JPH0862222A - 光化学反応による、ボロン酸基を有する化合物の担体への共有結合方法と、ボロン酸基を有する担体を用いたグリコヘモグロビンの分画定量方法、およびLymphokine Activated Killer様活性およびEffector Cellの誘導方法。 - Google Patents
光化学反応による、ボロン酸基を有する化合物の担体への共有結合方法と、ボロン酸基を有する担体を用いたグリコヘモグロビンの分画定量方法、およびLymphokine Activated Killer様活性およびEffector Cellの誘導方法。Info
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- JPH0862222A JPH0862222A JP23015494A JP23015494A JPH0862222A JP H0862222 A JPH0862222 A JP H0862222A JP 23015494 A JP23015494 A JP 23015494A JP 23015494 A JP23015494 A JP 23015494A JP H0862222 A JPH0862222 A JP H0862222A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】(1)光化学反応による、ボロン酸基を有する
化合物の担体への共有結合方法を提供する。 (2)光化学反応により、ボロン酸基を有する化合物を
共有結合させた担体を用いた、グリコヘモダロビンの分
画定量方法、およびLymphokine Activ
ated Killer様活性およびEffector
Cellの誘導方法を提供する。 (3)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用い
た、グリコヘモグロビンの分画定量方法、およびLym
phokine Activated Killer様
活性およびEffector Cellの誘導方法を提
供する。 【構成】光化学反応により、ボロン酸基を有する化合物
を共有結合させた担体、側鎖にボロン酸基を有する高分
子化合物、および測定試薬よりなる。
化合物の担体への共有結合方法を提供する。 (2)光化学反応により、ボロン酸基を有する化合物を
共有結合させた担体を用いた、グリコヘモダロビンの分
画定量方法、およびLymphokine Activ
ated Killer様活性およびEffector
Cellの誘導方法を提供する。 (3)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用い
た、グリコヘモグロビンの分画定量方法、およびLym
phokine Activated Killer様
活性およびEffector Cellの誘導方法を提
供する。 【構成】光化学反応により、ボロン酸基を有する化合物
を共有結合させた担体、側鎖にボロン酸基を有する高分
子化合物、および測定試薬よりなる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、第一に、ボロン酸基を
有する化合物を光化学反応により不溶性担体に共有結合
する方法に関する。本発明は第二に、当該担体を用い
た、グリコヘモグロビンの分画定量方法およびLymp
hokine Activated Killer様活
性およびEffector Cellの誘導方法に関す
る。本発明は第三に、側鎖にボロン酸基を有する高分子
化合物を用いた、グリコヘモグロビンの分画定量方法お
よびLymphokine Activated Ki
ller様活性およびEffector Cellの誘
導方法に関する。
有する化合物を光化学反応により不溶性担体に共有結合
する方法に関する。本発明は第二に、当該担体を用い
た、グリコヘモグロビンの分画定量方法およびLymp
hokine Activated Killer様活
性およびEffector Cellの誘導方法に関す
る。本発明は第三に、側鎖にボロン酸基を有する高分子
化合物を用いた、グリコヘモグロビンの分画定量方法お
よびLymphokine Activated Ki
ller様活性およびEffector Cellの誘
導方法に関する。
【0002】(i)ボロン酸基を有する化合物を共有結
合させた不溶性担体を用いたグリコヘモダロビンの分画
定量方法 末梢血中のグルコースは、ヘモグロビンA(HbA0)
のベータ鎖のN末端とシッフ結合することにより、不安
定なアルジミン(pre−HbAlc)となる。この反
応は可逆反応で、生成したアルジミンが元のグルコース
とヘモグロビンA(HbA0)に分解する場合と、アル
ジミンが更にアマドリ転換し、安定なケトアミン(Hb
Alc)になる場合がある。現在、グリコヘモグロビン
(HbAlc)値が、糖病の血糖コソトロールの指標と
して有用であると認識され、臨床領域で広く利用されて
いる。血液中には、へモグロビンA(HbA0)、アル
ジミン(pre−HbAlc)、グリコヘモグロビン
(HbAlc)が存在し、この内、アルジミン(pre
−HbAlc)は、採血時の血糖値、採血後のグルコー
スの消費等の原因により、値が変動し易い為、グリコヘ
モグロビン(HbAlc)のみを分別定量することが望
まれている。グリコヘモダロビン(HbAlc)の定量
方法には、エレクトロフォーカシング法、比色法、アフ
ィニティークロマトグラフィー法、HPLC法、EIA
法等がある。現在汎用されているHPLC法には、 (1)アルジミン(pre−HbAlc)とグリコヘモ
グロビン(HbAlc)とが混在する検体をクロマト処
理時間を長くすることにより、両者を分離する方法。 (2)検体の前処理により、アルジミン(pre−Hb
Alc)を除去し、クロマト処理時間を短縮する方法。 がある。アルジミン(pre−HbAlc)の除去方法
には、 (a)赤血球にグルコースを消費させ、アルジミン(p
re−HbAlc)を分解する方法。 (b)グルコースを受け取る物質を添加し、アルジミン
(pre−HbAlc)を分解する方法。 (c)強力なアロステリックエフェクターを添加し、可
逆的に結合しているグルコースを追い出し、アルジミン
(pre−HbAlc) を分解する方法。 がある。この様に、HPLC法は汎用されてはいるが、
高価な機器の購入が必要であり、煩雑な前処理が必須で
あること、1時間当たりの処理検体数が少ないこと等、
解決すべき問題が多い。アフィニティークロマトグラフ
ィー法の測定操作は、 (1)資料調製液で調製した検体を3−アミノフェニル
ボロン酸を固定化したアガロースを充填したヵラムに添
加L、グリコヘモグロビン(HbAlc)のcis−ジ
オール基とアガロースに結合した3−アミノフェニルボ
ロン酸と五員環を形成させる。 (2)緩衝液でアガロースを洗浄することにより、グリ
コヘモグロビン(HbAlc)以外のヘモグロビンを流
出させる。 (3)溶出用緩衝液でグリコヘモグロビン(HbAl
c)を溶出させる。 (4)グリコヘモグロビン(HbAlc)画分の吸光
度、非グリコヘモグロビン(HbAlc)画分の吸光度
を測定する。 (5)計算によりグリコヘモグロビン(HbAlc)量
を算出する。 であり、 (1)正確で特異性の高い測定値が得られる。 (2)アルジミン(pre−HbAlc)の影響がな
い。 (3)胎児性ヘモグロビン(HbF)、異常ヘモグロビ
ン(HbS,HbC)の影響がない。 という特長がある。しかしながら、アフィニティークロ
マトダラフィーを用いる方法である為、測定操作を自動
化させることが困難であるという難点がある。本発明の
発明者は、既に、グルタルアルデヒド法およびアミド化
法により、担体に3−アミノフェニルボロン酸を共有結
合させた不溶性担体を用いたグリコヘモグロビン(Hb
Alc)の定量方法を発明し、出願に及んでいる。今
回、本発明の発明者は、光反応により、ボロン酸基を有
する化合物を担体に共有結合させる方法と、側鎖にボロ
ン酸基を有する高分子化合物を用いたグリコヘモグロビ
ン(HbAlc)の定量方法を考案し出願に及んだ。
合させた不溶性担体を用いたグリコヘモダロビンの分画
定量方法 末梢血中のグルコースは、ヘモグロビンA(HbA0)
のベータ鎖のN末端とシッフ結合することにより、不安
定なアルジミン(pre−HbAlc)となる。この反
応は可逆反応で、生成したアルジミンが元のグルコース
とヘモグロビンA(HbA0)に分解する場合と、アル
ジミンが更にアマドリ転換し、安定なケトアミン(Hb
Alc)になる場合がある。現在、グリコヘモグロビン
(HbAlc)値が、糖病の血糖コソトロールの指標と
して有用であると認識され、臨床領域で広く利用されて
いる。血液中には、へモグロビンA(HbA0)、アル
ジミン(pre−HbAlc)、グリコヘモグロビン
(HbAlc)が存在し、この内、アルジミン(pre
−HbAlc)は、採血時の血糖値、採血後のグルコー
スの消費等の原因により、値が変動し易い為、グリコヘ
モグロビン(HbAlc)のみを分別定量することが望
まれている。グリコヘモダロビン(HbAlc)の定量
方法には、エレクトロフォーカシング法、比色法、アフ
ィニティークロマトグラフィー法、HPLC法、EIA
法等がある。現在汎用されているHPLC法には、 (1)アルジミン(pre−HbAlc)とグリコヘモ
グロビン(HbAlc)とが混在する検体をクロマト処
理時間を長くすることにより、両者を分離する方法。 (2)検体の前処理により、アルジミン(pre−Hb
Alc)を除去し、クロマト処理時間を短縮する方法。 がある。アルジミン(pre−HbAlc)の除去方法
には、 (a)赤血球にグルコースを消費させ、アルジミン(p
re−HbAlc)を分解する方法。 (b)グルコースを受け取る物質を添加し、アルジミン
(pre−HbAlc)を分解する方法。 (c)強力なアロステリックエフェクターを添加し、可
逆的に結合しているグルコースを追い出し、アルジミン
(pre−HbAlc) を分解する方法。 がある。この様に、HPLC法は汎用されてはいるが、
高価な機器の購入が必要であり、煩雑な前処理が必須で
あること、1時間当たりの処理検体数が少ないこと等、
解決すべき問題が多い。アフィニティークロマトグラフ
ィー法の測定操作は、 (1)資料調製液で調製した検体を3−アミノフェニル
ボロン酸を固定化したアガロースを充填したヵラムに添
加L、グリコヘモグロビン(HbAlc)のcis−ジ
オール基とアガロースに結合した3−アミノフェニルボ
ロン酸と五員環を形成させる。 (2)緩衝液でアガロースを洗浄することにより、グリ
コヘモグロビン(HbAlc)以外のヘモグロビンを流
出させる。 (3)溶出用緩衝液でグリコヘモグロビン(HbAl
c)を溶出させる。 (4)グリコヘモグロビン(HbAlc)画分の吸光
度、非グリコヘモグロビン(HbAlc)画分の吸光度
を測定する。 (5)計算によりグリコヘモグロビン(HbAlc)量
を算出する。 であり、 (1)正確で特異性の高い測定値が得られる。 (2)アルジミン(pre−HbAlc)の影響がな
い。 (3)胎児性ヘモグロビン(HbF)、異常ヘモグロビ
ン(HbS,HbC)の影響がない。 という特長がある。しかしながら、アフィニティークロ
マトダラフィーを用いる方法である為、測定操作を自動
化させることが困難であるという難点がある。本発明の
発明者は、既に、グルタルアルデヒド法およびアミド化
法により、担体に3−アミノフェニルボロン酸を共有結
合させた不溶性担体を用いたグリコヘモグロビン(Hb
Alc)の定量方法を発明し、出願に及んでいる。今
回、本発明の発明者は、光反応により、ボロン酸基を有
する化合物を担体に共有結合させる方法と、側鎖にボロ
ン酸基を有する高分子化合物を用いたグリコヘモグロビ
ン(HbAlc)の定量方法を考案し出願に及んだ。
【0003】(ii)ボロソ酸基を有する化合物を固定
化した担体を用いたリンパ球の活性化 を疫担当細胞を刺激して、Lymphokine Ac
tivated Killer(LAK)細胞を誘導す
る養子免疫療法が知られている。LAK細胞は、Cla
ssical NK細胞に抵抗性を示す腫瘍細胞のみな
らず、自己の新鮮腫瘍細胞に対しても細胞障害性を示
し、広いスペクトラムを持つKiller細胞であるこ
とが示されている。しかしながらLAK療法には、過剰
に投与するr−IL−2による体内貯留、長時間のin
vitro培養により異物化、大型化したリンパ球に
よる肺動脈閉塞、煩雑な操作手順による感染の問題があ
る。今回、本発明の発明者は、光化学反応によりボロソ
酸基を有する化合物を共有結合させた担体を用いて、i
n vitroで免疫担当細胞と共に培養する方法およ
び、側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用いて、
in vitroで免疫担当細胞と共に培養する方法
が、共に、リガンドであるボロン酸基を有する化合物の
剥離の問題を克服することが可能であることを見い出
し、出願に及んだ。
化した担体を用いたリンパ球の活性化 を疫担当細胞を刺激して、Lymphokine Ac
tivated Killer(LAK)細胞を誘導す
る養子免疫療法が知られている。LAK細胞は、Cla
ssical NK細胞に抵抗性を示す腫瘍細胞のみな
らず、自己の新鮮腫瘍細胞に対しても細胞障害性を示
し、広いスペクトラムを持つKiller細胞であるこ
とが示されている。しかしながらLAK療法には、過剰
に投与するr−IL−2による体内貯留、長時間のin
vitro培養により異物化、大型化したリンパ球に
よる肺動脈閉塞、煩雑な操作手順による感染の問題があ
る。今回、本発明の発明者は、光化学反応によりボロソ
酸基を有する化合物を共有結合させた担体を用いて、i
n vitroで免疫担当細胞と共に培養する方法およ
び、側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用いて、
in vitroで免疫担当細胞と共に培養する方法
が、共に、リガンドであるボロン酸基を有する化合物の
剥離の問題を克服することが可能であることを見い出
し、出願に及んだ。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、 (1)ボロン酸基を有する化合物を光化学反応により共
有結合させた不溶性担体 (2)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物 を提供することにより、従来法であるグルタルアルデヒ
ド法、アミド化法の欠点であるリガンド(ボロン酸基を
有する化合物)の剥離の問題のない、グリコヘモダロビ
ンの分画定量方法およびLymphokine Act
ivated Killer様活性およびEffect
or Cellの誘導方法を提供することに関する。
有結合させた不溶性担体 (2)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物 を提供することにより、従来法であるグルタルアルデヒ
ド法、アミド化法の欠点であるリガンド(ボロン酸基を
有する化合物)の剥離の問題のない、グリコヘモダロビ
ンの分画定量方法およびLymphokine Act
ivated Killer様活性およびEffect
or Cellの誘導方法を提供することに関する。
【0005】
【課題を解決するための手段】従来の担体へのリガンド
の固定化方法には、 1)リガンドが部分的な修飾を受けることにより、リガ
ンドの高次構造や活性中心等が部分的に破壊される恐れ
がある。 2)リガンドの自由な動きが制限されることにより、被
検検体との相互作用が起こりにくくなり、その結果リガ
ンドの活性の低下が起こる。 3)リガンドに優れた活性と安定性を与える固定化条件
を見つけることが困難である。 4)リガンドを非特異吸着により固定化した場合には、
リガンドが剥離し易い。 等の欠点があった。一方、フェニルアジド基は、紫外線
照射により高反応性の中間体であるナイトレンを経由
し、近傍の炭素等と共有結合することが知られている
(吉本薫:フォトポリマーハンドブック:工業調査会1
989)。また、人工臓器に生体適合性を付与する方法
として、材料表面の改質方法(特願、平2−20657
3)が知られている。同方法は、デバイスの表面にアジ
ド基を介して、アルブミン等の蛋白質を共有結合させる
ことにより、生体適合性を付与する方法である。
の固定化方法には、 1)リガンドが部分的な修飾を受けることにより、リガ
ンドの高次構造や活性中心等が部分的に破壊される恐れ
がある。 2)リガンドの自由な動きが制限されることにより、被
検検体との相互作用が起こりにくくなり、その結果リガ
ンドの活性の低下が起こる。 3)リガンドに優れた活性と安定性を与える固定化条件
を見つけることが困難である。 4)リガンドを非特異吸着により固定化した場合には、
リガンドが剥離し易い。 等の欠点があった。一方、フェニルアジド基は、紫外線
照射により高反応性の中間体であるナイトレンを経由
し、近傍の炭素等と共有結合することが知られている
(吉本薫:フォトポリマーハンドブック:工業調査会1
989)。また、人工臓器に生体適合性を付与する方法
として、材料表面の改質方法(特願、平2−20657
3)が知られている。同方法は、デバイスの表面にアジ
ド基を介して、アルブミン等の蛋白質を共有結合させる
ことにより、生体適合性を付与する方法である。
【0006】本発明の発明者は、このフェニルアジド基
の紫外線照射法を、ボロン酸基を有する化合物の強固な
結合に応用すること、更に、側鎖にボロン酸基を有する
高分子化合物をグリコヘモグロビンの分画定量に用いる
ことを考案した。即ち、本発明の発明者は、グリコヘモ
グロビンの分画定量およびLymphokine Ac
tivated Killer様活性およびEffec
tor Cellの誘導方法について鋭意検討した結
果、 1)不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗布
した後、ボロン酸基を有する化合物を塗布し、更に光を
照射することからなるホロン酸基を有する化合物の共有
結合方法。 2)不溶性担体の表面に0−ニトロベンジルエステル基
を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカル
ボキシル基を生成させ、更に、水溶性縮合剤を用いて、
ボロン酸基を有する化合物を化学結合させる方法とから
なるボロン酸基を有する化合物の共有結合方法。 3)緩衝液中でp−azidobenzoyloxy
succinimideと反応させることにより、フェ
ニルアジド基を導入したボロン酸基を有する化合物を被
固定化担体に塗布した後、更に光を照射することことか
らなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結合方法。 によりリガンドであるボロン酸基を有する化合物を担体
に容易に、強固に共有結合できることを発見し、本発明
を完成した。本発明の発明者は更に、 4)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用いて、
グリコヘモグロビンを分画定量する方法。 5)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢血
リンパ球とをin vitrにより培養し、Lymph
okine Activated Killer様活性
およびEffect Cellを誘導する方法。 6)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢血
リンパ球とリンホカインとをin vitroにより培
養し、Lymphokine Activated K
iller様活性およびEffector Cellを
誘導する方法。 が、グリコヘモグロビンの分画定量およびLympho
kine Activated Killer様活性お
よびEffector Cel1の誘導に極めて有効で
あることを見い出した。
の紫外線照射法を、ボロン酸基を有する化合物の強固な
結合に応用すること、更に、側鎖にボロン酸基を有する
高分子化合物をグリコヘモグロビンの分画定量に用いる
ことを考案した。即ち、本発明の発明者は、グリコヘモ
グロビンの分画定量およびLymphokine Ac
tivated Killer様活性およびEffec
tor Cellの誘導方法について鋭意検討した結
果、 1)不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗布
した後、ボロン酸基を有する化合物を塗布し、更に光を
照射することからなるホロン酸基を有する化合物の共有
結合方法。 2)不溶性担体の表面に0−ニトロベンジルエステル基
を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカル
ボキシル基を生成させ、更に、水溶性縮合剤を用いて、
ボロン酸基を有する化合物を化学結合させる方法とから
なるボロン酸基を有する化合物の共有結合方法。 3)緩衝液中でp−azidobenzoyloxy
succinimideと反応させることにより、フェ
ニルアジド基を導入したボロン酸基を有する化合物を被
固定化担体に塗布した後、更に光を照射することことか
らなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結合方法。 によりリガンドであるボロン酸基を有する化合物を担体
に容易に、強固に共有結合できることを発見し、本発明
を完成した。本発明の発明者は更に、 4)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用いて、
グリコヘモグロビンを分画定量する方法。 5)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢血
リンパ球とをin vitrにより培養し、Lymph
okine Activated Killer様活性
およびEffect Cellを誘導する方法。 6)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢血
リンパ球とリンホカインとをin vitroにより培
養し、Lymphokine Activated K
iller様活性およびEffector Cellを
誘導する方法。 が、グリコヘモグロビンの分画定量およびLympho
kine Activated Killer様活性お
よびEffector Cel1の誘導に極めて有効で
あることを見い出した。
【0007】
【発名の効果】本発明は、 (a)不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗
布した後、ボロン酸基を有する化合物を塗布し、更に光
を照射することからなる、ボロン酸基を有する化合物の
共有結合方法。 (b)不溶性担体の表面に0−ニトロベンジルエステル
基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカ
ルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を用いてボ
ロン酸基を有する化令物を化学結合させる方法とからな
るボロン酸基を有する化合物の共有結合方法 (c)緩衝液中で p−azidobenzoylox
y succinimideと反応させることにより、
フェニルアジド基を導入したボロン酸基を有する化合物
を被固定化担体に塗布した後、更に光を照射することこ
とからなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結合方
法。 (d)(a)または、(b)または、(c)の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合したことを特
徴とする、不溶性担体および実験器具。 (e)(a)または、(b)または、(c)の方法によ
り調製した不溶性担体を用いて、グリコヘモグロビンを
分画定量する方法。 (f)(a)または、(b)または、(c)の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合した不溶性担
体と、末梢血リンパ球とリンホカインとをinvitr
oにより培養し、Lymphokine Activa
ted Killer様活性を誘導する方法。 (g)(a)または、(b)または、(c)の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合した不溶性担
体と、末梢血リンパ球とをin vitroにより培養
し、Effector Cellを誘導する方法。 (h)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用い
て、グリコヘモグロビンを分画定量する方法。 (j)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢
血リンパ球とリンホカインとをin vitroにより
培養し、Lymphokine Activated
Killer様活性を誘導する方法。 (i)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢
血リンパ球とをinvitroにより培養し、Effe
ctor Cellを誘導する方法。 よりなる。本発明に関わる共有結合方法により、ボロン
酸基を有する化合物の活性を失うことなく、ボロン酸基
を有する化合物を容易に、堅固に共有結合することが可
能になる。また、本発明に関わる共有結合方法により、
ボロン酸基を有する化合物を共有結合Lた実験器具か
ら、ボロン酸基を有する化合物を剥離させることなく、
グリコヘモダロビンを分画定量することや、リンパ球を
活性化することが可能となる。
布した後、ボロン酸基を有する化合物を塗布し、更に光
を照射することからなる、ボロン酸基を有する化合物の
共有結合方法。 (b)不溶性担体の表面に0−ニトロベンジルエステル
基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカ
ルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を用いてボ
ロン酸基を有する化令物を化学結合させる方法とからな
るボロン酸基を有する化合物の共有結合方法 (c)緩衝液中で p−azidobenzoylox
y succinimideと反応させることにより、
フェニルアジド基を導入したボロン酸基を有する化合物
を被固定化担体に塗布した後、更に光を照射することこ
とからなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結合方
法。 (d)(a)または、(b)または、(c)の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合したことを特
徴とする、不溶性担体および実験器具。 (e)(a)または、(b)または、(c)の方法によ
り調製した不溶性担体を用いて、グリコヘモグロビンを
分画定量する方法。 (f)(a)または、(b)または、(c)の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合した不溶性担
体と、末梢血リンパ球とリンホカインとをinvitr
oにより培養し、Lymphokine Activa
ted Killer様活性を誘導する方法。 (g)(a)または、(b)または、(c)の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合した不溶性担
体と、末梢血リンパ球とをin vitroにより培養
し、Effector Cellを誘導する方法。 (h)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用い
て、グリコヘモグロビンを分画定量する方法。 (j)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢
血リンパ球とリンホカインとをin vitroにより
培養し、Lymphokine Activated
Killer様活性を誘導する方法。 (i)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢
血リンパ球とをinvitroにより培養し、Effe
ctor Cellを誘導する方法。 よりなる。本発明に関わる共有結合方法により、ボロン
酸基を有する化合物の活性を失うことなく、ボロン酸基
を有する化合物を容易に、堅固に共有結合することが可
能になる。また、本発明に関わる共有結合方法により、
ボロン酸基を有する化合物を共有結合Lた実験器具か
ら、ボロン酸基を有する化合物を剥離させることなく、
グリコヘモダロビンを分画定量することや、リンパ球を
活性化することが可能となる。
【0008】本発明では、最初に担体表面にアジド基を
有するポリマーや、低分子化合物を塗布する。使用する
ポリマーとしては、アジド基を導入したスチレン、アジ
ド基を含有するメタクリレート類等のビニルモノマー単
独重合体、アジド基含有モノマーとスチレン、アクリル
アミド等のアジド基を含有しないビニルモノマーとの共
重合体が考えられるが、安定性を考慮すると、スチレ
ン、メチルメタクリレート、ジメチルアクリルアミドと
の共重合体が特に好ましい。これらの共重合体における
アジド基の割合は、モル比で10〜20% 存在するこ
とが好ましい。前記ポリマーの分子量は、数平均分子量
で100,000以上であることが好ましい。また、ア
ジド基を有する低分子化合物としては、ビスアジド化合
物や、イオン性基等が考えられるが、必ずしもこれらに
限定されるものではない。これらのアジド基を有する低
分子化合物では、ボロン酸基を有する化合物を安定に固
定化させる為に、アジド基を2個以上含有することが望
まれる。ボロン酸基を有する化合物を固定化する材料と
しては、プラスチック(ポリビニルアルコール、セルロ
ース、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、メタクリ
ル酸、ポリメチルメタクリレート、ポリイソプロピルア
クリルアミド、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフォン
等)、ガラス、セラミック、繊維、紙、合成紙、中空
糸、金属等が考えられるが、これらに限定される訳では
なく、また、それらの形状、表面の状態等には、何等制
限はない。
有するポリマーや、低分子化合物を塗布する。使用する
ポリマーとしては、アジド基を導入したスチレン、アジ
ド基を含有するメタクリレート類等のビニルモノマー単
独重合体、アジド基含有モノマーとスチレン、アクリル
アミド等のアジド基を含有しないビニルモノマーとの共
重合体が考えられるが、安定性を考慮すると、スチレ
ン、メチルメタクリレート、ジメチルアクリルアミドと
の共重合体が特に好ましい。これらの共重合体における
アジド基の割合は、モル比で10〜20% 存在するこ
とが好ましい。前記ポリマーの分子量は、数平均分子量
で100,000以上であることが好ましい。また、ア
ジド基を有する低分子化合物としては、ビスアジド化合
物や、イオン性基等が考えられるが、必ずしもこれらに
限定されるものではない。これらのアジド基を有する低
分子化合物では、ボロン酸基を有する化合物を安定に固
定化させる為に、アジド基を2個以上含有することが望
まれる。ボロン酸基を有する化合物を固定化する材料と
しては、プラスチック(ポリビニルアルコール、セルロ
ース、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、メタクリ
ル酸、ポリメチルメタクリレート、ポリイソプロピルア
クリルアミド、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフォン
等)、ガラス、セラミック、繊維、紙、合成紙、中空
糸、金属等が考えられるが、これらに限定される訳では
なく、また、それらの形状、表面の状態等には、何等制
限はない。
【0009】アジド基を有する化合物は、ボリマーで
も、低分子化合物であっても、揮発性有機溶媒に溶解
し、被固定化表面に塗布、乾燥することにより実施する
ことが可能である。塗布により、形成される皮膜の厚さ
は、ポリマーの場合は、0.1〜3.0umであること
が好ましい。低分子の場合は、分子層が複数になる様に
塗布することが好ましい。ボロン酸基を有する化合物を
被固定化担体に存在させる方法には、ボロン酸基を有す
る化合物の溶液に被固定化担体を浸漬し、ボロン酸基を
有する化合物を被固定化担体に吸着させる方法が考えら
れる。
も、低分子化合物であっても、揮発性有機溶媒に溶解
し、被固定化表面に塗布、乾燥することにより実施する
ことが可能である。塗布により、形成される皮膜の厚さ
は、ポリマーの場合は、0.1〜3.0umであること
が好ましい。低分子の場合は、分子層が複数になる様に
塗布することが好ましい。ボロン酸基を有する化合物を
被固定化担体に存在させる方法には、ボロン酸基を有す
る化合物の溶液に被固定化担体を浸漬し、ボロン酸基を
有する化合物を被固定化担体に吸着させる方法が考えら
れる。
【0010】次に、ボロン酸基を有する化合物の存在す
る被固定化担体に紫外線を照射することにより、短時間
で固定化が完了する。使用される光源としては、水銀灯
等が考えられる。ボロン酸基を有する化合物の水溶液ま
たは、コロイド溶液または、懸濁液に被固定化担体を浸
漬し、ボロン酸基を有する化合物を被固定化担体に吸着
させた後に紫外線を照射する場合には、必ずしも溶液を
乾燥させる必要はない。紫外線照射に特に限定される条
件はないが、被固定化ボロン酸基を有する化合物を防御
する為には、320nm よりも長波長の光を照射する
ことが好ましい。紫外線を照射した後、固定化されなか
ったボロン酸基を有する化合物は洗浄により除去する。
洗浄に使用される溶媒にも特に制限はない。
る被固定化担体に紫外線を照射することにより、短時間
で固定化が完了する。使用される光源としては、水銀灯
等が考えられる。ボロン酸基を有する化合物の水溶液ま
たは、コロイド溶液または、懸濁液に被固定化担体を浸
漬し、ボロン酸基を有する化合物を被固定化担体に吸着
させた後に紫外線を照射する場合には、必ずしも溶液を
乾燥させる必要はない。紫外線照射に特に限定される条
件はないが、被固定化ボロン酸基を有する化合物を防御
する為には、320nm よりも長波長の光を照射する
ことが好ましい。紫外線を照射した後、固定化されなか
ったボロン酸基を有する化合物は洗浄により除去する。
洗浄に使用される溶媒にも特に制限はない。
【0011】以上の操作からなる本発明によれば、ボロ
ン酸基を有する化合物と塗布したポリマー間との共有結
合、更に、塗布したボリマー間とポリマー内との架橋が
生成する為、被固定化担体が安定して存在し続ける。被
固定化担体がプラスチックの場合には、被固定化担体の
表面と塗布したボロン酸基を有する化合物との間に共有
結合が生成する為、被固定化担体が更に安定して存在し
続ける。アジド基を有する化合物が低分子化合物である
場合にも、化学療法剤と塗布した低分子化合物間との共
有結合、更に、塗布した低分子化合物間の架橋が生成す
る為、被固定化担体が安定して存在し続ける。
ン酸基を有する化合物と塗布したポリマー間との共有結
合、更に、塗布したボリマー間とポリマー内との架橋が
生成する為、被固定化担体が安定して存在し続ける。被
固定化担体がプラスチックの場合には、被固定化担体の
表面と塗布したボロン酸基を有する化合物との間に共有
結合が生成する為、被固定化担体が更に安定して存在し
続ける。アジド基を有する化合物が低分子化合物である
場合にも、化学療法剤と塗布した低分子化合物間との共
有結合、更に、塗布した低分子化合物間の架橋が生成す
る為、被固定化担体が安定して存在し続ける。
【0012】本発明で光反応によらずに合成される、側
鎖にボロン酸基を有する高分子化合物としては、 1)ポリ(m−アクルルアミドフェニルボロン酸−CO
−N−ビニルピロリドン)とポリビニルアルコールの複
合体、 2)アクリル酸と3−アミノフェニルボロン酸ヘミサル
ファイトとの縮合により合成される3−アクリルアミド
フェニルボロン酸、 3)メタクリルアミドフェニルボロン酸とアクリルアミ
ドとN,N−メチレンビス(アクリルアミド)の共重合
体、 4)ボロン酸基を有するポリマーとポリビニルアルコー
ルからなる相互侵入高分子網目ゲル 等が考えられるが、必ずしもこれらに限定される訳では
ない。
鎖にボロン酸基を有する高分子化合物としては、 1)ポリ(m−アクルルアミドフェニルボロン酸−CO
−N−ビニルピロリドン)とポリビニルアルコールの複
合体、 2)アクリル酸と3−アミノフェニルボロン酸ヘミサル
ファイトとの縮合により合成される3−アクリルアミド
フェニルボロン酸、 3)メタクリルアミドフェニルボロン酸とアクリルアミ
ドとN,N−メチレンビス(アクリルアミド)の共重合
体、 4)ボロン酸基を有するポリマーとポリビニルアルコー
ルからなる相互侵入高分子網目ゲル 等が考えられるが、必ずしもこれらに限定される訳では
ない。
【0013】
【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。 《実施例1.》 i)アジドスチレンの合成 エタノール−濃塩酸混液20mlに、3−ニトロスチレ
ン5g を懸濁させ、更に、エタノールに溶解したSn
Cl32H2O溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温
で一夜、反応させた。NaOHにより中和し、固体成分
を濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテ
ル層をMgSO4で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体
をた。同中間体を10%硫酸溶液10mlに溶解、氷冷
しlNのNaNO2水溶液を添加した。2時間後に,N
aN3水溶液を添加し、室温に戻した後、3時間攪拌し
た。酢酸エチルにより抽出し、拍出液を0.1N Na
HCO3水溶液と精製水で洗浄し、MgSO4を添加
し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム/ヘキサン
(1/4)混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラムで精製
した。溶媒を留去し、3−アジドスチレンを得た。 ii)アジドスチレン−スチレン共重合体の合成 アジドスチレン1モルとスチレン4モルとをベンゼンで
5倍に希釈し、0.01当量のN,N,アゾゼスイソブ
チロニトリル(AIBN)を添加、脱気、封管し、60
℃で4時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、沈
殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収した。
得られた共重合体の数平均分子量は、10万であった。 iii)3−アミノフェニルボロン酸を共有結合したP
ET、フィルムの調製前記方法により合成したアジドス
チレン−スチレン共重合体をアセトンに溶解し、1%溶
液を調製した。この溶液100mlを1m2のポリエチ
レンテレフタレート(PET)フィルムの両面に塗布、
乾燥し、アジドスチレン−スチレン共重合体の皮膜を形
成した。リン酸緩衝液に1%の割合で溶解した3−アミ
ノフェニルボロン酸溶液に、前記処理をしたPETフィ
ルムを1時間浸潰し、3−アミノフェニルボロン酸を吸
着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を1分間照射し
た。次に、当該PETフィルムを精製水で水洗、乾燥し
た。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。 《実施例1.》 i)アジドスチレンの合成 エタノール−濃塩酸混液20mlに、3−ニトロスチレ
ン5g を懸濁させ、更に、エタノールに溶解したSn
Cl32H2O溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温
で一夜、反応させた。NaOHにより中和し、固体成分
を濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテ
ル層をMgSO4で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体
をた。同中間体を10%硫酸溶液10mlに溶解、氷冷
しlNのNaNO2水溶液を添加した。2時間後に,N
aN3水溶液を添加し、室温に戻した後、3時間攪拌し
た。酢酸エチルにより抽出し、拍出液を0.1N Na
HCO3水溶液と精製水で洗浄し、MgSO4を添加
し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム/ヘキサン
(1/4)混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラムで精製
した。溶媒を留去し、3−アジドスチレンを得た。 ii)アジドスチレン−スチレン共重合体の合成 アジドスチレン1モルとスチレン4モルとをベンゼンで
5倍に希釈し、0.01当量のN,N,アゾゼスイソブ
チロニトリル(AIBN)を添加、脱気、封管し、60
℃で4時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、沈
殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収した。
得られた共重合体の数平均分子量は、10万であった。 iii)3−アミノフェニルボロン酸を共有結合したP
ET、フィルムの調製前記方法により合成したアジドス
チレン−スチレン共重合体をアセトンに溶解し、1%溶
液を調製した。この溶液100mlを1m2のポリエチ
レンテレフタレート(PET)フィルムの両面に塗布、
乾燥し、アジドスチレン−スチレン共重合体の皮膜を形
成した。リン酸緩衝液に1%の割合で溶解した3−アミ
ノフェニルボロン酸溶液に、前記処理をしたPETフィ
ルムを1時間浸潰し、3−アミノフェニルボロン酸を吸
着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を1分間照射し
た。次に、当該PETフィルムを精製水で水洗、乾燥し
た。
【0014】《実施例2.》 3−アミノフェニルボロン酸を共有結合したPETフィ
ルムを用いたグリコヘモダロビンの定量 (1)実施例1.で調製した3−アミノフェニルボロン
酸を共有結合したPETフィルムを1cm2四方に切断
した。 (2)(1)のPETフィルム各1枚を小試験管に分取
した。 (3)(2)の小試験管にリン酸緩衝液各1mlを分取
した。 (4)(3)の小試験管に溶血させた被検検体各200
μlを分取し、37℃で30分間反応させた。 (5)(4)の小試験管中のPETフィルムをリン酸緩
衝液2mlで3回洗浄した。 (6)新規に小試験管中を準備し、テトラメチルベンジ
ジン溶液各2mlを分注し、濾紙で充分に水切りした、
(5)の小試験管中のFETフィルムを移し、37℃で
30分間反応させた。 (7)(6)の小試験管に反応停止液各1mlを分注
し、反応を停止した。 (8)(7)の小試験管の溶液の370nmの吸光度を
測定した。 (8)標準グリコヘモダロビンを用いて、同様の操作を
行ない、検量線を描いた。 (9)(8)の検量線から、被検検体中のグリコヘモグ
ロビンを求めた。
ルムを用いたグリコヘモダロビンの定量 (1)実施例1.で調製した3−アミノフェニルボロン
酸を共有結合したPETフィルムを1cm2四方に切断
した。 (2)(1)のPETフィルム各1枚を小試験管に分取
した。 (3)(2)の小試験管にリン酸緩衝液各1mlを分取
した。 (4)(3)の小試験管に溶血させた被検検体各200
μlを分取し、37℃で30分間反応させた。 (5)(4)の小試験管中のPETフィルムをリン酸緩
衝液2mlで3回洗浄した。 (6)新規に小試験管中を準備し、テトラメチルベンジ
ジン溶液各2mlを分注し、濾紙で充分に水切りした、
(5)の小試験管中のFETフィルムを移し、37℃で
30分間反応させた。 (7)(6)の小試験管に反応停止液各1mlを分注
し、反応を停止した。 (8)(7)の小試験管の溶液の370nmの吸光度を
測定した。 (8)標準グリコヘモダロビンを用いて、同様の操作を
行ない、検量線を描いた。 (9)(8)の検量線から、被検検体中のグリコヘモグ
ロビンを求めた。
【0015】《実施例3.》 i)アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレートの合
成 N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)100mlに
p−アジド安息香酸10gを溶解、氷冷し、トリエチル
アミン3.5mlを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブチ
ル8.3mlを添加した。次に、DMT300mlにヒ
ドロキシルエチルメタクリレート5.2mlを溶解し、
前記溶液に添加し、60℃で5時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し,10%クエン酸水溶
液、精製水、4%NaHCO3水溶液で順次洗浄し、無
水NaSO4を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレ
ートを得た。 ii)アジドベンゾイルオキシニチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成 前記方法により合成したアジドベソゾイルオキシエチル
メタクリレート1molとメチルメタクリレート4mo
lとをDMFで2倍に希釈し,0、01等量のAIBN
を添加、脱気、封管し、60℃で3時間重合した。冷却
後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したアジドベン
ゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレ
ート重合体を得た。得られた共重合体の数平均分子量は
15万であった。 iii)3−アミノフェニルボロン酸共有結合フラスコ
の調製 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、1%溶液を調製した。この溶液各30μ
lをポリアクリルアミド製フラスコの内面に塗布、乾燥
し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メ
チルメタクリレート共重合体の皮膜を形成した。前記処
理をしたポリアクリルアミド製フラスコの内面に、リン
酸緩衝液に0.01%の割合で溶解した3−アミノフェ
ニルボロン酸溶液200μlを添加し、3−アミノフェ
ニルボロン酸溶液を吸着させ、電子線加速器(加速電圧
2MeW、電子線電流1mA)を用いて、電子線を30
秒間照射した。次に、当該ポリアクリルアミド製フラス
コを精製水で水洗、乾燥した。
成 N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)100mlに
p−アジド安息香酸10gを溶解、氷冷し、トリエチル
アミン3.5mlを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブチ
ル8.3mlを添加した。次に、DMT300mlにヒ
ドロキシルエチルメタクリレート5.2mlを溶解し、
前記溶液に添加し、60℃で5時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し,10%クエン酸水溶
液、精製水、4%NaHCO3水溶液で順次洗浄し、無
水NaSO4を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレ
ートを得た。 ii)アジドベンゾイルオキシニチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成 前記方法により合成したアジドベソゾイルオキシエチル
メタクリレート1molとメチルメタクリレート4mo
lとをDMFで2倍に希釈し,0、01等量のAIBN
を添加、脱気、封管し、60℃で3時間重合した。冷却
後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したアジドベン
ゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレ
ート重合体を得た。得られた共重合体の数平均分子量は
15万であった。 iii)3−アミノフェニルボロン酸共有結合フラスコ
の調製 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、1%溶液を調製した。この溶液各30μ
lをポリアクリルアミド製フラスコの内面に塗布、乾燥
し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メ
チルメタクリレート共重合体の皮膜を形成した。前記処
理をしたポリアクリルアミド製フラスコの内面に、リン
酸緩衝液に0.01%の割合で溶解した3−アミノフェ
ニルボロン酸溶液200μlを添加し、3−アミノフェ
ニルボロン酸溶液を吸着させ、電子線加速器(加速電圧
2MeW、電子線電流1mA)を用いて、電子線を30
秒間照射した。次に、当該ポリアクリルアミド製フラス
コを精製水で水洗、乾燥した。
【0016】《実施例4.》 Effector Cellの誘導 末梢血から沈殿法に従い、末梢血リンパ球を分離した。
次に、抗CD4抗体固定化フラスコを用いて、CD4+
末梢血リンパ球を分離し、実施例3で調製した3−アミ
ノフェニルホウ酸固定化フラスコを用いて、自己血しょ
うと共に2時間培養した。2時間後に前記操作により得
られた細胞(1×104cell/well)と、ラジ
オアイソトープ(51Cr−クロム酸ナトリウム)標識
した、ヒト子宮頚部癌由来Hela細胞(Hela−S
3:1×102cell/well)と、pokepe
ed mitogen(1μg/ml)とをmicro
test plate wellに取り、炭酸ガス培養
器で8時間培養した。キラー活性の検量は、リンパ球浮
遊液の代りにRPMl1640培地を添加したものを0
%、リンパ球浮遊液の代りに2%SDSを添加したもの
を100%とした。キラー活性の検量の結果、8時間後
にmicrotost plate well内のHe
la細胞は消滅し、Effector Cellの誘導
が確認された。
次に、抗CD4抗体固定化フラスコを用いて、CD4+
末梢血リンパ球を分離し、実施例3で調製した3−アミ
ノフェニルホウ酸固定化フラスコを用いて、自己血しょ
うと共に2時間培養した。2時間後に前記操作により得
られた細胞(1×104cell/well)と、ラジ
オアイソトープ(51Cr−クロム酸ナトリウム)標識
した、ヒト子宮頚部癌由来Hela細胞(Hela−S
3:1×102cell/well)と、pokepe
ed mitogen(1μg/ml)とをmicro
test plate wellに取り、炭酸ガス培養
器で8時間培養した。キラー活性の検量は、リンパ球浮
遊液の代りにRPMl1640培地を添加したものを0
%、リンパ球浮遊液の代りに2%SDSを添加したもの
を100%とした。キラー活性の検量の結果、8時間後
にmicrotost plate well内のHe
la細胞は消滅し、Effector Cellの誘導
が確認された。
【0017】《実施例5.》 3−アミノフェニルボロン酸固定化不織布の調製 ラジカル重合により、2−(4−アジドベンゾイルオキ
シ)エチルメタクリレート:スチレン:0−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体(仕込モル比3:6:1
(以下PASN)を合成した。デュポン社製不織布(S
ontala 8005)に、前記PASNを塗布、薄
膜を形成した後、紫外線を照射した。次に当該不織布に
0.01%の3−アミノフェニルボロン酸と水溶性カル
ボジイミドを含有するリン酸緩 衝液に浸漬し、37℃
で16時間反応させた。次に当該不織布を1MのNaC
l水溶液およびリン酸緩衝液で、洗浄乾燥した。
シ)エチルメタクリレート:スチレン:0−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体(仕込モル比3:6:1
(以下PASN)を合成した。デュポン社製不織布(S
ontala 8005)に、前記PASNを塗布、薄
膜を形成した後、紫外線を照射した。次に当該不織布に
0.01%の3−アミノフェニルボロン酸と水溶性カル
ボジイミドを含有するリン酸緩 衝液に浸漬し、37℃
で16時間反応させた。次に当該不織布を1MのNaC
l水溶液およびリン酸緩衝液で、洗浄乾燥した。
【0018】《実施例6.》 lymphokine−activated kill
er様活性の誘導 実施例5で調製した3−アミノフェニルボロン酸固定化
不織布10gを容量10mlのカラムに充填した。次
に、当該カラムを3%のストレプマイシンを含有するリ
ン酸緩衝液で充分に洗浄した後、パイロジェンフリーの
精製水で充分に洗浄し、無菌的に乾燥した。続いて、三
方活栓、ペリスタポンプ、当該カラム、エアーチャンバ
ーの順にシリコンチューブでつないで、回路を作成し
た。次に、当該回路をガンマ線滅菌した。リンパ球浮遊
液を1×107個/mlに調製し、その20mlを三方
活栓から回路内へ注入した。流量0.5ml/mir
で、リンパ球浮遊液を3−アミノフェニルボロン酸固定
化不織布充填カラムを通して、30分間接触刺激した。
30分間の接触刺激後リンパ球を回収し、37℃5%C
O2下で24時間培養後Effector細胞とし、K
−562細胞とDaudi細胞をターゲットとして、そ
の細胞傷害活性をクロミウム放出試験で評価した。対照
群として、無処置のリンパ球を用い、また細胞傷害活性
をlymphokine−activated kil
ler Cellと比較検討する為、リンパ球浮遊液を
1×107個/mlに調整し、ricombinant
lnterleukin−2(TGP−3=武田薬品
製)1unit/mlと共に培養したものを調製した。
細胞傷害活性は次の式で計算した。 %cytotoxlcity=(実験測定値−自然放出
量)/(最大放出量−自然放出量)×100 ナチュラルキラーセルに感受性のK−562 細胞を標
的細胞として用いた場合、3−アミノフェニルボロン酸
固定化不織布充填カラムの刺激により、強い細胞傷害性
が確認できた(E/T ratio 50:cytot
oxicity=60%)。IL−2添加培養群(E/
Tratio 50:cytotoxicity=40
%)と比較しても、より強い細胞傷害性の誘導が可能で
あった。ナチュラルキラーセルに非感受性のDaudi
細胞を標的細胞として用いた場合も、強い細胞傷害性の
誘導が可能であったことから(E/T ratio 5
0:cytotoxicity=36%)、ナチュラル
キラー活性の増強のみならず、lymphokine−
activatedkiller様活性の誘導も可能で
あった。
er様活性の誘導 実施例5で調製した3−アミノフェニルボロン酸固定化
不織布10gを容量10mlのカラムに充填した。次
に、当該カラムを3%のストレプマイシンを含有するリ
ン酸緩衝液で充分に洗浄した後、パイロジェンフリーの
精製水で充分に洗浄し、無菌的に乾燥した。続いて、三
方活栓、ペリスタポンプ、当該カラム、エアーチャンバ
ーの順にシリコンチューブでつないで、回路を作成し
た。次に、当該回路をガンマ線滅菌した。リンパ球浮遊
液を1×107個/mlに調製し、その20mlを三方
活栓から回路内へ注入した。流量0.5ml/mir
で、リンパ球浮遊液を3−アミノフェニルボロン酸固定
化不織布充填カラムを通して、30分間接触刺激した。
30分間の接触刺激後リンパ球を回収し、37℃5%C
O2下で24時間培養後Effector細胞とし、K
−562細胞とDaudi細胞をターゲットとして、そ
の細胞傷害活性をクロミウム放出試験で評価した。対照
群として、無処置のリンパ球を用い、また細胞傷害活性
をlymphokine−activated kil
ler Cellと比較検討する為、リンパ球浮遊液を
1×107個/mlに調整し、ricombinant
lnterleukin−2(TGP−3=武田薬品
製)1unit/mlと共に培養したものを調製した。
細胞傷害活性は次の式で計算した。 %cytotoxlcity=(実験測定値−自然放出
量)/(最大放出量−自然放出量)×100 ナチュラルキラーセルに感受性のK−562 細胞を標
的細胞として用いた場合、3−アミノフェニルボロン酸
固定化不織布充填カラムの刺激により、強い細胞傷害性
が確認できた(E/T ratio 50:cytot
oxicity=60%)。IL−2添加培養群(E/
Tratio 50:cytotoxicity=40
%)と比較しても、より強い細胞傷害性の誘導が可能で
あった。ナチュラルキラーセルに非感受性のDaudi
細胞を標的細胞として用いた場合も、強い細胞傷害性の
誘導が可能であったことから(E/T ratio 5
0:cytotoxicity=36%)、ナチュラル
キラー活性の増強のみならず、lymphokine−
activatedkiller様活性の誘導も可能で
あった。
【0019】《実施例7.》 ボロン酸基を有する相互侵入高分子網目ゲルの合成 ポリビニルアルコール(PVA:分子量2.000)を
グルタルアルデヒドを触媒として硫酸を用いて架橋した
後、メタクリルアミドフェニルボロン酸(MAPB)1
0mol−%、ジメチルアクリルアミド(DMAA)9
0mol−%ポリエチレングリコールジアクリレート
(PEGDAA:n=14)90mol−%を含むジメ
チルスルフォキシド(DMSO)溶液をしみ込ませ、6
0℃で12時間加熱して重合した。得られたゲルから末
反応モノマーを除去した後、DMSO/H2O=3/
1、DMSO/H2O=1/1、DMSO/H2O=1
/3、の各溶液中に各々一日づつ浸漬した後、蒸留水中
に保存した。ゲル中のボロン酸基の含量はプラズマ発光
分析により求めた。
グルタルアルデヒドを触媒として硫酸を用いて架橋した
後、メタクリルアミドフェニルボロン酸(MAPB)1
0mol−%、ジメチルアクリルアミド(DMAA)9
0mol−%ポリエチレングリコールジアクリレート
(PEGDAA:n=14)90mol−%を含むジメ
チルスルフォキシド(DMSO)溶液をしみ込ませ、6
0℃で12時間加熱して重合した。得られたゲルから末
反応モノマーを除去した後、DMSO/H2O=3/
1、DMSO/H2O=1/1、DMSO/H2O=1
/3、の各溶液中に各々一日づつ浸漬した後、蒸留水中
に保存した。ゲル中のボロン酸基の含量はプラズマ発光
分析により求めた。
【0020】《実施例8.》 ボロン酸基を有する相互侵入高分子網目ゲルを用いたグ
リコヘモグロビンの定量 (1)実施例7で調製した相互侵入高分子網目ゲルを1
cm2四方に切断した。 (2)(1)の相互侵入高分子網目ゲル各1枚を小試験
管に分取した。 (3)(2)の小試験管にリン酸緩衝液各1mlを分取
した。 (4)(3)の小試験管に溶血させた被検検体各20
0)μlを分取し、37℃で30分間反応させた。 (5)(4)の小試験管中の相互侵入高分子網目ゲルを
リン酸緩衝液2mlで3回洗浄した。 (6)新規に小試験管中を準備し、テトラメチルベンジ
ジン溶液各2mlを分注し、濾紙で充分に水切りした、
(5)の小試験管中の相互侵入高分子網目ゲルを移し、
37℃で30分間反応させた。 (7)(6)の小試験管に反応停止液各1mlを分注
し、反応を停止した。 (8)(7)の小試験管の溶液の370nmの吸光度を
測定した。 (8)標準グリコヘモグロビンを用いて、同様の操作を
行ない、検量線を描いた。 (9)(8)の検量線から、被検検体中のグリコヘモグ
ロビンを求めた。
リコヘモグロビンの定量 (1)実施例7で調製した相互侵入高分子網目ゲルを1
cm2四方に切断した。 (2)(1)の相互侵入高分子網目ゲル各1枚を小試験
管に分取した。 (3)(2)の小試験管にリン酸緩衝液各1mlを分取
した。 (4)(3)の小試験管に溶血させた被検検体各20
0)μlを分取し、37℃で30分間反応させた。 (5)(4)の小試験管中の相互侵入高分子網目ゲルを
リン酸緩衝液2mlで3回洗浄した。 (6)新規に小試験管中を準備し、テトラメチルベンジ
ジン溶液各2mlを分注し、濾紙で充分に水切りした、
(5)の小試験管中の相互侵入高分子網目ゲルを移し、
37℃で30分間反応させた。 (7)(6)の小試験管に反応停止液各1mlを分注
し、反応を停止した。 (8)(7)の小試験管の溶液の370nmの吸光度を
測定した。 (8)標準グリコヘモグロビンを用いて、同様の操作を
行ない、検量線を描いた。 (9)(8)の検量線から、被検検体中のグリコヘモグ
ロビンを求めた。
【0021】《実施例9.》 i)メタクリルアミド−3−フェニルボロン酸(MAP
B)の合成 3−アミノフェニルボロン酸1/2硫酸塩(Shigm
a社製)0.1mol、メタクリル酸(和光純薬製)
0.1mol、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ
プロピル)カルボジイミド塩酸塩(Peptide I
nstitute,Inc)を300mlの精製水に溶
解し、氷水浴で冷却した。次に、NaOHでpHを4.
7に調整し、1時間攪拌した後、ジェチルエーテルを用
いて抽出を行ない、減圧乾燥した。熱水から結晶化さ
せ、メタクリルアミド−3−フェニルボロン酸の白色針
状晶を得た(収率約50%)。 ii)ハイドロゲルビーズの調製 7.1×10−3molのメタクリルアミドフェニルボ
ロン酸、1.6×10−1molのアクリルアミド、
9.4×10−3molのN,N’−メチレンビス(ア
クリルアミド)を144mlの精製水溶解し、更に、
0.6g/mlのアンモニウムパーオキソジスルフェー
ト0.8mlを添加した。この溶液を4.8mlのソル
ビタンセスキオリエートを含む960mlのトルエン:
クロロホルム(37:11)溶液に滴下し、窒素雰囲気
下、72℃で1時間攪拌した。重合したビーズはトルエ
ン、エタノール、精製水で洗浄し、凍結乾燥した。
B)の合成 3−アミノフェニルボロン酸1/2硫酸塩(Shigm
a社製)0.1mol、メタクリル酸(和光純薬製)
0.1mol、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ
プロピル)カルボジイミド塩酸塩(Peptide I
nstitute,Inc)を300mlの精製水に溶
解し、氷水浴で冷却した。次に、NaOHでpHを4.
7に調整し、1時間攪拌した後、ジェチルエーテルを用
いて抽出を行ない、減圧乾燥した。熱水から結晶化さ
せ、メタクリルアミド−3−フェニルボロン酸の白色針
状晶を得た(収率約50%)。 ii)ハイドロゲルビーズの調製 7.1×10−3molのメタクリルアミドフェニルボ
ロン酸、1.6×10−1molのアクリルアミド、
9.4×10−3molのN,N’−メチレンビス(ア
クリルアミド)を144mlの精製水溶解し、更に、
0.6g/mlのアンモニウムパーオキソジスルフェー
ト0.8mlを添加した。この溶液を4.8mlのソル
ビタンセスキオリエートを含む960mlのトルエン:
クロロホルム(37:11)溶液に滴下し、窒素雰囲気
下、72℃で1時間攪拌した。重合したビーズはトルエ
ン、エタノール、精製水で洗浄し、凍結乾燥した。
【0022】《実施例10.》 lymphokine−activatedkille
r様活性の誘導 実施例9で調製したハイドロゲルビーズ0.5gを70
mlの精製水を用いて、膨潤した。続いてRPMI 1
640培地で置換した。当該ビーズ1mlをポリスチレ
製フラスコに分取し、CD4+末梢血リンパ球(2×1
07個)、自己血しょうと共に10分間培養した。ピペ
ッティングにより、リンパ球を分離し、遠心回収後、1
0%自己血RPMI 1640培地で3回洗浄し、2×
106個/mlで30分間接触刺激した。30分間の接
触刺激後リンパ球を回収し、37℃5%CO下で24時
間培養後 Effector細胞とし、K−562細胞
とDaudi細胞をターゲットとして、その細胞傷害活
性をクロミウム放出試験で評価した。対照群として、無
処置のリンパ球を用い、また細胞傷害活性をlymph
okine−activated killereel
lと比較検討する為、リンパ球浮遊液を1×107個/
mlに調製し、ricombinant Interl
eukin−2(TGP−3:武田薬品製)1unit
/mlと共に培養したものを調製した。細胞傷害活性は
次の式で計算した。 % Cytotoxicity=(実験測定値−自然放
出量)/(最大放出量−自然放出量)×100 ナチュラルキラーセルに感受性のK−562 細胞を標
的細胞として用いた場合ハイドロゲルビーズの刺激によ
り、強い細胞傷害性が確認できた(E/Tratio
50:Cytotoxicity=65%)。IL−2
添加培養群と比較しても、より強い細胞傷害性の誘導が
可能であった(E/Tratio 50:Cytoto
deity=38%)。ナチュラルキラーセルに非感受
性のDaudi細胞を標的細胞として用いた場合も、強
い細胞傷害性の誘導が可能であった(E/T rati
o 50:Cytotoxicity=32%)ことか
ら、ナチュラルキラー活性の増強のみならず、lymp
hokine−activatedkiller様活性
の誘導も可能であった。
r様活性の誘導 実施例9で調製したハイドロゲルビーズ0.5gを70
mlの精製水を用いて、膨潤した。続いてRPMI 1
640培地で置換した。当該ビーズ1mlをポリスチレ
製フラスコに分取し、CD4+末梢血リンパ球(2×1
07個)、自己血しょうと共に10分間培養した。ピペ
ッティングにより、リンパ球を分離し、遠心回収後、1
0%自己血RPMI 1640培地で3回洗浄し、2×
106個/mlで30分間接触刺激した。30分間の接
触刺激後リンパ球を回収し、37℃5%CO下で24時
間培養後 Effector細胞とし、K−562細胞
とDaudi細胞をターゲットとして、その細胞傷害活
性をクロミウム放出試験で評価した。対照群として、無
処置のリンパ球を用い、また細胞傷害活性をlymph
okine−activated killereel
lと比較検討する為、リンパ球浮遊液を1×107個/
mlに調製し、ricombinant Interl
eukin−2(TGP−3:武田薬品製)1unit
/mlと共に培養したものを調製した。細胞傷害活性は
次の式で計算した。 % Cytotoxicity=(実験測定値−自然放
出量)/(最大放出量−自然放出量)×100 ナチュラルキラーセルに感受性のK−562 細胞を標
的細胞として用いた場合ハイドロゲルビーズの刺激によ
り、強い細胞傷害性が確認できた(E/Tratio
50:Cytotoxicity=65%)。IL−2
添加培養群と比較しても、より強い細胞傷害性の誘導が
可能であった(E/Tratio 50:Cytoto
deity=38%)。ナチュラルキラーセルに非感受
性のDaudi細胞を標的細胞として用いた場合も、強
い細胞傷害性の誘導が可能であった(E/T rati
o 50:Cytotoxicity=32%)ことか
ら、ナチュラルキラー活性の増強のみならず、lymp
hokine−activatedkiller様活性
の誘導も可能であった。
【0023】
【発明の効果】本発明にかかわる (1)ボロン酸基を有する化合物を光化学反応により共
有結合させた不溶性担体 および (2)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物 により、従来法であるダルタルアルデヒド法、アミド化
法の欠点であるリガンド(ボロン酸基を有する化合物)
の剥離の問題のない、ダソコヘモグロビンの分画定量方
法およびLymphokine Activated
Killer様活性およびEffectorellの誘
導方法を提供することが可能となる。
有結合させた不溶性担体 および (2)側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物 により、従来法であるダルタルアルデヒド法、アミド化
法の欠点であるリガンド(ボロン酸基を有する化合物)
の剥離の問題のない、ダソコヘモグロビンの分画定量方
法およびLymphokine Activated
Killer様活性およびEffectorellの誘
導方法を提供することが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】 光化学反応による、ボロン酸基を有する化合物の担体への共有結合方法と、ボロン酸基を有する 担体を用いたグリコヘモグロビンの分画定量方法、およびLymphokine Activa ted Killer様活性およびEffector Cellの誘導方法。
Claims (10)
- 【請求項1】 不溶性担体の表面にアジド基を有する化
合物を塗布した後、ボロン酸基を有する化合物を塗布
し、更に光を照射することからなる、ボロン酸基をもつ
化合物の共有結合方法。 - 【請求項2】 不溶性担体の表面に0−ニトロベンジル
エステル基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射
によりカルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を
用いてボロン酸基を有する化合物を化学結合させる方法
とからなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結合方
法。 - 【請求項3】 緩衝液中でP−azidobenzoy
loxy succinimideと反応させることに
より、フェニルアジド基を導入したボロン酸基を有する
化合物を被固定化担体に塗布した後、更に光を照射する
ことことからなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結
合方法。 - 【請求項4】 請求項1、または請求項2、または請求
項3記載の方法により、ボロン酸基を有する化合物を共
有結合したことを特徴とする、不溶性担体および実験器
具。 - 【請求項5】 請求項1、または請求項2、または請求
項3記載の方法により調製した不溶性担体を用いて、グ
リコヘモダロビンを分画定量する方法。 - 【請求項6】 請求項1、または請求項2、または請求
項3記載の方法によりボロン酸基を有する化合物を共有
結合した不溶性担体と、末梢血リンパ球とリンホカイソ
とをin vitroにより培養し、Lymphoki
ne Activated Killer様活性を誘導
する方法。 - 【請求項7】 請求項1、または請求項2、または請求
項3記載の方法によりボロン酸基を有する化合物を共有
結合した不溶性担体と、末梢血リンパ球とをin vi
troにより培養し、Effector Cellを誘
導する方法。 - 【請求項8】 側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物
を用いて、グリコヘモグロビンを分画定量する方法。 - 【請求項9】 側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物
と、末梢血リンパ球とリンホカインとをin vitr
oにより培養し、Lymphokine Activa
ted Killer様活性を誘導する方法。 - 【請求項10】側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物
と、末梢血リンパ球とをin vitroにより培養
し、Effector Cellを誘導する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23015494A JPH0862222A (ja) | 1994-08-19 | 1994-08-19 | 光化学反応による、ボロン酸基を有する化合物の担体への共有結合方法と、ボロン酸基を有する担体を用いたグリコヘモグロビンの分画定量方法、およびLymphokine Activated Killer様活性およびEffector Cellの誘導方法。 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23015494A JPH0862222A (ja) | 1994-08-19 | 1994-08-19 | 光化学反応による、ボロン酸基を有する化合物の担体への共有結合方法と、ボロン酸基を有する担体を用いたグリコヘモグロビンの分画定量方法、およびLymphokine Activated Killer様活性およびEffector Cellの誘導方法。 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0862222A true JPH0862222A (ja) | 1996-03-08 |
Family
ID=16903445
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23015494A Pending JPH0862222A (ja) | 1994-08-19 | 1994-08-19 | 光化学反応による、ボロン酸基を有する化合物の担体への共有結合方法と、ボロン酸基を有する担体を用いたグリコヘモグロビンの分画定量方法、およびLymphokine Activated Killer様活性およびEffector Cellの誘導方法。 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0862222A (ja) |
-
1994
- 1994-08-19 JP JP23015494A patent/JPH0862222A/ja active Pending
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