JP2008170350A - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、長さが10〜100mm、幅が10〜100μmである泳動路を有するマイクロチップと、pHが5.0〜6.0、塩濃度が10〜300mMである緩衝液とを用いて、100〜2000Vの電圧を負荷するヘモグロビン類の測定方法。
【選択図】なし
Description
従来、HbA1cの測定方法としては、HPLC法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられているHPLC法では、1試料当たり1〜2分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のCV値が1.0%程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。
電気泳動法によるHb類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Hb類の分離方法として古くから用いられているが、HbA1cの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では30分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、測定時間及び測定精度の点で問題があるため、現在では糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。
しかしながら、特許文献1に開示された方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のpHが9〜12と高く、Hbが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。
以下に本発明を詳述する。
本発明において、泳動路とは、マイクロチップ上又はマイクロチップ内に形成された流路であって、電気泳動が行われる際に、その流路の内において、試料が移動及び/又は分離される部位(試料が注入された部位から、検出部によって検出される部位)をいう。
上記泳動路の断面の形状としては特に限定されず、例えば、矩形、円形等が挙げられる。
上記マイクロチップは、単数の泳動路を有していてもよく、複数の泳動路を有していてもよい。
上記コーティングを行うことによって上記泳動路内面に形成されるコーティング層は、単層であってもよく、同一又は異なる材料からなる多層であってもよい。
このように親水性ポリマーを用いてコーティングすることによって、泳動路の内面に親水性を付与し、泳動路の内部を通過する測定試料であるヒト血液中の蛋白質、脂質等の各成分の非特異吸着を抑制し、測定対象であるヘモグロビン類を充分に分離測定することが可能となる。親水性が不充分であると、測定試料中の各成分が上記泳動路の内面に非特異吸着を起こし、各成分の分離に悪影響を及ぼすことがある。
本明細書において、親水性ポリマーとは親水性の官能基を有するポリマーをいう。
上記イオン性の親水性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ(2―アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸)、ポリ(2−ジエチルアミノエチルメタクリレート)、ポリエチレンイミン、ポリブレン等のイオン性合成高分子;コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類及びその塩類;アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類及びその塩類;セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類及びその誘導体へのイオン性基導入化物及びその塩類等のアニオン性多糖類、キチン、キトサン等のキトサン誘導体及びその塩類;アミノセルロース、N−メチルアミノセルロース等のN−置換セルロースの誘導体、及び、その塩類;デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのアミノ基導入化物、及び、その塩類等のカチオン性多糖類等;牛血清アルブミン、ラクトフェリン、スキムミルク等蛋白質類等が挙げられる。
上記親水性ポリマー溶液の濃度としては、好ましい下限が0.01%、好ましい上限が20%である。0.01%未満であると、コーティングが不充分となることがある。20%を超えると、上記親水性ポリマーからなる層を均一に形成することができず、ヘモグロビン類の測定途中に剥離し、再現性低下の原因となることがある。
上記緩衝液のpHの下限は5.0、上限は6.0である。5.0未満であると、ヘモグロビン類が変性してしまうため、測定精度が低下することがある。6.0を超えると、ヘモグロビン類の等電点に近づくことから、ヘモグロビン類の電荷量が減少して、ヘモグロビン類の各成分の電気的差異が小さくなり、各成分の分離が不充分となるために測定精度が低下することがある。
なお、本明細書において、塩濃度とは、後述する緩衝能を有する緩衝液組成物のモル濃度をいう。後述する緩衝液組成物を複数使用する場合には、それらの合計モル濃度をいう。
本明細書において、イオン性ポリマーは、分子内にイオン性の官能基を有するポリマーを意味する。
上記イオン性ポリマーは、イオン性の種類により、アニオン性ポリマーと、カチオン性ポリマーとに大別される。なかでも、アニオン性ポリマーが好ましい。
上記アニオン性の官能基としては、特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
上記アニオン性ポリマーは、親水性を有することが好ましい。
上記親水性を有するアニオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、アニオン性基含有多糖類、アニオン性基含有有機合成高分子等が挙げられる。
具体的には例えば、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸等の多糖類;ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ(2―アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸)及び、これらの共重合体等、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等の硫酸基含有多糖類及びその塩類;アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類、及び、その塩類;セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのイオン性基導入化物、及び、その塩類等のアニオン性多糖類、ポリ(メタ)アクリル酸、リン酸基含有(メタ)アクリル酸エステル重合体、スルホン酸基含有(メタ)アクリル酸重合体、2−アクリルアミド−ブチルスルホン酸重合体、及び、これらの共重合物等の水溶性アニオン性基含有有機合成高分子類が挙げられる。
(1)マイクロチップの作製
ポリジメチルシロキサン製マイクロチップに、長さ80mm、幅80μmの泳動路を形成し、クロス十字型の電気泳動用マイクロチップを作製した。泳動路に0.5%キトサン(親水性ポリマー)溶液を満たし、20分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してキトサン溶液を追い出した後、40℃の乾燥機内で12時間乾燥させた。その後、再び、キトサン溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥からなる一連の工程を5回繰り返すことによって、泳動路がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたキトサンコーティングマイクロチップの泳動路に、2.0%のコンドロイチン硫酸を含む150mMクエン酸緩衝液(pH5.2)を満たすことによって、測定用マイクロチップを得た。
健常人よりヘパリン採血した健常人全血70μLに、0.05%のTriton X−100(界面活性剤:和光純薬製)を含むクエン酸緩衝液(pH6.0)200μLを添加して溶血希釈し、溶血試料を得た。
上述のマイクロチップの泳動路の一方の端部に得られた溶血試料を添加し、泳動路の両端に1000Vの電圧をかけて電気泳動を行い、415nmの可視光における吸光度変化を測定することによって、安定型HbA1cの測定を行った。
図1は、実施例1において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムをに示す模式図である。図1中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0を示す。なお、安定型HbA1cの分離は、約60秒の電気泳動時間で行うことができた。
健常人よりヘパリン採血した健常人全血に、グルコースを2500mg/dLとなるように添加し、37℃で3時間加温し、修飾Hbの一種である不安定型HbA1cを多量に含む試料を人為的に調製した。
得られたマイクロチップの泳動路の一方の端部に得られた溶血試料を添加し、泳動路の両端に1000Vの電圧をかけて電気泳動を行い、415nmの可視光における吸光度変化を測定することによって、安定型HbA1cの測定を行った。
図2は、実施例1において、修飾Hbを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムをに示す模式図である。図2中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0、ピーク3は修飾Hb(不安定型HbA1c)を示す。図2に示すように、安定型HbA1cと修飾Hbである不安定型HbA1cが良好に分離された。
(1)マイクロチップの作製
フューズドシリカ製マイクロチップに、長さ50mm、幅50μmの泳動路を形成し、クロス十字型の電気泳動用マイクロチップを作製した。泳動路に0.5%プリブレン水溶液を満たし、20分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してプリブレン水溶液を追い出した後、40℃の乾燥機内で12時間乾燥させた。その後、再び、プリブレン水溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥を5回繰り返すことによって、泳動路の内面がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたポリブレンコーティングマイクロチップの泳動路に、1.5%のデキストラン硫酸を含む50mMコハク酸緩衝液(pH5.8)を満たすことによって、測定用マイクロチップを得た。
(2)健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定
泳動路の両端に500Vの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例1と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図1と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Hbを含む試料の測定では、図2と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
(1)マイクロチップの作製
メチルメタクリレート製マイクロチップに、長さ90mm、幅30μmの泳動路を形成し、電気泳動用のマイクロチップを作製した。泳動路に0.5%のコンドロイチン硫酸水溶液を満たし、20分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してコンドロイチン硫酸水溶液を追い出した後、40℃の乾燥機内で12時間乾燥させた。その後、再び、コンドロイチン硫酸水溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥を5回繰り返すことによって、泳動路の内面がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたコンドロイチン硫酸コーティングマイクロチップの泳動路に、2.0%のコンドロイチン硫酸を含む100mMリン酸緩衝液(pH5.5)を満たすことによって、測定用マイクロチップを得た。
泳動路の両端に700Vの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例1と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図1と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Hbを含む試料の測定では、図2と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
(1)マイクロチップの作製
メチルメタクリレート製マイクロチップに、長さ60mm、幅60μmの泳動路を形成し、電気泳動用のマイクロチップを作製した。泳動路に0.5%ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)(以下、ポリ2−HEMAともいう)水溶液を満たし、20分間放置した。その後、空気を泳動路内に注入してポリ2−HEMA水溶液を追い出した後、40℃の乾燥機内で12時間乾燥させた。その後、再び、ポリ2−HEMA水溶液の注入、空気の注入、及び、乾燥を5回繰り返すことによって、泳動路の内面がコーティングされたマイクロチップを得た。得られたポリ2−HEMAコーティングマイクロチップの泳動路に、2.0%の(2−アクリルアミド−ブチルスルホン酸)−(2−HEMA)共重合体を含む100mMリンゴ酸緩衝液(pH5.4)を満たすことによって、測定用マイクロチップを得た。
泳動路の両端に400Vの電圧をかけて電気泳動を行った以外は、実施例1と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Hbを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図1と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Hbを含む試料の測定では、図2と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
フューズドシリカからなるキャピラリー(GLサイエンス製:内径25μm×全長30cm)を0.2N−NaOH、イオン交換水、0.5N−HClの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、BSA(カチオン性ポリマー:牛血清アルブミン:和光純薬製)を0.5重量%含有するリンゴ酸緩衝液を1分間通液し、キャピラリー内面をコーティングした。
得られたキャピラリーを、キャピラリー電気泳動装置(Beckman−Couler社製P/ACE MDQ)にセットし、0.2重量%のコンドロイチン硫酸(和光純薬製)を含有するリンゴ酸緩衝液(pH4.7)を上述のキャピラリー内に満たした。
得られた測定用キャピラリー電気泳動装置を用いて10kVの電圧を負荷して修飾Hbを含む試料の測定を行った。
図3は、比較例1において、修飾Hbを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
図3中、ピーク1は安定型HbA1c、ピーク2はHbA0、ピーク3は修飾Hb(不安定型HbA1c)を示す。図4に示すように、得られたエレクトロフェログラムにおいて、安定型HbA1cを示すピーク1と修飾Hbを示すピーク3とが重なっている。
マイクロチップの泳動路を長さ120mm、幅140μmとした以外は、実施例1と同様に処理し、電気泳動用マイクロチップを得た。更に、実施例1と同様の測定条件により、健常人血の測定を実施した。
得られたエレクトロフェログラムでは、1本のヘモグロビンのピークが確認されたのみで、安定型HbA1cの分離が全くできなかった。この結果は、緩衝液組成、設定電圧、泳動時間等の電気泳動の条件を変更して測定を行っても、改善されなかった。
(1)修飾Hb類の分離性能試験
実施例1〜4及び比較例1の測定条件について、健常人血試料と、同一健常人血を元に調製した修飾Hb含有試料、すなわち実施例1(3)修飾Hbを含む試料の測定において調製した健常人血にグルコースを2500mg/dLとなるように添加して得られた不安定型HbA1c含有試料と、更に他の修飾Hb含有試料、すなわち該健常人血にアセトアルデヒドを50mg/dLとなるように添加して得られたアセチル化Hb含有試料、シアン酸ナトリウムを50mg/dLとなるように添加して得られたカルバミル化Hb含有試料を調製し、各試料における安定型HbA1c値を求めた。
なお、各試料の安定型HbA1c値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型HbA1cピークの面積の比率(%)を求めることにより算出した。
得られた修飾Hb含有試料の安定型HbA1c値から、得られた健常人血試料の安定型HbA1c値を差し引いた値を求めた。
結果を表1に示した。
実施例1〜4及び比較例1の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を10回連続して得られた安定型HbA1c値のCV値を算出した。
また、比較例1では、1回の測定が終了した時点で、0.2NのNaOH、イオン交換水、0.5NのHCl溶液の順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、BSA(カチオン性ポリマー:牛血清アルブミン:和光純薬社製)の0.5%リンゴ酸緩衝液を1分間通液して動的コーティングを施した後、次試料を測定することによって、測定を繰り返し行うことによって同時再現性試験を行った。
結果を表2に示した。
実施例1〜4及び比較例1の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を100回連続して測定して得られた安定型HbA1c値の最大値と最小値との差(R値)を算出した。
結果を表2に示した。
一方、比較例1については、同時再現性試験におけるCV値が4%以上と大きく、また耐久性試験時のバラツキ幅も最大0.5%程度であり、糖尿病患者のHbA1c値を管理する上で全く不充分な値となっていた
実施例1及び2の測定条件において、実施例1で用いたクエン酸緩衝液、及び、実施例2で用いたコハク酸緩衝液のpH及び塩濃度を変化させながら、上述した同時再現性試験を行うことによって、緩衝液のpH及び塩濃度の影響を測定した。
pHを変化させた場合の結果を図4a、塩濃度を変化させた場合の結果を図4bに示した。
実施例1、2ともに、pHが5.0〜6.0、塩濃度が10〜300mMにおいて、CV値が小さくなり、安定型HbA1cを高い精度で測定することが可能となることが判明した。
Claims (2)
- 電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面が親水性ポリマーでコーティングされ、長さが10〜100mm、幅が10〜100μmである泳動路を有するマイクロチップと、pHが5.0〜6.0、塩濃度が10〜300mMである緩衝液とを用いて、100〜2000Vの電圧を負荷することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 緩衝液は、アニオン性ポリマーを含有することを特徴とする請求項1記載のヘモグロビン類の測定方法。
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