JPH0889296A - 核酸検出方法 - Google Patents
核酸検出方法Info
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- JPH0889296A JPH0889296A JP6237627A JP23762794A JPH0889296A JP H0889296 A JPH0889296 A JP H0889296A JP 6237627 A JP6237627 A JP 6237627A JP 23762794 A JP23762794 A JP 23762794A JP H0889296 A JPH0889296 A JP H0889296A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 固定用担体上に存在する検出すべき核酸と、
その核酸の少なくとも一部の塩基配列に相補的なプロー
ブＤＮＡとのハイブリッド形成を利用した核酸の検出方
法において、プローブＤＮＡはリンカーを介して結合し
ているハプテンを含有しており、そのハプテンはジベレ
リンまたはジベレリン誘導体であり、検出すべき核酸と
プローブＤＮＡとの反応によるハイブリッド形成に続い
て、未反応のプローブＤＮＡを排除した後、標識された
抗ハプテン抗体を前記ハイブリッドのプローブＤＮＡに
結合させ、前記標識を利用して前記核酸を検出すること
を特徴とする核酸検出方法。 【効果】 標識混合率や標識率に関係なく、従って、被
検対象核酸の塩基組成に関係なく、安定した検出感度が
得られる。
その核酸の少なくとも一部の塩基配列に相補的なプロー
ブＤＮＡとのハイブリッド形成を利用した核酸の検出方
法において、プローブＤＮＡはリンカーを介して結合し
ているハプテンを含有しており、そのハプテンはジベレ
リンまたはジベレリン誘導体であり、検出すべき核酸と
プローブＤＮＡとの反応によるハイブリッド形成に続い
て、未反応のプローブＤＮＡを排除した後、標識された
抗ハプテン抗体を前記ハイブリッドのプローブＤＮＡに
結合させ、前記標識を利用して前記核酸を検出すること
を特徴とする核酸検出方法。 【効果】 標識混合率や標識率に関係なく、従って、被
検対象核酸の塩基組成に関係なく、安定した検出感度が
得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸中に目的とする塩
基配列が存在するかどうかを検出するための核酸検出方
法に関する。
基配列が存在するかどうかを検出するための核酸検出方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の核酸検出方法は、膜などの固定用
担体に固定したサンプルＤＮＡ中の目的とする特定塩基
配列に、これと相補的に結合するプローブＤＮＡを、あ
らかじめラジオアイソトープ、蛍光色素などの標識物を
結合させた後に反応させ、未反応のプローブＤＮＡを洗
浄して排除した後、標識物が残留しているか否かによっ
て特定塩基配列を検出している。
担体に固定したサンプルＤＮＡ中の目的とする特定塩基
配列に、これと相補的に結合するプローブＤＮＡを、あ
らかじめラジオアイソトープ、蛍光色素などの標識物を
結合させた後に反応させ、未反応のプローブＤＮＡを洗
浄して排除した後、標識物が残留しているか否かによっ
て特定塩基配列を検出している。
【０００３】そして現在では、設備面や安全面の考慮か
ら非ラジオアイソトープ化システムが主流であり、その
一つが、例えば特開平１−２１５３００号公報等に開示
された、いわゆるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムで
ある。このシステムでは、プローブＤＮＡに結合する標
識物としてジゴキシゲニンを用い、標識の検出に当たっ
ては、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ジゴキ
シゲニン抗体をジゴキシゲニンに結合させた後、アルカ
リフォスファターゼの触媒反応による基質の発色により
検出している。
ら非ラジオアイソトープ化システムが主流であり、その
一つが、例えば特開平１−２１５３００号公報等に開示
された、いわゆるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムで
ある。このシステムでは、プローブＤＮＡに結合する標
識物としてジゴキシゲニンを用い、標識の検出に当たっ
ては、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ジゴキ
シゲニン抗体をジゴキシゲニンに結合させた後、アルカ
リフォスファターゼの触媒反応による基質の発色により
検出している。
【０００４】ところで、上記のＤＩＧシステムでは、プ
ローブＤＮＡにＤＩＧを標識する際に、ＤＮＡを構成す
るアデニン、グアニン、チミン、シトシンの４種の塩基
のうちチミンに対し、ＤＩＧ標識されたウラシルを所定
の割合で混入させておき、これらの塩基を用いてプロー
ブＤＮＡを合成している。ここで、プローブの合成時に
チミンに混入させる標識ウラシルの比（以下、「標識体
混合比」という。）には至適値の存在することが判明し
た。
ローブＤＮＡにＤＩＧを標識する際に、ＤＮＡを構成す
るアデニン、グアニン、チミン、シトシンの４種の塩基
のうちチミンに対し、ＤＩＧ標識されたウラシルを所定
の割合で混入させておき、これらの塩基を用いてプロー
ブＤＮＡを合成している。ここで、プローブの合成時に
チミンに混入させる標識ウラシルの比（以下、「標識体
混合比」という。）には至適値の存在することが判明し
た。
【０００５】即ち、検出プローブを構成する４種の塩基
の比が同一である場合において標識体混合比が３５％の
時（この時、標識率、即ちプローブＤＮＡの全塩基中の
標識ウラシルの比は理論上約６％である。）に検出感度
が最も高く、それ以外の標識体混合比の時には感度が悪
くなった。従って、この方法では標識率を一定に保たな
いと、検出感度の低下や不安定化を招き、ひいては陽
性、陰性の判定を誤るおそれがある。
の比が同一である場合において標識体混合比が３５％の
時（この時、標識率、即ちプローブＤＮＡの全塩基中の
標識ウラシルの比は理論上約６％である。）に検出感度
が最も高く、それ以外の標識体混合比の時には感度が悪
くなった。従って、この方法では標識率を一定に保たな
いと、検出感度の低下や不安定化を招き、ひいては陽
性、陰性の判定を誤るおそれがある。
【０００６】しかし、検出対象たる天然の核酸において
は４種の塩基の比が一定ではないため、その都度、至適
標識率を確保するために標識体混合比を計算して調整す
ることが要求され、非常に面倒である。また、標識体混
合比を調整しても、あるＤＮＡを鋳型としてポリメラー
ゼ反応によりプローブＤＮＡを合成する際に、酵素反応
により生じるプローブの長さに差を生じて、狙い通りの
標識率にならないおそれもある。更に、４種の塩基の比
が未知である核酸の場合には、その検出感度を予測でき
ないままの不安な判定を余儀なくされる。
は４種の塩基の比が一定ではないため、その都度、至適
標識率を確保するために標識体混合比を計算して調整す
ることが要求され、非常に面倒である。また、標識体混
合比を調整しても、あるＤＮＡを鋳型としてポリメラー
ゼ反応によりプローブＤＮＡを合成する際に、酵素反応
により生じるプローブの長さに差を生じて、狙い通りの
標識率にならないおそれもある。更に、４種の塩基の比
が未知である核酸の場合には、その検出感度を予測でき
ないままの不安な判定を余儀なくされる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、標識
率の差異によって、あるいはプローブＤＮＡの塩基配列
の如何によって検出感度の低下や不安定化を招くことの
ない核酸検出方法を提供することを、その解決すべき課
題とする。
率の差異によって、あるいはプローブＤＮＡの塩基配列
の如何によって検出感度の低下や不安定化を招くことの
ない核酸検出方法を提供することを、その解決すべき課
題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の研究の過程で、ハプテン（本発明においてプローブＤ
ＮＡを標識する物質として使用する）として、ＤＩＧに
代えジベレリンまたはその誘導体を用いると、その標識
率が検出装置の許容する最低限度以上である限り、標識
率に関係なく安定した検出感度を得る、という全く新し
い知見を得た。
の研究の過程で、ハプテン（本発明においてプローブＤ
ＮＡを標識する物質として使用する）として、ＤＩＧに
代えジベレリンまたはその誘導体を用いると、その標識
率が検出装置の許容する最低限度以上である限り、標識
率に関係なく安定した検出感度を得る、という全く新し
い知見を得た。
【０００９】従って本発明は、固定用担体上に存在する
検出すべき核酸と、その核酸の少なくとも一部の塩基配
列に相補的なプローブＤＮＡとのハイブリッド形成を利
用した核酸の検出方法において、前記プローブＤＮＡは
リンカーを介して結合しているハプテンを有しており、
そのハプテンはジベレリンまたはジベレリン誘導体であ
り、検出すべき核酸とプローブＤＮＡとの反応によるハ
イブリッド形成に続いて、未反応のプローブＤＮＡを排
除した後、標識された抗ハプテン抗体を前記ハイブリッ
ドのプローブＤＮＡに結合させ、前記標識を利用して前
記核酸を検出することを特徴とする核酸検出方法を提供
する。
検出すべき核酸と、その核酸の少なくとも一部の塩基配
列に相補的なプローブＤＮＡとのハイブリッド形成を利
用した核酸の検出方法において、前記プローブＤＮＡは
リンカーを介して結合しているハプテンを有しており、
そのハプテンはジベレリンまたはジベレリン誘導体であ
り、検出すべき核酸とプローブＤＮＡとの反応によるハ
イブリッド形成に続いて、未反応のプローブＤＮＡを排
除した後、標識された抗ハプテン抗体を前記ハイブリッ
ドのプローブＤＮＡに結合させ、前記標識を利用して前
記核酸を検出することを特徴とする核酸検出方法を提供
する。
【００１０】本発明はさらに、前記標識された抗ハプテ
ン抗体の使用に代え、抗ハプテン抗体と、その抗ハプテ
ン抗体に特異的に結合する能力を持つと共にそれ自体が
標識された抗体とを使用することを特徴とする核酸検出
方法を提供する。
ン抗体の使用に代え、抗ハプテン抗体と、その抗ハプテ
ン抗体に特異的に結合する能力を持つと共にそれ自体が
標識された抗体とを使用することを特徴とする核酸検出
方法を提供する。
【００１１】
【発明の効果】本発明は、その標識率が検出装置の許容
する最低限度以上である限り、標識率や標識体混合比の
如何に関係なく、従ってまたプローブＤＮＡの塩基配列
の如何に関係なく安定した検出感度を得ることができ
る。このため、目的とする核酸の存否の判断を正確に行
うことができる。
する最低限度以上である限り、標識率や標識体混合比の
如何に関係なく、従ってまたプローブＤＮＡの塩基配列
の如何に関係なく安定した検出感度を得ることができ
る。このため、目的とする核酸の存否の判断を正確に行
うことができる。
【００１２】
【具体的な説明】本発明においては、標識用ハプテンと
してジベレリン又はその誘導体が使用され、これらは天
然に存在する各ジベレリン（ＧＡ）すなわちＧＡ1 ，Ｇ
Ａ2 ，ＧＡ3 ，ＧＡ4 等、及びジベレリン骨格を損なわ
ない範囲で化学的な修飾や官能基除去を施した非天然型
のＧＡ誘導体を用いることができ、これらはジベレリン
としての生理活性を示さないものでもよい。
してジベレリン又はその誘導体が使用され、これらは天
然に存在する各ジベレリン（ＧＡ）すなわちＧＡ1 ，Ｇ
Ａ2 ，ＧＡ3 ，ＧＡ4 等、及びジベレリン骨格を損なわ
ない範囲で化学的な修飾や官能基除去を施した非天然型
のＧＡ誘導体を用いることができ、これらはジベレリン
としての生理活性を示さないものでもよい。
【００１３】この標識用ハプテンはリンカーを介してプ
ローブＤＮＡに連結される。リンカーが結合するプロー
ブＤＮＡ中のヌクレオチドとしては、アデニン、グアニ
ン、シトシン又はチミンのいずれであってもよく、ま
た、チミンに代えてウラシルを用いることもできる。プ
ローブＤＮＡ中のリンカーの連結部位としては、例えば
プローブＤＮＡを構成するヌクレオチド中の塩基におい
て、好ましく、例えばプリン塩基中の８位又はピリミジ
ン塩基中の５位等を使用することができる。
ローブＤＮＡに連結される。リンカーが結合するプロー
ブＤＮＡ中のヌクレオチドとしては、アデニン、グアニ
ン、シトシン又はチミンのいずれであってもよく、ま
た、チミンに代えてウラシルを用いることもできる。プ
ローブＤＮＡ中のリンカーの連結部位としては、例えば
プローブＤＮＡを構成するヌクレオチド中の塩基におい
て、好ましく、例えばプリン塩基中の８位又はピリミジ
ン塩基中の５位等を使用することができる。
【００１４】他方、ジベレリン又はその誘導体のリンカ
ー結合部位としては、それらの化合物の６位のカルボキ
シル基、１６位のケトン基又は３位の水酸基等を用いる
のが好ましい。リンカーは、プローブＤＮＡ中の結合基
と結合することができる基と、ジベレリン又はその誘導
体中の結合基に結合することができる基の両方を有する
構造物であり、例えばリンカー中の結合基としては、ア
ミド結合を形成するアミノ基、ジベレリン又はその誘導
体中のカルボキシル基と共にジベレリン又はその誘導体
に導入されたケトン基と反応してイミノ結合基を形成す
るアミノ基等を使用することができる。
ー結合部位としては、それらの化合物の６位のカルボキ
シル基、１６位のケトン基又は３位の水酸基等を用いる
のが好ましい。リンカーは、プローブＤＮＡ中の結合基
と結合することができる基と、ジベレリン又はその誘導
体中の結合基に結合することができる基の両方を有する
構造物であり、例えばリンカー中の結合基としては、ア
ミド結合を形成するアミノ基、ジベレリン又はその誘導
体中のカルボキシル基と共にジベレリン又はその誘導体
に導入されたケトン基と反応してイミノ結合基を形成す
るアミノ基等を使用することができる。
【００１５】リンカーは、ハプテン−抗体反応の際にい
わゆる立体障害を避けるためにある程度以上の長さを必
要とし、例えば前記の結合基中の原子を含めて原子４個
以上の長さを有することが好ましい。好ましいリンカー
としては、例えば、そのままでもリンカーとして用いる
ことができ、前記したリンカーの連結部位であるプリン
塩基の８位、ピリミジン塩基の５位に結合可能なアリル
アミンが挙げられる。
わゆる立体障害を避けるためにある程度以上の長さを必
要とし、例えば前記の結合基中の原子を含めて原子４個
以上の長さを有することが好ましい。好ましいリンカー
としては、例えば、そのままでもリンカーとして用いる
ことができ、前記したリンカーの連結部位であるプリン
塩基の８位、ピリミジン塩基の５位に結合可能なアリル
アミンが挙げられる。
【００１６】また、リンカーの原子長を更に伸ばすため
には、すでにリンカーとして塩基に結合しているアリル
アミノ基と結合可能なカルボキシル基を一端に有し、他
端にアミノ基を有する脂肪族鎖から成るもの等を用いる
ことができる。この場合の脂肪族基の炭素数に２〜１０
個、好ましくは４〜７個、例えば５個である。好ましい
例として、６−アミノカプロン酸、４−アミノプロピオ
ン酸、４−アミノブチル酸等が挙げられる。
には、すでにリンカーとして塩基に結合しているアリル
アミノ基と結合可能なカルボキシル基を一端に有し、他
端にアミノ基を有する脂肪族鎖から成るもの等を用いる
ことができる。この場合の脂肪族基の炭素数に２〜１０
個、好ましくは４〜７個、例えば５個である。好ましい
例として、６−アミノカプロン酸、４−アミノプロピオ
ン酸、４−アミノブチル酸等が挙げられる。
【００１７】本発明において用いる抗ハプテン抗体は、
抗原としてハプテンであるジベレリン又はその誘導体を
用いて生じさせた抗体であり、ポリクローナル抗体でも
モノクローナル抗体でもよい。抗原の部分としてハプテ
ンを用いてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
を作製する方法はよく知られており、既知の方法に従っ
て得ることができる。ポリクローナル抗体を産生する動
物としては、例えばウサギ、モルモット、マウス等が用
いられる。
抗原としてハプテンであるジベレリン又はその誘導体を
用いて生じさせた抗体であり、ポリクローナル抗体でも
モノクローナル抗体でもよい。抗原の部分としてハプテ
ンを用いてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
を作製する方法はよく知られており、既知の方法に従っ
て得ることができる。ポリクローナル抗体を産生する動
物としては、例えばウサギ、モルモット、マウス等が用
いられる。
【００１８】本発明の１つの態様によれば、上記の抗体
は、それを検出するための標識と連結される。この標識
としては、酵素、例えば発色反応、発光反応又は蛍光反
応を生じさせるための酵素が挙げられる。例えば発色反
応を生じさせる酵素の例としてアルカリ性ホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシターゼ等が用い
られ、発光反応を生じさせる酵素として、ルシフェラー
ゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられ、また蛍光反応の酵
素としてはアルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダー
ゼ、エステラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の検出
のためには、酵素の種類に対応して比色基質、発光基
質、蛍光基質等が使用される。検出のための酵素、基
質、検出反応等は常法に従って行うことができる。
は、それを検出するための標識と連結される。この標識
としては、酵素、例えば発色反応、発光反応又は蛍光反
応を生じさせるための酵素が挙げられる。例えば発色反
応を生じさせる酵素の例としてアルカリ性ホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシターゼ等が用い
られ、発光反応を生じさせる酵素として、ルシフェラー
ゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられ、また蛍光反応の酵
素としてはアルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダー
ゼ、エステラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の検出
のためには、酵素の種類に対応して比色基質、発光基
質、蛍光基質等が使用される。検出のための酵素、基
質、検出反応等は常法に従って行うことができる。
【００１９】本発明の第二の態様によれば、抗ハプテン
抗体（一次抗体）を直接標識せず、抗ハプテン抗体に対
する抗体（二次抗体）であって標識されたものを用いて
抗ハプテン抗体を検出することができる。例えば抗ハプ
テン抗体（一次抗体）としてある種の動物の抗体を用い
る場合には、その種の抗体に対して特異的に結合する他
の種の抗体（二次抗体）を用いることができる。例え
ば、抗ハプテン抗体としてマウスの抗体を一次抗体とし
て用いる場合、マウスの抗体に対して特異的なウサギの
抗体を二次抗体として用いることができる。
抗体（一次抗体）を直接標識せず、抗ハプテン抗体に対
する抗体（二次抗体）であって標識されたものを用いて
抗ハプテン抗体を検出することができる。例えば抗ハプ
テン抗体（一次抗体）としてある種の動物の抗体を用い
る場合には、その種の抗体に対して特異的に結合する他
の種の抗体（二次抗体）を用いることができる。例え
ば、抗ハプテン抗体としてマウスの抗体を一次抗体とし
て用いる場合、マウスの抗体に対して特異的なウサギの
抗体を二次抗体として用いることができる。
【００２０】この態様において二次抗体を検出するため
に二次抗体に結合させる標識及びその検出方法は、第一
の態様において抗ハプテン抗体を検出する場合と同様で
ある。上記一次抗体及び／又は二次抗体に、生来の抗体
をそのまま用いてもよく、又は結合性を保持している抗
体の断片、例えばＦ（ａｂ）2 、Ｆ（ａｂ）等を用いて
もよい。これらの断片化は常法に従って行うことができ
る。
に二次抗体に結合させる標識及びその検出方法は、第一
の態様において抗ハプテン抗体を検出する場合と同様で
ある。上記一次抗体及び／又は二次抗体に、生来の抗体
をそのまま用いてもよく、又は結合性を保持している抗
体の断片、例えばＦ（ａｂ）2 、Ｆ（ａｂ）等を用いて
もよい。これらの断片化は常法に従って行うことができ
る。
【００２１】本発明の方法において、被検核酸を固定す
るための固体担体としては、公知の各種固定用担体が用
いられる。一般的には、ハプテン−抗体反応のため溶液
に浸しやすい形状で、バックグラウンドの原因となる抗
体や蛋白質との非特異的結合性の低い材質のものが用い
られ、具体例としては、ニトロセルロースフィルター、
ナイロンフィルター、プラスチック、プレキシガラス、
ニトロセルロースまたはナイロンで被覆したプラスチッ
クやプレキシガラス等が挙げられる。
るための固体担体としては、公知の各種固定用担体が用
いられる。一般的には、ハプテン−抗体反応のため溶液
に浸しやすい形状で、バックグラウンドの原因となる抗
体や蛋白質との非特異的結合性の低い材質のものが用い
られ、具体例としては、ニトロセルロースフィルター、
ナイロンフィルター、プラスチック、プレキシガラス、
ニトロセルロースまたはナイロンで被覆したプラスチッ
クやプレキシガラス等が挙げられる。
【００２２】本発明の実施に当っては、まず、固体担体
表面上に被検試料中の核酸を固定する。核酸はＤＮＡで
もＲＮＡでもよい。固定は常法に従って行うことができ
る。例えばＵＶ照射、８０℃で２時間の加熱、あるいは
真空ブロッティングにより行うことができる。前記真空
ブロッティングの場合、固定化反応の媒体として例えば
０．５Ｎ ＮａＯＨ、２×ＳＳＣ、ＴＥ等の緩衝液を用
いることができ、この反応は例えば室温〜３７℃にて５
分間行う。
表面上に被検試料中の核酸を固定する。核酸はＤＮＡで
もＲＮＡでもよい。固定は常法に従って行うことができ
る。例えばＵＶ照射、８０℃で２時間の加熱、あるいは
真空ブロッティングにより行うことができる。前記真空
ブロッティングの場合、固定化反応の媒体として例えば
０．５Ｎ ＮａＯＨ、２×ＳＳＣ、ＴＥ等の緩衝液を用
いることができ、この反応は例えば室温〜３７℃にて５
分間行う。
【００２３】次に、ハイブリダイゼーション液に浸し、
プレハイブリダイゼーション処理する。ハイブリダイゼ
ーション溶液の組成は、例えば１％カゼイン水溶液（Ｂ
ｕｆｆｅｒ；０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０mM
ＮａＣｌ；pH＝７．５）であり、処理は４２〜７０℃に
て１〜１６時間行う。次にプローブＤＮＡを含むハイブ
リダイゼーション溶液により固体担体を処理してハイブ
リダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション溶液
としては、例えば１０×ＳＳＣ、５％カゼイン、５％ラ
ウロインオルコシン、５％ＳＤＳの組成のものを用いる
ことができる。ハイブリダイゼーションの条件は、プロ
ーブＤＮＡの長さ等により異るが、４２℃〜７０℃にて
１〜１８時間である。
プレハイブリダイゼーション処理する。ハイブリダイゼ
ーション溶液の組成は、例えば１％カゼイン水溶液（Ｂ
ｕｆｆｅｒ；０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０mM
ＮａＣｌ；pH＝７．５）であり、処理は４２〜７０℃に
て１〜１６時間行う。次にプローブＤＮＡを含むハイブ
リダイゼーション溶液により固体担体を処理してハイブ
リダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション溶液
としては、例えば１０×ＳＳＣ、５％カゼイン、５％ラ
ウロインオルコシン、５％ＳＤＳの組成のものを用いる
ことができる。ハイブリダイゼーションの条件は、プロ
ーブＤＮＡの長さ等により異るが、４２℃〜７０℃にて
１〜１８時間である。
【００２４】次に、プローブＤＮＡには、ハプテンが結
合しているので、本発明の第一の態様によれば、このハ
プテンと標識された抗ハプテン抗体と結合せしめる。こ
の反応は常用の条件下で、例えばトリス緩衝液（pH７．
５）、リン酸緩衝液等の中で２０〜３７℃にて１５〜６
０分間行うことができる。次に、洗浄液、例えばトリス
緩衝液（pH７．５）等により固体担体を洗浄して未結合
の標識抗体を除去した後、抗ハプテン抗体の標識が酵素
であれば、該酵素に対する発色基質と反応せしめること
により発色を行う。
合しているので、本発明の第一の態様によれば、このハ
プテンと標識された抗ハプテン抗体と結合せしめる。こ
の反応は常用の条件下で、例えばトリス緩衝液（pH７．
５）、リン酸緩衝液等の中で２０〜３７℃にて１５〜６
０分間行うことができる。次に、洗浄液、例えばトリス
緩衝液（pH７．５）等により固体担体を洗浄して未結合
の標識抗体を除去した後、抗ハプテン抗体の標識が酵素
であれば、該酵素に対する発色基質と反応せしめること
により発色を行う。
【００２５】この場合の反応媒体としては、例えばトリ
ス緩衝液（pH７．５）等が使用される。発色は、標識酵
素及びその基質により異るが、例えば２０〜３７℃にて
適宜な時間放置して行う。本発明の他の態様によれば、
抗ハプテン抗体は標識されておらず、抗ハプテン抗体に
対する標識された抗体を用いて検出を行う。抗ハプテン
抗体（一次抗体）と標識抗体（二次抗体）との反応は例
えばトリス緩衝液（pH７．５）等の媒体中で２０〜３７
℃にて１５〜６０分間行うことができる。
ス緩衝液（pH７．５）等が使用される。発色は、標識酵
素及びその基質により異るが、例えば２０〜３７℃にて
適宜な時間放置して行う。本発明の他の態様によれば、
抗ハプテン抗体は標識されておらず、抗ハプテン抗体に
対する標識された抗体を用いて検出を行う。抗ハプテン
抗体（一次抗体）と標識抗体（二次抗体）との反応は例
えばトリス緩衝液（pH７．５）等の媒体中で２０〜３７
℃にて１５〜６０分間行うことができる。
【００２６】次に、洗浄液、例えばトリス緩衝液（pH
７．５）等により固体担体を洗浄して未結合の標識抗体
（二次抗体）を除去した後、二次抗体の標識が酵素であ
る場合には、発色基質と反応せしめることにより発色を
行う。この場合の発色は第一の態様の場合と同様にして
行えばよい。次に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。実施例１〜８における反応系統を図１及び
図２に示す。
７．５）等により固体担体を洗浄して未結合の標識抗体
（二次抗体）を除去した後、二次抗体の標識が酵素であ
る場合には、発色基質と反応せしめることにより発色を
行う。この場合の発色は第一の態様の場合と同様にして
行えばよい。次に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。実施例１〜８における反応系統を図１及び
図２に示す。
【００２７】実施例１． ジベレリンＡ3 −Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステル（リンカー結合予定サイト
が活性化されたジベレリンＡ3 ）の合成 ５０mlのナスフラスコ中で、ジベレリンＡ3 ２ｇ（５．
８mmol）とＮ−ヒドロキシサクシンイミド６６８mg
（５．８mmol）を、ジオキサン２０mlに溶解し、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド１．３ml（５．８mmol）を添
加し、室温で２〜３時間攪拌した。析出したジシクロヘ
キシル尿素を濾過により除去し、ジオキサンをオイルポ
ンプ真空中で蒸発させた。残った油状物質を酢酸エチル
１０mlに溶解し、石油エーテル５０mlに注ぐと、結晶が
析出した。その結晶を真空中で乾燥させた。２．０７ｇ
（収率８０％）が得られた。
キシサクシンイミドエステル（リンカー結合予定サイト
が活性化されたジベレリンＡ3 ）の合成 ５０mlのナスフラスコ中で、ジベレリンＡ3 ２ｇ（５．
８mmol）とＮ−ヒドロキシサクシンイミド６６８mg
（５．８mmol）を、ジオキサン２０mlに溶解し、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド１．３ml（５．８mmol）を添
加し、室温で２〜３時間攪拌した。析出したジシクロヘ
キシル尿素を濾過により除去し、ジオキサンをオイルポ
ンプ真空中で蒸発させた。残った油状物質を酢酸エチル
１０mlに溶解し、石油エーテル５０mlに注ぐと、結晶が
析出した。その結晶を真空中で乾燥させた。２．０７ｇ
（収率８０％）が得られた。
【００２８】実施例２． ジベレリンＡ3 −ε−アミド
カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
（末端活性化リンカーと結合したジベレリンＡ3)の合成 ３０mlのナスフラスコ中で、ジベレリンＡ3 −Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル３６０mg（０．８０mmo
l）をジメチルスルホキシド３．６mlに溶解し、これに
Ｈ2 Ｏ１．８mlに溶解させた６−アミノカプロン酸２１
３mg及びトリエチルアミン０．２２mlを順次加え、室温
で一夜攪拌した。真空中で溶媒を蒸発させ、残った油状
物質をジメチルスルホキシド２mlに溶解し、逆相系のカ
ラムを用いて、水とアセトニトリルにより溶出させ、生
成物を分けた。真空中で乾燥させ、そのまま次の反応に
用いた。
カプロン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
（末端活性化リンカーと結合したジベレリンＡ3)の合成 ３０mlのナスフラスコ中で、ジベレリンＡ3 −Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル３６０mg（０．８０mmo
l）をジメチルスルホキシド３．６mlに溶解し、これに
Ｈ2 Ｏ１．８mlに溶解させた６−アミノカプロン酸２１
３mg及びトリエチルアミン０．２２mlを順次加え、室温
で一夜攪拌した。真空中で溶媒を蒸発させ、残った油状
物質をジメチルスルホキシド２mlに溶解し、逆相系のカ
ラムを用いて、水とアセトニトリルにより溶出させ、生
成物を分けた。真空中で乾燥させ、そのまま次の反応に
用いた。
【００２９】生成したジベレリンＡ3 −ε−アミドカプ
ロン酸を無水ジメチルホルムアミド３mlに溶解し、Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミド１１５mg（１．０mmol）及び
ジシクロヘキシルカルボジイミド０．２２ml（１．０mm
ol）を順次加え、室温で一夜反応させた。析出したジシ
クロヘキシル尿素を濾過により除去し、真空中で溶媒を
蒸発させた後、油状物質を酢酸エチルに懸濁し、石油エ
ーテルに注ぎ、結晶化させた。結晶を回収し、真空中で
乾燥させた。１７４mg（収率３８％）を得た。次の実施
例３〜５は、ジベレリンＡ4 のリンカー結合予定部位の
活性化とリンカーの結合に関する。
ロン酸を無水ジメチルホルムアミド３mlに溶解し、Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミド１１５mg（１．０mmol）及び
ジシクロヘキシルカルボジイミド０．２２ml（１．０mm
ol）を順次加え、室温で一夜反応させた。析出したジシ
クロヘキシル尿素を濾過により除去し、真空中で溶媒を
蒸発させた後、油状物質を酢酸エチルに懸濁し、石油エ
ーテルに注ぎ、結晶化させた。結晶を回収し、真空中で
乾燥させた。１７４mg（収率３８％）を得た。次の実施
例３〜５は、ジベレリンＡ4 のリンカー結合予定部位の
活性化とリンカーの結合に関する。
【００３０】実施例３． ジベレリンＡ4 −１７−ノル
ケトンの合成 ３０mlのナスフラスコ中で、ジベレリンＡ4 １００．６
mg（０．３０mmol）をテトラヒドロフラン／Ｈ2 Ｏ
（１：１）１０mlに溶解し、これに酸化オスミウム１
５．２mg（０．０６mmol）を氷冷しながら加えた。１０
分攪拌後、過よう素酸ナトリウム２１７．２mg（１．０
２mmol）を加え、Ｎ2 ガスを封入後、常温にて一夜攪拌
した。反応液の沈殿をろ別し、ろ液を４０℃で減圧濃縮
してテトラヒドロフランを留去して得た水溶液を６Ｎの
硫酸を２滴加えてpH１．５にし、３回、計２５mlの酢酸
エチルで抽出した。得られた酢酸エチル抽出液を、無水
硫酸ナトリウムを加えて一夜冷蔵し脱水後、無水硫酸ナ
トリウムをろ別しろ液を濃縮した。
ケトンの合成 ３０mlのナスフラスコ中で、ジベレリンＡ4 １００．６
mg（０．３０mmol）をテトラヒドロフラン／Ｈ2 Ｏ
（１：１）１０mlに溶解し、これに酸化オスミウム１
５．２mg（０．０６mmol）を氷冷しながら加えた。１０
分攪拌後、過よう素酸ナトリウム２１７．２mg（１．０
２mmol）を加え、Ｎ2 ガスを封入後、常温にて一夜攪拌
した。反応液の沈殿をろ別し、ろ液を４０℃で減圧濃縮
してテトラヒドロフランを留去して得た水溶液を６Ｎの
硫酸を２滴加えてpH１．５にし、３回、計２５mlの酢酸
エチルで抽出した。得られた酢酸エチル抽出液を、無水
硫酸ナトリウムを加えて一夜冷蔵し脱水後、無水硫酸ナ
トリウムをろ別しろ液を濃縮した。
【００３１】これをシリカゲル（３ｇ）吸着クロマトグ
ラフィで精製した。溶出液として、クロロホルム−酢酸
エチルの溶出系を用い、クロロホルム１００％から酢酸
エチルを５％刻みで増やした。１ステップあたりの溶出
量は１０mlとして分取した。ジベレリンＡ4 −１７−ノ
ルケトンは酢酸エチル２０％〜５５％区に溶出した。こ
れをアセトン／ヘキサン系により再結晶し、７５mgのジ
ベレリンＡ4 −１７−ノルケトンを得た。本合成は、報
文 M.Nakajima et.al., Plant Cell Physiol. 32(4),50
5-510(1991) に準じた。
ラフィで精製した。溶出液として、クロロホルム−酢酸
エチルの溶出系を用い、クロロホルム１００％から酢酸
エチルを５％刻みで増やした。１ステップあたりの溶出
量は１０mlとして分取した。ジベレリンＡ4 −１７−ノ
ルケトンは酢酸エチル２０％〜５５％区に溶出した。こ
れをアセトン／ヘキサン系により再結晶し、７５mgのジ
ベレリンＡ4 −１７−ノルケトンを得た。本合成は、報
文 M.Nakajima et.al., Plant Cell Physiol. 32(4),50
5-510(1991) に準じた。
【００３２】実施例４． ジベレリンＡ4 −１６−カル
ボキシメトキシムの合成 １０mlナスフラスコ中でカルボキシメトキシルアミン塩
酸塩２５．５mg（０．２３mmol）を０．６８mlのピリジ
ンに溶解した。これにジベレリンＡ4 −１７−ノルケト
ン３０mg（０．０９mmol）を加え、５０℃に加温して３
時間静置した。
ボキシメトキシムの合成 １０mlナスフラスコ中でカルボキシメトキシルアミン塩
酸塩２５．５mg（０．２３mmol）を０．６８mlのピリジ
ンに溶解した。これにジベレリンＡ4 −１７−ノルケト
ン３０mg（０．０９mmol）を加え、５０℃に加温して３
時間静置した。
【００３３】反応液を、氷冷した０．５％ＨＣ１２０ml
の中へ流し込み、ＨＣ１でpH３．５に調節し、３回、計
１５０mlの酢酸エチルで抽出し、得られた酢酸エチル抽
出液を、２回、計２００mlで洗浄後、０．５％ＨＣ１無
水硫酸ナトリウムを加えて一夜冷蔵し脱水後、無水硫酸
ナトリウムをろ別しろ液を減圧濃縮し、残査をアセトン
／ヘキサン系により再結晶し、２２．２mgのジベレリン
Ａ4 −１６−カルボキシメトキシムを得た。本合成は、
報文 M.Nakajima et.al., Plant Cell Physiol. 32(4),
505-510(1991) に準じた。
の中へ流し込み、ＨＣ１でpH３．５に調節し、３回、計
１５０mlの酢酸エチルで抽出し、得られた酢酸エチル抽
出液を、２回、計２００mlで洗浄後、０．５％ＨＣ１無
水硫酸ナトリウムを加えて一夜冷蔵し脱水後、無水硫酸
ナトリウムをろ別しろ液を減圧濃縮し、残査をアセトン
／ヘキサン系により再結晶し、２２．２mgのジベレリン
Ａ4 −１６−カルボキシメトキシムを得た。本合成は、
報文 M.Nakajima et.al., Plant Cell Physiol. 32(4),
505-510(1991) に準じた。
【００３４】実施例５． ジベレリンＡ4 −１６−カル
ボキシメトキシム−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テルの合成 ジベレリンＡ4 −１６−カルボキシメトキシム５mg
（０．０１２mmol）をジメチルスルホキシド８３μｌに
溶解し、ジメチルスルホキシドに１００mg／mlの濃度で
溶解させたＮ−ヒドロキシサクシンイミドを１４μｌ
（０．０１２mmol）加え、次にジシクロヘキシルカルボ
ジイミド２．７μｌ（０．０１２mmol）を加え、室温で
一夜反応させた。析出したジシクロヘキシル尿素を濾過
により除去し、この溶液のまま、次の反応に用いた。
ボキシメトキシム−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テルの合成 ジベレリンＡ4 −１６−カルボキシメトキシム５mg
（０．０１２mmol）をジメチルスルホキシド８３μｌに
溶解し、ジメチルスルホキシドに１００mg／mlの濃度で
溶解させたＮ−ヒドロキシサクシンイミドを１４μｌ
（０．０１２mmol）加え、次にジシクロヘキシルカルボ
ジイミド２．７μｌ（０．０１２mmol）を加え、室温で
一夜反応させた。析出したジシクロヘキシル尿素を濾過
により除去し、この溶液のまま、次の反応に用いた。
【００３５】実施例６． ジベレリンＡ3 −［５−（ア
ミドアリル）−２′−デオキシウリジン−５′−三リン
酸］−四ナトリウム塩（ハプテン結合塩基（標識塩
基））の合成 ジベレリンＡ3 −Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステ
ル４mg（９．０μmol）をジメチルスルホキシド１００
μｌに溶解し、５−アリルアミノ−２′−デオキシウリ
ジン−５′−三リン酸−四ナトリウム塩２．０５μmol
が溶解している０．１Ｍほう酸ナトリウム溶液（pH８．
５）０．９mlに加え、室温で一夜放置した。
ミドアリル）−２′−デオキシウリジン−５′−三リン
酸］−四ナトリウム塩（ハプテン結合塩基（標識塩
基））の合成 ジベレリンＡ3 −Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステ
ル４mg（９．０μmol）をジメチルスルホキシド１００
μｌに溶解し、５−アリルアミノ−２′−デオキシウリ
ジン−５′−三リン酸−四ナトリウム塩２．０５μmol
が溶解している０．１Ｍほう酸ナトリウム溶液（pH８．
５）０．９mlに加え、室温で一夜放置した。
【００３６】反応混合物から目的物を分離するには、高
速イオン交換クロマトグラフィ用充填カラムのＴＳＫゲ
ルＤＥＡＥ−２ＳＷ（東ソー）で、０Ｍから０．７Ｍの
塩化ナトリウム溶液の直線濃度勾配を用いて、ＨＰＬＣ
クロマトグラフィによって行なった。目的物のピークは
５−アリルアミノ−２′−デオキシウリジン−５′−三
リン酸よりもリテンションタイムが遅くなり、はっきり
と区別される。純粋な目的物のピークを含有するフラク
ションを回収し、セファデックスＧ−１０により脱塩を
行ない、凍結乾燥し、目的物を得た。この生成物におい
てはジベレリンＡ3 とウリジルの間のカルバミノプロペ
ニル基がリンカーとなっている。
速イオン交換クロマトグラフィ用充填カラムのＴＳＫゲ
ルＤＥＡＥ−２ＳＷ（東ソー）で、０Ｍから０．７Ｍの
塩化ナトリウム溶液の直線濃度勾配を用いて、ＨＰＬＣ
クロマトグラフィによって行なった。目的物のピークは
５−アリルアミノ−２′−デオキシウリジン−５′−三
リン酸よりもリテンションタイムが遅くなり、はっきり
と区別される。純粋な目的物のピークを含有するフラク
ションを回収し、セファデックスＧ−１０により脱塩を
行ない、凍結乾燥し、目的物を得た。この生成物におい
てはジベレリンＡ3 とウリジルの間のカルバミノプロペ
ニル基がリンカーとなっている。
【００３７】実施例７． ジベレリンＡ3 −ε−アミド
カプロイル−［５−（アミドアリル）−２′−デオキシ
ウリジン−５′−三リン酸］−四ナトリウム塩（ハプテ
ン結合塩基（標識塩基））の合成 ジベレリンＡ3 −ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル１０mg（１０．５μmol ）を
ジメチルスルホキシド１５５μｌに溶解し、５−アリル
アミノ−２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸−四
ナトリウム塩４．２μmol が溶解している０．１Ｍ ほ
う酸ナトリウム溶液（pH８．５）１．４mlに加え、室温
で一夜放置した。
カプロイル−［５−（アミドアリル）−２′−デオキシ
ウリジン−５′−三リン酸］−四ナトリウム塩（ハプテ
ン結合塩基（標識塩基））の合成 ジベレリンＡ3 −ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル１０mg（１０．５μmol ）を
ジメチルスルホキシド１５５μｌに溶解し、５−アリル
アミノ−２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸−四
ナトリウム塩４．２μmol が溶解している０．１Ｍ ほ
う酸ナトリウム溶液（pH８．５）１．４mlに加え、室温
で一夜放置した。
【００３８】実施例６と同様に、反応混合物から分離す
るには、高速イオン交換クロマトグラフィ用充填カラム
のＴＳＫゲルＤＥＡＥ−２ＳＷ（東ソー）で、０Ｍから
０．７Ｍの塩化ナトリウム溶液の直線濃度勾配を用い
て、ＨＰＬＣクロマトグラフィによって行なった。目的
物のピークは５−アリルアミノ−２′−デオキシウリジ
ン−５′−三リン酸よりもリテンションタイムが遅くな
り、はっきりと区別される。純粋な目的物のピークを含
有するフラクションを回収し、セファデックスＧ−１０
により脱塩を行ない、凍結乾燥し、目的物を得た。
るには、高速イオン交換クロマトグラフィ用充填カラム
のＴＳＫゲルＤＥＡＥ−２ＳＷ（東ソー）で、０Ｍから
０．７Ｍの塩化ナトリウム溶液の直線濃度勾配を用い
て、ＨＰＬＣクロマトグラフィによって行なった。目的
物のピークは５−アリルアミノ−２′−デオキシウリジ
ン−５′−三リン酸よりもリテンションタイムが遅くな
り、はっきりと区別される。純粋な目的物のピークを含
有するフラクションを回収し、セファデックスＧ−１０
により脱塩を行ない、凍結乾燥し、目的物を得た。
【００３９】実施例８． ジベレリンＡ4 −１６−カル
ボキシメトキシム−［５−（アミドアリル）−２′−デ
オキシウリジン−５′−三リン酸］−四ナトリウム塩
（ハプテン結合塩基（標識塩基））の合成 実施例５のジベレリンＡ4 −１６−カルボキシメトキシ
ム−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの反応液３
４μｌ（４μmol ）を、５−アリルアミノ−２′−デオ
キシウリジン−５′−三リン酸−四ナトリウム塩１μmo
l が溶解している０．１Ｍほう酸ナトリウム溶液（pH
８．５）０．４２mlに加え、室温で一夜放置した。
ボキシメトキシム−［５−（アミドアリル）−２′−デ
オキシウリジン−５′−三リン酸］−四ナトリウム塩
（ハプテン結合塩基（標識塩基））の合成 実施例５のジベレリンＡ4 −１６−カルボキシメトキシ
ム−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの反応液３
４μｌ（４μmol ）を、５−アリルアミノ−２′−デオ
キシウリジン−５′−三リン酸−四ナトリウム塩１μmo
l が溶解している０．１Ｍほう酸ナトリウム溶液（pH
８．５）０．４２mlに加え、室温で一夜放置した。
【００４０】実施例６と同様に、反応混合物から分離す
るには、高速イオン交換クロマトグラフィ用充填カラム
のＴＳＫゲルＤＥＡＥ−２ＳＷ（東ソー）で、０Ｍから
０．７Ｍの塩化ナトリウム溶液の直線濃度勾配を用い
て、ＨＰＬＣクロマトグラフィによって行った。目的物
のピークは５−アリルアミノ−２′−デオキシウリジン
−５′−三リン酸よりもリテンションタイムが遅くな
り、はっきりと区別される。純粋な目的物のピークを含
有するフラクションを回収し、セファデックスＧ−１０
により脱塩を行ない、凍結乾燥し、目的物を得た。次の
実施例９〜１２は標識された抗ハプテン抗体の作成に関
する。
るには、高速イオン交換クロマトグラフィ用充填カラム
のＴＳＫゲルＤＥＡＥ−２ＳＷ（東ソー）で、０Ｍから
０．７Ｍの塩化ナトリウム溶液の直線濃度勾配を用い
て、ＨＰＬＣクロマトグラフィによって行った。目的物
のピークは５−アリルアミノ−２′−デオキシウリジン
−５′−三リン酸よりもリテンションタイムが遅くな
り、はっきりと区別される。純粋な目的物のピークを含
有するフラクションを回収し、セファデックスＧ−１０
により脱塩を行ない、凍結乾燥し、目的物を得た。次の
実施例９〜１２は標識された抗ハプテン抗体の作成に関
する。
【００４１】実施例９． ジベレリンＡ3 標識ウシ血清
アルブミンの合成 ジベレリンＡ3 ３０mgをジメチルホルムアミド１５０μ
ｌに溶解し、ジメチルホルムアミド７５μｌに溶解した
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド３０mg及びジメチルホル
ムアミド７５μｌに溶解したジシクロヘキシルカルボジ
イミド３８mgと混合し、室温で３．５時間攪拌した。遠
心分離した上清を、ウシ血清アルブミン溶液（３０mg／
３ml １００mMリン酸−ナトリウム緩衝液 pH＝７．
５）に加え、氷上で２時間放置した。遠心分離後の上清
を、５０mM リン酸−ナトリウム緩衝液（pH＝７．０）
に対して透析した。これを凍結乾燥し、目的物を得た。
アルブミンの合成 ジベレリンＡ3 ３０mgをジメチルホルムアミド１５０μ
ｌに溶解し、ジメチルホルムアミド７５μｌに溶解した
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド３０mg及びジメチルホル
ムアミド７５μｌに溶解したジシクロヘキシルカルボジ
イミド３８mgと混合し、室温で３．５時間攪拌した。遠
心分離した上清を、ウシ血清アルブミン溶液（３０mg／
３ml １００mMリン酸−ナトリウム緩衝液 pH＝７．
５）に加え、氷上で２時間放置した。遠心分離後の上清
を、５０mM リン酸−ナトリウム緩衝液（pH＝７．０）
に対して透析した。これを凍結乾燥し、目的物を得た。
【００４２】実施例１０． ジベレリンＡ3 抗血清の作
成 ジベレリンＡ3 標識ウシ血清アルブミン２５mgをＰＢＳ
（Phosphate-bufferedSaline ）５mlに溶解し、これに
同量の乳化剤を加え、乳化したものをウサギ３羽に毎週
１回ずつ免疫した。７回免疫後に、全採血し、ジベレリ
ンＡ3 抗血清を得た。
成 ジベレリンＡ3 標識ウシ血清アルブミン２５mgをＰＢＳ
（Phosphate-bufferedSaline ）５mlに溶解し、これに
同量の乳化剤を加え、乳化したものをウサギ３羽に毎週
１回ずつ免疫した。７回免疫後に、全採血し、ジベレリ
ンＡ3 抗血清を得た。
【００４３】実施例１１． 抗血清から抗ジベレリンＡ
3 抗体の精製 抗血清４５mlを、同量の０．１５Ｍ ＮａＣｌで希釈し
た後、硫酸アンモニウム３４ｇ（５０％飽和量）を加え
溶解した後、４℃１時間放置した。遠心分離で集めた沈
澱を、０．０１７５Ｍ リン酸−ナトリウム緩衝液（pH
＝６．３）４５mlに溶解し、同じリン酸緩衝液に対して
透析した。これを上記緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセフ
ァセル（ファルマシア）カラム（２．５×１０cm）に通
し、素通り分画を限外濾過により濃縮した。
3 抗体の精製 抗血清４５mlを、同量の０．１５Ｍ ＮａＣｌで希釈し
た後、硫酸アンモニウム３４ｇ（５０％飽和量）を加え
溶解した後、４℃１時間放置した。遠心分離で集めた沈
澱を、０．０１７５Ｍ リン酸−ナトリウム緩衝液（pH
＝６．３）４５mlに溶解し、同じリン酸緩衝液に対して
透析した。これを上記緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセフ
ァセル（ファルマシア）カラム（２．５×１０cm）に通
し、素通り分画を限外濾過により濃縮した。
【００４４】この濃縮液を、ジベレリンＡ3 をＥＡＨ−
セファロース４Ｂ（ファルマシア）に結合させたアフィ
ニティゲルのカラム（１×１０cm）に流速７ml／ｈで流
した後、カラムを３０mlのリン酸緩衝液（０．１Ｍ pH
＝７．５）で洗浄した。つづいて、０．１％ ポリエチ
レングリコールラウリルエーテルを含む１Ｍ プロピオ
ン酸（pH＝３．５）２０mlを流し、溶出液を予め１Ｍ
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−
エタンスルホン酸（pH＝７．５）１mlずつ入れておいた
チューブ４０本に０．５mlずつ分画し、溶出分画を集
め、抗ジベレリンＡ3 抗体を得た。
セファロース４Ｂ（ファルマシア）に結合させたアフィ
ニティゲルのカラム（１×１０cm）に流速７ml／ｈで流
した後、カラムを３０mlのリン酸緩衝液（０．１Ｍ pH
＝７．５）で洗浄した。つづいて、０．１％ ポリエチ
レングリコールラウリルエーテルを含む１Ｍ プロピオ
ン酸（pH＝３．５）２０mlを流し、溶出液を予め１Ｍ
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−
エタンスルホン酸（pH＝７．５）１mlずつ入れておいた
チューブ４０本に０．５mlずつ分画し、溶出分画を集
め、抗ジベレリンＡ3 抗体を得た。
【００４５】実施例１２． アルカリフォスファターゼ
標識抗ジベレリンＡ3 抗体の作製 抗ジベレリンＡ3 抗体３mg（０．４ml）を０．１Ｍ酢酸
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH４．５）で透析し、ペプ
シン１mgを加え、３７℃で１６時間静置した。沈殿を遠
心分離により除去し、ゲルろ過（Ultrogel AcA44、１×
４５cm、０．１Ｍリン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH
＝６）後、相当する分子量付近の蛋白画分を回収し、限
外濾過により０．４mlに濃縮した。
標識抗ジベレリンＡ3 抗体の作製 抗ジベレリンＡ3 抗体３mg（０．４ml）を０．１Ｍ酢酸
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH４．５）で透析し、ペプ
シン１mgを加え、３７℃で１６時間静置した。沈殿を遠
心分離により除去し、ゲルろ過（Ultrogel AcA44、１×
４５cm、０．１Ｍリン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH
＝６）後、相当する分子量付近の蛋白画分を回収し、限
外濾過により０．４mlに濃縮した。
【００４６】これに、０．１Ｍメルカプトエチルアミン
（０．１Ｍリン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH＝６，
５mM ＥＤＴＡ）７０μｌを加え、３７℃９０分静置し
た。ゲルろ過（Ultrogel AcA44、１×４５cm、０．１Ｍ
リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH＝６，５mM ＥＤ
ＴＡ）後、相当する分子量付近の蛋白画分を回収し、限
界濾過により０．４ml、Ｆａｂ′溶液とした。
（０．１Ｍリン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH＝６，
５mM ＥＤＴＡ）７０μｌを加え、３７℃９０分静置し
た。ゲルろ過（Ultrogel AcA44、１×４５cm、０．１Ｍ
リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH＝６，５mM ＥＤ
ＴＡ）後、相当する分子量付近の蛋白画分を回収し、限
界濾過により０．４ml、Ｆａｂ′溶液とした。
【００４７】一方、アルカリホスファターゼ１mg（１０
０μｌ、３Ｍ塩化ナトリウム、１mM塩化マンガン、０．
１mM塩化亜鉛、３０mMトリエタノールアミン、pH＝７．
６、ベーリンガー）に１Ｍリン酸−水酸化ナトリウム緩
衝液（pH７）２００μｌを加え、さらに、N-sulfosucci
nimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carbox
ylate (sulfo-SMCC,５mg／２５０μｌ ＤＭＳＯ）３０
μｌを加え、３０℃６０分間静置し遠心後、ゲルろ過(S
ephadex G-25、１×１５cm、０．１Ｍリン酸−水酸化ナ
トリウム、pH６）により脱塩後、蛋白質画分を回収し、
限外濾過により０．４mlに濃縮した。
０μｌ、３Ｍ塩化ナトリウム、１mM塩化マンガン、０．
１mM塩化亜鉛、３０mMトリエタノールアミン、pH＝７．
６、ベーリンガー）に１Ｍリン酸−水酸化ナトリウム緩
衝液（pH７）２００μｌを加え、さらに、N-sulfosucci
nimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carbox
ylate (sulfo-SMCC,５mg／２５０μｌ ＤＭＳＯ）３０
μｌを加え、３０℃６０分間静置し遠心後、ゲルろ過(S
ephadex G-25、１×１５cm、０．１Ｍリン酸−水酸化ナ
トリウム、pH６）により脱塩後、蛋白質画分を回収し、
限外濾過により０．４mlに濃縮した。
【００４８】これを先のＦａｂ′溶液０．２mlと混合
し、３０℃６０分間放置し、５０mMＮ−エチルマレイミ
ド１０μｌを加え、ゲルろ過（Ultrogel AcA44、１×４
５cm、０．１Ｍリン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH＝
６．５）後、相当する分子量付近の蛋白画分を回収しア
ルカリフォスファターゼ標識抗ジベレリンＡ3 溶液とし
た。本調製は、酵素免疫法（石川栄治ら編 医学書院）
に準じて行なった。
し、３０℃６０分間放置し、５０mMＮ−エチルマレイミ
ド１０μｌを加え、ゲルろ過（Ultrogel AcA44、１×４
５cm、０．１Ｍリン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH＝
６．５）後、相当する分子量付近の蛋白画分を回収しア
ルカリフォスファターゼ標識抗ジベレリンＡ3 溶液とし
た。本調製は、酵素免疫法（石川栄治ら編 医学書院）
に準じて行なった。
【００４９】実施例１３． ジベレリンＡ4 標識検出プ
ローブ（標識体混合比３５％）の作製 この実施例においては所定の塩基配列をもったサンプル
ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）を鋳型として、プローブＤＮＡ
を作製した。ｐＢＲ３２２（１μｇ／μｌ、宝酒造）８
μｌ、ＨｉｎｄIII （宝酒造）８μｌ、bufferM ×１０
（宝酒造）６．４μｌ、水５７．６μｌを混合し、３７
℃６０分間放置後、フェノール／クロロホルム８０μｌ
を加え、遠心分離後上清を回収する洗浄操作を２回行っ
た。３Ｍ酢酸ナトリウム（pH９）８μｌ、冷エタノール
２４０μｌを加え、−７０℃６０分間放置し、遠心分離
後上清を除去し、沈殿に冷７０％エタノール１００μｌ
を加え、遠心分離後沈殿を真空乾燥した。
ローブ（標識体混合比３５％）の作製 この実施例においては所定の塩基配列をもったサンプル
ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）を鋳型として、プローブＤＮＡ
を作製した。ｐＢＲ３２２（１μｇ／μｌ、宝酒造）８
μｌ、ＨｉｎｄIII （宝酒造）８μｌ、bufferM ×１０
（宝酒造）６．４μｌ、水５７．６μｌを混合し、３７
℃６０分間放置後、フェノール／クロロホルム８０μｌ
を加え、遠心分離後上清を回収する洗浄操作を２回行っ
た。３Ｍ酢酸ナトリウム（pH９）８μｌ、冷エタノール
２４０μｌを加え、−７０℃６０分間放置し、遠心分離
後上清を除去し、沈殿に冷７０％エタノール１００μｌ
を加え、遠心分離後沈殿を真空乾燥した。
【００５０】水１００μｌを加え、９５℃１０分間加熱
し、氷冷後ヘキサヌクレオチド（ベーリンガー）６μ
ｌ、ＧＡ4 標識混合液［０．２６mM ジベレリンＡ4 −
１６−カルボキシメトキシム−［５−（アミドアリル）
−２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸］−四ナト
リウム塩２７μｌ、１０mMデオキシグアノシン−５′−
三リン酸２μｌ、１０mM デオキシアデノシン−５′−
三リン酸２μｌ、１０mMデオキシシチジン−５′−三リ
ン酸２μｌ、６．７mM デオキシチミジン−５′−三リ
ン酸２μｌ］９μｌ、クレノーエンザイム（ベーリンガ
ー）３μｌを加え、３７℃１０時間放置後、０．２Ｍ
ＥＤＴＡ（pH８）６μｌ、３Ｍ塩化リチウム６μｌ、冷
エタノール３６０μｌを加え、−７０℃６０分間放置
し、遠心分離後上清を除去し、沈殿に冷７０％エタノー
ル１００μｌを加え、遠心分離後沈殿を真空乾燥し、目
的物を得た。
し、氷冷後ヘキサヌクレオチド（ベーリンガー）６μ
ｌ、ＧＡ4 標識混合液［０．２６mM ジベレリンＡ4 −
１６−カルボキシメトキシム−［５−（アミドアリル）
−２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸］−四ナト
リウム塩２７μｌ、１０mMデオキシグアノシン−５′−
三リン酸２μｌ、１０mM デオキシアデノシン−５′−
三リン酸２μｌ、１０mMデオキシシチジン−５′−三リ
ン酸２μｌ、６．７mM デオキシチミジン−５′−三リ
ン酸２μｌ］９μｌ、クレノーエンザイム（ベーリンガ
ー）３μｌを加え、３７℃１０時間放置後、０．２Ｍ
ＥＤＴＡ（pH８）６μｌ、３Ｍ塩化リチウム６μｌ、冷
エタノール３６０μｌを加え、−７０℃６０分間放置
し、遠心分離後上清を除去し、沈殿に冷７０％エタノー
ル１００μｌを加え、遠心分離後沈殿を真空乾燥し、目
的物を得た。
【００５１】実施例１４． 標識率の検出感度への影響
の比較 本発明のプローブＤＮＡとＤＩＧのプローブＤＮＡ（比
較例）とを各種の標識体混合比で作製し、サンプルＤＮ
Ａの検出感度試験を行なった。ｐＢＲ３２２を９５℃で
１０分間熱変性させた後、ＤＮＡ希釈バッファ（５０μ
ｇ／μｌ サケ***ＤＮＡ、１０mM トリス−塩酸、１
mM ＥＤＴＡ、pH８）で０．０５pg／２μｌ、０．１pg
／２μｌ、０．２pg／２μｌ、０．５pg／２μｌ、１pg
／２μｌ、１０pg／２μｌ溶液とし、１０枚のナイロン
膜上にそれぞれスポットした。５分間ＵＶ照射して、Ｄ
ＮＡを膜に固定後、ハイブリダイゼーション溶液（０．
５％ ブロッキング試薬（ベーリンガー）、０．１％
Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％ ＳＤＳ、０．７
５Ｍ 塩化ナトリウム、７５mMクエン酸、pH７）に浸
し、６８℃４時間振盪した。
の比較 本発明のプローブＤＮＡとＤＩＧのプローブＤＮＡ（比
較例）とを各種の標識体混合比で作製し、サンプルＤＮ
Ａの検出感度試験を行なった。ｐＢＲ３２２を９５℃で
１０分間熱変性させた後、ＤＮＡ希釈バッファ（５０μ
ｇ／μｌ サケ***ＤＮＡ、１０mM トリス−塩酸、１
mM ＥＤＴＡ、pH８）で０．０５pg／２μｌ、０．１pg
／２μｌ、０．２pg／２μｌ、０．５pg／２μｌ、１pg
／２μｌ、１０pg／２μｌ溶液とし、１０枚のナイロン
膜上にそれぞれスポットした。５分間ＵＶ照射して、Ｄ
ＮＡを膜に固定後、ハイブリダイゼーション溶液（０．
５％ ブロッキング試薬（ベーリンガー）、０．１％
Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％ ＳＤＳ、０．７
５Ｍ 塩化ナトリウム、７５mMクエン酸、pH７）に浸
し、６８℃４時間振盪した。
【００５２】標識体混合比を、２０％、３５％、５０
％、７５％、１００％としたものを、実施例１３の方法
に従い調製し、また、実施例１３においてＧＡ4 標識混
合液のジベレリンＡ4 −１６−カルボキシメトキシム−
［５−（アミドアリル）−２′−デオキシウリジン−
５′−三リン酸］−四ナトリウム塩をジゴキシゲニン−
１１−ウリジン−５′−三リン酸（ベーリンガー）に置
き換え、標識体混合比を、２０％、３５％、５０％、７
５％、１００％としたものを調製した。
％、７５％、１００％としたものを、実施例１３の方法
に従い調製し、また、実施例１３においてＧＡ4 標識混
合液のジベレリンＡ4 −１６−カルボキシメトキシム−
［５−（アミドアリル）−２′−デオキシウリジン−
５′−三リン酸］−四ナトリウム塩をジゴキシゲニン−
１１−ウリジン−５′−三リン酸（ベーリンガー）に置
き換え、標識体混合比を、２０％、３５％、５０％、７
５％、１００％としたものを調製した。
【００５３】これら１０種の溶液をハイブリダイゼーシ
ョン溶液で２６ng／mlとし、前記の１０枚のナイロン膜
をそれぞれに浸し、６８℃で６時間振とうした。０．３
Ｍ塩化ナトリウム、３０mM クエン酸（pH７）で室温５
分間２回洗浄、１５mM 塩化ナトリウム、１．５mM ク
エン酸（pH７）で６８℃１５分間２回洗浄後、ジベレリ
ンＡ4 標識ＤＮＡを固定したナイロン膜は、実施例１２
と同様の方法で作成したアルカリフォスファターゼ標識
抗ジベレリンＡ4 抗体（０．２μｇ／ml、０．１Ｍ ト
リス−ＨＣ１、０．１５Ｍ ＮａＣ１、pH７．５）に浸
し、ＤＩＧ標識ＤＮＡを固定したナイロン膜は、アルカ
リフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ベーリンガー、
０．２μｇ／ml、０．１Ｍ トリス−ＨＣ１、０．１５
Ｍ ＮａＣ１、pH７．５）に浸し、３０分間室温振盪し
た。
ョン溶液で２６ng／mlとし、前記の１０枚のナイロン膜
をそれぞれに浸し、６８℃で６時間振とうした。０．３
Ｍ塩化ナトリウム、３０mM クエン酸（pH７）で室温５
分間２回洗浄、１５mM 塩化ナトリウム、１．５mM ク
エン酸（pH７）で６８℃１５分間２回洗浄後、ジベレリ
ンＡ4 標識ＤＮＡを固定したナイロン膜は、実施例１２
と同様の方法で作成したアルカリフォスファターゼ標識
抗ジベレリンＡ4 抗体（０．２μｇ／ml、０．１Ｍ ト
リス−ＨＣ１、０．１５Ｍ ＮａＣ１、pH７．５）に浸
し、ＤＩＧ標識ＤＮＡを固定したナイロン膜は、アルカ
リフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ベーリンガー、
０．２μｇ／ml、０．１Ｍ トリス−ＨＣ１、０．１５
Ｍ ＮａＣ１、pH７．５）に浸し、３０分間室温振盪し
た。
【００５４】トリスバッファ（０．１Ｍ トリス−ＨＣ
１、０．１５Ｍ ＮａＣ１、pH７．５）に浸し、１５分
間２回振盪洗浄後、ナイロン膜を発色試薬［４−Nitrob
luetetrazoliumchloride （ベーリンガー）４５μｌ、5
-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate（ベーリンガ
ー）３５μｌ、０．１Ｍ トリス−ＨＣ１、０．１ＭＮ
ａＣ１、０．０５Ｍ ＭｇＣ１2 、pH９．５、１０ml］
に浸し、２０時間暗所放置した。ナイロン膜を水で洗浄
乾燥後、発色したスポットを目視により検出した。その
結果に基づく最高検出感度を、表１に示す。
１、０．１５Ｍ ＮａＣ１、pH７．５）に浸し、１５分
間２回振盪洗浄後、ナイロン膜を発色試薬［４−Nitrob
luetetrazoliumchloride （ベーリンガー）４５μｌ、5
-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate（ベーリンガ
ー）３５μｌ、０．１Ｍ トリス−ＨＣ１、０．１ＭＮ
ａＣ１、０．０５Ｍ ＭｇＣ１2 、pH９．５、１０ml］
に浸し、２０時間暗所放置した。ナイロン膜を水で洗浄
乾燥後、発色したスポットを目視により検出した。その
結果に基づく最高検出感度を、表１に示す。
【００５５】
【表１】 表１により、ＤＩＧ標識ＤＮＡでは標識体混合比により
その最高検出感度がばらつくが、ジベレリン標識ＤＮＡ
では常にほぼ一定であることがわかる。
その最高検出感度がばらつくが、ジベレリン標識ＤＮＡ
では常にほぼ一定であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の実施例における物質の系統図
である。
である。
【図２】図２は、本発明の実施例における物質の系統図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 浅見 修 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 内山 裕子 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 杉山 英彦 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 藤田 聡 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内 (72)発明者 山本 ▲たけ▼萬 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内 (72)発明者 鍵山 直人 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内 (72)発明者 籾山 政慶 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内 (72)発明者 近藤 恭光 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内
Claims (2)
- 【請求項１】 固定用担体上に存在する検出すべき核酸
と、その核酸の少なくとも一部の塩基配列に相補的なプ
ローブＤＮＡとのハイブリッド形成を利用した核酸の検
出方法において、前記プローブＤＮＡはリンカーを介し
て結合しているハプテンを有しており、そのハプテンは
ジベレリンまたはジベレリン誘導体であり、検出すべき
核酸とプローブＤＮＡとの反応によるハイブリッド形成
に続いて、未反応のプローブＤＮＡを排除した後、標識
された抗ハプテン抗体を前記ハイブリッドのプローブＤ
ＮＡに結合させ、前記標識を利用して前記核酸を検出す
ることを特徴とする核酸検出方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の標識された抗ハプテン
抗体の使用に代え、抗ハプテン抗体と、その抗ハプテン
抗体に特異的に結合する能力を持つと共にそれ自体が標
識された抗体とを使用することを特徴とする核酸検出方
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06237627A JP3093116B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | 核酸検出方法 |
| EP96105091A EP0798387B1 (en) | 1994-09-30 | 1996-03-29 | Method of detecting nucleic acid |
| US08/624,116 US5728531A (en) | 1994-09-30 | 1996-03-29 | Method of detecting nucleic acid |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06237627A JP3093116B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | 核酸検出方法 |
| EP96105091A EP0798387B1 (en) | 1994-09-30 | 1996-03-29 | Method of detecting nucleic acid |
| US08/624,116 US5728531A (en) | 1994-09-30 | 1996-03-29 | Method of detecting nucleic acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0889296A true JPH0889296A (ja) | 1996-04-09 |
| JP3093116B2 JP3093116B2 (ja) | 2000-10-03 |
Family
ID=27237282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06237627A Expired - Fee Related JP3093116B2 (ja) | 1994-09-30 | 1994-09-30 | 核酸検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5728531A (ja) |
| EP (1) | EP0798387B1 (ja) |
| JP (1) | JP3093116B2 (ja) |
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| JP2001526045A (ja) * | 1997-12-12 | 2001-12-18 | ダイジーン・コーポレーション | ヒトパピローマウイルス関連疾患の評価 |
| US7439016B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-10-21 | Digene Corporation | Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method |
| US7601497B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-10-13 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method |
| JP2012506705A (ja) | 2008-10-27 | 2012-03-22 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 迅速に結果を得るハイブリッドキャプチャー法による分析およびシステム |
| JP6108661B2 (ja) * | 2009-01-28 | 2017-04-05 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 配列特異的な大量試料調製方法およびアッセイ法 |
| JP5738278B2 (ja) * | 2009-05-01 | 2015-06-24 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 試料中のｒｎａスプライシング形態を検出するための非標的増幅法 |
| JP5826752B2 (ja) | 2009-09-14 | 2015-12-02 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法 |
| US9605303B2 (en) | 2010-01-29 | 2017-03-28 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample |
| ES2615728T3 (es) | 2010-01-29 | 2017-06-08 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Métodos y composiciones para una purificación y un análisis múltiple específico de secuencia de ácidos nucleicos |
| CA2799200A1 (en) | 2010-05-19 | 2011-11-24 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
| JP6153866B2 (ja) | 2010-05-25 | 2017-06-28 | キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． | 迅速なハイブリッド捕捉アッセイ、及び関連する戦略的に切断されたプローブ |
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| CN110441518B (zh) * | 2019-07-17 | 2022-10-18 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测赤霉素的试纸条及方法 |
| CN114249705A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-03-29 | 苏州快捷康生物技术有限公司 | 一种赤霉素半抗原与抗原的制备及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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