JPH09105739A - 毛管電気泳動検出および/または分析方法およびユニット - Google Patents
毛管電気泳動検出および/または分析方法およびユニットInfo
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Abstract
分析方法およびユニットを提供する。 【解決手段】 本方法は、すぐに使用できる毛管をイニ
シエーターで動的にすすいで初期化毛管を作製し、その
毛管はカソード末端とアノード末端を備え;前記初期化
毛管中に毛管緩衝液を添加し、前記毛管緩衝液は1種の
ポリアニオンまたはポリアニオンの混合物を含有し;前
記毛管中に被分析試料を加え;前記試料を毛管電気泳動
にかける;ステップからなる1種のポリアニオンまたは
ポリアニオンの混合物は少なくとも毛管またはカソード
の緩衝液に含有される。電気泳動を行った後に、毛管を
NaOHですすぐステップを追加してもよい。
Description
気泳動検出法および/または分析方法およびユニットに
関する。
泳動において、支持体としてシリカを用いる場合、電気
浸透(EOF)は、シリカ/水の界面にイオン勾配が存
在することによっておこる誘導流であり、これによって
わずかに過剰の正イオンがカソードに向かって移行す
る。その結果下記のようにカソードに向かって正味流動
が起こり、その流動によって電場内で移行するイオンに
追加の速度成分が与えられる。
管ともう一つの毛管で、または多数の毛管装置で試験す
る場合の異なる毛管の間で再現性のある試験結果を得る
には一定の電気浸透移動度が必要である。
て行われている。極端なpH値すなわちEOFがほとん
ど起こらないpH2.5未満もしくはEOFが最高のp
H8以上で操作するか、またはEOFを停止させる添加
剤を緩衝液中で使用するか、またはコートされた毛管を
使用するか、または外部電場を加えることによって行わ
れている。しかし通常これらの方法はすべて分析時間が
長くなる。
準の欠点がなく、かつ安価で実用的であり使用し易い新
しい毛管電気泳動検出および/または分析法およびユニ
ットを提供するものである。本発明は水酸化ナトリウム
によって初期エッチングを行った後、毛管のEOFを直
接安定化することができる方法とユニットを提供するも
のである。本発明の他の利点は、同じ条件で使用される
異なる毛管が同じEOFを生成する方式で毛管の平衡化
を標準化できる方法とユニットを提供することである。
はモル濃度を改変するため緩衝液を変更するかもしくは
緩衝液の成分を1種以上変更するとき、または分離度を
改変するため添加剤を添加するときに、与えられた毛管
が期待されたEOFを提供できる方法とユニットを提供
するものである。また緩衝液のpHによる、与えられた
緩衝液に対する電気浸透流動の変動も最少になる。その
上、与えられたpHで、同じイオン強度の各種緩衝液に
対しほぼ同じ電気浸透流動を生成させることができる。
電気浸透流動を高くすることが可能になると、分析時間
が短くなり(すなわち分析速度が速くなり)、その結果
処理量が大になって分析経費が低下する。本発明は、実
験毎、毛管毎および多重毛管毎の、移行時間と定量測定
値(各ピークの面積)の再現性が優れている。
試料の速度を低下させることが知られている物質を含有
する緩衝液を、分析時間を犠牲にすることなく使用する
ことができる。本発明によれば、負電荷物質を、極性を
変化させずに酸性pHで分離することができ、かつ中性
物質もしくは正電荷物質からまたは両方の物質から1回
の操作で分離することができる。全理論段数を増やすこ
とができるので、移行時間が短くなるにもかかわらず電
気泳動の効率を高めることができる。
置、空間立体配置などによって、還元時間がわずかに異
なった密接に関連がある種(例えば化学薬剤、生化学物
質、ペプチド、タンパク質)の間の分離度を増大できる
方法とユニットを提供するものである。電荷は同じであ
るが、官能基もしくは分極性基が異なるかまたは官能基
もしくは分極性基の位置もしくは数が異なる種も分離す
ることができる。
が、本発明が存在していないときの短い毛管で得られる
のと同じ時間で達成することができる。電気泳動移動度
は同じであるが1種のポリアニオンもしくはポリアニオ
ンの混合物とのイオン対形成定数( ion−pairing con
stant )が異なる正電荷の種の分離も、本発明によれ
ば、イオン対を形成した種の移動度は低下するにもかか
わらず、高速でしたがって短い移行時間で達成すること
ができる。
な方法とユニットを提供することであり、このことはユ
ーザーが毛管を変えずに多くの分離を実施できることを
意味する。したがって、本発明の方法は、特定のクラス
の分離に専用の固定のコーティングとは対照的に動的な
コーティングである。また本発明の上記利点は、電気泳
動の方法を、極性反転(polarity reversal)のみなら
ず移行時間を長くし速度を下げることによって行う場合
にも達成することができる。
ちイニシエーター(initiator )で、すぐ使用できる毛
管( ready−to−use capillary)をすすぎ(動的すす
ぎ);その初期化された(initialized )毛管中に毛管
緩衝液を加え;分析すべき試料(必要な場合、試料希釈
剤で希釈してもよい)を毛管中に注入し;場合によって
は、カソード緩衝液を毛管のカソード末端に添加し;該
試料を毛管電気泳動にかけ、この場合毛管緩衝液および
/またはカソード緩衝液は1種のポリアニオンまたはポ
リアニオンの混合物を含有し但し1種のポリアニオンま
たはポリアニオンの混合物は少なくとも毛管緩衝液中ま
たはカソード緩衝液中に含有され;そして電気泳動を行
った後、NaOHですすぐ;ステップからなる改良毛管
電気泳動検出および/または分析方法に関する。
場合によって、毛管は、ポリアニオンを欠いた緩衝液で
すすいでもよく、注入された試料はポリアニオンを欠い
た緩衝液を用いて電気泳動を行う。
種のポリアニオンまたはポリアニオンの混合物を含有し
ている(毛管および/またはカソードの)緩衝液からな
り、1種のポリアニオンまたはポリアニオンの混合物が
少なくとも毛管および/またはカソードの緩衝液中に含
まれている、試料の毛管電気泳動検出および/または分
析を行うユニット(すなわち装置)に関する。
リマー誘導体が有利である。
ルキル、アリール、アルキル−アリールまたは複素環骨
格およびその誘導体であり;BはH、OH、NH2 、ア
ルキル、アリール、アルキル−アリールまたは複素環骨
格およびその誘導体であり;R1 〜Rm はモノマーであ
り(mは1より大きい自然数である)、R1 =R2=・
・・=Rm であるかまたそうではなく、R1 =R2 =・
・・=Rm のとき得られるポリマーがホモポリマーであ
るかまたは少なくとも一つのRが他のRとは異なってい
るとき得られるポリマーがヘテロポリマーであり、R
は、アミノ−アルキル、アミノ−アリール、アミノ−ア
ルキル−アリール、またはアミノ複素環の骨格もしくは
基、または窒素複素環の骨格もしくは基およびその誘導
体、塩基性アミノ酸基もしくはペプチド基(少なくとも
一つの塩基性アミノ酸を含有する)、またはアルキル、
アリール、アルキル−アリールもしくは複素環の骨格も
しくは基であり;W1 〜Wm (すなわちW1 ,・・・,
Wm )は、H;またはイミン、アミン(第一級、第二
級、第三級または第四級のアミン)、グアニジン基もし
くはヒドラジン基または他の任意の基からなる群から選
択される塩基性基であり;Y1 〜Ym (すなわち、Y1
・・・,Ym )はHまたは酸性ラジカル含有の他の基で
あり、但し操作pHにおいて、イニシエーターは正味の
正電荷をもっている。
シエーターは少なくとも一つの窒素原子を含有するホモ
ポリマーRである。本発明の好ましい他の実施態様によ
れば、イニシエーターはポリペプチドまたはタンパク質
である。ポリアニオンは、多糖誘導体、合成ポリマー誘
導体、ポリ塩基性アミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリホ
スフェートもしくはポリホスホネート、ポリリン酸およ
び/またはその混合物からなる群から選択することが有
利である。
で表される。
り、R1 =R2 =・・・=Rm であるかまたはそうでは
なく、R1 =R2 =・・・=Rm のとき得られるポリマ
ーがホモポリマーであるかまたは一つのRが他のRと異
なっているとき得られるポリマーがヘテロポリマーであ
り、Rは、P(リン)またはアルキル、アリール、アル
キル−アリールもしくは複素環骨格であり;AはH、O
H、NH2 、アルキル、アリール、アルキル−アリール
または複素環骨格およびその誘導体であり;BはH、O
H、NH2 、アルキル、アリール、アルキル−アリール
または複素環骨格およびその誘導体であり;W1 〜Wm
はOH、O、酸性ラジカル、またはアルキル、アリー
ル、アルキル−アリール、酸性ラジカル含有複素環骨格
であり;Y1 〜Ym はH、OH、酸性ラジカルまたはア
ルキル、アリール、アルキル−アリール、複素環骨格お
よびその誘導体、アミン(第一級、第二級または第三級
のアミン)、窒素複素環またはその混合物であり、但し
操作pH下でポリアニオンは正味の負の電荷をもってい
る。
ル基、硫酸基、スルホン酸基、またはリン酸基(モノ
−、ジ−またはトリ−リン酸基)からなる群から選択す
ることが好ましい。
は下記構造式で表される。
OHである。
オンは、ホモポリヌクレオチド、ヘテロポリヌクレオチ
ド、リボ核酸またはデオキシリボ核酸である。
ーの含有量は、毛管の全液体容積に対して10-12 %〜
10%である。一つの実施態様で、ポリアニオンは毛管
中の液体の約1容量%を構成している。
る。
する。
毛管中に存在している緩衝液を意味する。
末端における緩衝液を意味する。
末端における緩衝液を意味する。
r )”は毛管緩衝液、カソード緩衝液およびアノード緩
衝液として用いられている緩衝液を意味する。
希釈剤を意味し、異なる濃度またはpHのランニング緩
衝液およびポリアニオンを欠いたランニング緩衝液があ
げられる。
エーターを全く使用せず、ポリアニオンを欠いた緩衝液
を用いる電気泳動法を意味する。
イニシエーターですすぎ続いて毛管を毛管緩衝液または
ランニング緩衝液ですすぎ;試料を添加し;次にランニ
ング緩衝液またはカソード緩衝液およびアノード緩衝液
を用いて分離を行うステップを含む電気泳動法を意味す
る。
000M.W.より大で好ましくは5000M.W.よ
り大きい分子量)の分子もしくは分子混合物であって、
それが溶解される希釈剤のpH下でまたは緩衝液のpH
下でいくらかの正電荷を有するもののすすぎ溶液を意味
する。このイニシエーターは動的に作用する。イニシエ
ーターは正の電荷だけをもっているときはポリカチオン
であり、正と負の電荷をもっているときはポリ電解質で
ある。
うな処理:0.1M/LのNaOHで15分間すすぎ、
次に水で5分間すすぎ、次に0.1M/LのNaOHで
5分間すすぎ、次に水で5分間すすぎ、次いで適当な緩
衝液で10分間すすぐ処理を受けた安定化毛管または非
安定化毛管を意味する。
に30分間〜数日間の変動がある平衡化時間で安定化さ
れた毛管を意味する。この平衡化は緩衝液および緩衝液
のpHに依存し、かつ毛管毎に同じメーカーのロット番
号の毛管の間でも変化する。安定化毛管を使用して繰返
し分析すると、平均値のまわりに分散するEOF測定値
を示す。
い毛管を意味する。非安定化毛管を使用して繰返し分析
すると、連続して上昇または下降する傾向を示すEOF
測定値を示す。
記式: に示すように、注入(添加)点から検出器までの毛管の
長さLD を成分の移行時間測定値で割り算することによ
って計算できる値である。
式: で定義され、teoはジメチルホルムアミド(DMF)の
ような中性マーカーの移行時間の測定値である。
し、その正味電荷は負電荷のポリアニオンとの相互作用
によって、減らされ、相殺されまたは負になる。
り、そしてLt は毛管の全長である。
同じ毛管でなされる比較実験の場合、係数: は一定であるのでμは
れるランニング緩衝液による毛管のすすぎステップの前
に、まずイニシエーターの溶液で短時間のすすぎを行
い、次いで1種のポリアニオンまたはポリアニオンの混
合物を含有するランニング緩衝液ですすぐステップを実
施することによって通常の毛管電気泳動法とは異なって
いる。
型的な代表例を表1に列挙してあるが、1種の高分子電
解質または高分子電解質の混合物であり、好ましくは巨
大分子で、正および負に帯電するようになる酸性基また
は塩基性基をもっている。このような高分子電解質は1
種のタンパク質またはタンパク質の混合物でもよい。
のポリカチオンまたはポリカチオンの混合物であり、そ
のモノマーは正に帯電するようになる一つ以上の塩基性
基をもっている。このようなポリカチオンは第一級、第
二級、第三級または第四級のアミンを含有する合成ポリ
マーでもよい。このようなポリカチオンはポリアミノ酸
のようなポリ電解質でもよく、そのアミノ酸は塩基性ア
ミノ酸かまたはそのような塩基性アミノ酸のランダムコ
ポリマーである。
なるイニシエーターと同じポリアニオンを使用する初期
化毛管電気泳動法のEOFに対する効果を示す。
L、pH4.625 初期化毛管電気泳動法:0.01%のコンドロイチン硫
酸を含有する通常の毛管電気泳動法と同じもの。 イニシエーター:各種のタンパク質、ポリペプチド、ポ
リカチオンまたはポリマー〔ことわりがなければ濃度は
0.25%;場合によっては濃度が異なる(指示した場
合)〕。
ッジ、同じ安定化毛管25μ×23cm。12KVで分
離を行った。
ほど効率が高い。
つかの代表例の特徴は以下の特性である。すなわちこれ
らポリアニオンは、そのポリマーに正味の負の電荷を与
える繰返し単位を有する可溶性ポリマーである(そのモ
ノマーはカルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基、リン
酸基などのような酸性基を少なくとも一つ含有してい
る)。
ポリアニオン類を使用する初期化毛管電気泳動法との比
較結果を示す。
L、pH4.605 初期化毛管電気泳動法:0.01%の各種ポリアニオン
を含有する通常の毛管電気泳動法と同じもの。 イニシエーター:通常の毛管電気泳動法のものにブタア
ルブミン0.2%を溶解したもの。
2000、同じカートリッジ、同じ安定化毛管25μ×
23cm 初期化毛管電気泳動法の場合は安定化は行わない。電圧
は12KVであった。EOF(DMF)は5回測定し
た。平均時間(分)とRSDは表に示してある。
び各種組織由来のコンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、
デルマタン硫酸、ポリシアル酸、コロミン酸、ポリアス
パラギン酸類とポリグルタミン酸類および両者の誘導
体、アスパラギン酸類とグルタミン酸類のランダムコポ
リマー類、MW(分子量)が4000000までのポリ
アクリル酸類などを、上記条件ではないが試験して成功
している。
ードの方へ移行し、すなわち電気浸透流動に対して逆に
対向流で移行して(表3)、電気浸透流動が安定化する
だけでなく。EOFの速度および分離される種の速度の
再現性が予想外に改善される。
いて通常の毛管電気泳動法と同じ。イニシエーター: コンドロイチン硫酸なしの緩衝液中ブ
タアルブミン0.2%。毛管: 25μ×23.7cm、カソードから6.7cm
の位置に検出器。コンドロイチン硫酸とDMFのポリア
ニオンによる速度は、カソード緩衝液にのみまたは毛管
緩衝液にのみ現われる。
のみ存在している場合、コンドロイチン硫酸がカソード
緩衝液から移行して検出器を通過する際の吸光度の増大
によって時間を求める(移行長6.7cm)。
存在している場合、時間は、コンドロイチン硫酸が検出
器より前にもはや存在しないときの吸光度の低下によっ
て求める(移行長6.7cm)。
ると、これらイニシエーターは、ポリアニオンが存在し
ない場合、アノードに向かって進む逆の電気浸透流動を
誘発し、毛管壁の電荷を正にした(表4)。
リアニオンなし、ホスフェート/NaOH 100mM
/L、pH2.617 初期化毛管電気泳動法 トリス/リンゴ酸0.01%コンドロイチン硫酸ホスフ
ェート0.1%コンドロイチン硫酸
流動はアノードに向かいそして速度は負であり一方ポリ
アニオンの存在下(正常極性での試験)では速度は正で
ある。しかし、初期化毛管電気泳動法のようにポリアニ
オンとともにイニシエーターを用いると予想外にポリア
ニオンの効果が強化される。
毛管を用いる初期化毛管電気泳動法は、同じ緩衝液に対
して同じEOFを起こすが(表5)、このことは、一群
の多重毛管の装置内の毛管を変更もしくは取替えると新
しい毛管を安定化し平衡化する必要がなくなり、ユーザ
ーはすぐ使用できる毛管のステップを実施することだけ
が必要でその後の分析を直接進めることができることを
意味する。同様に、緩衝液を別のものと取替えるとき、
初期化毛管電気泳動法では、再度平衡化ステップを行う
ことなしに、新しい緩衝液に対して予想EOFを直ちに
得ることができる(表6)。
05 コンドロイチン硫酸1%イニシエーター: 通常の毛管電気泳動法緩衝液中0.2
5%ブタアルブミン 通常の毛管電気泳動法 トリス/リンゴ酸150mM/L、pH4.605マーカー: 各毛管(すぐ使用できる毛管)と各方法につ
いて、毛管1〜5についてはまずICEMで次にUCE
Mによって、毛管6〜11についてはまずUCEMによ
って次にICEMによって9回ずつDMFを分析した。
した後に得たがこれらの数値は、毛管が安定化されてい
なかったこととUCEMでは移行時間が常に増大してい
ることを示している。この緩衝液の場合、安定化毛管を
用いると、EOF時間は通常約14minである。
べてpH4.605、コンドロイチン硫酸1%イニシエーター: 通常の毛管電気泳動法緩衝液中0.2
5%ブタアルブミン 通常の毛管電気泳動法 150mM/L、pH4.605、コンドロイチン硫酸
なし。マーカー: 各緩衝液について、まずUCEMにより次に
ICEMによって9回ずつDMFを分析した。毛管: 23.7cm×25μ。同じ毛管を使用し、各緩
衝液に対して常に平衡化を行った。 DAP:ジアミノプロパン ARG:アルギニン
定なpH約4〜5において(J. KohrsおよびH. Engelha
rdt ,J. Microcol.,3巻491頁、1991年9月)
特にEOFが安定化される。このことは、EOFの移行
時間および被検体の各ピークの再現性が改善されている
ことを示す(表7)。さらにこの方法によれば各ピーク
の面積の再現性が改善される(表8)。このことは、ユ
ーザーが自信をもって、被検体の移動度を計算すること
によってピークを確認し(定性試験結果)かつ与えられ
た混合物中の被検体の百分率を確認する(定量的試験結
果)ことができることを意味する。
して物質の速度が高くなる。このことは移行時間の短縮
に反映されている(表9)。この効果の大きさは、緩衝
液の性質、緩衝液のモル濃度、緩衝液のイオン強度、緩
衝液のpH、ポリアニオンの百分率、イニシエーターの
百分率またはイニシエーターのすすぎ時間、ならびに一
つのポリアニオンから他のポリアニオンへの変更(表
2)と一つのイニシエーターから他のイニシエーターへ
の変更(表1)によって変化する。毛管の内径もEOF
の増大に影響する。例えば、75μの内径で、5KVに
て、リンゴ酸/トリス25mM/L、pH4.922を
用いるとteof の測定値は14.615min.である
が、一方ポリブレン0.001%とコンドロイチン硫酸
0.01%の存在下では3.942min.になる。5
0μIDの内径で、37.5mM/L、pH4.8の同
じ緩衝液を用いるとteof の測定値は3.194mi
n.であるが、一方ポリブレン0.001%とコンドロ
イチン0.01%の存在下では2.269min.にな
る。
EG,PVPおよびアミン類のようなEOFの低下剤も
しくは阻害剤が緩衝剤中に存在していることのようなE
OFを弱める条件下では、初期化毛管電気泳動法がEO
Fを高める効果は強力である。一方低モル濃度、高pH
およびEOF低下剤が存在しないことのようなEOFを
強める条件下では、初期化毛管電気泳動法がEOFを高
める効果は弱い(表10〜11)。
0.1M/L、pH10。 初期化毛管電気泳動法(ICEM):0.1%デキスト
ラン硫酸MW500000を含有する通常の毛管電気泳
動法の緩衝液。 イニシエーター:ポリブレン0.00005% 試料:ジヒドロキシ安息香酸の4種の位置異性体。
M/L、pH10.005。 初期化毛管電気泳動法(ICEM):デキストラン硫酸
MW500000 0.01%を含有する通常の毛管電
気泳動法と同じ緩衝液。 イニシエーター:ポリエチレンイミンMW600000
10−6%。 試料:DMFとバルビタールナトリウム(中性マーカー
と酸性マーカー)を含有するリン酸緩衝食塩水で1/1
0に希釈したヒト血清。
せる条件下でEOFを増大するので、高モル濃度もしく
は低pHもしくはEOF低下剤の存在もしくはこれらの
組合わせの条件の使用(表12)またはアミンもしくは
ジアミンを含む塩基緩衝剤の使用さえも可能になる。そ
れにもかかわらず、この方法で得られる移行時間は、同
じ緩衝液であるがEOFが高くなる条件下で得られる移
行時間と絶対値がわずかに異なっている(表13)。こ
の効果は塩基緩衝液を使用できるということであり、例
えばNaOHをトリスのような塩基アミンと取替えた。
このような置換には多くの利点がある。例えばカチオン
種の吸着がない(または少ない);かようなアミノ緩衝
剤は導電性が低い(したがって拡散係数が低い)ので高
モル濃度を使用;精細度に優れた幅の狭いピーク;およ
び分析時間がわずかに長くなるだけで分離度が高い;と
いう利点がある(表12)。
たは高イオン強度の緩衝液を使用することができ、その
ためピークがシャープになるかまたは拡散が少なくな
り、かつ移行時間がわずかに増大するだけで一層対称形
になる。この移行時間の増大は、高モル濃度または高イ
オン強度の同じ条件下の通常の毛管電気泳動法で得られ
る移行時間の増大ほど重大ではない(表12)。
04%−0.2%−1%)の酢酸塩/トリスpH4.6
5 初期化毛管電気泳動法(ICEM):各種濃度のコンド
ロイチン硫酸を含有している通常の毛管電気泳動法の緩
衝液。 イニシエーター:通常の毛管電気泳動法の緩衝液中のブ
タアルブミン0.25% +:PEGを添加した緩衝液
Hまたはリンゴ酸/トリス両者ともに150mM/L、
リンゴ酸およびpH4.605。 初期化毛管電気泳動法(ICEM):1%コンドロイチ
ン硫酸を含有している通常の毛管電気泳動法の緩衝液 イニシエーター:通常の毛管電気泳動法の緩衝液中0.
25%のブタアルブミン。
ポリアニオンの酸性基またはポリアニオンの分極性基と
相互に作用しうる分極性基を含有していない場合、これ
らの負電荷物質の移動度を変えない(表20)。このよ
うな相互作用の例は表10に見られ、ピーク3(2−3
ジヒドロキシ安息香酸)がポリアニオンの存在下で移動
度が変化することを示している。したがって、初期化毛
管電気泳動法を用いることによって、同じ負の電荷をも
っているが、分極性基が異なっているか、または同じ分
極性基をもっているが位置が異なっているかもしくは相
互作用定数もしくは錯形成定数が異なる官能基もしくは
分極性基をもっていることによって異なっている物質を
分離することができる。初期化毛管電気泳動法では、ラ
ンニング緩衝液のpHにおいて正の電荷を有する物質の
移動度が低下する(表14)。さらに、中性または正電
荷の物質の分極性基もポリアニオンと相互に作用するこ
とができるので、同じ電荷を有する中性物質または正電
荷物質の分極性基の位置が異なっている場合または相互
作用定数もしくは錯形成定数が異なっている場合、これ
らの物質を初期化毛管電気泳動法によって分離すること
ができる。表14の最後の欄は、分子の分極性が増大す
るにつれて(OCF3 >Br>Cl>F>OCH3 )、
上記の効果が増大することを示している。
時間(9個の測定値)に基づいて計算し、下記式: で表し、そして移動度の相対的減少は下記式: で表す。
少する場合、中性および負電荷の物質の理論段数(N)
および通常は正電荷物質の理論段数(N)も増大する。
実際にNは下記式で表す。
少するにもかかわらず予想外に効率が増大する。効率は
下記式で表す。
ラインにおけるピークの幅(sec)である。
化毛管電気泳動法による移行時間の減少がその減少以上
に、比率(t/w)2 が高くなるピーク幅の減少によっ
て相殺されることを示している。
がら分離度が増大する。初期化毛管電気泳動法によれ
ば、中性、負電荷および正電荷の成分の混合物を一回の
試験で分析することができる(実施例1と2)。
スラインが滑らかなので、通常、数量化する前に、ベー
スラインをそれ以上調整もしくは補正する必要がなくな
る(表16)。この特性もピーク面積の再現性の改善に
反映されている。
25 ICEM:0.01%コンドロイチン硫酸を含有するU
CEMと同じ緩衝液 イニシエーター:通常の毛管電気泳動法の緩衝液中のブ
タアルブミン0.2%試料: 低濃度で信号/バックグランド比が小さいジメチ
ルアニリン(dimethylaniline )の6種の位置異性体。
がおそければおそいほど、速く移行する成分より検出窓
を通過して移行する時間が長くなる。その結果、一層ゆ
っくり移動する領域によって、ピークベースの広がりで
マークされるピーク面積のカウントが増大する。混合物
中に定量溶質(quantifying solutes)が存在している
場合、ピーク面積を移行速度の関数として正規化するに
は補正係数を用いなければならない。表9と17から分
かるように、初期化毛管電気泳動法または標準毛管電気
泳動法(normal capillary eletrophoresis method
s)を用いる場合、その最も遅いピークはその移行時間
が最も大きな影響を受けるが、これは、それらの移行時
間が大きくは異なっていない試料を分析する場合、補正
係数が1に近づくことを意味し、このことは通常の毛管
電気泳動法には当てはまらない(表18)。
分かるように電気浸透流動の変動が最小になる。初期化
毛管電気泳動法の再現性は高い。中性のマーカーは、移
動度を計算する場合を除いて、移行時間と各ピークの面
積については不要である。このことは、中性と正電荷の
物質または中性と負電荷の物質またはこれら3物質を分
析するとき、例えば低濃度の中性物質を隠蔽できるマー
カーによる妨害が全くないことを意味する。またこのた
め定量が容易になる。というのはマーカーの百分率を差
引いて定量結果を正規化することはもはや必要でないか
らである。
100mM/L。初期化毛管電気泳動法。0.1%の
コンドロイチン硫酸を含有することを除いて通常の毛管
電気泳動法に同じ。イニシエーター: 通常の毛管電気泳動法の緩衝液中0.
001%のポリブレン。
するまで、各pHの変化毎に平衡化時間なしで、マーカ
ーのDMFを9回分析した。
によるEOFはUCEMよるEOFより弱いが、イニシ
エーターとポリアニオンを変えてある種の緩衝液を用い
ることによってEOFを増大させることができる(表1
0)。ICEMがUCEMよりわずかに低いEOFを示
し、一方UCEMより優れた再現性を示す条件を選択で
きることは注目に値する。
同じpHおよび同じイオン強度に対して同じ大きさのイ
オン浸透流動を生成する(表6、12、13および1
9)。
んで各々所定の濃度を選択すれば、初期化毛管電気泳動
法によって、各種pHの普遍的な緩衝液をいくつか開発
することができる。このような配合の利点は、これら緩
衝液は多くの用途をカバーし、同じEOFを生成し、優
れた定性および定量の再現性を示し、分析時間を短くし
ながら効率と分離度を増大し、そして処理量を増大して
分析経費を減少させることである。
管電気泳動法に類縁の技術分野にも利用可能であり、こ
のような技術分野としては、例えばゲル充填毛管を使用
する場合があり、この場合本発明を用いると、アガロー
スゲル充填毛管に電気浸透流を増大させるか、またはポ
リアクリルアミドゲル充填毛管に電気浸透流動を起こす
ことができるはずである。
すなわち同じ安定化毛管(Polymicro Technology 社由
来)、同じ緩衝液、同じ電圧、同じ試料で行った。“初
期化毛管電気泳動法”または“標準毛管電気泳動法”と
“通常の毛管電気泳動法”との間の試験結果を比較す
る。
(chiral selector)がポリアニオン自体でない場合、
キラル分離に適用される。実際にキラル選択剤はシクロ
デキストリン類のような分子である。使用されるポリア
ニオン類の大部分はそれら自体がキラルであるので、キ
ラル分離は他のキラル選択剤を添加しなくても達成する
ことができる。
Vel(Vは正である)でカソードに向かって移行する。
すなわち正電荷物質の移行方向がポリアニオン類の移行
方向に対して逆方向であることによって、分離機構が、
正イオンと分離溶液に加えられるポリアニオンとが特異
な(differential)イオン対を形成することに基づいて
いる一種のイオン交換動電学的クロマトグラフィーを実
現する。
れるポリアニオンとのイオン対形成定数が異なっている
ならば、電気泳動移動度が同じ正電荷被分析物質は初期
化毛管電気泳動法で分離することができる。
キラル分離およびミセル動電学的クロマトグラフィーに
も価値がある(実施例4)。
とだけを目的とするものであり本発明を開示されたもの
に限定するものではない。実験はすべて6個の毛管を備
えたPACE 2000(登録商標)および/またはPi
lot CE (登録商標)の装置(両者ともに米国カリフォ
ルニア州所在のBeckman Instruments社製)を用いて行
った。
下記式: (式中、Lは毛管の長さでありそしてDは個々の溶質の
拡散係数である)で表すと、少なくとも中性と負電荷の
被分析体に対して理論段数(N)が増大する。Vtot が
増大するにつれて、溶質は一層移動し易くなり、毛管を
通じて拡散できる時間が最小になる。また高分子物であ
るポリアニオンを利用する初期化毛管電気泳動法は拡散
定数を低下させるので理論段数Nが増大すると考えられ
る。
ル効果によって生成する熱量は減少するが、この熱量は
電圧を印加する時間に比例するので分析時間は短くな
る。やはり、熱量が少ないことは対流力が減少すること
を意味する。
同じ濃度で、イニシエーター毎に変わり(表1)および
ポリアニオン毎に変わる(表2)。いくつかのポリアニ
オンは非常に低い濃度で効果を示す。1%を越える濃度
では、粘度の増大、過剰に高い電流、または移行の逆転
などの副作用が生じることがある。イニシエーターとポ
リアニオンについては、得られる効果は、濃度によって
極大値を通過して非直線的に変化する。その効果は重合
度によって変化する(表1と2)。したがって通常の濃
度は、ポリアニオンの粘度、溶解度およびゲル化特性の
関数としてポリアニオン毎に変わる。
定数はポリアニオン毎に異なり、このことは、本発明の
概念の多様性が高いことを意味する。
組成がどのようなものであっても存在するが与えられた
ポリアニオンに対する緩衝液の作用の大きさは、緩衝液
とポリアニオンの両者のpHおよび/またはイオン強度
が同じであっても緩衝液毎に変化する。
験に対して同じ毛管を使用)緩衝液: 通常の毛管電気泳動法:0.142M/Lリン
ゴ酸、アルギニンpH4.6; 初期化毛管電気泳動法:各種濃度でコンドロイチン硫酸
を含有していることを除いて通常の毛管電気泳動法に同
じ。 イニシエーター:通常の毛管電気泳動法の緩衝液中0.
2%のブタアルブミン。試料: 通常の毛管電気泳動法の緩衝液に溶解したパラ位
置換アニリン類:メトキシ−、メチル−、フルオロ−、
クロロ−、ブロモ−およびトリフルオロメトキシ−アニ
リンならびにジメチルホルムアミド(EOFマーカー)
の混合物。
毛管電気泳動法で9回分析した。各回毎にポリアニオン
(ここではコンドロイチン硫酸)の量を増大した。
イソニコチン酸、ピコリン酸およびDMFの等モル混合
物でありDMFを9回分析した。通常の毛管電気泳動法
で同じ試料を分析するには、極性逆転で試験する必要が
ある(表21)。
pH2.507、15KV。 初期化毛管電気泳動法:0.1%コンドロイチン硫酸含
有リン酸緩衝液−0.1M/L、pH2.507、15
KV。 イニシエーター:リン酸緩衝液中ポリブレン0.000
5%。 試料:通常の毛管電気泳動法の緩衝液中のニコチン酸、
イソニコチン酸およびピコリン酸、DMF。
25M/L SDS、pH7.027、12KV。 初期化毛管電気泳動法:2種百分率のコンドロイチン硫
酸を含有することを除いて通常の毛管電気泳動法の緩衝
液と同じ。 試料:クロロ−、フルオロ−、ブロモ−、メチル−およ
びメトキシ−ベンゼン、3回ずつ測定
ヘモグロビン変異体からのグリコシル化ヘモグロビン
の、ICEMによる分離。ランニング緩衝液: リンゴ酸:20.44g/L アルギニン:40.15g/L エチレングリコール:1g/L トリトン:0.01g/L コンドロイチン硫酸:2.05g/L pH 4.651イニシエーター: リンゴ酸/アルギニン緩衝液(それぞ
れ14g/Lおよび27.5g/L)中0.5%のウマ
アルブミン。試料: 全血溶血溶液(hemolyzing solution): リンゴ酸18.2
g/Lを、0.1%エチレングリコールと0.01%ト
リトンを含有するアルギニンを用いてpH5.3にし
た。x−100、1%サポニン、1%コンドロイチン硫
酸。注入する試料の調製: 200μlの全血を1000μl
の溶血溶液とともに撹拌する。
1c、メトヘモグロビンおよびHbAの間の分離度を示
す走査(scan)を示す。図2は、HbA1a、HbA1
b、HbF、HbA1c、メトヘモグロビン、HbAお
よびHbS間の分離度を示す走査を示す。
きたが、当該技術分野の当業者は、本発明がこれらの実
施態様に限定されないことが分かるであろう。さらに本
明細書に引用した文献は本明細書に援用するものであ
る。
モグロビンおよびHbAの間の分離度を示す走査の結果
を示すグラフである。
c、メトヘモグロビン、HbAおよびHbSの間の分離
度を示す走査の結果を示すグラフである。
Claims (24)
- 【請求項1】 下記ステップ、すなわちすぐに使用でき
る毛管をイニシエーターで動的にすすいで初期化毛管を
作製し、その毛管はカソード末端とアノード末端を備
え;前記初期化毛管中に毛管緩衝液を添加し、前記毛管
緩衝液は1種のポリアニオンまたはポリアニオンの混合
物を含有し;前記毛管中に被分析試料を加え;次いで前
記試料を毛管電気泳動にかける;ステップからなる毛管
電気泳動検出および/または分析方法。 - 【請求項2】 さらに、毛管のカソード末端にカソード
緩衝液を添加するステップを有する請求項1記載の方
法。 - 【請求項3】 前記カソード緩衝液が1種のポリアニオ
ンまたはポリアニオンの混合物を含有している請求項2
記載の方法。 - 【請求項4】 さらに、前記試料に試料希釈剤を添加す
るステップを有する請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 前記ポリアニオンおよび前記イニシエー
ターが、前記毛管中に、前記毛管の容積に対して10
-12 %〜10%の量で存在している請求項1記載の方
法。 - 【請求項6】 前記イニシエーターが下記構造式: 【化1】 〔式中、m×n>12であり、 AはH、OH、NH2 、アルキル基、アリール基、アル
キル−アリール基および複素環基からなる群から選択さ
れ;BはH、OH、NH2 、アルキル基、アリール基、
アルキル−アリール基および複素環基からなる群から選
択され;R1 〜Rm はポリマー中のモノマーを表し、前
記ポリマーはR1 〜Rm で表される前記モノマーが各々
同じである場合ホモポリマーであり、そして前記ポリマ
ーはR1 〜Rm で表される前記モノマーの少なくとも一
つがR1 〜Rm で表される他のモノマーと異なっている
場合ヘテロポリマーであり、前記モノマーは各々、アミ
ノ−アルキル基、アミノ−アリール基、アミノ−アルキ
ル−アリール基またはアミノ複素環の骨格もしくは基ま
たは窒素複素環の骨格もしくは基およびその誘導体、塩
基性アミノ酸もしくはペプチドの基(少なくとも一つの
塩基性アミノ酸を含有する)またはアルキル、アリー
ル、アルキル−アリールもしくは複素環の骨格もしくは
基からなる群から選択され、そして前記モノマーは各々
対応するY基および対応するW基で置換され;W基(W
1 〜Wm )は各々、一つの原子;またはH、イミン、第
一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、第四級アミ
ン、グアニジン基およびヒドラジン基もしくは任意の他
の基からなる群から選択される化学基であり;ならびに
Y基(Y1 〜Ym )は各々、一つの原子;またはHもし
くは酸性ラジカル含有の任意の他の基からなる群から選
択される化学基である〕で表されるポリマー誘導体また
はポリマー誘導体の混合物であり、そのイニシエーター
が前記毛管緩衝液のpHにおいて正味の正電荷を有する
請求項1記載の方法。 - 【請求項7】 前記イニシエーター中の前記モノマーが
各々同じでかつ前記モノマーが少なくとも一つの窒素原
子を含有している請求項6記載の方法。 - 【請求項8】 前記イニシエーターがポリペプチドまた
はタンパク質である請求項6記載の方法。 - 【請求項9】 前記ポリアニオンおよび前記イニシエー
ターが、前記毛管中に、前記毛管の容積に対して10
-12 %〜10%の量で存在している請求項6記載の方
法。 - 【請求項10】 前記ポリアニオンが、多糖誘導体、合
成ポリマー誘導体、ポリ酸性アミノ酸、ポリヌクレオチ
ド、ポリリン酸、および上記物質のいずれかの混合物か
らなる群から選択される請求項6記載の方法。 - 【請求項11】 前記ポリアニオンが下記構造式: 【化2】 〔式中、m×n>12であり;AはH、OH、NH2 、
アルキル基、アリール基、アルキル−アリール基および
複素環基からなる群から選択され;BはH、OH、NH
2 、アルキル基、アリール基、アルキル−アリール基お
よび複素環基からなる群から選択され;R1 〜Rm はポ
リマー中のモノマーを表し、前記ポリマーはR1 〜Rm
で表される前記モノマーが各々同じである場合ホモポリ
マーであり、そして前記ポリマーはR1 〜Rm で表され
る前記モノマーの少なくとも一つがR1 〜Rm で表され
る他のモノマーと異なっている場合ヘテロポリマーであ
り、前記モノマーは各々、P(リン)の基、アルキル
基、アリール基、アルキル−アリール基および複素環基
からなる群から選択され、そして前記モノマーは各々、
対応するY基および対応するW基で置換され;W基(W
1 〜Wm )は各々、一つの原子;またはOH、O、酸性
ラジカル、酸性ラジカルを有するアルキル基、酸性ラジ
カルを有するアリール基、酸性ラジカルを有するアルキ
ル−アリール基、および酸性ラジカルを有する複素環基
からなる群から選択される化学基であり;ならびにY基
(Y1 〜Ym )は各々、一つの原子;またはH、OH、
酸性ラジカル、アルキル基、アリール基、アルキル−ア
リール基、複素環基とその誘導体、第一級アミン、第二
級アミン、第三級アミン、第四級アミン、窒素の複素
環、および上記のもののいずれかの混合物からなる群か
ら選択される化学基である〕で表され、 前記ポリアニオンが前記毛管緩衝液のpHにおいて正味
の負電荷を有する請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 前記酸性ラジカルがカルボキシル基、
硫酸基、スルホン酸基およびリン酸基からなる群から選
択される請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 前記ポリアニオンおよび前記イニシエ
ーターを、前記毛管の容積に対して10-12 %〜10%
の量で前記毛管に添加する請求項11記載の方法。 - 【請求項14】 前記ポリアニオンがHn+2 Pn O3n+1
でありそして下記構造式: 【化3】 (式中、n>12であり、 AはH、OHであり、 BはH、OHである)で表される請求項11記載の方
法。 - 【請求項15】 前記ポリアニオンおよび前記イニシエ
ーターを、前記毛管の容積に対して10-12 %〜10%
の量で前記毛管に添加する請求項14記載の方法。 - 【請求項16】 イニシエーター、毛管緩衝液および/
またはカソード緩衝液を保有し、前記毛管および/また
は前記カソードの緩衝液が1種のポリアニオンまたはポ
リアニオンの混合物を含有し、その1種のポリアニオン
またはポリアニオンの混合物が少なくとも毛管緩衝液中
またはカソード緩衝液中に含まれている、試料の毛管電
気泳動検出および/または分析用ユニット。 - 【請求項17】 前記イニシエーターが、下記構造式: 【化4】 〔式中、m×n>12であり;AはH、OH、NH2 、
アルキル基、アリール基、アルキル−アリール基および
複素環基からなる群から選択され;BはH、OH、NH
2 、アルキル基、アリール基、アルキル−アリール基お
よび複素環基からなる群から選択され;R1 〜Rm はポ
リマー中のモノマーを表し、前記ポリマーはR1 〜Rm
で表される前記モノマーが各々同じである場合ホモポリ
マーであり、そして前記ポリマーはR1 〜Rm で表され
る前記モノマーの少なくとも一つがR1 〜Rm で表され
る他のモノマーと異なっている場合ヘテロポリマーであ
り、前記モノマーは各々、アミノ−アルキル基、アミノ
−アリール基、アミノ−アルキル−アリール基もしくは
アミノ複素環の骨格もしくは基およびその誘導体、塩基
性アミノ酸もしくはペプチドの基(少なくとも一つの塩
基性アミノ酸を含有している)またはアルキル、アリー
ル、アルキル−アリールもしくは複素環の骨格もしくは
基または窒素複素環の骨格もしくは基からなる群から選
択され、そして前記モノマーが各々、対応するY基およ
び対応するW基で置換され;W基(W1 〜Wm )は各
々、一つの原子;またはH、イミン、第一級アミン、第
二級アミン、第三級アミン、第四級アミン、グアニジン
基およびヒドラジン基もしくは他の任意の基からなる群
から選択される化学基であり;ならびにY基(Y1 〜Y
m )は各々、一つの原子;またはHもしくは酸性ラジカ
ル含有の任意の他の基からなる群から選択される化学基
である〕で表されるポリマー誘導体であり、そのイニシ
エーターが前記毛管緩衝液のpHにおいて正味の正電荷
を有する請求項16記載のユニット。 - 【請求項18】 前記イニシエーター中の、R1 〜Rm
で表される前記モノマーが各々同じであり、そして前記
モノマーが少なくとも一つの窒素原子を含有している請
求項17記載のユニット。 - 【請求項19】 前記イニシエーターがポリペプチドま
たはタンパク質である請求項18項記載のユニット。 - 【請求項20】 前記ポリアニオンが、多糖誘導体、合
成ポリマー誘導体、ポリ酸性アミノ酸、ポリヌクレオチ
ド、ポリリン酸および前記のもののいずれかの混合物か
らなる群から選択される請求項17記載のユニット。 - 【請求項21】 前記ポリアニオンが下記構造式: 【化5】 〔式中、m×n>12であり;AはH、OH、NH2 、
アルキル基、アリール基、アルキル−アリール基および
複素環基からなる群から選択され;BはH、OH、NH
2 、アルキル基、アリール基、アルキル−アリール基お
よび複素環基からなる群から選択され;R1 〜Rm はポ
リマー中のモノマーを表し、前記ポリマーはR1 〜Rm
で表される前記モノマーが各々同じである場合ホモポリ
マーであり、そして前記ポリマーはR1 〜Rm で表され
る前記モノマーの少なくとも一つがR1 〜Rm で表され
る他のモノマーと異なっている場合ヘテロポリマーであ
り、前記モノマーは各々、P(リン)の基、アルキル
基、アリール基、アルキル−アリール基および複素環基
からなる群から選択され、そして前記モノマーは各々、
対応するY基および対応するW基で置換され;W基(W
1 〜Wm )は各々、一つの原子;またはOH、O、酸性
ラジカル、酸性ラジカルを有するアルキル基、酸性ラジ
カルを有するアリール基、酸性ラジカルを有するアルキ
ル−アリール基、および酸性ラジカルを有する複素環基
からなる群から選択される化学基であり;ならびにY基
(Y1 〜Ym )は各々、一つの原子;またはH、OH、
酸性ラジカル、アルキル基、アリール基、アルキル−ア
リール基、複素環基とその誘導体、第一級アミン、第二
級アミン、第三級アミン、第四級アミン、窒素の複素
環、および上記のもののいずれかの混合物からなる群か
ら選択される化学基である〕で表され、 前記ポリアニオンが前記毛管緩衝液のpHおよび/また
は前記カソード緩衝液のpHにおいて正味の負電荷を有
する請求項20記載のユニット。 - 【請求項22】 酸性ラジカルがカルボキシル基、硫酸
基、スルホン酸基およびリン酸基からなる群から選択さ
れる請求項21記載のユニット。 - 【請求項23】 ポリアニオンがHn+2 Pn O3n+1であ
り、下記構造式: 【化6】 (式中、n>12であり、 AはH、OHであり、 BはH、OHである)で表される請求項22記載のユニ
ット。 - 【請求項24】 下記ステップ、すなわちすぐに使用で
きる毛管をイニシエーターですすいで初期化毛管を作製
し、その毛管はカソード末端とアノード末端を備え;前
記初期化毛管中に毛管緩衝液を添加し;前記初期化毛管
中に被分析試料を注入し;前記毛管のカソード末端にカ
ソード緩衝液を加え、前記カソード緩衝液は1種のポリ
アニオンまたはポリアニオンの混合物を含有し;次いで
前記試料を毛管電気泳動にかける;ステップからなる毛
管電気泳動検出および/または分析方法。
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