JPH09127041A - 酵素電極 - Google Patents
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- C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
- C12Y105/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
- C12Y105/03001—Sarcosine oxidase (1.5.3.1)
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- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
- C12Y305/0201—Creatininase (3.5.2.10)
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- C12Y305/03003—Creatinase (3.5.3.3), i.e. creatine amidinohydrolase
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- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
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- G01N2333/9065—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- G01N2333/90672—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general
- G01N2333/90677—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general with a definite EC number (1.5.3.-)
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- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 バイオセンサーとして高い感度、持続的な直
線性及び低い干渉電流を有し、低廉で容易に製造され、
特に極めて長期の作動寿命、貯蔵寿命及び貯蔵安定性を
有する酵素電極を提供すること。 【解決手段】 （ａ）多孔性の導電性層を含む導電性支
持部材（ＥＳＭ）、（ｂ）該多孔性層の表面に吸着又は
固定された、触媒として有効な量の酵素、及び（ｃ）多
孔性層からの該酵素の浸出を防止する保護層、よりなる
酵素電極。
線性及び低い干渉電流を有し、低廉で容易に製造され、
特に極めて長期の作動寿命、貯蔵寿命及び貯蔵安定性を
有する酵素電極を提供すること。 【解決手段】 （ａ）多孔性の導電性層を含む導電性支
持部材（ＥＳＭ）、（ｂ）該多孔性層の表面に吸着又は
固定された、触媒として有効な量の酵素、及び（ｃ）多
孔性層からの該酵素の浸出を防止する保護層、よりなる
酵素電極。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、電流測定のバイオセン
サー、化学センサーとして又はバイオリアクター中で用
いられる酵素電極に関し、化学物質の電流測定検出法に
関する。より特に、長期の作動及び貯蔵寿命を有する電
極に関する。
サー、化学センサーとして又はバイオリアクター中で用
いられる酵素電極に関し、化学物質の電流測定検出法に
関する。より特に、長期の作動及び貯蔵寿命を有する電
極に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素電極は、基質の存在下、酵素の触媒
活性に電流測定的に応答するバイオセンサーとして用い
られているので、幾つかの型が既知であり、Biotech. G
enet.Eng. Rev., 1, pp. 89-120(1984)などに記載され
ており、その特定例は、例えば米国特許第４，９７０，
１４５及び５，１６０，４１８号の各明細書に提案され
ている。
活性に電流測定的に応答するバイオセンサーとして用い
られているので、幾つかの型が既知であり、Biotech. G
enet.Eng. Rev., 1, pp. 89-120(1984)などに記載され
ており、その特定例は、例えば米国特許第４，９７０，
１４５及び５，１６０，４１８号の各明細書に提案され
ている。
【０００３】米国特許第４，９７０，１４５号明細書に
は、酵素によって作用を受ける物質を含む液体及び
（ａ）炭素粒子、樹脂によって結合された白金族金属か
ら形成される多孔性の導電性層を含む導電性支持部材
（以下、「ＥＳＭ」と称する）、及び（ｂ）多孔性基材
の表面に吸着又は固定された、酵素の触媒的に活性な量
よりなる電極上の電位の存在下に、酵素の触媒活性を電
流測定的に指示する酵素電極が開示されている。米国特
許第５，１６０，４１８号明細書には、支持体及び支持
体上に形成され、基礎的支持体の表面に堆積した微粒の
白金族金属又は酸化物及び酵素を含む導電性層よりなる
酵素電極の製造法が開示されている。
は、酵素によって作用を受ける物質を含む液体及び
（ａ）炭素粒子、樹脂によって結合された白金族金属か
ら形成される多孔性の導電性層を含む導電性支持部材
（以下、「ＥＳＭ」と称する）、及び（ｂ）多孔性基材
の表面に吸着又は固定された、酵素の触媒的に活性な量
よりなる電極上の電位の存在下に、酵素の触媒活性を電
流測定的に指示する酵素電極が開示されている。米国特
許第５，１６０，４１８号明細書には、支持体及び支持
体上に形成され、基礎的支持体の表面に堆積した微粒の
白金族金属又は酸化物及び酵素を含む導電性層よりなる
酵素電極の製造法が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記の従来の技術にお
いて、非常に少量の固定化酵素を用い、非常に優れた応
答と安定性を示す電極が得られている。しかしながら、
上記の従来の技術においては、酵素と電気活動性の金属
粒子が同じ層に存在し、そのために酵素の触媒活性は、
電極製造の際に失われがちであり、吸着又は固定化され
た酵素は、測定中の時間経過と共に失われるので、電極
の安定性は必ずしも高くない。
いて、非常に少量の固定化酵素を用い、非常に優れた応
答と安定性を示す電極が得られている。しかしながら、
上記の従来の技術においては、酵素と電気活動性の金属
粒子が同じ層に存在し、そのために酵素の触媒活性は、
電極製造の際に失われがちであり、吸着又は固定化され
た酵素は、測定中の時間経過と共に失われるので、電極
の安定性は必ずしも高くない。
【０００５】本発明の目的は、バイオセンサーとして高
い感度、持続的な直線性及び低い干渉電流を有し、低廉
で容易に製造され、特に極めて長期の作動寿命、貯蔵寿
命及び貯蔵安定性を有する酵素電極を提供することであ
る。
い感度、持続的な直線性及び低い干渉電流を有し、低廉
で容易に製造され、特に極めて長期の作動寿命、貯蔵寿
命及び貯蔵安定性を有する酵素電極を提供することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明により、（ａ）多
孔性の導電性層を含む導電性支持部材（ＥＳＭ）、
（ｂ）該多孔層の表面に吸着又は固定された、触媒とし
て有効な量の酵素、及び（ｃ）多孔性層からの該酵素の
浸出を防止する保護層、よりなる酵素電極が提供され
る。
孔性の導電性層を含む導電性支持部材（ＥＳＭ）、
（ｂ）該多孔層の表面に吸着又は固定された、触媒とし
て有効な量の酵素、及び（ｃ）多孔性層からの該酵素の
浸出を防止する保護層、よりなる酵素電極が提供され
る。
【０００７】吸着又は固定されるとは、多孔性層を形成
する粒子表面に堆積されることをも意味する。
する粒子表面に堆積されることをも意味する。
【０００８】ＥＳＭは、その表面上に多孔性層が堆積又
は被覆されている電気伝導性の支持体から構成されるこ
とができる。導電性支持体は、金属、誘電性支持体複合
体及び金属層又は酸化インジウム（ＩＴＯガラス）のよ
うな導電性金属酸化物層であってよい。
は被覆されている電気伝導性の支持体から構成されるこ
とができる。導電性支持体は、金属、誘電性支持体複合
体及び金属層又は酸化インジウム（ＩＴＯガラス）のよ
うな導電性金属酸化物層であってよい。
【０００９】本発明の酵素電極は、電流測定バイオセン
サー、バイオセンサー若しくは化学センサーとして又は
バイオリアクター中で用いられる。
サー、バイオセンサー若しくは化学センサーとして又は
バイオリアクター中で用いられる。
【００１０】図１は、乳酸濃度に対する検量線であり、
検定は３７℃で流動停止分析で行われ、乳酸センサー
は、Ａｇ／ＡｇＣｌ（酵素６４μg/cm2 が仕込まれる）
に対して４００mVで分極される。ｘ−軸はmMで表した乳
酸濃度であり、ｙ−軸はnAで表した電流である。白丸は
３日、黒丸は５９日の測定である。
検定は３７℃で流動停止分析で行われ、乳酸センサー
は、Ａｇ／ＡｇＣｌ（酵素６４μg/cm2 が仕込まれる）
に対して４００mVで分極される。ｘ−軸はmMで表した乳
酸濃度であり、ｙ−軸はnAで表した電流である。白丸は
３日、黒丸は５９日の測定である。
【００１１】図２は、乳酸濃度に対する検量線であり、
検定は３７℃で流動停止分析で行われ、乳酸センサー
は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで分極される。ｘ
−軸はmMで表した乳酸濃度であり、ｙ−軸はnAで表した
電流である。四角は１日、三角は１０日の測定である。
検定は３７℃で流動停止分析で行われ、乳酸センサー
は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで分極される。ｘ
−軸はmMで表した乳酸濃度であり、ｙ−軸はnAで表した
電流である。四角は１日、三角は１０日の測定である。
【００１２】図３は、グルコースセンサーが分極されて
いる、グルコース濃度に対する検量線である。ｘ−軸は
mMで表したグルコース濃度であり、ｙ−軸はnAで表した
電流である。白丸は１日、黒丸は２２日、中抜き四角は
４２日の測定である。
いる、グルコース濃度に対する検量線である。ｘ−軸は
mMで表したグルコース濃度であり、ｙ−軸はnAで表した
電流である。白丸は１日、黒丸は２２日、中抜き四角は
４２日の測定である。
【００１３】以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１４】本発明では、該酵素によって作用を受ける
物質を含む液体及び電極上の電位の存在下に、酵素電極
の活性な被覆中に含まれる酵素の触媒活性を電流測定的
に指示する方法であって、（ａ）多孔性の導電性層を含
む導電性支持部材、（ｂ）触媒としての有効な量、好適
には１０〜３，０００μg/cm2 で、該多孔性層の表面に
吸着又は固定された該酵素、及び（ｃ）多孔性層からの
該酵素の浸出を防止する安定化層、よりなる電極を含む
改良法を提供する。
物質を含む液体及び電極上の電位の存在下に、酵素電極
の活性な被覆中に含まれる酵素の触媒活性を電流測定的
に指示する方法であって、（ａ）多孔性の導電性層を含
む導電性支持部材、（ｂ）触媒としての有効な量、好適
には１０〜３，０００μg/cm2 で、該多孔性層の表面に
吸着又は固定された該酵素、及び（ｃ）多孔性層からの
該酵素の浸出を防止する安定化層、よりなる電極を含む
改良法を提供する。
【００１５】この方法は、多孔性層に用いられた酵素の
触媒活性に応答する有機又は生物有機化合物の定量又は
定性分析に用いることができる。
触媒活性に応答する有機又は生物有機化合物の定量又は
定性分析に用いることができる。
【００１６】このＥＳＭは、炭素粒子、白金族金属及び
結合樹脂を含むことができる。炭素粒子の表面におい
て、白金族金属の微粒子は炭素粒子と密に接触し、炭素
粒子は、樹脂によって結合されている。ＥＳＭは、実質
的にコロイド状態で、全体にわたって実質的に均一に分
布した該金属粒子によって金属化され、かつ、実質的に
樹脂結合された炭素粒子よりなる、実質的に不均一な多
孔性基材を構成している。
結合樹脂を含むことができる。炭素粒子の表面におい
て、白金族金属の微粒子は炭素粒子と密に接触し、炭素
粒子は、樹脂によって結合されている。ＥＳＭは、実質
的にコロイド状態で、全体にわたって実質的に均一に分
布した該金属粒子によって金属化され、かつ、実質的に
樹脂結合された炭素粒子よりなる、実質的に不均一な多
孔性基材を構成している。
【００１７】本発明で用いられる炭素粒子は、酵素の引
き続く吸着又は固定化が容易に行われ、そして導電性で
ある限り、いかなる材料であってもよい。本発明で用い
られる炭素粒子は、ファーネス法又は接触法、好適には
ファーネス法によって得られる。特に、これらは、例え
ば、市販のカーボンブラック、黒鉛末、アセチレンブラ
ックなどであり、例えばVulcan XC-72（商品名、Cabot
Co., Ltd. の製品、油性吸収剤、１８５cc／１００
ｇ）、Ketjen black EC （商品名、Lion Akzo Co.,Ltd.
の製品、油性吸収剤、３５０cc／１００ｇ）、Conduct
ex SC（商品名、Columbia Carbon Co., Ltd. の製品、
油性吸収剤、１１５cc／１００ｇ）などがある。これら
の炭素粒子は、好適には約５０〜約３００オングストロ
ーム（約５〜３０nm）の粒径、ＤＢＰ法で測定された１
００ｇ又はそれ以上あたり１００ccの油性吸収、及びＢ
ＥＴ法で測定された１０〜２００m2/gの比表面積を有す
る。
き続く吸着又は固定化が容易に行われ、そして導電性で
ある限り、いかなる材料であってもよい。本発明で用い
られる炭素粒子は、ファーネス法又は接触法、好適には
ファーネス法によって得られる。特に、これらは、例え
ば、市販のカーボンブラック、黒鉛末、アセチレンブラ
ックなどであり、例えばVulcan XC-72（商品名、Cabot
Co., Ltd. の製品、油性吸収剤、１８５cc／１００
ｇ）、Ketjen black EC （商品名、Lion Akzo Co.,Ltd.
の製品、油性吸収剤、３５０cc／１００ｇ）、Conduct
ex SC（商品名、Columbia Carbon Co., Ltd. の製品、
油性吸収剤、１１５cc／１００ｇ）などがある。これら
の炭素粒子は、好適には約５０〜約３００オングストロ
ーム（約５〜３０nm）の粒径、ＤＢＰ法で測定された１
００ｇ又はそれ以上あたり１００ccの油性吸収、及びＢ
ＥＴ法で測定された１０〜２００m2/gの比表面積を有す
る。
【００１８】本発明で用いられる白金族金属は、好適に
は、個々の炭素粒子の表面上に吸着された粒子の形で存
在しており、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウ
ム、オスミウム及びイリジウム、特に好適には白金又は
パラジウムを包含する。白金族金属は、粒径において、
炭素粒子に比べてより微細な粒子の形で存在するのが好
ましく、個々の炭素粒子の表面上に吸着された粒子の形
で存在し、金属粒子は、好適には約１０〜１００、より
好適には１０〜５０、そして特に１５〜２５オングスト
ローム（１〜１０、１〜５又は１．５〜２．５nm）の範
囲にあるコロイド状寸法を有している。白金族金属は、
炭素粒子の重量に基づいて、好適には１〜１００重量
％、より好適には５〜８０重量％の量で存在する。
は、個々の炭素粒子の表面上に吸着された粒子の形で存
在しており、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウ
ム、オスミウム及びイリジウム、特に好適には白金又は
パラジウムを包含する。白金族金属は、粒径において、
炭素粒子に比べてより微細な粒子の形で存在するのが好
ましく、個々の炭素粒子の表面上に吸着された粒子の形
で存在し、金属粒子は、好適には約１０〜１００、より
好適には１０〜５０、そして特に１５〜２５オングスト
ローム（１〜１０、１〜５又は１．５〜２．５nm）の範
囲にあるコロイド状寸法を有している。白金族金属は、
炭素粒子の重量に基づいて、好適には１〜１００重量
％、より好適には５〜８０重量％の量で存在する。
【００１９】より微粒子又はコロイドとしての粒径の白
金族金属粒子の製造には、米国特許第４，０４４，１９
３号明細書に記載された下記の方法を用いることができ
る。即ち、塩化白金酸に炭酸ナトリウムを加えて中和し
て橙赤色のＮａ2 Ｐｔ（Ｃｌ)6を生成させ、次いで、こ
れに重亜硫酸ナトリウムを加えてpHを約４にし、さらに
炭酸ナトリウムを加えてpHを中性に戻す。これに水を加
えて懸濁液としてから必要な強酸性樹脂を加え、この溶
液を濾過して樹脂を除き、十分な量の該酸性樹脂のイオ
ン交換カラムを通過させて他の３個のＮａ原子を交換す
る。溶出液を加熱して濃縮し、亜硫酸白金酸錯化合物を
得る。この錯体は、空気中で乾固するまで加熱して分解
（酸化）し、約１３５℃の温度に約１時間保つと、平均
した微粒のコロイドとしての粒径を有する白金を含むゾ
ルを生成する。次いで、常法により、このゾルを炭素粒
子上に堆積又は吸着させることができる。本発明におい
て、市販の白金化活性炭（例えば、E-TEK Inc., MA, US
A の製品）を使用することができる。
金族金属粒子の製造には、米国特許第４，０４４，１９
３号明細書に記載された下記の方法を用いることができ
る。即ち、塩化白金酸に炭酸ナトリウムを加えて中和し
て橙赤色のＮａ2 Ｐｔ（Ｃｌ)6を生成させ、次いで、こ
れに重亜硫酸ナトリウムを加えてpHを約４にし、さらに
炭酸ナトリウムを加えてpHを中性に戻す。これに水を加
えて懸濁液としてから必要な強酸性樹脂を加え、この溶
液を濾過して樹脂を除き、十分な量の該酸性樹脂のイオ
ン交換カラムを通過させて他の３個のＮａ原子を交換す
る。溶出液を加熱して濃縮し、亜硫酸白金酸錯化合物を
得る。この錯体は、空気中で乾固するまで加熱して分解
（酸化）し、約１３５℃の温度に約１時間保つと、平均
した微粒のコロイドとしての粒径を有する白金を含むゾ
ルを生成する。次いで、常法により、このゾルを炭素粒
子上に堆積又は吸着させることができる。本発明におい
て、市販の白金化活性炭（例えば、E-TEK Inc., MA, US
A の製品）を使用することができる。
【００２０】本発明の結合剤として用いられる樹脂は、
これが酵素電極の支持部材に要求される十分な特性を有
している限り、特に限定するものではないが、好適には
ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＰＴＦＥ以
外の合成フッ化炭素樹脂、（メタ）アクリル樹脂〔例え
ば、ポリ（エチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタ
クリラート）及び（メタ）アクリル酸及び／又は（メ
タ）アクリラートのその他のコポリマー〕、ポリスチレ
ン樹脂、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（塩化ビニル）、ポ
リカーボネート、ポリ（４−メチル−１−ペンテン）、
ポリイソプレン、ポリクロロプレン、ポリ（１，３−ブ
タジエン）、シリコーンゴム、及びポリ（エチレンテレ
フタラート）である。これらのうち、ポリ（エチレンテ
レフタラート）のようなポリエステル又はポリ（塩化ビ
ニル）は特に好ましい。
これが酵素電極の支持部材に要求される十分な特性を有
している限り、特に限定するものではないが、好適には
ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＰＴＦＥ以
外の合成フッ化炭素樹脂、（メタ）アクリル樹脂〔例え
ば、ポリ（エチルメタクリラート）、ポリ（メチルメタ
クリラート）及び（メタ）アクリル酸及び／又は（メ
タ）アクリラートのその他のコポリマー〕、ポリスチレ
ン樹脂、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（塩化ビニル）、ポ
リカーボネート、ポリ（４−メチル−１−ペンテン）、
ポリイソプレン、ポリクロロプレン、ポリ（１，３−ブ
タジエン）、シリコーンゴム、及びポリ（エチレンテレ
フタラート）である。これらのうち、ポリ（エチレンテ
レフタラート）のようなポリエステル又はポリ（塩化ビ
ニル）は特に好ましい。
【００２１】本発明において、ＥＳＭは、（ａ′）導電
性ポリマーフィルム及び（ａ″）上記の白金族金属粒子
を含む層よりなる。導電性ポリマーフィルムは、ポリヘ
テロ芳香族のポリカチオン又はポリアニリンのポリカチ
オン、及びハロゲン化物、ＢＦ4 、ＰＦ6 、ＡｓＦ6 、
ＳｂＦ6 のような非求核性の小アニオン又は−ＳＯ3 -若
しくは−ＯＳＯ3 -基を有するポリマーの重合ポリアニオ
ンで構成される。ポリカチオンの例としては、非置換又
はＣ1 −Ｃ4 アルキル、Ｃ1 −Ｃ4 アルコキシ若しくは
Ｃ2 −Ｃ6 アルキレンジオキシ置換の、ポリピロール、
ポリチオフェン又はポリアニリンが挙げられる。これら
の導電性材料は、この技術分野でよく知られているもの
である。これらのうち、ポリピロールフィルムは特に好
ましい。ポリピロールフィルムは、成形可能であり、最
も好ましい。ポリスルフェート化ポリマーのアニオンを
有する、このような成形可能なポリピロールフィルム
（以下で「ＳＥＣフィルム」と称する）の例は、例え
ば、米国特許第Re. ３４，５１４号明細書に記載されて
いる。白金金属粒子に関しては、上記及び下記におい
て、同じ好適な実施態様が適用される。
性ポリマーフィルム及び（ａ″）上記の白金族金属粒子
を含む層よりなる。導電性ポリマーフィルムは、ポリヘ
テロ芳香族のポリカチオン又はポリアニリンのポリカチ
オン、及びハロゲン化物、ＢＦ4 、ＰＦ6 、ＡｓＦ6 、
ＳｂＦ6 のような非求核性の小アニオン又は−ＳＯ3 -若
しくは−ＯＳＯ3 -基を有するポリマーの重合ポリアニオ
ンで構成される。ポリカチオンの例としては、非置換又
はＣ1 −Ｃ4 アルキル、Ｃ1 −Ｃ4 アルコキシ若しくは
Ｃ2 −Ｃ6 アルキレンジオキシ置換の、ポリピロール、
ポリチオフェン又はポリアニリンが挙げられる。これら
の導電性材料は、この技術分野でよく知られているもの
である。これらのうち、ポリピロールフィルムは特に好
ましい。ポリピロールフィルムは、成形可能であり、最
も好ましい。ポリスルフェート化ポリマーのアニオンを
有する、このような成形可能なポリピロールフィルム
（以下で「ＳＥＣフィルム」と称する）の例は、例え
ば、米国特許第Re. ３４，５１４号明細書に記載されて
いる。白金金属粒子に関しては、上記及び下記におい
て、同じ好適な実施態様が適用される。
【００２２】驚くべきことであるが、白金族金属粒子
は、結合剤がなくとも、導電性ポリマーに十分に付着す
ることが見出された。さらに驚くことに、金属コロイド
は、炭素粒子とは接触していないに違いない。この発明
のもう一つの目的は、少なくとも一つの表面上に、白金
族金属の微粒子を含む導電性ポリマーである。この層
は、結合剤の有無に関わらず、上記のＥＳＭと同様な多
孔性を有している。
は、結合剤がなくとも、導電性ポリマーに十分に付着す
ることが見出された。さらに驚くことに、金属コロイド
は、炭素粒子とは接触していないに違いない。この発明
のもう一つの目的は、少なくとも一つの表面上に、白金
族金属の微粒子を含む導電性ポリマーである。この層
は、結合剤の有無に関わらず、上記のＥＳＭと同様な多
孔性を有している。
【００２３】ＥＳＭが導電性ポリマーフィルム及び白金
族金属粒子を含む層よりなる場合、白金族金属粒子を含
む層は、電気化学的な金属化、この技術分野において好
都合には既知であるポリマー結合剤と一緒での熱−圧縮
又は流延によって形成される。
族金属粒子を含む層よりなる場合、白金族金属粒子を含
む層は、電気化学的な金属化、この技術分野において好
都合には既知であるポリマー結合剤と一緒での熱−圧縮
又は流延によって形成される。
【００２４】電気化学的な金属化は、例えば、ヘキサク
ロロ白金酸カリウムの水溶液中、導電性ポリマーフィル
ム上にＰｔ黒のカソード堆積によって達成される。熱−
圧縮は、例えば２ーメトキシエタノールのようなアルコ
キシアルコール中の懸濁液から導電性ポリマーフィルム
上にＰｔ黒粒子を流延した後、例えば二段式加熱ローラ
（温度：１５０〜１６０℃）によって、乾燥してフィル
ムに圧縮することによって行うことができる。流延は、
例えば、ポリマーと一緒に作られたＰｔ黒ペーストを導
電性ポリマーフィルム上に流延し、次いで乾燥すること
によって達成することができる。
ロロ白金酸カリウムの水溶液中、導電性ポリマーフィル
ム上にＰｔ黒のカソード堆積によって達成される。熱−
圧縮は、例えば２ーメトキシエタノールのようなアルコ
キシアルコール中の懸濁液から導電性ポリマーフィルム
上にＰｔ黒粒子を流延した後、例えば二段式加熱ローラ
（温度：１５０〜１６０℃）によって、乾燥してフィル
ムに圧縮することによって行うことができる。流延は、
例えば、ポリマーと一緒に作られたＰｔ黒ペーストを導
電性ポリマーフィルム上に流延し、次いで乾燥すること
によって達成することができる。
【００２５】この発明の好適な実施態様において、ＥＳ
Ｍは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理された白金
化活性炭及び好適に約１〜５０μm 、より好適には３〜
４０μm の厚さを有する結合樹脂層よりなる。ここに記
載したＢＳＡ処理は、ＥＳＭを親水性にするのに好まし
い。
Ｍは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理された白金
化活性炭及び好適に約１〜５０μm 、より好適には３〜
４０μm の厚さを有する結合樹脂層よりなる。ここに記
載したＢＳＡ処理は、ＥＳＭを親水性にするのに好まし
い。
【００２６】この発明の別の好適な実施態様において
は、多孔性のＥＳＭが好ましく、特に大径多孔性のＥＳ
Ｍが好ましい。大径多孔性のＥＳＭは、約１〜５０μm
の平均直径を有する細孔を含んでいる。
は、多孔性のＥＳＭが好ましく、特に大径多孔性のＥＳ
Ｍが好ましい。大径多孔性のＥＳＭは、約１〜５０μm
の平均直径を有する細孔を含んでいる。
【００２７】ＥＳＭは、多孔性の層表面に堆積、吸着又
は固定された酵素によって発生されたＨ2 Ｏ2 を検出す
る。
は固定された酵素によって発生されたＨ2 Ｏ2 を検出す
る。
【００２８】本発明で用いられる酵素は、該多孔性の層
表面に、１０〜３，０００μg/cm2、好適には３０〜
１，５００μg/cm2 の量で、堆積、吸着又は固定され
る。この量が１０μg/cm2 以下である場合、被分析物に
ついての検量線の良好な直線性は得られず、３，０００
μg/cm2 以上の場合には、さらなる効果は得られない。
酵素は、流延又は物理的吸収によって堆積、吸着又は固
定される。酵素を多孔性の層表面に堆積、吸着又は固定
するための方法としては、酵素を緩衝液に溶解し、この
溶液を支持体上に適用する吸着法、又は米国特許第４，
９７０，１４５号明細書に記載されているように、グル
タルアルデヒド処理、カルボジイミド処理、カルボニル
ジイミダゾール処理又はＤＦＤＮＢ（３，４−ジフルオ
ロ−１，６−ジニトロベンゼン）処理のような固定化法
が挙げられる。
表面に、１０〜３，０００μg/cm2、好適には３０〜
１，５００μg/cm2 の量で、堆積、吸着又は固定され
る。この量が１０μg/cm2 以下である場合、被分析物に
ついての検量線の良好な直線性は得られず、３，０００
μg/cm2 以上の場合には、さらなる効果は得られない。
酵素は、流延又は物理的吸収によって堆積、吸着又は固
定される。酵素を多孔性の層表面に堆積、吸着又は固定
するための方法としては、酵素を緩衝液に溶解し、この
溶液を支持体上に適用する吸着法、又は米国特許第４，
９７０，１４５号明細書に記載されているように、グル
タルアルデヒド処理、カルボジイミド処理、カルボニル
ジイミダゾール処理又はＤＦＤＮＢ（３，４−ジフルオ
ロ−１，６−ジニトロベンゼン）処理のような固定化法
が挙げられる。
【００２９】本発明で用いられる酵素は、例えば、グル
コース酸化酵素、乳酸酸化酵素、コレステロール酸化酵
素、コリン酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素、ピルビン
酸酸化酵素、ラクトース酸化酵素、シュウ酸酸化酵素及
びサルコシン酸化酵素のような酸化還元酵素、好適には
乳酸酸化酵素及びサルコシン酸化酵素が挙げられる。さ
らに、この酸化還元酵素は、酸化還元酵素以外の少なく
とも一つの酵素を伴うことができる。酸化還元酵素以外
のこのような酵素は、クレアチナーゼを伴うクレアチニ
ナーゼである。本発明において、特に好適には、酵素は
サルコシン酸化酵素であり、酸化還元酵素以外の酵素
は、クレアチナーゼを伴うクレアチニナーゼである。
コース酸化酵素、乳酸酸化酵素、コレステロール酸化酵
素、コリン酸化酵素、グルタミン酸酸化酵素、ピルビン
酸酸化酵素、ラクトース酸化酵素、シュウ酸酸化酵素及
びサルコシン酸化酵素のような酸化還元酵素、好適には
乳酸酸化酵素及びサルコシン酸化酵素が挙げられる。さ
らに、この酸化還元酵素は、酸化還元酵素以外の少なく
とも一つの酵素を伴うことができる。酸化還元酵素以外
のこのような酵素は、クレアチナーゼを伴うクレアチニ
ナーゼである。本発明において、特に好適には、酵素は
サルコシン酸化酵素であり、酸化還元酵素以外の酵素
は、クレアチナーゼを伴うクレアチニナーゼである。
【００３０】保護層は、ＥＳＭ及び酵素上に形成され、
それから酵素が浸出するのを防止する。この層は、好適
には親水性である。安定化層を設けることによって、酵
素の浸出は顕著に防止され、それによって、電極の安定
性は、著しく改善されることができる。保護層を形成す
る材料としては、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミ
ン、それぞれがスチルバゾリウム基、ビニル基などのよ
うな置換基を有していてもよい、ポリ（ビニルアルコー
ル）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリ
ドン）、ポリアクリルアミド及びポリ（２−ヒドロキシ
エチルメタクリラート）よりなる群から選ばれる少なく
とも一つを挙げることができる。これらのうち、ゼラチ
ン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレンオキシ
ド）及びポリ（ビニルピロリドン）は好適である。保護
層の機能は、酵素を含むＥＳＭを安定化することであ
る。
それから酵素が浸出するのを防止する。この層は、好適
には親水性である。安定化層を設けることによって、酵
素の浸出は顕著に防止され、それによって、電極の安定
性は、著しく改善されることができる。保護層を形成す
る材料としては、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミ
ン、それぞれがスチルバゾリウム基、ビニル基などのよ
うな置換基を有していてもよい、ポリ（ビニルアルコー
ル）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリ
ドン）、ポリアクリルアミド及びポリ（２−ヒドロキシ
エチルメタクリラート）よりなる群から選ばれる少なく
とも一つを挙げることができる。これらのうち、ゼラチ
ン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレンオキシ
ド）及びポリ（ビニルピロリドン）は好適である。保護
層の機能は、酵素を含むＥＳＭを安定化することであ
る。
【００３１】安定化層は、酵素上に層を設けた後にグル
タルアルデヒド又は光架橋剤を用いて架橋することがで
きる。光架橋剤としては、光照射によってラジカルを発
生する限り、いかなる材料も使用することができる、例
えばIrgacure 2959 、Irgacure 907及びIrgacure 369
（全部商品名、Ciba Geigy AG の製品）を挙げることが
できる。安定化層は、好適には１〜１００μm 、より好
適には３〜５０μm の厚さを有する。
タルアルデヒド又は光架橋剤を用いて架橋することがで
きる。光架橋剤としては、光照射によってラジカルを発
生する限り、いかなる材料も使用することができる、例
えばIrgacure 2959 、Irgacure 907及びIrgacure 369
（全部商品名、Ciba Geigy AG の製品）を挙げることが
できる。安定化層は、好適には１〜１００μm 、より好
適には３〜５０μm の厚さを有する。
【００３２】本発明において、保護層を被覆するための
保護被覆層は、安定化層上に設けられ、それによって透
過される被分析物の量を調節する。保護被覆層は、内部
層を保護して被分析物を適切な量に調節し得るならば、
いかなる材料であってもよい。保護被覆層を形成する材
料としては、例えば、ポリカーボネート、ポリエステ
ル、ポリアミド、ペルフルオロ化イオン交換樹脂などよ
りなる群から選ばれる少なくとも一つが挙げられる。こ
のような保護被覆層は、膜又はフィルムを安定化層に接
着し、又は樹脂溶液を安定化層に被覆し、乾燥すること
によって形成させ得る。保護被覆層は、好適には０．０
５〜２０μm 、より好適には０．１〜１０μm の厚さを
有し、１〜５０nm、より好適には５〜３０nmの平均細孔
寸法を有している。
保護被覆層は、安定化層上に設けられ、それによって透
過される被分析物の量を調節する。保護被覆層は、内部
層を保護して被分析物を適切な量に調節し得るならば、
いかなる材料であってもよい。保護被覆層を形成する材
料としては、例えば、ポリカーボネート、ポリエステ
ル、ポリアミド、ペルフルオロ化イオン交換樹脂などよ
りなる群から選ばれる少なくとも一つが挙げられる。こ
のような保護被覆層は、膜又はフィルムを安定化層に接
着し、又は樹脂溶液を安定化層に被覆し、乾燥すること
によって形成させ得る。保護被覆層は、好適には０．０
５〜２０μm 、より好適には０．１〜１０μm の厚さを
有し、１〜５０nm、より好適には５〜３０nmの平均細孔
寸法を有している。
【００３３】上記の酵素電極は、グルコース、乳酸エス
テル、クレアチニン、コレステロール、コリン、グルタ
ミン酸エステル、ピルビン酸エステル、ラクトース、ス
クロース、シュウ酸エステル、アセチルコリン、全コレ
ステロールなどの量を検出するバイオセンサーとして、
特に電流測定バイオセンサー、化学センサーとして又は
バイオリアクター中で用いられる。
テル、クレアチニン、コレステロール、コリン、グルタ
ミン酸エステル、ピルビン酸エステル、ラクトース、ス
クロース、シュウ酸エステル、アセチルコリン、全コレ
ステロールなどの量を検出するバイオセンサーとして、
特に電流測定バイオセンサー、化学センサーとして又は
バイオリアクター中で用いられる。
【００３４】本発明のバイオセンサーは、好適に（ａ）
ＥＳＭ、（ｂ）酵素層、（ｃ）安定化層、及び（ｄ）保
護被覆層を含んでいる。
ＥＳＭ、（ｂ）酵素層、（ｃ）安定化層、及び（ｄ）保
護被覆層を含んでいる。
【００３５】このようなバイオセンサーは、例えば次の
ようにして調製することができる。最初に、電極基盤を
調製する。次に、コロイド状白金を、Ｈ2 Ｏ2 を用いた
酸化分解によって炭素粉末表面に堆積し、次いで白金化
活性炭を、リン酸緩衝液で処理して中和する。得られた
材料を結合樹脂と混合し、この混合物を粉砕して粘度を
調整した後、スクリーンプリントによって電極（電極基
盤）に適用してＥＳＭを形成させる。次に、緩衝液に溶
解した酵素をＥＳＭ上に適用して乾燥する。その後、安
定化層を形成するための材料溶液を酵素層上に散布し、
乾燥後、得られた材料を、例えばグルタルアルデヒド溶
液中に浸して安定化層を架橋させる。さらに、保護被覆
層のためのフィルムを付着させるか又は保護被覆層を形
成する樹脂溶液を被覆し乾燥して、バイオセンサーを調
製する。
ようにして調製することができる。最初に、電極基盤を
調製する。次に、コロイド状白金を、Ｈ2 Ｏ2 を用いた
酸化分解によって炭素粉末表面に堆積し、次いで白金化
活性炭を、リン酸緩衝液で処理して中和する。得られた
材料を結合樹脂と混合し、この混合物を粉砕して粘度を
調整した後、スクリーンプリントによって電極（電極基
盤）に適用してＥＳＭを形成させる。次に、緩衝液に溶
解した酵素をＥＳＭ上に適用して乾燥する。その後、安
定化層を形成するための材料溶液を酵素層上に散布し、
乾燥後、得られた材料を、例えばグルタルアルデヒド溶
液中に浸して安定化層を架橋させる。さらに、保護被覆
層のためのフィルムを付着させるか又は保護被覆層を形
成する樹脂溶液を被覆し乾燥して、バイオセンサーを調
製する。
【００３６】上記の層−層法によって調製されたバイオ
センサーは、現況の技術と比較して、性能での優れた改
善が見られる。開発されたシステムは、多くのＨ2 Ｏ2
発生酵素と共に作動する、かくして、酵素層中で相当す
る酵素／酵素類を使用することによって、グルコース、
乳酸エステル、クレアチニン、コレステロール、コリ
ン、グルタミン酸エステル、ピルビン酸エステル、ラク
トース、スクロース、シュウ酸エステル、アセチルコリ
ン、全コレステロールなどのための一連のバイオセンサ
ーを製造することができる。層−層構造のバイオセンサ
ーの性能は以下のようである： １）被分析物に高度に鋭敏（最高電流：２００〜１，０
００μA/cm2)であり、そのために、被分析物のマイクロ
モル以下の濃度を測定することができ、 ２）拡張した直線性、 ３）低い干渉電流、及び ４）低廉で簡単な製造法である。 この発明の最も有意な改善は、持続的又は長期的な作業
寿命と貯蔵寿命並びに高度な貯蔵安定性である。
センサーは、現況の技術と比較して、性能での優れた改
善が見られる。開発されたシステムは、多くのＨ2 Ｏ2
発生酵素と共に作動する、かくして、酵素層中で相当す
る酵素／酵素類を使用することによって、グルコース、
乳酸エステル、クレアチニン、コレステロール、コリ
ン、グルタミン酸エステル、ピルビン酸エステル、ラク
トース、スクロース、シュウ酸エステル、アセチルコリ
ン、全コレステロールなどのための一連のバイオセンサ
ーを製造することができる。層−層構造のバイオセンサ
ーの性能は以下のようである： １）被分析物に高度に鋭敏（最高電流：２００〜１，０
００μA/cm2)であり、そのために、被分析物のマイクロ
モル以下の濃度を測定することができ、 ２）拡張した直線性、 ３）低い干渉電流、及び ４）低廉で簡単な製造法である。 この発明の最も有意な改善は、持続的又は長期的な作業
寿命と貯蔵寿命並びに高度な貯蔵安定性である。
【００３７】本発明で調製したバイオセンサーは、長期
間、各種の濃度範囲で驚異的に優れた直線性を示す。
間、各種の濃度範囲で驚異的に優れた直線性を示す。
【００３８】
【実施例】以下に、実施例により本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００３９】実施例１： 多孔性ＥＳＭの製造 白金亜硫酸（II）錯体をＨ2 Ｏ2 で酸化分解することに
より、炭素粉末（公称粒径：約３０nm）表面上にコロイ
ド状白金（粒径：約１．５〜２．５nm）を堆積すること
によって調製した、E-TEK （Natic, MA, USA）から市販
されている白金化活性炭（ＰＡＣ、５％白金）の約３．
１５ｇをリン酸緩衝液で処理し、残存している硫酸があ
れば中和した。このリン酸緩衝液は、Kathon CG microb
icide （Rohm & Haas Corp., Philadelphia, PA の商品
名）の商品名で市販されている殺菌剤も含んでいる。蒸
留水１，０００mlに、リン酸ナトリウム〔二塩基性（Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 ）〕の１１．４９９ｇ、リン酸ナトリウム
〔一塩基性一水和化物（ＮａＨ2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ）〕の
２．８９８ｇ及びKathon CG microbicide １．０ｇを加
えて緩衝液を調製した。緩衝調合液をpH計及び電極で測
定し、７．５のpHを有することを確かめた。ＰＡＣの
３．１５ｇにリン酸緩衝液約１００mlを加え、７日間混
合した。混合した最初の３日目にＰＡＣを静置し、使用
した緩衝液６０mlを傾瀉し、新鮮な緩衝液１００mlで置
き換え、７日間混合した。混合７日後に吸引濾過し、中
和した炭素を吸引濾過しながら、緩衝液１００mlで洗浄
した。この炭素から緩衝液の大部分を吸引した後、約１
５〜２０秒間吸引を続け、この炭素を僅かに乾燥させて
材料を取り扱い易くした。
より、炭素粉末（公称粒径：約３０nm）表面上にコロイ
ド状白金（粒径：約１．５〜２．５nm）を堆積すること
によって調製した、E-TEK （Natic, MA, USA）から市販
されている白金化活性炭（ＰＡＣ、５％白金）の約３．
１５ｇをリン酸緩衝液で処理し、残存している硫酸があ
れば中和した。このリン酸緩衝液は、Kathon CG microb
icide （Rohm & Haas Corp., Philadelphia, PA の商品
名）の商品名で市販されている殺菌剤も含んでいる。蒸
留水１，０００mlに、リン酸ナトリウム〔二塩基性（Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 ）〕の１１．４９９ｇ、リン酸ナトリウム
〔一塩基性一水和化物（ＮａＨ2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ）〕の
２．８９８ｇ及びKathon CG microbicide １．０ｇを加
えて緩衝液を調製した。緩衝調合液をpH計及び電極で測
定し、７．５のpHを有することを確かめた。ＰＡＣの
３．１５ｇにリン酸緩衝液約１００mlを加え、７日間混
合した。混合した最初の３日目にＰＡＣを静置し、使用
した緩衝液６０mlを傾瀉し、新鮮な緩衝液１００mlで置
き換え、７日間混合した。混合７日後に吸引濾過し、中
和した炭素を吸引濾過しながら、緩衝液１００mlで洗浄
した。この炭素から緩衝液の大部分を吸引した後、約１
５〜２０秒間吸引を続け、この炭素を僅かに乾燥させて
材料を取り扱い易くした。
【００４０】次いで、ＰＡＣを、Sigma (St. Louis，M
O，USA)から市販されているウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の６２５mgと混合した。ＰＡＣを含むフラスコにＢ
ＳＡの６２５mgを加え、さらに緩衝液４０mlを加えた。
ＢＳＡとＰＡＣを穏やかに混合し、０．５時間放置して
ＢＳＡを溶解した。この混合物を、室温で一夜穏やかに
混合した。その後、ＢＳＡ−ＰＡＣ混合物を吸引濾過
し、ＢＳＡ−ＰＡＣから緩衝液の大部分を吸引した後、
約２０秒間吸引を続け、ＢＳＡ−ＰＡＣを乾燥して水分
含量を約６０〜７０％とした。
O，USA)から市販されているウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の６２５mgと混合した。ＰＡＣを含むフラスコにＢ
ＳＡの６２５mgを加え、さらに緩衝液４０mlを加えた。
ＢＳＡとＰＡＣを穏やかに混合し、０．５時間放置して
ＢＳＡを溶解した。この混合物を、室温で一夜穏やかに
混合した。その後、ＢＳＡ−ＰＡＣ混合物を吸引濾過
し、ＢＳＡ−ＰＡＣから緩衝液の大部分を吸引した後、
約２０秒間吸引を続け、ＢＳＡ−ＰＡＣを乾燥して水分
含量を約６０〜７０％とした。
【００４１】Metech（Elverson, PA, USA)から製品番号
8101 RS （ポリエステル樹脂）として市販されている結
合樹脂５．０ｇを、ＢＳＡ−ＰＡＣ（上記と同様に調製
した）の２．０ｇに加えてインクを調合した。この混合
物に、プリント流動助剤として東京化成（東京）から市
販されているTriton X-100界面活性剤０．２５ｇを加え
た。次いで、塗料工業で標準的な三段式ロールミルを用
いて、この混合物を粉砕した。最初の粉砕が終了した
後、8101 RS thinner としてMetechから市販されている
Albesso シンナー１．０mlを加え、プリントの目的のた
めにペーストの粘度を調整した。第二の期間に、混合物
を粉砕した。得られたペーストを電極上のスクリーンプ
リントのために適用して作動電極を調製した。
8101 RS （ポリエステル樹脂）として市販されている結
合樹脂５．０ｇを、ＢＳＡ−ＰＡＣ（上記と同様に調製
した）の２．０ｇに加えてインクを調合した。この混合
物に、プリント流動助剤として東京化成（東京）から市
販されているTriton X-100界面活性剤０．２５ｇを加え
た。次いで、塗料工業で標準的な三段式ロールミルを用
いて、この混合物を粉砕した。最初の粉砕が終了した
後、8101 RS thinner としてMetechから市販されている
Albesso シンナー１．０mlを加え、プリントの目的のた
めにペーストの粘度を調整した。第二の期間に、混合物
を粉砕した。得られたペーストを電極上のスクリーンプ
リントのために適用して作動電極を調製した。
【００４２】比較実施例１： 非多孔性ＥＳＭの製造 実施例１に記載した方法により、ＢＳＡ処理を行うこと
なくＰＡＣを調製し、非多孔性電極を製造するのに使用
した。インクは、ＰＡＣの０．２３８ｇ及びTriton X-1
00にMetech 8101 RSの０．２５０ｇを加えて調合した。
得られた混合物を、実施例１と同様に粉砕し、スクリー
ンプリントのために電極上に適用して作動電極を調製し
た。
なくＰＡＣを調製し、非多孔性電極を製造するのに使用
した。インクは、ＰＡＣの０．２３８ｇ及びTriton X-1
00にMetech 8101 RSの０．２５０ｇを加えて調合した。
得られた混合物を、実施例１と同様に粉砕し、スクリー
ンプリントのために電極上に適用して作動電極を調製し
た。
【００４３】実施例２： バイオセンサーの製造 乳酸酸化酵素（Aerococcus Viridans)の１．０mg（２０
％蛋白含量）をリン酸緩衝液（０．１M 、ＫＨ2 ＰＯ4
／Ｋ2 ＨＰＯ4 、pH７．０）の１００μl に溶解し、Ｌ
ＯＤ溶液２mg/ml を得た。５％白金添加ＰＡＣに代え
て、４０％白金添加ＰＡＣを用いた以外は、実施例１で
調製した上記のＥＳＭ（検出面積：０．０３１４cm2)
に、得られた溶液１．０μl を適用した。これは電極表
面上の活性酵素約６４μg/cm2 に相当する。電極を室温
で３０分間乾燥後、減圧にした乾燥器中で３０℃で１時
間さらに乾燥した。酵素層にゼラチン溶液（５％脱イオ
ン水溶液）の１０μl を散布して安定化層を得た。得ら
れた電極を室温で３０分間乾燥し、減圧下に３０℃でさ
らに乾燥した。ゼラチン層を５％グルタルアルデヒド溶
液に３０秒間浸して架橋させた。脱イオン水で連続的に
３回洗浄した後、電極を室温で１時間、減圧下に３０℃
で一夜さらに乾燥した。
％蛋白含量）をリン酸緩衝液（０．１M 、ＫＨ2 ＰＯ4
／Ｋ2 ＨＰＯ4 、pH７．０）の１００μl に溶解し、Ｌ
ＯＤ溶液２mg/ml を得た。５％白金添加ＰＡＣに代え
て、４０％白金添加ＰＡＣを用いた以外は、実施例１で
調製した上記のＥＳＭ（検出面積：０．０３１４cm2)
に、得られた溶液１．０μl を適用した。これは電極表
面上の活性酵素約６４μg/cm2 に相当する。電極を室温
で３０分間乾燥後、減圧にした乾燥器中で３０℃で１時
間さらに乾燥した。酵素層にゼラチン溶液（５％脱イオ
ン水溶液）の１０μl を散布して安定化層を得た。得ら
れた電極を室温で３０分間乾燥し、減圧下に３０℃でさ
らに乾燥した。ゼラチン層を５％グルタルアルデヒド溶
液に３０秒間浸して架橋させた。脱イオン水で連続的に
３回洗浄した後、電極を室温で１時間、減圧下に３０℃
で一夜さらに乾燥した。
【００４４】保護被覆層としてNuclepore （商品名、細
孔径：１５nm、厚さ：６μm)を適用した後、得られた乳
酸センサーの性能を、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mV
で分極させ、流動停止分析法により３７℃で乳酸エステ
ルの各種濃度について試験した。酵素６４μg/cm2 を添
加した。結果を図１に示した。図１に見られるように、
５９日間の連続操作後にも電極の応答は変わらず、広い
濃度範囲で非常に優れた直線性を示した。
孔径：１５nm、厚さ：６μm)を適用した後、得られた乳
酸センサーの性能を、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mV
で分極させ、流動停止分析法により３７℃で乳酸エステ
ルの各種濃度について試験した。酵素６４μg/cm2 を添
加した。結果を図１に示した。図１に見られるように、
５９日間の連続操作後にも電極の応答は変わらず、広い
濃度範囲で非常に優れた直線性を示した。
【００４５】比較実施例２：乳酸酸化酵素（Aerococcus
Viridans からの）をＰＡＣペーストに加えたことを除
き、実施例１に記載した方法に準じて、従来の方法で乳
酸センサーを調製した。得られたペーストを電極上にス
クリーンプリントし、作動電極を調製した。保護被覆層
としてNuclepore （商品名、細孔径：１５nm、厚さ：６
μm)を適用した後、得られた乳酸センサーの性能を、Ａ
ｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸エステルの各種濃
度について試験した。１日目と１０日目の結果を図２に
示した。図２に見られるように、酵素がペーストと混合
して用いられる場合、バイオセンサーとしての安定性
は、時間の経過と共に悪くなり、１０日後には良い直線
性は得られなかった。
Viridans からの）をＰＡＣペーストに加えたことを除
き、実施例１に記載した方法に準じて、従来の方法で乳
酸センサーを調製した。得られたペーストを電極上にス
クリーンプリントし、作動電極を調製した。保護被覆層
としてNuclepore （商品名、細孔径：１５nm、厚さ：６
μm)を適用した後、得られた乳酸センサーの性能を、Ａ
ｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸エステルの各種濃
度について試験した。１日目と１０日目の結果を図２に
示した。図２に見られるように、酵素がペーストと混合
して用いられる場合、バイオセンサーとしての安定性
は、時間の経過と共に悪くなり、１０日後には良い直線
性は得られなかった。
【００４６】実施例３：乳酸酸化酵素溶液（２mg/ml)の
０．５μl を電極表面に適用したことを除いて、実施例
２の方法を行い、電極表面上の活性酵素約３２μg/cm2
を得た。検定は、流動停止分析法によって３７℃で行っ
た。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸センサーを
分極させた。酵素３２μg/cm2 を添加した。０〜１６mM
の間で非常に優れた直線性を有する、実質的に同様な直
線性の電極を得た。感度は２．７４μA/cm2 ×mMであっ
た。
０．５μl を電極表面に適用したことを除いて、実施例
２の方法を行い、電極表面上の活性酵素約３２μg/cm2
を得た。検定は、流動停止分析法によって３７℃で行っ
た。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸センサーを
分極させた。酵素３２μg/cm2 を添加した。０〜１６mM
の間で非常に優れた直線性を有する、実質的に同様な直
線性の電極を得た。感度は２．７４μA/cm2 ×mMであっ
た。
【００４７】実施例４：乳酸酸化酵素溶液（２mg/ml)の
８μl を電極表面に適用したことを除いて、実施例２の
方法を行い、電極表面上の活性酵素約１，２８０μg/cm
2 を得た。検定は、流動停止分析法によって３７℃で行
った。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸センサー
を分極させた。酵素１，２８０μg/cm2 を添加した。乳
酸エステルの各種濃度で測定した電極材料からの電流出
力を観察した。０〜１６mMの間で非常に優れた直線性を
有する、実質的に同様な直線性の電極を得た。感度は
２．８０μA/cm2 ×mMであった。
８μl を電極表面に適用したことを除いて、実施例２の
方法を行い、電極表面上の活性酵素約１，２８０μg/cm
2 を得た。検定は、流動停止分析法によって３７℃で行
った。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸センサー
を分極させた。酵素１，２８０μg/cm2 を添加した。乳
酸エステルの各種濃度で測定した電極材料からの電流出
力を観察した。０〜１６mMの間で非常に優れた直線性を
有する、実質的に同様な直線性の電極を得た。感度は
２．８０μA/cm2 ×mMであった。
【００４８】実施例５：ゼラチン−グルタルアルデヒド
の代わりにHo-326〔商品名、Toyo Goseiの製品、スチル
バゾリウム基を有するポリ（ビニルアルコール）〕を用
いたことを除いて、実施例２の方法を行った。検定は、
流動停止分析法によって３７℃で行った。Ａｇ／ＡｇＣ
ｌに対して４００mVで乳酸センサーを分極させた。ポリ
（ビニルアルコール）型のプレポリマーで酵素を捕捉し
た。乳酸エステルの各種濃度で測定した電極材料からの
電流出力を観察した。０〜１６mMの間で非常に優れた直
線性を有する、実質的に同様な直線性の電極を得た。感
度は２．９９μA/cm2 ×mMであった。
の代わりにHo-326〔商品名、Toyo Goseiの製品、スチル
バゾリウム基を有するポリ（ビニルアルコール）〕を用
いたことを除いて、実施例２の方法を行った。検定は、
流動停止分析法によって３７℃で行った。Ａｇ／ＡｇＣ
ｌに対して４００mVで乳酸センサーを分極させた。ポリ
（ビニルアルコール）型のプレポリマーで酵素を捕捉し
た。乳酸エステルの各種濃度で測定した電極材料からの
電流出力を観察した。０〜１６mMの間で非常に優れた直
線性を有する、実質的に同様な直線性の電極を得た。感
度は２．９９μA/cm2 ×mMであった。
【００４９】実施例６：ゼラチン−グルタルアルデヒド
に代えて、光開始剤として、ENT-1000〔商品名、Kansai
Paintの製品、両末端にビニル基を有するポリ（エチレ
ンオキシド）〕及びIrugacure 2959（Ciba-Geigy A.G.
の製品）を用いたことを除いて、実施例２の方法を行っ
た。検定は、流動停止分析法によって３７℃で行った。
Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸センサーを分極
させた。ポリ（エチレンオキシド）型のプレポリマーで
酵素を捕捉した。乳酸エステルの各種濃度で測定した電
極材料からの電流出力を観察した。０〜１６mMの間で非
常に優れた直線性を有する、実質的に同様な直線性の電
極を得た。感度は０．２１７μA/cm2 ×mMであった。
に代えて、光開始剤として、ENT-1000〔商品名、Kansai
Paintの製品、両末端にビニル基を有するポリ（エチレ
ンオキシド）〕及びIrugacure 2959（Ciba-Geigy A.G.
の製品）を用いたことを除いて、実施例２の方法を行っ
た。検定は、流動停止分析法によって３７℃で行った。
Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸センサーを分極
させた。ポリ（エチレンオキシド）型のプレポリマーで
酵素を捕捉した。乳酸エステルの各種濃度で測定した電
極材料からの電流出力を観察した。０〜１６mMの間で非
常に優れた直線性を有する、実質的に同様な直線性の電
極を得た。感度は０．２１７μA/cm2 ×mMであった。
【００５０】比較実施例３：比較実施例２で調製した非
多孔性電極を用いたことを除いて、実施例２の方法を行
った。検定は、流動停止分析法によって３７℃で行っ
た。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸センサーを
分極させた。酵素を平板型チップ上に添加した。同条件
下に、乳酸エステルの各種濃度で測定した電極材料から
の電流出力を観察した。０〜１０mMの間で非常に優れた
直線性を有する、実質的に同様な直線性の電極を得た。
感度は２．５３μA/cm2 ×mMであった。１０mM以上の乳
酸濃度では、良い直線性は見られなかった。
多孔性電極を用いたことを除いて、実施例２の方法を行
った。検定は、流動停止分析法によって３７℃で行っ
た。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸センサーを
分極させた。酵素を平板型チップ上に添加した。同条件
下に、乳酸エステルの各種濃度で測定した電極材料から
の電流出力を観察した。０〜１０mMの間で非常に優れた
直線性を有する、実質的に同様な直線性の電極を得た。
感度は２．５３μA/cm2 ×mMであった。１０mM以上の乳
酸濃度では、良い直線性は見られなかった。
【００５１】実施例７：４０％白金添加ＰＡＣに代え
て、８０％白金添加ＰＡＣを適用した以外は、実施例２
の方法を行った。検定は、流動停止分析法によって３７
℃で行った。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸セ
ンサーを分極させた。８０％ＰＡＣを含むチップ上に酵
素を添加した。乳酸エステルの各種濃度で測定した電極
材料からの電流出力を観察した。０〜１６mMの間で非常
に優れた直線性を有する、実質的に同様な直線性の電極
を得た。感度は０．２μA/cm2 ×mMであった。
て、８０％白金添加ＰＡＣを適用した以外は、実施例２
の方法を行った。検定は、流動停止分析法によって３７
℃で行った。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVで乳酸セ
ンサーを分極させた。８０％ＰＡＣを含むチップ上に酵
素を添加した。乳酸エステルの各種濃度で測定した電極
材料からの電流出力を観察した。０〜１６mMの間で非常
に優れた直線性を有する、実質的に同様な直線性の電極
を得た。感度は０．２μA/cm2 ×mMであった。
【００５２】実施例８：クレアチニナーゼ（Pseudomona
s sp. から、Asahi Chemicalの製品、８．８unit/mg)の
０．９mg、クレアチナーゼ（Bacillus sp.から、Asahi
Chemicalの製品、７．０unit/mg)の３．４mg及びサルコ
シン酸化酵素（Arthrobacter sp.から、Toyoboの製品、
５．７unit/mg)の１．４mgを、リン酸緩衝液（０．１M
ＫＨ2 ＰＯ4 ／Ｋ2 ＨＰＯ4 、pH７．０）の１００μl
に溶解した。得られた溶液２．０μl を、実施例１で調
製した上記のＨ2 Ｏ2 検出層（検出面積：０．０３１４
cm2)に適用した。室温で３０分間乾燥後、電極を減圧に
した乾燥器中で３０℃で１時間さらに乾燥した。酵素層
にゼラチン溶液（５％脱イオン水溶液）の１０μlを散
布し、安定化層を形成させた。得られた電極を室温で３
０分間乾燥し、減圧下に３０℃でさらに乾燥した。ゼラ
チン層を５％グルタルアルデヒド溶液に３０秒間浸して
架橋させた。脱イオン水で連続的に３回洗浄した後、電
極を室温で１時間、減圧下に３０℃で一夜さらに乾燥し
た。
s sp. から、Asahi Chemicalの製品、８．８unit/mg)の
０．９mg、クレアチナーゼ（Bacillus sp.から、Asahi
Chemicalの製品、７．０unit/mg)の３．４mg及びサルコ
シン酸化酵素（Arthrobacter sp.から、Toyoboの製品、
５．７unit/mg)の１．４mgを、リン酸緩衝液（０．１M
ＫＨ2 ＰＯ4 ／Ｋ2 ＨＰＯ4 、pH７．０）の１００μl
に溶解した。得られた溶液２．０μl を、実施例１で調
製した上記のＨ2 Ｏ2 検出層（検出面積：０．０３１４
cm2)に適用した。室温で３０分間乾燥後、電極を減圧に
した乾燥器中で３０℃で１時間さらに乾燥した。酵素層
にゼラチン溶液（５％脱イオン水溶液）の１０μlを散
布し、安定化層を形成させた。得られた電極を室温で３
０分間乾燥し、減圧下に３０℃でさらに乾燥した。ゼラ
チン層を５％グルタルアルデヒド溶液に３０秒間浸して
架橋させた。脱イオン水で連続的に３回洗浄した後、電
極を室温で１時間、減圧下に３０℃で一夜さらに乾燥し
た。
【００５３】得られたクレアチニンセンサーの性能を、
クレアチニンの各種濃度で試験した。検定は、手動で注
入する流動停止分析法によって３７℃で行った。Ａｇ／
ＡｇＣｌに対して４００mVでクレアチニンセンサーを分
極させた。０〜２５０μM のクレアチニン濃度で優れた
直線性を得た。感度は１３．９nA/cm2×μM であった。
クレアチニンの各種濃度で試験した。検定は、手動で注
入する流動停止分析法によって３７℃で行った。Ａｇ／
ＡｇＣｌに対して４００mVでクレアチニンセンサーを分
極させた。０〜２５０μM のクレアチニン濃度で優れた
直線性を得た。感度は１３．９nA/cm2×μM であった。
【００５４】実施例９：クレアチニナーゼ（Pseudomona
s sp. から、Toyoboの製品、２５８unit/mg)の０．１１
mg、クレアチナーゼ（Actinobacillusから、Sigma の製
品、３０unit/mg)の４．８mg及びサルコシン酸化酵素
（Bacillus sp.から、Asahi Chemicals の製品、３６un
it/mg)の０．７９mgを用いた以外は、実施例６の方法を
行った。検定は、手動で注入する流動停止分析法によっ
て室温で行った。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVでク
レアチニンセンサーを分極させた。実施例６と同じ条件
下に、電流出力を測定した。０〜１００μM のクレアチ
ニン濃度で優れた直線性を得た。感度は３２．３nA/cm2
×μM であった。
s sp. から、Toyoboの製品、２５８unit/mg)の０．１１
mg、クレアチナーゼ（Actinobacillusから、Sigma の製
品、３０unit/mg)の４．８mg及びサルコシン酸化酵素
（Bacillus sp.から、Asahi Chemicals の製品、３６un
it/mg)の０．７９mgを用いた以外は、実施例６の方法を
行った。検定は、手動で注入する流動停止分析法によっ
て室温で行った。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して４００mVでク
レアチニンセンサーを分極させた。実施例６と同じ条件
下に、電流出力を測定した。０〜１００μM のクレアチ
ニン濃度で優れた直線性を得た。感度は３２．３nA/cm2
×μM であった。
【００５５】実施例１０： 成形可能な白金化導電性（Ｐ−ＳＥＣ）フィルムの製造 （ａ）ＳＥＣフィルムの洗浄 ＳＥＣフィルム表面は高度に疏水性であるために、フィ
ルム表面が有機粒子の吸着によって汚れたままであるこ
とがあり得る。したがって、表面を清浄するために、フ
ィルムをエタノールで一夜処理してアセトニトリルで１
〜２時間洗浄し、最後にmilli-Q 水で徹底的に洗浄して
２〜３時間減圧乾燥し、次いで密閉容器に入れ室温に貯
蔵した。
ルム表面が有機粒子の吸着によって汚れたままであるこ
とがあり得る。したがって、表面を清浄するために、フ
ィルムをエタノールで一夜処理してアセトニトリルで１
〜２時間洗浄し、最後にmilli-Q 水で徹底的に洗浄して
２〜３時間減圧乾燥し、次いで密閉容器に入れ室温に貯
蔵した。
【００５６】（ｂ）白金化 ＳＥＣフィルム上にＰｔ黒層を作るために二つの異なる
方法を使用した。 １）電気化学的白金化：ヘキサクロロ白金酸の１０〜５
０mM及び酢酸鉛０．６mg/ml を含む溶液中で、静電的又
は静電流的の何れかで白金化を行った。この溶液は、ま
た、０．１M ＨＣｌ又は０．１M Ｈ2 ＳＯ4 を含む。Ｓ
ＥＣフィルム作動電極に、５〜１０分間、−０．２V 〜
−０．４V （この明細書中での電位は全てＡｇ／ＡｇＣ
ｌに対するものである）の範囲の電位を与えて、白金化
を行った。他方、静電流堆積は、５〜１０分間、２mA/c
m2〜６mA/cm2の範囲の一定電流で行った。比較的大きな
Ｐ−ＳＥＣフィルムを作るためには、水平に回転する型
の電極を用いた。ＳＥＣフィルムを、回転するシリンダ
ーに接着テープで固定した。通常、希釈溶液（１０mMＨ
2 ＰｔＣｌ6)からの静電流堆積は、電極を毎分１０〜１
００回転の速度で回転しながら、このＳＥＣフィルム上
で行った。白金化の後、Ｐ−ＳＥＣを、pH７のリン酸緩
衝液（ＰＢＳ）で一夜洗浄して乾燥した。 ２）熱−圧縮法：非常に微細なＰｔ黒粉末を、ＮａＢＨ
4 による化学還元で調製した。この粉末を２−メトキシ
エタノール中で懸濁液とした。懸濁液を希釈してＳＥＣ
上に流延して乾燥した。Ｐｔ流延フィルムを二段式加熱
ローラで圧縮した。ローラの温度を１５０〜１６０℃に
設定した。この温度でＳＥＣは非常に柔らかになり、Ｐ
ｔ黒粒子はＳＥＣフィルムに強く付着し、非常に均一な
白金化ＳＥＣフィルムを形成した。
方法を使用した。 １）電気化学的白金化：ヘキサクロロ白金酸の１０〜５
０mM及び酢酸鉛０．６mg/ml を含む溶液中で、静電的又
は静電流的の何れかで白金化を行った。この溶液は、ま
た、０．１M ＨＣｌ又は０．１M Ｈ2 ＳＯ4 を含む。Ｓ
ＥＣフィルム作動電極に、５〜１０分間、−０．２V 〜
−０．４V （この明細書中での電位は全てＡｇ／ＡｇＣ
ｌに対するものである）の範囲の電位を与えて、白金化
を行った。他方、静電流堆積は、５〜１０分間、２mA/c
m2〜６mA/cm2の範囲の一定電流で行った。比較的大きな
Ｐ−ＳＥＣフィルムを作るためには、水平に回転する型
の電極を用いた。ＳＥＣフィルムを、回転するシリンダ
ーに接着テープで固定した。通常、希釈溶液（１０mMＨ
2 ＰｔＣｌ6)からの静電流堆積は、電極を毎分１０〜１
００回転の速度で回転しながら、このＳＥＣフィルム上
で行った。白金化の後、Ｐ−ＳＥＣを、pH７のリン酸緩
衝液（ＰＢＳ）で一夜洗浄して乾燥した。 ２）熱−圧縮法：非常に微細なＰｔ黒粉末を、ＮａＢＨ
4 による化学還元で調製した。この粉末を２−メトキシ
エタノール中で懸濁液とした。懸濁液を希釈してＳＥＣ
上に流延して乾燥した。Ｐｔ流延フィルムを二段式加熱
ローラで圧縮した。ローラの温度を１５０〜１６０℃に
設定した。この温度でＳＥＣは非常に柔らかになり、Ｐ
ｔ黒粒子はＳＥＣフィルムに強く付着し、非常に均一な
白金化ＳＥＣフィルムを形成した。
【００５７】実施例１１： バイオセンサーの製造 Ｐ−ＳＥＣフィルムを一定の大きさに切断した。酵素の
１０〜２０mg/ml をpH７．０のＰＢＳに溶解した。ＧＯ
Ｄ溶液の２０μl/cm2 をＰ−ＳＥＣフィルム上に流延
し、フィルムが乾くまで周囲条件で放置した。又は、酵
素吸着のために、Ｐ−ＳＥＣを上記の酵素溶液中に一夜
浸漬した。その後、溶液を水中で調製し、３０分間３７
℃に放置した。ゼラチン溶液の１０μl/cm2 を、酵素流
延Ｐ−ＳＥＣフィルム上に流延して周囲条件で乾燥し
た。次いで、このフィルムをグルタルアルデヒド溶液
（５％水溶液）に６０秒間浸し、水で完全に洗浄してか
ら周囲条件で数時間乾燥した。このフィルムを、用時ま
で−１８℃で保存した。結果を図３及び第１表に示し
た。
１０〜２０mg/ml をpH７．０のＰＢＳに溶解した。ＧＯ
Ｄ溶液の２０μl/cm2 をＰ−ＳＥＣフィルム上に流延
し、フィルムが乾くまで周囲条件で放置した。又は、酵
素吸着のために、Ｐ−ＳＥＣを上記の酵素溶液中に一夜
浸漬した。その後、溶液を水中で調製し、３０分間３７
℃に放置した。ゼラチン溶液の１０μl/cm2 を、酵素流
延Ｐ−ＳＥＣフィルム上に流延して周囲条件で乾燥し
た。次いで、このフィルムをグルタルアルデヒド溶液
（５％水溶液）に６０秒間浸し、水で完全に洗浄してか
ら周囲条件で数時間乾燥した。このフィルムを、用時ま
で−１８℃で保存した。結果を図３及び第１表に示し
た。
【００５８】図３は、１日目、２２日目及び４２日目に
おけるグルコースセンサーの検量線である。本発明のバ
イオセンサーは、２２日及び４２日後にも優れた直線性
を示すことが図３から理解される。さらに、図１は、Ｐ
−ＳＥＣフィルムに関する層−層構造のグルコースセン
サーの貯蔵安定性を示している。第１表に示すように、
本発明のグルコースセンサーの検量線の勾配は、１５ヵ
月貯蔵後にも非常に安定している。
おけるグルコースセンサーの検量線である。本発明のバ
イオセンサーは、２２日及び４２日後にも優れた直線性
を示すことが図３から理解される。さらに、図１は、Ｐ
−ＳＥＣフィルムに関する層−層構造のグルコースセン
サーの貯蔵安定性を示している。第１表に示すように、
本発明のグルコースセンサーの検量線の勾配は、１５ヵ
月貯蔵後にも非常に安定している。
【００５９】
【表１】
【００６０】上記の結果から、本発明で製造されたバイ
オセンサーは、被分析物の幅広い濃度範囲で、長期間安
定して、優れた直線性を示すと言うことができる。
オセンサーは、被分析物の幅広い濃度範囲で、長期間安
定して、優れた直線性を示すと言うことができる。
【図１】乳酸センサーのための、乳酸濃度に対する検量
線である。
線である。
【図２】乳酸センサーのための、乳酸濃度に対する検量
線である。
線である。
【図３】グルコースセンサーのための、グルコース濃度
に対する検量線である。
に対する検量線である。
Claims (29)
- 【請求項１】 （ａ）多孔性の導電性層を含む導電性支
持部材（ＥＳＭ）、（ｂ）該多孔性層の表面に吸着又は
固定された、触媒として有効な量の酵素、及び（ｃ）多
孔性層からの該酵素の浸出を防止する保護層、よりなる
酵素電極。 - 【請求項２】 該多孔性の導電性層が、表面が白金族金
属の微粒子と密に接触し、かつ、樹脂によって一体に結
合された炭素粒子から形成され、該層が、全体にわたっ
て実質的に均一に分布した該金属粒子によって金属化さ
れ、かつ、樹脂結合された金属化炭素粒子より実質的に
なる、本質的に不均一な多孔性基材を構成する、請求項
１記載の酵素電極。 - 【請求項３】 該白金族金属が、該炭素粒子に比べてよ
り微細な粒子の形で存在する、請求項２記載の酵素電
極。 - 【請求項４】 該白金族金属が、個々の炭素粒子の表面
に吸着された粒子の形で存在し、該金属粒子が、約１５
〜２５オングストロームの範囲のコロイドとしての粒径
を有する、請求項２記載の酵素電極。 - 【請求項５】 該炭素粒子が、約１〜約１０オングスト
ロームの平均粒径を有する、請求項２記載の酵素電極。 - 【請求項６】 該白金族金属が、該炭素粒子の重量に基
づいて１〜１００重量％の量で存在する、請求項２記載
の酵素電極。 - 【請求項７】 該白金族金属が、該炭素粒子の重量に基
づいて５〜８０重量％の量で存在する、請求項６記載の
酵素電極。 - 【請求項８】 該白金族金属が、白金である、請求項２
記載の酵素電極。 - 【請求項９】 該白金族金属が、パラジウムである、請
求項２記載の酵素電極。 - 【請求項１０】 該樹脂が、フッ化炭素樹脂、ポリエス
テル樹脂、セルロース、ポリアミド樹脂及びポリ（ビニ
ル酢酸）樹脂よりなる群から選ばれる、請求項２記載の
酵素電極。 - 【請求項１１】 該多孔性の導電性層が、導電性ポリマ
ーフィルム及び白金族金属粒子を含む層よりなる、請求
項１記載の酵素電極。 - 【請求項１２】 該導電性フィルムが、ポリピロールか
ら製造される、請求項１１記載の酵素電極。 - 【請求項１３】 白金族金属粒子を含む層が、電気化学
的金属化によって形成される、請求項１１記載の酵素電
極。 - 【請求項１４】 白金族金属粒子を含む層が、熱−圧縮
によって形成される、請求項１１記載の酵素電極。 - 【請求項１５】 白金族金属粒子を含む層が、ポリマー
結合剤と共に流延によって形成される、請求項１１記載
の酵素電極。 - 【請求項１６】 該酵素が、１０〜３，０００μg/cm
2 、好適には３０〜１，５００μg/cm2 の量で固定又は
吸着されている、請求項１記載の酵素電極。 - 【請求項１７】 該酵素が、酸化還元酵素である、請求
項１記載の酵素電極。 - 【請求項１８】 該酵素が、グルコース酸化酵素、乳酸
酸化酵素、コレステロール酸化酵素、コリン酸化酵素、
グルタミン酸酸化酵素、ピルビン酸酸化酵素、ラクトー
ス酸化酵素、シュウ酸酸化酵素及びサルコシン酸化酵素
よりなる群から選ばれる、請求項１７記載の酵素電極。 - 【請求項１９】 該酸化還元酵素が、該酸化還元酵素以
外の少なくとも一つの酵素を伴う、請求項１７記載の酵
素電極。 - 【請求項２０】 該酸化還元酵素が、サルコシン酸化酵
素であり、そして該酸化還元酵素以外の該酵素が、クレ
アチナーゼを伴うクレアチニナーゼである、請求項１９
記載の酵素電極。 - 【請求項２１】 該保護層が、ゼラチン、ポリビニルア
ルコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリビニルピロ
リドン、ポリアクリルアミド及びポリ（２−ヒドロキシ
エチルメタクリラート）よりなる群から選ばれる少なく
とも一つを含む、請求項１７記載の酵素電極。 - 【請求項２２】 該保護層が、グルタルアルデヒドを用
いて架橋される、請求項２１記載の酵素電極。 - 【請求項２３】 該保護層が、光架橋剤を用いて架橋さ
れる、請求項２１記載の酵素電極。 - 【請求項２４】 該電極が、該多孔性の導電性層及び保
護層をおおう保護被覆層として、検出する物質が透過で
きる微細な多孔性薄膜を含む、請求項１記載の酵素電
極。 - 【請求項２５】 該薄膜が、拡散が制御された条件下
で、該物質の透過を可能にする、請求項２４記載の酵素
電極。 - 【請求項２６】 該酵素によって作用を受ける物質を含
む液体及び電極上の電位の存在下に、酵素電極の活性な
被覆中に含まれる酵素の触媒活性を電流測定的に指示す
る方法であって、 （ａ）多孔性の導電性層よりなる導電性支持部材、
（ｂ）該多孔性層の表面に吸着又は固定された、触媒と
して有効な量の該酵素、及び（ｃ）多孔性層からの該酵
素の浸出を防止する安定化層、よりなる電極を含む改良
法。 - 【請求項２７】 少なくとも一つの表面に、白金族金属
の微粒子を含む導電性ポリマーフィルム。 - 【請求項２８】 粒径が、１〜１０nmである、請求項２
７記載のポリマーフィルム。 - 【請求項２９】 導電性ポリマーフィルムが、ポリヘテ
ロ芳香族のポリカチオン又はポリアニリンのポリカチオ
ン、及びハロゲン化物、ＢＦ4 、ＰＦ6 、ＡｓＦ6 、Ｓ
ｂＦ6 の群から選ばれる非求核性の小アニオン又は−Ｓ
Ｏ3 -若しくは−ＯＳＯ3 -基を有するポリマーのポリマー
性のポリアニオンから構成される、請求項２７記載のポ
リマーフィルム。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006292761A (ja) * | 2005-04-12 | 2006-10-26 | Lifescan Scotland Ltd | 酵素電気化学を基礎とするセンサーに用いられる水混和性の導電性インク |
| JP2007514460A (ja) * | 2003-09-30 | 2007-06-07 | エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト | 増大した生物適合性を示すセンサー |
| JP2007139729A (ja) * | 2005-11-23 | 2007-06-07 | Japan Science & Technology Agency | 酵素固定化バイオセンサー |
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|---|---|---|---|---|
| US5696314A (en) * | 1996-07-12 | 1997-12-09 | Chiron Diagnostics Corporation | Multilayer enzyme electrode membranes and methods of making same |
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| EP0969282B1 (en) * | 1998-07-02 | 2011-09-21 | NEC Corporation | An enzyme electrode and a biosensor and a measuring apparatus therewith |
| US6042751A (en) * | 1998-09-17 | 2000-03-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Thick film conductor composition for use in biosensors |
| US6599408B1 (en) | 1998-09-17 | 2003-07-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Thick film conductor composition for use in biosensors |
| GB0004155D0 (en) * | 2000-02-23 | 2000-04-12 | Univ Birmingham | Metal reduction |
| US6896793B2 (en) | 2001-03-07 | 2005-05-24 | Instrumentation Laboratory Company | Liquid junction reference electrode and methods of use thereof |
| US6960466B2 (en) * | 2001-05-31 | 2005-11-01 | Instrumentation Laboratory Company | Composite membrane containing a cross-linked enzyme matrix for a biosensor |
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| GB0208153D0 (en) * | 2002-04-09 | 2002-05-22 | Univ Warwick | Biosensor |
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| US7545272B2 (en) | 2005-02-08 | 2009-06-09 | Therasense, Inc. | RF tag on test strips, test strip vials and boxes |
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| US8241697B2 (en) | 2007-12-20 | 2012-08-14 | Abbott Point Of Care Inc. | Formation of immobilized biological layers for sensing |
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Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5861459A (ja) * | 1981-10-07 | 1983-04-12 | Hitachi Ltd | クレアチンとクレアチニンの分析装置 |
| GB8612861D0 (en) * | 1986-05-27 | 1986-07-02 | Cambridge Life Sciences | Immobilised enzyme biosensors |
| JPH0721479B2 (ja) * | 1987-05-20 | 1995-03-08 | ケンブリッジ ライフ サイエンシズ ピーエルシー | 酵素電極及びこれを用いたセンサ、定量分析方法 |
| US5061401A (en) * | 1988-09-08 | 1991-10-29 | Ciba-Geigy Corporation | Electrically conductive composition of polyheteroaromatic compounds and polymeric sulfates |
| US5196340A (en) * | 1989-08-04 | 1993-03-23 | Nec Corporation | Enzyme electrode containing an enzyme and a coenzyme immobilized in separate layers of a membrane |
| JP2605596B2 (ja) * | 1993-09-07 | 1997-04-30 | 日本電気株式会社 | 導電性高分子膜及びその製造方法、導電性高分子化合物溶液、並びに固体電解コンデンサ及びその製造方法 |
-
1996
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007514460A (ja) * | 2003-09-30 | 2007-06-07 | エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト | 増大した生物適合性を示すセンサー |
| US7252912B2 (en) | 2004-03-29 | 2007-08-07 | Kazunori Kataoka | Polymer composite |
| JP2006292761A (ja) * | 2005-04-12 | 2006-10-26 | Lifescan Scotland Ltd | 酵素電気化学を基礎とするセンサーに用いられる水混和性の導電性インク |
| JP2007139729A (ja) * | 2005-11-23 | 2007-06-07 | Japan Science & Technology Agency | 酵素固定化バイオセンサー |
| WO2014002999A1 (ja) * | 2012-06-25 | 2014-01-03 | 合同会社バイオエンジニアリング研究所 | 酵素電極 |
| JP2019039817A (ja) * | 2017-08-25 | 2019-03-14 | 国立大学法人 筑波大学 | クレアチニンセンサ |
Also Published As
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|---|---|
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