JPH09133681A - 酵素免疫アッセイ装置及び方法 - Google Patents
酵素免疫アッセイ装置及び方法Info
- Publication number
- JPH09133681A JPH09133681A JP26030196A JP26030196A JPH09133681A JP H09133681 A JPH09133681 A JP H09133681A JP 26030196 A JP26030196 A JP 26030196A JP 26030196 A JP26030196 A JP 26030196A JP H09133681 A JPH09133681 A JP H09133681A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- developing solution
- pad
- section
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
Abstract
性に変換することがない酵素免疫アッセイ装置を提供す
ること。 【解決手段】 メンブレン部と、該メンブレン部の両端
にそれぞれ設けられた展開液パッド部と吸収パッド部と
を具備し、前記メンブレン部に検出すべき抗原又は抗体
と反応する抗体又は抗原が標識酵素により標識された標
識体が含有された標識体含有部が設けられ、該標識体含
有部と前記吸収パッドの間には、検出すべき抗原又は抗
体と反応する抗体又は抗原が前記メンブレン部に固定化
された検出部が設けられており、かつ、前記標識体含有
部と前記展開液パッド部との間のメンブレン部に、酵素
反応により発色する、前記標識酵素の基質が乾燥状態で
含有されている基質含有部が設けられている、酵素免疫
アッセイ装置。
Description
抗体を検出するために用いられる酵素免疫アッセイ装置
及びそれを用いた酵素免疫アッセイ方法に関する。
装置として、酵素免疫アッセイ装置が用いられている。
従来の酵素免疫アッセイ装置を図2に模式的に示す。従
来の酵素免疫アッセイ装置は、ニトロセルロース等の材
質から成るメンブレン部20と、その両端にそれぞれ設
けられた、吸水性の材質から成る展開液パッド部22及
び吸収パッド部24を有する。メンブレン部20には、
標識体を点着した標識体点着部26が設けられている。
標識体点着部26には、タンパク質の非特異的吸着を防
止するためにメンブレンをブロッキングした後、検出す
べき抗原又は抗体と反応する抗体又は抗原が酵素標識さ
れた標識体が点着されている。さらに、標識体点着部2
6と吸収パッド部24との間には、検出ライン28が設
けられている。検出ライン28には、検出すべき抗原又
は抗体と反応する抗体又は抗原が固定化されている。
加えると共に展開液パッド部に展開液を加える。展開液
は、標識体の標識酵素の基質であって、酵素反応により
発色する基質を含む。標識体点着部26に点着されてい
る標識体は検体液中の抗原又は抗体と反応し、展開液パ
ッド部22から流れてくる展開液により流されると共
に、該展開液中の基質と反応する。これらが展開液によ
り流されて検出ライン28に到達すると、検体中の抗原
又は抗体が検出ライン28に固定化されている抗体又は
抗原にトラップされ、そこに留まる。この場合、検体中
の抗原又は抗体は、標識体と結合しているから標識体も
検出ラインに留まる。従って、検体液中に検出すべき抗
原又は抗体が含まれている場合には検出ライン28上で
発色が観察される。なお、展開液及びトラップされなか
った他の成分は吸収パッド部24に吸収される。一方、
検体液中に検出すべき抗原又は抗体が含まれない場合に
は、標識体は検出ライン28にトラップされないので、
そのまま吸収パッド部24に吸収されてしまい、検出ラ
イン28上に発色は観察されない。従って、検出ライン
が発色するか否かにより検体中に検出すべき抗原又は抗
体が含まれるか否かを知ることができる。
セイ装置も知られている。この装置では、検出すべき抗
原又は抗体と反応する抗体又は抗原をカラーラテックス
粒子に結合したものが標識体として用いられる。この装
置を模式的に図3に示す。メンブレン30の一端に標識
体点着部32が設けられ、ここに、前記標識体が含有さ
れている。一方、検出ライン36には検出すべき抗原又
は抗体と反応する抗体又は抗原が固定化されている。検
体液は、標識体点着部32の中にある試料点着部位34
に加えられる。検体液及び検体液により溶かされた標識
体が反応しながら流れ、検体液中に検出すべき抗原又は
抗体が含まれる場合には標識体が、上記と同様、検出ラ
イン36にトラップされる。標識体はカラーラテックス
を含むので、検出ライン36が着色する。一方、検体液
中に検出すべき抗原又は抗体が含まれない場合には、標
識体が検出ライン36にトラップされないので検出ライ
ン36は着色しない。従って、検出ライン36が着色さ
れるか否かにより、検体液中に検出すべき抗原又は抗体
が含まれるか否かを知ることができる。
免疫アッセイ装置では、判定時に陰性であった結果が経
時的に陽性に変化することがあるという問題があった。
従って、複数の検体を同一条件で判定する場合には、一
定の判定時間で判定するか又は一定時間経過後に反応停
止液を加えて反応を停止させてから判定する必要があっ
た。しかしながら、臨床検査のように、多数の検体を並
行して検査する場合には、全ての検体について同一の判
定時間で判定を行うことや同一の時間経過後に反応停止
液を加えることは困難である。また、反応停止液を加え
ると工程が増し、煩雑になる。
あった判定結果が経時的に陽性に変換することがない酵
素免疫アッセイ装置及び該装置を用いた酵素免疫アッセ
イ方法を提供することである。
究の結果、酵素の基質を従来のように展開液中に含める
のではなく、メンブレンに乾燥状態で含有させることに
より上記目的が達成できることを見出し本発明を完成し
た。
メンブレン部の両端にそれぞれ設けられた展開液パッド
部と吸収パッド部とを具備し、前記メンブレン部に検出
すべき抗原又は抗体と反応する抗体又は抗原が標識酵素
により標識された標識体が含有された標識体含有部が設
けられ、該標識体含有部と前記吸収パッドの間には、検
出すべき抗原又は抗体と反応する抗体又は抗原が前記メ
ンブレン部に固定化された検出部が設けられており、か
つ、前記標識体含有部と前記展開液パッド部との間のメ
ンブレン部に、酵素反応により発色する、前記標識酵素
の基質が乾燥状態で含有されている基質含有部が設けら
れている、酵素免疫アッセイ装置を提供する。さらに本
発明は、上記本発明の装置を用い、検体を前記標識体含
有部又は該標識体含有部と前記展開液パッドに挟まれる
メンブレン部の領域上のいずれかの部位に点着し、前記
展開液パッドから展開液を前記メンブレン部に流し、前
記検出部における発色を調べることを含む、酵素免疫ア
ッセイ方法を提供する。
好ましい態様を図1に模式的に示す。基本的な構成は図
2に示す上記した従来のアッセイ装置と同じである。す
なわち、本発明のアッセイ装置は、メンブレン部10を
含む。メンブレン部は、従来と同様、通常、ニトロセル
ロースメンブレンのような材質から成り、通常、長方形
状である。メンブレン部10の両端には、展開液パッド
部12と吸収パッド部14とがそれぞれ設けられてい
る。これらは、従来と同様、吸水性の材質、例えば、ス
ポンジ、吸水性の不織布、ろ紙等からなる。展開液パッ
ド部12及び吸収パッド部14の厚さは、多量の液を含
浸できるように、メンブレン部10の厚さよりも通常厚
く形成されているが、このことは必須的ではない。メン
ブレン部10上に設けられる標識体含有部16(後述)
と吸収パッド14の間には検出部18が設けられてい
る。検出部18には、従来と同様、検出すべき抗原又は
抗体と反応する抗体又は抗原が固定化されている。検出
部18は、従来と同様線状に形成されていることが好ま
しいが、必ずしも線状である必要はなく、円形等の他の
形状であってもよい。また、従来と同様、メンブレン部
10は、タンパク質の非特異的吸着を防止するために、
BSA等でブロッキングされている。
は抗体と反応する抗体又は抗原を酵素標識した標識体が
乾燥状態で含有されている。標識酵素としては、従来と
同様、酵素免疫分析で多用されている、アルカリフォス
ファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ
等を用いることができる。なお、標識体は、メンブレン
に直接点着してもよいが、メンブレン上に吸水性の材
質、例えば、スポンジ、吸水性不織布、ろ紙等からなる
標識体パッドを設け、これに標識体を含有させることも
できる。この場合には、含有させる標識体の量を多くす
ることができ、標識体が展開液により流れやすく、ま
た、多量の検体液を用いることができるので、検出感度
を高くすることができる。
の装置と異なり、標識酵素の基質を乾燥状態で含む基質
含有部19がメンブレン10に設けられている。基質含
有部19は、標識体含有部16と展開液パッド部12の
間に設けられる。基質含有部19に含有される基質の量
は、特に限定されず、各検査によっても異なるが、通
常、20〜200μg程度である。なお、基質は、従来
と同様、酵素反応により発色する、標識酵素の基質であ
る。
は該標識体含有部16と前記展開液パッド12に挟まれ
るメンブレン部の領域上のいずれかの部位に加えると共
に展開液パッド部12に展開液を加える。なお、検体液
と標識体との反応を十分に行うために検体液は標識体含
有部16に加えることが好ましい。従来と異なり、展開
液中には、標識体の標識酵素の基質が含まれない。展開
液パッド部12に加えられた展開液は、基質含有部19
中の基質を溶かして流れ、標識体含有部16に達する。
標識体含有部16に含まれている標識体は検体液中の抗
原又は抗体と反応し、展開液パッド部12から流れてく
る展開液により流されると共に、該展開液中の基質と反
応する。これらが展開液により流されて検出部18に到
達すると、検体中の抗原又は抗体が検出部18に固定化
されている抗体又は抗原にトラップされ、そこに留ま
る。この場合、検体中の抗原又は抗体は、標識体と結合
しているから標識体も検出ラインに留まる。従って、検
体液中に検出すべき抗原又は抗体が含まれている場合に
は検出部18上で発色が観察される。なお、展開液及び
トラップされなかった他の成分は吸収パッド部14に吸
収される。一方、検体液中に検出すべき抗原又は抗体が
含まれない場合には、標識体は検出部18にトラップさ
れないので、そのまま吸収パッド部14に吸収されてし
まい、検出部18上に発色は観察されない。従って、検
出部が発色するか否かにより検体中に検出すべき抗原又
は抗体が含まれるか否かを知ることができる。なお、展
開液及びトラップされなかった他の成分は吸収パッド部
14に吸収される。一方、検体液中に検出すべき抗原又
は抗体が含まれない場合には、標識体は検出部18にト
ラップされないので、そのまま吸収パッド部14に吸収
されてしまい、検出部18上に発色は観察されない。従
って、検出部が発色するか否かにより検体中に検出すべ
き抗原又は抗体が含まれるか否かを知ることができる。
なお、前記標識体と前記基質の一部は展開液が前記検出
部に到達する前に反応して発色しつつ移動しても構わな
いが、検出部では展開液中に免疫アッセイを行うために
十分な基質量を含有している。この場合、形成された発
色体のうち、前記検出部にトラップされなかったものは
前記吸収パッド部に吸収される。
び検出部に固定化する物質を抗体又は抗原としたが、本
願明細書で言う「抗体又は抗原」とは、抗原抗体反応が
可能な物質であれば、例えば抗体断片(Fab フラグメン
ト、F(ab')2 フラグメント等)やハプテン等も包含する
意味で用いている。
れ、展開液は多量に用いられるから、発色反応がいつま
でも続く。これに対し、本発明のアッセイ装置では、基
質含有部19に含まれる基質の全量が展開液で流されて
しまった後には、基質が存在しなくなるので、発色反応
はそれ以上進まない。従って、判定時に陰性と判定され
たものが経時的に陽性に変化することはない。また、本
発明のアッセイ装置では、基質が乾燥状態で維持される
ので、従来のように展開液に溶けた状態で液体で維持さ
れるのに比較して保存安定性が高い。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
るメンブレン部の両端に、吸水性の不織布から成る展開
液パッド部及び吸水パッド部を設けた。メンブレン部の
吸水パッド部よりの部分に、抗ヘモグロビンポリクロー
ナル抗体を点着し、乾燥し、検出ラインとした。次いで
メンブレンをブロッキング後、5mm四方、厚さ1mm
の吸水性不織布からなる標識体パッドをメンブレン上に
設けた。該標識体パッドには、15μg/mlの濃度で
アルカリフォスファターゼ標識抗ヘモグロビンポリクロ
ーナル抗体を含む溶液10μlを点着し、乾燥させた。
さらに、実施例1の装置では、標識体パッドと展開液パ
ッド部との間のメンブレン部に、基質含有部を設け、ア
ッセイ装置とした。基質含有部は、20mg/mlの5
−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−リン酸ナトリ
ウム(BCIP,Na)溶液5μlを点着し、乾燥させ
る操作を3回繰り返すことにより形成した。一方、比較
例1の装置では、基質含有部を設けなかった。
ンを含む試料25μlを標識体パッドに点着した後、展
開パッドに展開液200μlを添加して測定開始とし
た。展開液は、実施例1では0.1M 2,2’−イミ
ノジエタノール−塩酸緩衝液pH10、1mM MgC
l2 、0.05%Tween20(商品名)を用いた。
比較例1では、実施例1で用いた展開液に0.3 mg
/mlの濃度でBCIP,Naを加えたものを展開液と
して用いた。展開液添加後8分を判定時間とし、さらに
開始後10分及び30分後に判定を行った。なお、各試
験は2回ずつ行った。結果を表1及び表2に示す。
用いた場合には、全ての場合において経時的に判定結果
が陰性から陽性に変わっているのに対し、本発明の装置
を用いた場合には、陰性から陽性への変化はほぼないこ
とがわかる。
ッセイ装置を作製した。検出ラインは実施例1と同様に
作製した。実施例1と同様な検体液100μlを試料点
着部位に添加して測定開始とした。試料添加後8分を判
定時間とし、さらに開始後10分及び30分後に判定を
行った。結果を下記表3に示す。
た方法でも判定結果が陰性から陽性に変化することがわ
かる。
的に陰性から陽性に変化しない酵素免疫アッセイ装置及
びそれを用いた酵素免疫アッセイ方法が提供された。
様の一例を模式的に示す図である。
である。
を模式的に示す図である。
Claims (4)
- 【請求項1】 メンブレン部と、該メンブレン部の両端
にそれぞれ設けられた展開液パッド部と吸収パッド部と
を具備し、前記メンブレン部に検出すべき抗原又は抗体
と反応する抗体又は抗原が標識酵素により標識された標
識体が含有された標識体含有部が設けられ、該標識体含
有部と前記吸収パッドの間には、検出すべき抗原又は抗
体と反応する抗体又は抗原が前記メンブレン部に固定化
された検出部が設けられており、かつ、前記標識体含有
部と前記展開液パッド部との間のメンブレン部に、酵素
反応により発色する、前記標識酵素の基質が乾燥状態で
含有されている基質含有部が設けられている、酵素免疫
アッセイ装置。 - 【請求項2】 前記標識体含有部は、標識体を含有する
吸水性の材料から形成された標識体パッドである請求項
1記載の装置。 - 【請求項3】 請求項1又は2記載の装置を用い、検体
を前記標識体含有部又は該標識体含有部と前記展開液パ
ッドに挟まれるメンブレン部の領域上のいずれかの部位
に点着し、前記展開液パッドから展開液を前記メンブレ
ン部に流し、前記検出部における発色を調べることを含
む、酵素免疫アッセイ方法。 - 【請求項4】 前記標識体と前記基質の一部は展開液が
前記検出部に到達する前に反応して発色しつつ移動し、
検出部では免疫アッセイを行うために十分な基質が展開
液中に含まれる請求項3記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26030196A JP3284896B2 (ja) | 1995-09-08 | 1996-09-09 | 酵素免疫アッセイ装置及び方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7-256757 | 1995-09-08 | ||
JP25675795 | 1995-09-08 | ||
JP26030196A JP3284896B2 (ja) | 1995-09-08 | 1996-09-09 | 酵素免疫アッセイ装置及び方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09133681A true JPH09133681A (ja) | 1997-05-20 |
JP3284896B2 JP3284896B2 (ja) | 2002-05-20 |
Family
ID=26542885
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26030196A Expired - Lifetime JP3284896B2 (ja) | 1995-09-08 | 1996-09-09 | 酵素免疫アッセイ装置及び方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3284896B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5998156A (en) * | 1997-06-25 | 1999-12-07 | Fujirebio Inc. | Color developing method, enzyme immunoassay using the color developing method, and immunochromatography incorporating the enzyme immunoassay |
JP2014527183A (ja) * | 2011-09-16 | 2014-10-09 | クレド バイオメディカル ピーティーイー リミテッド | 分子診断アッセイデバイス及び使用方法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4544907B2 (ja) * | 2004-05-21 | 2010-09-15 | デンカ生研株式会社 | デバイスおよび検出方法 |
JP4876646B2 (ja) | 2006-03-13 | 2012-02-15 | 富士レビオ株式会社 | 免疫測定用ストリップ及び免疫測定装置 |
JP5010649B2 (ja) * | 2009-08-10 | 2012-08-29 | デンカ生研株式会社 | デバイスおよび検出方法 |
-
1996
- 1996-09-09 JP JP26030196A patent/JP3284896B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5998156A (en) * | 1997-06-25 | 1999-12-07 | Fujirebio Inc. | Color developing method, enzyme immunoassay using the color developing method, and immunochromatography incorporating the enzyme immunoassay |
DE19828378C2 (de) * | 1997-06-25 | 2002-11-28 | Fujirebio Kk | Farbe entwickelndes Verfahren, Enzym-Immunoassay, der das Farbe entwickelnde Verfahren anwendet und Immunochromatographie, die den Enzym-Immunoassay einarbeitet |
JP2014527183A (ja) * | 2011-09-16 | 2014-10-09 | クレド バイオメディカル ピーティーイー リミテッド | 分子診断アッセイデバイス及び使用方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3284896B2 (ja) | 2002-05-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7344893B2 (en) | Immuno-gold lateral flow assay | |
JP3585933B2 (ja) | 導伝バリアを用いる対置成分アッセイ装置 | |
JP3506178B2 (ja) | 対置部材クロマトグラフィー検定装置 | |
JP4104669B2 (ja) | 取り外し可能要素検定装置 | |
KR920009420B1 (ko) | 고체상 분석장치 및 이를 이용하는 방법 | |
JP2786438B2 (ja) | 分析検査装置及び方法 | |
JP4040110B2 (ja) | 膜ベースでの検定のための分析装置 | |
US5166051A (en) | Membranes, membrane overlays for exclusion of erythrocytes, and method for immunoassay of whole blood analytes | |
EP0480497B1 (en) | Device for performing a rapid single manual assay | |
US5989840A (en) | Estimation of active infection by heliobacter pylori | |
JP5173808B2 (ja) | 横向き移動でのイムノクロマトの手段による検体アッセイ | |
EP0171150A2 (en) | Method and apparatus for assaying with optional reagent quality control | |
JPH08501387A (ja) | ボード上に陰性および陽性対照を有する分析試験装置 | |
JPH11507125A (ja) | 競合イムノアッセイ装置 | |
US5958339A (en) | Format for immunoassay in thin film | |
JPH08501018A (ja) | 分析試験装置用のケーシング手段 | |
JP5590651B2 (ja) | 血液試料の品質評価方法 | |
JPWO2019124532A1 (ja) | イムノクロマトグラフィー装置 | |
US7067264B2 (en) | Test device for detecting human blood and method of use | |
JPH10177028A (ja) | 乳頭分泌液中の特定物質の測定方法 | |
CA2570383C (en) | Filter device, the method, kit and use thereof | |
JP3284896B2 (ja) | 酵素免疫アッセイ装置及び方法 | |
JP4437211B2 (ja) | 免疫クロマトグラフィーを用いた測定方法およびそれに用いる検体分析用具 | |
JPH0772152A (ja) | 特異的バインディングアッセイ方法及び分析要素 | |
JP2000304750A (ja) | 発光標識イムノアッセイ及びその分析要素 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080308 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090308 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090308 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100308 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100308 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110308 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110308 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120308 Year of fee payment: 10 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120308 Year of fee payment: 10 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130308 Year of fee payment: 11 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130308 Year of fee payment: 11 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140308 Year of fee payment: 12 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140308 Year of fee payment: 12 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |