JPH09502342A - ホスファターゼ又はその誘導体を含む製薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は敗血症を含む、内毒素により媒介される臨床的合併症の処置又は治療に適した製薬学的組成物に関する。組成物は内毒素を無毒化し、それをヒトなどの哺乳類、特に宿主−防御抵抗が低下した患者にあまり有害でなくするのに適した成分を含む。本発明はまた、例えば破壊された骨の修理のための骨形成の刺激に、あるいは骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療に適した製薬学的組成物、ならびに望ましくない骨形成を低下又は阻害するための製薬学的組成物に関する。本発明の製薬学的組成物は、生体内においてホスファターゼ活性を調節することを目的とする。

Description

【発明の詳細な説明】 ホスファターゼ又はその誘導体を含む製薬学的組成物 発明の分野 本発明は、敗血症を含むグラム−陰性バクテリアの感染により引き起こされる 臨床的合併症の処置又は治療に適した製薬学的組成物に関する。特に本発明は全 身的に適用可能な組成物を目的とする。組成物はバクテリア−壁誘導リポ多糖類 （内毒素類としても既知）の無毒化に適した成分を含み、これらの産物を人間な どの哺乳類に、特に場合により宿主−防御抵抗性（ｈｏｓｔ−ｄｅｆｅｎｃｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の低下と組み合わされた、すなわち臓器移植の後、癌又 は癌の化学療法処置に伴う白血球減少症（参照文献１）の間、又はＡＩＤＳ及び ＡＩＤＳ−関連疾患（参照文献２）の間の敗血症の患者にあまり有害でないよう にする。 本発明は骨の形成の刺激に、例えば破壊された骨の修理に、又は骨粗しょう症 及び骨軟化症などの代謝性骨疾患（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂｏｎｅ ｄｉｓｅａ ｓｅｓ）の予防又は治療に適した製薬学的組成物、ならびに又、望ましくない骨 の形成を低下させる、又は阻害する製薬学的組成物にも関する。 背景に関する情報 内毒素はグラム−陰性バクテリアの莢膜に存在する負に帯電したリポ多糖であ る（参照文献３）。内毒素類はリン脂質（脂質Ａ）と多糖の複合体である。種々 のバクテリアにより生産される内毒素類はその抗原性 が異なるが、それらはすべて同じ生物学的影響を有し、それは主に脂質Ａによる 。本記載の目的の場合、内毒素という用語はエンテロトキシン類も含む。負に帯 電した糖部分に加え、内毒素はその毒性に必須の２つのリン酸基を含む（参照文 献３、４）。 内毒素は外部環境において、ならびに多くの種の胃腸管において偏在的な分子 であるが、それは一度胃腸管を去るとこれらの種に非常に有害であり得、例えば １０ピコグラムなどの少量でも敗血症及び潰瘍などにおける炎症を引き起こす。 しかしこれまで、重要な内毒素無毒化機構は生体内で発見されなかった（参照文 献５）。 内毒素は重症の、致死でさえある合併症を引き起こすことが知られている（参 照文献５及び６）。事実、抗生物質の使用にもかかわらず、このバクテリア生産 物は西洋社会で集中治療室における死亡の主要原因である。 種々の微生物類により生産される多種の内毒素があり、結局、生体内における 内毒素の作用は、内毒素が生物中に侵入できる方法と同様に多数である。従って グラム陰性菌感染に伴う症状も患者の間で広く異なる（参照文献７）。これらの 症状はさらに敗血症性ショックを併発し、低血圧、末梢血管拡張及び散在性血管 内凝固（ｄｉｆｆｕｓｅ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏ ｎ）がその主な特徴である（参照文献８）。続いて心臓（急性心不全）、肺（成 人呼吸促進症候群）、腎臓（急性尿細管壊死）及び脳などの臓器が影響を受け得 る（参照文献８）。内毒素媒介の病気は、多臓器不全の症状及び一般に当該技術 分野において直接又は間接的に内毒素により引き起こされると受け入れられてい る他の症状も含む。 今日まで、内毒素に対する抗体類は、毒性を不可逆的に減少させることが知ら れている内毒素無毒化タンパク質類のみであるが、これらの抗体類の臨床的価値 はまだ確立されていない。内毒素に結合することができる他の物質、例えばリポ 多糖結合タンパク質及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（参照文献９）は、生 体内で可逆的な複合体を形成するという主な欠点を示す。これらの複合体が解離 すると、本来の（毒性の）分子が再び生産される。さらに血漿の無毒化活性がし ばらく注目されたが（参照文献１０）、この活性を担う物質の単離又は特性化の 試みは成功しなかった。敗血症の処置のための他の実験的方法は、内毒素−誘導 ショックの重要な媒介物であり、生体内における内毒素の影響を悪化させるサイ トカイン類（例えばＴＮＦ−α）の活性に拮抗する組成物の適用を含む。この方 法の主な欠点は、これらの組成物が原因である因子を無毒化せず、この毒素への 体の反応の１つを阻害することである。さらに天然に存在するサイトカイン類へ の拮抗は複数の副作用を引き起こし得る。 アルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１）は、人間を含む多くの種 に存在する共通の酵素であり、広く研究されてきた。アルカリ性ホスファターゼ をコードするＤＮＡ配列は得られたが、これまでそれらの商業的開発は起こらな かった。酵素は抗体標識として、及び肝臓及び好中球機能に関するマーカーとし て日常的に適用されるが、その生物学的関連性は未知である。指示薬として用い られる特異的活性が向上した組み換えアルカリ性ホスファターゼが、例えばＥＰ −Ａ−０ ４４１ ２５２において開示されている。しかしこの特許出願はアル カリ性ホスファターゼの抗−内毒素活性又は骨形成に関して言及していない。引 用のヨーロッパ特許出願は１つのアミノ算が野生型と異なる複数の誘導体を記載 している。置換基はＶａｌ又はＩｌｅによるＴｈｒ１００の置換、Ａｒｇによる Ｌｙｓ３２８の置換、ＡｌａによるＶａｌ９９の置換、ＶａｌによるＴｈｒ１０ ７の置換、ＳｅｒによるＡｓｐ１０１の置換、ＡｌａによるＶａｌ３７７の置換 及びＧｌｙによるＳｅｒ１１５の置換、ならびにＡｓｐによるＡｌａ１０３の置 換を含む。引用の特許出願に記載されている他の誘導体は、サンドイッチＥＩＡ を行うためのＭ マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ルを用いた誘導体、及びアルカリ性ホスファターゼのチオール化突然変異体であ り、それはスクシンイミジル−４−Ｎ−マレイミドメチル−１−チオカプラミド シクロヘキサンカルボキシレートを用いて誘導することができる。これらのすべ ての誘導体の中で、アルカリ性ホスファターゼ誘導体により運ばれる電荷に関す る言及はなされていない。挙げられているすべての誘導体は、ＡｓｐによるＡｌ ａ１０３の置換の場合を除いて、対応する本来のアルカリ性ホスファターゼと比 較して、より正の正味電荷又は等しい正味電荷を生ずることが我々により計算さ れたことを指摘する。 アルカリ性ホスファターゼは、細胞外分子を脱リン酸化することが知られてい る膜−結合エクト−酵素である。酵素は、腸、腎臓、骨芽細胞及び好中球を含む 多くの臓器に存在する(参照文献１１、１２及び１３)。試験管内でそれは約１０ ．５の最適ｐＨを示す（参照文献１２）。この高いｐＨレベルは無損傷の臓器の 生体組織には存在しないと思われるので、この非常に高い最適ｐＨが生物学的関 連性の認識を妨げてきた（参照文献１２〜１４）。 複数の公開文献において、アルカリ性ホスファターゼ及びコラーゲン、 特に原繊維状コラーゲンの誘導体が記載されている。そのような誘導体の負の正 味電荷については言及されていないが、我々は正味電荷が非−誘導アルカリ性ホ スファターゼと比較して正であることを計算した。 ＵＳ ４ ４０９ ３３２（１９８３）において、アルカリ性ホスファターゼ を用いて誘導されたコラーゲン縫合糸が、コラーゲンの炎症性を減少させるとし て記載されている。コラーゲンにより起こされる炎症は内毒素による炎症反応で はなく、それは起こってしまった組織の損傷により一般的に引き起こされる炎症 であり、それはコラーゲンが体にとって異種である異種タンパク質であるという 事実から、及びコラーゲンは常に生体内で凝固を引き起こし、それは続いて複数 の方法で炎症細胞を活性化するという事実からわかる。傷の感染による炎症は、 無菌の溶液を用い無菌の環境で働いている著者自身にしばしば起こる状態とは思 われない。当該技術分野における熟練者は、この引用公開特許から、コラーゲン と組み合わされたアルカリ性ホスファターゼがいかにして通常コラーゲンにより 引き起こされる炎症を阻害できるのかを誘導することはできない。しかし例えば 特異的免疫反応の細胞に関する抗原を防御し、それにより認識を妨げることによ る、又はアルカリ性ホスファターゼが負に帯電した糖基を含むので非−特異的免 疫反応の正に帯電した媒介物を結合することによる、などの複数の方法を提案す ることができる。他の可能性は、コラーゲンのマスキング又はＡＴＰ、ＡＤＰ及 び血小板活性化因子などの媒介物類の脱リン酸化により、あるいは正に帯電した 媒介物類及び補因子の結合により凝固カスケードを阻害することである。 引用文献において、おおまかなホスファターゼの加水分解機能は５０年以上広 く研究されてきたが、生物にとっての酵素の価値に関する明確 な像が現れないことが述べられている。要するにアルカリ性ホスファターゼの生 体内活性は明白でない。引用文献においては、アルカリ性ホスファターゼと骨形 成又は抗−内毒素活性が結び付けられていない。アルカリ性ホスファターゼとコ ラーゲンの組み合わせの抗−炎症活性に、理論的背景が示されていない。事実、 当該技術分野における熟練者が抗−炎症活性をアルカリ性ホスファターゼの存在 に帰因するとするかどうか、又はコラーゲンの特定の基が無作為な誘導体の存在 により保護されている事実が抗−炎症活性を与えるかどうか、疑問である。これ は、グルタルアルデヒドなどの架橋剤又は他の架橋手段の使用が材料の抗−炎症 性を向上させると思われることが記載されている事実から誘導し得る。 ＵＳ ４ ３９４ ３７０において、コラーゲン及びＢＭＰの抗−炎症性複合 体が、破壊された骨の治療におけるその利用と共に記載されおり、それはさらに ＵＳ ４ ４０９ ３３２において明らかにされている。ＵＳ ４ ３９４ ３ ７０は、骨欠損における生体内埋植のためのスポンジにおいて構成された再構築 コラーゲンと無機質除去骨粒子（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｐａ ｒｔｉｃｌｅｓ）、又は再構築コラーゲンと可溶化された骨形態発生タンパク質 （ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）の利用につき記載 している。無機質脱落骨粒子及び骨形態発生タンパク質の両者共、動物及び人間 の実験において骨組織の形成を起こす能力を示した。再構築コラーゲン複合体は 高度に生物適合性であり、多様な形状に構成することができる。この材料は、プ ラスチック及び再建手術、歯周骨移植において、及び歯内法（ｅｎｄｏｄｏｎｔ ｉｃ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）において移植片として用いることができる。構造 的持続性はグルタルアルデヒドを用い た架橋により強化され、それは埋植の前にコラーゲン複合体を滅菌し、消毒する ためにも用いられる。無機質脱落骨からの可溶性因子、骨形態発生タンパク質は 骨誘導性であることが記載され、無機質脱落骨は骨形成も促進することも知られ ている。ＵＳ ４ ３９４ ３７０に開示されているＢＭＰとコラーゲンに組み 合わされたアルカリ性ホスファターゼの利用はアルカリ性ホスファターゼの骨形 成向上活性だけを特に目的としてはいないが、コラーゲンに結合したアルカリ性 ホスファターゼが非−誘導コラーゲンより炎症性が低いという事実がある。ＵＳ ４ ３９４ ３７０は特にコラーゲンＢＭＰ複合体スポンジを目的としており 、そのようなスポンジと複合化されたアルカリ性ホスファターゼの利用は単にＢ ＰＭ−コラーゲンの利用の複数の実施態様の１つであり、本特許出願と同じ発明 、すなわち中でも骨形成の向上のためのそのままのホスファターゼ又はその誘導 体の生体内活性を目的としていない。ＵＳ ４ ３９４ ３７０においては、ア ルカリ性ホスファターゼの抗−内毒素活性は言及されていない。 ＷＯ ９３／００９３５は、骨の石灰化の促進における酵素アルカリ性ホスフ ァターゼの可能な役割が長年提案されてきたと記載している。しかしそのような 試験管内無機質化研究の、生体内の状況への関連性は、特に試験管内研究で用い られる比較的高濃度のホスフェートエステルの観点から、及びホスフェートエス テルの加水分解速度及び生理学的ｐＨ値が無機質化の過程と関連させるには低す ぎると思われる理由で、疑問視されてきた。引用特許出願においてＢｅｅｒｔｓ ｅｎ ｅｔ ａｌ．は、生物適合性担体材料、好ましくはある程度それ自身が無 機質化できる材料、例えば原繊維状コラーゲンと、ある量のホスファターゼ酵素 の 組み合わせが無機質化を促進するであろうと記載している。アルカリ性ホスファ ターゼと担体の組み合わせが、担体と、及び酵素と共有結合的に結合することが できるカップリング剤の存在下で担体を酵素と共にインキュベートすることによ りもたらされるのが好ましい。適したカップリング剤はビオチンアビジン、グル タルアルデヒド及び１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボ ジイミドＨＣｌであると記載されている。特に好ましいカップリング剤は、マレ イミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＨＳ）と組み合わされ たスクシンイミジル−ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）として知られ 、この場合担体がＳＡＴＡと共にインキュベートされ、酵素がＭＨＳとインキュ ベートされる。これらの２つのインキュベーション過程の生成物が合わされ、反 応させられ、埋植材料を与える。引用文献は、コラーゲンへのアルカリ性ホスフ ァターゼのカップリングは、そのような複合体が傷の場所に置かれると、骨形成 を促進すると記載している。アルカリ性ホスファターゼは、骨形成を刺激するこ とが既知の生成物と組み合わされて用いられる。アルカリ性ホスファターゼその ままの、又は特定の変更電荷を有する誘導体としての利用は記載されていない。 原繊維状コラーゲンを用いたアルカリ性ホスファターゼの誘導体は非−誘導アル カリ性ホスファターゼと比較して正の電荷が増していることが指摘される。原繊 維状コラーゲンを用いたアルカリ性ホスファターゼの誘導体は、原繊維状コラー ゲンが血管内血小板活性化を引き起こし、塞栓症に導くので、全身的適用には適 していない。従って原繊維状コラーゲンとアルカリ性ホスファターゼの複合体は 、骨粗しょう症又は骨軟化症、あるいは全身的適用を必要とする他の骨欠陥の処 置の方法で用いることができな かった。それは傷の位置にその場で固定される場合のみに用いることができる。 発明の記述 本発明の主題は、アルカリ性ホスファターゼが誘導されずにそのままで、生理 学的ｐＨレベルにおいても、すなわち生体内(in vivo)でも、ある種の生体機能 を調節するホスファターゼ活性を与えられているという我々の発見に基づく。 この見識の基礎は、生体内における分子レベルで、アルカリ性微環境が試験管 内の水溶液と異なって存在し得るという考えにより与えられた。生体内で負に帯 電した分子は、Ｈ⁺に結合するその能力により弱塩基類として作用することがで きる。結局これらのアニオン類はｐＨレベルを局所的に上昇させ、それによりア ルカリ性ホスファターゼがホスファターゼとして機能するのに十分なｐＨ値を有 する微環境(micro environment)を与える。 負の電荷の添加は生体内において：酵素に正味で負に帯電した基質を加える、 第２に負の電荷を有する膜担体をホスファターゼに与える、及び第３にタンパク 質自身の帯電基のイオン化の変更及び／又はタンパク質主鎖への負に帯電した部 分の導入又はタンパク質のおそらく正に帯電した基の除去による３種類の方法で 与えることができる。 単独の、又は組み合わされたこれらの種々の機構は、試験管内の酵素の通常高 い最適ｐＨを説明することができる。 他の種類のホスファターゼ類に同様の考えが適用できた。 本発明の他の側面は、アルカリ性ホスファターゼがそのままで、生理学的ｐＨ レベルにおいてさえ、内毒素無毒化活性も与えられているとい うさらに特定的な発見に基づく。 かくして負に帯電した部分を有する内毒素は、例えばアルカリ性ホスファター ゼの微環境において必要な負に帯電した残基を供給することができる。この方法 で、この偏在する酵素は生体内において、グラム陰性バクテリアの偏在産物であ る内毒素に対する防御を与えることができる。 内毒素自身を無毒化するための酵素組成物の利用は、初期における疾患の処置 が可能であるという利点を有し、さらに内毒素の毒性を不可逆的に低下させると いう利点を有する。さらに酵素の活性は基質特異性なので、アルカリ性ホスファ ターゼなどの酵素の使用の副作用は限られている。 内毒素の脂質Ａ部分のホスフェート基はこのバクテリア成分の毒性を決定する 。脱リン酸化された脂質Ａ分子はその免疫刺激活性のいくらかを保持しており、 かくしてワクチンの製造が可能になる。 グラム陰性バクテリアの内毒素類により媒介される病気の予防のためのワクチ ンは本発明の実施態様であり、該ワクチンは活性成分としてそのままのホスファ ターゼ又はホスファターゼ活性を有するホスファターゼの誘導体、及びワクチン において通常用いられる添加剤を含む。ワクチンの分野で一般に許容されるいず れの種類の誘導体も用いることができる。 本発明のさらに別の側面は、骨形成の向上を必要とする処置又は予防のため、 例えば破壊された骨の修理の刺激のため、あるいは特に骨粗しょう症及び骨軟化 症などの代謝性骨疾患の処置及び／又は予防のための製薬学的組成物における活 性成分としての、そのままのアルカリ性ホスファターゼの利用を目的とする。生 体内において最適アリカリ性ホスファタ ーゼ活性のために必要な負の電荷は、基質によってのみでなく、微環境によって も、あるいは両方によって与えられることができる。 例えば骨において、アルカリ性ホスファターゼはグリコサミノグリカン（ＧＡ Ｇ）−鎖類、オステオポンチン、オステオカルシン及び骨シアロタンパク質（ｂ ｏｎｅ ｓｉａｌｏ ｐｒｏｔｅｉｎ）の豊富な細胞外環境に存在する。これら の分子はすべて、負に帯電した残基の含有量が高いことが特に特徴である（参照 文献１５）。今日まで、骨形成におけるアルカリ性ホスファターゼに関する役割 は不明確である。しかしその重要性は、骨形成の部位に酵素が存在するという事 実により反映され得る（例えば骨折の２つの部位の間の細胞外空間に（参照文献 １６及び個人的観察））。さらに骨及び血清におけるアルカリ性ホスファターゼ 活性の低いレベルを特徴とする低ホスファターゼ血症などの疾患は、骨格の変形 を伴う（参照文献１７）。 やはり、主に種々の基質を用いた酵素の非生理学的な高い最適ｐＨのために、 アルカリ性ホスファターゼの基質は未知である。しかし我々の考えから鑑みて、 与えられたリン酸化基質が強い負の分子に結合すると適した微環境が作られるこ とが容易に想像され得る。そのような条件下で、アルカリ性ホスファターゼは生 理学的ｐＨレベルにおいて最適活性を発現し、この基質を脱リン酸化し、それに より骨基質の重要な成分である不溶性カルシウムホスフェート−複合体の形成に 寄与することができる。 アルカリ性ホスファターゼ又はその誘導体は（まだ限定されていない性質の） 有機ホスフェートエステル類を局所的に脱リン酸化し、かくしてカルシウムホス フェート−複合体の形成に寄与することができる。さ らに骨−無機質化のための最適生理化学的条件を作るために、細胞外環境におけ る高濃度の無機ホスフェートが必要なので（高いイオン濃度がホスフェート−複 合体の沈澱を容易にする）、血漿アルカリホスファターゼ又はその誘導体の活性 は血液における無機ホスフェート濃度を向上させ、かくしてさらに骨形成の過程 に寄与することができる。従ってアルカリ性ホスファターゼ又はその誘導体は生 体内において二重の効果を有すると思われる；それは骨基質の無機質化を直接引 き起こし、さらにそれは環境をホスフェートで過飽和させることによりこの過程 を容易にする。 最近の実験データは、骨形成の間の生体内におけるアルカリ性ホスファターゼ の誘導体の役割に関するこの見解を支持している。アルカリ性ホスファターゼ誘 導体がコーティングされたコラーゲン層のシートは、ラットにおいて皮下に埋植 されると急速に無機質化される（参照文献３２）。無機質化の程度はコラーゲン 埋植片に結合したアルカリ性ホスファターゼ誘導体の量、及びこれらの動物にお ける無機ホスフェートの血清量に依存する。比較的高令の雌のラット（３５週令 ）は、若い雄のラットと比較してＰｉの低い血清量及び低い程度埋移植片の無機 質化を示す。さらに正常なマウスにおいて食事のホスフェートを排除すると、骨 形成が損なわれる（参照文献３３）。試験管内でも、アルカリ性ホスファターゼ がコーティングされたコラーゲンのシートの無機質化を、媒体におけるＰｉ濃度 を減少させることにより減じることができる。 骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患は一般に高齢の人間を冒す。高 齢の人々において血清アルカリ性ホスファターゼ活性は向上するか、低下するか 、又は変化しないかに関して矛盾した報告がある（精 査のために参照文献３４を参照）。血清アルカリ性ホスファターゼ活性は組織− 結合アルカリ性ホスファターゼ活性を適確に反映し得ないことが知られている（ 参照文献３４）。事実、いくつかの報告は、例えば肝臓細胞（参照文献３５）、 腸及び白血球（参照文献３６）におけるアルカリ性ホスファターゼ活性が年令と 共に徐々に低下することを示唆している。骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝 性骨疾患は、酵素の局所的欠乏又は微環境内の負に帯電した分子の量の減少によ り、アルカリ性ホスファターゼ又はその誘導体のその場における活性が損なわれ ることを特徴とすると思われる。雌の集団における骨粗しょう症の高い発生率も 、アルカリ性ホスファターゼ又はその誘導体がこの疾患の病因に含まれるという 見解により説明することができる：アルカリ性ホススファターゼ又はその誘導体 の活性は少なくとも婦人の場合、エストラジオールなどのホルモン類により調節 されており（参照文献３７）、それは妊娠の間の血清アルカリホスファターゼ活 性の上昇によっても示される（参照文献１８）。閉経においてこの調節系は崩壊 する。 低い血清アルカリホスファターゼ活性は血液におけるＰｉの低濃度を引き起こ し、この条件は長い循環半減期の（アルカリ性）ホスファターゼ活性を有する（ アルカリ性）ホスファターゼ又はその誘導体の投与により逆転させることができ ると思われる。上記の観点から、骨の無機質化は（アルカリ性）ホスファターゼ を負に帯電した分子にカップリングさせることにより、及び／又は（アルカリ性 ）ホスファターゼの固有のアニオン性電荷を増加させることにより、さらに強化 することができる。従ってそのままの（アルカリ性）ホスファターゼの投与、又 は（内在性（アルカリ性））ホスファターゼ活性及び／又は生産の刺激は、骨粗 しょ う症又は骨軟化症などの代謝性骨疾患を有する患者に有益であることができる。 製薬学的組成物の活性成分としてのそのままの（アルカリ性）ホスファターゼの （多発性）骨折の人への全身的投与、及び活性成分としてそのままの（アルカリ 性）ホスファターゼを含む製薬学的組成物も本発明の範囲内に含まれる。さらに （アルカリ性）ホスファターゼ活性の阻害は、骨癌又は転移性癌から誘導される 続発性腫瘍（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｕｍｏｕｒｓ）などの過剰の骨形成を特徴 とする悪性疾患の患者における治療のための選択できる方法（ｏｐｔｉｏｎ）で あり得る。従って骨肉腫組織において見られる高いアルカリ性ホスファターゼ活 性（参照文献１９）は、骨形成の増加に関する臨床的マーカーであるのみでなく 、治療的介在のための入り口でもある。 従って本発明は骨肉腫などの急速な骨形成を伴う病気の処置の方法を目的とし 、該方法は、好ましくは標的特異的方法で、すなわち該病気が起こっている位置 においてアルカリ性ホスファターゼ活性を低下させる、又は阻害することを含む 。ホスファターゼ活性の低下は、例えばホスファターゼの生産を低下させること により、又はホスファターゼに競争的に結合してその脱リン酸化を妨げることに よりもたらすことができる。ホスファターゼ活性及び／又は（アルカリ性）ホス ファターゼ（活性）の濃度を減少させる又は阻害することができる少なくとも１ つの物質を含み、該物質が好ましくは、望ましくない骨形成が妨げられるべき位 置で作用するように標的化されている製薬学的組成物も本発明の範囲内に含まれ る。 本発明の製薬学的組成物は循環系において無毒性であり、かくして全身的に許 容され得、適用可能であるのが好ましい。これは内毒素及び代 謝性骨疾患に対する利用を可能にし、破壊された骨の修理を必要としているいく つかの場合に手術の必要を取り除きもする。 アルカリ性ホスファターゼがリポ多糖類を無毒化するその能力により宿主−防 御系の防御酵素であるという仮定を調べるために、我々はアルカリ性ホスファタ ーゼが生理学的ｐＨレベルにおいてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）の内毒素を脱リン酸化することができるかどうかを研究した。ア ルカリ性ホスファターゼ活性を腸、腎臓及び脾臓の４％ホルマリン−固定クリオ スタット切片（４μｍ）において、標準的組織化学的方法に従い、アルカリ性（ 参照文献２０）及び生理学的ｐＨレベル（参照文献２１）において、従来の基質 β−グリセロホスフェート（６．０ｍｇ／ｍｌ）又はエシェリキア・コリからの 内毒素（０．５５ｍｇ／ｍｌ；血清型０．５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて探査した。アルカリ 性ｐＨレベルにおいて、Ｇｏｍｏｒｉ（参照文献２０）の組織化学的方法を用い たが、低いｐＨレベルにおいてはＷａｃｈｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｅｉｓｅｌの 方法（参照文献２１）を用いた。切片を基質と共に３７℃において１時間インキ ュベートした。基質として内毒素が用いられた場合、ｐＨ７．４及び９．０にお いて、酵素活性を示すホスフェート沈澱が腸及び腎臓切片において見いだされた （図１）。脾臓の場合、赤色脾髄全体に散乱した強い陽性の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ）細胞が見いだされた。反応生成物の分布は両基質に関して同じであった。基質 を含まずにインキュベートされた切片はすべて完全に反応生成物がなかった。さ らに選択的アルカリ性ホスファターゼ阻害剤であるレバミソール（１．０ｍＭ） （参照文献２０）は、腎臓切片において内毒素か らのホスフェート放出を完全に阻害し、しかし腸切片においてこの活性は腸アル カリ性ホスファターゼの周知の阻害剤であるＬ−フェニルアラニン（５ｍＭ）（ 参照文献２２）により減少したが立体異性体Ｄ−フェニルアラニン（５ｍＭ）に よっては減少しなかった。かくして種々の臓器における酵素活性の分布、及び選 択的阻害剤を用いて得られた結果の両方共、生理学的ｐＨレベルにおいて内毒素 がアルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸化されることを示している。 アルカリ性ホスファターゼ活性の最適ｐＨを、ラット腎臓の尿細管刷子縁断片 を用い、より定量的な方法で研究した。この特定の酵素組成物は、それを原形質 膜との会合において研究できるという利点を有する。さらにそれはレバミソール により完全に阻害され得る。１２μｇのタンパク質（比ホスファターゼ活性：８ ６Ｕ／ｍｇ、ｐＨ９．８において評価）を含む尿細管刷子縁断片の組成物を（１ ８０メッシュのふるいを用いてＰＶＧラット腎臓の皮質から単離し、０．９％食 塩水中で濯ぐ）、種々のｐＨレベルの２５０μｌの２−アミノ−２−メチル−１ ，３−プロパンジオール緩衝液に加えた。緩衝液はＥ．コリからの内毒素（１． ２５ｍｇ／ｍｌ）又はパラニトロフェノールホスフェート（０．５ｍｇ／ｍｌ； ｐＮＰＰ）のいずれかを含んだ。インキュベーション期間の開始の直前に２ｍＭ のＭｇＣｌ₂を加えた。３７℃における１時間のインキュベーションの後、Ｃｈ ａｎｄｒａｒａｊａｎの方法（参照文献２３）に従って無機ホスフェート濃度を 評価した。従来の基質ｐＮＰＰの場合、ｐＨと共に一定に増加するホスフェート 放出が観察された（図２、上左角）；が、基質として内毒素が適用された場合、 酵素活性はｐＨ８．８において最大に達し、この高さで安定したままであった。 内毒素−及び ｐＮＰＰ−脱リン酸化はアルカリ性ホスファターゼ阻害剤であるレバミソール（ ０．２ｍＭ）により阻害された。ｐＨ９．８における１時間の内毒素の予備イン キュベーションは組織化学的に調べるとｐＨ７．４において脱リン酸化を阻害し なかったので、高ｐＨレベルにおける活性は、アルカリ性条件下で起こる内毒素 の脂肪族アシル鎖の脱−アシル化により妨げられなかった。かくして基質ｐＮＰ Ｐの場合に見られる高い最適ｐＨと対照的に、基質として内毒素が用いられると 、アルカリ性ホスファターゼはあまり極端でないｐＨレベルにおいて最大活性に 達する。試験管内で観察されるアルカリ性最適ｐＨを模すために必要な追加の負 の電荷を含むその適した微環境内で酵素が生体内研究されると、最適ｐＨはもっ と低いと思われる。 内毒素の毒性へのアルカリ性ホスファターゼの効果を研究するために、リムル ス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アッセイを行った。このリムルスアッセイは、カブトガニ 、リムルス・ポリフェムス（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）に対する 分子の毒性に基づく、試験管内における内毒素濃度を評価するための標準的方法 である（参照文献２５）。内毒素（２．０ｎｇ／ｍｌ）を尿細管断片（０．８μ ｇタンパク質／ｍｌ、比ホスファターゼ活性８６Ｕ／ｍｇ）と共に、ＲＰＭＩ− １６４０緩衝液（ｐＨ７．６）中で１時間インキュベートした。標準試料は内毒 素又は尿細管刷子縁断片のいずれかが欠如していた。続いてリムルスアッセイを 行った。結果は、酵素を含まずに等量の内毒素を含む懸濁液と比較して、内毒素 及びアルカリ性ホスファターゼ活性を含む懸濁液において、この方法により測定 された内毒素濃度の有意な減少を示している（表１）。試験管内で評価されると 、アルカリ性ホスファターゼが生理学的ｐＨレベルに おいて内毒素分子の毒性を低下させることができると結論することができる。 本発明が基質を内毒素の毒性効果から解放する方法である別の方法は、生成物 をホスファターゼのホスファターゼ活性、例えばアルカリ性ホスファターゼ又は ホスファターゼ活性を有するホスファターゼの誘導体に供することを含む。その ような誘導体は、例えば請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体であ ることができる。無毒化されるべき物質は、存在する内毒素を無毒化するのに十 分な長さの時間、ホスファターゼ活性の存在に供されなければならない。当該技 術分野における熟練者は、不必要な実験を行わずにどの程度の長さの時間が適し ているかを突き止めることができるであろう。 アルカリ性ホスファターゼで処置された内毒素の毒性を、２回の連続的内毒素 注射に続く局所的炎症（局所的Ｓｈｗａｒｔｚｍａｎ反応（参照文献２６））を 容易に定量することができるという事実を利用して、生体内においても研究した 。無毒化の仮定が確かであれば、この炎症反 応はアルカリ性ホスファターゼで予備処置された内毒素組成物の投与の後、減少 しなければならない。従って我々は局所的皮内Ｓｈｗａｒｔｚｍａｎ反応を誘導 し、生理学的ｐＨにおいて尿細管刷子縁断片を用いて第２の内毒素投薬量を処置 した。続いてＳｈｗａｒｔｚｍａｎ反応の重要な特徴である酸素ラジカル生産細 胞の流入を組織化学的に調べた。かくして雌のＰＶＧラット（２００ｇ）におい てＳｈｗａｒｔｚｍａｎ反応を、内毒素（Ｅ．コリ ０５５：Ｂ５から）の２０ 時間隔てた２回の連続的注射により誘導した。第１の内毒素注射（１ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）は静脈内に投与したが、第２の注射は２ｍＭのＭｇＳＯ₄及び４０ μｇの内毒素（Ｅ）又はＭｇＳＯ₄のみ（Ｃ）が補足された７０μｌのＲＰＭＩ １６４０培地（ｐＨ７．６）の混合物の皮内投与から成った。注射の前に培地 を、アルカリ性ホスファターゼ阻害剤レバミソール（Ｌ；最終的濃度１．０ｍＭ ）を含む、又は含まない、８６Ｕ／ｍｇのアルカリ性ホスファターゼ活性を含む ６μｇの尿細管刷子縁断片と共にインキュベートした（１時間、３７℃）（Ａ） 。標準培地は、食塩水（Ｓ）を補足され、内毒素又はアルカリ性ホスファターゼ 、あるいは両方が欠如していた。皮内注射の２時間後、皮膚部位を酸素ラジカル 生産細胞の流入に関して分析し、光学顕微鏡のレベルで３，３’−ジアミノベン ジジン（ＤＡＢ）を用いて組織化学的に示した（参照文献２７）。標準と比較し て有意な酸素ラジカル生産細胞の流入が、未処置の内毒素を注射された皮膚部位 において観察された（Ｅ／Ｓ対Ｃ／Ｓ ｐ＜０．０１、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ；図４ ）。この炎症応答は、尿細管刷子縁断片を用いて予備処置された内毒素を注射さ た皮膚部位において減少した（Ｅ／Ｓ対Ｅ／Ａ、ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏ ｎ）が、尿細管断片及びレバミソ ールで予備処理された内毒素は、尿細管断片のみで予備処理された内毒素と比較 してプロ−炎症活性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ） の上昇を示した（Ｅ／Ａ対Ｅ／Ａ／Ｌ、ｐ＜０．０２５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）。 各試験は同じラットにつき二重に行い、結果は６匹のラットの算術平均（＋／− ＳＤ）として表す。これらのデータは、アルカリ性ホスファターゼで処置された 内毒素が生体内において毒性の減少を示し、アルカリ性ホスファターゼは生体内 においても内毒素を無毒化することができることを示している。 生体内の内毒素無毒化における内在性アルカリ性ホスファターゼ活性の寄与を 調べるために、我々はグラム−陰性リポ多糖類に対して比較的抵抗性の種である ラットにおける内毒素−感受性に対するレバミソールの影響を評価した。６月令 の雌のＰＶＧラットにｔ＝−２４及びｔ＝−１時間において、アルカリ性ホスフ ァターゼ阻害剤レバミソール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌ ｏｕｉｓ，ＵＳＡ）又は食塩水を腹腔内に与えた（１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．） 。ｔ＝０において、ラットに０．５ｍｇの内毒素の静脈内攻撃を与え、直前、な らびにこの注射後のｔ＝３、６、２４及び４８時間において血液を集めた。 肝臓の損傷（内毒素−誘導の死亡の重要な病因）を反映する血清グルタメート −ピルベートトランスアミラーゼ活性をこれらの試料において、Ｗｒｏｂｌｅｗ ｓｋｉ ａｎｄ ＬａＤｕｅの方法に従って評価した。結果は、レバミソールの みで処置された後、食塩水で処置されたラットと比較して血清トランスアミラー ゼ活性における変化がないが、内毒素の攻撃の後に増加が見いだされたことを示 した（図５）。しかし内毒素のみを与えられたラットで観察された小さい増加と 対照的に、レバミソ ールで予備処置されたラットは血清トランスアミラーゼ活性における非常に強い 増加を示し（ｐ＜０．００１）、生体内においてラットの内毒素−無毒化活性に 内在性アルカリ性ホスファターゼ活性が含まれることを示した。 アルカリ性ホスファターゼの無毒化活性を、ラット及びマウスにおける敗血症 性ショックの実験モデルにおいても研究した。かくしてラットに、１．０ｘ１０¹⁰ コロニー形成単位（ＣＦＵ）の十分に特性化されたエシェリキア・コリバクテ リアの株（ＡＴＣＣ ２５９２２）を腹腔内に注射し、マウスに０．２ｘ１０¹⁰ ＣＦＵを与えた。この投薬量の接種は、約６時間以内に血小板減少症、白血球減 少症、肝機能の損傷及び体温の低下（直腸内）を特徴とするフルブロウン（ｆｕ ｌｌ ｂｌｏｗｎ）敗血症性ショック症候群に導く。 比較的内毒素に対して抵抗性のほとんどのラットはＥ．コリバクテリアの注射 に生き残った（図７Ａ）。しかしアルカリ性ホスファターゼ−阻害剤であるレバ ミソール（５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．バクテリアの２時間前に皮下投与）と組み 合わされると、グラム−陰性バクテリアの接種は致死であった。１０匹中の９匹 がショックの臨床的症状で死亡した。レバミソールで処置されたラットにおける アルカリ性ホスファターゼ活性の血清量は、注射の６時間後に５０％減少した。 レバミソールは致死量以下の投薬量のグラム−陽性バクテリアを与えられたラッ トの生き残りに影響を与えなかった；１．０ｘ１０¹⁰ＣＦＵのスタフィロコック ス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の投与の２時 間前に５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．のレバミソールを与えられたラットはほとんど すべてが生き残った（１群当たり８匹のラット、図７Ｂ）。 これは、ラットの内在性アルカリ性ホスファターゼ活性がグラム−陰性バクテリ アの内毒素に対する抵抗性に含まれることを示す。 ラットと対照的に、１０匹中９匹のマウスは０．２ｘ１０¹⁰ＣＦＵのＥ．コリ の投薬量から死亡した（図８）。しかしバクテリアの投与の２時間前に０．１５ Ｕの精製ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼの１回の腹腔内注射を受けた動物は すべて、この致死投薬量の接種に生き残った（ｎ＝１０）。アルカリ性ホスファ ターゼはブタノール（５０％ ｖ／ｖ）を用いてヒト胎盤から抽出し、ジエチル アミノエチルセルロースカラム及びアフィニティーカラム（ウサギ−抗−ヒト− 胎盤アルカリ性ホスファターゼ抗体がカップリングされたＣＮＢｒ−セファロー ス^4Bカラム）を用いて精製した。かくしてアルカリ性ホスファターゼは生体内で 内毒素を無毒化できると思われ、内毒素性ショックの処置に適用できると思われ る。 胎盤アルカリ性ホスファターゼの循環半減期はヒト血液において約７日間であ る（参照文献３１）。ラットにおいて、７１／２分の循環半減期を有する腸アル カリ性ホスファターゼ（参照文献２８）と対照的に、ヒト胎盤アルカリ性ホスフ ァターゼは約３日間血液中で検出される（個人的観察）。これらのデータに基づ き、及びマウスにおける研究の結果（上記参照）に基づき、胎盤アルカリ性ホス ファターゼは、製薬学的組成物、特に敗血症の予防などのための全身的適用可能 な組成物における活性成分とするのに特に適していると結論することができる。 アルカリ性ホスファターゼにより示される脱リン酸化活性に基づく抗−内毒素 活性は当然、他のホスファターゼ類、特に試験管内でアルカリ性ｐＨにおいて最 適ｐＨを有するホスファターゼ類、またはホスファター ゼ活性を有するホスファターゼ類の誘導体に関して除外することはできない。従 って本発明は、内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体により媒介される 病気の予防又は治療のための製薬学的組成物の製造のための活性成分としての、 そのままのホスファターゼ、又はホスファターゼ活性を有するその誘導体の利用 を目的とする。活性成分として全身的適用に適した少なくとも１種のそのままの ホスファターゼ又はホスファターゼ活性を有するその誘導体を含む、あるいは全 身的適用に適したそのままのホスファターゼ又はホスファターゼ活性を有するそ の誘導体を生産することができるビヒクルを含み、該ホスファターゼ又は該誘導 体が内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有して おり、さらに製薬学的に許容し得る担体を含む組成物は、本発明の範囲内に含ま れる。特にそのままのアルカリ性ホスファターゼ又はホスファターゼ活性を有す るその誘導体、あるいはそのままのアルカリ性ホスファターゼを生産することが できるビヒクルを含む製薬学的組成物は、本発明の好ましい実施態様を構成する 。製薬学的組成物で用いるために、ホスファターゼは実質的に純粋な形態で得る ことができなければならない。一般に組み換えＤＮＡ法が本発明の製薬学的組成 物で用いる 今日までに、４種の別の遺伝子によりコードされる４種のイソ酵素が記載され た。これらは腸形態、肝臓／骨／腎臓−型（好中球にも存在）、胎盤−型及び胎 盤−様イソ酵素（胚細胞に存在）を含む。腸形態及び肝臓／骨／腎臓−型アルカ リ性ホスファターゼの両方は内毒素無毒化活性を示すが、アルカリ性ホスファタ ーゼの他のイソ酵素が内毒素を分解することができないと考える理由はない。従 って本発明はいずれかのそのようなイソ酵素を含む製薬学的組成物を包含する。 特に胎盤型のアルカ リ性ホスファターゼは、生体内におけるその長い半減期の故に適している。 以下の症例履歴（ｃａｓｅ ｈｉｓｔｒｙ）は、ヒトなどの哺乳類におけるア ルカリ性ホスファターゼ活性の低下の有害な結果を例示する。１才の女児が再発 する内毒素血奨に苦しんだ。これらの期間に生命を脅かすショックの症状が伴っ た。処置を行うと回復が得られたが、多くの場合に数週間以内に再発が続き、そ の時点で内毒素血症が再び起こった。１０カ月の間に１２回の再発が起こり、つ いに子供は１才で死亡した。死因はグラム−陰性バクテリアにより引き起こされ た敗血症性ショックと診断された。再発する内毒素血症自身の原因は未知であっ た。我々の最近の研究は、肝臓及び脾臓においてアルカリ性ホスファターゼは正 常であるように見えたが、正常にはヒトの体において最高の酵素活性を発現する 臓器である回腸において酵素活性がほとんど不在であったことを示した。我々の 発見の観点から、そのような決定的な臓器におけるアルカリ性ホスファターゼ活 性の低下は死因を説明することができる。腸管におけるＥ．コリの高い含有量を 考慮し、腸における内毒素無毒化機構の欠如が再発する内毒素血症を生ずること は容易に想像できる。そのような欠乏症は本発明に従って適切に処置することが できる。 再発する内毒素血症に苦しむ患者（悪性疾患又は肝臓病などの根源的な合併症 はない）における回顧的研究は、血清アルカリ性ホスファターゼ又はその誘導体 の活性が臨床的状態と関連することを示した。かくして敗血症が起こった時に、 ラットにおいても見られた現象である血清アルカリ性ホスファターゼ又はその誘 導体の活性の強い減少が必ず測定され得、数日以内に血清におけるアルカリ性ホ スファターゼ又はその誘導 体の活性の向上が続き得た。ある特定の場合に、重症の病気の間に炎症組織が除 去された（部分的回腸切除）。これは直後に血清アルカリ性ホスファターゼ又は その誘導体の活性を正常なレベルに上昇させた。これらの観察は、グラム−陰性 バクテリア感染の間の酵素の代謝回転（ｔｕｒｎ−ｏｖｅｒ）の増加を指摘して おり、敗血症の患者へのアルカリ性ホスファターゼ又はその誘導体の投与が有用 であり得るという見解を支持している。 従って、患者に治療的量のホスファターゼ又はホスファターゼ活性を有するホ スファターゼの誘導体を投与することを含む、内毒素又は内毒素活性を有する内 毒素の誘導体により媒介される病気の治療又は予防の方法は、本発明の範囲内に 含まれる。生体内ｐＨ近辺において最適活性を有する誘導体が好ましいであろう 。従って内毒素又は内毒素の誘導体により媒介される病気の予防又は治療のため の製薬学的組成物の製造法におけるホスファターゼ誘導体の利用は当然、本発明 の範囲内に含まれる。全身的に適用可能な誘導体は、そのままのホスファターゼ の場合にすでに説明した通り、処置されるべき患者の血流中に適用することがで きるので、そのような誘導体が特に好ましい。グラム−陰性バクテリア感染に対 する効力のために、活性成分は好ましくはグラム−陰性バクテリア又はその内毒 素が位置することができるいずれの位置にも到達しなければならない。 本発明の他の側面は、酸類及び塩基類のＢｒｏｎｓｔｅｄ−Ｌｏｗｒｙ分類に 従い、ポリアニオン類がＨ⁺に結合できる故に弱い塩基として作用することがで きるという見解にある。かくしてこれを、タンパク質類又はポリペプチド類の最 適機能性が多くの場合にｐＨ依存性であり、 特に試験管内においてインキュベーション培地が該タンパク質類又はポリペプチ ド類、特にアルカリ性ホスファターゼの最適活性のためにアルカリ性でなければ ならないことが例示された事実に外挿し、我々は生体内のポリアニオン部位、例 えば細胞膜と会合した負に帯電したシアロ糖タンパク質がそのような酵素又はポ リペプチドのｐＨ要求を満たすことができると結論した。 アルカリ性ホスファターゼは主に原形質膜と会合して見いだされる。例えば好 中球は酵素を炎症性微環境中に放出する代わりにそれらの負に帯電した細胞膜の 背景に対して与える。この理由で、ポリアニオン性基質はさらに、通常アルカリ 性ｐＨにおいて最適を有するホスファターゼ及びその誘導体のホスファターゼ活 性、特にアルカリ性ホスファターゼのホスファターゼ活性のための生体内におけ る好ましいアニオン性条件に寄与することができると思われる。 内毒素の負に帯電した糖部分がこの酵素活性の最適ｐＨに影響を与えるとする と、ポリカチオン類がこの反応を妨げることが予想される。従って我々は基質を カチオン類、ポリ−エチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリ−Ｌ−リシン（Ｌｙｓ） で処理した。基質は０．５％ＰＥＩ、０．７５％ポリ−Ｌ−リシン又は蒸留水（ Ｃ）と共に３０分間予備インキュベートした。続いて上記の通りにインキュベー ションを行い、ホスフェート放出を評価した。両カチオンは、負の電荷を中和す ることにより内毒素の脱リン酸化に強く影響を与えたが、それらの１つもｐＮＰ Ｐ分解に有意に影響を与えなかった（図３）。内毒素分解へのＰＥＩの顕著な効 果は負の電荷の中和により引き起こされ得るが、この効果に立体障害も加わり得 る。興味深いことに、ポリ−Ｌ−リシンは最適ｐＨをもっと高い レベルに移動させ、微環境における負に帯電した残基が最適ｐＨを決定するとい う考えを支持している。 微環境において負に帯電した分子がアルカリ性ホスファターゼの最適ｐＨに影 響を与えるという見解の追加の支持は、腸酵素を用いた実験からも誘導された。 基質ｐＮＰＰを用いたＧｏｍｏｒｉの方法を適用したラット腸のクリオスタット 切片（４μｍ）におけるアルカリ性ホスファターゼの最適ｐＨの組織化学的評価 は、インキュベーション培地のｐＨレベルを７．８から９．８に変化させ場合、 染色強度に有意な変化を現さなかった。しかし腸由来であることが示されている 血清におけるアルカリ性ホスファターゼ活性は、９．８又はそれより高い最適ｐ Ｈを示した。その場における、及び血清における腸アルカリ性ホスファターゼの 間の重要な差は、それらのシアロ糖タンパク質含有量である。腸酵素はシアル化 された原形質膜に固定されているが、血清アルカリ性ホスファターゼはこれらの ポリアニオンにより囲まれていない。 従って本発明は、ホスファターゼ活性を有し、負に帯電した部分の含有量が対 応する本来のホスファターゼより正味で高いホスファターゼの誘導体も目的とす る。特に本発明はアルカリ性ホスファターゼなどのアルカリ性ｐＨに最適を有す るホスファターゼから誘導された誘導体を目的とする。 負に帯電した部分の含有量が高い本発明のホスファターゼの誘導体は誘導され たアルカリ性アミノ部分の含有量が対応する本来のホスファターゼより高いこと ができる。これは例えば、負に帯電したＮ−アセチルノイラミン酸基（＝シアル 酸基）の含有量が対応する本来のホスファターゼより高い該誘導体により達成す ることができる。他の可能性は、対 応する本来のそのままのホスファターゼより負に帯電した酸部分の含有率が高い 、及び／又は塩基性部分の数が減少した誘導体、あるいは前記の実施態様との組 み合わせにある。さらに別の本発明の実施態様の場合、ホスファターゼの誘導体 は、負に帯電したタンパク質又はポリペプチドに結合したホスファターゼ部分を 含むことができる。そのような負に帯電したタンパク質の適した例は負に帯電し た修飾アルブミン、例えばスクシニル化アルブミンである。Ｗｏ ９３／００９ ３５、ＵＳ ４３９４３７０、ＵＳ４４０９３３２及びＥＰ−Ａ−０４４１２５ ２で開示されたホスファターゼの誘導体は、正味の負の電荷が増加した誘導体で はないことを繰り返す。該文献において開示された唯一の、より負に帯電した誘 導体は、ＡｓｐによるＡｌａ１０３の置換を有する組み換えＥ．コリアルカリ性 ホスファターゼである。さらに開示された誘導体のいずれも全身的に適用可能で ない。当該技術分野における熟練者は、どの種類の誘導体を全身的に適用可能と いう用語が意味するかわかるであろう。特に興味深いものは、経口的投薬形態又 は静脈内溶液、あるいは活性成分が血流中に侵入することができるようないずれ かの医薬投薬形態で用いることができる誘導体である。コラーゲン誘導体のよう な毒性誘導体は許容され得ない。 本発明の他の側面において、ホスファターゼの誘導体は、例えばガラクトース レセプターへの結合の妨害などにより生体内における該誘導体の半減期を延長さ せるための少なくとも１つの修飾を含むことができ、該修飾は例えばアルカリ性 ホスファターゼなどのホスファターゼの末端ガラクトース残基に位置する。例え ば血清アルカリ性ホスファターゼの除去は、肝臓ガラクトースレセプター類によ り媒介されることが既知で ある（参照文献２８）が、そのようなレセプターの基質を修飾する試みは以前に 記載又は示唆されていなかった。修飾は例えば酸化又は還元の結果であることが できる。 本発明は上記の種々の実施態様におけるそのままの誘導体を含むのみでなく、 そのような実施態様の種々の側面の組み合わせも含む。 ホスファターゼの誘導体として可能な種々の実施態様に関し、ＷＯ ９２／１ ５３１６は、それらのアミノ基及び／又は他の塩基性官能基を、塩基性アミノ基 及び／又は他の塩基性官能基のプロトン化を妨げる試薬を用いて誘導する、ある いは該塩基性基を、負の電荷を有する１つ又はそれ以上の官能基で置換すること により、タンパク質類又はポリペプチド類を修飾し、追加の正味の負の電荷を有 する修飾物質を与える方法の例を示している。誘導されるべき基はヒスチジン及 びリシン残基であることができる。試薬はアルデヒド類、無水物類、酸クロリド 類及びイソチオシアナート類から選ばれることができる。血清アルブミンの場合 、適した試薬はシス−アコニチン酸無水物である。修飾され、ホスファターゼに 結合し、本発明の誘導体を形成するべき他の適したタンパク質はα−酸糖タンパ ク質である。 生理学的ｐＨにおいて最適ホスファターゼ活性を有するアルカリ性ホスファタ ーゼの誘導体を創造することもでき、その誘導体は従って、生体内における使用 に適しており、そのような誘導体も本発明の範囲内に含まれる。 本発明は種々の実施態様において上記に記載した誘導体を含むのみでなく、ホ スファターゼ活性を有するそのようなホスファターゼの誘導体を少なくとも１種 、又はホスファターゼ活性を有するそのようなホスファ ターゼの誘導体を生産することができるビヒクルを活性成分として含み、さらに 製薬学的に許容され得る担体を含む製薬学的組成物も含む。 特に上記の活性成分、すなわちそのままのホスファターゼ、全身的に適用可能 であり、及び／又は対応する本来のホスファターゼの負の電荷より大きい正味の 負の電荷を有するホスファターゼの誘導体、あるいはホスファターゼ又はホスフ ァターゼ活性を有するこの誘導体を生産することができるビヒクルが、好ましく は負に帯電した膜成分と組み合わされて、リポソームの脂質二重層に埋め込まれ ている製薬学的組成物が本発明の好ましい実施態様である。そのような組成物に おいてホスファターゼは、内毒素又はその誘導体に関する無毒化活性を有するホ スファターゼ活性を持つホスファターゼである。 内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体により媒介される病気の予防又 は治療のための製薬学的組成物の製造のため活性成分としての、上記の実施態様 のいずれかにおけるホスファターゼ誘導体の利用も、従って本発明に含まれる。 特に負に帯電した、及び／又は全身的に適用可能なアルカリ性ホスファターゼの 誘導体、あるいは上記の実施態様のいずれかにおける誘導体のアルカリ性ホスフ ァターゼをデリバーできる、及び／又はそれらの合成を誘導できるビヒクルを含 む製薬学的組成物は、本発明の好ましい実施態様を構成する。全身的に適用可能 な製薬学的組成物が好ましい。 患者に治療的量のそのような製薬学的組成物、又はホスファターゼ活性を有す るホスファターゼの誘導体及び製薬学的に許容され得る担体を投与することを含 む、内毒素又は内毒素活性を有するその誘導体により媒介される病気の治療又は 予防の方法も本発明の範囲内に含まれる。特 に本発明は、移植又は輸血の後の、内毒素又は内毒素活性を有するその誘導体に より媒介される病気の発病を予防する方法も目的としており、該方法は、移植又 は輸血されるべき材料を移植又は輸血の前、及び／又はその間、及び／又はその 後にそのままの、又は製薬学的組成物の活性成分としての以下の成分の１つ： −内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有し、好 ましくはアルカリ性ホスファターゼ、より好ましくはヒトアルカリ性ホスファタ ーゼである、そのままのホスフアターゼ； −上記の本発明の実施態様の少なくとも１つに従う、ホスファターゼ活性を有す るホスファターゼの誘導体； −内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有するホ スファターゼ又はホスファターゼ誘導体のホスファターゼ活性をデリバーする、 及び／又はその合成を誘導することができ、該ホスファターゼガ好ましくはアル カリ性ホスファターゼであるビヒクル； −上記の本発明に従うホスファターゼの誘導体のホスファターゼ活性をデリバー する、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクルで処置することを含 む。製薬学的組成物は、活性成分を血流中に侵入できるようにする形態を有する のが好ましい。 内毒素無毒化機構がこのバクテリア産物の存在下でアップレギュレーションさ れるか否かを調べるために、ヒト好中球を単離し、内毒素と共に予備インキュベ ートし、アルカリ性ホスファターゼ活性に関してアッセイした。かくして好中球 を正常なヒトのボランティアから標準的方法に従って単離し、無菌の培地中に集 めた。好中球は、これらの細胞による超酸化物アニオン生産の測定により評価し た場合、単離法の間は活性 化されなかった。続いて細胞（０．９ｘ１０⁷細胞／ｍｌ）を、内毒素（２０ｐ ｇ／ｍｌ）又は食塩水が補足された緩衝液中で３７℃においてインキュベートし た。３０分後、ｐＮＰＰを基質として用い、ｐＨ９．８において標準的方法に従 い、これらの試料においてアルカリ性ホスファターゼ活性をアッセイした。ホス ファターゼ活性はレバミソール（１ｍＭ）を培地に加えて、及び加えずに測定し た。結果は、内毒素により誘導される好中球アルカリ性ホスファターゼ活性にお ける３３５％の増加を示し（図６）、それは提案されたこの酵素の機能と合致す る。 本発明は、以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有するホ スファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性、好ましくはアルカリ性ホス ファターゼ活性を剌激するための物質； −内毒素に関する、又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性 を有するホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性、好ましくはアル カリ性ホスファターゼ活性を刺激するための物質をデリバーする、及び／又はそ の合成を誘導することができるビヒクル、 を活性成分として含み、さらに製薬学的に許容し得る担体を含む製薬学的組成物 を含み、該製薬学的組成物は全身的に適用可能である。 本発明は以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有するホ スファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性、好ましくはアルカリ性ホス ファターゼ活性を刺激するための物質； −内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有するホ スファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性、好ましく はアルカリ性ホスファターゼ活性を刺激するための物質をデリバーする、及び／ 又はその合成を誘導することができるビヒクル、 を活性成分として、さらに製薬学的に許容し得る担体を、そのままのホスファタ ーゼ又はホスファターゼ活性を有するホスファターゼの誘導体、あるいは該ホス ファターゼ又は該誘導体をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することが できるビヒクルである他の活性成分と組み合わせて含む製薬学的組成物も含み、 但し該製薬学的組成物は（アルカリ性）ホスファターゼをコラーゲン及び／又は 無機質脱落骨との誘導体としては含まない、すなわち所望の骨形成の場における 骨形成のための、Ｂｅｅｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．により記載された製薬学的組 成物を含まない。対応する本来のホスファターゼと比較して正味の負の電荷を有 するホスファターゼの誘導体、あるいは該誘導体をデリバーする、及び／又はそ の合成を誘導することができるビヒクルを活性成分の１つとして、ホスファター ゼ活性を刺激することができる物質又は物質生産ビヒクルと組み合わせて含む製 薬学的組成物は、本発明の範囲内に含まれる。ホスファターゼ、好ましくは内在 性ホスファターゼ、特にアルカリ性ホスファターゼの天然の無毒化活性は、かく してさらに刺激され、内毒素又は内毒素活性を有するその誘導体により引き起こ される負の病理学的症状に対する防御の手段を与える。特にホスファターゼ活性 を刺激する、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性を刺激するための物質は 、以下の１つ又はそれ以上から選ばれることができる：内毒素、内毒素活性を有 する物質、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レチノイン酸、グルココル チコイド及び他のサイトカイン類又はホスファターゼ活性を刺激することが知ら れている物質（参照文献１３、２９及び３０）。 本発明は又、内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体により媒介される 病気の予防又は治療のための製薬学的組成物の製造のための活性成分としての、 ホスファターゼ活性を刺激するための上記の活性成分のいずれかの利用も含む。 本発明は又、そのような製薬学的組成物の製造のための、そのままのホスファタ ーゼ又はホスファターゼ活性を有するホスファターゼの誘導体、あるいは該誘導 体をデリバー、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクルと組み合わ された、ホスファターゼ活性を刺激するための該活性成分の利用も含む。 特に内在性アルカリ性ホスファターゼ活性の向上により、例えば上記の成分の １つをそのままで、又は製薬学的組成物の活性成分として患者に投与することに よって患者におけるその生産を向上させることにより、ホスファターゼ活性を刺 激することを含む、内毒素又は内毒素活性を有するその誘導体により媒介される 病気の発病を予防するための方法も本発明の範囲内に含まれる。移植又は輸血の 後の内毒素又は内毒素活性を有するその誘導体により媒介される病気の発病を予 防するための方法と同様に、該方法は移植又は輸血されるべき材料を、特に内在 性アルカリ性ホスファターゼ活性を向上させることにより、例えば以下の成分の 少なくとも１つ： −特に内毒素又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有す る内在性ホスファターゼ又はその誘導体の活性を向上させることによりホスファ ターゼ活性を刺激するための物質； −ホスファターゼ活性を刺激するための物質をデリバーする、及び／又はその合 成を誘導することができるビヒクル をそのままで、又は製薬学的組成物の活性成分として患者に投与するこ とにより、その該材料の生産を増加させることによりホスファターゼ活性を刺激 する処置に供することを含む。本発明のこの側面の適した実施態様は、ホスファ ターゼ活性を刺激するための上記の成分の少なくとも１つをそのままで、又は組 成物の活性成分として適用することを含む、動物又はヒトの体、組織又は体液に おけるアルカリ性ホスファターゼ、好ましくは内在性アルカリ性ホスファターゼ の存在を増加させるための方法に見いだすことができる。 上記の実験から要するに、アルカリ性ホスファターゼ活性に基づく酵素組成物 は、内毒素を脱リン酸化し、それにより試験管内及び生体内におけるこの分子の 毒性を弱めることができると結論することができる。この酵素の生理学的活性は 、適した微環境条件を与える負に帯電した残基が伴う場合に最も顕著である。さ らに、アルカリ性ホスファターゼ活性は、宿主−防御系の細胞においてアップレ ギュレーションされることができ、内毒素に対する天然の障壁を与える。 本発明は以下の成分の少なくとも１つ： −生体内において骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有する、好ましくはアル カリ性ホスファターゼ、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファターゼであ り、好ましくは組み換えホスファターゼであるそのままのホスファターゼ； −生体内において骨内又は骨上で該ホスファターゼ活性を有する全身的に許容さ れ得るアルカリホスファターゼの誘導体、及び／又は請求の範囲第１〜１２項の いずれかに記載の誘導体； −そのままの該ホスファターゼ及び／又は該誘導体のホスファターゼ活性、及び ／又は誘導体をデリバーする、及び／又はその合成を誘導する ことができるビヒクル を、生体内における活性成分として含み、さらに製薬学的許容し得る担体を含む 製薬学的組成物も含む。本明細書に関し、生体内は生理学的ｐＨ、すなわち７〜 ８のｐＨを有する大環境（ｍａｃｒｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）内を意味する 。そのような製薬学的組成物の適した実施態様は、好ましくは負に帯電した膜成 分と組み合わされてリポソームの脂質二重層に埋め込まれた活性成分を含む。 本発明はさらに以下の成分の少なくとも１つ： −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、より 好ましくはアルカリ性ホスファターゼ、及びより好ましくはヒトアルカリ性ホス ファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼであるそのままのホスフ ァターゼ； −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有するアル カリ性ホスファターゼの誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体をデリバーする、及び／又は その合成を誘導することができるビヒクル の、骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療のための製薬 学的組成物の製造のための生体内における活性成分としての利用を含む。 以下の成分の少なくとも１つ： −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、より 好ましくはアルカリ性ホスファターゼ、及びより好ましくはヒト（アルカリ性） ホスファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼであるそのままのホ スファターゼ； −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、生体 内でホスファターゼ活性を有する全身的に適用可能なアルカリ性ホスファターゼ の誘導体、ならびに／又は好ましくは対応する本来のホスファターゼと比較して 正味の負の電荷が増加した請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体で あるホスファターゼの誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体のホスファターゼ活性をデリ バーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクル の、破壊された骨の修理の刺激などの骨形成の向上を必要とする病気の予防又は 治療、ならびに骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療の ための製薬学的組成物の製造のための活性成分としての利用も、本発明の範囲内 である。 又、以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 し、及び／又は生体内において、特に骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有す る、好ましくは内在性ホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性を刺 激するための、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト （アルカリ性）ホスファターゼを刺激するための物質である物質； −ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファターゼ活性 を刺激するための該物質をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することが できるビヒクル を活性成分として含み、さらに製薬学的に許容し得る担体を含み、全身的に適用 可能である製薬学的組成物も本発明の範囲内である。本発明は 以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 し、及び／又は生体内において、特に骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有す る、好ましくは内在性ホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性を刺 激するための、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト （アルカリ性）ホスファターゼを刺激するための物質である物質； −ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファターゼ活性 を刺激するための該物質をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することが できるビヒクル を活性成分として、及びさらに製薬学的に許容し得る担体を、生体内活性成分と しての活性成分の少なくとも１つ： −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、より 好ましくはアルカリ性ホスファターゼ、及びより好ましくはヒトアルカリ性ホス ファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼであるそのままのホスフ ァターゼ； −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有する（ア ルカリ性）ホスファターゼの誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体をデリバーする、及び／又は その合成を誘導することができるビヒクル と、あるいは活性成分としての以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体に関する無毒化活性を有し、 好ましくはアルカリ性ホスファターゼ、より好ましくはヒトアルカリ性ホスファ ターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼで あるそのままのホスファターゼ； −内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体に関するホスファターゼ活性 を有し、好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ましくはヒトアル カリ性ホスファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼであるホスフ ァターゼの、全身的に許容され得るホスファターゼの誘導体であり、及び／又は 好ましくは対応する本来のホスファターゼと比較して正味の負の電荷が増加した 請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体である誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又はホスファターゼの誘導体のホスファタ ーゼ活性をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクル と組み合わせて含む製薬学的組成物も目的とする。 アルカリ性ホスファターゼ活性を刺激するための物質は、以下の１つ又はそれ 以上：内毒素、内毒素活性を有する物質、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ ）、レチノイン酸、グルココルチコイドから適切に選ばれることができる。当該 技術分野における熟練者に既知のいずれの他のそのような物質も本発明に従う所 望の（アルカリ性）ホスファターゼ活性の刺激を得るために用いることができる 。 ホスファターゼ活性を刺激するための物質、又はそのような上記の物質をデリ バーすることができるビヒクルを含む製薬学的組成物において、さらに別の活性 成分は、成分： −内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体に関するその無毒化活性を有 し、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ、より好ましくはヒトアルカリ性ホス ファターゼであり、好ましくは組み換えホスファター ゼであるそのままのホスファターゼ； −ホスファターゼ活性を有し、全身的に適用可能であり、及び／又は、好ましく は対応する本来のホスファターゼと比較して負の電荷が増加した請求の範囲第１ 〜１２項のいずれかに記載の誘導体であるホスファターゼの誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体のホスファターゼ活性をデリ バーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクル； −生体内において、骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、好ましくはアル カリ性ホスファターゼであり、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファター ゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼである、そのままのホスファター ゼ； −生体内において、骨内又は骨上で該ホスファターゼ活性を有する全身的に許容 され得るアルカリ性ホスファターゼの誘導体、ならびに／又は請求の範囲第１〜 １２項のいずれかに記載の誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体のホスファターゼ活性をデリ バーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクル のいずれであることもできる。 開示されているいずれの実施態様においても、製薬学的組成物は、好ましくは 負に帯電した膜成分と組み合わされてリポソームの脂質二重層に埋め込まれた活 性成分を含むことができる。製薬学的組成物は全身的に許容し得るのが好ましい 。 本発明は、ホスファターゼ活性を刺激するための物質、あるいは該物 質をデリバーする、及び／又はその合成を刺激するためのビヒクルを活性成分と して含む製薬学的組成物の少なくとも１つの活性成分の、内毒素及び／又は内毒 素活性を有する内毒素の誘導体により媒介される病気の予防又は治療のための製 薬学的組成物の製造のための利用も目的とする。上記で言及した活性成分の少な くとも１つの、骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療の ための製薬学的組成物の製造のための活性成分としての利用も本発明の範囲内で ある。さらに、活性成分としての請求の範囲第２５〜２７項のいずれかに記載の 製薬学的組成物の活性成分の少なくとも１つと組み合わされた、請求の範囲第２ ０〜２２項のいずれかに記載の製薬学的組成物の活性成分の少なくとも１つの、 破壊された骨の修理の刺激などの骨形成の向上を必要とする行気の予防又は治療 、及び骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療のための製 薬学的組成物の製造のための利用は本発明の範囲内である。本発明は又、骨形成 の向上を必要とする骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治 療のための方法を目的とし、該方法は、処置されるべき患者への請求の範囲第２ ３又は２４項の成分の少なくとも１つの適用を含む。破壊された骨の修理の刺激 などの骨形成の向上を必要とする病気の予防又は治療、ならびに骨粗しょう症及 び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療のための、請求の範囲第２０〜２ ２及び２５〜２７項のいずれかに記載の製薬学的組成物の活性成分の少なくとも １つをそのまま、又は組成物の活性成分として、処置されるべき患者に投与する ことを含む方法、ならびに骨肉腫などの急速な骨形成を伴う病気の処置のための 、好ましくは標的特異的方法で、すなわち該病気が起こっている位置において、 アルカリ性ホスファターゼ活 性を低下させる、又は阻害することを含む方法は、本発明の一部を構成する。開 示されているすべての方法において、活性成分は全身的に適用可能である。前に 挙げた製薬学的組成物に加えて、ホスファターゼ活性及び／又はホスファターゼ の濃度、特にアルカリ性ホスファターゼ（活性）を低下させる、又は阻害するこ とができる少なくとも１つの物質を含み、該物質が好ましくは望ましくない骨形 成が妨げられるべき位置において作用するように標的化されている製薬学的組成 物は、本発明に包含される。 図面の説明 図１ 基質β−グリセロホスフェートを用い、ｐＨ９．０において示されるラット腸 （Ａ）及び腎臓（Ｂ）のクリオスタット切片におけるアルカリ性ホスファターゼ 活性。図Ｃ及びＤはｐＨ７．４において基質として内毒素を用いて示される腸（ Ｃ）及び腎臓（Ｄ）の切片におけるホスファターゼ活性を示す。腸陰窩に沿って （図Ｃ）及び腎臓の尿細管刷子縁において内毒素の有意な脱リン酸化が見い出さ れ、アルカリ性ホスファターゼ活性の局在化と対応している（図Ａ及びＢ）。さ らに腸切片においてこの活性はＬ−フェニル−アラニンの添加により低下するが （図Ｅ）、腎臓切片における内毒素脱リン酸化はレバミソールにより完全に阻害 される（図Ｆ）。略字：ｍ＝髄質。倍率：３５ｘ（Ａ、Ｂ）、１４０ｘ（Ｃ、Ｅ ）及び５６ｘ（Ｄ、Ｆ）。 図２ 基質として内毒素を用いた種々のｐＨレベルにおいての尿細管刷子縁の懸濁液 における、１時間当たりの無機ホスフェート（Ｐｉ）放出とし て表されるホスファターゼ活性。基質パラ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ ＮＰＰ）を用いたホスファターゼ活性が上左角に示されている。尿細管刷子縁断 片はＰＶＧラット腎臓の皮質から単離され、Ｅ．コリ内毒素（１．２５ｍｇ／ｍ ｌ）又はｐＮＰＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む種々のｐＨレベルにおける２５０ μｌの２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール緩衝液に加えられた 。インキュベーションの直前に２ｍＭのＭｇＣｌ₂を加えた。破線はレバミソー ル（０．２ｍＭ）の存在下におけるホスファターゼ活性を示す。３７℃で１時間 インキュベートした後、無機ホスフェート濃度を以前に記載された通りに（参照 文献２９）評価した。結果は６回のアッセイの算術平均（±ＳＤ）として表し、 各アッセイは二重に行った。結果は内毒素の最大脱リン酸化がｐＨ８．８におい て起こるが、ｐＮＰＰの脱リン酸化はｐＨ９．８まで一定の増加を示すことを示 している。 図３ 基質として内毒素（図Ａ）又はｐＮＰＰ（図Ｂ）を用いた種々のｐＨレベルに おいての尿細管刷子縁の懸濁液における、１時間当たりのホスフェート（Ｐｉ） 放出として表されるホスファターゼ活性。基質は０．５％ポリ−エチレンイミン （ＰＥＩ）、０．７５％のポリ−Ｌ−リシン（Ｌｙｓ）又は蒸留水（Ｃ）と共に ３０分間予備インキュベートした。続いて図２において記載した通りにインキュ ベーションを行った。結果は４回のアッセイの算術平均として表し、各アッセイ は二重に行った（±ＳＤ）。 図４ 生体内における内毒素の毒性を評価するために、背中の種々の位置に おいてＰＶＧラットの皮膚に局所的Ｓｈｗａｒｔｚｍａｎ反応（参照文献１６） を誘導した。注射の前にすべての培地を、アルカリ性ホスファターゼ活性を含む ６μｇの尿細管刷子縁断片（Ａ）又は０．９％の食塩水（Ｓ）と共にインキュベ ートした（１時間、３７℃）。示されている場合はアルカリ性ホスファターゼ阻 害剤、レバミソール（Ｌ）を加えた（最終的濃度１．０ｍＭ）。皮内注射の２時 間後、皮膚部位を酸素ラジカル生産細胞の流入に関して分析し、３，３’−ジア ミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて光学顕微鏡のレベルで組織化学的に示した¹⁷ 。各試験は同じラットに関して二重に行い、６匹のラットの算術平均（±ＳＤ） として表す。 図５ ＰＶＧラットにおける、肝臓細胞の損傷を反映するグルタメート−ピルベート トランスアミラーゼ（ＧＰＴ）の血清量への内毒素の影響。動物の一部はｔ＝− ２４及び−１時間においてレバミソール（Ｌ；１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．）で予 備処置した。ｔ＝０においてラットに０．５ｍｇのＥ．コリからの内毒素を静脈 内に、又は０．５ｍｌの食塩水を与えた。結果は群当たりの算術平均（±ＳＤ ４匹のラット）として表す。 図６ ヒト好中球のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）活性への内毒素の影響。好中 球は標準的方法に従って全血から単離し、Ｅ．コリからの内毒素（２０ｐｇ／ｍ ｌ）を含む、又は含まない０．９％の食塩水中で３７℃において３０分間インキ ュベートした。続いてこれらの細胞のホスファターゼ活性を、基質としてパラニ トロフェノールホスフェートを用い、ｐＨ９．８において測定した。ホスフェー ト放出にアルカリ性ホスファ ターゼが含まれることを確証するためにレバミソール（１ｍＭ）を加えた。 図７Ａ Ｙ−軸に沿った、時における時間に対し、Ｘ−軸に沿ってＥ．コリ（実線）、 レバミソール（Ｌｅ）（三角形を有する破線）又は両方（丸を有する破線）の注 射後のラットの生き残りのパーセンテージを示す。 図７Ｂ スタフィロコックス・アウレウス（実線）、レバミソール（Ｌｅ）（三角形を 有する破線）又は両方（丸を有する破線）の注射後のラットの生き残りのパーセ ンテージを示す。 図８ アルカリ性ホスファターゼ処置を行って（破線）、及びアルカリ性ホスファタ ーゼを含まずに（実線）、Ｅ．コリを注射した後のマウスの生き残りを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１１月１５日 【補正内容】 請求の範囲 １．ホスファターゼ活性を有し、対応する本来のホスファターゼより負に帯電し た部分の正味の含有量が高く、好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、但 し、Ａｌａ１０３がＡｓｐにより置換された組み換えＥ．ｃｏｌｉアルカリ性ホ スファターゼではないホスファターゼの誘導体。 ２．ホスファターゼ活性を有し、例えばガラクトースレセプター類への誘導体の 結合を妨げることにより誘導体の生体内除去半減期を延長させることができる少 なくとも１つの修飾を含み、該修飾が例えば誘導体の末端ガラクトース残基に位 置し、該修飾が酸化又は還元の結果であるホスファターゼの誘導体。 ３．好ましくは生体内で、内毒素又は内毒素活性を有するこの誘導体に関する無 毒化活性を有する請求の範囲第１又は２項のいずれかに記載のホスファターゼの 誘導体。 ４．例えばガラクトースレセプター類への誘導体の結合を妨げることにより誘導 体の生体内除去半減期を延長させることができる少なくとも１つの修飾を含み、 該修飾が例えば誘導体の末端ガラクトース残基に位置し、該修飾が酸化又は還元 の結果である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のホスファターゼの誘導体 。 ５．生理学的ｐＨにおいて最適ホスファターゼ活性を示す請求の範囲第１〜４項 のいずれかに記載のアルカリ性ホスファターゼの誘導体。 ６．アルカリ性ホスファターゼ、好ましくはヒトアルカリ性ホスファターゼから 誘導され、好ましくは組み換えＤＮＡ法を介して得られる請求の範囲第１〜５項 のいずれかに記載のホスファターゼの誘導体。 ７．胎盤アルカリ性ホスファターゼ、好ましくはヒト胎盤アルカリ性ホスファタ ーゼから誘導される請求の範囲第６項に記載のホスファターゼの誘導体。 ８．対応する本来のホスファターゼ又は対応するその一部より誘導アルカリ性ア ミノ部分の含有量が高い請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のホスファター ゼの誘導体。 ９．対応する本来のホスファターゼ又はその一部より負に帯電したＮ−アセチル ノイラミン酸基の含有量が高い請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のホスフ ァターゼの誘導体。 １０．対応する本来のホスファターゼ又は対応するその一部より負に帯電した酸 部分の含有量が高く、塩基性基の数が少ない請求の範囲第１〜９項のいずれかに 記載のホスファターゼの誘導体。 １１．ホスファターゼ部分が負に帯電したタンパク質又はポリペプチドに結合し ている請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のホスファターゼの誘導体。 １２．ホスファターゼ部分が負に帯電した修飾アルブミン、例えばスクシニル化 アルブミンに結合している請求の範囲第１１項に記載のホスファターゼの誘導体 。 １３．以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体に関する無毒化活性を有し、 請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体であり、好ましくは対応する 本来のホスファターゼと比較して正味の負の電荷が増加しており、ホスファター ゼが好ましくはアルカリ性ホスファターゼ、より好ましくはヒトアルカリ性ホス ファターゼであり、好ましくは組み 換えホスファターゼであるホスフアターゼの誘導体； −該誘導体のホスファターゼ活性をデリバーする、及び／又はその合成を誘導す ることができるビヒクル、 を活性成分として含み、さらに製薬学的に許容され得る担体を含む製薬学的組成 物。 １４．活性成分が好ましくは負に帯電した膜成分と組み合わされてリポソームの 脂質二重層に埋め込まれている請求の範囲第１３項に記載の製薬学的組成物。 １５．組成物が全身的に許容され得る請求の範囲第１３又は１４項に記載の製薬 学的組成物。 １６．以下の成分の少なくとも１つ： −ホスファターゼが好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ましく はヒトアルカリ性ホスファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼで あり、ホスファターゼの誘導体が内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導 体に関するホスファターゼ活性を有し、請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記 載の誘導体であり、好ましくは対応する本来のホスファターゼと比較して正味の 負の電荷が増加している、内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体に関 する無毒化活性を有するホスフアターゼの誘導体； −ホスファターゼの該誘導体のホスファターゼ活性をデリバーする、及び／又は その合成を誘導することができるビヒクル、 を活性成分として含み、さらにワクチンに必要なアジュバントを含む内毒素及び ／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体により媒介される病気の予防のための ワクチン。 １７．ホスファターゼが好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ま しくはヒトアルカリ性ホスファターゼてあり、好ましくは組み換えホスファター ゼであり、ホスファターゼの誘導体が請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載 の誘導体であり、好ましくは全身的に適用可能である無毒化活性を有するホスフ ァターゼの誘導体、ならびに／又は内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘 導体に関するホスファターゼ活性をデリバーする、及び／又はその合成を誘導す ることができるビヒクルの、内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導 体により媒介される病気の予防又は治療のための製薬学的組成物の製造のための 活性成分としての利用。 １８．治療的量のホスファターゼ活性を有するホスファターゼの誘導体、あるい はホスファターゼの該誘導体のホスファターゼ活性をデリバーする、及び／又は その合成を誘導することができるビヒクルを患者に投与することを含み、特に請 求の範囲第１３〜１５項のいずれかに記載の製薬学的組成物の活性成分、又はそ のままの製薬学的組成物を投与することを含む内毒素及び／又は内毒素活性を有 する内毒素の誘導体により媒介される病気の治療又は予防の方法。 １９．移植、埋植又は輸血の前、及び／又はその間、及び／又は後に、移植、埋 植又は輸血されるべき材料を、以下の成分の１つ： −ホスファターゼが好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ましく はヒト（アルカリ性）ホスファターゼであり、好ましくは組み換えホスファター ゼであり、ホスファターゼの誘導体がホスファターゼ活性を有し、請求の範囲第 １〜１２項のいずれかに記載の誘導体であり、好ましくは対応する本来のホスフ ァターゼと比較して正味の負の電荷が 増加しており、特に全身的に適用可能である、内毒素及び／又は内毒素活性を有 する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有するホスファターゼの誘導体； −ホスファターゼの該誘導体をデリバーする、及び／又はその合成を誘導するこ とができるビヒクル をそのままで、又は製薬学的組成物の活性成分として用いて処理することを含む 移植、埋植又は輸血の後の内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体によ り媒介される病気の発病の予防の方法。 ２０．以下の成分の少なくとも１つ： −生体内において骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、請求の範囲第１〜 １２項のいずれかに記載の誘導体である誘導体； −該誘導体のホスファターゼ活性をデリバーする、及び／又はその合成を誘導す ることができるビヒクル を生体内における活性成分として含み、さらに製薬学的に許容され得る担体を含 む製薬学的組成物。 ２１．活性成分が好ましくは負に帯電した膜成分と組み合わされてリポソームの 脂質二重層に埋め込まれている請求の範囲第２０項に記載の製薬学的組成物。 ２２．組成物が全身的に許容され得る請求の範囲第２０又は２１項に記載の製薬 学的組成物。 ２３．以下の成分の少なくとも１つ： −請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の、生体内において、好ましくは骨 内又は骨上でホスファターゼ活性を有するホスファターゼの誘導体； −該誘導体をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒク ル の、骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は処置のための製薬 学的組成物の製造のための生体内における活性成分としての利用。 ２４．以下の成分の少なくとも１つ： −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、請求 の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体であるホスファターゼの誘導体； −該誘導体のホスファターゼ活性をデリバーする、及び／又はその合成を誘導す ることができるビヒクル の、破壊された骨の修理の刺激などの骨形成の向上を必要とする病気の予防又は 治療、ならびに骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療の ための製薬学的組成物の製造のための活性成分としての利用。 ２５．請求の範囲第１３〜１５項及び／又は２０〜２２項のいずれかに記載の製 薬学的組成物の活性成分の少なくとも１つに加えて、以下の成分の少なくとも１ つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 し、ならびに／又は生体内において、特に骨内又は骨上でホスファターゼ活性を 有する、好ましくは内在性ホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性 を刺激するための、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性、より好ましくは ヒト（アルカリ性）ホスファターゼを刺激するための物質である物質； −ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファターゼ活性 を刺激するための物質をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することがで きるビヒクル をさらなる活性成分として含み、さらに製薬学的に許容さ得る担体を含み、全身 的に適用可能である製薬学的組成物。 ２６．請求の範囲第１３〜１６及び／又は２０〜２３項の活性成分の少なくとも １つと組み合わせて以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 し、及び／又は生体内において、特に骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有す る、特に内在性ホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性を刺激する ための、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アル カリ性）ホスファターゼを刺激するための物質である物質； −ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファターゼ活性 を刺激するための物質をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することがで きるビヒクル をさらなる活性成分として含み、さらに製薬学的に許容さ得る担体を含み、但し 、コラーゲン及び／又は無機質脱落骨を用いて誘導されたホスファターゼを活性 成分として含まず、好ましくは全身的に適用可能である製薬学的組成物。 ２７．ホスファターゼ活性を剌激するための物質が以下の１つ又はそれ以上：内 毒素、内毒素活性を有する物質、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レチ ノイン酸、グルココルチコイドから選ばれる請求の範囲第２５又は２６項に記載 の製薬学的組成物。 ２８．請求の範囲第１３〜１６及び／又は２０〜２３項のいずれかに記載の活性 成分の少なくとも１つの、内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体 により媒介される病気の予防又は治療のための製薬学的組成物の製造のための活 性成分としての利用。 ２９．請求の範囲第１３〜１６及び／又は２０〜２３項のいずれかに記載の活性 成分の少なくとも１つの、骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防 又は治療のための製薬学的組成物の製造のための活性成分としての利用。 ３０．請求の範囲代２０〜２３項のいずれかに記載の製薬学的組成物の活性成分 の、

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バツカー，ウインストン・ウイレム オランダ・エヌエル―9795ピーシー ウオ ルテルスム・ケルクパト１ (72)発明者 マイジヤー，デイルク・クラース・フオツ ケ オランダ・エヌエル―9724エイエヌ グロ ニンゲン・パルクラーン17

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ホスファターゼ活性を有し、対応する本来のホスファターゼより負に帯電し た部分の正味の含有量が高く、好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、但 し、Ａｌａ１０３がＡｓｐにより置換された組み換えＥ．ｃｏｌｉアルカリ性ホ スファターゼではないホスファターゼの誘導体。 ２．ホスファターゼ活性を有し、例えばガラクトースレセプター類への誘導体の 結合を妨げることにより誘導体の生体内除去半減期を延長させることができる少 なくとも１つの修飾を含み、該修飾が例えば誘導体の末端ガラクトース残基に位 置し、該修飾が酸化又は還元の結果であるホスファターゼの誘導体。 ３．好ましくは生体内で、内毒素又は内毒素活性を有するこの誘導体に関する無 毒化活性を有する請求の範囲第１又は２項のいずれかに記載のホスファターゼの 誘導体。 ４．例えばガラクトースレセプター類への誘導体の結合を妨げることにより誘導 体の生体内除去半減期を延長させることができる少なくとも１つの修飾を含み、 該修飾が例えば誘導体の末端ガラクトース残基に位置し、該修飾が酸化又は還元 の結果である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のホスファターゼの誘導体 。 ５．生理学的ｐＨにおいて最適ホスファターゼ活性を示す請求の範囲第１〜４項 のいずれかに記載のアルカリ性ホスファターゼの誘導体。 ６．アルカリ性ホスファターゼ、好ましくはヒトアルカリ性ホスファターゼから 誘導され、好ましくは組み換えＤＮＡ法を介して得られる請求の範囲第１〜５項 のいずれかに記載のホスファターゼの誘導体。 ７．胎盤アルカリ性ホスファターゼ、好ましくはヒト胎盤アルカリ性ホスファタ ーゼから誘導される請求の範囲第６項に記載のホスファターゼの誘導体。 ８．対応する本来のホスファターゼ又は対応するその一部より誘導アルカリ性ア ミノ部分の含有量が高い請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のホスファター ゼの誘導体。 ９．対応する本来のホスファターゼ又はその一部より負に帯電したＮ−アセチル ノイラミン酸基の含有量が高い請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のホスフ ァターゼの誘導体。 １０．対応する本来のホスファターゼ又は対応するその一部より負に帯電した酸 部分の含有量が高く、塩基性基の数が少ない請求の範囲第１〜９項のいずれかに 記載のホスファターゼの誘導体。 １１．ホスファターゼ部分が負に帯電したタンパク質又はポリペプチドに結合し ている請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のホスファターゼの誘導体。 １２．ホスファターゼ部分が負に帯電した修飾アルブミン、例えばスクシニル化 アルブミンに結合している請求の範囲第１１項に記載のホスファターゼの誘導体 。 １３．以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体に関する無毒化活性を有し、 好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ましくはヒトアルカリ性ホ スファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼであるそのままのホス ファターゼ； −ホスファターゼ活性を有し、全身的に許容され得、及び／又は請求の 範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体であり、好ましくは対応する本来の ホスファターゼと比較して正味の負の電荷が増加しているホスフアターゼの誘導 体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体のホスファターゼ活性をデリ バーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクル、 を活性成分として含み、さらに製薬学的に許容され得る担体を含む製薬学的組成 物。 １４．活性成分が好ましくは負に帯電した膜成分と組み合わされてリポソームの 脂質二重層に埋め込まれている請求の範囲第１３項に記載の製薬学的組成物。 １５．組成物が全身的に許容され得る請求の範囲第１３又は１４項に記載の製薬 学的組成物。 １６．以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体に関する無毒化活性を有し、 好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ましくはヒトアルカリ性ホ スファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼであるそのままのホス ファターゼ； −内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体に関するホスファターゼ活性 を有し、ホスファターゼが好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好 ましくはヒトアルカリ性ホスファターゼであり、好ましくは組み換えホスファタ ーゼであり、誘導体がホスファターゼの全身的に許容され得る誘導体であり、及 び／又は請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体であり、好ましくは 対応する本来のホスファタ ーゼと比較して正味の負の電荷が増加しているホスフアターゼの誘導体； −該そのままのホスファターゼ又はホスファターゼの該誘導体のホスファターゼ 活性をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクル、 を活性成分として含み、さらにワクチンに必要なアジュバントを含む内毒素及び ／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体により媒介される病気の予防のための ワクチン。 １７．好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ましくはヒトアルカ リ性ホスファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼであるそのまま のホスファターゼ、ならびに／又は特に好ましくは全身的に許容され得、及び／ 又は請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体である無毒化活性を有す るホスファターゼの誘導体、ならびに／又は内毒素及び／又は内毒素活性を有す るその誘導体に関するホスファターゼ活性をデリバーする、及び／又はその合成 を誘導することができるビヒクルの、内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒 素の誘導体により媒介される病気の予防又は治療のための製薬学的組成物の製造 のための活性成分としての利用。 １８．治療的量のそのままのホスファターゼ、あるいはホスファターゼ活性を有 するその誘導体、あるいは該ホスファターゼ又は誘導体のホスファターゼ活性を デリバーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクルを患者に投 与することを含み、特に請求の範囲第１３〜１５項のいずれかに記載の製薬学的 組成物の活性成分、又はそのままの製薬学的組成物を投与することを含む内毒素 及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体により媒介される病気の治療又は 予防の方法。 １９．移植、埋植又は輸血の前、及び／又はその間、及び／又は後に、移植、埋 植又は輸血されるべき材料を、以下の成分の１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 し、好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ましくはヒト（アルカ リ性）ホスファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼであるそのま まのホスファターゼ； −ホスファターゼ活性を有し、特に好ましくは全身的に許容され得、及び／又は 請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体であり、好ましくは対応する 本来のホスファターゼと比較して正味の負の電荷が増加しているホスファターゼ の誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又はホスファターゼの該誘導体をデリバー する、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクルをそのままで、又は 製薬学的組成物の活性成分として用いて処理することを含む移植、埋植又は輸血 の後の内毒素及び／又は内毒素活性を有するその誘導体により媒介される病気の 発病の予防の方法。 ２０．以下の成分の少なくとも１つ： −生体内において骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、好ましくはアルカ リ性ホスファターゼであり、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファターゼ であり、好ましくは組み換えホスファターゼであるホスファターゼ； −生体内において骨内又は骨上で該ホスファターゼ活性を有するアルカリ性ホス ファターゼの全身的に許容され得る誘導体、及び／又は請求の範囲第１〜１２項 のいずれかに記載の誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体のホスファターゼ活 性をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクル を生体内における活性成分として含み、さらに製薬学的に許容され得る担体を含 む製薬学的組成物。 ２１．活性成分が好ましくは負に帯電した膜成分と組み合わされてリポソームの 脂質二重層に埋め込まれている請求の範囲第２０項に記載の製薬学的組成物。 ２２．組成物が全身的に許容され得る請求の範囲第２０又は２１項に記載の製薬 学的組成物。 ２３．以下の成分の少なくとも１つ： −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、より 好ましくはアルカリ性ホスファターゼ、より好ましくはヒトアルカリ性ホスファ ターゼ、及び好ましくは組み換えホスファターゼであるそのままのホスファター ゼ； −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有するアル カリ性ホスファターゼの誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体をデリバーする、及び／又は その合成を誘導することができるビヒクル の、骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は処置のための製薬 学的組成物の製造のための生体内における活性成分としての利用。 ２４．以下の成分の少なくとも１つ： −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、より 好ましくはアルカリ性ホスファターゼであり、より好ましくは ヒト（アルカリ性）ホスファターゼであり、好ましくは組み換えホスファターゼ であるそのままのホスファターゼ； −生体内において、好ましくは骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有し、生体 内でホスファターゼ活性を有するアルカリ性ホスファターゼの全身的に許容され 得る誘導体、及び／又は請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体であ り、好ましくは対応する本来のホスファターゼと比較して正味の負の電荷が増加 しているホスファターゼの誘導体； −該そのままのホスファターゼ及び／又は該誘導体のホスファターゼ活性をデリ バーする、及び／又はその合成を誘導することができるビヒクル の、破壊された骨の修理の刺激などの骨形成の向上を必要とする病気の予防又は 治療、ならびに骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療の ための製薬学的組成物の製造のための活性成分としての利用。 ２５．以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 し、及び／又は生体内において、特に骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有す る、特に内在性ホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性を刺激する ための、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アル カリ性）ホスファターゼを刺激するための物質である物質； −ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファターゼ活性 を刺激するための物質をデリバーする、及び／又はその合成を 誘導することができるビヒクル を活性成分として含み、さらに製薬学的に許容さ得る担体を含み、全身的に適用 可能である製薬学的組成物。 ２６．以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 し、及び／又は生体内において、特に骨内又は骨上でホスファターゼ活性を有す る、特に内在性ホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性を刺激する ための、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アル カリ性）ホスファターゼを刺激するための物質である物質； −ホスファターゼ活性、より好ましくはヒト（アルカリ性）ホスファターゼ活性 を刺激するための物質をデリバーする、及び／又はその合成を誘導することがで きるビヒクル を活性成分として、さらに製薬学的に許容さ得る担体を、請求の範囲第１６及び ／又は２３項に記載の活性成分の少なくとも１つ組み合わせて含み、但し、コラ ーゲン及び／又は無機質脱落骨を用いて誘導されたホスファターゼを活性成分と して含まず、好ましくは全身的に適用可能である製薬学的組成物。 ２７．ホスファターゼ活性を刺激するための物質が以下の１つ又はそれ以上：内 毒素、内毒素活性を有する物質、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レチ ノイン酸、グルココルチコイドから選ばれる請求の範囲第２５又は２６項に記載 の製薬学的組成物。 ２８．さらに請求の範囲第１３〜１５及び／又は２０〜２２項のいずれかに記載 の製薬学的組成物の活性成分の少なくとも１つを、さらなる活 性成分として含む請求の範囲第２５〜２７項のいずれかに記載の製薬学的組成物 。 ２９．請求の範囲第２５〜２７項のいずれかに記載の製薬学的組成物の活性成分 の少なくとも１つの、内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体によ り媒介される病気の予防又は治療のための製薬学的組成物の製造のための活性成 分としての利用。 ３０．請求の範囲第２５〜２７項のいずれかに記載の製薬学的組成物の活性成分 の少なくとも１つの、骨粗しょう症及び骨軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は 治療のための製薬学的組成物の製造のための活性成分としての利用。 ３１．請求の範囲第２５２７項のいずれかに記載の製薬学的組成物の活性成分の 少なくとも１つと組み合わされた請求の範囲第２０〜２２項のいずれかに記載の 製薬学的組成物の活性成分の少なくとも１つの、破壊された骨の修理の刺激など の骨形成の向上を必要とする病気の予防又は治療、ならびに骨粗しょう症及び骨 軟化症などの代謝性骨疾患の予防又は治療のための製薬学的組成物の製造のため の活性成分としての利用。 ３２．特に内在性アルカリ性ホスファターゼ活性を向上させることにより、例え ば以下の成分の少なくとも１つ： −好ましくは内在性ホスファターゼ及び／又はその誘導体のホスファターゼ活性 を刺激するための物質； −ホスファターゼ活性を刺激するための該物質をデリバーする、及び／又はその 合成を誘導することができるビヒクル をそのままで、又は組成物の活性成分として、処置されるべき患者に投与するこ とによって処置されるべき患者におけるその生産を向上させる ことにより、ホスファターゼ活性を刺激することを含む、内毒素及び／又は内毒 素活性を有する内毒素の誘導体により媒介される病気の発病を予防する方法。 ３３．移植又は輸血されるべき材料を、例えば以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 する、特に内在性ホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性を刺激す るための、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性を刺激するための物質であ る物質； −内在性ホスファターゼ活性を刺激するための該物質をデリバーする、及び／又 はその合成を誘導することができるビヒクル をそのまま、又は組成物の活性成分として処置されるべき対象に投与することに よって該材料におけるその生産を向上させることにより、特に内在性アルカリ性 ホスファターゼのホスファターゼ活性を刺激する処置に供することを含む、移植 又は輸血の後の内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体により媒介 される病気の発病を予防するための方法。 ３４．以下の成分の少なくとも１つ： −内毒素及び／又は内毒素活性を有する内毒素の誘導体に関する無毒化活性を有 する内在性ホスファターゼ又はその誘導体のホスファターゼ活性を刺激するため の、好ましくはアルカリ性ホスファターゼ活性を刺激するための物質である物質 ； −ホスファターゼ活性を刺激するための該物質をデリバーする、及び／又はその 合成を誘導することができるビヒクル をそのままで、又は組成物の活性成分として動物又はヒトの体組織又は体液に適 用することを含む、動物又はヒトの体、組織又は体液における内在性ホスファタ ーゼ、好ましくはアルカリ性ホスファターゼの生産を活性化する方法。 ３５．請求の範囲第２３又は２４項の成分の少なくとも１つを処置されるべき患 者に投与することを含む、骨形成の向上を必要とする骨粗しょう症及び骨軟化症 などの代謝性骨疾患の予防又は治療の方法。 ３６．請求の範囲第２０〜２２及び２５〜２７項にいずれかに記載の製薬学的組 成物の活性成分の少なくとも１つをそのままで、又は組成物の活性成分として処 置されるべき患者に投与することを含む、破壊された骨の修理の刺激などの骨形 成の向上を必要とする病気の予防又は治療、ならびに骨粗しょう症及び骨軟化症 などの代謝性骨疾患の予防又は治療の方法。 ３７．好ましくは標的特異的方法で、すなわち病気が起こっている位置において 、アルカリ性ホスファターゼ活性を低下させる、又は阻害することを含む、骨肉 腫などの急速な骨形成を伴う病気の処置の方法。 ３８．活性成分が全身的に適用可能である請求の範囲第３２３７項のいずれかに 記載の方法。 ３９．ホスファターゼ活性及び／又はホスファターゼの濃度、特にアルカリ性ホ スファターゼ（活性）を低下させる、又は阻害することができ、好ましくは望ま しくない骨形成が妨げられるべき位置において作用するように標的化された物質 を少なくとも１つ含む製薬学的組成物。 ４０．物質を、ホスファターゼ、例えばアルカリ性ホスファターゼ又はホスファ ターゼ活性を有するホスファターゼの誘導体、例えば請求の範 囲第１〜１２項のいずれかに記載の誘導体のホスファターゼ活性に、存在する内 毒素を無毒化するのに十分な長さの時間、供することを含む、物質を内毒素の毒 性から解放する方法。