JPH09297141A - C型肝炎ウイルス感染症診断薬 - Google Patents
C型肝炎ウイルス感染症診断薬Info
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Abstract
HCV感染症診断薬ならびに診断法を提供する。 【解決手段】 HCV抗原と、HCV抗原とキャリアー
タンパク質との化学結合により調製した複合抗原とを固
相に感作させて得られるC型肝炎ウイルス感染症診断
薬、ならびに該C型肝炎ウイルス感染症診断薬を検体試
料に添加し、担体粒子の凝集度を測定することからなる
C型肝炎ウイルス感染症の診断法。
Description
用してC型肝炎ウイルス(HCV)感染症を検出する診
断薬に関する。
社の研究グループによってHCV遺伝子がウイルスに先
立って発見された。このHCVに対する抗体を検出する
ために各種組換え抗原や合成ペプチドが検討され、HC
V関連抗体を検出するキットが開発されている。また、
検出方法としては、寒天ゲル拡散法、対向免疫電気泳動
法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、受身赤血球凝集
法、ラテックス凝集法などがある。
るHCV抗原タンパクとしては、構造領域タンパクとし
てコアおよびエンベロープタンパク、非構造領域タンパ
クとしてNS1〜NS5タンパクが知られている。1つ
のHCV抗原タンパクのみでは検出感度が十分高くな
く、特異性にも問題があるので、構造領域と非構造領域
のタンパクを適宜組み合わせて用いられている(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:10011-10015, 1992)。ま
た、さらに検出感度を高めるための試みもなされてい
る。例えば、粒子凝集法では、感作するHCV抗原の数
をさらに増やしたり、HCV抗原活性ポリペプチドを加
熱処理したり(特開平6−1002273号)、あるい
はHCV抗原タンパクとキャリアータンパクとの融合タ
ンパクを親水性粒子に感作して用いる(特開平7−19
8723号)などが行われている。
みもなされているが、合成ペプチドを用いた場合には一
般に検出感度が低くなると言われている。
度で迅速に多数の検体を測定できるHCV感染症診断薬
ならびに診断法が求められている。
意検討した結果、グルタルアルデヒド法を用いて、キャ
リアータンパク質と各種C型肝炎ウイルスのコア抗原、
NS3抗原、NS4抗原およびNS5抗原を化学結合し
た複合抗原を担体粒子に感作させることにより、高感度
化が可能となった。またこの複合抗原を使用することに
より、粒子の安定性についても大幅に改善することが可
能となった。
ャリアータンパク質との化学結合により調製した複合抗
原とを固相に感作させて得られるC型肝炎ウイルス感染
症診断薬を提供する。
ンパクであれば特に制限はないが、好ましくは分子量1
0,000〜1,000,000、より好ましくは3
0,000〜150,000であり、具体的にはウシ血
清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン、ヘモシアニ
ンなどが好適に用いられる。この他にも、水溶性合成高
分子、例えばポリビニルアルコール、デキストランなど
も使用できる。
プレート、試験管などを使用できる。担体粒子を用いる
ことが好ましい。担体粒子としては、通常粒子凝集法の
診断薬で用いられる公知の粒子を用いることができる。
例えば、ポリスチレンラテックスのような疎水性粒子、
粒子表面にアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有
する共重合ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子など
を用いることができる。より好ましくはポリスチレンラ
テックスが用いられる。
パク質は、公知のHCVの構造領域タンパク質や非構造
タンパク質である。構造領域タンパク質としては、コア
タンパク、非構造領域タンパク質としてはNS3タンパ
ク、NS4タンパク、およびNS5タンパクを使用でき
る。なお、これらの抗原タンパク質のアミノ酸およびヌ
クレオチド配列については文献(特表平5−50821
9号)に記載されている。抗原タンパク質の由来につい
てはHCV抗原活性を有するものであれば特に制限され
ず、天然から単離したもの、化学合成によるもの、およ
び遺伝子組換え法により製造したものを使用できる。抗
原タンパク質としてはこれらの領域のタンパク質のうち
の種々の長さのペプチドを用いることができ、好ましく
は、少なくとも1つのエピトープを含む8個以上のアミ
ノ酸からなるペプチドを用いる。より好ましくは、分子
量1,000〜5,000の合成ペプチドを用いる。ペ
プチドは当業界で公知の方法、例えば固相合成法、フラ
グメント縮合法、または古典的溶液合成法を用いて合成
することができる。好ましくは文献(Merrifield,J. A
m. Chem. Soc. 85:2149, 1963)に記載の固相ペプチド
合成法により製造できる。なお、本発明では、コア、N
S3、NS4、NS5のそれぞれの抗原タンパク質とし
て、少なくとも1つ以上の異なるエピトープを含む1種
類以上の抗原を組み合わせて、これらを直接あるいはキ
ャリアータンパク質との複合抗原として担体粒子に感作
することができる。後述する実施例ではコア抗原として
特表平5−508219号記載のコア領域のうちのアミ
ノ酸49〜68を含むペプチドを使用し、NS4ペプチ
ドとして特表平5−508219号記載のNS4領域の
うちのアミノ酸1706〜1725、1718〜173
7および1724〜1743を含むペプチドを使用し、
またNS5ペプチドとして特表平5−508219号記
載のNS5領域のうちのアミノ酸2287〜2306、
2299〜2318および2311〜2330を含むペ
プチドを使用し、またNS3抗原としては特表平5−5
08219号記載のNS3領域のうちのアミノ酸119
2〜1457のペプチドを使用したが、これに限定され
ない。
ータンパク質と化学結合により結合して複合抗原を調製
する。抗原タンパク質は直接担体粒子に感作させるより
も複合抗原として感作させた方が検出感度のよいことが
見いだされた。ただし、本発明で使用したNS3抗原の
ように分子量が10,000以上のものについては顕著
な差は観察されず、したがってそのような抗原タンパク
質を直接担体粒子に感作し、他の抗原タンパク質を複合
抗原として感作させてもよい。キャリアータンパク質と
抗原タンパク質との結合には公知の方法を用いることが
でき、例えば、カルボジイミド法、過ヨウ素酸法、マレ
イミド法、グルタルアルデヒド法などを用いることがで
きる。グルタルアルデヒドによる架橋により行うことに
よって反応性が増大するのでグルタルアルデヒド法を用
いることが好ましい。また、キャリアータンパク質と抗
原タンパク質は、分子数の比で、約1:3〜1:20、
好ましくは約1:4〜1:9、より好ましくは約1:6
〜1:8の割合で混合して複合抗原を調製する。このよ
うにして調製した複合抗原を公知の方法により担体粒子
と結合(感作)する。例えば、物理的吸着、化学的吸着
によって行うことができる。上述したように、NS3抗
原はキャリアータンパク質と複合抗原を形成することな
く直接担体粒子に感作することもできるが、これも同様
の方法を用いることができる。感作は緩衝作用のある緩
衝液中で行い、例えばリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、
トリス緩衝液、酢酸緩衝液を用い、好ましくはpH3〜
8、より好ましくはpH4〜5で行う。
症診断薬を検体試料に添加し、担体粒子の凝集度をフロ
ーサイトメーターで測定することからなるC型肝炎ウイ
ルス感染症の診断法を提供する。本発明のC型肝炎ウイ
ルス感染症診断薬は、検体試料中に抗HCV抗体が存在
する場合にはこれも反応して凝集を生じる。生じた凝集
は目視、あるいは濁度、吸光度などでも測定は可能であ
るが、フローサイトメータの原理を応用した全自動免疫
凝集測定装置(例えば東亜医用電子社製のPAMIA−
30TM)を用いて凝集粒子の大きさを光学的に測定する
ことにより迅速かつ高感度、高精度に測定することがで
きる。すなわち、試料をシースフロー機構によりフロー
セル中に導き、1列に並べて通過させる。ここにレーザ
ー光を照射して生じる散乱光の強度を測定することによ
っても凝集の程度を知ることができる。凝集粒子数
(P:Polymer)と未凝集粒子数(M:Mono
mer)を計数する。このPとMからP/T(T=P+
M)を演算し、あらかじめ得られたカットオフ値からH
CV抗体の有無を定性判定するものである。この方法を
用いることによって、HCV抗体をより高感度に検出す
ることができる。また、粒径を適当なものとすれば、電
気抵抗法を用いた血液分析装置や粒度分析測定装置によ
り測定することも可能である。ただし検出器の目詰まり
などの問題を考慮すると、光学的な方法で測定する方が
好ましい。
を用いるとC型肝炎ウイルスへの感染を感度よく、かつ
市販の診断薬よりも早期に診断することが可能である。
すなわち、HCV抗体が陽性化していく過程で同一人か
ら経時的に採血した数検体から構成されるパネル血清
(例えば、HCVセロコンバージョンパネル、輸入販売
元:協和メディックス、製造元:BOSTON BIO
MEDICA,INC)を用いて試験したところ、本発
明のC型肝炎ウイルス感染症診断薬は、従来の赤血球を
用いる受動血球凝集法(PHA)、酵素免疫検定法(E
IA)、および酵素免疫ソルベント検定法(ELIS
A)に比べてより早期に、すなわち感染初期にHCVへ
の感染を検出できることが明らかとなった。
るがキャリアータンパク質と複合抗原を調製することな
く直接感作することによって製造した診断薬とを比較し
たところ、本発明の診断薬の方が検出感度の優れている
ことが判明した。
後にも検出感度が落ちず、安定な診断薬であるといえ
る。
法と比較して、繁雑な洗浄工程を伴わなず、単に本発明
のHCV感染症診断薬(好ましくはHCV抗原を感作し
たラテックス粒子)を、検体試料(好ましくは被験者血
液)と混合するだけの操作によって実施することが可能
である。また、本発明の診断法は上記混合操作および測
定操作のいずれをも全自動で行う測定機による測定が可
能であり、多数の検体を測定するのに好適である。
説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。
19号の実施例1の記載に基づいて遺伝子組換え法によ
り製造し使用した。用いたNS3ペプチドはHCVタン
パク質のアミノ酸1192〜1457である。
ては、特表平5−508219号に記載されたアミノ酸
配列のうち、それぞれ49〜68、1706〜172
5、2287〜2306を含むペプチドを、PERKI
N ELMER社のペプチドシンセサイザModel
431Aを用いて合成し使用した。
10mM PBS、pH7.0中に、0.1%(w/
v)の濃度で調製したもの1容量に、コア抗原(アミノ
酸49〜68のペプチド)を10mM PBS、pH
7.0中に0.1%(w/v)の濃度に調製したもの7
容量を添加し、最終的に10mM PBS、pH7.0
を加えて9容量となるよう調製する。その後、1%グル
タルアルデヒド水溶液を添加し反応を開始する。反応温
度は30℃で行い、30分後に20%グリシン水溶液1
容量を添加して反応を停止する。
様の操作を行い、10mM PBS、pH6〜8の緩衝
液を用い、1容量の1%(w/v)BSA溶液に対し、
1〜8容量の0.1%(w/v)HCV抗原溶液を反応
させてHCV複合抗原を調製した。
造 粒径0.78μmのポリスチレンラテックス粒子(積水
化学工業株式会社製)を10mM PBS、pH4.0
中に5%(w/v)の濃度に調製し、この中に実施例1
で調製したNS3複合抗原、NS4複合抗原、NS5複
合抗原をラテックス分散液1ml当たり50μg添加
し、4℃で24時間反応させた。その後遠心(1200
0rpm、10分)を行い、1mg/ml BSAを含
む0.1MPBS緩衝液、pH7.0を最初と同量添加
し粒子を分散させた。再度遠心処理を行い、同じ緩衝液
中に分散させてHCV抗原感作ラテックスとした。
HCV抗原感作ラテックス(5%)10μlを添加し、
1mg/mlのBSAを含む0.1Mリン酸緩衝液80
μlを加え、45℃で15分間反応させた後、ラテック
ス粒子の凝集度を測定した。この反応および測定は全自
動免疫測定装置PAMIA−30(東亜医用電子株式会
社製)を用い、前方散乱光を測定した。
た粒子数のパーセント(P/T%)で示される。
らかなように、HCV抗体陽性検体において十分な凝集
度が得られている。また、HCV抗体陰性検体ではラテ
ックスは凝集せず、HCV抗体を含む検体試料では凝集
が認められることから、HCV抗原で感作したラテック
ス粒子がHCV抗体と反応することによって凝集が生じ
たことがわかる。
採血した数検体から構成される、市販のHCVセロコン
バージョンパネルPHV901、PHV902およびP
HV903(輸入販売元:協和メディックス、製造元:
BOSTONBIOMEDICA,INC)を用いて、
HCV抗体陽転の早期検出感度を試験した。実施例2で
調製した診断薬を用いる本発明のカウンティングイムノ
アッセイ(CIA)を、以下の方法を用いる他社製品と
比較した: A社:赤血球を用いる受動血球凝集法(PHA) 使用HCV抗原:コア、NS3、NS4 B社:酵素免疫検定法(EIA) 使用HCV抗原:コア、NS3、NS4 C社:酵素免疫ソルベント検定法(ELISA) 使用HCV抗原:コア、NS3、NS4 得られた結果を以下の表2、表3および表4に示す(な
お、表中のB社およびC社のデータはパネルに添付のデ
ータを記載した)。本発明の診断薬ならびに診断法を用
いると、パネルPHV902およびPHV903(これ
らのパネルの被験者は採血第1日目からPCRによる抗
体検査は陽性である)において、他社のいずれの診断薬
よりも早期にHCV感染を検出できた。
薬との比較 本発明の診断薬と、同じHCV抗原を直接感作して調製
した診断薬とを用いて、HCV抗体の検出感度試験を行
った。
の)、コア抗原(合成法により得たペプチド)、NS4
抗原(合成法により得たペプチド)、およびNS5抗原
(合成法により得たペプチド)はそれぞれBSAとの複
合抗原とした後に、実施例2の方法により感作して、H
CV複合抗原感作ラテックスとした。
いてすべて直接感作によりHCV抗原直接感作ラテック
スを調製した。
方法により、HCV抗体陽性の検体試料(A〜E)およ
びHCV抗体陰性の検体(F〜J)の凝集度(P/T
%)を測定した。カットオフ値(複合抗原感作ラテック
スで1.95%;抗原直接感作ラテックスで1.01
%)を考慮して各検体のHCV抗体陽性または陰性を判
定した。得られた結果を以下の表5に示す。
びEにおいて、抗原を直接感作した診断薬ではHCV抗
体を検出できなかったが、本発明による複合抗原を感作
した診断薬では検出可能であった。
0.1M PBS、pH7.0懸濁液を冷蔵保存し、試
薬の保存安定性を試験した。得られた結果を以下の表6
に示す。
感作ラテックスは13カ月の長期保存後でも凝集度が安
定していた。一方、直接感作ラテックスでは、HCV抗
体陰性プール血清を用いた試験では凝集度が長期保存と
ともに徐々に上昇し、HCV抗体陽性プール血清を用い
た試験では凝集度が徐々に低下し、またカットオフ値が
徐々に上昇することが観察された。
造(2) HCV抗原として、実施例1と同じものを用い、NS3
抗原を複合抗原とせずに直接感作した以外は、実施例2
と同様に操作を行い、HCV抗原感作ラテックスと調製
した。
造(3) NS3抗原は、実施例1と同じものを用い、コア抗原と
して、前記公報(特表平5−508219号)記載のア
ミノ酸49〜68のペプチド、NS4抗原として、同じ
くアミノ酸1706〜1725、1718〜1737の
ペプチド、NS5抗原として、同じくアミノ酸2287
〜2306、2299〜2318のペプチドを用い、実
施例1と同様に1容量の1%(w/v)BSA溶液に対
し、1〜8容量の0.1%(w/v)HCV抗原溶液を
反応させてHCV複合抗原を調製し、実施例2と同様に
HCV抗原感作ラテックスを調製した。
造(4) NS3抗原は、実施例1と同じものを用い、コア抗原と
して、前記公報記載のアミノ酸49〜68のペプチド、
NS4抗原として、同じくアミノ酸1706〜172
5、1718〜1737、1724〜1743のペプチ
ド、NS5抗原として、同じくアミノ酸2287〜23
06、2299〜2318、2311〜2330のペプ
チドを用い、実施例1と同様に1容量の1%(w/v)
BSA溶液に対し、1〜8容量の0.1%(w/v)H
CV抗原溶液を反応させてHCV複合抗原を調製し、実
施例2と同様にHCV抗原感作ラテックスを調製した。
Claims (11)
- 【請求項1】 HCV抗原と、HCV抗原とキャリアー
タンパク質との化学結合により調製した複合抗原とを固
相に感作させて得られるC型肝炎ウイルス感染症診断
薬。 - 【請求項2】 HCV抗原が、コア抗原、NS3抗原、
NS4抗原およびNS5抗原から選ばれたものである請
求項1記載のC型肝炎ウイルス感染症診断薬。 - 【請求項3】a.コア抗原とキャリアータンパク質との
化学結合により調製した複合抗原、 b.NS3抗原、またはNS3抗原とキャリアータンパ
ク質との化学結合により調製した複合抗原、 c.NS4抗原とキャリアータンパク質との化学結合に
より調製した複合抗原、 d.NS5抗原とキャリアータンパク質との化学結合に
より調製した複合抗原、 から選択される3種以上のHCV抗原を固相に感作させ
て得られる請求項1または2記載のC型肝炎ウイルス感
染症診断薬。 - 【請求項4】 HCV抗原が、HCV抗原活性を有する
少なくとも1つ以上の異なるエピトープを含む1種以上
である請求項1〜3のいずれかに記載のC型肝炎ウイル
ス感染症診断薬。 - 【請求項5】 キャリアータンパク質がBSA、卵白ア
ルブミンまたはヘモシアニンから選択される請求項1〜
4のいずれかに記載のC型肝炎ウイルス感染症診断薬。 - 【請求項6】 固相が担体粒子である請求項1〜5のい
ずれかに記載のC型肝炎ウイルス感染症診断薬。 - 【請求項7】 担体粒子が疎水性粒子である請求項6記
載のC型肝炎ウイルス感染症診断薬。 - 【請求項8】 疎水性粒子がポリスチレンラテックスで
ある請求項7記載のC型肝炎ウイルス感染症診断薬。 - 【請求項9】 請求項6記載のC型肝炎ウイルス感染症
診断薬を検体試料に添加し、担体粒子の凝集度を測定す
ることからなるC型肝炎ウイルス感染症の診断法。 - 【請求項10】 凝集度をフローサイトメータで測定す
る請求項9記載のC型肝炎ウイルス感染症の診断法。 - 【請求項11】 フローサイトメータによる測定が前方
散乱光を測定することによって行う請求項10記載のC
型肝炎ウイルス感染症の診断法。
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