JPH09275996A - Assay of biocomponent - Google Patents
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- JPH09275996A JPH09275996A JP9105496A JP9105496A JPH09275996A JP H09275996 A JPH09275996 A JP H09275996A JP 9105496 A JP9105496 A JP 9105496A JP 9105496 A JP9105496 A JP 9105496A JP H09275996 A JPH09275996 A JP H09275996A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ビオチン標識体と
アビジン又はストレプトアビジンを反応させる際に生じ
る非特異的反応を抑制し、この非特異的反応によるノイ
ズが低減され、測定対象を高感度に検出することができ
る生体成分の測定法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention suppresses a non-specific reaction that occurs when a biotin-labeled substance is reacted with avidin or streptavidin, reduces noise due to this non-specific reaction, and makes a measurement target highly sensitive. The present invention relates to a method for measuring a biological component that can be detected.
【０００２】[0002]
【従来の技術】分子生物学的な手法による特定遺伝子の
検出や塩基配列の決定は、遺伝的な疾患の病因解析や、
タンパク質の構造や機能解析に欠かせない基本技術であ
る。特に、遺伝子解析のための分析法としては、従来よ
り32Ｐや35Ｓといった放射性同位元素（以下、ＲＩと称
す）を使用する方法が主流を成してきた。しかし、ＲＩ
を使用する方法では、ＲＩによる作業者の健康に対する
影響や、取り扱う施設の限定などの問題があるため、近
年、ＲＩを使用しない方法が行われるようになってきて
いる。2. Description of the Related Art The detection of a specific gene or the determination of a nucleotide sequence by a molecular biology method is used to analyze the etiology of a genetic disease,
It is a basic technology essential for protein structure and function analysis. In particular, as an analysis method for gene analysis, a method using a radioactive isotope such as 32 P or 35 S (hereinafter, referred to as RI) has conventionally been the mainstream. However, RI
In the method of using RI, there are problems such as the influence of RI on the health of workers and the limitation of facilities to be handled. Therefore, in recent years, a method of not using RI has been used.
【０００３】このようにＲＩを使用せず、非ＲＩを使用
する方法の代表例は、ＤＮＡに標識したビオチンと、こ
れと特異的に結合するストレプトアビジンの反応を利用
したものである。この方法において、ストレプトアビジ
ンを予め特定の酵素、例えばアルカリ性フォスファター
ゼ（以下、ＡＬＰと称す）で標識しておき、目的に合わ
せた基質を用いて検出する方法が知られている。従来、
ＡＬＰ標識ストレプトアビジンと５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルリン酸−ニトロブルーテトラゾリウ
ム系を組み合わせたものなどが汎用されていたが、最近
ではジオキセタンなどを基質として高い感度を有する化
学発光法に基づいたものも多用されている。また、発光
法には、化学発光法の他に生物発光法があり、例えばＡ
ＴＰの存在下、ルシフェリン−ホタルルシフェラーゼの
反応により発光させる方法などが行われている。A typical example of the method of using non-RI without using RI is to utilize the reaction between biotin labeled on DNA and streptavidin that specifically binds to it. In this method, a method is known in which streptavidin is labeled in advance with a specific enzyme, for example, alkaline phosphatase (hereinafter referred to as ALP), and the substrate is detected according to the purpose. Conventionally,
A combination of ALP-labeled streptavidin and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate-nitroblue tetrazolium system has been widely used, but recently, chemiluminescence method with high sensitivity using dioxetane as a substrate. The one based on is often used. In addition to the chemiluminescence method, the luminescence method includes bioluminescence method.
A method of emitting light by a reaction of luciferin-firefly luciferase in the presence of TP has been performed.
【０００４】これらの方法のうち、非ＲＩ標識を用いた
遺伝子測定法においては、ＤＮＡを直接ナイロンメンブ
レン等の固相に吸着あるいは転写するか、あるいは酵素
処理や熱処理などで前処理した後、直接あるいはビオチ
ンなどの標識剤で標識して電気泳動を行い、次にナイロ
ンメンブレン等の固相に吸着あるいは転写し、固定す
る。次に検出したいＤＮＡ断片を、これと特異的に結合
する標識プローブや、予め試料の標識に用いたビオチン
などと特異的に結合するストレプトアビジン−酵素複合
体などと反応させ、その後の発光反応などにより検出す
る。Among these methods, in the gene measuring method using non-RI labeling, DNA is directly adsorbed or transferred onto a solid phase such as a nylon membrane, or pretreated by enzyme treatment or heat treatment and then directly treated. Alternatively, it is labeled with a labeling agent such as biotin and electrophoresed, then adsorbed or transferred to a solid phase such as a nylon membrane and fixed. Next, the DNA fragment to be detected is reacted with a labeled probe that specifically binds to it, a streptavidin-enzyme complex that specifically binds to biotin used for labeling the sample in advance, and the subsequent luminescence reaction, etc. To detect.
【０００５】そして、より正確な検出を行うためには、
非特異的な反応によるノイズを抑制する必要がある。す
なわち、このようなノイズは、固相化されたビオチン標
識体と特異的に結合するはずのストレプトアビジン等
が、非特異的に固相上に吸着するために生ずるものであ
り、このような非特異的な結合を防ぐためにブロッキン
グ操作が必要となる。And, in order to perform more accurate detection,
It is necessary to suppress noise due to non-specific reactions. That is, such noise is generated because streptavidin or the like, which should specifically bind to the immobilized biotin-labeled substance, is nonspecifically adsorbed on the solid phase. A blocking operation is required to prevent specific binding.
【０００６】ＡＬＰ標識ストレプトアビジンに代表され
る化学発光による検出系においては、かかる問題はＡＬ
Ｐ標識ストレプトアビジンとビオチンの反応を行う前
に、ブロッキング剤としてスキムミルク、牛血清アルブ
ミン、カゼイン、ゼラチン、サケ***ＤＮＡ、ドデシル
硫酸ナトリウムなどを含有する緩衝液で、固相を所定時
間浸漬又は所定回洗浄することにより解決することがで
きる（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ，１９８３，４０４５−４０４９）。し
かしながら、生物発光による検出系においては、従来化
学発光による検出系で汎用されているブロッキング剤で
は、固相側のビオチンとストレプトアビジン−酵素複合
体による特異反応以外の非特異反応の抑制が困難であっ
たり、ドデシル硫酸ナトリウムのように発光系の反応を
妨害するものがあるなどの問題もあった。In a chemiluminescence detection system represented by ALP-labeled streptavidin, such a problem is caused by AL.
Before the reaction between P-labeled streptavidin and biotin is performed, the solid phase is immersed in a buffer solution containing skim milk, bovine serum albumin, casein, gelatin, salmon sperm DNA, sodium dodecyl sulfate, etc. as a blocking agent for a predetermined time or a predetermined time. It can be solved by washing (Proceedings of the Nat
Ional Academy of Sciences
of the United States of
America, 1983, 4045-4049). However, in the bioluminescence detection system, it is difficult to suppress nonspecific reactions other than the specific reaction by biotin and streptavidin-enzyme complex on the solid phase side with the blocking agent which is generally used in the conventional chemiluminescence detection system. There are also problems, such as sodium dodecyl sulfate that interferes with the reaction of the luminescent system.
【０００７】さらに、従来行われている分析法のうち、
化学発光による方法は生物発光による方法より量子収率
が劣るという問題があり、また生物発光による検出で
は、ルシフェラーゼの熱安定性が悪く、かつ大量取得が
困難という問題があった。Further, among the conventional analysis methods,
The chemiluminescence method has a problem that the quantum yield is inferior to the bioluminescence method, and the bioluminescence detection has a problem that the thermostability of luciferase is poor and it is difficult to obtain a large amount.
【０００８】近年、遺伝子組替え技術により、従来品に
比べ耐熱性の向上したルシフェラーゼが使用できるよう
になり、これと酢酸キナーゼによるＡＴＰ産生系を組み
合わせたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光系が開発さ
れたが、この発光系においても非特異反応によるノイズ
が大きく、塩基配列解析の解像度が低いなどの問題が認
められた。[0008] In recent years, genetic recombination technology has made it possible to use luciferase with improved thermostability compared to conventional products, and a luciferin-luciferase luminescence system was developed by combining this with an ATP production system by acetate kinase. Even in the luminescence system, there were problems such as large noise due to non-specific reaction and low resolution of base sequence analysis.
【０００９】[0009]
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ビオチン標識体とストレプトアビジン等を反応させ
る際に生じる非特異的反応を抑制し、非特異的反応によ
るノイズが少なく、測定対象を高感度に検出することが
できる生体成分の測定法を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to suppress a non-specific reaction that occurs when a biotin-labeled substance is reacted with streptavidin, etc. An object of the present invention is to provide a method for measuring a biological component that can be detected with high sensitivity.
【００１０】[0010]
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意研究を行った結果、ビオチン標識体とス
トレプトアビジン等とを、ポリアニオンの存在下に反応
させれば、非特異的反応が抑制され、ノイズが低減さ
れ、測定対象を高感度に検出できることを見出し、本発
明を完成した。[Means for Solving the Problems] Under such circumstances, the present inventors have conducted diligent research and as a result, when a biotin-labeled substance and streptavidin etc. were reacted in the presence of a polyanion, a non-specific reaction was caused. The inventors have found that the object to be measured is suppressed, noise is reduced, and the object to be measured can be detected with high sensitivity, and the present invention has been completed.
【００１１】すなわち、本発明は、ビオチン標識体と、
アビジン、ストレプトアビジン、アビジン−酵素複合体
又はストレプトアビジン−酵素複合体とをポリアニオン
の存在下に反応させ、得られた複合体をさらに光学的手
段により検出することを特徴とする生体成分の測定法を
提供するものである。That is, the present invention comprises a biotin-labeled substance,
Avidin, streptavidin, avidin-enzyme complex or streptavidin-enzyme complex are reacted in the presence of a polyanion, and the resulting complex is further detected by optical means, a method for measuring a biological component. Is provided.
【００１２】また、本発明は、ポリアニオンを含有する
ことを特徴とするビオチン標識体と、アビジン、ストレ
プトアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトア
ビジン−酵素複合体との特異的反応における非特異的反
応を抑制する液を提供するものである。Further, the present invention provides a non-specific reaction in a specific reaction between a biotin-labeled product containing a polyanion and avidin, streptavidin, avidin-enzyme complex or streptavidin-enzyme complex. A liquid for suppressing the above is provided.
【００１３】本発明において、測定対象となる生体成分
とは、核酸（遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ）をいう。In the present invention, the biological component to be measured refers to nucleic acid (gene, DNA, RNA).
【００１４】なお、従来、ＲＩ標識を用いる測定におい
て、標識プローブが非特異的吸着をしないようにするた
め、標識プローブを固相上の測定対象物と反応させる前
段階で固相加熱処理液中に、ヘパリン等を添加する方法
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
９８４，５６２７−５６３８）が知られている。しかし
ながら、この方法において、非特異反応抑制のメカニズ
ムは、標識プローブとして用いる遺伝子断片に親和性を
有し、かつそれと複合体を形成して固相に非特異的に吸
着し易くする性質を有する試薬中の夾雑成分による影響
を、標識プローブを固相に加える前に予めヘパリンを加
えることにより取り除き、標識プローブとして用いる遺
伝子断片の固相への非特異吸着を抑制するというもので
ある。上述の原理は、検出を目的に用いた標識剤に対し
て特異的に結合するはずの酵素標識成分が、固相側に非
特異的に吸着することを抑制する本発明方法とは相違す
るものである。Conventionally, in the measurement using RI labeling, in order to prevent the non-specific adsorption of the labeled probe, the labeled probe is allowed to react with an object to be measured on the solid phase in the solid phase heat treatment liquid before the reaction. Method of adding heparin or the like (Nucleic Acids Research, 1
984, 5627-5638) is known. However, in this method, the mechanism of suppressing the non-specific reaction is a reagent having an affinity for a gene fragment used as a labeled probe and a property of facilitating non-specific adsorption to a solid phase by forming a complex with the gene fragment. Heparin is added in advance before adding the labeled probe to the solid phase to suppress the influence of impurities contained therein to suppress non-specific adsorption of the gene fragment used as the labeled probe to the solid phase. The above-mentioned principle is different from the method of the present invention in which an enzyme-labeled component that should specifically bind to a labeling agent used for the purpose of detection suppresses nonspecific adsorption on the solid phase side. Is.
【００１５】[0015]
【発明の実施の形態】本発明において、ビオチン標識体
としては、特に制限されないが、例えば目的とするＤＮ
Ａを通常の方法に従いＰＣＲ法等で増幅し、これにビオ
チンを標識し、固相に含有又は固定させたものを使用す
ることができる。ここで用いられる固相としては、特に
制限されないが、例えばナイロンメンブレン、ニトロセ
ルロースメンブレン、セルロースアセテートメンブレ
ン、ポリビニルピロリドンメンブレン等が挙げられる。
また、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビジン−
酵素複合体の酵素部分としては、例えばリン酸化酵素、
具体的には酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、クレア
チンキナーゼ等を用いることができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, the biotin-labeled product is not particularly limited.
A can be used by amplifying A by a PCR method or the like according to a usual method, labeling it with biotin, and containing or immobilizing it in a solid phase. The solid phase used here is not particularly limited, but examples thereof include nylon membrane, nitrocellulose membrane, cellulose acetate membrane, polyvinylpyrrolidone membrane, and the like.
In addition, avidin-enzyme complex or streptavidin-
Examples of the enzyme part of the enzyme complex include, for example, phosphorylase,
Specifically, acetate kinase, pyruvate kinase, creatine kinase and the like can be used.
【００１６】本発明においては、これらのビオチン標識
体と、アビジン、ストレプトアビジン、アビジン−酵素
複合体又はストレプトアビジン−酵素複合体との反応
を、ポリアニオンの存在下に行う。ここで用いられるポ
リアニオンとしては、多価の陰性荷電を有するものであ
ればいずれでも良く、例えばヘパリン、デキストラン硫
酸、リンタングステン酸などが好ましい。これらのポリ
アニオンは、溶媒に溶解したブロッキング液として用い
られ、溶媒としては、一般にはリン酸緩衝液、トリス緩
衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等の緩衝液が用いられる。これ
らの緩衝液には、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カ
リウム等の塩や、界面活性剤等を添加することもでき
る。溶液中のポリアニオンの濃度は特に制限されない
が、一般的には１０-7〜１０重量％が好ましく、特に１
０-7〜５重量％が好ましい。また、ブロッキング液のpH
は５〜１０が好ましく、特にpH６〜９が好ましい。In the present invention, these biotin-labeled compounds are reacted with avidin, streptavidin, avidin-enzyme complex or streptavidin-enzyme complex in the presence of polyanions. Any polyanion may be used as long as it has a polyvalent negative charge, and heparin, dextran sulfate, phosphotungstic acid and the like are preferable. These polyanions are used as a blocking solution dissolved in a solvent, and as the solvent, a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, or a GOOD buffer solution is generally used. If necessary, salts such as sodium chloride and potassium chloride, a surfactant and the like can be added to these buffer solutions. The concentration of the polyanion in the solution is not particularly limited, but is generally preferably 10 -7 to 10% by weight, and particularly 1
0 -7 to 5% by weight. Also, the pH of the blocking solution
5 to 10 is preferable, and pH 6 to 9 is particularly preferable.
【００１７】ブロッキング液には、本発明の効果を損わ
ない範囲において、ポリアニオン以外に、従来、固相と
検出系構成試薬との非特異反応を抑制するために非特異
反応抑制剤として使用されている公知の物質等を配合す
ることができる。かかる物質としては、例えば牛血清ア
ルブミン、カゼイン、スキムミルク等が挙げられる。こ
れらの成分の使用濃度も特に限定されるものではない
が、一般的には０．０５〜１０重量％が好ましい。In the blocking solution, in addition to the polyanion, conventionally, it is used as a non-specific reaction inhibitor in order to suppress the non-specific reaction between the solid phase and the detection system constituent reagent as long as the effect of the present invention is not impaired. Known substances can be added. Examples of such substances include bovine serum albumin, casein, skim milk and the like. The concentrations of these components used are not particularly limited, but generally, 0.05 to 10% by weight is preferable.
【００１８】ブロッキング操作は、例えばビオチン標識
体が固定された固相をブロッキング液に浸漬するか、又
はこれで洗浄することにより行われる。ブロッキング液
の使用量は固相が浸る量以上あればよく、浸漬処理時間
も特に制限はないが、一般には３０分〜１２０分が好ま
しい。また、洗浄回数も特に制限はないが、一般には２
〜５回が好ましい。The blocking operation is carried out, for example, by immersing the solid phase on which the biotin-labeled substance is immobilized in a blocking solution or washing with this. The amount of the blocking liquid used may be at least the amount by which the solid phase is immersed, and the immersion treatment time is not particularly limited, but generally 30 minutes to 120 minutes is preferable. The number of washings is not particularly limited, but generally 2
~ 5 times is preferred.
【００１９】本発明においては、次に、固相化されたビ
オチン標識体とストレプトアビジン等との反応により得
られた複合体をさらに、光学的手段により検出する。光
学的手段による検出法としては、通常行われるものであ
れば特に制限されないが、量子収率が高い生物発光法が
好ましく、特に検出系のＡＴＰ又はＡＴＰ産生系により
産するＡＴＰを用いる生物発光法が好ましい。ＡＴＰ産
生系としてはどのような系でもよいが、例えばリン酸化
酵素、具体的には酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、
クレアチンキナーゼ等を用いる系を使用することができ
る。ＡＴＰを用いる生物発光法としては、特に制限され
ないが、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系が好ましく、
通常の方法に従って検出を行えばよい。In the present invention, next, the complex obtained by the reaction between the solid-phased biotin-labeled substance and streptavidin is further detected by optical means. The detection method by optical means is not particularly limited as long as it is usually performed, but a bioluminescence method having a high quantum yield is preferable, and particularly, a bioluminescence method using ATP of a detection system or ATP produced by an ATP production system is used. Is preferred. Any system may be used as the ATP production system, for example, a phosphorylase, specifically, acetate kinase, pyruvate kinase,
A system using creatine kinase or the like can be used. The bioluminescence method using ATP is not particularly limited, but a luciferin-luciferase system is preferable,
The detection may be performed according to a usual method.
【００２０】[0020]
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明をさらに説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。Next, the present invention will be further described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００２１】実施例１ Ａ：試薬の調製 （１）ブロッキング液Ａの調製：カゼイン０．５％、ヘ
パリン０．０２％及び塩化カリウム０．４Ｍの濃度とな
るように、０．０５Ｍトリス緩衝液（pH８）に混和、溶
解し、ブロッキング液Ａとした。 （２）洗浄液Ａの調製：塩化カリウム０．４Ｍ、ヘパリ
ン０．０２％及びＴｗｅｅｎ２０ ０．３％の濃度とな
るように、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（pH８）に溶解
し、洗浄液Ａとした。 （３）洗浄液Ｂの調製：０．１mMジチオスレイトール及
び０．１mM ＥＤＴＡの濃度となるように、０．０５Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）に溶解し、洗浄液Ｂとし
た。 （４）固定液の調製：水酸化ナトリウム０．４Ｍの濃度
となるように、精製水に溶解し、固定液とした。 （５）ビオチン化酢酸キナーゼ・ストレプトアビジン複
合体の調製：ビオチン化酢酸キナーゼ３．７×１０-9Ｍ
を含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）と、スト
レプトアビジン２．１×１０-8Ｍを含む０．０５Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（pH７）を等量混合し、室温で３０分放
置して調製した。 （６）発光液の調製：ルシフェラーゼ０．７７mg／ml、
Ｄ−ルシフェリン０．３５mM、ＡＤＰ１２．５μＭ、ア
セチルリン酸２．５mM及び硫酸マグネシウム３０mMを、
５０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）に溶解し、発光液と
した。Example 1 A: Preparation of Reagents (1) Preparation of Blocking Solution A: 0.05M Tris buffer so that the concentrations of casein 0.5%, heparin 0.02% and potassium chloride 0.4M. It was mixed with (pH 8) and dissolved to obtain blocking solution A. (2) Preparation of Wash Solution A: Wash Solution A was dissolved in 0.05 M Tris buffer solution (pH 8) so that the concentrations of potassium chloride 0.4 M, heparin 0.02% and Tween 20 0.3% were obtained. (3) Preparation of washing solution B: 0.05 M so that the concentration of 0.1 mM dithiothreitol and 0.1 mM EDTA may be adjusted.
It was dissolved in a HEPES buffer solution (pH 7) and used as a washing solution B. (4) Preparation of fixative solution: The fixative solution was dissolved in purified water to a concentration of 0.4 M sodium hydroxide. (5) Preparation of Biotinylated Acetate Kinase / Streptavidin Complex: Biotinylated Acetate Kinase 3.7 × 10 −9 M
Containing 0.05M HEPES buffer (pH 7) and streptavidin 2.1 × 10 −8 M containing 0.05MH
EPES buffer solution (pH 7) was mixed in equal amounts and left at room temperature for 30 minutes for preparation. (6) Preparation of luminescent solution: luciferase 0.77 mg / ml,
D-luciferin 0.35 mM, ADP 12.5 μM, acetyl phosphate 2.5 mM and magnesium sulfate 30 mM,
It was dissolved in 50 mM HEPES buffer (pH 7) to give a luminescent solution.
【００２２】Ｂ：ＤＮＡの検出 （１）ＤＮＡ抽出：大腸腺腫患者より正常大腸粘膜組織
を採取し、プロテアーゼＫ及びフェノールを用いる方法
により、高分子ＤＮＡを抽出した。 （２）目的遺伝子の増幅：大腸腺腫発生に関与するＡＰ
Ｃ遺伝子のうち変異の起こりやすい部位を含む領域をＰ
ＣＲ法により増幅した。 （３）ＤＮＡシークエンシング操作、電気泳動：ＰＣＲ
産物を鋳型ＤＮＡとしてビオチン化プライマーを用いて
サイクル・シークエンシングを行った。次に、サイクル
・シークエンシング産物を６％変性ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動し、泳動後、ナイロンメンブレンへ転写
した。 （４）固定化：ナイロンメンブレンを室温で２０分間固
定液に浸したのち、室温で１０分間乾燥させ固定化し
た。 （５）ブロッキング：ブロッキング液Ａにナイロンメン
ブレンを室温で３０分間浸し、ブロッキングを行った。 （６）ビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトアビジン
複合体の結合反応：ナイロンメンブレンを浸しているブ
ロッキング液１００mlに、ビオチン標識酢酸キナーゼ・
ストレプトアビジン複合体液２５０μｌを加える。室温
で３０分間反応させ、ナイロンメンブレン上のビオチン
とストレプトアビジンを結合させた。 （７）余剰なビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトア
ビジン複合体の洗浄：ナイロンメンブレンを洗浄液に浸
し、過剰なビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトアビ
ジン複合体を除去した。洗浄は洗浄液Ａで液を交換して
４回行った後、洗浄液Ｂで１回行った。各回とも室温、
１回当り５分間とした。 （８）発光反応：ナイロンメンブレン上の余分な洗浄液
を取り除いたあと、ナイロンメンブレンを発光液に浸し
た。次に余分な発光液を除き、暗所にてＸ線フィルムに
１５分露光後現像した。B: Detection of DNA (1) DNA extraction: Normal colorectal mucosal tissue was collected from a patient with colorectal adenoma, and high molecular weight DNA was extracted by the method using protease K and phenol. (2) Amplification of target gene: AP involved in colorectal adenoma development
The region of the C gene containing the site where mutation is likely to occur is P
It was amplified by the CR method. (3) DNA sequencing operation, electrophoresis: PCR
The product was subjected to cycle sequencing using a biotinylated primer as a template DNA. Next, the cycle-sequencing product was electrophoresed on a 6% denaturing polyacrylamide gel, electrophoresed, and then transferred to a nylon membrane. (4) Immobilization: The nylon membrane was immersed in a fixative solution at room temperature for 20 minutes and then dried at room temperature for 10 minutes to be immobilized. (5) Blocking: A nylon membrane was immersed in the blocking solution A at room temperature for 30 minutes for blocking. (6) Binding reaction of biotin-labeled acetate kinase / streptavidin complex: Biotin-labeled acetate kinase / 100 ml of blocking solution in which nylon membrane was immersed
Add 250 μl of streptavidin complex solution. The reaction was carried out at room temperature for 30 minutes to bind biotin and streptavidin on the nylon membrane. (7) Washing of excess biotin-labeled acetate kinase / streptavidin complex: Nylon membrane was immersed in a washing solution to remove excess biotin-labeled acetate kinase / streptavidin complex. The washing was carried out 4 times by exchanging the solution with the washing solution A and then once with the washing solution B. Room temperature,
Each time was 5 minutes. (8) Luminescence reaction: After removing the excess washing solution on the nylon membrane, the nylon membrane was immersed in the luminescence solution. Then, the excess luminescent liquid was removed, and the X-ray film was exposed in the dark for 15 minutes and then developed.
【００２３】実施例２ （１）ブロッキング液Ｂの調製：カゼイン０．５％、デ
キストラン硫酸０．０１％及び塩化カリウム０．４Ｍの
濃度となるように、０．０５Ｍトリス緩衝液（pH８）に
混和、溶解し、ブロッキング液Ｂとした。 （２）ブロッキング液Ａの代わりにブロッキング液Ｂを
用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡの検出を行
った。Example 2 (1) Preparation of blocking solution B: 0.05M Tris buffer solution (pH 8) so that the concentrations of casein 0.5%, dextran sulfate 0.01% and potassium chloride 0.4M were obtained. It was mixed and dissolved to obtain blocking solution B. (2) DNA was detected in the same manner as in Example 1 except that blocking solution B was used instead of blocking solution A.
【００２４】比較例１ （１）ブロッキング液ａの調製：カゼイン０．５％及び
塩化カリウム０．４Ｍの濃度となるように、０．０５Ｍ
トリス緩衝液（pH８）に混和、溶解し、ブロッキング液
ａとした。 （２）ブロッキング液Ａの代わりにブロッキング液ａを
用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡの検出を行
った。Comparative Example 1 (1) Preparation of blocking solution a: 0.05M so that the concentration of casein was 0.5% and potassium chloride was 0.4M.
It was mixed with Tris buffer (pH 8) and dissolved to obtain blocking solution a. (2) DNA was detected in the same manner as in Example 1 except that the blocking solution a was used instead of the blocking solution A.
【００２５】試験例１ 実施例１、２及び比較例１で得られたＤＮＡ検出の結果
を比較した。すなわち、発光反応の結果より、分析に供
したＤＮＡの配列中、解析できた核酸の個数を求めた。
結果を表１に示す。Test Example 1 The results of DNA detection obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 were compared. That is, from the result of the luminescence reaction, the number of nucleic acids that could be analyzed in the sequence of DNA used for analysis was determined.
The results are shown in Table 1.
【００２６】[0026]
【表１】 解析できた 核酸の数 実施例１（ブロッキング液Ａ：ヘパリン含有） ５０塩基 実施例２（ブロッキング液Ｂ：デキストラン硫酸含有） ５０塩基 比較例１（ブロッキング液ａ） ０塩基 [Table 1] Number of nucleic acids that could be analyzed Example 1 (blocking solution A: containing heparin) 50 bases Example 2 (blocking solution B: containing dextran sulfate) 50 bases Comparative Example 1 (blocking solution a) 0 bases
【００２７】表１の結果より、比較例では何れも、非特
異反応によるノイズが認められ、結果として解像能の低
下を来しているのに対し、ポリアニオンを用いた本発明
の実施例では高い解像度を示し、本発明で用いるブロッ
キング液が、きわめて良好な非特異反応抑制効果を有す
ることが認められた。From the results shown in Table 1, in each of the comparative examples, noise due to the non-specific reaction was observed, and as a result, the resolution was lowered, whereas in the examples of the present invention using polyanions, It was confirmed that the blocking solution used in the present invention showed a high resolution and had a very good non-specific reaction suppressing effect.
【００２８】[0028]
【発明の効果】本発明によれば、ビオチン標識体とスト
レプトアビジン−酵素複合体を反応させる際に生じる非
特異的反応が抑制され、この非特異的反応によるノイズ
が低減され、高い解像度が得られる。従って、放射性物
質を使用することなく、安全で高感度にしかも安価に生
体成分を検出することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a nonspecific reaction that occurs when a biotin-labeled substance is reacted with a streptavidin-enzyme complex is suppressed, noise due to this nonspecific reaction is reduced, and high resolution is obtained. To be Therefore, a biological component can be detected safely, with high sensitivity, and at low cost without using a radioactive substance.
Claims (8)
トアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビ
ジン−酵素複合体とをポリアニオンの存在下に反応さ
せ、得られた複合体をさらに光学的手段により検出する
ことを特徴とする生体成分の測定法。1. A biotin-labeled substance is reacted with avidin, streptavidin, an avidin-enzyme complex or a streptavidin-enzyme complex in the presence of a polyanion, and the resulting complex is further detected by optical means. A method for measuring a biological component, which is characterized in that
ン硫酸又はリンタングステン酸である請求項１記載の測
定法。2. The method according to claim 1, wherein the polyanion is heparin, dextran sulfate or phosphotungstic acid.
ＴＰ又はＡＴＰ産生系により産するＡＴＰを用いる生物
発光法である請求項１又は２記載の測定法。3. The detection method by optical means is the detection system A
The method according to claim 1 or 2, which is a bioluminescence method using ATP produced by a TP or ATP production system.
ものである請求項３記載の測定法。4. The measuring method according to claim 3, wherein the ATP production system uses a phosphorylating enzyme.
ン酸キナーゼ又はクレアチンキナーゼである請求項４記
載の測定法。5. The method according to claim 4, wherein the phosphorylating enzyme is acetate kinase, pyruvate kinase or creatine kinase.
リン−ルシフェラーゼ系である請求項３記載の測定法。6. The method according to claim 3, wherein the bioluminescence method using ATP is a luciferin-luciferase system.
る固相化されたビオチン標識体と、アビジン、ストレプ
トアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビ
ジン−酵素複合体との特異的反応における非特異的反応
を抑制する液。7. A non-specific in a specific reaction between a solid-phased biotin-labeled body containing a polyanion and avidin, streptavidin, an avidin-enzyme complex or a streptavidin-enzyme complex. Liquid that suppresses the reaction.
ン硫酸又はリンタングステン酸である請求項７記載の
液。8. The liquid according to claim 7, wherein the polyanion is heparin, dextran sulfate or phosphotungstic acid.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9105496A JPH09275996A (en) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | Assay of biocomponent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9105496A JPH09275996A (en) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | Assay of biocomponent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09275996A true JPH09275996A (en) | 1997-10-28 |
Family
ID=14015800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9105496A Pending JPH09275996A (en) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | Assay of biocomponent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09275996A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013152247A (en) * | 2013-04-12 | 2013-08-08 | Abbott Japan Co Ltd | Nonspecific interaction inhibitor and application of the same to diagnostic measuring system |
| CN116930513A (en) * | 2023-09-19 | 2023-10-24 | 北京索莱宝科技有限公司 | Protein-free rapid blocking liquid for protein detection and application thereof |
-
1996
- 1996-04-12 JP JP9105496A patent/JPH09275996A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013152247A (en) * | 2013-04-12 | 2013-08-08 | Abbott Japan Co Ltd | Nonspecific interaction inhibitor and application of the same to diagnostic measuring system |
| CN116930513A (en) * | 2023-09-19 | 2023-10-24 | 北京索莱宝科技有限公司 | Protein-free rapid blocking liquid for protein detection and application thereof |
| CN116930513B (en) * | 2023-09-19 | 2023-11-17 | 北京索莱宝科技有限公司 | Protein-free rapid blocking liquid for protein detection and application thereof |
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