JPH09154596A - Antibody specific to para-nitrophenoxy organic phosphorous compound, its production, and measurement of para-nitrophenoxy organic phosphorous compound - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new antibody specific to para-nitrophenoxy organic phosphorous compounds and enabling to simultaneously measure plural kinds of left agrochemicals by using the combination of a specific para-nitrophenoxyalkyl derivative with a biological polymer carrier as an immunogen. SOLUTION: The combination of a papa-nitrophenoxyalkyl derivative of formula I (R<1> is a functional group capable of binding to a carrier; X is CH2 , CH2 O, CH2 CH2 O, COO, CONH; n is an integer of 1-7; PhNO2 is para-nitrophenyl) with the carrier is used as an immunogen to obtain the new antibody which specifically reacts with two or more kinds of compounds of formula II [A is a group of formula III (R<2> is a 1-4C alkoxy, phenoxy; R<3> is a 1-4C alkoxy), a 1-4C alkyl)]. The antibody enables to measure several kinds of left agrochemicals in a measurement operation. The antibody is obtained by administering the combination of the compound of formula I [e.g. 1-(paral- nitrophenoxy)butyric acid] with a biological polymer carrier (e.g. ovalbumin as an immunogen into an animal such as mouse.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、パラニトロフェノ
キシ系有機リン化合物、特にはパラニトロフェノキシ構
造を有する有機リン系農薬と特異的に反応する新規抗体
又はその抗体フラグメントに関する。また、この抗体の
製造方法、更にはこの抗体及び／又は抗体フラグメント
を用いるパラニトロフェノキシ系有機リン化合物の免疫
学的測定方法にも関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel antibody or an antibody fragment thereof that specifically reacts with a para-nitrophenoxy-based organophosphorus compound, particularly an organophosphorus-based pesticide having a para-nitrophenoxy structure. The present invention also relates to a method for producing this antibody, and further to an immunological measurement method for a para-nitrophenoxy type organophosphorus compound using this antibody and / or antibody fragment.

【０００２】[0002]

【従来の技術】有機リン系農薬は、世界中で使用されて
いる代表的な農薬である。近年、環境中や食品中に残留
する農薬が、人体へ与える影響などの面で大きな社会問
題として関心を集めている。そこで、環境や食品に関す
る安全性確保のためには、まずこれらに残留する農薬の
量を正確に測定することが必要である。一般に、残留農
薬の分析法は、農薬が登録される時点において作物ごと
に定められており、主に試料から農薬を抽出し、精製
後、ガスクロマトグラフィー又は液体クロマトグラフィ
ーを用いて抽出物中の含有量を測定している。この従来
の測定方法は、精度の点では問題はないものの、試料の
調製が煩雑で長時間かかること、及び測定装置や設備等
に高額な費用を要するという欠点があった。残留農薬の
分析は、分析件数が多大であるため、精度面以外にも簡
便性や迅速性が重要である。また、高価な測定装置がな
くても容易に分析できることが要求されていた。従来、
有機リン系農薬の分析は、上述したように、ガスクロマ
トグラフィーを用いて測定する方法が採用されていた
が、その分析には相当の時間と手間を要していた。ま
た、測定装置や設備等にも高額な費用を要していた。2. Description of the Related Art Organophosphorus pesticides are typical pesticides used all over the world. In recent years, pesticides remaining in the environment and food have been attracting attention as a major social problem in terms of the effects on human bodies. Therefore, in order to ensure the safety of the environment and foods, it is first necessary to accurately measure the amount of pesticides remaining in them. Generally, the analytical method for residual pesticides is defined for each crop at the time of registration of the pesticide, and the pesticide is extracted mainly from the sample, and after purification, the content of the extract in the extract is analyzed using gas chromatography or liquid chromatography. The content is measured. Although this conventional measuring method has no problem in terms of accuracy, it has drawbacks in that the preparation of the sample is complicated and takes a long time, and the measuring device and equipment require a high cost. Since the number of analysis of pesticide residues is large, simplicity and speed are important in addition to accuracy. Further, it is required that the analysis can be easily performed without using an expensive measuring device. Conventionally,
As described above, the method of measuring the organophosphorus pesticide has been adopted by using gas chromatography, but the analysis requires a considerable amount of time and labor. In addition, the measuring device and equipment also require high cost.

【０００３】一方、近年、生体試料以外の成分の測定に
おいても、免疫学的検出方法が応用されるようになり、
多岐にわたって応用が検討されているが、最近、いくつ
かの有機リン系農薬の測定に応用されるようになってき
た。例えば、パラニトロフェノキシ構造を有し、式（I
V）： （Ｃ₂ Ｈ₅ Ｏ）₂ Ｐ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （IV） （式中、−Ｐｈ−ＮＯ₂ はパラニトロフェニル基であ
る）で表されるパラチオンに対する抗体を用いる免疫学
的検出方法が、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄ．Ｅｒｃｅｇｏｖｉ
ｃｈ，Ｒｅｍｏ Ｐ．Ｖａｌｌｅｊｏ，Ｒｕｓｓｅｌｌ
Ｒ．Ｇｅｔｔｉｇ，Ｌｙｎｎ Ｗｏｏｄｓ，Ｅｄｗａ
ｒｄ Ｒ．Ｂｏｇｕｓ，ａｎｄ ＲａｌｐｈＯ．Ｍｕｍ
ｍａ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，２９，
５５９−５６３（１９８１）に報告されている。On the other hand, in recent years, immunological detection methods have been applied to the measurement of components other than biological samples,
Various applications have been studied, but recently it has been applied to the measurement of some organophosphorus pesticides. For example, having a para-nitrophenoxy structure, the formula (I
V): an antibody against parathion represented by (C ₂ H ₅ O) ₂ P (= S) -O-Ph-NO ₂ (IV) (in the formula, -Ph-NO ₂ is a paranitrophenyl group). An immunological detection method using the method of Charles D. et al. Ercegovi
ch, Remo P. Vallejo, Russell
R. Gettig, Lyn Woods, Edward
rd R.D. Bogus, and Ralph O. Mum
ma, J.M. Agric. Food Chem. , 29,
559-563 (1981).

【０００４】また、同様に、パラニトロフェノキシ構造
を有し、式（VII)： （Ｃ₂ Ｈ₅ Ｏ）₂ Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （VII) （式中、−Ｐｈ−ＮＯ₂ −は前記と同じ意味である）で
表されるパラオキソンに対する抗体と測定法が、Ｋｅｎ
ｎｅｔｈ Ｗ．，Ｈｕｎｔｅｒ Ｊｒ．，ａｎｄＤａｖ
ｉｄ Ｅ．Ｌｅｎｚ，Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ，３
０，３５５−３６１（１９８２）、Ｍ．Ｌｏｂｅｒ，
Ｓ．Ｋｒａｎｔｚ，ａｎｄ Ｉ．Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ａ
ｃｔａ ｂｉｏｌ．ｍｅｄ．ｇｅｒｍ．，４１，４８７
−４９６（１９８２）、Ｅｌｉａｈｕ Ｈｅｌｄｍａ
ｎ，Ａｙａｌａ Ｂａｌａｎ，ＯｒａＨｏｒｏｗｉｔ
ｚ，Ｓａｒｉｔ Ｂｅｎ−Ｚｉｏｎ，ａｎｄ Ｍｉｃｈ
ａｅｌＴｏｒｔｅｎ，ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ，１８
０，２４３−２４８（１９８５）、及びＡｌａｎ Ａ．
Ｂｒｉｍｆｉｅｌｄ，Ｄａｖｉｄ Ｅ．Ｌｅｎｚ，Ｃａ
ｒｏｌｉｎｅ Ｇｒａｈａｍ，ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｔｈ
Ｗ．Ｈｕｎｔｅｒ，Ｊｒ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏ
ｄ Ｃｈｅｍ．，３３，１２３７−１２４２（１９８
５）に報告されている。Similarly, it has a para-nitrophenoxy structure and has the formula (VII): (C ₂ H ₅ O) ₂ P (= O) -O-Ph-NO ₂ (VII) (where -Ph -NO ₂ -has the same meaning as above), and an antibody against paraoxon represented by
news W. , Hunter Jr. , AndDav
id E. Lenz, Life science, 3
0,355-361 (1982), M.A. Lover,
S. Krantz, and I.D. Herrmann, A
cta biol. med. germ. , 41,487
-496 (1982), Eliahu Heldma
n, Ayala Balan, OraHorowit
z, Sarit Ben-Zion, and Mich
ael Torten, FEBS LETTERS, 18
0,243-248 (1985), and Alan A. et al.
Brimfield, David E. Lenz, Ca
roline Graham, and Kenneth
W. Hunter, Jr. , J. et al. Agric. Foo
d Chem. , 33, 1237-1242 (198
5).

【０００５】更に、パラニトロフェノキシ構造とは異な
るが、それと類似の構造を有する有機リン系農薬、例え
ば、フェニトロチオン及び近縁の有機リン酸エステルを
測定する検査法に関して、特開平４−５０３７６０号公
報には、式（Ｖ）： （ＣＨ₃ Ｏ）₂ Ｐ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｂ （Ｖ） （式中、Ｂは３−メチル−４−ニトロフェニル基であ
る）で表されるフェニトロチオン及び類似の有機リン酸
エステルを測定するためのモノクローナル抗体及びポリ
クローナル抗体が開示されている。しかしながら、前記
の各文献に記載の公知抗体はすべて、抗体の作製に用い
たハプテンの構造が芳香族基とリン酸基とのエステルで
あることを特徴としており、前記の各抗体は、ハプテン
のデザインの元になった有機リン系農薬とはそれぞれ特
異的に反応するが、それ以外の有機リン系農薬とは反応
しないか、又は極めて反応性が低いことが示されてい
る。従って、これらの抗体を用いた検査法は、多種類の
有機リン系農薬を簡便にかつ正確に測定することが困難
であった。Further, regarding an inspection method for measuring an organophosphorus pesticide having a structure different from the para-nitrophenoxy structure but having a structure similar to that, for example, fenitrothion and related organophosphate esters, Japanese Patent Laid-Open No. 4-503760. in the formula _{(V): (CH 3 O} ) 2 P (= S) -O-B (V) ( wherein, B is a is 3-methyl-4-nitrophenyl group) and fenitrothion represented by Monoclonal and polyclonal antibodies for measuring similar organophosphates have been disclosed. However, all the known antibodies described in each of the above-mentioned documents are characterized in that the structure of the hapten used in the production of the antibody is an ester of an aromatic group and a phosphate group, and each of the above-mentioned antibodies is a hapten. It has been shown that they specifically react with the organophosphorus pesticides that were the basis of the design, but do not react with other organophosphorus pesticides or have extremely low reactivity. Therefore, it is difficult for the test method using these antibodies to easily and accurately measure many kinds of organophosphorus pesticides.

【０００６】更に、特表平７−５０６８１４号公報に
は、有機リン酸エステルを免疫学的に検出するための新
たなハプテンの合成方法が開示されている。しかしなが
ら、この方法も前記の各方法と同様に、芳香族基とリン
酸基とのエステルをハプテンの構造中に含むことを特徴
としているので、ハプテンのデザインの元になった有機
リン系農薬の有機リン酸エステルを単独かつ特異的に検
出するための手段を提供しているのみであった。Further, Japanese Patent Publication No. 7-506814 discloses a new method for synthesizing a hapten for immunologically detecting an organic phosphate. However, this method is also characterized by containing an ester of an aromatic group and a phosphoric acid group in the structure of the hapten, as in the above-mentioned methods, so that the organophosphorus pesticide that was the basis of the hapten design It has only provided a means for the single and specific detection of organophosphates.

【０００７】一方、メチルパラチオン、エチル−ｐ−ニ
トロフェニルフェニルチオホスフェート（ＥＰＮ）、パ
ラチオンや更にはフェニトロチオン等も含めたパラニト
ロフェノキシ構造又は類似の構造を有する複数種類の有
機リン系農薬を同時にかつ特異的に検出する研究は、従
来試みられていなかった。複数農薬の同時検出は、１回
の測定のみで、検体中に対象農薬群の少なくとも１種類
の農薬を含んでいれば、それを検出できることから、多
検体を測定する際の最初のスクリーニング方法として特
に有用である。On the other hand, a plurality of organophosphorus pesticides having a paranitrophenoxy structure or a similar structure including methylparathion, ethyl-p-nitrophenylphenylthiophosphate (EPN), parathion and further fenitrothion are simultaneously and uniquely specified. Studies to detect positively have not previously been attempted. Simultaneous detection of multiple pesticides can be performed only once, and if at least one pesticide of the target pesticide group is contained in the sample, it can be detected. Therefore, it can be used as the first screening method when measuring multiple samples. Especially useful.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、複数種類の有機リン系農薬を同時にかつ特異的に測
定するために、ハプテンに関する従来のデザイン手法と
は全く異なる発想に基づいて鋭意研究した結果、従来適
用されてきた有機リン系農薬の有機リン酸エステル構造
を基に、ハプテンをデザインするのではなく、全く別異
の化学構造を有するハプテンを用いることにより、複数
種類のパラニトロフェノキシ系有機リン化合物と同時に
しかも特異的に反応するモノクローナル抗体及びポリク
ローナル抗体を作製することに成功し、更に、これらの
抗体を利用することによって、複数種類のパラニトロフ
ェノキシ系有機リン系農薬を１回の免疫学的測定のみで
正確に測定することが可能になった。Therefore, the present inventors have diligently studied based on an idea completely different from the conventional design method for hapten in order to simultaneously and specifically measure plural kinds of organophosphorus pesticides. As a result of research, instead of designing a hapten based on the organic phosphate ester structure of an organophosphorus pesticide that has been conventionally applied, by using a hapten having a completely different chemical structure, multiple types of paranitro We have succeeded in producing monoclonal and polyclonal antibodies that react specifically and simultaneously with a phenoxy-based organophosphorus compound. Furthermore, by utilizing these antibodies, multiple types of para-nitrophenoxy-based organophosphorus pesticides can be produced. It has become possible to make accurate measurements with only one immunological measurement.

【０００９】また、作物や土壌等に残留するパラニトロ
フェノキシ系有機リン系農薬を免疫学的に測定する場合
には、被検試料から農薬を抽出するために、通常、有機
溶媒が使用される。従って、有機溶媒存在下においても
抗原抗体反応を行うことができることが望ましい。そこ
で、本発明者らは、迅速かつ簡便な操作工程の開発にお
いて、前記のモノクローナル抗体やポリクローナル抗体
の中から、有機溶媒に対して耐性を示す抗体を見出し、
この抗体を用いると、有機溶媒存在下においても免疫学
的に複数種類のパラニトロフェノキシ系有機リン系農薬
を１回の測定のみで迅速に測定することができることを
見出した。本発明は、こうした知見に基づくものであ
る。Further, in the case of immunologically measuring a p-nitrophenoxy-based organophosphorus pesticide remaining in crops, soil, etc., an organic solvent is usually used to extract the pesticide from the test sample. . Therefore, it is desirable that the antigen-antibody reaction can be performed even in the presence of an organic solvent. Therefore, in the development of a rapid and simple operation process, the present inventors found an antibody showing resistance to an organic solvent from the above-mentioned monoclonal antibodies and polyclonal antibodies,
It was found that the use of this antibody enables immunologically rapid determination of a plurality of paranitrophenoxy-based organophosphorus pesticides even in the presence of an organic solvent, with only one measurement. The present invention is based on these findings.

【００１０】[0010]

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、一般
式（VI）： Ｒ¹ −Ｘ_n −Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （VI） （式中、Ｒ¹ は担体と結合することのできる官能基であ
り、Ｘは−ＣＨ₂ −、−ＣＨ₂ Ｏ−、−ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｏ
−、−ＣＯＯ−、又は−ＣＯＮＨ−であり、ｎは１〜７
の整数、特には３であり、−Ｐｈ−ＮＯ₂ はパラニトロ
フェニル基である）で表されるパラニトロフェノキシア
ルキル誘導体と担体との結合体を免疫原として用いるこ
とを特徴とする、抗体の製造方法に関する。また、本発
明は、前記一般式（VI）で表されるパラニトロフェノキ
シアルキル誘導体と担体との結合体を免疫原として用い
て調製され、一般式（Ｉ）： Ａ−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （Ｉ） 〔式中、Ａは、一般式： Ｒ² Ｒ³ Ｐ（＝Ｓ）− （式中、Ｒ² は炭素数１〜４のアルコキシ基又はフェニ
ル基であり、Ｒ³ は炭素数１〜４のアルコキシ基であ
る）で表される基であるか、又は炭素数１〜４のアルキ
ル基であり、−Ｐｈ−ＮＯ₂ は前記と同じ意味である〕
で表される化合物２種以上と特異的に反応する抗体に関
する。また、本発明は、前記抗体のフラグメントであっ
て、前記一般式（Ｉ）で表される化合物に対する抗原結
合部位を含む、抗体フラグメントにも関する。更に、本
発明は、前記抗体及び／又は前記抗体フラグメントを用
いることを特徴とする、一般式（Ｉ）で表される化合物
の免疫学的測定方法にも関する。Accordingly, the present invention provides a compound of the general formula (VI): R ¹ -X _n -O-Ph-NO ₂ (VI) where R ¹ can be bound to a carrier. is a functional group, X is _{-CH 2 -, - CH 2 O} -, - CH 2 CH 2 O
-, -COO-, or -CONH-, and n is 1 to 7
Integer, in particular is 3, -Ph-NO ₂ is characterized by using a conjugate of a para-nitrophenoxy alkyl derivatives and carrier represented by a para-nitrophenyl group) as an immunogen, antibodies It relates to a manufacturing method. The present invention is also prepared by using a conjugate of a para-nitrophenoxyalkyl derivative represented by the general formula (VI) and a carrier as an immunogen, and the compound of the general formula (I): A-O-Ph-NO ₂ (I) wherein, a represents the general ^{formula: R 2 R 3 P (=} S) - ( wherein, R ² is an alkoxy group or a phenyl group having 1 to 4 carbon atoms, R ³ is C 1 -C Is an alkoxy group of 4 to 4) or is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and -Ph-NO ₂ has the same meaning as described above.]
The present invention relates to an antibody that specifically reacts with two or more compounds represented by. The present invention also relates to a fragment of the above antibody, which antibody fragment contains an antigen-binding site for the compound represented by the general formula (I). Furthermore, the present invention also relates to a method for immunologically measuring the compound represented by the general formula (I), which comprises using the above antibody and / or the above antibody fragment.

【００１１】また、本明細書において「パラニトロフェ
ノキシ構造」とは、フェノキシ基の４位にニトロ基が置
換されていることを意味し、ベンゼン環が４−ニトロ基
以外の置換基によって更に置換されたパラニトロフェノ
キシ構造、例えば、３−メチル−４−ニトロフェノキシ
基又は２−クロロ−４−ニトロフェノキシ基等は含まれ
ない。以下、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を、パ
ラニトロフェノキシ系有機リン化合物と称することがあ
る。In the present specification, the term "paranitrophenoxy structure" means that a nitro group is substituted at the 4-position of the phenoxy group, and the benzene ring is further substituted with a substituent other than the 4-nitro group. The formed para-nitrophenoxy structure, such as a 3-methyl-4-nitrophenoxy group or a 2-chloro-4-nitrophenoxy group, is not included. Hereinafter, the compound represented by the general formula (I) may be referred to as a para-nitrophenoxy-based organic phosphorus compound.

【００１２】[0012]

【発明の実施の形態】以下、本発明による抗体の製造方
法、すなわちポリクローナル抗体の製造方法、モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの分離方法とモノ
クローナル抗体の製造方法、免疫学的測定方法の順に説
明する。本発明によれば、前記一般式（VI）で表される
パラニトロフェノキシアルキル誘導体をハプテンとして
使用することにより、ポリクローナル抗体、又はモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製すること
ができる。本発明のポリクローナル抗体の調製並びにモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの分離及び
モノクローナル抗体の調製は、常法、例えば、続生化学
実験講座、又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に
記載の方法に従って行うことができる。本明細書におい
て「ハプテン」とは、抗体との結合能を有しているもの
の、それ単独では免疫原性を有さず、担体（シュレッパ
ー）と結合することによって免疫原性を発現する物質を
意味する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, a method for producing an antibody according to the present invention, that is, a method for producing a polyclonal antibody, a method for isolating a hybridoma producing a monoclonal antibody, a method for producing a monoclonal antibody, and an immunological measuring method will be described in this order. According to the present invention, by using the paranitrophenoxyalkyl derivative represented by the general formula (VI) as a hapten, a polyclonal antibody or a hybridoma producing a monoclonal antibody can be prepared. The preparation of the polyclonal antibody of the present invention, the isolation of the hybridoma producing the monoclonal antibody, and the preparation of the monoclonal antibody are carried out by a conventional method, for example, the method described in the Second Biochemical Experiment Course or the Immunobiochemical Research Method (edited by the Japanese Biochemical Society). Can be done according to. As used herein, the term “hapten” refers to a substance that has the ability to bind to an antibody, but does not have immunogenicity by itself, but expresses immunogenicity by binding to a carrier (shreper). means.

【００１３】前記一般式（VI）において、Ｒ¹ は担体と
結合することのできる官能基である。ここで「担体」と
は、ハプテンと結合して複合体（コンジュゲート）を形
成し、免疫原性を発現することのできる物質（シュレッ
パー）を意味する。本発明においても、従来からシュレ
ッパーとして一般に用いられている公知の物質を担体と
して用いることができる。従って、担体としては、例え
ば生体高分子担体、例えば、分子量が約１万以上、好ま
しくは約４万〜１００万のタンパク質〔例えば、哺乳類
（例えばウシやヒト）の血清アルブミン、免疫グロブリ
ン、オボアルブミン、ポリリジン、キーホールリンペッ
トヘモシアニン、又は多糖類（例えば、デキストラン、
アミロース、アミロペクチン）；あるいは細胞〔例え
ば、哺乳類（例えばウシやヒト）の赤血球又はＢＣＧ
菌〕を挙げることができる。In the general formula (VI), R ¹ is a functional group capable of binding to the carrier. Here, the "carrier" means a substance (shredper) capable of expressing immunogenicity by forming a complex (conjugate) by binding with a hapten. Also in the present invention, a known substance that has been generally used as a shreper from the past can be used as a carrier. Therefore, as the carrier, for example, a biopolymer carrier such as a protein having a molecular weight of about 10,000 or more, preferably about 40,000 to 1,000,000 [eg, mammalian (eg, bovine or human) serum albumin, immunoglobulin, ovalbumin] is used. , Polylysine, keyhole limpet hemocyanin, or polysaccharides (eg, dextran,
Amylose, amylopectin); or cells [eg mammalian (eg bovine or human) erythrocytes or BCG
Fungus].

【００１４】前記の「担体と結合することのできる官能
基」としては、前記の各担体と結合することのできる官
能基である限り特に限定されず、使用する担体に応じて
適宜選択することができる。例えば、タンパク質のアミ
ノ基と結合することのできる官能基としてはカルボキシ
ル基、アミノ基、水酸基又はチオール基；タンパク質の
チオール基と結合することのできる官能基としてはチオ
ール基、又はアミノ基；多糖類の水酸基と結合すること
のできる官能基としてはチオール基、又はアルデヒド基
を挙げることができる。The above-mentioned "functional group capable of binding to a carrier" is not particularly limited as long as it is a functional group capable of binding to each of the above-mentioned carriers, and may be appropriately selected according to the carrier to be used. it can. For example, a functional group capable of binding to an amino group of a protein is a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group or a thiol group; a functional group capable of binding to a thiol group of a protein is a thiol group or an amino group; a polysaccharide. Examples of the functional group capable of binding to the hydroxyl group include a thiol group or an aldehyde group.

【００１５】前記一般式（VI）で表されるパラニトロフ
ェノキシアルキル誘導体と生体高分子担体（シュレッパ
ー）との結合は、従来公知の方法に従って実施すること
ができる。例えば、生体高分子担体としてウシ血清アル
ブミンを用いる場合には、混合酸無水物法、グルタルア
ルデヒド法、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロス
クシンイミド法、カルボジイミド法などの方法によって
アルブミンのアミノ基とパラニトロフェノキシアルキル
誘導体との結合体を調製することができる。The binding of the para-nitrophenoxyalkyl derivative represented by the general formula (VI) and the biopolymer carrier (shredper) can be carried out by a conventionally known method. For example, when bovine serum albumin is used as the biopolymer carrier, the amino group of albumin and para-nitro can be prepared by the mixed acid anhydride method, glutaraldehyde method, m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide method, carbodiimide method or the like. A conjugate with a phenoxyalkyl derivative can be prepared.

【００１６】前記一般式（VI）で表されるパラニトロフ
ェノキシアルキル誘導体としては、好ましくは一般式
（VI−１）： Ｒ¹¹−Ｘ_n −Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （VI−１） （式中、Ｒ¹¹は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂ 、−ＳＨ、又は−
ＯＨであり、Ｘ、ｎ及び−Ｐｈ−ＮＯ₂ は前記と同じ意
味である）で表されるパラニトロフェノキシアルキル誘
導体、より好ましくは式（VI−２）： ＨＯＯＣ−（ＣＨ₂ ）₃ −Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （VI−２） （式中、−Ｐｈ−ＮＯ₂ は前記と同じ意味である）で表
される１−（パラニトロフェノキシ）酪酸を用いること
ができる。The paranitrophenoxyalkyl derivative represented by the general formula (VI) is preferably the general formula (VI-1): R ¹¹ -X _n -O-Ph-NO ₂ (VI-1) (formula Wherein R ¹¹ is —COOH, —NH ₂ , —SH, or —
Is OH, X, p nitrophenoxy alkyl derivatives n and -Ph-NO ₂ is represented in the same sense in which) as defined above, more preferably the formula (VI-2): HOOC- ( CH 2) 3 -O 1- (paranitrophenoxy) butyric acid represented by -Ph-NO ₂ (VI-2) (wherein -Ph-NO ₂ has the same meaning as described above) can be used.

【００１７】前記一般式（VI）で表されるパラニトロフ
ェノキシアルキル誘導体と担体（シュレッパー）、特に
は生体高分子担体とから形成した免疫原性複合体を免疫
原として用いて、抗血清（ポリクローナル抗体）又はモ
ノクローナル抗体を製造すると、前記一般式（Ｉ）で表
される化合物のすべて、又はその大部分と反応すること
ができる抗体を産生することができる点で好ましい。有
機リン系農薬には、種々の化合物が存在するため、でき
る限り多種類の測定対象を同時に測定することが可能な
抗体を取得することができる免疫原を選択することが重
要である。Using an immunogenic complex formed from a paranitrophenoxyalkyl derivative represented by the above general formula (VI) and a carrier (shredper), particularly a biopolymer carrier, as an immunogen, antiserum (polyclonal The production of an antibody) or a monoclonal antibody is preferable in that an antibody capable of reacting with all or most of the compound represented by the general formula (I) can be produced. Since various compounds exist in organophosphorus pesticides, it is important to select an immunogen capable of obtaining an antibody capable of simultaneously measuring as many kinds of measurement targets as possible.

【００１８】これらの免疫原性複合体を用いて、哺乳動
物又は鳥類（例えば、マウス、ラット、又は鶏等）をイ
ン・ビボ免疫法により免疫することができる。例えば、
免疫原性複合体を等量のフロイントの完全アジュバント
又は不完全アジュバントと乳化混合し、ウサギやマウス
の皮下に投与する（初回免疫）。以後、２〜４週間の間
隔で同様の操作を行い、数回免疫する。このようにして
免疫した動物の血液を採取し、抗血清として、本発明の
ポリクローナル抗体を調製することができる。また、免
疫したマウスやラットの腹腔内にエールリッヒ腹水癌細
胞を接種し、その結果、貯留してきた腹水より、本発明
のポリクローナル抗体を調製することができる。すなわ
ち、前記一般式（VI）で表される化合物と前記担体、特
には前記生体高分子担体（特に、血清アルブミン又は免
疫グロブリン）との結合体を免疫原として用いることに
より、前記一般式（Ｉ）で表される化合物のすべて、又
はその大部分と反応することができる抗体を得ることが
できる。Using these immunogenic complexes, mammals or birds (eg, mouse, rat, chicken, etc.) can be immunized by the in vivo immunization method. For example,
The immunogenic complex is emulsified and mixed with an equal amount of Freund's complete or incomplete adjuvant, and subcutaneously administered to rabbits or mice (primary immunization). Thereafter, the same operation is performed at intervals of 2 to 4 weeks, and immunization is performed several times. Blood of the animal thus immunized can be collected to prepare the polyclonal antibody of the present invention as an antiserum. In addition, Ehrlich's ascites tumor cells are inoculated into the abdominal cavity of immunized mice or rats, and as a result, the polyclonal antibody of the present invention can be prepared from the accumulated ascites. That is, by using a conjugate of the compound represented by the general formula (VI) and the carrier, particularly the biopolymer carrier (in particular, serum albumin or immunoglobulin) as an immunogen, Antibodies capable of reacting with all or most of the compounds represented by

【００１９】一方、本発明のモノクローナル抗体を調製
する場合には、前記の免疫操作〔特には、前記一般式
（VI）で表される化合物と前記担体、特には前記生体高
分子担体（特に、血清アルブミン又は免疫グロブリン）
との結合体を免疫原として〕を行った哺乳動物又は鳥
類、例えば、マウスから、最終免疫操作の数日後に、脾
臓を無菌的に取り出し、ステンレススチールメッシュな
どで押しつぶして脾臓細胞を調製し、細胞融合工程に用
いる。細胞融合のもう一方の親細胞であるミエローマ細
胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞株、例え
ば、ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，５，５１１−５１７（１９７５）〕、
ＳＰ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９
−２７０（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８−１５５
０（１９７９）〕、ＮＳ０〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１）〕等を使用
することができる。On the other hand, when the monoclonal antibody of the present invention is prepared, the above-mentioned immunization procedure [particularly, the compound represented by the general formula (VI) and the carrier, particularly the biopolymer carrier (particularly, Serum albumin or immunoglobulin)
Mammals or birds that have performed the conjugate with as an immunogen, for example, from a mouse, a few days after the final immunization operation, the spleen is aseptically removed, and spleen cells are prepared by crushing with a stainless steel mesh or the like, Used in the cell fusion process. As a myeloma cell (myeloma cell) which is the other parent cell of the cell fusion, various known cell lines, for example, p3.NS-1 / 1.Ag4.1 [Eur. J. I
mmunol. , 5,511-517 (1975)],
SP2 / 0-Ag14 [Nature, 276, 269
-270 (1978)], P3-X63-Ag8.65.
3 [J. Immunol. , 123, 1548-155
0 (1979)], NS0 [Methods in E]
nzymology, 73, 3 (1981)] and the like can be used.

【００２０】細胞融合は通常の方法、例えば、公知の融
合促進剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を用
いて行うことができ、細胞の使用比率も常法に従って、
例えば、マウスの脾臓細胞に対してミエローマ細胞を約
１／５〜１／１０程度の割合で行なうことができる。細
胞融合用培地としては、例えば、市販の細胞融合用ポリ
エチレングリコール（分子量１５００：ベーリンガーマ
ンハイム社製）を用いることができる。融合は、前記の
培地内で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合す
ることによって行うことができる。The cell fusion can be carried out by an ordinary method, for example, using a known fusion promoter (for example, polyethylene glycol), and the ratio of cells to be used can be determined according to a conventional method.
For example, myeloma cells can be added to mouse spleen cells at a ratio of about 1/5 to 1/10. As the cell fusion medium, for example, commercially available polyethylene glycol for cell fusion (molecular weight 1500: manufactured by Boehringer Mannheim) can be used. The fusion can be performed by thoroughly mixing the immune spleen cells and the myeloma cells in the above medium.

【００２１】続いて、選別用培地（例えば、ＨＡＴ培
地）を用いてハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイ
ブリドーマ培養上清の抗体産生の有無を、例えば、前記
パラニトロフェノキシ系有機リン化合物を用いるＥＬＩ
ＳＡ法によって測定し、目的とするハイブリドーマを分
離することができる。本発明の抗体を産生するハイブリ
ドーマは、通常、細胞クローニング法、例えば、限界希
釈法を用いてクローン化することができる。また、有機
溶媒に対して耐性を有するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマを選別する場合には、各種濃度で有機
溶媒を含む有機水溶液に前記パラニトロフェノキシ系有
機リン化合物を添加し、これにモノクローナル抗体を加
えた後に、抗原抗体反応が正常に進行することを確認す
ることによって、有機溶媒耐性モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを分離することができる。有機溶
媒としては、測定対象となるパラニトロフェノキシ系有
機リン化合物の溶媒を選択するのが好ましい。分離した
ハイブリドーマは、公知の培地で継代培養することがで
き、液体窒素等の中で容易に長期間保存することができ
る。Subsequently, cells other than the hybridomas are removed using a selection medium (for example, HAT medium), and the presence or absence of antibody production in the hybridoma culture supernatant is determined by, for example, ELI using the paranitrophenoxy-based organophosphorus compound.
The target hybridoma can be separated by measurement by the SA method. The hybridoma producing the antibody of the present invention can usually be cloned using a cell cloning method, for example, a limiting dilution method. When selecting a hybridoma producing a monoclonal antibody having resistance to an organic solvent, the paranitrophenoxy-based organophosphorus compound is added to an organic aqueous solution containing an organic solvent at various concentrations, and the monoclonal antibody is added thereto. After the addition, by confirming that the antigen-antibody reaction normally proceeds, the hybridoma producing the organic solvent-resistant monoclonal antibody can be isolated. As the organic solvent, it is preferable to select the solvent of the para-nitrophenoxy-based organic phosphorus compound to be measured. The isolated hybridoma can be subcultured in a known medium and can be easily stored in liquid nitrogen or the like for a long period of time.

【００２２】また本発明によるモノクローナル抗体は、
目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
培養することにより、容易に調製することができる。ハ
イブリドーマを培養する培地としては、イン・ビトロの
場合には、例えば、５％二酸化炭素及び３７℃条件下で
培養に適した任意の培地を用いることができ、好適には
イスコフ改変ダルベコ培地（以下、イスコフ培地と称す
る）に１０％ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと称する）を
含む培地（以下、イスコフ／１０％ＦＢＳ培地と称す
る）を用いることができる。また、イン・ビボの場合に
は、適当な哺乳動物、例えば、マウスの腹腔中で培養す
るのが好ましい。The monoclonal antibody according to the present invention also comprises
It can be easily prepared by culturing a hybridoma that produces the desired monoclonal antibody. As the medium for culturing the hybridoma, in the case of in vitro, for example, any medium suitable for culturing under the conditions of 5% carbon dioxide and 37 ° C. can be used, and preferably, the Iscove's modified Dulbecco's medium (hereinafter A medium containing 10% fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS) (hereinafter, referred to as Iscove's medium) (hereinafter referred to as Iscove / 10% FBS medium) can be used. In the case of in vivo, it is preferable to culture in the abdominal cavity of a suitable mammal such as mouse.

【００２３】前記のハイブリドーマ培養液、ハイブリド
ーマを腹腔中に投与した適当な哺乳動物の腹水、又はポ
リクローナル抗体を含む抗血清は、そのまま抗体液とし
て用いることができる。また、これらの抗体液を出発材
料に、目的とする抗体を分離・精製して用いることも可
能である。タンパク質の単離・精製に用いることができ
る通常の方法を使用して、抗体を分離・精製することが
できる。このような方法としては、硫安塩析、イオン交
換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラ
ムクロマトグラフィー、プロテインＡ若しくはプロテイ
ンＧ結合ポリマー等を用いるアフィニテイークロマトグ
ラフィー、又は透析等の方法がある。The hybridoma culture solution, the ascites of a suitable mammal in which the hybridoma is intraperitoneally administered, or the antiserum containing a polyclonal antibody can be used as an antibody solution as it is. It is also possible to separate and purify the desired antibody using these antibody solutions as starting materials. Antibodies can be separated and purified using conventional methods that can be used to isolate and purify proteins. Examples of such methods include salting out with ammonium sulfate, ion exchange chromatography, molecular sieve column chromatography using a molecular sieve gel, affinity chromatography using a protein A or protein G binding polymer, dialysis and the like.

【００２４】本発明の抗体は、前記一般式（Ｉ）で表さ
れる化合物少なくとも２種と特異的に反応する。前記一
般式（Ｉ）で表される化合物には、種々の化合物（例え
ば、パラニトロフェノキシ構造を有する有機リン系農
薬）が存在し、本発明の抗体は、前記一般式（Ｉ）で表
される複数の化合物と特異的に反応することができる。
目的とする測定対象に応じて、適当な免疫原及び／又は
スクリーニングに用いる化合物を選択することによっ
て、種々の特異性を有する抗体を調製することができ
る。The antibody of the present invention specifically reacts with at least two compounds represented by the general formula (I). Various compounds (for example, organophosphorus pesticides having a para-nitrophenoxy structure) are present in the compound represented by the general formula (I), and the antibody of the present invention is represented by the general formula (I). Can specifically react with a plurality of compounds.
Antibodies having various specificities can be prepared by selecting an appropriate immunogen and / or a compound to be used for screening according to the target measurement object.

【００２５】本発明の抗体は、式（II）： （ＣＨ₃ Ｏ）₂ Ｐ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （II） （式中、−Ｐｈ−ＮＯ₂ はパラニトロフェニル基であ
る）で表される化合物（メチルパラチオン）、式（II
I)： （Ｃ₂ Ｈ₅ Ｏ）（Ｐｈ）Ｐ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （III) （式中、Ｐｈはフェニル基であり、−Ｐｈ−ＮＯ₂ は前
記と同じ意味である）で表される化合物（ＥＰＮ）、及
び式（IV）： （Ｃ₂ Ｈ₅ Ｏ）₂ Ｐ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （IV） （式中、−Ｐｈ−ＮＯ₂ は前記と同じ意味である）で表
される化合物（パラチオン）と特異的に反応するモノク
ローナル抗体であることが好ましい。The antibody of the present invention has the formula (II): (CH ₃ O) ₂ P (= S) -O-Ph-NO ₂ (II) (wherein -Ph-NO ₂ is a para-nitrophenyl group). A compound represented by the formula (methylparathion), the formula (II
I): (C ₂ H ₅ O) (Ph) P (= S) -O-Ph-NO ₂ (III) (In the formula, Ph is a phenyl group, and -Ph-NO ₂ has the same meaning as above. A compound represented by the formula (EPN), and formula (IV): (C ₂ H ₅ O) ₂ P (= S) -O-Ph-NO ₂ (IV) (wherein -Ph-NO ₂ is It is preferably a monoclonal antibody that specifically reacts with a compound (parathion) having the same meaning as described above.

【００２６】また、本発明の抗体は、前記式（II）で表
される化合物、及び前記式（IV）で表される化合物と特
異的に反応し、更に式（Ｖ）： （ＣＨ₃ Ｏ）₂ Ｐ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｂ （Ｖ） （式中、Ｂは３−メチル−４−ニトロフェニル基であ
る）で表される化合物（フェニトロチオン）と特異的に
反応するポリクローナル抗体であることが好ましい。な
お、前記一般式（Ｉ）で表される化合物には、例えば、
前記式（III ）で表される化合物のように、光学異性体
が存在するものがあり、それらのすべての光学異性体が
前記一般式（Ｉ）で表される化合物に含まれる。本発明
の抗体が、光学異性体の存在する化合物と特異的に反応
する抗体である場合には、そのラセミ体化合物と特異的
に反応する抗体であることが好ましい。The antibody of the present invention specifically reacts with the compound represented by the formula (II) and the compound represented by the formula (IV), and further has the formula (V): (CH ₃ O ) ₂ P (= S) -OB (V) (wherein B is a 3-methyl-4-nitrophenyl group) is a polyclonal antibody that specifically reacts with a compound (fenitrothion). It is preferable. The compound represented by the general formula (I) includes, for example,
Some of the compounds represented by the formula (III) have optical isomers, and all the optical isomers are included in the compound represented by the general formula (I). When the antibody of the present invention is an antibody that specifically reacts with a compound having an optical isomer, it is preferably an antibody that specifically reacts with the racemic compound.

【００２７】本発明の抗体には、前記一般式（Ｉ）で表
される化合物に対する抗原結合部位を含む抗体フラグメ
ント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂ 、又
はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例え
ば、本発明の抗体を、常法によりタンパク質分解酵素に
よって消化し、続いてタンパク質の単離・精製の常法に
従って得ることができる。The antibody of the present invention includes an antibody fragment containing an antigen-binding site for the compound represented by the general formula (I), such as Fab, Fab ′, F (ab ′) ₂ or Fv. . These fragments can be obtained by, for example, digesting the antibody of the present invention with a proteolytic enzyme according to a conventional method, and then following a conventional method for protein isolation and purification.

【００２８】本発明による、前記一般式（Ｉ）で表され
る化合物の免疫学的測定方法は、前記のポリクローナル
抗体及び／又はモノクローナル抗体、あるいは抗体フラ
グメントを用いて実施するので、前記パラニトロフェノ
キシ系有機リン化合物、特にはパラニトロフェノキシ構
造を有する有機リン系農薬を正確に測定することができ
る。また、本発明の測定方法においては、有機溶媒耐性
モノクローナル抗体を用いると、測定対象のパラニトロ
フェノキシ系有機リン化合物を充分に溶解することので
きる有機溶媒を含有する有機水性系中でも正確な抗原抗
体反応を進行させることができる。Since the method for immunologically measuring the compound represented by the general formula (I) according to the present invention is carried out by using the polyclonal antibody and / or the monoclonal antibody or the antibody fragment, the paranitrophenoxy compound is used. It is possible to accurately measure an organic phosphorus compound of a system, in particular, an organic phosphorus pesticide having a para-nitrophenoxy structure. In the measuring method of the present invention, when an organic solvent-resistant monoclonal antibody is used, an accurate antigen-antibody in an organic aqueous system containing an organic solvent capable of sufficiently dissolving the paranitrophenoxy-based organophosphorus compound to be measured The reaction can proceed.

【００２９】本発明による測定方法は、パラニトロフェ
ノキシ系有機リン化合物、特にはパラニトロフェノキシ
構造を有する有機リン系農薬に反応するポリクローナル
抗体及び／又はモノクローナル抗体を用いること、そし
て好ましくは有機溶媒耐性抗体を用いること（従って、
有機溶媒の存在下で抗原抗体反応を実施すること）を除
けば、それ以外の点では従来公知の免疫学的測定方法に
そのまま適用することができる。すなわち、酵素免疫測
定法、ラテックス凝集法、又は放射性免疫測定法等に適
用することができる。酵素免疫測定法には、抗体を酵素
標識して、固相化した抗原及び試料中のパラニトロフェ
ノキシ系有機リン化合物と競合反応させる酵素標識法の
内、直接競合法と通常呼ばれる方法、若しくは未標識の
抗体と固相化した抗原及び試料中のパラニトロフェノキ
シ系有機リン化合物を競合反応させた後、固相化した抗
原に結合した抗体を、酵素標識した二次抗体を用いて検
出する間接競合法と通常呼ばれる方法、又は抗体を固相
化し、標識化した抗原と試料中のパラニトロフェノキシ
系有機リン化合物とを競合させる抗原標識法と通常呼ば
れる方法などがある。ここでは、抗体標識法の内、間接
競合法と通常呼ばれる測定法に沿って、本発明方法を以
下に説明する。The measurement method according to the present invention uses a paranitrophenoxy-type organophosphorus compound, particularly a polyclonal antibody and / or a monoclonal antibody which reacts with an organophosphorus pesticide having a paranitrophenoxy structure, and preferably an organic solvent resistance Using antibodies (hence,
Except for the fact that the antigen-antibody reaction is carried out in the presence of an organic solvent), it can be applied as it is to a conventionally known immunological measurement method as it is. That is, it can be applied to enzyme immunoassay, latex agglutination, radioimmunoassay and the like. In the enzyme immunoassay, an antibody is enzyme-labeled, and among the enzyme-labeling methods in which the immobilized antigen and the paranitrophenoxy-type organophosphorus compound in the sample are competitively reacted, a method usually called a direct competitive method, or After the competitive reaction of the labeled antibody with the immobilized antigen and the paranitrophenoxy-type organophosphorus compound in the sample, the antibody bound to the immobilized antigen is detected using an enzyme-labeled secondary antibody. There is a method usually called a competitive method, or a method usually called an antigen labeling method in which an antibody is immobilized on a solid phase and the labeled antigen and the paranitrophenoxy-based organophosphorus compound in the sample compete with each other. Here, among the antibody labeling methods, the method of the present invention will be described below along with a measurement method usually called an indirect competitive method.

【００３０】本発明による測定方法により、パラニトロ
フェノキシ系有機リン化合物、特にはパラニトロフェノ
キシ構造を有する有機リン系農薬を測定する場合には、
例えば、 （１）ハプテン〔例えば、前記一般式（VI）で表される
パラニトロフェノキシアルキル誘導体〕と、担体、特に
は生体高分子担体（例えば、血清アルブミン又は免疫グ
ロブリン等）との結合体を固相化する（以下、固相化抗
原と称する）工程； （２）被検試料（例えば、土壌、水、又は食品）を有機
溶媒（特には、水混和性有機溶媒）で抽出し、場合によ
り緩衝液で希釈して検体を調製する工程； （３）前記固相化抗原と、前記検体と、一定量の本発明
の抗体、すなわちパラニトロフェノキシ系有機リン化合
物に対して反応する抗体、特には有機溶媒に耐性を有す
る抗体（以下、第１抗体と称する）とを混合し、競合反
応させる工程； （４）固相化抗原と結合した第１抗体と、検体中のパラ
ニトロフェノキシ系有機リン化合物と結合した第１抗体
とを分離する工程； （５）標識化した抗マウス抗体（以下、第２抗体と称す
る）を、固相化抗原と結合した第１抗体に接触させる工
程； （６）固相化抗原に結合した第１抗体に更に結合した第
２抗体と、第１抗体と結合していない第２抗体とを分離
する工程；及び （７）前記工程（６）で分離したいずれか一方、好まし
くは第１抗体と結合した第２抗体が有する標識からの信
号を測定する工程からなる。When a paranitrophenoxy-based organophosphorus compound, particularly an organophosphorus pesticide having a paranitrophenoxy structure, is to be measured by the measuring method according to the present invention,
For example, (1) a conjugate of a hapten [for example, a paranitrophenoxyalkyl derivative represented by the general formula (VI)] and a carrier, particularly a biopolymer carrier (eg, serum albumin or immunoglobulin) (2) A test sample (for example, soil, water, or food) is extracted with an organic solvent (particularly, a water-miscible organic solvent) when immobilized (hereinafter, referred to as immobilized antigen); A step of preparing a sample by diluting it with a buffer solution according to: (3) the solid-phased antigen, the sample, and a certain amount of the antibody of the present invention, that is, an antibody that reacts with a para-nitrophenoxy-based organophosphorus compound, In particular, a step of mixing with an antibody having resistance to an organic solvent (hereinafter referred to as the first antibody) to cause a competitive reaction; (4) The first antibody bound to the immobilized antigen and the paranitrophenoxy system in the sample Combined with organic phosphorus compounds (5) contacting the labeled anti-mouse antibody (hereinafter referred to as the second antibody) with the first antibody bound to the solid-phased antigen; (6) solid phase A second antibody further bound to the first antibody bound to the activated antigen and a second antibody not bound to the first antibody; and (7) one of the two separated in step (6), Preferably, it comprises the step of measuring the signal from the label of the second antibody bound to the first antibody.

【００３１】本発明方法で用いることのできる有機溶媒
は、パラニトロフェノキシ系有機リン化合物を溶解でき
る溶媒である。水混和性有機溶媒は、有機溶媒抽出液を
水で適当に希釈してから、抗原抗体反応を行うことがで
きるので好ましい。有機溶媒としては、例えば、アルコ
ール化合物（例えば、炭素原子１〜２個の低級アルコー
ル、特には、メチルアルコール、エチルアルコール）、
ケトン化合物（特には、アセトン）、若しくはアセトニ
トリル、又はこれらの混合物を挙げることができる。The organic solvent which can be used in the method of the present invention is a solvent which can dissolve the para-nitrophenoxy type organic phosphorus compound. The water-miscible organic solvent is preferable because the antigen-antibody reaction can be performed after appropriately diluting the organic solvent extract with water. Examples of the organic solvent include alcohol compounds (for example, lower alcohols having 1 to 2 carbon atoms, particularly methyl alcohol and ethyl alcohol),
Mention may be made of ketone compounds (in particular acetone), or acetonitrile, or mixtures thereof.

【００３２】本発明方法を実施する場合には、標識化第
２抗体を用いてパラニトロフェノキシ系有機リン化合物
の確認又は定量を行うことができる。抗体の標識には、
公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、³²Ｐ、
³⁵Ｓ、若しくは ³Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダー
ゼ、若しくはアルカリフォスファターゼ）、ビタミン
（例えば、ビオチン）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴ
Ｃ）、又は化学発光物質（例えば、アクリジニウム）等
を用いることができる。In carrying out the method of the present invention, the labeled second antibody can be used to confirm or quantify the para-nitrophenoxy type organophosphorus compound. For labeling antibodies,
Known labels such as radioisotopes (eg, ³² P,
³⁵ S, or ³ H), enzyme (eg, peroxidase or alkaline phosphatase), vitamin (eg, biotin), fluorescent substance (eg, FIT)
C), or a chemiluminescent substance (eg, acridinium) or the like can be used.

【００３３】標識化第２抗体は、第１抗体と、パラニト
ロフェノキシ系有機リン化合物及び固相化抗原との競合
反応工程が終了してから反応系に加えることができる。
すなわち、第１抗体を、パラニトロフェノキシ系有機リ
ン化合物及び固相化抗原と競合反応させた後、固相化抗
原と結合しなかった第１抗体を分離除去してから標識化
第２抗体を加えると、固相化抗原と結合した第１抗体に
対して標識化第２抗体が結合する。The labeled second antibody can be added to the reaction system after the step of competitive reaction between the first antibody, the paranitrophenoxy type organic phosphorus compound and the solid phase antigen is completed.
That is, after the first antibody is competitively reacted with the paranitrophenoxy-based organophosphorus compound and the solid-phased antigen, the first antibody that has not bound to the solid-phased antigen is separated and removed, and then the labeled second antibody is added. When added, the labeled second antibody binds to the first antibody bound to the immobilized antigen.

【００３４】本発明方法では、第１抗体と、パラニトロ
フェノキシ系有機リン化合物と、固相化抗原との競合反
応が終了した後で、固相化抗原に結合した第１抗体を分
離する。分離は、例えば、濾過、遠心処理、又は緩衝液
による洗浄によって行うことができる。更に、固相化抗
原に結合した第１抗体と標識化第２抗体との反応が終了
した後で、第１抗体と結合しなかった標識化第２抗体を
分離し、続いて、例えば、第１抗体と結合した標識化第
２抗体の標識からの信号を測定する。信号を測定する際
には、標識化第２抗体を含む反応系を信号測定に適した
条件に変えることが好ましい。例えば、標識として蛍光
又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない
条件で信号を測定する。In the method of the present invention, the first antibody bound to the solid-phased antigen is separated after the competitive reaction between the first antibody, the paranitrophenoxy type organic phosphorus compound and the solid-phased antigen is completed. Separation can be performed, for example, by filtration, centrifugation, or washing with a buffer. Furthermore, after the reaction between the first antibody bound to the solid-phased antigen and the labeled second antibody is completed, the labeled second antibody not bound to the first antibody is separated, and subsequently, for example, The signal from the label of the labeled secondary antibody bound to the 1 antibody is measured. When measuring a signal, it is preferable to change the reaction system containing the labeled second antibody to conditions suitable for signal measurement. For example, when a fluorescent or chemiluminescent substance is used as the label, the signal is measured under the condition that quenching does not occur.

【００３５】[0035]

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：パラニトロフェノキシ構造を有するハプテン
とタンパク質との結合体の作製 有機リン系農薬の代表的な部分構造の一つであるパラニ
トロフェノキシ構造と、カルボキシル基とを有する前記
式（VI−２）で表される１−（パラニトロフェノキシ酪
酸（以下、Ｍ−ＰＡと称する）２５ｍｇを無水ジオキサ
ン２ｍｌに溶解した後、Ｎ−メチルモルホリン５０μｌ
を添加し、１０℃で１０分間撹拌した。次いで、イソブ
チルクロロカーボネート２０μｌを少しずつ添加し、２
０分間撹拌した。一方、オボアルブミン８０ｍｇを蒸留
水１ｍｌに溶解した後、１０℃でジオキサン２．６ｍｌ
を滴下し、更に１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ９に調整した。こ
のオボアルブミン溶液に、１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ９に保
ちながら、先に調製したＭ−ＰＡ溶液を徐々に滴下し、
４℃で４時間反応させた。反応終了後、ダルベコのリン
酸緩衝液〔以下、ＰＢＳ（−）と称する〕に対して透析
し、Ｍ−ＰＡとオボアルブミンとの結合体を得た。オボ
アルブミンの代わりに牛血清アルブミンを用いたことを
除いては、前記工程と同じ操作を行ない、Ｍ−ＰＡと牛
血清アルブミンとの結合体を得た。Ｍ−ＰＡとオボアル
ブミンとの結合体及びＭ−ＰＡと牛血清アルブミンとの
結合体は、凍結乾燥後、各々免疫原及び分析用抗原とし
て用いた。EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but these examples do not limit the scope of the present invention. Example 1: Hapten having a para-nitrophenoxy structure
Preparation of a conjugate of a protein and a protein 1- (paranitro represented by the above formula (VI-2) having a paranitrophenoxy structure, which is one of the typical partial structures of organophosphorus pesticides, and a carboxyl group. After dissolving 25 mg of phenoxybutyric acid (hereinafter referred to as M-PA) in 2 ml of anhydrous dioxane, 50 μl of N-methylmorpholine
Was added and stirred at 10 ° C. for 10 minutes. Then, 20 μl of isobutyl chlorocarbonate was added little by little, and 2
Stirred for 0 minutes. On the other hand, after dissolving 80 mg of ovalbumin in 1 ml of distilled water, 2.6 ml of dioxane was added at 10 ° C.
Was added dropwise, and the pH was adjusted to 9 with 1N-NaOH. To this ovalbumin solution, while maintaining pH 9 with 1N-NaOH, the previously prepared M-PA solution was gradually added dropwise,
The reaction was carried out at 4 ° C for 4 hours. After completion of the reaction, it was dialyzed against a Dulbecco's phosphate buffer solution (hereinafter referred to as PBS (-)) to obtain a conjugate of M-PA and ovalbumin. The same operation as the above step was performed except that bovine serum albumin was used instead of ovalbumin to obtain a conjugate of M-PA and bovine serum albumin. The conjugate of M-PA and ovalbumin and the conjugate of M-PA and bovine serum albumin were used as an immunogen and an antigen for analysis after lyophilization.

【００３６】実施例２：Ｍ−ＰＡとオボアルブミンとの
結合体のマウスへの免疫 Ｍ−ＰＡとオボアルブミンとの結合体１００μｇを免疫
原として、ＰＢＳ（−）５０μｌに溶解し、等量のフロ
イントの完全アジュバントと混合した後、マウスに皮下
接種することによって、マウスへの免疫を行った。１カ
月後と３カ月後に、それぞれ初回免疫量の１／４量を追
加免疫した。 Example 2: M-PA with ovalbumin
Immunization of Conjugate to Mice 100 μg of the conjugate of M-PA and ovalbumin was used as an immunogen, dissolved in 50 μl of PBS (−), mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant, and then subcutaneously inoculated into mice. The mice were immunized with. One month and three months later, 1/4 of the initial immunization was boosted.

【００３７】実施例３：ポリクローナル抗体液の調製 前記実施例２で免疫したマウスの腹水を、以下の方法で
採取することによりポリクローナル抗体液を得た。ま
ず、追加免疫の１週間後に、エールリッヒ腹水癌細胞を
１×１０⁷ 細胞／マウスの量で接種した。その１週間後
に、貯留した腹水を採取し、１０，０００ｒｐｍで１０
分間遠心分離し、その上清をポリクローナル抗体液とし
た。こうして得られたポリクローナル抗体ＳＰ２−３を
以下の実施例で用いた。 Example 3: Preparation of Polyclonal Antibody Solution The ascites of the mice immunized in Example 2 above was collected by the following method to obtain a polyclonal antibody solution. First, one week after the booster immunization, Ehrlich ascites tumor cells were inoculated at a dose of 1 × 10 ⁷ cells / mouse. One week after that, the collected ascites fluid was collected and subjected to 10 rpm at 10,000 rpm.
Centrifuged for minutes, and the supernatant was used as a polyclonal antibody solution. The polyclonal antibody SP2-3 thus obtained was used in the following examples.

【００３８】実施例４：モノクローナル抗体の作製 細胞融合に用いるために、前記実施例２で免疫したマウ
スから、最終免疫の３日後に脾臓を摘出した。まず、摘
出した脾臓をイスコフ改変ダルベッコ培地（以下、イス
コフ培地と称する）で３回洗浄し、組織中の脾臓細胞を
イスコフ培地中に取り出した。この細胞懸濁液をステン
レスメッシュで濾過して大きな固形物を除き、得られた
脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３とを各々イスコフ培地で３回洗浄後、細胞数
の比で５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）になるよう
に混ぜ、遠心（１，２００ｒｐｍ、５分間）して細胞沈
さを得た。これに３７℃に暖めておいた５０％ポリエチ
レングリコール（分子量１，５００）溶液１ｍｌを、ゆ
っくり加え、細胞を融合した。１分間反応させた後、イ
スコフ培地１０ｍｌをゆっくり添加し、牛胎児血清（以
下、ＦＢＳと称する）１ｍｌを更に添加することによっ
て、細胞融合を停止した。得られた細胞を、ＨＡＴ培地
（イスコフ／１０％ＦＢＳ培地に、１３．６μｇ／ｍｌ
ヒポキサンチン、１７６ｎｇ／ｍｌアミノプテリン、及
び３．８８μｇ／ｍｌチミジンを添加したもの）に懸濁
し、９６ウェルのマイクロタイタープレート中に２×１
０⁵ 細胞／ｍｌの濃度で分注して、３７℃、５％二酸化
炭素存在下で１０日間から１４日間培養した。培養後、
実施例１で調製したＭ−ＰＡと牛血清アルブミンとの結
合体を用いて、それぞれの培養液中の抗体産生の有無を
スクリーニングした。 Example 4 Preparation of Monoclonal Antibody For use in cell fusion, the spleen was extracted from the mouse immunized in Example 2 3 days after the final immunization. First, the excised spleen was washed three times with Iscove's modified Dulbecco's medium (hereinafter referred to as Iscove's medium), and the spleen cells in the tissue were taken out into the Iscove's medium. This cell suspension was filtered through a stainless mesh to remove large solids, and the resulting spleen cells and mouse myeloma cells P3-X63-Ag.
8.653 and 3 were washed with Iscove's medium three times, and mixed at a cell number ratio of 5: 1 (spleen cells: myeloma cells) and centrifuged (1,200 rpm, 5 minutes) to precipitate the cells. Obtained. To this, 1 ml of a 50% polyethylene glycol (molecular weight 1,500) solution that had been warmed to 37 ° C. was slowly added to fuse the cells. After reacting for 1 minute, 10 ml of Iscove's medium was slowly added, and 1 ml of fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS) was further added to stop the cell fusion. The obtained cells were mixed with HAT medium (Iscove / 10% FBS medium at 13.6 μg / ml).
Hypoxanthine, 176 ng / ml aminopterin, and 3.88 μg / ml thymidine) and suspended in a 96-well microtiter plate at 2 × 1.
The cells were dispensed at a concentration of 0 ⁵ cells / ml and cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for 10 to 14 days. After culture
Using the conjugate of M-PA and bovine serum albumin prepared in Example 1, the presence or absence of antibody production in each culture was screened.

【００３９】抗体の活性は、ＥＬＩＳＡ法によって測定
した。まず、Ｍ−ＰＡと牛血清アルブミンとの結合体を
０．５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（−）に溶解し、この
溶液１００μｌ／ウェルを９６ウェルのマイクロタイタ
ープレートに添加した後、４℃で１晩静置して抗原を固
相化した。次に、１％ＢＳＡと６２ｍＭ塩化ナトリウム
とを含有した８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以
下、ブロッキングバッファーと称する）２５０μｌ／ウ
ェルに置き換え、室温で１時間ブロッキング反応を行っ
た。６２ｍＭ塩化ナトリウムを含有する８５ｍＭホウ酸
緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、洗浄液と称する）で３回
洗浄後、ハイブリドーマの培養上清７５μｌ／ウェルを
加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液で
３回洗浄した後、２次抗体希釈液〔０．３％ＢＳＡと６
２ｍＭ塩化ナトリウムとを含有する８５ｍＭホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．０）〕で１，０００倍に希釈したペルオキ
シダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）を１００
μｌ／ウェル加え、１時間反応させた。ブロッキングバ
ッファー液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質
溶液〔０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
５）、１００μｇ／ｍｌテトラメチルベンチジン（ＴＭ
ＢＺ）及び０．００６％Ｈ₂ Ｏ₂ 含有〕１００μｌ／ウ
ェルを加えて発色させ、１０分後に２Ｎ硫酸を加えて発
色反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度を測定するこ
とによって、抗体を産生している細胞を含むウェルを選
び出した。The activity of the antibody was measured by the ELISA method. First, the conjugate of M-PA and bovine serum albumin was dissolved in PBS (−) at a concentration of 0.5 μg / ml, 100 μl / well of this solution was added to a 96-well microtiter plate, and then at 4 ° C. The antigen was solid-phased by standing still overnight. Next, the solution was replaced with 250 μl / well of 85 mM borate buffer (pH 8.0) containing 1% BSA and 62 mM sodium chloride (hereinafter referred to as blocking buffer), and the blocking reaction was performed at room temperature for 1 hour. After washing three times with 85 mM borate buffer (pH 8.0) containing 62 mM sodium chloride (hereinafter referred to as a washing solution), 75 μl / well of hybridoma culture supernatant was added and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was washed 3 times with the washing solution and then diluted with the secondary antibody [0.3% BSA and 6
A peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody (secondary antibody) diluted 1,000-fold with 85 mM borate buffer (pH 8.0) containing 2 mM sodium chloride was added to 100
μl / well was added and reacted for 1 hour. After washing three times with a blocking buffer solution, a substrate solution of peroxidase [0.1 M acetic acid-sodium acetate buffer solution (pH 5.
5), 100 μg / ml tetramethylbenzidine (TM
BZ) and 0.006% H ₂ O ₂ ]] 100 μl / well was added, and after 10 minutes, 2N sulfuric acid was added to stop the color reaction. Wells containing cells producing antibody were selected by measuring the absorbance at 450 nm.

【００４０】この結果、Ｍ−ＰＡと牛血清アルブミンと
の結合体への反応が陽性であった培養上清を含むウェル
の内、更に有機リン系農薬のメチルパラチオンによる阻
害反応が起こるものを間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用い
て二次スクリーニングした。まず、上記のＥＬＩＳＡ法
と同様、Ｍ−ＰＡと牛血清アルブミンとの結合体を０．
５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（−）に溶解し、この溶液
１００μｌ／ウェルを９６ウェルのマイクロタイタープ
レートに添加した後、４℃で一晩抗原を固相化した。次
に、ブロッキングバッファー２５０μｌ／ウェルに置き
換え、室温で１時間ブロッキング反応を行った。洗浄液
で３回洗浄後、１％メタノールと６２ｍＭ塩化ナトリウ
ムとを含む８５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）に１μ
ｇ／ｍｌの濃度に溶解したメチルパラチオン（和光純薬
工業）溶液５０μｌ／ウェルを加え、直ちに等量の培養
上清を加えて混合し、室温にて１時間反応させた。洗浄
液で３回洗浄後、二次抗体希釈液で１，０００倍に希釈
した前記の二次抗体を１００μｌ／ウェル加え、１時間
反応させた。再び洗浄液で３回洗浄後、ペルオキシダー
ゼの基質溶液１００μｌ／ウェルを加えて発色させ、１
０分後に２Ｎ硫酸を加えて発色反応を停止させた後、４
５０ｎｍの吸光度を測定した。As a result, among the wells containing the culture supernatant, which had a positive reaction to the conjugate of M-PA and bovine serum albumin, those in which the inhibition reaction by the organophosphorus pesticide, methylparathion, occurred were indirectly competed. Secondary screening was performed using the inhibition ELISA method. First, as in the case of the above-mentioned ELISA method, the conjugate of M-PA and bovine serum albumin was adjusted to 0.
It was dissolved in PBS (-) at a concentration of 5 μg / ml, 100 μl / well of this solution was added to a 96-well microtiter plate, and then the antigen was immobilized at 4 ° C. overnight. Next, the blocking buffer was replaced with 250 μl / well, and the blocking reaction was performed at room temperature for 1 hour. After washing three times with a washing solution, 1 μm was added to an 85 mM borate buffer solution (pH 8.0) containing 1% methanol and 62 mM sodium chloride.
50 μl / well of a methylparathion (Wako Pure Chemical Industries) solution dissolved at a concentration of g / ml was added, and an equal amount of culture supernatant was immediately added and mixed, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times with the washing solution, 100 µl / well of the above-mentioned secondary antibody diluted 1,000 times with the secondary antibody dilution solution was added and reacted for 1 hour. After washing again with the washing solution three times, 100 μl / well of substrate solution of peroxidase was added to develop color, and 1
After 0 minutes, 2N sulfuric acid was added to stop the color reaction, and then 4
Absorbance at 50 nm was measured.

【００４１】二次スクリーニングの結果、目的とする抗
体を産生しているウェルのハイブリドーマについて、限
界希釈法によって細胞クローニングを行った。細胞クロ
ーニングの結果、Ｍ−ＰＡ／牛血清アルブミン結合体と
の反応をメチルパラチオンによって阻害されるモノクロ
ーナル抗体を産生しているハイブリドーマを３株（１８
−２株、６１−６株、及び７０−５株）得た。それらの
ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をそれぞ
れ、１８−２、６１−６、及び７０−５と称する。得ら
れたモノクローナル抗体の免疫グロブリンサブクラスを
表１に示す。それらのハイブリドーマをイスコフ／１０
％ＦＢＳ培地で培養し、それぞれの培養上清をモノクロ
ーナル抗体液として以下の実験に用いた。As a result of the secondary screening, the hybridoma in the well producing the desired antibody was subjected to cell cloning by the limiting dilution method. As a result of cell cloning, 3 strains of hybridomas producing a monoclonal antibody that inhibits the reaction with the M-PA / bovine serum albumin conjugate by methylparathion (18
-2 strain, 61-6 strain, and 70-5 strain) were obtained. The monoclonal antibodies produced by these hybridomas are referred to as 18-2, 61-6, and 70-5, respectively. Table 1 shows the immunoglobulin subclasses of the obtained monoclonal antibodies. Iskoff / 10 for those hybridomas
The cells were cultured in a% FBS medium, and each culture supernatant was used as a monoclonal antibody solution in the following experiment.

【００４２】[0042]

【表１】 [Table 1]

【００４３】実施例５：間接競合ＥＬＩＳＡ法によるモ
ノクローナル抗体７０−５又はポリクローナル抗体ＳＰ
２−３とメチルパラチオンとの反応性 前記実施例４で得られたモノクローナル抗体７０−５、
及び前記実施例３で得られたポリクローナル抗体ＳＰ２
−３について、以下に示す間接競合ＥＬＩＳＡ法によっ
てパラニトロフェノキシ構造を有する有機リン系農薬の
１種であるメチルパラチオンに対する測定感度を調べ
た。Ｍ−ＰＡと牛血清アルブミンとの結合体を、０．５
μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ（−）に溶解し、
得られた溶液１００μｌ／ウェルを９６ウェルのマイク
ロタイタープレートに添加した後、４℃で１晩静置する
ことにより固相化した。次に、ブロッキングバッファー
２５０μｌ／ウェルに置き換え、室温で１時間ブロッキ
ングした。各ウエルを洗浄液で３回洗浄した後、１％メ
タノールと６２ｍＭ塩化ナトリウムとを含む８５ｍＭホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で段階的に濃度を変化させ
たメチルパラチオン溶液５０μｌ／ウェルを加え、直ち
に６２ｍＭ塩化ナトリウムを含む８５ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で適当な濃度に希釈した抗体液（モノク
ローナル抗体７０−５液又はポリクローナル抗体ＳＰ２
−３液）５０μｌ／ウェルを加えて混合し、室温にて１
時間反応させた（以下、競合反応工程と称する）。再び
洗浄液で３回洗浄してから、２次抗体希釈液で１，００
０倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗
体１００μｌ／ウェルを加え、１時間反応させた。洗浄
液で３回洗浄した後、前記実施例４で示した手順に従っ
て、ペルオキシダーゼの基質溶液を発色させ、４５０ｎ
ｍの吸光度を測定した。 Example 5: Indirect competitive ELISA
Noclonal antibody 70-5 or polyclonal antibody SP
Reactivity of 2-3 with methyl parathion Monoclonal antibody 70-5 obtained in Example 4 above,
And the polyclonal antibody SP2 obtained in Example 3 above
For -3, the measurement sensitivity to methyl parathion, which is one of organophosphorus pesticides having a para-nitrophenoxy structure, was examined by the indirect competitive ELISA method shown below. The conjugate of M-PA and bovine serum albumin was added to 0.5
Dissolve in PBS (-) so that the concentration becomes μg / ml,
100 μl / well of the obtained solution was added to a 96-well microtiter plate and then left standing at 4 ° C. overnight to immobilize it. Next, the blocking buffer was replaced with 250 μl / well, and blocking was performed at room temperature for 1 hour. After washing each well three times with a washing solution, 50 μl / well of a solution of methylparathion in which the concentration was changed stepwise in an 85 mM borate buffer solution (pH 8.0) containing 1% methanol and 62 mM sodium chloride was added, and immediately. Antibody solution (monoclonal antibody 70-5 solution or polyclonal antibody SP2) diluted to an appropriate concentration with 85 mM borate buffer solution (pH 8.0) containing 62 mM sodium chloride.
-3 solution) 50 μl / well was added and mixed, and 1 at room temperature
The reaction was carried out for a time (hereinafter referred to as a competitive reaction step). Wash 3 times with the washing solution again, then use the secondary antibody diluent to
100 μl / well of 0-fold diluted peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody was added, and the mixture was reacted for 1 hour. After washing with the washing solution three times, the substrate solution of peroxidase was allowed to develop color according to the procedure described in Example 4 above, and 450 n
m was measured.

【００４４】モノクローナル抗体７０−５とメチルパラ
チオンとの反応性を図１に、ポリクローナル抗体ＳＰ２
−３とメチルパラチオンとの反応性を図２に示した。図
１の結果から、モノクローナル抗体７０−５は、約０．
５〜約１２．５μｇ／ｍｌの範囲で定量的にメチルパラ
チオンを測定することができることが明らかとなった。
図２の結果から、ポリクローナル抗体ＳＰ２−３は、約
０．２〜約５０μｇ／ｍｌの範囲で定量的にメチルパラ
チオンを測定することができることが明らかとなった。The reactivity of the monoclonal antibody 70-5 with methyl parathion is shown in FIG.
The reactivity between -3 and methyl parathion is shown in FIG. From the result of FIG. 1, the monoclonal antibody 70-5 was about 0.
It was revealed that methylparathion can be quantitatively measured in the range of 5 to about 12.5 μg / ml.
From the results of FIG. 2, it was revealed that the polyclonal antibody SP2-3 can quantitatively measure methylparathion in the range of about 0.2 to about 50 μg / ml.

【００４５】実施例６：モノクローナル抗体７０−５及
びポリクローナル抗体ＳＰ２−３のメチルアルコール耐
性 前記実施例５で用いたモノクローナル抗体７０−５及び
ポリクローナル抗体ＳＰ２−３について、前記実施例５
に示した間接競合ＥＬＩＳＡ法を用いてメチルアルコー
ルに対する耐性を調べた。実施例５と同じ希釈率で各一
次抗体を希釈し、同時に競合反応工程の反応溶液中の最
終濃度が０〜５０％の範囲で所定の濃度となるようにメ
チルアルコールを添加して使用した。メチルパラチオン
との反応において、モノクローナル抗体７０−５のメチ
ルアルコール耐性の結果を図３に、ポリクローナル抗体
ＳＰ２−３のメチルアルコール耐性の結果を図４に示し
た。図３の結果から、モノクローナル抗体７０−５は、
メチルアルコール濃度４０％までは、徐々に測定感度が
低下するものの、十分定量的にメチルパラチオンを測定
することができることが明らかとなった。一方、図４の
結果から、ポリクローナル抗体ＳＰ２−３は、メチルア
ルコール濃度１０％までは比較的安定で測定することも
可能だが、それよりも高濃度では急速に感度が低下する
ことが明らかとなった。 Example 6: Monoclonal antibody 70-5 and
And polyclonal antibody SP2-3 methyl alcohol resistance
For monoclonal antibodies 70-5 and polyclonal antibodies SP2-3 used in sexual Example 5, Example 5
The resistance to methyl alcohol was examined using the indirect competitive ELISA method described in (1). Each primary antibody was diluted at the same dilution rate as in Example 5, and at the same time, methyl alcohol was added so that the final concentration in the reaction solution of the competitive reaction step was a predetermined concentration in the range of 0 to 50%. In the reaction with methyl parathion, the result of methyl alcohol resistance of the monoclonal antibody 70-5 is shown in FIG. 3, and the result of methyl alcohol resistance of the polyclonal antibody SP2-3 is shown in FIG. From the results of FIG. 3, the monoclonal antibody 70-5 was
It was revealed that methylparathione can be sufficiently quantitatively measured at a methyl alcohol concentration of up to 40%, although the measurement sensitivity gradually decreases. On the other hand, from the results of FIG. 4, it is clear that the polyclonal antibody SP2-3 is relatively stable and can be measured up to a methyl alcohol concentration of 10%, but the sensitivity is rapidly decreased at higher concentrations. It was

【００４６】実施例７：メチルパラチオンの誘導体及び
類縁農薬との交差反応性 前記実施例５で示した条件を用いて、メチルパラチオン
の代わりにその誘導体又は類縁農薬と反応させ、モノク
ローナル抗体７０−５及びポリクローナル抗体ＳＰ２−
３の交差反応性を調べた。本実施例では、メチルパラチ
オン、ＥＰＮ（和光純薬工業）、フェンチオン（和光純
薬工業）、パラチオン（和光純薬工業）、プロパホス
（和光純薬工業）、スルプロホス（ヘキスト）、フェニ
トロチオン（和光純薬工業）、フェンスルホチオン（和
光純薬工業）、 ｐ−ニトロ安息香酸（和光純薬工
業）、ｐ−ニトロアニソール（和光純薬工業）、及びｏ
−ニトロアニソール（和光純薬工業）を使用した。それ
ぞれの抗体のメチルパラチオン又はその関連化合物のＩ
Ｃ₅₀値（μｇ／ｍｌ）及び交差反応性値（％）の結果を
表２に示す。なお、ＩＣ₅₀値とは、対象となる被検化合
物を加えずに反応させた場合の吸光度を１００％とし
て、その５０％を阻害するのに必要な被検化合物の濃度
をその被検化合物のＩＣ₅₀値（μｇ／ｍｌ）とした。ま
た、交差反応性値（％）とは、メチルパラチオンのＩＣ
₅₀値を１００％としたときの各供試化合物のＩＣ₅₀値の
百分率と定義し、以下の式により求めた。 交差反応性値（％）＝（メチルパラチオンのＩＣ₅₀／供
試化合物のＩＣ₅₀）×１００ Example 7: Derivatives of methyl parathion and
Cross-Reactivity with Related Pesticides Using the conditions described in Example 5 above, a reaction was made with a derivative or related pesticide instead of methylparathione, and monoclonal antibody 70-5 and polyclonal antibody SP2-
The cross reactivity of 3 was investigated. In this example, methylparathion, EPN (Wako Pure Chemical Industries), fenthion (Wako Pure Chemical Industries), parathion (Wako Pure Chemical Industries), propaphos (Wako Pure Chemical Industries), sulprophos (Hoechst), fenitrothion (Wako Pure Chemical Industries). ), Phensulfothion (Wako Pure Chemical Industries), p-nitrobenzoic acid (Wako Pure Chemical Industries), p-nitroanisole (Wako Pure Chemical Industries), and o
-Nitroanisole (Wako Pure Chemical Industries) was used. I of methylparathion of each antibody or its related compounds
The results of C ₅₀ value (μg / ml) and cross-reactivity value (%) are shown in Table 2. The IC ₅₀ value is defined as the concentration of a test compound required to inhibit 50% of the test compound, assuming that the absorbance is 100% when the reaction is performed without adding the test compound to be tested. The IC ₅₀ value (μg / ml) was used. The cross-reactivity value (%) is the IC of methyl parathion.
_It was defined as the percentage of the IC ₅₀ value of each test compound when the ₅₀ value was 100%, and was calculated by the following formula. Cross-reactivity value (%) = (IC ₅₀ of IC ₅₀ / test compound of methyl parathion) × 100

【００４７】[0047]

【表２】 モノクローナル 抗体７０−５ ホ゜リクローナル 抗体ＳＰ２−３ 化合物名 ＩＣ₅₀ 交差反応性（％） ＩＣ₅₀ 交差反応性（％） メチルパラチオン １．５ １００ ５．７ １００ ＥＰＮ（＊） ３．３ ４５．５ ＞５０ ＜１１．４ フェンチオン ＞５０ ＜３．０ ＞５０ ＜１１．４ パラチオン １２．２ １２．３ ２１．８ ２６．１ プロパホス ＞５０ ＜３．０ ＞５０ ＜１１．４ スルプロホス ＞５０ ＜３．０ ＞５０ ＜１１．４ フェニトロチオン ＞５０ ＜３．０ ９．８ ５８．２ フェンスルホチオン ＞５０ ＜３．０ ＞５０ ＜１１．４ ｐ−ニトロ安息香酸 ＞５０ ＜３．０ ＞５０ ＜１１．４ ｐ−ニトロアニソール ９．３ １６．１ ２．９ １９７ｏ−ニトロアニソール ＞５０ ＜３．０ ＞５０ ＜１１．４ 〔＊〕：ＥＰＮとして、ラセミ体を用いた。Table 2 Monoclonal antibody 70-5 Polyclonal antibody SP2-3 Compound name IC ₅₀ cross-reactivity (%) IC ₅₀ cross-reactivity (%) Methyl parathion 1.5 100 5.7 100 EPN (*) 3.3 45. 5> 50 <11.4 Fenthione> 50 <3.0> 50 <11.4 Parathion 12.2 12.3 21.8 26.1 Propaphos> 50 <3.0> 50 <11.4 Sulprophos> 50 <3.0> 50 <11.4 fenitrothion> 50 <3.0 9.8 58.2 phensulfothion> 50 <3.0> 50 <11.4 p-nitrobenzoic acid> 50 <3.0> 50 <11 .4 p-nitroanisole 9.3 16.1 2.9 197 o-nitroanisole> 50 <3.0> 50 <11.4 [*]: As EPN, racemic Mi body was used.

【００４８】本実施例で用いた各供試化合物の構造式
は、以下のとおりである。The structural formulas of the test compounds used in this example are as follows.

【００４９】[0049]

【表３】 [Table 3]

【００５０】[0050]

【表４】 [Table 4]

【００５１】表２から明らかなように、モノクローナル
抗体７０−５は、パラニトロフェノキシ構造とは異なる
構造を有する他の誘導体又は有機リン系農薬とは、ほと
んど反応しないのに対し、メチルパラチオンだけでな
く、パラニトロフェノキシ構造を有する別の化合物であ
るＥＰＮ、パラチオン、及びｐ−ニトロアニソールとも
有意に高い反応性を示し、前記のパラニトロフェノキシ
系有機リン化合物の複数種類を１回の測定操作で同時に
免疫学的に測定することができることが明らかになっ
た。一方、ポリクローナル抗体ＳＰ２−３は、メチルパ
ラチオンだけでなく、パラニトロフェノキシ構造を有す
る別の化合物であるパラチオン及びｐ−ニトロアニソー
ルとも反応し、更に、フェニトロチオンとも反応し、こ
れら類縁化合物の複数種類を１回の測定操作で同時に免
疫学的に測定することができることが明らかになった。As is clear from Table 2, the monoclonal antibody 70-5 hardly reacts with other derivatives having a structure different from the para-nitrophenoxy structure or organophosphorus pesticides. , Another compound having a para-nitrophenoxy structure, EPN, parathion, and p-nitroanisole showed significantly high reactivity, and a plurality of the above-mentioned para-nitrophenoxy-based organophosphorus compounds were simultaneously measured in one measurement operation. It became clear that it can be measured immunologically. On the other hand, the polyclonal antibody SP2-3 reacts not only with methylparathion but also with another compound having a paranitrophenoxy structure, parathion and p-nitroanisole, and further with fenitrothion. It was revealed that immunoassay can be performed simultaneously by one measurement operation.

【００５２】[0052]

【発明の効果】従来、有機リン系農薬の測定は、ガスク
ロマトグラフィーを用いて測定する方法が採用されてい
たが、その分析には相当の時間と手間を要していた。本
発明による免疫学的測定方法では、例えば、モノクロー
ナル抗体７０−５を用いることにより、メチルパラチオ
ン、ＥＰＮ、及びパラチオンを１回の測定操作で同時に
測定することができ、あるいはポリクローナル抗体ＳＰ
２−３を用いることにより、メチルパラチオン、パラチ
オン、又はフェニトロチオンを１回の測定操作で同時に
測定することができる。また、メチルアルコールを含む
条件下でもメチルパラチオンを測定することができ、例
えば、河川、水田、又は湖沼等から採取した被検水ばか
りでなく、例えば、作物や土壌などの被検試料から有機
溶媒で抽出した抽出液についても容易に測定することが
できると考えられる。従って、本発明による測定方法を
用いることにより、前記一般式（Ｉ）で表される化合物
の測定の大幅な簡略化と測定時間の短縮が可能となり、
多数の検体を迅速かつ安価に測定することができる。EFFECTS OF THE INVENTION Conventionally, a method of measuring an organophosphorus pesticide has been adopted by using gas chromatography, but the analysis requires a considerable amount of time and labor. In the immunological measurement method according to the present invention, for example, by using the monoclonal antibody 70-5, methylparathion, EPN, and parathion can be simultaneously measured by one measurement operation, or the polyclonal antibody SP.
By using 2-3, methylparathion, parathion, or fenitrothion can be simultaneously measured by one measurement operation. Further, methylparathion can be measured even under conditions containing methyl alcohol, for example, not only test water collected from rivers, paddy fields, or lakes, but also organic solvents from test samples such as crops and soil. It is considered that the extracted liquid can be easily measured. Therefore, by using the measurement method according to the present invention, it becomes possible to greatly simplify the measurement of the compound represented by the general formula (I) and shorten the measurement time,
A large number of specimens can be measured quickly and inexpensively.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】モノクローナル抗体７０−５とメチルパラチオ
ンとの反応性を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the reactivity of monoclonal antibody 70-5 with methyl parathion.

【図２】ポリクローナル抗体ＳＰ２−３とメチルパラチ
オンとの反応性を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the reactivity of polyclonal antibody SP2-3 with methyl parathion.

【図３】メチルパラチオンとの反応において、モノクロ
ーナル抗体７０−５のメチルアルコール耐性を示すグラ
フである。FIG. 3 is a graph showing methyl alcohol resistance of monoclonal antibody 70-5 in a reaction with methyl parathion.

【図４】メチルパラチオンとの反応において、ポリクロ
ーナル抗体ＳＰ２−３のメチルアルコール耐性を示すグ
ラフである。FIG. 4 is a graph showing methyl alcohol resistance of polyclonal antibody SP2-3 in a reaction with methyl parathion.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/531 33/563 33/563 33/577 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 竹脇 俊一 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 (72)発明者 喜多 寛 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 (72)発明者 大川 秀郎 兵庫県芦屋市朝日ヶ丘町14−３−403─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI Technical display location G01N 33/53 G01N 33/531 A 33/531 33/563 33/563 33/577 B 33/577 9282-4B C12N 15/00 C // (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Shunichi Takewaki 1-11-4 Higashi-Kanda, Chiyoda-ku, Tokyo Inside the company Yatron (72) Inventor Kita Hiroshi 1-11-4 Higashikanda, Chiyoda-ku, Tokyo Inside the company Yatron (72) Inventor Hideo Okawa 14-3-403 Asahigaoka-cho, Ashiya-shi, Hyogo

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 一般式（VI）： Ｒ¹ −Ｘ_n −Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （VI） （式中、Ｒ¹ は担体と結合することのできる官能基であ
り、Ｘは−ＣＨ₂ −、−ＣＨ₂ Ｏ−、−ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｏ
−、−ＣＯＯ−、又は−ＣＯＮＨ−であり、ｎは１〜７
の整数であり、−Ｐｈ−ＮＯ₂ はパラニトロフェニル基
である）で表されるパラニトロフェノキシアルキル誘導
体と生体高分子担体との結合体を免疫原として用いるこ
とを特徴とする、抗体の製造方法。1. General formula (VI): R ¹ —X _n —O—Ph—NO ₂ (VI) (wherein R ¹ is a functional group capable of binding to a carrier, and X is —CH _{2 -, - CH 2 O -,} - CH 2 CH 2 O
-, -COO-, or -CONH-, and n is 1 to 7
Is a whole number, and -Ph-NO ₂ is a para-nitrophenyl group), and the use of a conjugate of a para-nitrophenoxyalkyl derivative represented by the biopolymer carrier as an immunogen. Method. 【請求項２】 一般式（VI）： Ｒ¹ −Ｘ_n −Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （VI） （式中、Ｒ¹ は担体と結合することのできる官能基であ
り、Ｘは−ＣＨ₂ −、−ＣＨ₂ Ｏ−、−ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｏ
−、−ＣＯＯ−、又は−ＣＯＮＨ−であり、ｎは１〜７
の整数であり、−Ｐｈ−ＮＯ₂ はパラニトロフェニル基
である）で表されるパラニトロフェノキシアルキル誘導
体と担体との結合体を免疫原として用いて調製され、一
般式（Ｉ）： Ａ−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （Ｉ） 〔式中、Ａは、一般式： Ｒ² Ｒ³ Ｐ（＝Ｓ）− （式中、Ｒ² は炭素数１〜４のアルコキシ基又はフェニ
ル基であり、Ｒ³ は炭素数１〜４のアルコキシ基であ
る）で表される基であるか、又は炭素数１〜４のアルキ
ル基であり、−Ｐｈ−ＮＯ₂は前記と同じ意味である〕
で表される化合物２種以上と特異的に反応する抗体。2. General formula (VI): R ¹ —X _n —O—Ph—NO ₂ (VI) (wherein R ¹ is a functional group capable of binding to a carrier, and X is —CH _{2 -, - CH 2 O -,} - CH 2 CH 2 O
-, -COO-, or -CONH-, and n is 1 to 7
An integer, -Ph-NO ₂ are prepared conjugates of para-nitrophenoxy alkyl derivatives and carrier represented by a para-nitrophenyl group) as an immunogen, the general formula (I): A- _{O-Ph-NO 2 (I} ) wherein, a represents the general ^{formula: R 2 R 3 P (=} S) - ( wherein, R ² is an alkoxy group or a phenyl group having 1 to 4 carbon atoms, R ³ is either a group represented by a is) an alkoxy group having from 1 to 4 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, -Ph-NO ₂ is the same as defined above]
An antibody that specifically reacts with two or more compounds represented by. 【請求項３】 請求項２に記載の抗体のフラグメントで
あって、一般式（Ｉ）： Ａ−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （Ｉ） 〔式中、−Ｐｈ−ＮＯ₂ はパラニトロフェニル基であ
り、Ａは、一般式： Ｒ² Ｒ³ Ｐ（＝Ｓ）− （式中、Ｒ² は炭素数１〜４のアルコキシ基又はフェニ
ル基であり、Ｒ³ は炭素数１〜４のアルコキシ基であ
る）で表される基であるか、又は炭素数１〜４のアルキ
ル基である〕で表される化合物に対する抗原結合部位を
含むフラグメント。3. A fragment of the antibody according to claim 2, which has the general formula (I): A—O—Ph—NO ₂ (I) [wherein —Ph—NO ₂ is a paranitrophenyl group]. And A is a general formula: R ² R ³ P (= S)-(wherein, R ² is an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms or a phenyl group, and R ³ is an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms. Which is a group represented by the formula (1) or a C1-4 alkyl group]. 【請求項４】 請求項２に記載の抗体及び／又は請求項
３に記載の抗体フラグメントを用いることを特徴とす
る、一般式（Ｉ）： Ａ−Ｏ−Ｐｈ−ＮＯ₂ （Ｉ） 〔式中、−Ｐｈ−ＮＯ₂ はパラニトロフェニル基であ
り、Ａは、一般式： Ｒ² Ｒ³ Ｐ（＝Ｓ）− （式中、Ｒ² は炭素数１〜４のアルコキシ基又はフェニ
ル基であり、Ｒ³ は炭素数１〜４のアルコキシ基であ
る）で表される基であるか、又は炭素数１〜４のアルキ
ル基である〕で表される化合物の免疫学的測定方法。4. Use of the antibody according to claim 2 and / or the antibody fragment according to claim 3 in the general formula (I): A-O-Ph-NO ₂ (I) [formula In the formula, -Ph-NO ₂ is a paranitrophenyl group, A is a general formula: R ² R ³ P (= S)-(wherein, R ² is an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms or a phenyl group. R ³ is an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms) or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms].