 ３２．前記遺伝子を、前記ＤＮＡとのハイブリッド鎖および鋳型鎖「Ｄ」ループ の両方を形成する条件下において前記化合物と接触させる、請求項３０記載の方 法。 ３３．ＲＮＡポリメラーゼを二本鎖ＤＮＡと結合させる方法であって、 前記ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連 結部分により共有結合した一連のリガンドを含む化合物と接触させ、ここで複数 の前記リガンドは前記ＤＮＡと相互作用し；そして 前記化合物および前記ＤＮＡを前記ＲＮＡポリメラーゼにさらす ことを含む方法。 ３４．転写を変調するためのハイブリッド複合体であって、 二本鎖ＤＮＡ； アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共 有結合した一連のリガンドを含む化合物であって、ここで複数の前記リガンドは 前記二本鎖ＤＮＡと相互作用する化合物；および 前記ＤＮＡおよび前記化合物の少なくとも１つと接触しているＲＮＡポリメラー ゼ； を含む複合体。 ３５．二本鎖ＤＮＡ；および アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共 有結合した一連のリガンドを含む化合物であって、ここで複数の前記リガンドは 前記二本鎖ＤＮＡと相互作用する化合物； を含む、合成転写因子。 ３６．第１および第２の合成鎖を含み、ここでそれぞれの鎖は、アミド、チオア ミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した約６ −５０個の一連のリガンドを含み、前記鎖のそれぞれは、前記遺伝子の少なくと も１つのＤＮＡ鎖上の近接する領域内の塩基配列を、前記鎖が前記ＤＮＡ鎖上に 互いに近接して結合するように認識するリガンド配列を有することを特徴とする 、配列特異的遺伝子活性化剤。 ３７．前記合成鎖のリガンド配列が、前記ＤＮＡの非鋳型鎖に相補的である、請 求項３６記載の遺伝子活性化剤。 ３８．前記合成鎖のリガンド配列が、前記合成鎖の前記遺伝子への結合により、 前記遺伝子上の前記合成鎖の結合部位を含むＤＮＡのループが形成されるように 選択される、請求項３６記載の遺伝子活性化剤。 ３９．第１および第２の合成鎖を含み、ここで それぞれの鎖は、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド 連結部分により共有結合した約６−５０個の一連のリガンドを含み； 前記第１の鎖は、前記遺伝子の一方のＤＮＡ鎖の塩基配列を認識するリガンド配 列を有し； 前記第２の鎖は、前記遺伝子の他方のＤＮＡ鎖の塩基配列を認識するリガンド配 列を有し；かつ 前記一方のＤＮＡ鎖上の認識される塩基配列と、前記他方のＤＮＡ鎖上の認識さ れる塩基配列が、前記遺伝子上で互いに近接して位置する； ことを特徴とする配列特異的遺伝子活性化剤。 ４０．前記合成鎖のリガンド配列が、前記合成鎖の前記遺伝子への結合により前 記遺伝子上の前記合成鎖の結合部位を含むＤＮＡループが前記遺伝子上に形成さ れるように選択される、請求項３９記載の遺伝子活性化剤。 ４１．ＤＮＡまたはＲＮＡを含む第１の鎖部分、およびアミド、チオアミド、ス ルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連のリガン ドを含む第２の鎖部分を含み、前記第１および前記第２の鎖部分が共有結合して いるキメラ化合物。 ４２．前記第１の鎖部分がＤＮＡを含む、請求項４１記載のキメラ構造。 ４３．二本鎖キメラ複合体であって、ここで 第１の鎖は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む第１の鎖部分、およびアミド、チオアミ ド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連の リガンドを含む第２の鎖部分を含み、前記第１および前記第２の鎖部分は共有結 合しており； 第２の鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアミド、チオアミド、スルフィンアミドも しくはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連のリガンドを含み；そし て 前記第１の鎖と前記第２の鎖は互いに相互作用してデュープレックス構造を形成 することを特徴とする複合体。 ４４．細胞間で転写因子の活性を変調する方法であって、 ＤＮＡまたはＲＮＡを含む第１の鎖部分、およびアミド、チオアミド、スルフィ ンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連のリガンドを含 む第２の鎖部分を共有結合させることによりキメラ構造を形成し、ここで複数の 前記リガンドは前記転写因子と結合し；そして 前記キメラ構造を細胞内に導入する； ことを含む方法。 ４５．さらに、前記リガンドおよび前記ＤＮＡまたはＲＮＡを、複数の前記リガ ンドが前記ＲＮＡまたはＤＮＡの糖−ホスフェート主鎖に結合するように選択す ることを含む、請求項４４記載の方法。 ４６．蛋白質の結合を細胞間で阻害する方法であって、 アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共 有結合した一連のリガンドを含む化合物を形成し、ここで複数の前記リガンドは 前記蛋白質に結合し；そして 前記構造を細胞内に導入する； ことを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人 ニールセン，ペーター・エー デンマーク王国デーコー―2980 コーデダ ル，イェルテヴァンゲット 509 (71)出願人 ベルグ，ロルフ・ホー デンマーク王国デーコー―2960 ロングス デド・カースド，スドランドヴァンゲット ６ (72)発明者 ブシャート，オレ デンマーク王国デーコー―3500 ベルラー ゼ，サナーゴールスヴェイ 73 (72)発明者 エグホルム，ミカエル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02173, レキシントン，レキシントン・リッジ・ド ライブ 1231 (72)発明者 ニールセン，ペーター・エー デンマーク王国デーコー―2980 コーデダ ル，イェルテヴァンゲット 509 (72)発明者 ベルグ，ロルフ・ホー デンマーク王国デーコー―2960 ロングス デド・カースド，スドランドヴァンゲット ６ (72)発明者 エッカー，デヴィッド・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, ルーカディア，サキソニー・ロード 1041 (72)発明者 モルガード，ニールス・エー デンマーク王国デーコー― 2830 ヴィー ラム，ソルゲンフリ，ベンヴェドバンゲッ ト 27

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第１の核酸鎖および第２および第３の鎖を含む複合体であって、 前記第２および第３の鎖は独立して、連結部分により共有結合している一連のリ ガンドを含み； 前記第２の鎖の連結部分の少なくとも１つは、アミド、チオアミド、スルフィン アミドまたはスルホンアミド連結を含み、前記第２の鎖上の複数の前記リガンド は前記第１の鎖と相互作用し；そして 前記第３の鎖の連結部分の少なくとも１つは、アミド、チオアミド、スルフィン アミドまたはスルホンアミド連結を含み、前記第３の鎖上の複数の前記リガンド は前記第１の鎖とまたは前記第２の鎖上の前記リガンドと相互作用する； ことを特徴とする複合体。 ２．前記第２の鎖と前記第３の鎖のそれぞれが、独立して、アミド、チオアミド 、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結を介して連結している複数のモノ マー性単位を含む、請求項１記載の複合体。 ３．前記第１の鎖がＤＮＡ鎖である、請求項１記載の複合体。 ４．前記第１の鎖がＲＮＡ鎖である、請求項１記載の複合体。 ５．前記モノマー性単位がアミド連結を介して連結している、請求項２記載の複 合体。 ６．前記モノマー性単位がそれぞれ、前記リガンドと前記モノマー性単位とを連 結させる第１の窒素原子および前記アミド、チオアミド、スルフィンアミドまた はスルホンアミド連結の一部を形成する第２の窒素原子を含む、請求項２記載の 複合体。 ７．前記第２の鎖または第３の鎖の少なくとも１つの、前記リガンドの大部分が ピリミジン塩基である、請求項２に記載の複合体。 ８．前記ピリミジン塩基がチミンおよびシトシンから選択される、請求項７記載 の複合体。 ９．前記核酸鎖がプリンリッチ鎖である、請求項２記載の複合体。 １０．前記モノマー性単位がアミノエチルグリシン単位を含む、請求項２記載の 複合体。 １１．前記第２および前記第３の鎖が、独立して、式： ［式中、ｎは少なくとも２であり； Ｌ¹−Ｌⁿのそれぞれは、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に 生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカレーター 、核塩基結合基、複素環部分、およびレポーターリガンドからなる群より独立し て選択され； Ｃ¹−Ｃⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_y［式中、Ｒ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然に生 ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選択され、またはＲ⁶およびＲ⁷は独立して 、水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒド ロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ＮＲ³Ｒ⁴および ＳＲ⁵［式中、Ｒ³およびＲ⁴は上で定義したとおりであり、Ｒ⁵は水素である］、 （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはヒドロキシ置換、アルコキシ置換もしくはアルキ ルチオ置換された（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルからなる群より選択され、または、Ｒ⁶ およびＲ⁷は一緒になって脂環式または複素環式系を形成する］であり； Ｄ¹−Ｄⁿのそれぞれは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_z［式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は上で定義したと おりである］であり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は、 ２より大きいが１０以下であり； Ｇ¹−Ｇ^n-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ− 、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−［式中、Ｒ³は上で定義したとおりである ］であり； Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿのそれぞれは、 （ａ） Ａは式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）または（IIｄ）の基であり、かつ ＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺である；または （ｂ） Ａは式（IIｄ）の基であり、かつＢはＣＨである： ［式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０以 下であり； ｒおよびｓのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０以 下であり； Ｒ¹およびＲ²のそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコキシも しくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ 、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選択され； Ｒ³およびＲ⁴のそれぞれは、独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキ シもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄ ）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノからなる群よ り選択される］ ように選択され； Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ₃Ｈもしくは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ"、また は−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；そして Ｉは−ＮＨＲ'"Ｒ""または−ＮＲ'"Ｃ（Ｏ）Ｒ""［式中、Ｒ'、Ｒ"、Ｒ'"および Ｒ""は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、イン ターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、ステロイド 、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドト リホスフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および溶解性およ び不溶性ポリマーからなる群より選択される］ の化合物を含む、請求項１記載の複合体。 １２．前記第２の鎖および前記第３の鎖が、独立して、式III、IVまたはＶ： ［式中、それぞれのＬは、独立して、水素、フェニル、複素環式部分、天然に生 ずる核塩基、および天然に生じない核塩基からなる群より選択され； それぞれのＲ７'は、独立して、水素および天然に生ずるαアミノ酸の側鎖から なる群より選択され； ｎは１より大きい整数であり； ｋ、ｌおよびｍのそれぞれは、独立して、０または１から５の整数であり； それぞれのｐは０または１であり； Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そして ＲⁱはＨまたはＣＯＣＨ₃である］ の化合物を含む、請求項１記載の複合体。 １３．前記第１の鎖と第２の鎖との間の前記相互作用が、前記第１の鎖の複素環 塩基と前記第２の鎖上のリガンドとの間で生ずる、請求項１記載の複合体。 １４．前記第１の鎖と第３の鎖との間の前記相互作用が、前記第１の鎖の複素環 塩基と前記第３の鎖上のリガンドとの間で生ずる、請求項１記載の複合体。 １５．前記相互作用が非共有結合の形成を含む、請求項１記載の複合体。 １６．リガンドの前記相互作用が水素結合を介するものである、請求項１記載の 複合体。 １７．前記第１の鎖と第２の鎖との間の前記相互作用が、前記第１の鎖の複素環 塩基と前記第２の鎖上のリガンドとの間で生じ； 前記第１の鎖と第３の鎖との間の前記相互作用が、前記第１の鎖の複素環塩基と 前記第３の鎖上のリガンドとの間で生じ；そして 前記第２の鎖のリガンドと前記第１の鎖の複素環塩基との前記相互作用がワトソ ン−クリック水素結合を介するものであり、前記第２の鎖のリガンドと前記第１ の鎖の複素環塩基との前記相互作用がワトソン−クリック水素結合またはホーグ スティーン水素結合の１つを介するものである、請求項１記載の複合体。 １８．第１の核酸鎖、第２の核酸鎖および第３の鎖を含む複合体であって、 前記第３の鎖は連結部分により共有結合している一連のリガンドを含み、ここで 複数の前記リガンドは前記第１の鎖および前記第２の鎖の少なくとも１つと相互 作用し；そして 前記第３の鎖の連結部分の少なくとも１つは、アミド、チオアミド、スルフィン アミドまたはスルホンアミド連結を含む； ことを特徴とする複合体。 １９．前記第３の鎖が、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホン アミド主鎖連結を介して連結している複数のモノマー性単位を含む、請求項１８ 記載の複合体。 ２０．前記相互作用が非共有結合の形成を含む、請求項１８記載の複合体。 ２１．前記相互作用が水素結合を含む、請求項１８記載の複合体。 ２２．前記相互作用が、前記第１の鎖または前記第２の鎖の複素環塩基と前記第 ３の鎖上のリガンドとの間で生ずる、請求項１８記載の複合体。 ２３．前記第１の鎖および前記第２の鎖がＤＮＡ鎖である、請求項１８記載の複 合体。 ２４．前記ＤＮＡ鎖が二本鎖ＤＮＡである、請求項２３記載の複合体。 ２５．前記ＤＮＡ鎖が相補的ＤＮＡ鎖である、請求項２３記載の複合体。 ２６．前記モノマー性単位がアミド連結を介して連結している、請求項１９記載 の複合体。 ２７．前記モノマー性単位がそれぞれ、前記リガンドと前記モノマー性単位とを 連結させる第１の窒素原子および前記アミド、チオアミド、スルフィンアミドま たはスルホンアミド連結の一部を形成する第２の窒素原子を含む、請求項１９記 載の複合体。 ２８．前記リガンドの大部分がピリミジン塩基である、請求項１８に記載の複合 体。 ２９．前記ピリミジン塩基がチミンおよびシトシンから選択される、請求項２８ 記載の複合体。 ３０．前記核酸鎖の１つがプリンリッチ鎖である、請求項１８記載の複合体。 ３１．前記モノマー性単位がアミノエチルグリシン単位を含む、請求項１９記載 の複合体。 ３２．前記第３の鎖が、式： ［式中、ｎは少なくとも２であり： Ｌ¹−Ｌⁿのそれぞれは、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に 生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカレーター 、核塩基結合基、複素環部分、およびレポーターリガンドからなる群より独立し て選択され； Ｃ¹−Ｃⁿのそれぞれは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_y［式中、Ｒ⁶は水素であり、Ｒ⁷は天然に生 ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選択され、またはＲ⁶およびＲ⁷は独立して 、水素、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒド ロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、ＮＲ³Ｒ⁴および ＳＲ⁵［式中、Ｒ³およびＲ⁴は上で定義したとおりであり、Ｒ⁵は水素である］、 （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはヒドロキシ置換、アルコキシ置換もしくはアルキ ルチオ置換された（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルからなる群より選択され、または、Ｒ⁶ およびＲ⁷は一緒になって脂環式または複素環式系を形成する］であり； Ｄ¹−Ｄⁿのそれぞれは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_z［式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は上で定義したと おりである］であり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は、 ２より大きいが１０以下であり； Ｇ¹−Ｇ^n-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ− 、−ＮＲ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−［式中、Ｒ³は上で定義したとおりである ］であり； Ａ¹−ＡⁿおよびＢ¹−Ｂⁿのそれぞれは、 （ａ） Ａは式（IIａ）、（IIｂ）、（IIｃ）または（IIｄ）の基であり、かつ ＢはＮまたはＲ³Ｎ⁺である；または （ｂ） Ａは式（IIｄ）の基であり、かつＢはＣＨである： ［式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０以 下であり； ｒおよびｓのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０以 下であり； Ｒ¹およびＲ²のそれぞれは、独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコキシも しくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ 、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より選択され； Ｒ³およびＲ⁴のそれぞれは、独立して、水素、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキ シもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ₁−Ｃ₄ ）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノからなる群よ り選択される］ ように選択され； Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯＮＲ'Ｒ"、−ＳＯ₃Ｈもしくは−ＳＯ₂ＮＲ'Ｒ"、また は−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；そして Ｉは−ＮＨＲ'"Ｒ""または−ＮＲ'"Ｃ（Ｏ）Ｒ""［式中、Ｒ'、Ｒ"、Ｒ'"および Ｒ""は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、イン ターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、ステロイド 、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドト リホスフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および溶解性およ び不溶性ポリマーからなる群より選択される］ の化合物を含む、請求項１８記載の複合体。 ３３．前記第３の鎖が、式III、IVまたはＶ： ［式中、それぞれのＬは、独立して、水素、フェニル、複素環式部分、天然に生 ずる核塩基、および天然に生じない核塩基からなる群より選択され； それぞれのＲ７’は、独立して、水素および天然に生ずるαアミノ酸の側鎖から なる群より選択され； ｎは１より大きい整数であり； ｋ、ｌおよびｍのそれぞれは、独立して、０または１から５の整数であり； それぞれのｐは０または１であり； Ｒ^hはＯＨ、ＮＨ₂または−ＮＨＬｙｓＮＨ₂であり；そして ＲⁱはＨまたはＣＯＣＨ₃である］ の化合物を含む、請求項１８記載の複合体。 ３４．二本鎖ＤＮＡを修飾する方法であって、 前記二本鎖ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンア ミド連結部分により共有結合している一連のリガンドを含む化合物と接触させ、 ここで複数の前記リガンドは前記二本鎖ＤＮＡと相互作用し、このことにより前 記ＤＮＡ鎖の一方を置き換え；そして 前記置き換えられた鎖を修飾する； の各工程を含む方法。 ３５．前記置き換えられた鎖の修飾が前記鎖の切断を含む、請求項３４記載の方 法。 ３６．前記切断が酵素により行われる、請求項３５記載の方法。 ３７．前記二本鎖ＤＮＡを細胞間で前記化合物と接触させ、前記酵素的切断が細 胞間に天然に存在する酵素により行われる、請求項３６記載の方法。 ３８．前記酵素がヌクレアーゼである、請求項３７記載の方法。 ３９．前記ヌクレアーゼがヌクレアーゼＳ₁である、請求項３８記載の方法。 ４０．前記化合物がさらに、前記置き換えられた鎖を修飾する成分を含む、請求 項３４記載の方法。 ４１．成分が前記置き換えられた鎖を切断する、請求項４０記載の方法。 ４２．複数の前記リガンドが前記ＤＮＡと水素結合する、請求項３４記載の方法 。 ４３．前記化合物が前記二本鎖ＤＮＡの１つの鎖とワトソン−クリック水素結合 を形成する、請求項３４記載の方法。 ４４．前記化合物の第１の分子が前記二本ＤＮＡの第１の鎖とワトソン−クリッ ク水素結合を形成し、前記化合物の第２の分子が前記第１の鎖とホーグスティー ン水素結合を形成する、請求項３１記載の方法。 ４５．前記置き換えられた鎖の修飾が、前記置き換えられた鎖の結合部分の共有 結合化を含む、請求項３４記載の方法。 ４６．前記置き換えられた鎖の修飾が、前記置き換えられた鎖を消化する細胞性 修復機構の活性化を含む、請求項３４記載の方法。 ４７．前記置き換えられた鎖が、前記置き換えられた鎖への結合部分の共有結合 化により修飾され、このことにより、前記置き換えられた鎖を消化する細胞性修 復機構を開始させる、請求項３４記載の方法。 ４８．遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記遺伝子を、アミド、チオアミ ド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連の リガンドを含む化合物と接触させることを含み、ここで複数の前記リガンドが前 記遺伝子と相互作用することを特徴とする方法。 ４９．複数の前記リガンドが前記遺伝子のＤＮＡと水素結合する、請求項４８記 載の方法。 ５０．遺伝子の発現の阻害が転写妨害を含む、請求項４８記載の方法。 ５１．前記転写妨害がＲＮＡポリメラーゼ休止を含む、請求項５０記載の方法。 ５２．前記転写妨害が前記遺伝子のプロモーター領域の外における転写休止を含 む、請求項５１記載の方法。 ５３．複数の前記リガンドが前記遺伝子の鋳型鎖に水素結合する、請求項４９記 載の方法。 ５４．前記化合物が、ポリアミド主鎖を介して連結している少なくとも６個のモ ノマー性単位を含み、前記モノマー性単位のそれぞれが前記リガンドの１つを含 む、請求項４８記載の方法。 ５５．遺伝子の転写を休止させる方法であって、前記遺伝子を、アミド、チオア ミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連 のリガンドを含む化合物と接触させ、このことにより複数の前記リガンドを前記 遺伝子の鋳型ＤＮＡ鎖と結合させることを含む方法。 ５６．ＤＮＡ制限部位において制限酵素の活性を変調させる方法であって、前記 ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部 分により共有結合した一連のリガンドを含む化合物と接触させ、このことにより 複数の前記リガンドを前記制限部位の近傍の前記ＤＮＡと結合させることを含む 方法。 ５７．ＤＮＡをシークエンスする方法であって、 前記ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連 結部分により共有結合した一連のリガンドを含む化合物と接触させ、このことに より複数の前記リガンドをＤＮＡ制限部位の近傍の前記ＤＮＡと結合させ； 前記ＤＮＡを、前記ＤＮＡを前記制限部位において認識して切断する制限酵素で 処理し；そして 前記切断の少なくとも１つの生成物を同定する ことを含む方法。 ５８．ＤＮＡの転写を阻害する方法であって、 その転写が阻害されるべきＤＮＡを選択し；そして 前記ＤＮＡおよび前記ＤＮＡのための転写因子を含む混合物に、アミド、チオア ミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連 のリガンドを含む化合物を加え、このことにより、複数の前記リガンドを前記転 写因子に結合させる ことを含む方法。 ５９．ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖ＤＮＡへの結合を変調させる方法であって、 前記ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連 結部分により共有結合した一連のリガンドを含む化合物と接触させ、このことに より複数の前記リガンドを前記ＤＮＡに結合させ；そして 前記複合体をＲＮＡポリメラーゼにさらす ことを含む方法。 ６０．遺伝子の転写を開始させる方法であって、前記遺伝子を、アミド、チオア ミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連 のリガンドを含む化合物と接触させ、ここで複数の前記リガンドは前記遺伝子と 相互作用して前記遺伝子の二本鎖ＤＮＡを融解させ、このことにより前記ＤＮＡ の鋳型鎖をＲＮＡポリメラーゼによる認識にさらす ことを含む方法。 ６１．前記遺伝子を、前記ＤＮＡの非コード鎖とハイブリッド鎖を形成する条件 下において前記化合物と接触させる、請求項６０記載の方法。 ６２．前記遺伝子を、前記ＤＮＡとのハイブリッド鎖および鋳型鎖「Ｄ」ループ の両方を形成する条件下において前記化合物と接触させる、請求項６０記載の方 法。 ６３．遺伝子の転写を開始させる方法であって、前記遺伝子を、アミド、チオア ミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連 のリガンドを含む化合物と接触させ、ここで複数の前記リガンドは前記遺伝子と 相互作用して前記遺伝子の二本鎖ＤＮＡを融解させ、このことにより転写伸長ル ープを形成する ことを含む方法。 ６４．ＲＮＡポリメラーゼを二本鎖ＤＮＡと結合させる方法であって、 前記ＤＮＡを、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連 結部分により共有結合した一連のリガンドを含む化合物と接触させ、ここで複数 の前記リガンドは前記ＤＮＡと相互作用し；そして 前記化合物および前記ＤＮＡを前記ＲＮＡポリメラーゼにさらす ことを含む方法。 ６５．転写を変調するためのハイブリッド複合体であって、 二本鎖ＤＮＡ； アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共 有結合した一連のリガンドを含む化合物であって、ここで複数の前記リガンドは 前記二本鎖ＤＮＡと相互作用する化合物；および 前記ＤＮＡおよび前記化合物の少なくとも１つと接触しているＲＮＡポリメラー ゼ； を含む複合体。 ６６．二本鎖ＤＮＡ；および アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共 有結合した一連のリガンドを含む化合物であって、ここで複数の前記リガンドは 前記二本鎖ＤＮＡと相互作用する化合物； を含む、合成転写因子。 ６７．アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分に より共有結合した一連のリガンドを含む化合物を含み、ここで複数の前記リガン ドは前記遺伝子のＤＮＡの特定の配列と相互作用することを特徴とする、配列特 異的遺伝子活性化剤。 ６８．第１および第２の合成鎖を含み、ここでそれぞれの鎖は、アミド、チオア ミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した約６ −５０個の一連のリガンドを含み、前記鎖のそれぞれは、前記遺伝子の少なくと も１つのＤＮＡ鎖上の近接する領域内の塩基配列を、前記鎖が前記ＤＮＡ鎖上に 互いに近接して結合するように認識するリガンド配列を有することを特徴とする 、配列特異的遺伝子活性化剤。 ６９．前記合成鎖のリガンド配列が、前記ＤＮＡの非鋳型鎖に相補的である、請 求項６８記載の遺伝子活性化剤。 ７０．前記合成鎖のリガンド配列が、前記合成鎖の前記遺伝子への結合により、 前記遺伝子上の前記合成鎖の結合部位を含むＤＮＡのループが形成されるように 選択される、請求項６８記載の遺伝子活性化剤。 ７１．第１および第２の合成鎖を含み、ここで それぞれの鎖は、アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド 連結部分により共有結合した約６−５０個の一連のリガンドを含み； 前記第１の鎖は、前記遺伝子の一方のＤＮＡ鎖の塩基配列を認識するリガンド配 列を有し； 前記第２の鎖は、前記遺伝子の他方のＤＮＡ鎖の塩基配列を認識するリガンド配 列を有し；かつ 前記一方のＤＮＡ鎖上の認識される塩基配列と、前記他方のＤＮＡ鎖上の認識さ れる塩基配列が、前記遺伝子上で互いに近接して位置する； ことを特徴とする配列特異的遺伝子活性化剤。 ７２．前記合成鎖のリガンド配列が、前記合成鎖の前記遺伝子への結合により前 記遺伝子上の前記合成鎖の結合部位を含むＤＮＡループが前記遺伝子上に形成さ れるように選択される、請求項７１記載の遺伝子活性化剤。 ７３．ＤＮＡまたはＲＮＡを含む第１の鎖部分、およびアミド、チオアミド、ス ルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連のリガン ドを含む第２の鎖部分を含み、前記第１および前記第２の鎖部分が共有結合して いるキメラ化合物。 ７４．前記第１の鎖部分がＤＮＡを含む、請求項７３記載のキメラ構造。 ７５．二本鎖キメラ複合体であって、ここで 第１の鎖は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む第１の鎖部分、およびアミド、チオアミ ド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連の リガンドを含む第２の鎖部分を含み、前記第１および前記第２の鎖部分は共有結 合しており； 第２の鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアミド、チオアミド、スルフィンアミドも しくはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連のリガンドを含み；そし て 前記第１の鎖と前記第２の鎖は互いに相互作用してデュープレックス構造を形成 することを特徴とする複合体。 ７６．細胞間で転写因子の活性を変調する方法であって、 ＤＮＡまたはＲＮＡを含む第１の鎖部分、およびアミド、チオアミド、スルフィ ンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共有結合した一連のリガンドを含 む第２の鎖部分を共有結合させることによりキメラ構造を形成し、ここで複数の 前記リガンドは前記転写因子と結合し；そして 前記キメラ構造を細胞内に導入する； ことを含む方法。 ７７．さらに、前記リガンドおよび前記ＤＮＡまたはＲＮＡを、複数の前記リガ ンドが前記ＲＮＡまたはＤＮＡの糖−ホスフェート主鎖に結合するように選択す ることを含む、請求項７６記載の方法。 ７８．蛋白質の結合を細胞間で阻害する方法であって、 アミド、チオアミド、スルフィンアミドまたはスルホンアミド連結部分により共 有結合した一連のリガンドを含む化合物を形成し、ここで複数の前記リガンドは 前記蛋白質に結合し；そして 前記構造を細胞内に導入する； ことを含む方法。