JPH09176048A - Production of human mip-1alpha/pantes receptor protein and use thereof - Google Patents
Production of human mip-1alpha/pantes receptor protein and use thereofInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトMIP-1α/RANT
ES受容体タンパク質、該ヒトMIP-1α/RANTES受容体タン
パク質を発現するCHO細胞、またはその細胞膜画分を用
いるMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩の
スクリーニング方法および該スクリーニング用キットに
関する。また、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を
生産し続ける能力を有するCHO細胞、その細胞膜画分、
該CHO細胞またはその細胞膜画分から単離されるヒトMIP
-1α/RANTES受容体タンパク質およびその部分ペプチド
またはそれらの塩に関する。さらに、上記スクリーニン
グ方法あるいは上記スクリーニング用キットを用いて得
られるヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはそ
の塩、および該化合物を含有する医薬に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to human MIP-1α / RANT
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a screening method for a MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof using an ES receptor protein, a CHO cell expressing the human MIP-1α / RANTES receptor protein, or a cell membrane fraction thereof, and the screening kit. . In addition, CHO cells capable of continuously producing human MIP-1α / RANTES receptor protein, cell membrane fraction thereof,
Human MIP isolated from the CHO cells or cell membrane fraction thereof
-1α / RANTES receptor protein and partial peptides thereof or salts thereof. Further, the present invention relates to a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof obtained by using the above screening method or the above screening kit, and a medicine containing the compound.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ケモカイン（chemokine, chemotactic c
ytokineの略）は白血球に対する遊走活性を有する一群
のタンパク質である（Critical Reviews in Immunology
12: 17 - 46 (1992); Current Opinion in Immunology
6: 865 - 873 (1994)）。近年ケモカインが炎症の急性
期および慢性期においてその病態の発症、進展、および
増悪に関与していることが明らかにされつつある。ケモ
カインはいずれも４個のシステインをもち、１番目と２
番目のシステインの間に１個のアミノ酸が挿入されたCX
Cケモカインサブファミリー（αケモカインサブファミ
リー）と１番目と２番目のシステインが隣接したCCケモ
カインサブファミリー（βケモカインサブファミリー）
に分かれる。CCケモカインサブファミリーにはRANTES(r
egulated on activation, normal T expressed and sec
reted)、MIP-1α(macrophage inflammatory protein 1
α)、MIP-1β、MCP-1 (monocyte chemoattractant prot
ein 1)、MCP-2、MCP-3、I-309などがある。CCケモカイ
ンは単球、リンパ球、好酸球、好塩基球、肥満細胞に作
用してこれらの細胞を遊走させ、また脱顆粒や種々の炎
症性メディエーターの放出などの作用をもつ。2. Description of the Related Art Chemokine, chemotactic c
(abbreviation of ytokine) is a group of proteins with chemotactic activity for leukocytes (Critical Reviews in Immunology
12: 17-46 (1992); Current Opinion in Immunology
6: 865-873 (1994)). Recently, it has been revealed that chemokines are involved in the onset, progress, and exacerbation of the pathological conditions in the acute and chronic stages of inflammation. Each chemokine has four cysteines, the first and second
CX with one amino acid inserted between the second cysteine
C chemokine subfamily (α chemokine subfamily) and CC chemokine subfamily (β chemokine subfamily) in which the first and second cysteines are adjacent
Divided into CC chemokine subfamily includes RANTES (r
egulated on activation, normal T expressed and sec
reted), MIP-1α (macrophage inflammatory protein 1
α), MIP-1β, MCP-1 (monocyte chemoattractant prot
ein 1), MCP-2, MCP-3, I-309, etc. CC chemokines act on monocytes, lymphocytes, eosinophils, basophils, and mast cells to migrate these cells, and also have actions such as degranulation and release of various inflammatory mediators.
【０００３】MIP-1αおよびRANTESに高親和性のヒトMIP
-1α/RANTES受容体（CC CKR-1と略称されることもあ
る）の構造は1993年に報告され、Gタンパクに共役した
７回膜貫通型のレセプターであることがわかった（Cell
72: 415 - 425 (1993); J. Exp. Med. 177: 1421 - 14
27 (1993)）。慢性関節リウマチ患者滑膜組織でRANTES
およびMIP-1α/RANTES受容体のmRNAの発現量が亢進して
いることが観察され（Lancet 343: 547 - 548 (199
4)）、また心臓移植後の心血管の内膜肥厚部位でRANTES
のmRNAの発現量が亢進したので（Circulation 82: III-
699 (1990)）、該疾患にRANTESが関与することが示唆さ
れる。さらに、腎移植拒絶時に移植部位でRANTES mRNA
の発現およびRANTESタンパク量が増加した（Lancet 34
3: 209 - 211 (1994)）ので、臓器移植拒絶にRANTESが
関与すると考えられる。また、リウマチ患者滑液中にMI
P-1αタンパクが増加することが報告され（J. Clin. In
vest. 93:921 - 928 (1994)）、マウスコラーゲン関節
炎実験において抗MIP-1α抗体の投与が関節炎の発症を
遅らせ、さらに症状を緩和させた（J. Clin. Invest.9
5: 2868 - 2876 (1995)）。抗MIP-1α抗体の投与はマウ
ス実験的自己免疫性脳脊髄炎（マウス実験的アレルギー
性脳脊髄炎）にも有効であった（J. Immunol. 155: 500
3 - 5010 (1995)）。したがって、MIP-1αも慢性関節リ
ウマチの発症に関与し、またMIP-1αは多発性硬化症に
も関与すると推察される。Human MIP with high affinity for MIP-1α and RANTES
The structure of the -1α / RANTES receptor (sometimes abbreviated as CC CKR-1) was reported in 1993 and was found to be a G protein-coupled seven-transmembrane receptor (Cell
72: 415-425 (1993); J. Exp. Med. 177: 1421-14
27 (1993)). RANTES in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis
And MIP-1α / RANTES receptor mRNA expression levels were increased (Lancet 343: 547-548 (199
4)), and RANTES at the intimal thickening site of the cardiovascular after heart transplantation.
Expression level was increased (Circulation 82: III-
699 (1990)), suggesting that RANTES is involved in the disease. Furthermore, at the time of renal transplant rejection, RANTES mRNA
Expression and RANTES protein level increased (Lancet 34
3: 209-211 (1994)), so it is considered that RANTES is involved in organ transplant rejection. In addition, MI in rheumatoid patients' synovial fluid
Increased P-1α protein was reported (J. Clin. In
vest. 93: 921 -928 (1994)), administration of anti-MIP-1α antibody delayed the onset of arthritis and further alleviated the symptoms in a mouse collagen arthritis experiment (J. Clin. Invest. 9).
5: 2868-2876 (1995)). The administration of anti-MIP-1α antibody was also effective in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice (mouse experimental allergic encephalomyelitis) (J. Immunol. 155: 500).
3-5010 (1995)). Therefore, it is speculated that MIP-1α is also involved in the onset of rheumatoid arthritis, and MIP-1α is also involved in multiple sclerosis.
【０００４】好酸球、好塩基球および肥満細胞は炎症部
位への集積、活性化によってアレルギー性疾患の発症、
進展、および増悪に関わる。RANTESは好酸球の遊走因子
でもあり （J. Immunol. 176: 587 (1992); J. Immuno
l. 176: 1489 (1992)）、ヒトにRANTESを皮内注射する
と単核球と好酸球の浸潤がみられた（FASEB J. 9: A804
(1995)）。以上のことから、これらのCCケモカインの作
用を阻害するアンタゴニストは、慢性関節リウマチ、動
脈硬化、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、多発性硬化
症、腎炎などの予防・治療につながると考えられる。さ
らに、CCケモカインの受容体に対するアゴニストは単球
などの白血球の機能を亢進させるので、抗腫瘍能などを
増進させることが予想される。しかしながら、まだかか
るアンタゴニストやアゴニストの報告はない。受容体の
アンタゴニストやアゴニストは、受容体に特異的に結合
する親和性の高い化合物を探索することによって発見で
きる。ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するアンタゴニス
トやアゴニストを見出すことを目的として、該受容体に
結合する親和性の高い化合物を探索するためには、該受
容体を安定に発現する細胞が必須である。[0004] Eosinophils, basophils and mast cells accumulate allergic diseases at the sites of inflammation and activate allergic diseases,
Involved in progress and exacerbation. RANTES is also a migration factor for eosinophils (J. Immunol. 176: 587 (1992); J. Immunol.
l. 176: 1489 (1992)), intracutaneous injection of RANTES into humans revealed infiltration of mononuclear cells and eosinophils (FASEB J. 9: A804.
(1995)). From the above, it is considered that these antagonists that inhibit the action of CC chemokines will lead to the prevention / treatment of rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, bronchial asthma, atopic dermatitis, multiple sclerosis, nephritis and the like. Furthermore, an agonist for the CC chemokine receptor enhances the functions of leukocytes such as monocytes, and is therefore expected to enhance antitumor activity and the like. However, there are no reports of such antagonists or agonists. Receptor antagonists and agonists can be found by searching for compounds with high affinity that specifically bind to the receptor. In order to find an antagonist or agonist for the human MIP-1α / RANTES receptor, in order to search for a compound having a high affinity that binds to the receptor, a cell that stably expresses the receptor is essential. .
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】実用的なヒトMIP-1α/
RANTES受容体タンパク質の製造法およびヒトMIP-1α/RA
NTES受容体高親和性化合物のスクリーニング法を提供す
る。[Problems to be Solved by the Invention] Practical human MIP-1α /
Method for producing RANTES receptor protein and human MIP-1α / RA
Provided is a screening method for compounds with high affinity for NTES receptor.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトMIP-
1α/RANTES受容体タンパク質をコードするDNAをCHO細胞
に導入し、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を高発
現するCHO細胞株を製造することに成功した。さらに本
発明者らは、該CHO細胞株を用いることにより、効率よ
くヒトMIP-1α/RANTES受容体高親和性化合物またはその
塩のスクリーニングを行うことができることを見出し、
鋭意研究を進めて本発明を完成するに至った。[Means for Solving the Problems] The present inventors have found that human MIP-
We succeeded in producing a CHO cell line that highly expresses human MIP-1α / RANTES receptor protein by introducing DNA encoding 1α / RANTES receptor protein into CHO cells. Furthermore, the present inventors have found that by using the CHO cell line, it is possible to efficiently screen a compound having a high affinity for human MIP-1α / RANTES receptor or a salt thereof,
Through intensive research, the present invention has been completed.
【０００７】すなわち本発明は、 （１）ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩と被験化合物とを接触させる
ことを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合
物またはその塩のスクリーニング方法、 （２）ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有する
CHO細胞または該細胞膜画分と被験化合物とを接触させ
ることを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化
合物またはその塩のスクリーニング方法、 （３）ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする
ヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩の
スクリーニング用キット、 （４）ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有する
CHO細胞または細胞膜画分を含むことを特徴とするヒトM
IP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩のスク
リーニング用キット、 （５）ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質をコードす
るDNAを保持することを特徴とするpCCRで標示される発
現ベクター、 （６）ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質をコードす
るDNAが配列番号：１で表される塩基配列を含有するDNA
である第（５）項記載の発現ベクター、 （７）第（５）項記載の発現ベクターを含有することを
特徴とするCHO細胞、 （８）第（７）項記載のCHO細胞がCHO/CCRで標示される
CHO細胞、 （９）第（７）項記載のCHO細胞から得られるヒトMIP-1
α/RANTES受容体タンパク質を含有する細胞膜画分、 （１０）第（７）項記載のCHO細胞を、ヒトMIP-1α/RAN
TES受容体タンパク質の発現可能な条件下で培養するこ
とを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質の
製造法、 （１１）第（７）項記載のCHO細胞または第（１０）項
記載の細胞膜画分から単離されることを特徴とするヒト
MIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩、 （１２）第（１）項または第（２）項記載のスクリーニ
ング方法によって得られるヒトMIP-1α/RANTES受容体親
和性化合物またはその塩、 （１３）第（３）項または第（４）項記載のスクリーニ
ング用キットを用いて得られるヒトMIP-1α/RANTES受容
体親和性化合物またはその塩、 （１４）ヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物がヒト
MIP-1α/RANTES受容体アンタゴニストである第（１２）
項または第（１３）項記載のヒトMIP-1α/RANTES受容体
親和性化合物またはその塩、 （１５）ヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物がヒト
MIP-1α/RANTES受容体アゴニストである第（１２）項ま
たは第（１３）項記載のヒトMIP-1α/RANTES受容体親和
性化合物またはその塩、 （１６）第（１４）項記載のアンタゴニストあるいは第
（１５）項記載のアゴニストを含有することを特徴とす
る医薬、および、 （１７）ウイルス性疾患、感染性疾患、腫瘍、アレルギ
ー性疾患、炎症性疾患、糖尿病性疾患、中枢性疾患、高
脂血症、高コレステロール血症、透析による血小板減少
症、脊髄損傷、骨粗鬆症、潰瘍性大腸炎、消化性潰瘍、
敗血症ショック、肺・心臓における再潅流障害、不安定
狭心症、一過性脳虚血発作、心弁膜症、臓器移植後拒絶
反応、血管形成術後再狭窄、全身性エリテマトーデス、
多発性硬化症、腎不全、子宮内膜症、肺線維症、成人呼
吸逼迫症候群の予防・治療剤である第（１６）項記載の
医薬に関する。That is, the present invention provides (1) human MIP-1α / RANTES receptor affinity, which is characterized in that a test compound is contacted with a human MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof. Method for screening compound or salt thereof (2) Containing human MIP-1α / RANTES receptor protein
A method for screening a compound having affinity for human MIP-1α / RANTES receptor or a salt thereof, which comprises contacting a test compound with CHO cells or the cell membrane fraction, (3) human MIP-1α / RANTES receptor protein, A kit for screening a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof, which contains a partial peptide or a salt thereof, (4) contains a human MIP-1α / RANTES receptor protein
Human M characterized by containing CHO cells or cell membrane fraction
A kit for screening an IP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof, (5) an expression vector labeled with pCCR, which holds a DNA encoding a human MIP-1α / RANTES receptor protein, (6) The DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Which is a CHO cell characterized by containing the expression vector according to item (5), (7) the expression vector according to item (5), and (8) the CHO cell according to item (7) is CHO / Marked with CCR
CHO cells, (9) Human MIP-1 obtained from the CHO cells according to (7)
Cell membrane fraction containing α / RANTES receptor protein, (10) The CHO cells described in (7) above are transformed into human MIP-1α / RAN
A method for producing a human MIP-1α / RANTES receptor protein, which comprises culturing under conditions capable of expressing a TES receptor protein, (11) CHO cells according to (7) or (10) above Characterized by being isolated from the cell membrane fraction of
MIP-1α / RANTES receptor protein, partial peptides thereof or salts thereof, (12) human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound obtained by the screening method according to item (1) or (2), or A salt thereof, (13) a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof obtained by using the screening kit according to (3) or (4), (14) human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound is human
The MIP-1α / RANTES receptor antagonist (12)
Or the salt of the human MIP-1α / RANTES receptor-affinity compound according to item (13), or (15) the human MIP-1α / RANTES receptor-affinity compound is human.
The human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof according to item (12) or (13), which is a MIP-1α / RANTES receptor agonist, (16) the antagonist according to item (14), or (15) A pharmaceutical comprising the agonist according to (15), and (17) a viral disease, an infectious disease, a tumor, an allergic disease, an inflammatory disease, a diabetic disease, a central disease, and a high Lipemia, hypercholesterolemia, thrombocytopenia due to dialysis, spinal cord injury, osteoporosis, ulcerative colitis, peptic ulcer,
Septic shock, lung / heart reperfusion injury, unstable angina, transient cerebral ischemic attack, valvular heart disease, rejection after organ transplantation, restenosis after angioplasty, systemic lupus erythematosus,
The pharmaceutical according to item (16), which is a prophylactic / therapeutic agent for multiple sclerosis, renal failure, endometriosis, pulmonary fibrosis, and adult respiratory distress syndrome.
【０００８】より具体的には本発明は、 （１８）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガ
ンドを第（１１）項記載のヒトMIP-1α/RANTES受容体タ
ンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触さ
せた場合と、（ii）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する
リガンドおよび被験化合物を同時に第（１１）項記載の
ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分ペプチ
ドまたはそれらの塩に接触させた場合との比較を行うこ
とを特徴とする第（１）項記載のヒトMIP-1α/RANTES受
容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、 （１９）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する標識
したリガンドを第（１１）項記載のヒトMIP-1α/RANTES
受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
に接触させた場合と、（ii）ヒトMIP-1α/RANTES受容体
に対する標識したリガンドおよび被験化合物を同時に第
（１１）項記載のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場
合の該ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩に対する標識したリガンドの
結合量を比較することを特徴とする第（１）項記載のヒ
トMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩のス
クリーニング方法、 （２０）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガ
ンドを第（７）項記載のCHO細胞または第（９）項記載
の細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）ヒトMIP-1α/
RANTES受容体に対するリガンドおよび被験化合物を同時
に第（７）項記載のCHO細胞または第（９）項記載の細
胞膜画分に接触させた場合との比較を行うことを特徴と
する第（２）項記載のヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性
化合物またはその塩のスクリーニング方法、 （２１）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する標識
したリガンドを第（７）項記載のCHO細胞または第
（９）項記載の細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）
ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する標識したリガンドお
よび被験化合物を同時に第（７）項記載のCHO細胞また
は第（９）項記載の細胞膜画分に接触させた場合の、該
CHO細胞または該細胞膜画分に対する標識したリガンド
の結合量を比較することを特徴とする第（２）項記載の
ヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩の
スクリーニング方法、 （２２）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガ
ンドを第（７）項記載のCHO細胞または第（９）項記載
の細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）ヒトMIP-1α/
RANTES受容体に対するリガンドおよび被験化合物を同時
に第（７）項記載のCHO細胞または第（９）項記載の細
胞膜画分に接触させた場合の、ヒトMIP-1α/RANTES受容
体を介した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内Ca2+
濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イノシトールリン
脂質の産生、アラキドン酸の遊離、ヒスタミンなどの炎
症性メディエーターの遊離、脱顆粒、細胞膜電位の変
動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細胞内タンパク質
の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内タンパク質のリ
ン酸化などを促進あるいは抑制する活性など）を測定比
較することを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体アン
タゴニストのスクリーニング方法、More specifically, the present invention provides (18) (i) a ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor, which is the human MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof, or When contacted with those salts, (ii) the ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor and the test compound are simultaneously given, and the human MIP-1α / RANTES receptor protein, its partial peptide, or those described in (11). And a method for screening a human MIP-1α / RANTES receptor-affinitive compound or a salt thereof according to item (1), which is characterized in that it is compared with the case of contact with a salt of (19) (i) human MIP. The labeled ligand for the -1α / RANTES receptor is the human MIP-1α / RANTES according to item (11).
The human MIP-1α / described in (11), wherein the receptor protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof is contacted, and (ii) the labeled ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor and the test compound are simultaneously administered. Comparing the amount of labeled ligand bound to the human MIP-1α / RANTES receptor protein, its partial peptide or salts thereof when contacted with RANTES receptor protein, its partial peptide or salts thereof A method for screening a compound or a salt thereof having affinity for the human MIP-1α / RANTES receptor according to item (1), (20) (i) a ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor according to item (7). When contacted with CHO cells or the cell membrane fraction described in (9), (ii) human MIP-1α /
Paragraph (2), wherein the ligand for the RANTES receptor and the test compound are simultaneously contacted with the CHO cells described in (7) or the cell membrane fraction described in (9). A method for screening a compound having affinity for the human MIP-1α / RANTES receptor or a salt thereof according to (21) (i) a labeled ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor, the CHO cell according to (7) or (9) when contacted with the cell membrane fraction described in (9),
When the labeled ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor and the test compound are simultaneously contacted with the CHO cell described in (7) or the cell membrane fraction described in (9),
(2) A method for screening a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof according to item (2), characterized in that the amount of labeled ligand bound to CHO cells or the cell membrane fraction is compared. (I) when a ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor is contacted with the CHO cells described in (7) or the cell membrane fraction described in (9), and (ii) human MIP-1α /
Human MIP-1α / RANTES receptor-mediated cell stimulation when a ligand for RANTES receptor and a test compound are simultaneously contacted with the CHO cells described in (7) or the cell membrane fraction described in (9) Activity (eg cell migration, intracellular Ca 2+
Concentration change, G protein activation, inositol phospholipid production, arachidonic acid release, inflammatory mediator release such as histamine, degranulation, cell membrane potential change, pH change, membrane protein or intracellular protein activity Method, a method for screening a human MIP-1α / RANTES receptor antagonist, characterized in that
【０００９】（２３）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対す
るリガンドを第（７）項記載のCHO細胞または第（９）
項記載の細胞膜画分に接触させた場合の、ヒトMIP-1α/
RANTES受容体を介した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、
細胞内Ca2+濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イノシ
トールリン脂質の産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生
成、ヒスタミンなどの炎症性メディエーターの遊離、脱
顆粒、細胞膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク質ある
いは細胞内タンパク質の活性化、膜タンパク質あるいは
細胞内タンパク質のリン酸化などを促進あるいは抑制す
る活性など）を測定することを特徴とするヒトMIP-1α/
RANTES受容体アゴニストのスクリーニング方法、および （２４）ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質が、配列
番号：２で表されるアミノ酸配列、配列番号：２で表さ
れるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠
失したアミノ酸配列、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列に１または２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸
配列、または配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の
１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され
たアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれらのタ
ンパク質の分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基（例
えばホルミル基、アセチル基などのアシル基など）で保
護されているタンパク質、もしくはそれらのタンパク質
に糖鎖などが結合しているタンパク質である第（１１）
項記載のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩を提供する。(23) A ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor is used as a CHO cell or (9) according to item (7).
Human MIP-1α / when contacted with the cell membrane fraction
RANTES receptor-mediated cell stimulatory activity (eg cell migration,
Fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, activation of G protein, production of inositol phospholipid, release of arachidonic acid, production of cAMP, release of inflammatory mediators such as histamine, degranulation, fluctuation of cell membrane potential, fluctuation of pH , MIP-1α /, the activity of activating membrane proteins or intracellular proteins, and promoting or suppressing the phosphorylation of membrane proteins or intracellular proteins)
Method for screening RANTES receptor agonist, and (24) human MIP-1α / RANTES receptor protein having 1 or 2 amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 The amino acid sequence in which the above amino acids are deleted, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 by adding 1 or 2 or more amino acids, or 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Proteins with amino acid sequences in which one or more amino acids have been replaced with other amino acids, or the side chains of amino acids in the molecules of these proteins are protected by appropriate protecting groups (eg, formyl group, acyl group such as acetyl group, etc.) (11) which is a protein that has been modified, or a protein in which sugar chains are bound to these proteins
The human MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof is provided.
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】本発明において、ヒトMIP-1α/RA
NTES受容体タンパク質をコードするDNAを保持する発現
ベクターを作製する場合、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タ
ンパク質をコードするDNAとしては、例えばヒトMIP-1α
/RANTES受容体タンパク質をコードするcDNAやゲノムDNA
などが用いられているが、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タ
ンパク質またはヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質と
実質的に同等のリガンド結合活性を有する部分ペプチド
をコードする塩基配列を有するものであれば、必ずしも
これに制約されるものではない。例えば公知のヒトMIP-
1α/RANTES受容体タンパク質をコードするcDNAやゲノム
DNAなどを用いることができるが、合成DNAなどであって
もよい。具体的には、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質をコ
ードするDNAが挙げられ、例えば配列番号：１で表され
る塩基配列を有するDNA〔図１〕などが用いられる。こ
れらのDNAは、それ自体公知の遺伝子工学的手法を用い
て製造することもできる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, human MIP-1α / RA
When preparing an expression vector carrying a DNA encoding the NTES receptor protein, examples of the DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein include human MIP-1α
CDNA or genomic DNA encoding / RANTES receptor protein
, Etc., which has a nucleotide sequence encoding a human MIP-1α / RANTES receptor protein or a partial peptide having substantially the same ligand-binding activity as the human MIP-1α / RANTES receptor protein. However, it is not necessarily limited to this. For example, known human MIP-
CDNA or genome encoding 1α / RANTES receptor protein
Although DNA or the like can be used, synthetic DNA or the like may be used. Specifically, a DNA encoding a human MIP-1α / RANTES receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be mentioned. For example, the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 [Fig. 1] or the like is used. These DNAs can also be produced using a genetic engineering technique known per se.
【００１１】発現ベクターとしては、例えばpAKKO-11
1、pAKKO-111H、pXT1、pRC/CMV、pRC/RSV、pcDNA I Neo
などが用いられ、なかでもpAKKO-111Hが好ましい。プロ
モーターとしては、宿主となる細胞で効率よく機能する
ものであれば何でもよく、SV40プロモーター、CMVプロ
モーター、HSV-TKプロモーター、SRαプロモーター、RS
Vプロモーターなどが好ましく、特にSRαプロモーター
が好ましい。発現ベクターには、以上の他にエンハンサ
ー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選
択マーカー等を含有しているものを用いるのが好まし
い。選択マーカーとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素（以
下DHFRまたはdhfrと略称する場合がある）遺伝子、ネオ
マイシン耐性遺伝子（G418耐性）などが挙げられ、なか
でもDHFR遺伝子が好ましい。特に、選択マーカーとして
DHFR遺伝子を含有した発現ベクターをDHFR遺伝子を欠損
したCHO細胞に導入した場合には、核酸を含まない培地
で培養することによって形質転換体を選択できる。Examples of expression vectors include pAKKO-11.
1, pAKKO-111H, pXT1, pRC / CMV, pRC / RSV, pcDNA I Neo
Etc. are used, and among them, pAKKO-111H is preferable. As the promoter, any promoter can be used so long as it functions efficiently in the host cell, and SV40 promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, SRα promoter, RS
V promoter and the like are preferable, and SRα promoter is particularly preferable. It is preferable to use an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker and the like in addition to the above. Examples of the selectable marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as DHFR or dhfr) gene, a neomycin resistance gene (G418 resistance), and the like. Among them, the DHFR gene is preferable. Especially as a selection marker
When the expression vector containing the DHFR gene is introduced into CHO cells lacking the DHFR gene, transformants can be selected by culturing in a medium containing no nucleic acid.
【００１２】本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質をコードするDNAを保持する発現ベクターとして
は、具体的にはヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を
コードするDNAの上流に前記のプロモーター（特に、SR
αプロモーター、CMVプロモーター、 RSVプロモーター
など）を挿入し、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質
をコードするDNAの下流にポリA付加シグナルを挿入し、
その下流にDHFR遺伝子やネオマイシン耐性遺伝子などの
選択マーカーを挿入し、さらにその下流にアンピシリン
耐性遺伝子を挿入したものなどが好ましい。より具体的
には、例えば〔図２〕に示す方法で作製し得る発現ベク
ターであって、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を
コードするDNAの上流にSRαプロモーターを挿入し、ヒ
トMIP-1α/RANTES受容体タンパク質をコードするDNAの
下流にポリA付加シグナルを挿入し、その下流にDHFR遺
伝子を挿入し、さらにその下流にアンピシリン耐性遺伝
子を挿入したpCCRで標示される発現ベクター（実施例
１）などが好適である。このようにして作製したヒトMI
P-1α/RANTES受容体タンパク質をコードするDNAを保持
する発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、
ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質をコードするDNA
を高発現する細胞を作製することができる。The expression vector carrying the DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention includes, specifically, the above promoter upstream of the DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein. (Especially SR
α promoter, CMV promoter, RSV promoter, etc.), and a poly A addition signal downstream of the DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein,
It is preferable that a selectable marker such as a DHFR gene or a neomycin resistance gene is inserted downstream thereof, and an ampicillin resistance gene is inserted further downstream thereof. More specifically, for example, an expression vector that can be prepared by the method shown in [FIG. 2], in which the SRα promoter is inserted upstream of the DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein, the human MIP-1α / RANTES receptor protein-encoding DNA, a poly A addition signal is inserted downstream, a DHFR gene is inserted downstream thereof, and an ampicillin resistance gene is inserted further downstream thereof An expression vector indicated by pCCR (Example 1 ) Etc. are suitable. Human MI produced in this way
By introducing an expression vector carrying a DNA encoding the P-1α / RANTES receptor protein into a host cell,
DNA encoding human MIP-1α / RANTES receptor protein
A cell that highly expresses can be prepared.
【００１３】宿主細胞としてはCHO細胞（J. Exp. Med.,
108: 945（1995）)などが好適である。さらに、CHO細
胞のなかでも、特にDHFR遺伝子を欠損したCHO細胞（以
下、CHO(dhfr-)細胞と略称する場合がある）（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220（1980）)、CHO K-
1細胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60: 1275（196
8）)などが好ましい。特に、発現ベクター中にDHFR遺伝
子を選択マーカーをして挿入する場合はCHO(dhfr-)細胞
が好適である。この場合は、核酸を含まない培地で培養
することによって形質転換体をきわめて容易に選択でき
る。CHO細胞は、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質
をコードするDNAを高発現させるだけでなく、著しく安
定的に発現させることができる。発現ベクターと宿主細
胞の組み合せとしては適宜好ましい組み合せを選択でき
る。例えばpCCRで標示される発現ベクター（実施例１）
とCHO(dhfr-)細胞の組み合せなどが好適である。宿主細
胞への発現ベクターの導入方法としては、公知の方法、
例えばリン酸カルシウム法（Virology, 52: 456-467(19
73))、電気穿孔法（EMBO J., 1: 841-845 (1982))等が
用いられる。CHO cells (J. Exp. Med.,
108: 945 (1995)) and the like are preferable. Furthermore, among CHO cells, particularly CHO cells lacking the DHFR gene (hereinafter sometimes abbreviated as CHO (dhfr − ) cells) (Proc.
tl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)), CHO K-
1 cell (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60: 1275 (196
8)) and the like are preferable. In particular, when inserting the DHFR gene as a selection marker into an expression vector, CHO (dhfr − ) cells are preferable. In this case, transformants can be selected very easily by culturing in a medium containing no nucleic acid. CHO cells not only highly express DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein, but also can express it extremely stably. As the combination of the expression vector and the host cell, a preferable combination can be appropriately selected. For example, an expression vector designated by pCCR (Example 1)
And a combination of CHO (dhfr − ) cells and the like are preferable. As a method for introducing the expression vector into the host cell, a known method,
For example, calcium phosphate method (Virology, 52: 456-467 (19
73)), electroporation (EMBO J., 1: 841-845 (1982)) and the like.
【００１４】ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を高
発現する細胞は、まず上記の発現ベクターを導入した細
胞を選択マーカーを指標として形質転換体を選択し、つ
づいてクローン選択を行うことにより、得ることができ
る。DHFR遺伝子を用いた場合メソトレキセート（MTX）
の濃度を漸次増加して培養を継続することにより耐性細
胞を選択し、これにより導入遺伝子を細胞内で増幅し
て、より高発現の細胞株を得ることもできる。ここで、
宿主細胞としてたとえばヒトembryonic kidney 293など
の細胞を用いる場合に比べて、CHO細胞を用いる場合
は、発現ベクターの導入が著しく容易であり、また上記
した形質転換体の選択においても非常に容易に行うこと
ができるので有利である。なお、宿主としてCHO(dhfr-)
細胞を用いた場合であっても、例えばpCCRで標示される
発現ベクターはDHFR遺伝子を含むので、CCRで標示され
る発現ベクターを含有するCHO(dhfr-)細胞は、結果とし
てDHFR遺伝子を有している。本願明細書においては、DH
FR遺伝子を含有する発現ベクター（例えばpCCRなど）を
CHO(dhfr-)細胞に導入して得られるCHO細胞を「CHO(dhf
r+)」と表記する場合がある。The cells that highly express the human MIP-1α / RANTES receptor protein are selected by first selecting a transformant using the above-mentioned expression vector-introduced cell as a selection marker, and then performing clone selection. Obtainable. Methotrexate (MTX) when using the DHFR gene
It is also possible to select a resistant cell by gradually increasing the concentration of the above and continue the culture, and thereby amplify the transgene in the cell to obtain a cell line with higher expression. here,
When using CHO cells, the introduction of the expression vector is significantly easier than when cells such as human embryonic kidney 293 are used as host cells, and selection of the transformants described above is also very easy. This is advantageous because it can be done. Note that the host as CHO (dhfr -)
Even when cells are used, for example, the expression vector designated by pCCR contains the DHFR gene, so that CHO (dhfr − ) cells containing the expression vector designated by CCR have the DHFR gene as a result. ing. In the present specification, DH
Expression vector containing FR gene (eg pCCR)
CHO (dhfr -) CHO cells "CHO obtained by introducing into the cell (DHF
r + ) "may be written.
【００１５】本発明において、ヒトMIP-1α/RANTES受容
体タンパク質をコードするDNAを発現できるCHO細胞とし
ては、例えば後述する実施例１で得られるpCCRで標示さ
れる発現ベクターをCHO(dhfr-)細胞に導入して得られる
CHO(dhfr+)細胞、特にCHO/CCRで標示されるCHO細胞など
が好適である。これらのCHO(dhfr+)細胞は、天然のヒト
MIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有する細胞（例え
ばヒト末梢血単球など）に比べて10−500倍のリガンド
結合部位を有するものである。本発明のヒトMIP-1α/RA
NTES受容体タンパク質をコードするDNAを含む発現ベク
ターを含有する細胞を、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タン
パク質をコードするDNAの発現が可能な条件下で培養す
ることによりヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を製
造することができる。ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質をコードするDNAを含む発現ベクターを含有する細
胞を培養する際、培地としては0.5−20％のウシ胎児血
清を含むEMEM、DMEM、RPMI 1640、MEM-αなどが挙げら
れる。特に、CHO(dhfr-)細胞および選択マーカーとして
DHFR遺伝子を含む発現ベクターを用いる場合、核酸を含
まない透析ウシ胎児血清を含むDMEM培地あるいは核酸を
含まない透析ウシ胎児血清を含むα-MEM培地を用いるの
が好ましい。pHは約６−８であるのが好ましい。培養は
通常約30−40℃で約15−200時間行い、必要に応じて培
地の交換、通気、撹拌などを加える。In the present invention, as a CHO cell capable of expressing the DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein, for example, the expression vector designated by pCCR obtained in Example 1 described later is CHO (dhfr − ) Obtained by introducing into cells
CHO (dhfr + ) cells, particularly CHO cells indicated by CHO / CCR are suitable. These CHO (dhfr + ) cells are native human
It has a ligand binding site that is 10 to 500 times that of cells containing MIP-1α / RANTES receptor protein (for example, human peripheral blood monocytes). Human MIP-1α / RA of the present invention
By culturing cells containing an expression vector containing the DNA encoding the NTES receptor protein under conditions that allow the expression of the DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein, Body proteins can be produced. When culturing cells containing an expression vector containing a DNA encoding a human MIP-1α / RANTES receptor protein, the medium is 0.5 to 20% fetal bovine serum-containing EMEM, DMEM, RPMI 1640, MEM-α, etc. Is mentioned. In particular, CHO - as a cell and a selectable marker (dhfr)
When an expression vector containing the DHFR gene is used, it is preferable to use DMEM medium containing dialyzed fetal bovine serum without nucleic acid or α-MEM medium containing dialyzed fetal bovine serum without nucleic acid. The pH is preferably about 6-8. Culturing is usually carried out at about 30-40 ° C for about 15-200 hours, and if necessary, medium exchange, aeration, stirring, etc. are added.
【００１６】ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含
有する細胞膜画分とは、上記のヒトMIP-1α/RANTES受容
体タンパク質を含有するCHO細胞をそれ自体公知の方法
で破砕して得られる細胞膜を多く含む画分をいう。細胞
の破砕方法としては、例えばPotter-Elvehjem型ホモジ
ナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダー
やポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波に
よる破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細
いノズルから噴出させることによる破砕、凍結融解など
が挙げられる。細胞膜を分画するには、分画遠心分離法
や密度勾配遠心分離法などの方法が主として用いられ
る。例えば細胞破砕液を低速（500−3000rpm）で短時間
（通常約1−10分）遠心し、上清をさらに高速（15000−
30000 rpm）で通常約30分−2時間遠心し、得られる沈澱
を膜画分とする。該膜画分中には、発現したヒトMIP-1
α/RANTES受容体タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜
タンパク質などの膜成分が多く含まれる。本発明のヒト
MIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有する細胞やその
細胞膜画分中のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質の
量は、１細胞あたり103−107分子であるのが好ましく、
104−106分子であるのが好適である。[0016] The cell membrane fraction containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein means the cell membrane obtained by disrupting the CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein by a method known per se. It means a fraction containing a lot of. Examples of cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, disruption with a Waring blender or polytron (Kinematica), ultrasonic disruption, or jetting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Examples include crushing by freezing and freeze-thawing. In order to fractionate cell membranes, methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1-10 minutes), and the supernatant is spun at a higher speed (15000-
Centrifugation is usually carried out at 30,000 rpm for about 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction. Expressed human MIP-1 in the membrane fraction
It is rich in α / RANTES receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins. Human of the present invention
The amount of human MIP-1α / RANTES receptor protein in cells containing the MIP-1α / RANTES receptor protein or its cell membrane fraction is preferably 10 3 -10 7 molecules per cell,
It is preferably 10 4 -10 6 molecules.
【００１７】上記で得られたヒトMIP-1α/RANTES受容体
タンパク質を含有するCHO細胞からヒトMIP-1α/RANTES
受容体タンパク質を単離するには、例えば下記の方法に
より行うことができる。ヒトMIP-1α/RANTES受容体タン
パク質を含有するCHO細胞を培養後、公知の方法で細胞
を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波破砕、ホ
モジナイザー、凍結融解などによって細胞を破壊したの
ち、遠心分離や濾過により組換え型ヒトMIP-1α/RANTES
受容体タンパク質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に、PM
SF(phenylmethanesulfonyl fluoride)、ペプスタチン、
ロイペプチンなどのタンパク分解酵素阻害剤やCHAPS (3
-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesul
fonate)、ジギトニン、トリトンX-100などの界面活性剤
が含まれていてもよい。得られた抽出液中に含まれるヒ
トMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を、自体公知の分離
・精製方法を適切に組合わせて精製することができる。
これらの公知の分離・精製方法として、塩析や溶媒沈澱
などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾
過、あるいはSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動など
の主として分子量の差を利用する方法、アフィニティー
クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、疎水クロマトグラフィーや逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられ
る。From the CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein obtained above, human MIP-1α / RANTES
The receptor protein can be isolated by the following method, for example. After culturing CHO cells containing human MIP-1α / RANTES receptor protein, cells were collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and disrupted by ultrasonic disruption, homogenizer, freeze-thawing, etc. After that, by centrifugation or filtration, recombinant human MIP-1α / RANTES
A crude extract of the receptor protein is obtained. PM in the buffer
SF (phenylmethanesulfonyl fluoride), pepstatin,
Proteolytic enzyme inhibitors such as leupeptin and CHAPS (3
-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesul
A surfactant such as fonate), digitonin, or Triton X-100 may be included. The human MIP-1α / RANTES receptor protein contained in the obtained extract can be purified by an appropriate combination of separation / purification methods known per se.
Known separation / purification methods for these include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, methods utilizing mainly difference in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, or SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. , A method using specific affinity such as affinity chromatography, a method utilizing difference in hydrophobicity such as hydrophobic chromatography and reverse phase high performance liquid chromatography, and a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing. The method used is used.
【００１８】かくして得られるヒトMIP-1α/RANTES受容
体タンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の
方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換するこ
とができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あ
るいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に
変換することができる。なお、ヒトMIP-1α/RANTES受容
体タンパク質を精製前または精製後に適当なタンパク修
飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり
部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク修
飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、リシル
エンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダ
ーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用い
られる。ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質をコード
するDNAを含む発現ベクターを含有するCHO細胞を、ヒト
MIP-1α/RANTES受容体タンパク質の発現が可能な条件下
で培養することにより製造され得るヒトMIP-1α/RANTES
受容体タンパク質は、天然型のヒトMIP-1α/RANTES受容
体タンパク質と同質の活性を有するものである。実質的
に同質の活性としては、例えばリガンド結合活性やシグ
ナル伝達活性などが挙げられる。リガンド結合活性とし
ては、MIP-1α、RANTES、MCP-3(J. Biol. Chem., 270:
16491-16494(1995))などとの結合活性が挙げられる。実
質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同質
であることを示す。したがって、受容体タンパク質の分
子量などの量的要素は異なっていてもよい。When the human MIP-1α / RANTES receptor protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely obtained as a salt. In some cases, the free form or other salt can be converted by a method known per se or a method analogous thereto. The human MIP-1α / RANTES receptor protein can be optionally modified or partially removed by reacting it with an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase, protein kinase, glucosidase and the like are used. CHO cells containing an expression vector containing DNA encoding human MIP-1α / RANTES receptor protein
Human MIP-1α / RANTES that can be produced by culturing under conditions capable of expressing MIP-1α / RANTES receptor protein
The receptor protein has the same activity as the naturally-occurring human MIP-1α / RANTES receptor protein. Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal transduction activity. The ligand binding activity, MIP-1α, RANTES, MCP-3 (J. Biol. Chem., 270:
16491-16494 (1995)) and the like. "Substantially the same quality" means that the ligand binding activity and the like are qualitatively the same. Therefore, quantitative factors such as the molecular weight of the receptor protein may be different.
【００１９】本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質としては、例えば配列番号：２で表されるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有す
るヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質などが挙げられ
る。具体的には、配列番号：２で表されるアミノ酸配列
を有するヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質の他、配
列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以
上（好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは
２個以上１０個以下）のアミノ酸が欠失したもの、配列
番号：２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２
個以上１０個以下）のアミノ酸が付加したもの、配列番
号：２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２
個以上１０個以下）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れたものなどが挙げられる。さらに、これらのヒトMIP-
1α/RANTES受容体タンパク質は、分子内のアミノ酸の側
鎖が適当な保護基（例えばホルミル基、アセチル基など
のアシル基など）で保護されていてもよいし、糖鎖など
が結合していてもよい。本発明のヒトMIP-1α/RANTES受
容体タンパク質の塩としては生理学的に許容される塩基
（例、アルカル金属等）や酸（有機酸、無機酸）との塩
が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。このような塩としては、例えば無機酸
（例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あ
るいは有機酸（例えば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。The human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention includes, for example, a human MIP-1α / RANTES receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And so on. Specifically, in addition to the human MIP-1α / RANTES receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 or 2 or more (preferably, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferable, Deletion of 2 to 30 amino acids, more preferably 2 to 10 amino acids, 1 or 2 or more (preferably 2 to 30) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or less, more preferably 2
1 or 2 or more (preferably 2 or more and 30 or less, more preferably 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
One or more and 10 or less) amino acids are substituted with other amino acids. Furthermore, these human MIP-
In the 1α / RANTES receptor protein, the side chain of amino acid in the molecule may be protected with an appropriate protecting group (eg, formyl group, acyl group such as acetyl group), or sugar chain or the like may be bound. Good. As the salt of the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention, a salt with a physiologically acceptable base (eg, alcal metal etc.) or an acid (organic acid, inorganic acid) is used. Acid-acceptable acid addition salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid). , Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
【００２０】本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質の部分ペプチドとしては、例えばヒトMIP-1α/RANT
ES受容体タンパク質の分子のうち、疎水性プロット解析
から推定される疎水性領域や親水性領域の１つあるいは
複数の領域を含む部分ペプチドである。これらの部分ペ
プチドは１つの疎水性領域の一部あるいは全部を含んで
いてもよいし、１つの親水性領域の一部あるいは全部を
含んでいてもよい。本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体
タンパク質の部分ペプチドの塩としては、上記した本発
明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質の塩と同様の
ものが用いられる。Examples of the partial peptide of the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention include human MIP-1α / RANT
It is a partial peptide containing one or more regions of a hydrophobic region and a hydrophilic region inferred from the hydrophobicity plot analysis in the molecule of the ES receptor protein. These partial peptides may include a part or all of one hydrophobic region, or may include a part or all of one hydrophilic region. As the salt of the partial peptide of the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention, those similar to the salts of the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention described above are used.
【００２１】本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチ
ド合成法に従って、あるいは本発明のヒトMIP-1α/RANT
ES受容体タンパク質を適切なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチド合成法とし
ては、たとえば固相合成法、液相合成法のいずれによっ
ても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る
部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば以下の(a)
−(e)に記載された方法が挙げられる。 (a)M. Bodanszky およびM. A. Ondetti, ペプチドシン
セシス(Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) (b)Schroederおよび Luebke、ザ ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, New York (1965年) (c)泉屋信夫、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）
（1975年） (d)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タン
パク質の化学IV, 205, (1977年) (e)矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチ
ド合成、広川書店（１９９１年） また反応後は通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カ
ラムクロマトグラフィー、高速液体クトマトグラフィ
ー、再結晶などを組合わせて本発明の部分ペプチドを単
離精製することができる。上記の方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換できるし、逆に塩で得られた場合は、公知の
方法によって遊離体に変換できる。The partial peptide of the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention or a salt thereof can be prepared according to a peptide synthesis method known per se, or the human MIP-1α / RANT of the present invention.
It can be produced by cleaving the ES receptor protein with an appropriate peptidase. The peptide synthesis method may be either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group. Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the following (a)
-The method described in (e) can be mentioned. (a) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publisher
s, New York (1966) (b) Schroeder and Luebke, The Peptid
e), Academic Press, New York (1965) (c) Nobuo Izumiya, Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd.
(1975) (d) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977) (e) Supervision of Haruaki Yajima, Development of Pharmaceuticals, Volume 14, Peptide Synthesis , Hirokawa Shoten (1991) In addition, after the reaction, the partial peptide of the present invention can be isolated and purified by a combination of usual purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, high performance liquid chromatography, recrystallization and the like. You can When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method.
【００２２】本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質を含有するCHO細胞(CHO/CCR)もしくは該CHO細胞か
ら得られるヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有
する細胞膜画分、またはそれより単離して得られるヒト
MIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩はヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合
物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有
用である。該スクリーニングに用いられるヒトMIP-1α/
RANTES受容体タンパク質は、組換え型、天然型のいずれ
であっても使用し得る。上記、ヒトMIP-1α/RANTES受容
体親和性化合物には、ヒトMIP-1α/RANTES受容体アンタ
ゴニストおよびヒトMIP-1α/RANTES受容体アゴニストが
含まれる。すなわち、本発明は、（１）ヒトMIP-1α/RA
NTES受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれら
の塩と被験化合物とを接触させることを特徴とするヒト
MIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩のスク
リーニング方法、および（２）ヒトMIP-1α/RANTES受容
体タンパク質を含有するCHO細胞または該細胞膜画分と
被験化合物とを接触させることを特徴とするヒトMIP-1
α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩のスクリー
ニング方法を提供する。具体的には、本発明は、 （１）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガン
ドをヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分ペ
プチドまたはそれらの塩に接触させた場合と、（ii）ヒ
トMIP-1α/RANTES受容体に対するリガンドおよび被験化
合物を同時にヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、そ
の部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場合との
比較を行うことを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体
親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、およ
び （２）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガン
ドを、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有する
CHO細胞または該細胞膜画分と接触させた場合と、（i
i）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガンドおよび
被験化合物を同時にヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク
質を含有するCHO細胞または該細胞膜画分と接触させた
場合との比較を行うことを特徴とするヒトMIP-1α/RANT
ES受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方
法を提供する。CHO cells (CHO / CCR) containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention or a cell membrane fraction containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein obtained from the CHO cells, or Human obtained by isolation
The MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof is useful as a reagent for screening a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof. Human MIP-1α / used for the screening
The RANTES receptor protein may be used in either a recombinant form or a natural form. The human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound includes a human MIP-1α / RANTES receptor antagonist and a human MIP-1α / RANTES receptor agonist. That is, the present invention provides (1) human MIP-1α / RA
Human characterized by contacting a test compound with an NTES receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof
A method for screening a compound having affinity for MIP-1α / RANTES receptor or a salt thereof, and (2) contacting a CHO cell containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein or a cell membrane fraction thereof with a test compound Human MIP-1
Provided is a method for screening an α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof. Specifically, the present invention provides (1) (i) a case where a ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor is contacted with a human MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, (Ii) Comparison with the case where the ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor and the test compound are simultaneously contacted with the human MIP-1α / RANTES receptor protein, its partial peptide or salts thereof Method for screening human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or salt thereof, and (2) (i) human MIP-1α / RANTES receptor ligand containing human MIP-1α / RANTES receptor protein
When contacted with CHO cells or the cell membrane fraction, (i
i) Comparison with a case where a ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor and a test compound are simultaneously contacted with CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein or the cell membrane fraction thereof Human MIP-1α / RANT
A method for screening an ES receptor affinity compound or a salt thereof is provided.
【００２３】より具体的には、本発明のスクリーニング
方法において（ｉ）と（ii）の場合に、ヒトMIP-1α/RA
NTES受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれら
の塩、またはヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含
有するCHO細胞あるいは該細胞膜画分に対するヒトMIP-1
α/RANTES受容体のリガンドの結合量、もしくはリガン
ドによる細胞刺激活性などを測定して、比較することを
特徴とする。すなわち、本発明は、 （１ａ）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する標識
したリガンドを、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場
合と、（ii）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガン
ドおよび被験化合物を同時に、ヒトMIP-1α/RANTES受容
体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接
触させた場合の、該受容体タンパク質、その部分ペプチ
ドまたはそれらの塩に対する標識したリガンドの結合量
を比較することを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体
親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、 （１ｂ）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する標識
したリガンドを、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質
を含有するCHO細胞または該細胞膜画分に接触させた場
合と、（ii）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する標識し
たリガンドおよび被験化合物を同時に、ヒトMIP-1α/RA
NTES受容体タンパク質を含有するCHO細胞または該細胞
膜画分に接触させた場合の、該CHO細胞または該細胞膜
画分に対する標識したリガンドの結合量を比較すること
を特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法、More specifically, in the case of (i) and (ii) in the screening method of the present invention, human MIP-1α / RA
Human MIP-1 for CHO cells containing the NTES receptor protein, its partial peptide or salts thereof, or human MIP-1α / RANTES receptor protein or the cell membrane fraction
The feature is that the binding amount of the ligand of the α / RANTES receptor or the cell stimulating activity by the ligand is measured and compared. That is, the present invention includes (1a) (i) contacting a labeled ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor with a human MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (Ii) When the human MIP-1α / RANTES receptor ligand and a test compound are simultaneously contacted with the human MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof, the receptor protein, a portion thereof A method for screening a human MIP-1α / RANTES receptor-affinitive compound or a salt thereof, which comprises comparing the binding amount of a labeled ligand to a peptide or a salt thereof, (1b) (i) human MIP-1α / RANTES When a labeled ligand for the receptor is contacted with CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein or the cell membrane fraction, and (ii) for the human MIP-1α / RANTES receptor Labeled ligand and test compound simultaneously with human MIP-1α / RA
Human MIP-1α / RANTES, which is characterized by comparing binding amounts of labeled ligands to CHO cells containing the NTES receptor protein or the cell membrane fraction when contacted with the CHO cells or the cell membrane fraction. A method for screening a compound having affinity for a receptor or a salt thereof,
【００２４】（２ｂ）（ｉ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体
に対するリガンドを、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質を含有するCHO細胞または該細胞膜画分と接触させ
た場合と、（ii）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリ
ガンドおよび被験化合物を同時に、ヒトMIP-1α/RANTES
受容体タンパク質を含有するCHO細胞または該細胞膜画
分と接触させた場合の、ヒトMIP-1α/RANTES受容体を介
した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内Ca2+濃度の
変動、Gタンパク質の活性化、イノシトールリン脂質の
産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒスタミンな
どの炎症性メディエーターの遊離、脱顆粒、細胞膜電位
の変動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細胞内タンパ
ク質の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内タンパク質
のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性など）を測
定することを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体アン
タゴニストのスクリーニング方法、および、 （３ｂ）ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガンド
を、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有するCH
O細胞または該細胞膜画分と接触させた場合の、ヒトMIP
-1α/RANTES受容体を介した細胞刺激活性（例えば細胞
遊走、細胞内Ca2+濃度の変動、Gタンパク質の活性化、
イノシトールリン脂質の産生、アラキドン酸の遊離、cA
MPの生成、ヒスタミンなどの炎症性メディエーターの遊
離、脱顆粒、細胞膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク
質あるいは細胞内タンパク質の活性化、膜タンパク質あ
るいは細胞内タンパク質のリン酸化などを促進あるいは
抑制する活性など）を測定することを特徴とするヒトMI
P-1α/RANTES受容体アゴニストのスクリーニング方法を
提供する。(2b) (i) When a ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor is contacted with CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein or the cell membrane fraction thereof, (ii) A ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor and a test compound were simultaneously administered to the human MIP-1α / RANTES
Human MIP-1α / RANTES receptor-mediated cell stimulatory activity when contacted with CHO cells containing the receptor protein or the cell membrane fraction (eg cell migration, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, G protein) Activation, production of inositol phospholipids, release of arachidonic acid, production of cAMP, release of inflammatory mediators such as histamine, degranulation, fluctuation of cell membrane potential, fluctuation of pH, activation of membrane protein or intracellular protein, A method for screening a human MIP-1α / RANTES receptor antagonist, which comprises measuring the activity of promoting or suppressing phosphorylation of a membrane protein or an intracellular protein, and (3b) human MIP-1α / RANTES CH containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein as a ligand for the receptor
Human MIP when contacted with O cells or the cell membrane fraction
-1α / RANTES receptor-mediated cell stimulating activity (eg cell migration, intracellular Ca 2+ concentration fluctuations, G protein activation,
Production of inositol phospholipids, release of arachidonic acid, cA
Promote or suppress MP generation, release of inflammatory mediators such as histamine, degranulation, fluctuation of cell membrane potential, pH fluctuation, activation of membrane protein or intracellular protein, phosphorylation of membrane protein or intracellular protein, etc. Human MI characterized by measuring activity etc.)
A method for screening a P-1α / RANTES receptor agonist is provided.
【００２５】上記の（１ａ）または（１ｂ）のスクリー
ニング方法において、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、またはヒト
MIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有するCHO細胞も
しくは該細胞膜画分と結合することにより、ヒトMIP-1
α/RANTES受容体に対するリガンドとヒトMIP-1α/RANTE
S受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩、またはヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有
する該CHO細胞もしくは該細胞膜画分との結合を阻害す
る化合物をヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物また
はその塩の候補化合物として選択することができる。ま
た、上記の（２ｂ）のスクリーニング方法において、ヒ
トMIP-1α/RANTES受容体に対するリガンドとヒトMIP-1
α/RANTES受容体タンパク質を含有するCHO細胞または該
細胞膜画分との結合を阻害するが、ヒトMIP-1α/RANTES
受容体を介した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞内
Ca2+濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イノシトール
リン脂質の産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒ
スタミンなどの炎症性メディエーターの遊離、脱顆粒、
細胞膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク質あるいは細
胞内タンパク質の活性化、膜タンパク質あるいは細胞内
タンパク質のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性
など）を有しない化合物をヒトMIP-1α/RANTES受容体ア
ンタゴニストとして選択することができる。さらに、上
記の（３ｂ）のスクリーニング方法において、ヒトMIP-
1α/RANTES受容体に結合し、該受容体を介した細胞刺激
活性（例えば細胞遊走、細胞内Ca2+濃度の変動、Gタン
パク質の活性化、イノシトールリン脂質の産生、アラキ
ドン酸の遊離、cAMPの生成、ヒスタミンなどの炎症性メ
ディエーターの遊離、脱顆粒、細胞膜電位の変動、pHの
変動、膜タンパク質あるいは細胞内タンパク質の活性
化、膜タンパク質あるいは細胞内タンパク質のリン酸化
などを促進あるいは抑制する活性など）を有する化合物
をヒトMIP-1α/RANTES受容体アゴニストとして選択する
ことができる。In the above screening method (1a) or (1b), human MIP-1α / RANTES receptor protein, its partial peptide or salts thereof, or human
By binding to CHO cells containing the MIP-1α / RANTES receptor protein or the cell membrane fraction thereof, human MIP-1
Ligands for α / RANTES receptor and human MIP-1α / RANTE
The human MIP-1α / RANTES receptor is a compound that inhibits the binding of the S receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, or the CHO cell containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein or the cell membrane fraction. It can be selected as a candidate compound for the affinity compound or a salt thereof. In addition, in the screening method of (2b) above, a ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor and human MIP-1
Human MIP-1α / RANTES inhibits binding to CHO cells containing α / RANTES receptor protein or the cell membrane fraction
Receptor-mediated cell stimulating activity (eg cell migration, intracellular
Fluctuation of Ca 2+ concentration, activation of G protein, production of inositol phospholipid, release of arachidonic acid, production of cAMP, release of inflammatory mediators such as histamine, degranulation,
Human MIP-1α / RANTES receptor is a compound that does not have cell membrane potential fluctuation, pH fluctuation, activation of membrane protein or intracellular protein, and activity to promote or suppress membrane protein or intracellular protein phosphorylation. It can be selected as an antagonist. Furthermore, in the screening method of (3b) above, human MIP-
Binding to 1α / RANTES receptor and cell stimulating activity mediated by the receptor (eg cell migration, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, activation of G protein, production of inositol phospholipid, release of arachidonic acid, cAMP Activity, release of inflammatory mediators such as histamine, degranulation, fluctuation of cell membrane potential, pH fluctuation, activation of membrane or intracellular proteins, and phosphorylation of membrane or intracellular proteins. Etc.) can be selected as a human MIP-1α / RANTES receptor agonist.
【００２６】本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパ
ク質を含有するCHO細胞が得られる以前は、ヒトMIP-1α
/RANTES受容体タンパク質を持続的に高発現できる動物
細胞がなかったため、ヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性
化合物またはその塩のスクリーニングを効率よく行うこ
とができなかった。本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体
タンパク質を含有するCHO細胞は、ヒトMIP-1α/RANTES
受容体タンパク質を大量にかつ安定的に発現し、ヒトMI
P-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩のスクリ
ーニングに有用である。以下に本発明のスクリーニング
方法を具体的に説明する。本発明のスクリーニング方法
において、ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有
するCHO細胞を用いる場合は、該CHO細胞を生細胞のまま
用いることができる。あるいは、該CHO細胞をそれ自体
公知の方法に従ってグルタルアルデヒド、パラホルムア
ルデヒドなどで固定化した後、用いることもできる。Prior to obtaining CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention, human MIP-1α
Since there was no animal cell capable of continuously highly expressing the / RANTES receptor protein, it was not possible to efficiently screen a compound having affinity for human MIP-1α / RANTES receptor or a salt thereof. CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention are human MIP-1α / RANTES
Highly stable expression of receptor protein
It is useful for screening for P-1α / RANTES receptor affinity compounds or salts thereof. The screening method of the present invention will be specifically described below. When CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein are used in the screening method of the present invention, the CHO cells can be used as they are as live cells. Alternatively, the CHO cells can be used after being immobilized with glutaraldehyde, paraformaldehyde, etc. according to a method known per se.
【００２７】本発明のスクリーニング方法において使用
されるヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガンドとし
ては、例えばMIP-1α、RANTES、MCP-3などが挙げられ
る。ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する標識したリガン
ドとしては、たとえば［125I］［35S］、［3H］、
［14C］などで標識した上記のリガンドなどを用いるこ
とができる。あるいは、フルオレッセインなどで蛍光標
識したリガンド、または西洋ワサビペルオキシダーゼな
どで酵素標識したリガンド、あるいはリガンドとアルカ
リフォスファターゼなどのタンパク質との遺伝子工学的
に作製した融合タンパク質を用いることもできる。ある
いは、MIP-1α、RANTES、MCP-3などのリガンドの部分ア
ミノ酸配列を有するペプチドを用いることもできる。こ
れらの標識体は自体公知の方法に従って作製することが
できる。例えば［125I］で標識されたMIP-1αおよびRAN
TESがDu Pontより市販されているので、それらを利用で
きる。本発明のスクリーニング方法で使用される被験化
合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチ
ド性化合物、合成化合物、微生物発酵生産物、海洋生物
抽出液、植物抽出液、細胞抽出液、動物組織抽出液など
が挙げられる。これらの被験化合物は新規な化合物であ
ってもよいし、公知の化合物であってもよい。Examples of the ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor used in the screening method of the present invention include MIP-1α, RANTES, MCP-3 and the like. Labeled ligands for the human MIP-1α / RANTES receptor include, for example, [ 125 I] [ 35 S], [ 3 H],
The above ligands labeled with [ 14 C] and the like can be used. Alternatively, it is also possible to use a ligand fluorescently labeled with fluorescein or the like, a ligand enzymatically labeled with horseradish peroxidase or the like, or a genetically engineered fusion protein of the ligand and a protein such as alkaline phosphatase. Alternatively, a peptide having a partial amino acid sequence of a ligand such as MIP-1α, RANTES, MCP-3 can be used. These labels can be produced according to a method known per se. For example, MIP-1α and RAN labeled with [ 125 I]
TES is available from Du Pont, so you can use them. Examples of the test compound used in the screening method of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, microbial fermentation products, marine organism extracts, plant extracts, cell extracts, animal tissue extracts, etc. Is mentioned. These test compounds may be new compounds or known compounds.
【００２８】具体的には、上記の（１ａ）または（１
ｂ）のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発
明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分ペ
プチドまたはそれらの塩、またはヒトMIP-1α/RANTES受
容体タンパク質を含有するCHO細胞あるいは該細胞膜画
分を、スクリーニングに適した緩衝液に懸濁することに
より受容体標品を調製する。緩衝液としては、リガンド
と受容体との結合を阻害しないものであれば何でもよ
く、例えばpH 6−8のリン酸緩衝液、トリス-塩酸緩衝
液、PBS、HBSSなどが用いられる。また、非特異的結合
を低減させる目的で、ウシ血清アルブミンなどのタンパ
ク質、CHAPSやTween 80TM（花王−アトラス社） 、ジギ
トニンなどの界面活性剤を加えることもできる。さら
に、タンパク質分解酵素によるヒトMIP-1α/RANTES受容
体タンパク質の分解を抑えるために、PMSF、ペプスタチ
ン、ロイペプチンなどのタンパク質分解酵素阻害剤を添
加することもできる。また、組換え型ヒトMIP-1α/RANT
ES受容体タンパク質を含有するCHO細胞を培養器に接着
させたままスクリーニングに用いることもできる。約0.
01−10 mlの該受容体発現細胞または該受容体標品に、
一定量（約5,000−1,000,000 cpm）の標識体と約10-3−
10-10 Mの濃度の合成化合物などの被験化合物あるいは
適宜に希釈した微生物発酵生産物などの被験化合物とを
同時に添加し、約0−50℃（望ましくは約4−37℃）で、
約0.5−24時間（望ましくは約0.5−3時間）反応させ
る。反応後、適量の緩衝液で洗浄したのち該受容体発現
細胞または該受容体標品に残存する放射線量をガンマカ
ウンター、液体シンチレーションカウンターなどで測定
する。反応時に大過剰の非標識リガンドを共存させたと
きの残存放射線量を非特異的結合量とする。あるいは、
ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有しないコン
トロールのCHO細胞または該細胞膜画分を用いたときの
残存放射線量を非特異的結合量とすることもできる。共
存物のないときの残存放射線量を総結合量とするとき、
総結合量から非特異的結合量を差し引いた値が特異的結
合量である。反応液に添加することにより、この特異的
結合量を低下させる被験化合物をヒトMIP-1α/RANTES受
容体親和性化合物またはその塩の候補化合物として選択
することができる。Specifically, the above (1a) or (1
To carry out the screening method of b), first, a human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, or a CHO cell containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein or A receptor preparation is prepared by suspending the cell membrane fraction in a buffer suitable for screening. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, and for example, a phosphate buffer of pH 6-8, Tris-hydrochloric acid buffer, PBS, HBSS and the like are used. For the purpose of reducing non-specific binding, proteins such as bovine serum albumin, CHAPS, Tween 80 ™ (Kao-Atlas Co.), and surfactants such as digitonin can be added. Further, in order to suppress the degradation of the human MIP-1α / RANTES receptor protein by proteolytic enzymes, proteolytic enzyme inhibitors such as PMSF, pepstatin and leupeptin can be added. In addition, recombinant human MIP-1α / RANT
The CHO cells containing the ES receptor protein can also be used for screening while being adhered to the incubator. About 0.
01-10 ml of the receptor-expressing cells or the receptor preparation,
A fixed amount (about 5,000-1,000,000 cpm) of labeled substance and about 10 -3 −
A test compound such as a synthetic compound at a concentration of 10 -10 M or a test compound such as an appropriately diluted microbial fermentation product was added at the same time, and at about 0-50 ° C (desirably about 4-37 ° C),
The reaction is carried out for about 0.5-24 hours (desirably about 0.5-3 hours). After the reaction, the cells are washed with an appropriate amount of buffer solution, and the radiation dose remaining in the cells expressing the receptor or the preparation of the receptor is measured with a gamma counter, a liquid scintillation counter or the like. The amount of residual radiation when a large excess of unlabeled ligand is allowed to coexist during the reaction is defined as the amount of nonspecific binding. Or,
The non-specific binding amount can also be the residual radiation dose when a control CHO cell containing no human MIP-1α / RANTES receptor protein or the cell membrane fraction is used. When the total radiation dose is the residual radiation dose when there is no coexisting substance,
The value obtained by subtracting the non-specific binding amount from the total binding amount is the specific binding amount. By adding to the reaction solution, a test compound that reduces the specific binding amount can be selected as a candidate compound for the human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof.
【００２９】また、上記（２ｂ）または（３ｂ）のスク
リーニング方法を実施するためには、ヒトMIP-1α/RANT
ES受容体を介した細胞刺激活性（例えば細胞遊走、細胞
内Ca2+濃度の変動、Gタンパク質の活性化、イノシトー
ルリン脂質の産生、アラキドン酸の遊離、cAMPの生成、
ヒスタミンなどの炎症性メディエーターの遊離、脱顆
粒、細胞膜電位の変動、pHの変動、膜タンパク質あるい
は細胞内タンパク質の活性化、膜タンパク質あるいは細
胞内タンパク質のリン酸化などを促進あるいは抑制する
活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用
いて測定することができる。具体的には、本発明のヒト
MIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有するCHO細胞を
培養後、細胞懸濁液を調製し、ケモタキシスチャンバー
を用いてリガンドに応答した該CHO細胞の遊走活性を測
定できる。あるいは、該CHO細胞懸濁液にfura-2やfura-
PE3などの蛍光指示薬を添加することによりCHO細胞にこ
れらの蛍光指示薬を負荷し、蛍光分光光度計などを用い
てリガンドの刺激による細胞内Ca2+濃度の変動を測定で
きる。In order to carry out the screening method of (2b) or (3b) above, human MIP-1α / RANT
Cell stimulatory activity via ES receptor (eg cell migration, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, activation of G protein, production of inositol phospholipid, release of arachidonic acid, production of cAMP,
Release and degranulation of inflammatory mediators such as histamine, fluctuation of cell membrane potential, fluctuation of pH, activation of membrane protein or intracellular protein, and promotion or suppression of phosphorylation of membrane protein or intracellular protein) It can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, the human of the present invention
After culturing CHO cells containing the MIP-1α / RANTES receptor protein, a cell suspension is prepared, and the chemotaxis chamber can be used to measure the migration activity of the CHO cells in response to the ligand. Alternatively, in the CHO cell suspension, fura-2 or fura-
By adding a fluorescent indicator such as PE3 to CHO cells, these fluorescent indicators can be loaded, and changes in intracellular Ca 2+ concentration due to ligand stimulation can be measured using a fluorescence spectrophotometer or the like.
【００３０】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分ペ
プチドまたはそれらの塩、または本発明のヒトMIP-1α/
RANTES受容体タンパク質を含有するCHO細胞もしくは該
細胞膜画分を含有するものである。本発明のスクリーニ
ング用キットの例としては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 ＤＭＥＭ（GIBCO BRL）に、０.５％のウシ血清アルブミ
ン（Sigma）を加えたもの。孔径０.４５μｍのフィルタ
ーで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製
しても良い。 ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質標品 ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有するＣＨＯ
細胞を、９６ウェルマイクロプレートに５×１０4個／
ウェルで継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで
１日間培養したもの。 ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する標識したリガンド ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対する市販の〔125Ｉ〕な
どで標識したリガンド（例えば、MIP-1α, RANTES, MCP
-3など）溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて
保存し、用時に測定用緩衝液にて０．５−１．０ｎＭに
希釈する。 ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガンドの標準液 ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガンド（例えば、
MIP-1α, RANTES, MCP-3など）をＤＭＥＭ／０．５％Ｂ
ＳＡで１０μＭとなるように溶解し、−８０〜−２０℃
で保存する。The screening kit of the present invention comprises the human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention, its partial peptide or salts thereof, or human MIP-1α / of the present invention.
CHO cells containing the RANTES receptor protein or those containing the cell membrane fraction. Examples of the screening kit of the present invention include the following. [Screening Reagent] Measurement buffer and washing buffer DMEM (GIBCO BRL) to which 0.5% bovine serum albumin (Sigma) was added. It may be sterilized by filtration with a filter having a pore size of 0.45 μm and stored at 4 ° C., or may be prepared before use. Human MIP-1α / RANTES receptor protein preparation CHO containing human MIP-1α / RANTES receptor protein
5 × 10 4 cells / 96 well microplate
Subcultured in wells and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air for 1 day. Labeled ligand for human MIP-1α / RANTES receptor Labeled ligand for human MIP-1α / RANTES receptor such as commercially available [ 125 I] (eg, MIP-1α, RANTES, MCP
-3 or the like) is stored at 4 ° C. or −20 ° C. and diluted to 0.5-1.0 nM with a measurement buffer at the time of use. Standard solution of ligand for human MIP-1α / RANTES receptor Ligand for human MIP-1α / RANTES receptor (eg,
MIP-1α, RANTES, MCP-3, etc.) in DMEM / 0.5% B
Dissolve to 10 μM in SA, -80 to -20 ° C
To save.
【００３１】〔測定法〕 ９６ウェルマイクロプレートにてヒトMIP-1α/RANTES
受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞を培養し、培地
を除いた後、３５μｌ／ｗｅｌｌのＤＭＥＭ／０．５％
ＢＳＡを添加する。 １０-3〜１０-10Ｍの被験化合物溶液を５μｌ／ｗｅ
ｌｌ加えた後、０．５−１．０ｎＭ標識リガンド（例え
ば、MIP-1α, RANTES, MCP-3など）を１０μｌ／ｗｅｌ
ｌ加え、室温にて３０〜４０分間反応させる。非特異的
結合量を知るためには被験化合物のかわりに０．５〜
１．０μＭの非標識リガンド（例えば、MIP-1α, RANTE
S, MCP-3など）を１０μｌ／ｗｅｌｌ加えておく。 反応液を除去し、２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで２
回洗浄する。２５μｌ／ｗｅｌｌのエタノールを添加し
て撹拌する。さらに、２００μｌ／ｗｅｌｌのシンチレ
ーター(MicroScint-20, Packard)を添加して撹拌する。 細胞に結合した放射活性をTopCount (Packard)で測定
し、Percent of MaximumBinding（ＰＭＢ）を次の式
〔数１〕で求める。[Measurement Method] Human MIP-1α / RANTES in a 96-well microplate
After culturing CHO cells containing the receptor protein and removing the medium, 35 μl / well of DMEM / 0.5%
Add BSA. A test compound solution of 10 −3 to 10 −10 M was added at 5 μl / we.
After adding 11 μl, 0.5 μ-1.0 nM labeled ligand (eg, MIP-1α, RANTES, MCP-3, etc.) was added at 10 μl / well.
1 and added, and reacted at room temperature for 30 to 40 minutes. In order to know the amount of non-specific binding, 0.5-
1.0 μM unlabeled ligand (eg MIP-1α, RANTE
S, MCP-3, etc.) is added at 10 μl / well. Remove the reaction solution, and add 2 with 200 μl / well of PBS.
Wash twice. Add 25 μl / well of ethanol and stir. Further, 200 μl / well scintillator (MicroScint-20, Packard) is added and stirred. Radioactivity bound to cells is measured by Top Count (Packard), and Percent of Maximum Binding (PMB) is calculated by the following formula [Equation 1].
【００３２】[0032]
【数１】 ＰＭＢ：Percent of Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ0 ：最大結合量[Equation 1] PMB: Percent of Maximum Binding B: Value when a sample is added NSB: Non-specific Binding B 0 : Maximum binding amount
【００３３】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるヒトMIP-1α/RANTES
受容体親和性化合物またはその塩は、該スクリーニング
方法または該スクリーニング用キットを用いて被験化合
物（例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物、微生物発酵生産物、海洋生物抽出液、
植物抽出液、細胞抽出液、動物組織抽出液などが挙げら
れる。これらの被験化合物は新規な化合物であってもよ
いし、公知の化合物であってもよい。）の中から選択さ
れる化合物またはその塩である。被験化合物は、例えば
ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、微生物発酵生産物、海洋生物抽出液、植物抽出液、
細胞抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、新規な化
合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
これらのヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物または
その塩は、ヒトMIP-1α/RANTES受容体に対するリガンド
とヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質との結合を阻害
する化合物である。該化合物には、ヒトMIP-1α/RANTES
受容体を介した細胞刺激活性を有しない化合物（ヒトMI
P-1α/RANTES受容体アンタゴニスト）と該細胞刺激活性
を有する化合物（ヒトMIP-1α/RANTES受容体アゴニス
ト）またはそれらの塩が含まれる。本発明のスクリーニ
ング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ
る該ヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物の構造式の
一部を、付加、欠失あるいは置換などにより変換される
化合物なども本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるヒトMIP-1α/RANTES
受容体親和性化合物に含まれる。該ヒトMIP-1α/RANTES
受容体親和性化合物の塩としては、生理学的に許容され
る塩基塩又は酸付加塩が用いられるが、とりわけ生理学
的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩とし
ては、例えば無機酸（例えば塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メ
タンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用
いられる。Human MIP-1α / RANTES obtained by using the screening method or screening kit of the present invention
The receptor-affinity compound or salt thereof is a test compound (for example, peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, microbial fermentation product, marine organism extract, using the screening method or the screening kit).
Examples include plant extracts, cell extracts, animal tissue extracts and the like. These test compounds may be new compounds or known compounds. And a salt thereof. The test compound is, for example, peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, microbial fermentation product, marine organism extract, plant extract,
Examples thereof include cell extracts and animal tissue extracts, which may be novel compounds or known compounds.
These human MIP-1α / RANTES receptor affinity compounds or salts thereof are compounds that inhibit the binding between the ligand for the human MIP-1α / RANTES receptor and the human MIP-1α / RANTES receptor protein. The compound includes human MIP-1α / RANTES
Compounds that do not have receptor-mediated cell-stimulating activity (human MI
P-1α / RANTES receptor antagonist), a compound having the cell stimulating activity (human MIP-1α / RANTES receptor agonist), or a salt thereof. The present invention also includes compounds in which a part of the structural formula of the human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is converted by addition, deletion or substitution. MIP-1α / RANTES obtained using the screening method or screening kit
Included in receptor affinity compounds. The human MIP-1α / RANTES
As the salt of the receptor affinity compound, a physiologically acceptable base salt or acid addition salt is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid,
Salts such as tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
【００３４】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるヒトMIP-1α/RANTES
受容体親和性化合物またはその塩、すなわち、ヒトMIP-
1α/RANTES受容体アンタゴニストあるいはヒトMIP-1α/
RANTES受容体アゴニストは、安全で毒性のない化合物で
あり、種々のウイルス性疾患あるいは感染性疾患（例え
ば、急性ウイルス性脳炎、急性バクテリア性髄膜炎、ヘ
リコバクター・ピロリ感染症、肺炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝
炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスウイルス感染症、水痘−帯
状疱疹ウイルス感染症、エイズ感染症、インフルエンザ
感染症、侵襲性ブドウ状球菌感染症、結核など）、腫瘍
（例えば、膀胱ガン、乳ガン、子宮けいガン、慢性リン
パ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸ガン、多発性骨髄
腫、悪性骨髄腫、前立腺ガン、肺ガン、胃ガン、ホジキ
ン病など）、アレルギー性疾患（例えば、アトピー性皮
膚炎、アレルギー性鼻炎など）、炎症性疾患（例えば、
動脈硬化症、心臓移植後に発症する動脈硬化、（慢性）
関節リウマチ、腎炎など）、糖尿病性疾患（例えば、糖
尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性合併症、糖尿病性網膜
症、糖尿病性網膜炎、糖尿病性細小血管症など）、中枢
性疾患（例えば、アルツハイマー病、てんかん、発熱、
疼痛、痴呆など）、高脂血症、高コレステロール血症、
透析による血小板減少症、脊髄損傷、骨粗鬆症、潰瘍性
大腸炎、消化性潰瘍、敗血症（ショック）、肺・心臓に
おける再潅流障害、不安定狭心症、一過性脳虚血発作、
心弁膜症、臓器移植後拒絶反応、血管形成術後再狭窄、
全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、腎不全、子宮
内膜症、肺線維症、成人呼吸逼迫症候群などの予防・治
療剤として有用である。また、本発明のスクリーニング
方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるヒ
トMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩は、
ヒトMIP-1α/RANTES受容体に結合することができるの
で、受容体発現細胞や生体内におけるヒトMIP-1α/RANT
ES受容体タンパク質の検出または定量用の試薬としても
有用である。Human MIP-1α / RANTES obtained by using the screening method or screening kit of the present invention
Receptor affinity compound or its salt, that is, human MIP-
1α / RANTES receptor antagonist or human MIP-1α /
RANTES receptor agonists are safe and non-toxic compounds that are associated with various viral or infectious diseases (eg, acute viral encephalitis, acute bacterial meningitis, Helicobacter pylori infection, pneumonia, hepatitis A). , Hepatitis B, hepatitis C, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, AIDS infection, influenza infection, invasive staphylococcal infection, tuberculosis, etc., tumor (eg, bladder cancer, Breast cancer, uterine cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, colon cancer, multiple myeloma, malignant myeloma, prostate cancer, lung cancer, gastric cancer, Hodgkin's disease, etc., allergic diseases (eg, atopic) Dermatitis, allergic rhinitis, etc., inflammatory diseases (eg,
Arteriosclerosis, arteriosclerosis that develops after heart transplantation, (chronic)
Rheumatoid arthritis, nephritis, etc., diabetic diseases (eg, diabetes, diabetic nephropathy, diabetic complications, diabetic retinopathy, diabetic retinitis, diabetic microangiopathy, etc.), central diseases (eg Alzheimer's disease) Illness, epilepsy, fever,
Pain, dementia, etc.), hyperlipidemia, hypercholesterolemia,
Thrombocytopenia due to dialysis, spinal cord injury, osteoporosis, ulcerative colitis, peptic ulcer, sepsis (shock), reperfusion injury in lung / heart, unstable angina, transient cerebral ischemic attack,
Valvular heart disease, rejection after organ transplantation, restenosis after angioplasty,
It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, renal failure, endometriosis, pulmonary fibrosis, adult respiratory distress syndrome and the like. Further, a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention,
Since it can bind to the human MIP-1α / RANTES receptor, human MIP-1α / RANT in the receptor-expressing cells and in vivo
It is also useful as a reagent for detecting or quantifying ES receptor protein.
【００３５】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるヒトMIP-1α/RANTES
受容体親和性化合物またはその塩をヒトやほ乳哺動物
（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネ
コ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チ
ンパンジーなど）の医薬として使用する場合、常套手段
に従って実施することができる。例えば必要に応じて糖
衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロ
カプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそ
れ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または
懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例
えば該化合物またはその塩を生理学的に認められる単
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な容量がえられるようにするものである。錠剤、
カプセル剤などに混和することができる添加剤として
は、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガ
ム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースの
ような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸
などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのよう
な潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味
剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような
香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルであ
る場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状単体
を含有することができる。注射のための無菌組成物は注
射用蒸留水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰
子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁
させるなどの通常の製剤実施に従って処方することがで
きる。Human MIP-1α / RANTES obtained using the screening method or screening kit of the present invention
When a compound having affinity for a receptor or a salt thereof is used as a medicine for humans and mammals (mouse, rat, guinea pig, rabbit, chicken, cat, dog, sheep, pig, cow, monkey, baboon, chimpanzee, etc.), it is conventional. It can be carried out according to the means. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., which are optionally sugar-coated, orally, or aseptic solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, suspensions, etc. Can be used parenterally in the form of injection. For example, admixing the compound or a salt thereof with a physiologically acceptable substance, a flavoring agent, an excipient, a vehicle, an antiseptic, a stabilizer, a binder and the like in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. Can be manufactured by. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained. tablet,
Examples of additives that can be mixed with capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, swelling agents such as corn starch, gelatin and alginic acid. , Lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, red oil or cherry. When the dosage unit form is a capsule, a liquid simple substance such as oil and fat can be further contained in the above materials. Sterile compositions for injection may be formulated according to conventional pharmaceutical practices such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as distilled water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, palm oil, etc. it can.
【００３６】注射用の水溶液としては、例えば生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えばD-
ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナ
トリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例
えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール
（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８
０(TM)、HCO-50）などと併用してもよい。油性液として
はゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安
息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用しても
よい。また、緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナト
リウム緩衝液）、無痛化剤（例えば塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えばベンジルア
ルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合し
てもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに
充填させる。このようにして得られる製剤は安全で低毒
性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えばマウス、
ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジ
ー、ヒトなど）に対して投与することができる。該ヒト
MIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその塩の投与
量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、
一般的に成人（体重60 kgとして）においては、１日あ
たり約0.1から100 mg、好ましくは約1.0から50 mg、よ
り好ましくは約1.0から20 mgである。非経口的に投与す
る場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の
形では通常成人（体重60 kgとして）においては、１日
あたり約0.01から30 mg、好ましくは約0.1から20 mg、
より好ましくは約0.1から10 mg程度を静脈注射により投
与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60 k
g当たりに換算した量を投与することができる。Examples of the aqueous solution for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (for example, D-
Sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like, and suitable solubilizing agents such as alcohols (eg ethanol), polyalcohols (eg propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants ( For example polysorbate 8
0 (TM), HCO-50), etc. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. Also, mix with buffers (eg phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. You may. The prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans and mammals (for example, mouse,
Rat, guinea pig, rabbit, chicken, cat, dog,
Sheep, pigs, cows, monkeys, baboons, chimpanzees, humans, etc.). The human
The dose of the MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or its salt varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration,
Generally, in an adult human (as a body weight of 60 kg), the daily dose is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organs, symptoms, administration method, etc., but for example, in the form of an injection, in an adult (body weight 60 kg) a day About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg,
More preferably, about 0.1 to 10 mg is conveniently administered by intravenous injection. 60 k for other animals
An amount converted per g can be administered.
【００３７】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission
on Biochemistry Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
以下に示す。またアミノ酸に関して光学異性体があり得
る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャ−リボ核酸In this specification and the drawings, when abbreviations for bases and amino acids are used, IUPAC-IUB Commission
Abbreviations on Biochemistry Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are shown below. In addition, when an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger-ribonucleic acid
【００３８】 ＧあるいはGly ：グリシン ＡあるいはAla ：アラニン ＶあるいはVal ：バリン ＬあるいはLeu ：ロイシン ＩあるいはIle ：イソロイシン ＳあるいはSer ：セリンG or Gly: Glycine A or Ala: Alanine V or Val: Valine L or Leu: Leucine I or Ile: Isoleucine S or Ser: Serine
【００３９】 ＴあるいはThr ：スレオニン ＣあるいはCys ：システイン ＭあるいはMet ：メチオニン ＥあるいはGlu ：グルタミン酸 ＤあるいはAsp ：アスパラギン酸 ＫあるいはLys ：リシン ＲあるいはArg ：アルギニン ＨあるいはHis ：ヒスチジン ＦあるいはPhe ：フェニルアラニン ＹあるいはTyr ：チロシン ＷあるいはTrp ：トリプトファン ＰあるいはPro ：プロリン ＮあるいはAsn ：アスパラギン ＱあるいはGln ：グルタミン ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン ＦＢＳ ：ウシ胎児血清 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＣＨＯ ：チャイニーズハムスター卵巣
細胞 ＤＭＥＭ ：ダルベッコ変法イーグル培地 ＰＢＳ ：リン酸緩衝生理食塩水T or Thr: Threonine C or Cys: Cysteine M or Met: Methionine E or Glu: Glutamic acid D or Asp: Aspartic acid K or Lys: Lysine R or Arg: Arginine H or His: Histidine F or Phe: Phenylalanine Y Or Tyr: Tyrosine W or Trp: Tryptophan P or Pro: Proline N or Asn: Asparagine Q or Gln: Glutamine BSA: Bovine Serum Albumin FBS: Fetal Bovine Serum SDS: Sodium Dodecyl Sulfate CHO: Chinese Hamster Ovary Cell DMEM: Dulbecco's Modified Method Eagle Medium PBS: Phosphate buffered saline
【００４０】後述の実施例１で得られたプラスミドpCCR
を保持する形質転換体エシェリヒアコリ(Escherichia c
oli）JM109/pCCRは、平成７年１２月１９日に通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所(NIBH)に寄託番号
FERM BP-5342として寄託されている。また、後述の実
施例２で得られたCHO/CCRは平成７年１２月１９日に通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(NIBH)に寄
託番号FERM BP-5343として寄託されている。Plasmid pCCR obtained in Example 1 below
Escherichia c
oli) JM109 / pCCR was deposited at NIBH, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry, on December 19, 1995.
Deposited as FERM BP-5342. The CHO / CCR obtained in Example 2 described below was deposited on Dec. 19, 1995 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology (NIBH), Ministry of International Trade and Industry, under the deposit number FERM BP-5343. .
【００４１】本願明細書の配列表における各配列番号に
ついて以下に説明する。 〔配列番号：１〕ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質
をコードするDNAの塩基配列を表す。 〔配列番号：２〕ヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク質
のアミノ酸配列を表す。Each sequence number in the sequence listing in the present specification will be described below. [SEQ ID NO: 1] This shows the base sequence of DNA encoding human MIP-1α / RANTES receptor protein. [SEQ ID NO: 2] This shows the amino acid sequence of human MIP-1α / RANTES receptor protein.
【００４２】[0042]
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning; A Laborator
y Manual, 2nd ed. J. Sambrook, E. F. Fritsch and
T. Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor LaboratoriPr
ess)に記載されている方法に従った。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. In addition, the gene manipulation method using Escherichia coli is referred to as Molecular Cloning (A Laborator).
y Manual, 2nd ed. J. Sambrook, EF Fritsch and
T. Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor LaboratoriPr
ess).
【００４３】[0043]
【実施例１】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現ベクターの
構築 PCR 法によりhuman gland cDNA library（U-937 cells
activated by PMA,Clontech Laboratories Inc., Palo
Alto, CA, USA）からNeoteらの報告(Cell 72: 415 - 42
5 (1993))のKpn I (392)〜Hinc II(886)に相当する約 5
00 bpのDNA断片を得た。これをプローブとしてヒトMIP-
1α/RANTES受容体cDNAを得て、λgt11のEco RI部位にク
ローン化した。Neoteらの報告(Cell 72: 415−425(199
3))では未発表であった 5' 側の非翻訳領域の塩基配列
を決定し、5'側−30の位置にTthIII I サイトがあるこ
とを見出した。また、翻訳領域の全塩基配列を決定しNe
oteらの報告(Cell 72: 415−425 (1993))と完全に一致
していることを確認した。なお、塩基配列の決定は全て
蛍光DNAシークエンサー（Model 373A, AppliedBiosyste
ms Inc., Foster City, CA, USA）により行った。クロ
ーン化されたヒトMIP-1α/RANTES受容体 cDNA を、以下
のようにして動物細胞発現用ベクターであるpAKKO-111H
のSal IおよびNhe I部位に導入し、プラスミド pCCR を
構築した〔図２〕。まず、上記のλgt 11をEco RIで処
理することにより2つの断片を得た。これらをpUC19（宝
酒造、京都）のEco RI部位に導入し、プラスミドpCR1と
プラスミドpCR2を得た。次に、5'側と3'側の非翻訳領域
に切断部位がある制限酵素TthIII IとBst XIを用いてpC
R1とpCR2の一方のEco RI部位を削除した。非翻訳領域の
Eco RI部位を削除したこれら2つのプラスミドをSalI -E
co RIおよびXba I - Eco RIで消化することにより、2つ
のDNA断片を得た。これらをpAKKO-111HのSal IとNhe I
部位に導入してpCCRを得た。Example 1 Construction of Human MIP-1α / RANTES Receptor Expression Vector The human gland cDNA library (U-937 cells was analyzed by the PCR method.
activated by PMA, Clontech Laboratories Inc., Palo
Alto, CA, USA) reported by Neote et al. (Cell 72: 415-42)
5 (1993)) Kpn I (392) to Hinc II (886)
A 00 bp DNA fragment was obtained. Using this as a probe, human MIP-
1α / RANTES receptor cDNA was obtained and cloned into the EcoRI site of λgt11. Report by Neote et al. (Cell 72: 415-425 (199
In 3)), we determined the nucleotide sequence of the untranslated region on the 5'side, which had not been published, and found that there was a TthIII I site at position -30 on the 5'side. In addition, the entire base sequence of the translation region was determined and Ne
It was confirmed to be completely in agreement with the report of ote et al. (Cell 72: 415-425 (1993)). All nucleotide sequences were determined using a fluorescent DNA sequencer (Model 373A, Applied Biosyste
ms Inc., Foster City, CA, USA). The cloned human MIP-1α / RANTES receptor cDNA was cloned into the animal cell expression vector pAKKO-111H as follows.
Was introduced into Sal I and Nhe I sites to construct plasmid pCCR [FIG. 2]. First, two fragments were obtained by treating λgt 11 above with Eco RI. These were introduced into the Eco RI site of pUC19 (Takara Shuzo, Kyoto) to obtain plasmids pCR1 and pCR2. Then, using the restriction enzymes TthIII I and Bst XI, which have cleavage sites in the 5'and 3'untranslated regions, pC was used.
One Eco RI site of R1 and pCR2 was deleted. Untranslated region
These two plasmids with the Eco RI site deleted were SalI -E
Two DNA fragments were obtained by digestion with co RI and Xba I -Eco RI. These are Sal I and Nhe I of pAKKO-111H.
Introduced into the site to obtain pCCR.
【００４４】[0044]
【実施例２】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞株
の樹立 ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現プラスミドpCCRをリン酸
カルシウム法によりCHO(dhfr-)細胞へ導入した。この導
入はCellPhect transfection kit（PharmaciaBiotech,
Uppsala, Sweden）を用いて添付説明書に従って行っ
た。CHO(dhfr-細胞を直径10 cmのシャーレに1x105 cell
s/10 ml/dishでまき、核酸（+）の非選択培地（10%透析
FBS(GIBCO BRL, Life Technologies Inc., Grand Islan
d, NY, USA)/MEM-α with RNA and DNA (GIBCO BRL)）
で24時間培養した。これらのシャーレに塩化セシウムに
よる精製を２回繰り返して得られたpCCR DNA（10μg/di
sh）とリン酸カルシウムの共沈懸濁物を均一に一滴ずつ
落した。CO2インキュベーターで37℃、0.5% CO2の条件
下で6時間培養した後、非選択培地で２回洗浄し、10ml/
dishの非選択培地を加えて2日間さらに培養した。その
後、核酸（-）の選択培地（10%透析FBS/MEM-α without
RNA and DNA (GIBCO BRL)）にて4倍に拡大し培養を続
けた。3日ごとにフレッシュな選択培地に交換した。選
択培地での培養10日後に肉眼でコロニーが確認できた。
さらに4日後にそれらのコロニー（dhfr+に形質転換した
細胞）を拾った。dhfr+に形質転換した120のクローンに
対する125I-RANTES(Du Pont Company, Wilmington, DE,
USA)の結合量を調べ、結合量の多いクローンを限界希
釈法により再クローン化し、ヒトMIP-1α/RANTES受容体
を高発現している細胞株CHO/CCRを得た。Example 2 Establishment of CHO cell line expressing human MIP-1α / RANTES receptor Human MIP-1α / RANTES receptor expressing plasmid pCCR was introduced into CHO (dhfr − ) cells by the calcium phosphate method. This introduction is based on the CellPhect transfection kit (PharmaciaBiotech,
Uppsala, Sweden) according to the attached instructions. CHO (dhfr - cells 1x10 5 cells in a Petri dish with a diameter of 10 cm.
s / 10 ml / dish, and non-selective medium for nucleic acid (+) (10% dialysis
FBS (GIBCO BRL, Life Technologies Inc., Grand Islan
d, NY, USA) / MEM-α with RNA and DNA (GIBCO BRL))
The cells were cultured for 24 hours. Purification with cesium chloride was repeated twice on these dishes to obtain pCCR DNA (10 μg / di
sh) and calcium phosphate co-precipitate suspension was dropped uniformly. After culturing in a CO 2 incubator at 37 ° C and 0.5% CO 2 for 6 hours, the cells were washed twice with a non-selective medium and 10 ml /
Non-selective medium in a dish was added and further cultured for 2 days. Then, select medium for nucleic acid (-) (10% dialyzed FBS / MEM-α without
RNA and DNA (GIBCO BRL)) was used to expand 4 times and culture was continued. The medium was replaced with a fresh selective medium every 3 days. After 10 days of culture in the selective medium, colonies could be visually confirmed.
After a further 4 days, those colonies (dhfr + transformed cells) were picked up. 125 I-RANTES against 120 clones transformed into dhfr + (Du Pont Company, Wilmington, DE,
USA), and clones with a high binding amount were recloned by the limiting dilution method to obtain a cell line CHO / CCR highly expressing the human MIP-1α / RANTES receptor.
【００４５】[0045]
【実施例３】結合アッセイによるヒトMIP-1α/RANTES受
容体発現の確認125 I-RANTESおよび125I-MIP-1α（Du Pont Company）を
用いた結合アッセイを以下のように行った。96 ウェル
マイクロプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）に 5 x
104 / 100μl / well のCHO/CCR細胞またはベクタープ
ラスミドpAKKO-111HをトランスフェクトしたCHO細胞（m
ock transfectants）をまき24 時間培養した。培地を除
き、DMEM/ 0.5 % BSA で希釈した5 nMの125I-RANTESあ
るいは125I-MIP-1αを50 μl / well 加え、室温で30分
間インキュベートした。その後200μl / well のPBSで2
回洗浄し、100 μl / wellの0.1 N NaOH / 1 % SDSを
加えて細胞に結合したリガンドを溶出した。結合量の測
定はγ−カウンター（Cobra II, Packard Instrument C
ompany, Meriden, CT, USA ）で行った。図３はCHO/C
CR細胞に対する125I-RANTESの結合を、また図４は125I-
MIP-1αの結合をそれぞれ示す。これに対して、mock tr
ansfectantsに対する結合量はいずれも低値であった。
これらの結果から、CHO/CCR細胞でのヒトMIP-1α/RANTE
S受容体の発現が確認された。Example 3 Confirmation of Human MIP-1α / RANTES Receptor Expression by Binding Assay A binding assay using 125 I-RANTES and 125 I-MIP-1α (Du Pont Company) was performed as follows. 5x in 96-well microplates (Nunc, Roskilde, Denmark)
10 4 / 100μl / well of CHO / CCR cells or vector plasmid pAKKO-111H Transfected CHO cells (m
ock transfectants) were sowed and cultured for 24 hours. After removing the medium, 5 μM of 125 I-RANTES or 125 I-MIP-1α diluted with DMEM / 0.5% BSA was added at 50 μl / well and incubated at room temperature for 30 minutes. Then 2 with 200 μl / well PBS
After washing twice, 100 μl / well of 0.1 N NaOH / 1% SDS was added to elute the cell-bound ligand. The amount of binding was measured using a γ-counter (Cobra II, Packard Instrument C
Ompany, Meriden, CT, USA). Figure 3 shows CHO / C
The binding of 125 I-RANTES for CR cells, also 4 125 I-
The binding of MIP-1α is shown respectively. On the other hand, mock tr
The amount of binding to ansfectants was low.
From these results, human MIP-1α / RANTE in CHO / CCR cells
The expression of S receptor was confirmed.
【００４６】[0046]
【実施例４】種々の CC ケモカインに対するヒトMIP-1
α/RANTES受容体発現CHO細胞（CHO/CCR細胞）の遊走 96ウェルマイクロケモタキシスチャンバー（NeuroProb
e, Inc., Cabin John,MD, USA）を用いて遊走アッセイ
を行った。ポアサイズ 5 μm のポリカーボネートフレ
ームフィルター（NeuroProbe）を、PBSで希釈した10 μ
g/mlのウシフィブロネクチン溶液に室温で10分間浸漬し
たのち風乾することにより前処理を施した。下室にDMEM
/0.5% BSAに溶解した 37 μlの 種々の濃度の CC ケモ
カイン（RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1（いずれもP
epro Tech））を添加し、上室に1 x106 cells/mlのCHO/
CCR細胞を200 μl 添加して、37℃で4時間インキュベー
トした。フィルター下面に遊走したCHO/CCR細胞をDiff-
Quick (国際試薬，神戸)で固定染色し、プレートリーダ
ー（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA）で595
nm の吸光度を測定した。いずれの測定値も２ウェルの
平均値を示した。図５に示すように、CHO/CCR細胞はmoc
k transfectantsに比較して 50 nM RANTESに応答して明
らかに遊走することがわかった。RANTESに応答したCHO/
CCR細胞の遊走はRANTESの濃度に依存し、さらにMIP-1α
に対しても濃度依存的に遊走した。しかしながら、MIP-
1βやMCP-1に対しては遊走しなかった（図６）。Example 4 Human MIP-1 against various CC chemokines
Migration of α / RANTES receptor-expressing CHO cells (CHO / CCR cells) 96-well micro chemotaxis chamber (NeuroProb
e., Inc., Cabin John, MD, USA). A polycarbonate frame filter (NeuroProbe) with a pore size of 5 μm diluted with PBS to 10 μ
Pretreatment was performed by immersing in a g / ml bovine fibronectin solution at room temperature for 10 minutes and then air-drying. DMEM in lower chamber
37 μl of various concentrations of CC chemokines (RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 (all P
epro Tech)) is added to the upper chamber of 1 x 10 6 cells / ml of CHO /
200 μl of CCR cells were added and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Diff-migrate CHO / CCR cells that had migrated to the bottom of the filter.
Fixed staining with Quick (Kokusai Reagent, Kobe), 595 with plate reader (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)
The absorbance at nm was measured. All the measured values showed the average value of 2 wells. As shown in FIG. 5, CHO / CCR cells are moc
It was found to clearly migrate in response to 50 nM RANTES compared to k transfectants. CHO / in response to RANTES
Migration of CCR cells depends on the concentration of RANTES, and further MIP-1α
Also migrated in a concentration-dependent manner. However, MIP-
It did not migrate to 1β or MCP-1 (Fig. 6).
【００４７】[0047]
【実施例５】CHO/CCR細胞による細胞内Ca2+アッセイ CHO/CCR細胞をmodified Gey's buffer(MGB)(5 mM KCl,
147 mM NaCl, 0.22 mMKH2PO4, 1.1 mM Na2HPO4, 5.5 mM
glucose, 0.3 mM MgSO4, 1 mM MgCl2, 10 mMHEPES, pH
7.4)で２回洗浄したのち、5 x 106/ml になるようにMG
Bに懸濁した。蛍光指示薬であるfura-PE3/AM(Teflabs,
Austin, TX, USA) を終濃度2μMになるように添加して
室温で30分間放置することにより細胞内に取り込ませ
た。1 mMCaCl2を含むMGBで２回洗浄したのち、5 x 106/
mlになるように1 mM CaCl2を含むMGBに懸濁した。細胞
内Ca2+濃度の測定はF-2000分光蛍光光度計（日立製作
所、東京）で行った。CHO/CCR細胞を100 nM RANTESで刺
激することにより、細胞内Ca2+濃度の一過性の上昇が観
察された。この上昇はmock transfectantsではみられな
かった(図７)。CHO/CCR細胞は、RANTESのみならず MIP-
1αにも応答して細胞内Ca2+濃度が一過性に上昇した
が、MIP-1βに対する応答性は低く、MCP-1にはほとんど
応答しなかった(図８)。Example 5 Intracellular Ca 2+ Assay Using CHO / CCR Cells CHO / CCR cells were treated with modified Gey's buffer (MGB) (5 mM KCl,
147 mM NaCl, 0.22 mM KH 2 PO 4 , 1.1 mM Na 2 HPO 4 , 5.5 mM
glucose, 0.3 mM MgSO 4 , 1 mM MgCl 2 , 10 mM HEPES, pH
After washing twice with 7.4), MG to make 5 x 10 6 / ml
Suspended in B. A fluorescent indicator, fura-PE3 / AM (Teflabs,
Austin, TX, USA) was added to a final concentration of 2 μM and left at room temperature for 30 minutes to be incorporated into cells. After washing twice with MGB containing 1 mM CaCl 2 , 5 x 10 6 /
The cells were suspended in MGB containing 1 mM CaCl 2 so that the amount became ml. The intracellular Ca 2+ concentration was measured with an F-2000 spectrofluorometer (Hitachi, Tokyo). A transient increase in intracellular Ca 2+ concentration was observed by stimulating CHO / CCR cells with 100 nM RANTES. This increase was not seen in mock transfectants (Fig. 7). CHO / CCR cells are not only RANTES but also MIP-
The intracellular Ca 2+ concentration transiently increased in response to 1α, but the responsiveness to MIP-1β was low, and almost no response to MCP-1 (FIG. 8).
【００４８】[0048]
【実施例６】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞（C
HO/CCR細胞）を用いた125I-RANTES 結合阻害化合物のス
クリーニング 96 ウェルマイクロプレート（ CulturPlate, Packard）
に CHO/CCR細胞を 5x 104 /100μl/well でまき 24 時
間培養した。培地を除いた後、35 μl/wellのDMEM/0.5
% BSA、 ついでDMEM/0.5 % BSA で希釈した 被験化合
物を5 μl/well、さらに10 μl/well の 125I-RANTES
（終濃度 100 - 200 pM）を順次添加し、室温で 30 〜
40 分間インキュベートした。その後 200 μl/well の
PBS で 2回洗浄し、25 μl/well のエタノールを添加し
て撹拌した。さらに 200 μl/well のシンチレーター
（ MicroScint-20, Packard）を添加して撹拌したの
ち、細胞に結合した125I-RANTESの放射活性をTopCount
（Packard ）で測定した。被験化合物を添加しない場合
の結合量を100%、ベクタープラスミドpAKKO-111Hをトラ
ンスフェクトしたCHO細胞（mock transfectants）への
結合を0%とし、125I-RANTESの結合を50%阻害する濃度
（IC50値）を求めた。上記の方法で種々の化合物のスク
リーニングを行った結果、精神***病および躁病の治療
薬であるハロペリドール（haloperidol）Example 6 Human MIP-1α / RANTES receptor-expressing CHO cells (C
Screening of 125 I-RANTES binding inhibitory compounds using HO / CCR cells) 96-well microplate (CulturPlate, Packard)
The CHO / CCR cells were seeded 24 hours at 5x 10 4 / 100μl / well into. After removing the medium, 35 μl / well DMEM / 0.5
% BSA, then 5 μl / well of test compound diluted in DMEM / 0.5% BSA, and 10 μl / well of 125 I-RANTES
(Final concentration 100-200 pM) was added sequentially, and at room temperature 30 ~
Incubated for 40 minutes. Then 200 μl / well
After washing twice with PBS, 25 μl / well of ethanol was added and stirred. After adding 200 μl / well scintillator (MicroScint-20, Packard) and stirring, the radioactivity of 125 I-RANTES bound to the cells was counted by TopCount.
(Packard). The binding amount without addition of the test compound is 100%, the binding to CHO cells (mock transfectants) transfected with the vector plasmid pAKKO-111H is 0%, and the concentration that inhibits the binding of 125 I-RANTES by 50% (IC 50 values) were calculated. As a result of screening various compounds by the above method, haloperidol, which is a therapeutic drug for schizophrenia and mania
【００４９】[0049]
【化１】 Embedded image
【００５０】がCHO/CCR細胞に対する125I-RANTESの結合
を阻害することを見出した。ハロペリドールはCHO/CCR
細胞に対する125I-MIP-1αの結合をも阻害した。そのIC
50値はそれぞれ2 μMおよび4 μMであった〔表１〕。Was found to inhibit the binding of 125 I-RANTES to CHO / CCR cells. Haloperidol is CHO / CCR
It also inhibited the binding of 125 I-MIP-1α to cells. That IC
The 50 values were 2 μM and 4 μM, respectively [Table 1].
【００５１】[0051]
【表１】 [Table 1]
【００５２】[0052]
【実施例７】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞（C
HO/CCR細胞）の遊走アッセイにおけるハロペリドールの
阻害活性 実施例４に述べた方法により、RANTESに対するCHO/CCR
細胞の遊走アッセイにおけるハロペリドールの阻害活性
を調べた。下室にはDMEM/0.5% BSAに溶解した37 μlの
40 nMの RANTESを添加し、上室にまずDMEM/0.5 % BSAで
希釈した種々の濃度のハロペリドール 100μlを添加
し、ついで2 x 106 cells/mlのCHO/CCR細胞を100 μl
添加して、37℃で4時間インキュベートした。フィルタ
ー下面に遊走したCHO/CCR細胞をDiff-Quickで固定染色
し、プレートリーダーで595 nm の吸光度を測定した。
いずれの測定もduplicateで行った。下室に40 nMの濃度
のRANTESを添加し上室にハロペリドールを添加しない場
合の吸光度を100%、下室にDMEM/0.5 % BSAのみを添加し
上室にハロペリドールを添加しない場合の吸光度を0%と
して、CHO/CCR細胞の遊走を50%阻害する濃度（IC50値）
を求めた。〔表１〕に示したように、ハロペリドールの
IC50値は2 μMであった。[Example 7] Human MIP-1α / RANTES receptor-expressing CHO cells (C
HO / CCR cells) inhibitory activity of haloperidol in migration assay CHO / CCR against RANTES by the method described in Example 4.
The inhibitory activity of haloperidol in the cell migration assay was examined. The lower chamber contains 37 μl of DMEM / 0.5% BSA.
Add 40 nM RANTES, then add 100 μl of various concentrations of haloperidol diluted in DMEM / 0.5% BSA to the upper chamber first, then 100 μl of 2 x 10 6 cells / ml CHO / CCR cells.
Add and incubate at 37 ° C. for 4 hours. CHO / CCR cells that had migrated to the lower surface of the filter were fixed and stained with Diff-Quick, and the absorbance at 595 nm was measured with a plate reader.
All measurements were performed in duplicate. Absorbance is 100% when RANTES at a concentration of 40 nM is added to the lower chamber and haloperidol is not added to the upper chamber, and 0% when DMEM / 0.5% BSA is added to the lower chamber and haloperidol is not added to the upper chamber. %, The concentration that inhibits migration of CHO / CCR cells by 50% (IC 50 value)
I asked. As shown in [Table 1],
The IC 50 value was 2 μM.
【００５３】[0053]
【実施例８】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞（C
HO/CCR細胞）による細胞内Ca2+アッセイにおけるハロペ
リドールの阻害活性 実施例５に述べた方法により、細胞内Ca2+アッセイにお
けるハロペリドールの阻害活性を調べた。すなわち、CH
O/CCR細胞懸濁液に10μMのハロペリドールを添加し、そ
の150秒後に10 nMのRANTESを添加して、RANTESの誘因す
る細胞内Ca2+濃度の上昇に対するハロペリドールの作用
を調べた。その結果、ハロペリドール無添加時の細胞内
Ca2+濃度上昇のピーク濃度を100%とした時、10μMのハ
ロペリドール添加によりそのピーク濃度は31%にまで低
下した。さらに、10μMのハロペリドールの添加のみで
は、胞内Ca2+濃度上昇の一過性の上昇は認められなかっ
た。この結果は、実施例６および実施例７の結果ととも
に、ハロペリドールはヒトMIP-1α/RANTES受容体に対し
てアゴニストして作用せず、アンタゴニストとして作用
することを示す。また、ハロペリドールはヒトMIP-1α/
RANTES受容体のリガンドであるならばRANTESやMIP-1α
など種類を問わずその活性を阻害することを示す。Example 8 CHO cells expressing human MIP-1α / RANTES receptor (C
Inhibitory activity of haloperidol in intracellular Ca 2+ assay by HO / CCR cells) The inhibitory activity of haloperidol in intracellular Ca 2+ assay was examined by the method described in Example 5. That is, CH
To the O / CCR cell suspension, 10 μM of haloperidol was added, and 150 seconds later, 10 nM of RANTES was added to examine the effect of haloperidol on RANTES-induced increase in intracellular Ca 2+ concentration. As a result, intracellular cells without haloperidol
When the peak concentration of Ca 2+ concentration increase was set to 100%, the addition of 10 μM haloperidol lowered the peak concentration to 31%. Furthermore, the transient increase of intracellular Ca 2+ concentration was not observed by the addition of 10 μM haloperidol alone. This result, together with the results of Example 6 and Example 7, shows that haloperidol does not act as an agonist on the human MIP-1α / RANTES receptor but acts as an antagonist. In addition, haloperidol is human MIP-1α /
RANTES or MIP-1α if it is a ligand of RANTES receptor
It indicates that the activity is inhibited regardless of type.
【００５４】[0054]
【発明の効果】本発明のヒトMIP-1α/RANTES受容体タン
パク質またはその部分ペプチドもしくはそれらの塩、ま
たはヒトMIP-1α/RANTES受容体を有するCHO細胞もしく
は該細胞膜画分を用いて、ヒトMIP-1α/RANTES受容体親
和性化合物またはその塩のスクリーニングを行うことが
でき、それにより、該化合物を効率よく選択することが
できる。したがって、種々のウイルス性疾患あるいは感
染性疾患（例えば、急性ウイルス性脳炎、急性バクテリ
ア性髄膜炎、ヘリコバクター・ピロリ感染症、肺炎、Ａ
型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスウイルス感
染症、水痘−帯状疱疹ウイルス感染症、エイズ感染症、
インフルエンザ感染症、侵襲性ブドウ状球菌感染症、結
核など）、腫瘍（例えば、膀胱ガン、乳ガン、子宮けい
ガン、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸ガ
ン、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫、前立腺ガン、肺ガン、
胃ガン、ホジキン病など）、アレルギー性疾患（例え
ば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎など）、炎症
性疾患（例えば、動脈硬化症、心臓移植後に発症する動
脈硬化、（慢性）関節リウマチ、腎炎など）、糖尿病性
疾患（例えば、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性合併
症、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜炎、糖尿病性細小血
管症など）、中枢性疾患（例えば、アルツハイマー病、
てんかん、発熱、疼痛、痴呆など）、高脂血症、高コレ
ステロール血症、透析による血小板減少症、脊髄損傷、
骨粗鬆症、潰瘍性大腸炎、消化性潰瘍、敗血症（ショッ
ク）、肺・心臓における再潅流障害、不安定狭心症、一
過性脳虚血発作、心弁膜症、臓器移植後拒絶反応、血管
形成術後再狭窄、全身性エリテマトーデス、多発性硬化
症、腎不全、子宮内膜症、肺線維症、成人呼吸逼迫症候
群などの予防・治療剤を早期に提供できる。また、本発
明のヒトMIP-1α/RANTES受容体を含有するCHO細胞（CHO
/CCR細胞)は、ヒトMIP-1α/RANTES受容体を安定的に高
発現できる細胞である。EFFECTS OF THE INVENTION Human MIP-1α / RANTES receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, or a CHO cell having the human MIP-1α / RANTES receptor or a cell membrane fraction thereof is used for human MIP. -1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof can be screened, whereby the compound can be efficiently selected. Therefore, various viral or infectious diseases (eg, acute viral encephalitis, acute bacterial meningitis, Helicobacter pylori infection, pneumonia, A
Hepatitis B, hepatitis B, hepatitis C, herpes simplex virus infection, varicella-zoster virus infection, AIDS infection,
Influenza infection, invasive staphylococcal infection, tuberculosis, etc., tumor (eg, bladder cancer, breast cancer, uterine cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, colon cancer, multiple myeloma, malignant myeloma) , Prostate cancer, lung cancer,
Gastric cancer, Hodgkin's disease, etc., allergic diseases (eg, atopic dermatitis, allergic rhinitis, etc.), inflammatory diseases (eg, arteriosclerosis, arteriosclerosis after heart transplantation, (chronic) rheumatoid arthritis, nephritis) Etc.), diabetic diseases (eg, diabetes, diabetic nephropathy, diabetic complications, diabetic retinopathy, diabetic retinitis, diabetic microangiopathy, etc.), central diseases (eg, Alzheimer's disease,
Epilepsy, fever, pain, dementia, etc.), hyperlipidemia, hypercholesterolemia, thrombocytopenia due to dialysis, spinal cord injury,
Osteoporosis, ulcerative colitis, peptic ulcer, sepsis (shock), pulmonary / heart reperfusion injury, unstable angina, transient cerebral ischemic attack, valvular heart disease, rejection after organ transplantation, angiogenesis A prophylactic / therapeutic agent for postoperative restenosis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, renal failure, endometriosis, pulmonary fibrosis, adult respiratory distress syndrome, etc. can be provided at an early stage. In addition, CHO cells containing the human MIP-1α / RANTES receptor of the present invention (CHO
/ CCR cell) is a cell capable of stably highly expressing the human MIP-1α / RANTES receptor.
【００５５】[0055]
【配列番号：１】 配列の長さ：１０６５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGGAAACTC CAAACACCAC AGAGGACTAT GACACGACCA CAGAGTTTGA CTATGGGGAT 60 GCAACTCCGT GCCAGAAGGT GAACGAGAGG GCCTTTGGGG CCCAACTGCT GCCCCCTCTG 120 TACTCCTTGG TATTTGTCAT TGGCCTGGTT GGAAACATCC TGGTGGTCCT GGTCCTTGTG 180 CAATACAAGA GGCTAAAAAA CATGACCAGC ATCTACCTCC TGAACCTGGC CATTTCTGAC 240 CTGCTCTTCC TGTTCACGCT TCCCTTCTGG ATCGACTACA AGTTGAAGGA TGACTGGGTT 300 TTTGGTGATG CCATGTGTAA GATCCTCTCT GGGTTTTATT ACACAGGCTT GTACAGCGAG 360 ATCTTTTTCA TCATCCTGCT GACGATTGAC AGGTACCTGG CCATCGTCCA CGCCGTGTTT 420 GCCTTGCGGG CACGGACCGT CACTTTTGGT GTCATCACCA GCATCATCAT TTGGGCCCTG 480 GCCATCTTGG CTTCCATGCC AGGCTTATAC TTTTCCAAGA CCCAATGGGA ATTCACTCAC 540 CACACCTGCA GCCTTCACTT TCCTCACGAA AGCCTACGAG AGTGGAAGCT GTTTCAGGCT 600 CTGAAACTGA ACCTCTTTGG GCTGGTATTG CCTTTGTTGG TCATGATCAT CTGCTACACA 660 GGGATTATAA AGATTCTGCT AAGACGACCA AATGAGAAGA AATCCAAAGC TGTCCGTTTG 720 ATTTTTGTCA TCATGATCAT CTTTTTTCTC TTTTGGACCC CCTACAATTT GACTATACTT 780 ATTTCTGTTT TCCAAGACTT CCTGTTCACC CATGAGTGTG AGCAGAGCAG ACATTTGGAC 840 CTGGCTGTGC AAGTGACGGA GGTGATCGCC TACACGCACT GCTGTGTCAA CCCAGTGATC 900 TACGCCTTCG TTGGTGAGAG GTTCCGGAAG TACCTGCGGC AGTTGTTCCA CAGGCGTGTG 960 GCTGTGCACC TGGTTAAATG GCTCCCCTTC CTCTCCGTGG ACAGGCTGGA GAGGGTCAGC 1020 TCCACATCTC CCTCCACAGG GGAGCATGAA CTCTCTGCTG GGTTC 1065[SEQ ID NO: 1] Sequence length: 1065 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA Characterization method: S sequence ATGGAAACTC CAAACACCAC AGAGGACTAT GACACGACCA CAGAGTTTGA CTATGGGGAT 60 GCAACTCCGT GCCAGAAGGT GAACGAGAGG GCCTTTGGGG CCCAACTGCT GCCCCCTCTG 120 TACTCCTTGG TATTTGTCAT TGGCCTGGTT GGAAACATCC TGGTGGTCCT GGTCCTTGTG 180 CAATACAAGA GGCTAAAAAA CATGACCAGC ATCTACCTCC TGAACCTGGC CATTTCTGAC 240 CTGCTCTTCC TGTTCACGCT TCCCTTCTGG ATCGACTACA AGTTGAAGGA TGACTGGGTT 300 TTTGGTGATG CCATGTGTAA GATCCTCTCT GGGTTTTATT ACACAGGCTT GTACAGCGAG 360 ATCTTTTTCA TCATCCTGCT GACGATTGAC AGGTACCTGG CCATCGTCCA CGCCGTGTTT 420 GCCTTGCGGG CACGGACCGT CACTTTTGGT GTCATCACCA GCATCATCAT TTGGGCCCTG 480 GCCATCTTGG CTTCCATGCC AGGCTTATAC TTTTCCAAGA CCCAATGGGA ATTCACTCAC 540 CACACCTGCA GCCTTCACTT TCCTCACGAA AGCCTACGAG AGTGGAAGCT GTTTCAGGCT 600 CTGAAACTGA ACCTCTTTGG GCTGGTATTG CCTTTGTTGG TCATGATCAT CTGCTACACA 660 GGGATTATAA AGCGCACCTGCT A AATGAGAAGA AATCCAAAGC TGTCCGTTTG 720 ATTTTTGTCA TCATGATCAT CTTTTTTCTC TTTTGGACCC CCTACAATTT GACTATACTT 780 ATTTCTGTTT TCCAAGACTT CCTGTTCACC CATGAGTGTG AGCAGAGCAG ACATTTGGAC 840 CTGGCTGTGC AAGTGACGGA GGTGATCGCC TACACGCACT GCTGTGTCAA CCCAGTGATC 900 TACGCCTTCG TTGGTGAGAG GTTCCGGAAG TACCTGCGGC AGTTGTTCCA CAGGCGTGTG 960 GCTGTGCACC TGGTTAAATG GCTCCCCTTC CTCTCCGTGG ACAGGCTGGA GAGGGTCAGC 1020 TCCACATCTC CCTCCACAGG GGAGCATGAA CTCTCTGCTG GGTTC 1065
【００５６】[0056]
【配列番号：２】 配列の長さ：３５５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Glu Phe 1 5 10 15 Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys Val Asn Glu Arg Ala Phe 20 25 30 Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Val Ile Gly 35 40 45 Leu Val Gly Asn Ile Leu Val Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Lys Arg 50 55 60 Leu Lys Asn Met Thr Ser Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Phe Thr Leu Pro Phe Trp Ile Asp Tyr Lys Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Trp Val Phe Gly Asp Ala Met Cys Lys Ile Leu Ser Gly Phe 100 105 110 Tyr Tyr Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr 115 120 125 Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Ile Ile Trp Ala Leu 145 150 155 160 Ala Ile Leu Ala Ser Met Pro Gly Leu Tyr Phe Ser Lys Thr Gln Trp 165 170 175 Glu Phe Thr His His Thr Cys Ser Leu His Phe Pro His Glu Ser Leu 180 185 190 Arg Glu Trp Lys Leu Phe Gln Ala Leu Lys Leu Asn Leu Phe Gly Leu 195 200 205 Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ile Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys 210 215 220 Ile Leu Leu Arg Arg Pro Asn Glu Lys Lys Ser Lys Ala Val Arg Leu 225 230 235 240 Ile Phe Val Ile Met Ile Ile Phe Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Ile Leu Ile Ser Val Phe Gln Asp Phe Leu Phe Thr His Glu 260 265 270 Cys Glu Gln Ser Arg His Leu Asp Leu Ala Val Gln Val Thr Glu Val 275 280 285 Ile Ala Tyr Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val 290 295 300 Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe His Arg Arg Val 305 310 315 320 Ala Val His Leu Val Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp Arg Leu 325 330 335 Glu Arg Val Ser Ser Thr Ser Pro Ser Thr Gly Glu His Glu Leu Ser 340 345 350 Ala Gly Phe 355[SEQ ID NO: 2] Sequence length: 355 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Met Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Glu Phe 1 5 10 15 Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys Val Asn Glu Arg Ala Phe 20 25 30 Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Val Ile Gly 35 40 45 Leu Val Gly Asn Ile Leu Val Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Lys Arg 50 55 60 Leu Lys Asn Met Thr Ser Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Phe Thr Leu Pro Phe Trp Ile Asp Tyr Lys Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Trp Val Phe Gly Asp Ala Met Cys Lys Ile Leu Ser Gly Phe 100 105 110 Tyr Tyr Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr 115 120 125 Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Ile Ile Trp Ala Leu 145 150 155 160 Ala Ile Leu Ala Ser Met Pro Gly Leu Tyr Phe Ser Lys Thr Gln Trp 165 170 175 Glu Phe Thr His His Thr Cys Ser Leu His Phe Pro His Glu Ser Leu 180 185 190 Arg Glu Trp Lys Leu Phe Gln Ala Leu Lys Leu Asn Leu Phe Gly Leu 195 200 205 Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ile Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys 210 215 220 Ile Leu Leu Arg Arg Pro Asn Glu Lys Lys Ser Lys Ala Val Arg Leu 225 230 235 240 Ile Phe Val Ile Met Ile Ile Phe Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Ile Leu Ile Ser Val Phe Gln Asp Phe Leu Phe Thr His Glu 260 265 270 Cys Glu Gln Ser Arg His Leu Asp Leu Ala Val Gln Val Thr Glu Val 275 280 285 Ile Ala Tyr Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val 290 295 300 Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe His Arg Arg Val 305 310 315 320 Ala Val His Leu Val Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp Arg Leu 325 330 335 Glu Arg Val Ser Ser Thr Ser Pro Ser Thr Gly Glu His Glu Leu Ser 340 345 350 Ala Gly Phe 355
【００５７】[0057]
【図１】λgt 11の Eco RI 部位にクローン化したヒトM
IP-1α/RANTES受容体のコード領域をふくむ塩基配列
と、それにコードされるアミノ酸配列を示す。FIG. 1 Human M cloned into the Eco RI site of λgt 11.
The nucleotide sequence including the coding region of IP-1α / RANTES receptor and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence are shown.
【図２】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現ベクターpCCRの
構築方法および構築図を示す。FIG. 2 shows a construction method and construction diagram of a human MIP-1α / RANTES receptor expression vector pCCR.
【図３】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞（CHO/C
CR細胞）に対する125I-RANTESの結合。96 ウェルプレー
トでコンフルエントとなった CHO/CCR細胞およびmock t
ransfectants に 5 nMの125I-RANTESを加え、細胞への
結合を調べた。値は、3 ウェルの測定値の平均値±標準
誤差で表した。FIG. 3 Human MIP-1α / RANTES receptor-expressing CHO cells (CHO / C
125 I-RANTES binding to CR cells). CHO / CCR cells and mock t confluent in 96-well plates
5 nM of 125 I-RANTES was added to ransfectants, and the binding to cells was examined. Values were expressed as the average value of standard values of 3 wells ± standard error.
【図４】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞（CHO/C
CR細胞）に対する125I-MIP-1αの結合。96 ウェルプレ
ートでコンフルエントとなった CHO/CCR細胞および moc
k transfectants に 5 nMの125I-MIP-1αを加え、細胞
への結合を調べた。値は、3 ウェルの測定値の平均値±
標準誤差で表した。FIG. 4 Human MIP-1α / RANTES receptor-expressing CHO cells (CHO / C
Binding of 125 I-MIP-1α to CR cells). CHO / CCR cells and moc confluent in 96-well plates
5 nM of 125 I-MIP-1α was added to k transfectants, and binding to cells was examined. Values are the average of the measurements of 3 wells ±
Expressed by standard error.
【図５】CC ケモカインによるヒトMIP-1α/RANTES受容
体発現CHO細胞（CHO/CCR細胞）の遊走。50 nM RAMTESに
よるCHO/CCR細胞およびmock transfectantsの遊走を示
す。FIG. 5: Migration of human MIP-1α / RANTES receptor-expressing CHO cells (CHO / CCR cells) by CC chemokines. 5 shows migration of CHO / CCR cells and mock transfectants by 50 nM RAMTES.
【図６】CC ケモカインによるヒトMIP-1α/RANTES受容
体発現CHO細胞（CHO/CCR細胞）の遊走。種々の CC ケモ
カインによるCHO/CCR細胞の遊走を示す。FIG. 6: Migration of CHO cells expressing human MIP-1α / RANTES receptor (CHO / CCR cells) by CC chemokines. 3 shows migration of CHO / CCR cells by various CC chemokines.
【図７】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞（CHO/C
CR細胞）におけるCC ケモカインに応答した細胞内Ca2+
濃度の一過性の上昇。CHO/CCR細胞およびmock transfec
tantsを100 nM RANTES（矢印）で刺激したときの細胞内
Ca2+濃度の変動を示す。矢印の時点でCC ケモカインを
添加した。FIG. 7: Human MIP-1α / RANTES receptor-expressing CHO cells (CHO / C
Intracellular Ca 2+ in response to CC chemokines in CR cells)
Transient increase in concentration. CHO / CCR cells and mock transfec
Intracellular when tants are stimulated with 100 nM RANTES (arrow)
The change in Ca 2+ concentration is shown. CC chemokine was added at the time of the arrow.
【図８】ヒトMIP-1α/RANTES受容体発現CHO細胞（CHO/C
CR細胞）におけるCC ケモカインに応答した細胞内Ca2+
濃度の一過性の上昇。CHO/CCR細胞を種々の CC ケモカ
インで刺激したときの細胞内Ca2+濃度の変動を示す。矢
印の時点でCC ケモカインを添加した。FIG. 8: Human MIP-1α / RANTES receptor-expressing CHO cells (CHO / C
Intracellular Ca 2+ in response to CC chemokines in CR cells)
Transient increase in concentration. Fig. 7 shows the fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration when CHO / CCR cells were stimulated with various CC chemokines. CC chemokine was added at the time of the arrow.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＢＧ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＢＧ ＡＢＪ ＡＢＪ ＡＢＮ ＡＢＮ ＡＢＲ ＡＢＲ ＡＢＸ ＡＢＸ ＡＢＹ ＡＢＹ ＡＣＤ ＡＣＤ ＡＣＪ ＡＣＪ ＡＣＬ ＡＣＬ ＡＣＶ ＡＣＶ ＡＤＮ ＡＤＮ ＡＤＰ ＡＤＰ ＡＤＵ ＡＤＵ ＡＤＺ ＡＤＺ ＡＥＤ ＡＥＤ Ｃ０７Ｋ 14/705 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/705 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/00 9282−4Ｂ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Internal reference number FI Technical display location A61K 45/00 ABG A61K 45/00 ABG ABB ABR ABR ABX ABX ABY ABY ACJ ACAC ACL ACV ACV ADN ADN ADP ADP ADU ADU ADZ ADZ AED AED C07K 14/705 ZNA C07K 14/705 ZNA C12N 5/10 C12P 21/02 C 15/09 7823-4B C12Q 1/00 C C12P 21/02 C12N 5 / 00 B C12Q 1/00 9282-4B 15/00 A // (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12Q 1/00 C12R 1:91)
Claims (17)
の部分ペプチドまたはそれらの塩と被験化合物とを接触
させることを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体親和
性化合物またはその塩のスクリーニング方法。1. A method for screening a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof, which comprises contacting a human MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof with a test compound. Method.
有するCHO細胞または該細胞膜画分と被験化合物とを接
触させることを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体親
和性化合物またはその塩のスクリーニング方法。2. A human MIP-1α / RANTES receptor protein-containing compound or a salt thereof, which comprises contacting a CHO cell containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein or a cell membrane fraction thereof with a test compound. Screening method.
の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴
とするヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはそ
の塩のスクリーニング用キット。3. A kit for screening a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof, which comprises a human MIP-1α / RANTES receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof.
有するCHO細胞または該細胞膜画分を含むことを特徴と
するヒトMIP-1α/RANTES受容体親和性化合物またはその
塩のスクリーニング用キット。4. A screening kit for a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof, which comprises a CHO cell containing the human MIP-1α / RANTES receptor protein or a cell membrane fraction thereof.
ードするDNAを保持することを特徴とするpCCRで標示さ
れる発現ベクター。5. An expression vector designated by pCCR, which carries a DNA encoding a human MIP-1α / RANTES receptor protein.
ードするDNAが配列番号：１で表される塩基配列を含有
するDNAである請求項５記載の発現ベクター。6. The expression vector according to claim 5, wherein the DNA encoding the human MIP-1α / RANTES receptor protein is a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
とを特徴とするCHO細胞。7. A CHO cell containing the expression vector according to claim 5.
れるCHO細胞。8. The CHO cell according to claim 7, which is labeled with CHO / CCR.
IP-1α/RANTES受容体タンパク質を含有する細胞膜画
分。9. Human M obtained from the CHO cells according to claim 7.
Cell membrane fraction containing IP-1α / RANTES receptor protein.
/RANTES受容体タンパク質の発現可能な条件下で培養す
ることを特徴とするヒトMIP-1α/RANTES受容体タンパク
質の製造法。10. The CHO cell according to claim 7, which is human MIP-1α
/ A method for producing a human MIP-1α / RANTES receptor protein, which comprises culturing under conditions capable of expressing the RANTES receptor protein.
記載の細胞膜画分から単離されることを特徴とするヒト
MIP-1α/RANTES受容体タンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩。11. The CHO cell according to claim 7 or claim 9.
Human characterized in that it is isolated from the described cell membrane fraction
MIP-1α / RANTES receptor protein, its partial peptides or salts thereof.
ニング方法によって得られるヒトMIP-1α/RANTES受容体
親和性化合物またはその塩。12. A human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof obtained by the screening method according to claim 1 or 2.
ニング用キットを用いて得られるヒトMIP-1α/RANTES受
容体親和性化合物またはその塩。13. A human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or a salt thereof obtained by using the screening kit according to claim 3 or 4.
がヒトMIP-1α/RANTES受容体アンタゴニストである請求
項１２または請求項１３記載のヒトMIP-1α/RANTES受容
体親和性化合物またはその塩。14. The human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound or the human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound according to claim 12 or 13, which is a human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound. salt.
がヒトMIP-1α/RANTES受容体アゴニストである請求項１
２または請求項１３記載のヒトMIP-1α/RANTES受容体親
和性化合物またはその塩。15. The human MIP-1α / RANTES receptor affinity compound is a human MIP-1α / RANTES receptor agonist.
The compound having affinity for human MIP-1α / RANTES receptor according to claim 2 or claim 13, or a salt thereof.
は請求項１５記載のアゴニストを含有することを特徴と
する医薬。16. A medicament comprising the antagonist according to claim 14 or the agonist according to claim 15.
レルギー性疾患、炎症性疾患、糖尿病性疾患、中枢性疾
患、高脂血症、高コレステロール血症、透析による血小
板減少症、脊髄損傷、骨粗鬆症、潰瘍性大腸炎、消化性
潰瘍、敗血症ショック、肺・心臓における再潅流障害、
不安定狭心症、一過性脳虚血発作、心弁膜症、臓器移植
後拒絶反応、血管形成術後再狭窄、全身性エリテマトー
デス、多発性硬化症、腎不全、子宮内膜症、肺線維症、
成人呼吸逼迫症候群の予防・治療剤である請求項１６記
載の医薬。17. A viral disease, infectious disease, tumor, allergic disease, inflammatory disease, diabetic disease, central disease, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, thrombocytopenia due to dialysis, spinal cord injury, Osteoporosis, ulcerative colitis, peptic ulcer, septic shock, lung / heart reperfusion injury,
Unstable angina, transient ischemic attack, valvular heart disease, rejection after organ transplantation, restenosis after angioplasty, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, renal failure, endometriosis, lung fiber Illness,
The medicine according to claim 16, which is a prophylactic / therapeutic agent for adult respiratory distress syndrome.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7342130A JPH09176048A (en) | 1995-12-28 | 1995-12-28 | Production of human mip-1alpha/pantes receptor protein and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7342130A JPH09176048A (en) | 1995-12-28 | 1995-12-28 | Production of human mip-1alpha/pantes receptor protein and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09176048A true JPH09176048A (en) | 1997-07-08 |
Family
ID=18351368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7342130A Withdrawn JPH09176048A (en) | 1995-12-28 | 1995-12-28 | Production of human mip-1alpha/pantes receptor protein and use thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09176048A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000021999A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. | Novel g protein-coupled receptors |
| JP2003180386A (en) * | 2000-02-08 | 2003-07-02 | Sanagamo Biosciences Inc | Cell for drug discovery |
-
1995
- 1995-12-28 JP JP7342130A patent/JPH09176048A/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000021999A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. | Novel g protein-coupled receptors |
| JP2003180386A (en) * | 2000-02-08 | 2003-07-02 | Sanagamo Biosciences Inc | Cell for drug discovery |
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