JPH08510997A

JPH08510997A - 幹細胞増殖インヒビターおよびその使用

Info

Publication number: JPH08510997A
Application number: JP6522261A
Authority: JP
Inventors: コズロフ，ウラジミール; チルロヴァ，イレーナ
Original assignee: プロ−ニューロン，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-29
Publication date: 1996-11-19
Also published as: EP0691988A4; PT691988E; EP0691988B1; DE69431473T2; IL109177A; AU694111B2; WO1994022915A1; AU6493794A; EP0691988A1; CA2159506A1; ES2185649T3; US20020098583A1; DK0691988T3; IL109177A0; US6022848A; DE69431473D1; US6432917B1; CN1124491A; NZ263736A; ATE225370T1

Abstract

(57)【要約】異常な幹細胞周期を制御し、化学療法後の末梢血液の回復を速めるための幹細胞阻害因子の単離および使用が開示され、そして請求される。さらに、幹細胞増殖インヒビターも開示されそして請求される。

Description

【発明の詳細な説明】幹細胞増殖インヒビターおよびその使用発明の分野本発明は、自己免疫疾患、加齢、癌、脊髄形成異常、前白血病、白血病、乾癬、または過剰増殖状態を含む他の疾患を有するヒトまたは動物の治療において、幹細胞の細胞周期を調節するための幹細胞増殖インヒビターの使用に関する。本発明はまた、細胞周期の進行している幹細胞に損傷を与える化学療法剤または他の薬剤に曝されること、あるいは放射線に曝されること、を受けることが予想されるかまたは受けたヒトまたは動物の治療方法に関する。最後に、本発明は、自家移植または同種移植の手法あるいは遺伝子導入のための幹細胞の維持または拡張培養の改良に関する。発明の背景再生系のほとんどの終期細胞は、短命であり、一生を通じて連続的に置き換えられなければならない。例えば、血液細胞は、多能性造血幹細胞（HSC）の自己再生集団から生じる。造血幹細胞は造血系および免疫系の全ての成熟細胞の発育に必要であるので、化学療法剤または他の薬剤により治療される被験体における十分な機能的宿主防御系を再確立するために、造血幹細胞の生存は必須である。造血細胞の産生は、造血細胞の成長および分化を刺激する一連の因子によって調節され、それらのいくつかは、例えば、エリスロポエチンおよびG-CSFは、現在では臨床的な実用に用いられている。しかし、広範に特徴付けられていない制御ネットワークの一部分は、調節プロセスのネガティブアームを形成するフィードバック機構である（Eavesら、Blood 78:110-117、1991）。 Lordとその共同研究者による初期の研究は、正常なネズミおよびブタの骨髄抽出物中に、HSCの細胞周期の進行を可逆的に阻害し得る可溶性タンパク質因子が存在することを示した（Lordら、Br.J.Haem．34:441-446、1976）。この阻害活性（分子量50〜100kD）は幹細胞インヒビター（SCI）と呼ばれた。一次供給源からのこの因子の精製は、放射線照射された多数のマウスを必要とするインビボアッセイにはつきものの困難さにより達成されなかった。これらの問題を克服しようとして、Pragnellとその共同研究者とは、原始造血細胞（CFU- A）のインビトロアッセイを開発し、そして阻害活性源として細胞系をスクリーニングした。初期の研究がSCIの可能な供給源としてマクロファージを同定していたので（L ordら、Blood Cells 6:581-593、1980）、マウスマクロファージ細胞系のJ774.2 が選別された（Grahamら、Nature 344:442-444、1990）。この細胞系からの調整培地が精製に用いられた。阻害ペプチドが単離され、それは、前述のサイトカインマクロファージ炎症性タンパク質１−α（MIP-1 -α）と同一であることが証明された。従って、MIP-1-αは、細胞系から単離されたのであって、一次材料から単離されたのではない。Grahamらは、MIP-1-αに対する抗体が骨髄の粗抽出物の活性を失わせることを観察したが、他の研究者は、他の阻害活性が重要であることを示した。例えば、Grahamら（J.Exp.Med．178 :925-32、1993）は、MIP-1αではなくTGFβが造血幹細胞の主要なインヒビターであることを示唆した。さらにEavesら（PNAS 90:12015-19、1993）は、MIP-1α およびTGFβの両方が最適下限のレベルで正常骨髄中に存在し、そして阻害にはこれら２つの因子間の相乗作用が必要であることを示唆した。他の研究者は、さらに別の幹細胞阻害因子を記載した。Frindelとその共同研究者は、仔ウシの骨髄および肝臓の抽出物から幹細胞阻害活性を有するテトラペプチドを単離した（Lenfantら、PNAS 86:779-782、1989）。Paukovitsら（Cance r Res.50:328-332、1990）は、ペンタペプチドの特徴を調べあげ、そのモノマー体のものはインヒビターであり、そしてそのダイマー体のものは幹細胞の細胞周期の進行の刺激因子である。他の因子もまた、種々のインビトロ系において阻害性を有すると主張されている（Bailliere's Cllnical Haematology第５巻（Bail liere Tinadall、Paris）、pp723-39、1992中のWrightおよびPragnell参照）。現在までこれらの因子のいずれも臨床的使用に対して認可されていない。しかし、効果的な幹細胞インヒビターの必要性は存在している。化学療法または放射線治療に関連する主要な毒性は、正常増殖細胞の破壊であり、これにより骨髄の抑制または胃腸に対する毒性を生じ得る。効果的な幹細胞インヒビターは、これらの細胞を保護し、そしてこれらの治療レジメ（regimen）を最適化し得る。臨床状況に応じて種々の刺激性サイトカイン（例えば、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン、IL-11）が必要とされることが実証されているように、同様に異なる臨床上の必要性に関して種々の阻害因子が必要とされるようである。Ｉ．癌の化学療法および放射線療法刺激性成長因子についての生産面での研究は、多くのこれらの因子（エリスロポエチン、G-CSF、GM-CSFなど）の臨床的な使用につながる。これらの因子は化学療法および放射線照射治療に関連した死亡率および罹患率を低下させる。化学療法または放射線照射を受けている患者にとってのさらなる臨床的利点は、幹細胞が細胞周期に入るのをブロックし、それによって幹細胞を有毒な副作用から保護するという別のストラテジーにより実現され得たという点である。 II．骨髄移植骨髄移植（BMT）は、種々の血液疾患、自己免疫疾患および悪性疾患にとって有用な治療である。細胞のエクスビボ操作は、現在では、原始幹細胞を移植に適した集団に拡張するために用いられている。この手法を最適化するには以下のことが必要である：（１）造血の長期の再構築を維持し得るのに十分な数の幹細胞；（２）移植片対宿主が誘導するＴリンパ球の除去（depletion）、および：（３）悪性細胞の残留がないこと。この手法は、エクスビボ拡張のための幹細胞インヒビターを含むことにより最適化され得る。残留の悪性細胞を排除するために細胞障害性薬剤を用いて骨髄細胞を除去することの効果は、正常な造血細胞および特に幹細胞に対するこれらの化合物の毒性により制限される。除去中は、正常細胞を効果的に保護する必要性がある。保護は、効果的なインヒビターを用いて、幹細胞をその細胞周期からはずすことにより与えられ得る。 III．末梢幹細胞の採取末梢血液幹細胞（PBSC）は、自家移植に対して骨髄よりも多くの潜在的な利点を提供する。腫瘍を含むことにより、または以前の放射線治療により適切な骨髄採取部位を持たない患者は、さらにPBSC採集を受け得る。血液幹細胞の使用は、一般的な麻酔法および外科的手技に十分に耐えられない患者におけるそれらの必要性を排除する。血液細胞を採集するのに必要な血液成分分離（apheresis）技術は、効率的であり、ほとんどの主要な医療センターで広く利用されている。この方法の主要な限界点は、末梢血液中の幹細胞の正常な定常状態頻度が低いこと、および薬剤または成長因子（例えば、シクロホスファミド、G-CSF、幹細胞因子）を用いた動員手法（mobilization procedur es）の後では細胞周期の状態が速いこと、の両方である。効果的な幹細胞インヒビターは、そのような細胞を休止状態に戻すために有用であり、それによって分化の間にそれらが消失することを防ぐ。 IV．過剰増殖性疾患の治療多くの疾患は、調節異常の幹細胞が、終期の細胞の過剰生産を引き起こす過剰増殖状態によって特徴付けられる。このような病態は、表皮細胞の過剰生産である乾癬、および腸ポリープの出現を特徴とする胃腸管における前悪性状態を包含するが、それらに限定されることはない。幹細胞インヒビターはこのような状態の治療に有用である。Ｖ．遺伝子導入遺伝情報を造血細胞に導入する能力は、現在では、臨床的設定に利用されている。アクセスの容易さ、エクスビボでこの組織を操作し治療する幅広い経験のため、および血液細胞が組織に浸透する能力のため、骨髄は遺伝子治療の有用な標的である。さらに、特定のヒトの遺伝子欠損の修正は機能的遺伝子をヒト造血系の原始骨髄幹細胞に導入することにより可能であり得る。レトロウイルスベクターまたは遺伝子導入の物理的技術のいずれかを用いて、遺伝子をヒト造血細胞に導入することにはいくつかの制限がある：（１）造血組織中の幹細胞の頻度の低さは、効率の高い遺伝子導入技術の開発を必要とする；および（２）より迅速に細胞周期の進行している幹細胞はベクターの感染をより受けやすくすることが証明されたが、成長因子による幹細胞増殖の刺激によって感染頻度が増加することは、導入遺伝子を含む細胞が不可逆的に分化させられ、それらの自己再生ができなくなるので、長期の遺伝子発現に良くない影響を与えることが示されている。これらの問題は、幹細胞の使用によって改善され、分化および自己再生の損失を妨げ得る。発明の要旨本発明は、以下の性質により特徴付けられる幹細胞増殖インヒビターである：（a）ネズミコロニー形成脾臓（CFU-S）アッセイにおいて比活性（IC₅₀）が20 ng/ml以下である（実施例４参照）；（b）（限外濾過により）分子量が10,000ダルトンより大きく、100,000ダルトンより小さい；（c）活性がトリプシンによる分解に対して感受性である；（d）MIP-1αまたはTGFβよりも疎水比であり、そして逆相クロマトグラフィーにより両者から分離可能である（実施例12参考）；（e）水溶液中で37℃、55℃または75℃で１時間加熱した後でも生物学的活性が保持されている；（f）１％塩酸のアセトン溶液を用いて沈澱させた後でも生物学的活性が保持されている。本発明はさらに、短時間のプレインキュベーションの後のインビトロアッセイにおける阻害の達成能力によって特徴付けられ、他の幹細胞インヒビター候補（例えば、MIP-1α、TGFβ、および種々のオリゴペプチド）と区別される（実施例５参照）。本発明はまた、種々の疾患の治療のためのINPROLを含有する薬学的組成物を包含する。本発明は、被験体に有効量の幹細胞阻害性組成物を投与することにより、幹細胞を死減させるかまたは損傷し得る薬剤に曝されることが予想される被験体を治療する方法を提供する。この方法によって保護された幹細胞は、通常は骨髄中に存在しかつ骨髄中で***している造血幹細胞であり得る。あるいは、幹細胞は上皮性であり得、例えば腸管または頭皮または身体の他の領域に位置し得、あるいは生殖器官内に位置する生殖細胞に位置し得る。本発明の方法は、望ましくは、ヒトに用いられ得るが、動物の治療もまた、本発明に包含される。他の局面では、本発明は、化学療法を受けている患者の造血幹細胞系、免疫幹細胞系または他の幹細胞系を保護しかつ回復させる方法を提供する。この方法は患者に有効量のINPROLを投与する工程を包含する。さらに別の局面では、本発明は、癌を有する患者に有効量のINPROLを投与して、骨髄、胃腸管、または他の器官の幹細胞を、化学療法または放射線療法の有害な作用から保護することにより、固形腫瘍によって特徴付けられる癌を含むあらゆる癌を補助的に治療する方法を包含する。本発明のさらに別の局面は、正常幹細胞の増殖を阻害するために、増殖性白血病細胞を内部に有する骨髄細胞を有効量のINPROLで処理する工程、および白血病細胞を破壊するために、細胞障害性薬剤で骨髄を処理する工程、を含む白血病の治療を包含する。この方法は、骨髄の増殖を刺激する他の薬剤（例えば、コロニー刺激因子）で骨髄を継続治療することによって効果が高まる。１つの実施態様において、この方法はインビボで行われる。あるいは、この方法はまた、移植のためにエクスビボで骨髄細胞を除去し拡張するのに有用である。さらに別の局面では、この方法は、増殖する幹細胞によって引き起こされるあらゆる疾患を有する被験体を治療する工程を包含する。乾癬、脊髄形成異常、ある種の自己免疫疾患、加齢による免疫低下のような疾患は、被験体に有効量のIN PROLを投与して問題の幹細胞の増殖を部分的に阻害することにより治療される。本発明は、幹細胞を死滅させるかまたは損傷し得る細胞障害性薬剤由来の損傷から幹細胞を可逆的に保護する方法を提供する。この方法は、そのような薬剤に曝されることが予想される被験体に有効量のINPROLを投与する工程を包含する。本発明は、その範囲内にブタのINPROLの精製を含み、そしてそのような精製タンパク質を使用して、INPROLのcDNAまたは遺伝子のクローニングに有用な配列データを得ることを予想する。本発明はまた以下を提供する：以下の手順によってブタまたは他の骨髄から単離された幹細胞増殖インヒビター（実施例１２参考）：（a）骨髄を抽出し、濾過によって粒子状物質を除去する；（b）56℃で40分間熱処理した後、氷浴で冷却する；（c）４℃で30分間10,000ｇで遠心分離することによって沈澱物を除去する；（d）10容量の撹拌された氷冷アセトン（１容量％濃度の塩酸を含む）に上清を添加し、４℃で16時間インキュベーションすることにより酸沈澱させる；（e）４℃で30分間20,000ｇで遠心分離することにより沈澱物を単離し、そして冷アセトンで洗浄した後、乾燥させる；（f）逆相クロマトグラフィーによって単離し、そして5-フルオロウラシルで前処理してネズミIL-3存在下でインキュベートした骨髄細胞によるコロニー形成の阻害、および280nmにおける吸光度およびSDS-PAGEにより活性をモニターする。本発明はまた以下を提供する：実質的に他のタンパク性物質を含まない幹細胞増殖インヒビターを精製する方法であって、前記の工程を包含し、さらに以下により詳細に記載される、方法。本発明はまた以下を提供する：幹細胞増殖インヒビターが、幹細胞の過剰増殖によって引き起こされる免疫抑制を改善するように作用する、ヒトまたは動物を治療する方法。本発明はまた以下を提供する：前記幹細胞増殖インヒビターが、細胞障害性薬剤または放射線照射手技に曝されることによって幹細胞が増殖するように誘導された後、投与される、ヒトまたは動物を治療する方法。幹細胞は、通常は休止しているが、化学療法後、細胞周期に入るように刺激される。これによって幹細胞は２回目の化学療法剤の投与に対してより感受性となる；本方法はこの治療から幹細胞を保護する。本発明はまた以下を提供する：前記幹細胞増殖インヒビターが、免疫応答を増大させるためにワクチン投与の前またはと同時にアジュバントとして投与される、ヒトまたは動物を治療する方法。本発明はまた以下を提供する：幹細胞を損傷から保護するために有効量の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、細胞障害性薬剤または放射線治療を受けたヒトまたは動物を治療する方法。本発明は、INPROLと呼ばれる幹細胞インヒビターを記載している。このインヒビターは、MIP-1-α、TGF-β、Frindelおよびその同僚のテトラペプチド、またはPaukovitsとその共同研究者のペンタペプチド（Wright & Pragnell、1992（前出）参照）のような当該分野で公知のインヒビターとは異なる。INPROLは、INPROLと上記テトラペプチドおよび上記ペンタペプチドとを区別する限外濾過によれば、10 ,000ダルトンを超える分子量を有する。それは、逆相クロマトグラフィー系においてはMIP-1αまたはTGFβよりも疎水性であり、逆相クロマトグラフィーはそれをそれらのサイトカインと区別する。さらに、その作用様式は、前記のいずれのインヒビターの作用様式とも異なり、そのモードにおいては、プレインキュベーションの期間でのみ用いられる場合、それはインビトロアッセイにおいて活性である。例えば、MIP-1-αは、プレインキュベーションの期間でのみ用いられる場合、効果的ではない（実施例５）。さらに、INPROLは、「高増殖性潜在細胞（hi gh prollferative potential cells）」（HPP-PFC）を測定するアッセイにおいて活性であるが、MIP-1-αは活性ではない（実施例６）。図面の簡単な説明図１〜４は、各精製段階後の生成物のSDSポリアクリルアミドゲル泳動を示す。図５は、最終精製物のHPLCクロマトグラムを示す。図６は、INPROLを含まない場合（コントロール＝100％）および、種々の濃度のINPROLを含む場合のFDCP混合系の細胞内へのトリチル化チミジンの取り込み（ cpm）を示す。データは、コントロールの値に対して正規化される。図７は、テストステロンプロピオネート（TSP）、TSP＋INPROL、または賦形剤（vehicle）（コントロール）を用いてマウスを処理した後の細胞周期のＳ期にある細胞の％を示す。各グループは25匹を含んでいた（時点毎に３〜４匹）。図８は、２用量の5-FUで処理され、INPROL処理を受けたかまたは受けていないマウスの生存を示す。各グループは30匹を含んでいた。図９は、放射線照射され、INPROL処理を受けた場合および受けていない場合のマウスの生存を示す。各グループは50匹を含んでいた。図１０Ａおよび１０Ｂは、Ara-CまたはAra-C＋INPROLで処理した後、１週間目（１０Ａ）および３週間目（１０Ｂ）の正常骨髄の長期培養細胞の再生を示す。図１１は、致死量の放射線照射を行い、培地（コントロール）またはINPROL（ 25ng/ml）で４時間プレインキュベーションした後に、３×10⁴個の骨髄細胞を移植した後のマウス（各グループ75匹）の生存を示す。生存は30日間モニターされた。図１２は、致死量の放射線照射を行い、INPROLまたは培地で４時間プレインキュベートされたドナーの骨髄細胞により回復した後のマウスの骨髄細胞により14 日後に培養物中で形成されたCFU-GMの数を示す。図１３は、リンパ球の長期培養物から毎週取り出し、洗浄し、そして培地またはINPROLで４時間プレインキュベートした後にIL-7（10ng/ml）と共に接種される懸濁細胞を示す。図１４は、INPROLで処理された白血病の末梢血液細胞の改善された再生能（re populating ability）を示す。長期培養開始細胞（LTC-IC）は、粘着性および非粘着性LTC細胞をINPROLと共に、およびINPROLなしで接種し、７日目にCFU-GMの数を数えることにより測定された。データはコントロールの値に対して正規化される。図１５Ａは、53％アセトニトリルで溶出した精製INPROLのＣ４逆相クロマトグラムを示す。図１５Ｂは、43.9％アセトニトリルで溶出したMIP-1-αのＣ４逆相クロマトグラムを示す。図１５Ｃは、INPROLの粗調製物および逆相の後精製された調製物のSDS-PAGEクロマトグラムを示す。本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を記載する。この説明は、本発明の例示であるが、本発明を特に限定すると解釈されるべきではなく、そして当業者の理解範囲であるような変化は本発明の範囲に入ると考えられるべきである。好適な実施態様の詳細な説明 INPROLは、可逆的に幹細胞の***を阻害する。特に、INPROLは、造血幹細胞の細胞***を一時的に阻害することに効果的である。従って、本発明の方法は、癌またはウイルスに感染した細胞を破壊するために用いられる化学療法剤または放射線によって引き起こされる損傷から幹細胞を保護することによって、患者の造血系、骨髄系および免疫系に関する化学療法の望ましくない副作用を軽減することに用いられ得る。本発明の一つの実施態様では、INPROLは、化学療法剤が疾患細胞に作用している間に、幹細胞***を阻害するのに十分な用量で患者に投与される。化学療法剤がその機能を発揮した後、INPROLによって阻害された幹細胞は、さらなる治療を受けずに***細胞に戻る。造血再生を高めることが所望されるならば、刺激性成長因子またはサイトカインがさらに用いられ得る。代表的な臨床状況においては、INPROLは、例えば、0.01〜１mg/kgの精製または組換えINPROLを、例えば標準的化学療法または放射線治療の４〜60時間前に投与することを用いて、静脈注射または点滴により患者に投与される。本発明の別の実施態様では、INPROLによる前処理は、患者が通常耐えられる用量を超える増加した化学療法剤用量または放射線量を可能にする。必要に応じて、G-CFS、幹細胞因子のような刺激性成長因子が、化学療法または放射線治療の後に用いられて、さらに造血再構築を改良する。本発明の別の実施態様では、INPROLは、移植のために自家骨髄を調製する方法において用いられる。骨髄は、有効量のINPROLでエクスビボで処理されて、細胞 ***を阻害し、次いで骨髄培養物に有効量の化学療法剤または放射線を投与することによって癌性細胞を除去する。細胞周期が進行している細胞に特異性を有する化学療法剤が好ましい。このように処理された骨髄は、自家ドナー内に再注射される。必要に応じて、患者は、造血を刺激することが知られている薬剤で治療されて、患者の造血再構築を改善する。本発明の別の実施態様では、INPROLは、白血病治療の補助的な治療として用いられる。例えば、白血病細胞がINPROLに応答しない病態では、白血病の骨髄細胞はエクスビボでINPROLにより処理される。正常幹細胞の増殖はINPROLの投与により妨げられる。従って、増殖する白血病細胞が細胞周期に特異的な細胞障害性薬剤により処理されている間は、正常幹細胞の集団は損傷から保護される。さらに、IL-3またはGM-CSFのような刺激性サイトカインは、薬剤治療または放射線治療の間に必要に応じて投与されて白血病細胞における細胞周期の進行を誘導するが、正常幹細胞はINPROLにより保護される。患者は、白血病細胞を破壊するために化学療法剤または放射線により治療され、次いで除去された骨髄は、造血再構築を確立するために患者内に移植されて戻される。同様に、血液細胞または白血球を含む重篤なウイルス感染（例えば、HIV感染）にかかった患者を治療するための本発明の別の実施態様においては、骨髄はエクスビボでINPROLにより処理され、その後抗ウイルス薬剤、感染細胞を破壊する薬剤、または感染細胞を排除するための抗体による系により処理される。患者からウイルスの宿主細胞を根絶するために、骨髄の機能を破壊する（myeloablativ e）抗ウイルス剤または骨髄の機能を破壊する化学療法の後、INPROL処理した骨髄は患者に戻される。本発明の別の実施態様では、INPROLは過剰増殖性幹細胞に関連した疾患を治療するために用いられる。例えば、乾癬は、皮膚の過剰増殖する上皮細胞によって引き起こされる疾患であり、時には細胞障害性薬剤により治療される。幹細胞増殖を含む他の前腫瘍性病変は、幹細胞の増殖を全体的にまたは部分的に阻害するために用いられる有効量のINPROLに影響されやすい。これらの使用のため、INPR OLを含む局所的または経皮的な送達組成物は、非経口投与の代わりとして、適切な場面で用いられる。ほとんどの白血病の場合、白血病前駆細胞は、INPROLにより影響を受けない分化細胞集団であり、従って上記のようなINPROLを用いる方法によって治療される分化細胞集団である。白血病前駆細胞が非常に原始期のものであり、INPROLによる阻害に対して直接的に感受性である場合には、白血病細胞の増殖は有効量のINPROLの投与によって弱められる。モノクローナルまたはポリクローナルである抗体は、INPROLポリペプチドに対して標準的な技術によって開発される。これらの抗体またはINPROLポリペプチドは、当該分野では公知の多くのタイプの検出可能な標識により標識される。次いで、標識されたINPROLまたは抗INPROL抗体は、幹細胞マーカーとして用いられ、診断を目的として患者に直接それらを投与することによって幹細胞を同定および単離する。あるいは、これらの標識されたポリペプチドまたは抗体はエクスビボで用いられ、骨髄中の新生物細胞を除去する前にそれらを除き得るように骨髄調製物中の幹細胞を同定する。同様の方法で、このような標識されたポリペプチドまたは抗体は、上皮性または他の幹細胞を単離および同定するために用いられる。さらに、このような抗体は、標識されていても標識されていなくても、INPROL活性の中和化によって治療的に、または循環しているINPROLレベルを検出することによって診断的に用いられる。もしブタの因子がヒト免疫系から著しく有害な抗体の産生を誘発しないならば、ブタの因子は本発明の方法に用いられる。INPROLの活性と同様の活性を有する類似または同種のヒトタンパク質は、本発明の範囲内に入る。そのようなタンパク質は、標準的な技術を用いて、ヒト遺伝子または組換えヒトINPROLの発現用の cDNAライブラリーからクローニングされる。例えば、精製タンパク質から得られる配列情報を用いて、例えば32-リンで標識され得るオリゴヌクレオチドプローブが構築され、そして適切なcDNAライブラリー（例えば、骨髄）をスクリーニングするために用いられる。あるいは、適切な供給源（例えば、骨髄）由来の発現ライブラリーは、抗体を用いて、または適切な機能的アッセイ（例えば、実施例２に記載されるようなアッセイ）を用いて、INPROLをコードするcDNAに対してスクリーニングされる。他の種に由来するINPROLの同種または類似のバージョンは、上記の本発明の治療上の実施態様と同様に、種々の獣医学的使用に用いられる。さらに、幹細胞阻害因子は、細胞周期の進行している幹細胞を***しない「休止」期に可逆的に移行させることによって、それらに作用する。休止している幹細胞を刺激して***させることが望ましい場合、例えば、癌の化学療法剤または放射線により患者を治療した後、コロニー刺激因子および他の造血刺激剤が被験体に投与される。このような因子の例としては以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：M-CSF、CSF-1、GM-CSF、G-CSF、巨核球-CSF、または他のサイトカイン、例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-1 1、IL-12、IL-13、IL-14、あるいはエリスロポエチン。 INPROLポリペプチドまたは幹細胞阻害活性を有する活性フラグメントは、下記のプロトコルで例示されるように、精製されるか、または幹細胞阻害活性用の適切なバイオアッセイを組み合わせた従来の化学的プロセスによって合成される。本発明の１つの実施態様では、治療的に有効な量のINPROLタンパク質または治療的に有効なそれらのフラグメントは、薬学的に受容可能なキャリアと混合して用いられる。このINPROL組成物は、一般的に、非経口的注射または点滴によって投与される。皮下注射、静脈注射、または筋肉内注射の経路が、達成される治療的効果によって選択される。計画的に投与される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、発熱物質がなく、非経口的に受容可能な水溶液の形態である。薬学的に受容可能なタンパク質溶液は、pH、等張性、安定性、キャリアタンパク質などに関する要件を有し、当該分野の技術に属する。過剰増殖性幹細胞を治療する方法における投与に関しては、INPROLを含有する組成物は、局所的にまたは経皮的なパッチを介して過剰増殖領域に投与され、その効力を局在化および最適化する。そのような細胞障害性薬剤に曝されることが予想される被験体を治療する方法または過剰増殖性幹細胞を処理する方法に含まれる投与量レジメは、担当の医師により、薬剤の作用を改変する種々の要因；例えば、症状、体重、性別、患者の規定食、感染の重度、投与時間、および他の臨床的要因を考慮して決定される。一般に、毎日のレジメは、１〜100μg/kg（体重１ｋｇ当たりのINPROLタンパク質またはそのフラグメントマイクログラム数）の範囲である。被験者が細胞障害性薬剤または放射線に曝された後、本発明の治療方法は、必要に応じて、被験体に１種またはそれ以上のリンホカイン、コロニー刺激因子、または他のサイトカイン、造血素、インターロイキン、または一般に幹細胞の成長および***を刺激し、INPROLによる前処理により阻害される成長因子（およびそれらの派生物）を投与することを用いる。造血を促進するこのような治療剤としては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、Meg-CSF、M-CSF、CSF-1 、GM-CSF、G-CSF、またはエリスロポエチンが挙げられる。これらの薬剤の投与量は、化学療法または骨髄移植後の造血再構築の促進における効能に対する臨床試験にそれらを用いたときに得られる知見によって選択される。これらの投与量は、患者の身体症状の変化および被験体が曝された化学療法剤または放射線の量およびタイプを補償するように調整される。治療を受けた患者内へのINPROLの投与によって引き起こされる幹細胞の阻害の回復の進展は、従来の方法によってモニターされる。白血病の治療では、正常な幹細胞の細胞周期の進行を阻害するINPROLと、IL-3 またはGM-CSFのような白血病細胞の成長の刺激因子の両方を、細胞障害性薬剤治療または放射線照射の間に同時に投与することが有利である。このプロトコルにより、正常細胞と白血病細胞との間の細胞周期の進行状態および薬剤感受性に最も大きな違いを達成し得る。実施例１：インビボ幹細胞増殖阻害アッセイ幹細胞増殖の検出のために、細胞周期のＳ期にあるCFUの数を³H-チミジン「自殺（suicide）」法（Beckerら、Blood 26:296-308、1965）により測定した。未成熟の造血前駆細胞--脾臓のコロニー形成単位（CFU-S）--を、致死量の放射線を照射したマウスの脾臓において肉眼で見えるコロニーを形成させることにより、インビボで、造血細胞の静脈注射の８〜12日後に検出した（Till & McCul loch、1961）。標準的CFU増殖アッセイに関しては、H-チミジン「自殺」の方法が通常適用される（Beckerら、1965）。この方法は、DNAの前駆体である放射標識したチミジン（³H-チミジン）をDNA合成中の細胞内に取り込むことに基づいている。試験の時点で細胞周期のＳ期にあるこのCFU-Sは、高い放射活性により死滅しており、そのため脾臓ではコロニーを形成できない。従って、³H-チミジンなしでインキュベートされた細胞サンプルの注射によって形成されるCFU-Sの数と、³H-チミジンと共にインキュベートされた同じ細胞との間の違いは、元のサンプルにあった増殖性CFU-Sのパーセンテージを示す。インヒビター試験は、インヒビターが細胞周期が進行しているCFU（正常マウスの骨髄では７〜10％程の低さ）に影響する限り、刺激を受けていない動物由来の骨髄幹細胞集団に行うことはできない。 CFUの増殖を刺激するために、フェニルヒドラジン（PHZ）刺激、または致死量以下の放射線照射を用いた（Lord、1976）。本発明者らは、テストステロンプロピオネート（TSP）がCFUの細胞周期の進行に刺激効果を及ぼすこと（Byronら、Nature228:1204、1970）に基づいて、TSPの注射を発明し、それによって試験は簡素化され、いかなる副作用も引き起こされなかった。TSPは、注射後20〜24時間以内にCFU増殖の刺激を誘導し、そしてその効果は少なくとも７日間見られた。インヒビターの精製の間に画分のスクリーニングに用いられた手順は以下の通りである：マウス：全ての試験を通じてBDF₁またはCBF₁マウス種を用いた。 30〜35％のCFUをＳ期に誘導するために、ドナーマウスを、0.2ml/マウスの腹腔内注射によって10mg/100gの用量のTSPで処理した。 24時間後、細胞懸濁調製物のため骨髄を大腿骨から取り出す。次いで、１ml当たり5×10⁶から10×10⁵個の細胞を異なるコントロールおよび試験画分と、37℃ で3.5時間水浴中でインキュベーションする（各グループは試験管２本ずつ、標識したものと標識していないもの用） 3.5時間後、³H-チミジン（１mCi/ml、比活性18〜25Ci/mmole）を、標識したもの用の各試験管に細胞懸濁液１ml当たり200μlずつの容量で添加し、標識していないもの用の試験管には何も添加せず、37℃でさらに30分間インキュベーションし続ける。 30分間のインキュベーションの後、400μg/mlの放射能活性のないチミジンを含む10mlの冷培地（４℃）を添加することにより、死滅反応を停止させる。細胞を十分に洗浄する（３回）。細胞を再懸濁し、そして注射にとって所望の濃度、通常マウス１匹当たり0.3 〜0.5ml中２〜４×10⁴個細胞、まで希釈する。１グループ当たり８〜10匹のレシピエントマウスを注射の６時間以上前に放射線照射する。９〜12日目にレシピエントの脾臓を集め、そしてTellesnitsky溶液中で固定して、コロニー数を目で数える。式を用いてＳ期にある細胞のパーセンテージを計算する。ここで、a--³H-チミジンを有するCFUの数ここで、b--³H-チミジンを有するCFUの数表４に示されるINPROLの試験データは、INPROLによる処理の後に細胞周期の進行している幹細胞が³H-チミジンの作用に対して耐性になることを示していた。同じことは、Ｓ期特異的細胞障害性薬剤であるシトシンアラビノシドおよびヒドロキシ尿素にも当てはまる（データは示していない）。次いで、処理された幹細胞を放射能活性のないチミジンを含む冷培地で洗浄した場合、生き残った幹細胞はマウス脾臓内で増殖して、正常にコロニーを形成する。実施例２：インビトロ幹細胞増殖阻害アッセイ以下の試験システム（Lordら、The Inhibitors of Hematop oiesis pp.227-239、1987）を用いて、INPROLの直接的効果を示した。多系統（m ultilineage）因子（IL-3）依存性幹細胞系であるFDCP mix A4（A4）を、コロニー刺激性IL-3の供給源として、20％ウマ血清および10％WEHI-3調整培地を添加したIMDM培地中で維持した。増殖のためのトリチル化チミジン取り込みアッセイを測定した：20％ウマ血清および50％WEHI-3 CMを有する100μlの培地中の５×10⁴個のA4細胞を、５％CO₂ 中で37℃、16時間インキュベーションした。 INPROLまたは粗製のBME（画分IV）を開始時点で添加した。次いで、3HtdR（50 μl中3.7KBq、740 GBq/mmole）を各グループに添加し、さらに３時間インキュベーションした。増殖レベルを集めた細胞によって測定した。正常骨髄抽出物またはINPROLを段階的な用量で存在させて成長したFDCPmix-A4 細胞によるトリチル化チミジン（3H-Tdr）取り込みを図６に示す。INPROLの精製組成物は開始物質より少なくとも1000倍活性が高いことがわかった。曝す時間（ 16時間）は、効果的な阻害に対して重要な因子であり、そしてA4細胞系の幹細胞に直接的な効果を及ぼしている証拠を示している。実施例３：インビボのINPROL注射によるCFU増殖の阻害：用量および効果の持続期間インビボで注射されたINPROLの効果の研究は、INPROLがCFUの細胞周期への加入を効果的にブロックし得、これによりそれらの細胞をさらなる処理の細胞障害効果から保護し、その臨床使用への可能性を示すことを示した。実験プロトコルには２つの到達点がある：インビボで注射された場合にCFUに対するINPROLの効果をチェックすること、および、細胞周期の進行している幹細胞に関してINPROL活性の有効持続期間を明確にすること。 CFUの増殖を刺激するために、上記の実施例１で述べた効果に基づいて、テストステロンプロピオネートの注射を用いた。マウスBDF1をTSP（10mg/100g）と共に第０日に注射した；24時間後に、各実験グループのマウス（各グループ４匹）に０μg、５μg、10μg、15μg／マウスの用量範囲で腹腔内にSCPI注射を１回行った。 SCPI注射の24時間後、マウスを屠殺し、そして細胞周期の進行しているCFU-S のパーセントを実施例１に記載されたアッセイにより測定した。TSP注射は、未処理のマウスでは７％であったのに対し、約50％のCFU-Sを細胞周期に誘導した。２μg／マウスという程に低い用量のINPROLは、TSPに誘導される増殖を阻害して正常レベルまで下げることができた。有効持続期間の評価に関しては、１グループのマウス（１グループ当たりマウス21匹）にTSPのみを注射し、そしてもう一方のグループにT SPとINPROL（TSPの24時間後）の両方を注射した。CFUの細胞周期の進行は、各グループから３匹ずつドナーを取り出して、記載した方法で骨髄のCFU-Sの細胞周期の状態を測定することにより、24時間毎に１週間測定した（実施例１参照）。図７に示すデータは、TSPの有効持続期間は少なくとも７日間であるが、１回のI NPROLの注射によりCFU-Sは休止期に入り、たった48〜72時間は細胞周期に入らないようにすることができることを示している。癌および白血病の化学療法に用いられる化学療法剤の大多数は、インビボでは比較的半減期が短い（通常24時間より短い）ので、INPROLの効果は、得られたデータによれば、シトシンアラビノシドまたはヒドロキシ尿素のような化学療法剤がインビボで活性である間は有効期間よりも長く維持される。さらに重要なことは、長い間隔（24時間より長く96時間より短い）を有する化学療法および放射線照射の治療は、第１回目（幹細胞に損傷を与えない）と第２回目のCFUに損傷を与える細胞障害性手法との間に必要であり、化学療法剤または放射線照射の２回の適用の間の間隔にINPROLを１回注射すれば十分である。何回かの繰り返し行う細胞障害性治療または放射線照射に関しても、INPROL効果の持続期間に基づいて同じストラテジーを適用し得た。実施例４：5-FUによる処理の後、迅速に周期に入るように刺激された最も原初の造血幹細胞は、INPROLにより第２回目の5-FU被曝から保護される薬剤5-フルオロウラシル（5-FU）は、骨髄およびリンパ球の区画（compartmen t）中の細胞数を劇的に低減する。それは通常、細胞周期特異的であり、細胞周期のＳ期の間または前にヌクレオチドアナログをDNA内に取り込むことは細胞死となるので、増殖細胞を迅速に標的とすると考えられている。マウスの骨髄の長期生存および免疫造血再構築は、5-FUの１回の用量では影響を受けない；しかし、多能性造血幹細胞（PHSC）は最初の投薬後約３〜５日間という短い期間に第２回目の5-FUの投薬に対して攻撃されやすくなるということが示された（Harrison ら、Blood 78:1237-1240、1991）。PHSCは、通常、5-FUの１回の投薬に対して細胞周期に入るのが遅すぎて効果的ではなく、そして第１回目の5-FU処理の結果起こる刺激により刺激されて迅速に細胞周期に入ることが説明され得る。本発明者らは、PHSCは、INPROLにより遅い細胞周期状態に戻り得、これにより２回目の5- FU処理から保護され得るということを提案した。これらの実験に用いられたマウスは、BDF1雄マウスであった。5-FU（Sigma）の貯蔵液を生理食塩水中で10μg/mLの濃度となるように調製した。各処理マウスは、実験第０日に尾部静脈を介して体重10g当たり２mgの5-FUを受けた；24時間後、マウスにINPROL（10μg/体重100g）を腹膜内注射し、そして第３日に第２回目の5-FUの用量を注射した。生存研究は、各々30 匹のマウスからなる実験グループ（INPROL処理）およびコントロールグループにおいて、マウスの死亡をモニターすることにより行った。生存曲線を図８に示した。実施例５：骨髄細胞においてINPROLでプレインキュベーションした場合とMIP1α でプレインキュベーションした場合の効果この実験の目的は、インビトロでマウス骨髄細胞に対するInprolおよびMIP1α でプレインキュベーションした場合の阻害効果を比較することであった。以下の手順を用いた：インビボ：大腿骨から骨髄を集める48時間前に、６〜15週齢のBDF1マウスに20 0mg/kgの5-FUを腹腔内に注射する。インビトロ：単一の細胞をプールした懸濁液を計数し、そして５×10⁶細胞を、InprolまたはMIP-1αと一緒にまたはなしで、５％ウマ血清、L-グルタミン添加のIMDM培地と総容量２mlとして、37℃で５％CO₂で４時間インキュベーションする。次いで、細胞を２回洗浄し、そして再計数した。それらを以下の最終条件下でメチルセルロースに接種する： 0.8％メチルセルロース 25％ウマ血清 20ng/ml 組換えネズミIL3 L-グルタミン添加５×10⁵細胞／ml IMDM培地プレートを11日間37℃で湿度100％中５％CO₂でインキュベーションした。50細胞より多いコロニーを計数した。実施例６：INPROLはHPP-CFC増殖を阻害するネズミ再構築幹細胞および初期前駆体を評価するインビトロアッセイは、高増殖性潜在コロニー（HPP-PFC）アッセイである；他の関連アッセイ、例えばCFU-A 、CFU-GM、CFU-EおよびCFU-GEMMは、徐々に制限された前駆細胞の集団を検出する（M.Moore、Blood 177:2122-2128、1991）。この例は、INPROLによる細胞の前処理がそれらの増殖を阻害するのに対し、MIP-1αは、これらの実験条件下では阻害しないということを示す。 BDF1マウスを、それらの骨髄をHPP-CFC数に関してアッセイする前に、5-フルオロウラシル（200mg/kg腹腔内）で処理した。細胞を遠心分離により洗浄し、そして添加剤のない培地（コントロール）、INPROL（25ng/ml）またはMIP-1α（20 0ng/ml）を含む培地において、10⁶〜５×10⁶/mlの密度で４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そして30％FCSと、5637細胞系およびWEHI-3B細胞系由来の組合せ調整培地とを有する寒天（0.3%）に接種した（7.5％の各調整培地、Sharpら、 1991の勧めによる）。接種濃度は、60mmの皿に５×10⁴細胞／mlであった。14日目にコロニー数を計数し、そして結果を以下に示す。これらの結果により、MIP-1αは、プレインキュベーションの期間中にのみ存在した場合には、ほとんどの未成熟な前駆体の増殖を阻害しなかった。INPROLは、これらの条件下で増殖を効果的に阻害し、生物学的活性という点から見るとIN PROLとMIP-1αとの間には基本的な違いがあることを示している。実施例７：放射線誘導性骨髄形成不全からの回復に対するINPROL治療の効果骨髄形成不全は、放射線癌治療の一次的制限毒性（primary limiting toxicit y）である。ある種の成長因子（例えば、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン）は、放射線誘導性骨髄形成不全からの回復を促進し得るということが示されてきた。幹細胞増殖のインヒビターの使用による保護という概念は、血液学的な損傷に上手く対処することにおける異なった補足的なアプローチである。初期に開発された処理手順（実施例３、４）に従うように、致死量の放射線を照射されたマウスのモデルを確立した。９Gyのコバルト60 を受けたマウスは10〜14日後に死亡し始め；30日目までには死亡率は約50％となる、ということは当該分野では公知である。この致死用量を、それを連続した２回の適用に分けて各4.5Gyずつとし、投薬と投薬の間は３日間の間隔を置いて、本発明者らのモデルに用いた。予備データは、そのモデルの生存曲線が、９Gyによる１回の放射線照射で知られた生存曲線と非常に近いことを示した；さらに、 CFU増殖に関する試験は、第１回目の放射線照射の24時間後に35〜50％のCFUが増殖するように誘導されることを示した。このような細胞は第２回目の投薬の前に送達される幹細胞インヒビターにより保護され得る。この可能性を試験するために、マウス（50匹／グループ）に第０日に4.5Gyを照射し、その24時間後に腹腔内にINPROL２μｇ／マウスを投与し、コントロールグループには生理食塩水を注射し、そして第２回目の放射線の照射量（4.5Gy）を第３日目に与えた。図９は、INPROLの１回の用量を投与した後の増大した生存を示す。モデルの状態は、固形腫瘍により特徴付けられる癌を含むいかなる癌の治療にも臨床的に適切であり、このような治療は、２回続けた放射線照射の間に有効量のINPROLを送達することにより癌を有する患者に施され、それによって癌の治療に用いられる放射線の照射線量をより多くすることができる。この様式を化学療法剤に広げることも可能であるべきである。実施例８：自家骨髄移植へのINPROLの使用骨髄移植は、いくつかの白血病（CML、AML、およびその他）にとっては唯一知られた治癒的な治療である。点滴のための自家BMTのエクスビボ調整、白血病細胞の混入のない正常幹細胞の潜在的な自己供給源を提供し、そしてレシピエントの造血系を再生させて（repopulate）、積極的で効果的な治療を可能にする。１．INPROL効果の研究用の長期骨髄培養物L1210白血病モデルはAraCによる除去の間、正常な造血を保持する長期骨髄培養物（LTBMC）をToksozら（Blood 55;931-936、1980）に従って確立し、そして白血病細胞系L1210を２週間の間LTBMCと共培養した。正常前駆細胞および白血病前駆細胞の同時成長はこれらのLTBMC/L1210の混合培養物内で起こり、それは白血病患者の骨髄内と同様の状況である。正常なコロニー形成単位CF Uと白血病CFUとの間の区別は、WEHI-3（ネズミIL-3産生細胞系）由来の調整培地の存在下または非存在下での寒天コロニーとしてそれらを成長させることにより可能であった。正常細胞はIL-3非存在下でアポプトーシス（apoptosis）を受けるのに対し、白血病細胞はIL-3非存在下でコロニーを形成し得る。LTBMC-L1210 組成物由来の懸濁細胞は、接種された50,000細胞当たり、IL-3存在下で約150コロニー（正常造血クローン）を示し、IL-3なしで成長した場合70コロニー（白血病クローン）を示した。除去手順は、以下の通りであった：第０日に、全ての懸濁細胞および培地（10 ml／フラスコ）をLTBMC-L1210の入っているフラスコから取り出し、200μgのシトシンアラビノシド（AraC）を含む２mlの培地で置き換えた（Tsyrlovaら、Leuk emia:Advances in Biology and Therapy 、第35巻、1988）；20時間のインキュベーション後、フラスコを洗浄し、そして２mlの新鮮な培地のみ（コントロールグループ）または25ng/mlのINPROLを含む培地と４時間置き換えた。このプレインキュベーションの後、細胞を100μg／フラスコのAraCと一緒に37℃で３時間再びインキュベーションした。各グループは４本のフラスコを含んだ。LTBMC-L1210 培養物を３回洗浄し、そして新鮮なLTBC培地で置き換えた；それらを再生研究のため前述のように３〜４週間維持した。データを図１０に示す。AraCのみで処理されたコントロール培養物には細胞の成長が見られなかったが、INPROLで保護されたフラスコ内では、粘着層由来の前駆細胞の増殖のため、造血再生が非常に急速に起こった。さらに、実験グループ由来の細胞は、寒天に接種された場合、IL-3存在下では50,000細胞当たりわずか約100 CFUしか成長しなかった；少なくとも４週間の間には白血病細胞の成長は観察されなかった。従って、エクスビボでINPROLと組み合わせて有効量のAraCにより処理された骨髄は、癌性細胞を除去されるが、幹細胞は保護される。この様式は他の形態の化学療法または放射線治療に広げることが可能であるべきである。２．骨髄再生能（MRA）および30日間放射線防御は、インビトロのINPROL治療により増大する。 MRAは、致死量の放射線を照射されたマウスの骨髄を再生する細胞の能力であり、30日間の放射線防御を付与する能力を伴っていて、骨髄抑制動物を救うための可能性（potential）の直接的なインビボ測定である（Visserら、Blood Cells 14:369-384、1988）。放射線防御研究に関して、BDF1マウスは9.5Gyで放射線照射され、テストステロンで刺激されたドナー由来の骨髄の移植により回復する。レシピエントの１グループは培地で（コントロール−グループＡ）、そして別のグループ（グループＢ）は25ng/mlのINPROLで、４時間プレインキュベートされた骨髄細胞により回復した。両グループの細胞を洗浄し、そしてマウス１匹当たり30,000細胞を放射線照射された動物に移植した。生存データを示す（図１１）。３つの実験の合計を、コントロールを100％に正規化して示す。30日目までに、コントロールグループの生存マウスが36.5％であるのに対し、INPROLによるインキュベーションは 61.8％まで増加させている。 INPROLによるプレインキュベーションによって誘導されるMRAの増加は、放射線防御を改善するメカニズムの１つであり得る。この仮説を試験するため、Viss erら（前出）に従って MRAを測定した。簡単にいえば、ドナーBDF1マウスをテストステロンで前処理し、それらの骨髄を培地またはINPROLで４時間プレインキュベーションし、そして放射線照射された動物に注射した。13日目に、レシピエントの大腿骨由来の骨髄細胞を、20％ウマ血清、および10％WEHI-CMの存在下で、３つの異なる濃度（0.0 1、0.05、0.1当量の大腿骨（equivalent of a femur））で寒天に接種した。７日目のコロニー数は、その時点のレシピエントの骨髄中のコロニー形成細胞がドナーの未成熟幹細胞の前駆細胞である限り、MRAのことを表す。図１２に見られるように、INPROLでプレインキュベーションされた細胞集団の MRAは、コントロールグループ（B）の場合より多い。実施例９：INPROLの幹細胞への抗過剰増殖効果は、それらの分化の異常を変化させ得る CFUの過剰増殖は、細胞障害性薬剤または放射線照射からの回復中に見られるだけでなく、正常な加齢の結果としても見られ、そして骨髄異形成症候群（MDS ）の主要な特徴であると考えられている。それは、顆粒球に沿った分化の間、赤血球が分化する有病率のような分化障害を伴う。骨髄細胞を25ng/mlのINPROLまたは培地（コントロール）と共に37℃で４時間インキュベーションし、洗浄し、次いで20％ウマ血清、２U/mlエリスロポエチン、および10％WEHI-CMを有する寒天に接種した。BFU-eおよびGM-CFUコロニーの数を７日目に計数した。表５に示されるデータは、３つの実験をまとめたものであり、各グループから各時点で４匹を取り出した：４枚の皿に接種した。表５から明らかなように、無傷の動物（８〜12週齢のBDF1）由来の正常骨髄（ NBM）をINPROLと共にインキュベートすることにより、異なるタイプのコロニーの数および割合は変化しなかった；テストステロンプロピオネート（TSP）で前処理されたBDF₁ドナーは、前に示されたように（実施例１、３、４）、CFU増殖の増加、および赤血球前駆細胞の数（BFUeコロニー）の増加、およびGM-CFUの減少を示し、それはINPROLとのインキュベーションにより完全に取り消された。異常に高いレベルのCFU増殖はまた、細胞周期のＳ期のCFUの10％に戻った。CFUの過剰増殖は、例えばBalb/cマウス（表５）のようにウイルス性白血病誘発を高度に受けやすいある種のマウス種の特徴であることが知られており、そしてより高齢の動物においても観察し得る（表５）。TSP処理したBDF1マウスに見られる分化方向の決定付けられた（committed）前駆細胞の同じ再分布がBalb/cおよび23 〜25ヶ月齢のBDF1において観察され、それは一般に異常に高いレベルのCFU増殖を有する。CFUの増殖および分化の両方の修正は、INPROLとのインキュベーションによって可能であった。より一層臨床に適したものは、研究により、INPROLのインビボ注射（２μｇ／マウス）がCFUの増殖ならびに赤血球（BFUe）とGM-コロニーとの比の変化の両方に効果を及ぼすことが示された（表５）。実施例10：INPROLの免疫刺激活性高比率の増殖CFUを含む骨髄細胞とINPROLとのインキュベーションは、CFUの周期を変えるだけでなく、それらの分化を変えて、主に赤血球の分化から顆粒球およびリンパ球の前駆細胞へ変換する。このINPROLの性質は、細胞障害性の化学療法および放射線療法の免疫抑制的な副作用および過剰増殖幹細胞障害および加齢に伴う免疫抑制のため重要である。本実施例は、Wittlock & Witte（Ann.Rev.Immun.3:213-35、 1985）によって確立されたリンパ球長期培養（LLTC）由来の未成熟前駆体の前Ｂ前駆細胞への分化に及ぼすINPROLの直接的な影響を示し、これはIL-7を含むメチルセルロース中のコロニー形成によって測定される。 LLTCを、記載されたように確立し、そして新鮮なLLTC培地（Terry Fox Labs. ，Vancouver，Canada）を１週間に２回与えた。非粘着細胞を１週間に１度採取し、因子を洗い流し、そして25ng/mlのINPROLとまたはコントロールとして培地のみと４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、濃度が10⁵細胞／mlとなるように、30％FCSおよび10ng/mlのIL-7を含むメチルセルロースに接種した。３週間のデータを図13に示す。大きな前Ｂコロニーの数はコントロール中で変化し、時間とともに増加したが、INPROLとのプレインキュベーションは、常にコロニーの成長をコントロールレベルの４〜８倍に刺激した。このことは、免疫不全状態を抑制し、そして例えばワクチン投与に対して所望の免疫応答を増加させるのに有用であるINPROLの免疫刺激特性を示す。実施例11 ：INPROLは幹細胞の再生能を改善する--CMLの患者由来の長期培養開始細胞慢性骨髄性白血病（CML）は、造血幹細胞の致死的な悪性疾患である。慢性期にあるCMLを単一薬剤による化学療法、組み合わせ化学療法、脾摘出、または脾臓への放射線照射によって治療することは臨床的徴候および症状を制御し得るが、生存を有意に伸ばすことはない。CMLが慢性状態から促進状態に進むと、標準的な治療は効果的でない。現在では、骨髄移植（BMT）が唯一の既知の効果的なCML治療である。血縁でないドナーのBMTを用いる治療は組織不適合性の問題により困難である。適格なCML患者の40％未満にしか適合する血縁者がいない；従って自家移植が好ましい。長期培養（LTC）において成長するPh陽性患者由来の非白血病（Ph-陰性）骨髄前駆細胞を選択する能力と共に注入のための自己BMTのエクスビボ調整は、正常幹細胞の自己供給源がCMLの積極的で効果的な治療を行い得る可能性を示唆する。 BMTの状況においては、造血幹細胞は、長期間にわたって成熟した血液細胞を生成する能力を有する細胞として定義され得る。本発明者らはC.Eaves & A.Eave sによって開発されたヒトLTC系を、幹細胞数の定量用およびそれらの治療的使用のための操作手段として用いた。このことは、予め確立され、放射線照射されたヒト骨髄粘着層上に細胞を接種することを包含し、次いでこれらの培養物を５週間維持した。エンドポイント（end point）はこの期間の終わりに採取された培養物の総クローン原性細胞内容物（粘着および非粘着）である。このような条件下で生じたクローン原性細胞は、最初に添加された前駆細胞（長期培養開始細胞（LTC-IC））の数と直線関係にある；個々のヒトLTC-ICから生じた平均は、１LT C-ICにつき４クローン原性前駆細胞である。CML患者の骨髄が同様の条件下に置かれた場合、白血病性（Ph陽性）クローン原性細胞は迅速に衰退し、CML患者の残った正常LTC-ICの定量を用いることにより、培養自己移植片の移植により支持される集中治療から利益を得易い細胞を選択することが可能であることが既に示されている（Phillipsら、Bone Marrow Transplantat ion8:477-487、1991）。以下の手順を用いて、CML患者の末梢血液から確立された骨髄移植細胞中のクローン原性細胞（LTC-IC）の数におよぼすINPROLの影響を試験した。予め放射線照射した間質（stroma）上の長期培養と同様に培養を開始した。健常ドナーの末梢血液をコントロールとして用いた。CML患者のCML患者由来末梢血液細胞を、INPROL（25ng/ml）と共にまたはなしで４時間プレインキュベートし、洗浄し、そしてLTC-IC系に10日間置き、それに平行してLTC-IC中に５週間置いた。LTC-ICの数は、粘着細胞および非粘着細胞の両方を適当な成長因子を有するメチルセルロース（Terry Fox Laboratories、Vancouver、Canada）に接種することにより、クローン原性前駆細胞の数によって推定した。10日間成長させた培養由来の粘着および非粘着細胞の混合物を、INPROLと共にまたはなしでプレインキュベートし、さらに８週間予め確立させたフィーダー上に置き、クローン原性細胞の数の測定のため４週目と８週目に採取した。図14に示したデータは、健常ドナーの骨髄から始めた最初の10日間の培養ではLTC-ICに損失がなく、そして投入したLTC-IC数のおよそ30％が５週間たってもなお培養中に存在していたことを示す。CML患者の LTC-IC数は10日間の間に約８％にまで劇的に低下し、そしてさらなるインキュベーションによっても元には戻らなかったが、INPROLとの細胞のプレインキュベーションは、最初の数の30％までLTC-ICレベルを増加させ、そしてそれを８週間維持した。これらの予備データによって予想されるINPROLの臨床関連の適用は、新鮮なまたは培養の骨髄移植物の正常幹細胞内容物を選択的に改善するストラテジー、インビボの残留正常幹細胞の補充を高めるストラテジー、さらに患者へのさらなる移植のために新しい遺伝子物質をヒト骨髄幹細胞に転移させるプロトコルにおけるそれらの使用を包含する。実施例12 ：骨髄調製物由来の幹血液細胞増殖の免疫活性インヒビターの単離方法骨髄はブタの肋骨から単離した。ブタの胴体から肋骨を分離して筋繊維および脂肪を除き、断片に刻んで骨髄をBiophyzpribor社製の水圧プレス（hydropress ）によって抽出した。骨髄細胞を遠心機K-70中で2,000rpmで20分間遠心分離することにより分離する。次いで、抽出上清をAmicon USAメンブレンXM-100、PM-30 、PM-50をそれぞれ用いて限外濾過にかける。電気泳動による分析によると、この生成物の主要な成分はアルブミンである（図１参照）。生物化学的精製画分の骨髄抽出物およびタンパク質成分を、精製の各段階で、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを含む10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。電気泳動は20Ycmのゲルで５時間行った。次いでゲルを、エタノール：水：酢酸が５：５：１の混合物中の0.25クーマシーCBBC250で20℃で１時間染色し、そして７％酢酸を数回交換して洗浄した。７％までのドデシル硫酸ナトリウムおよび0.5〜１％までのメルカプトエタノールをサンプルに添加し、そしてそのサンプルをゲルに流す前に70℃で５分間インキュベートした。生成物の活性を幹造血細胞増殖の阻害方法により評価した（CFU）。この方法を以下に詳細に述べる。ステージ１．硫安沈澱による精製活性を、表１の結果に基づいて選択された飽和度40〜80％で25％の硫安を用いて沈澱させることにより精製した。精製の各工程の後の試験に用いられる調製物の量は、精製レベルによって決定し、始めの生成物の２×10^-2mgの用量と同じであった。活性を下式により決定した：変化％＝Sa％−Sb％ここで、ａは、コントロールのＳ％であり、ｂは、試験画分とのインキュベーション後のＳ％である。画分は、各活性試験の前、および次の各精製工程の前に硫安濃度を20倍低くするために脱塩した。ステージ２．ステージ１の不純物のあるインヒビターを脱塩後にイオン交換クロマトグラフィー（本発明者らの場合DEAE23セルロース）にかけて分画し、次いで酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）の勾配を用いて溶出する。インヒビターの活性画分は３〜５mMの間に溶出する。カラム体積は１mlであり、溶出速度は１時間に４mlであった。検出はクロマトグラフMillicromeにより230および280nmで行った。最も高い活性を示した画分１（図２参照）を単離し、５mM酢酸ナトリウム緩衝液中に溶出した（表２参照）。電気泳動データは、主なタンパク質混入物であるアルブミン（図３参照）がこの画分から除かれることを示し、さらに４回の精製に続く。ステージ３．ステージ２から部分精製されたインヒビターを直接G-75Sephadex カラムにかける。カラム体積は20ml（20×1）、溶出速度は2ml／時間である。溶出緩衝液は50mM NaCl、10mM Tris-HCl、pH7.5である。検出はクロマトグラフMillichromeにより 230および280nmで行った。最も高い活性を示した画分５を単離した。ステージ４．Pro-RECカラムを用いた逆相クロマトグラフィー（Pharmacia FPL C System）をアセトニトリル勾配における0.1％トリフルオロ酢酸中のUltrasfer a matrix 10μg上で行った。分子量16〜17kDの生成物の均質度は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたアクリルアミドゲル分析に示されるように90％に等しい（図６参照）。この結果を図４に示す。分画５についての活性を測定する。生成物の最終回収率は５％である。結果として、精製後の分子量16kDのタンパク質の総量は始めの生成物の650ng/ml である。精製プロセスの間、生成物は70℃の加熱インキュベーションを数分受けたが、生物学的活性の損失は検出されなかった。２．インビボ幹細胞増殖アッセイ（CFU）未成熟造血前駆細胞--脾臓のコロニー形成単位--CFUは、致死的に放射線照射されたマウスの脾臓中に、造血細胞の静脈注射後８〜12日後に、肉眼で見えるコロニーを形成することにより検出され得る（Till & McCulloch、1961）。標準的なCFU増殖アッセイである³Hチミジン「自殺」法が通常用いられる（Bec kerら、1970）。この方法は放射性標識チミジン（³H-チミジン）、即ちDNAの前駆体のDNA合成（細胞周期のＳ期）の間の細胞への取り込みに基づく。試験時に細胞周期のＳ期にあるCFUは、高い放射活性により死滅させられ、そして脾臓内で容易にコロニーを形成し得ない。従って、³H-チミジンなしでインキュベートした細胞サンプルの注射によって形成されたCFUの数と³H-チミジンとともにインキュベートした同じ細胞の注射によって形成されたCFUの数との違いは、増殖しているCFUのパーセンテージを示す。インヒビター試験は、インヒビターが細胞周期にあるCFU（正常マウスの骨髄中に７〜10％の低率で存在する）に効果を及ぼす限り、刺激されなかった動物由来の骨髄幹細胞群に関わることができない。 CFUの増殖を刺激するために、フェニルヒドラジン（phenylhydrazine:PHZ）刺激または致死量以下の放射線照射を用いた（Lord、Br.J.Haem.34:441-445、1976 ）。本発明者らは、CFUの細胞周期に及ぼすテストステロン−プロピオネート（TSP ）の刺激効果（Byronら、Nature 228:1204、1970）に基づくテストステロンプロピオネート（TSP）の注射を発明した。それは試験を簡便にし、いかなる副作用も引き起こさなかった。TSPはCFU増殖の刺激を注射後20〜24時間以内に誘導し、その効果は少なくとも７日間見ることができた。インヒビターについての精製中の画分のスクリーニングに用いられた手順は、以下の通りであった：マウス：全ての試験を通じてBDF₁またはCBF₁マウス血統を用いた。Ｓ期に30〜50％のCFUを誘導するために、ドナーマウスを１匹当たり0.2mlの腹腔内注射により10mg/100gの用量でTSPで処理した。 24時間後、細胞懸濁液調製用に大腿骨から骨髄を取り出す。次いで１ml当たり５〜10×10⁶細胞を、各グループ試験管２本ずつ（放射性含有用と非含有用）、異なるコントロールおよび試験画分とともに水浴中37℃で３〜５時間インキュベートする。３〜５時間後、³H-チミジン（１mCi/ml、比活性18〜25Ci/m.mole）を各放射性含有試験管に細胞懸濁液１ml当たり200μlずつ添加し、非含有用の試験管には何も添加せず、37℃でさらに30分間インキュベートする。 30分間のインキュベーションの後、死滅反応を400μg/mlの非放射性チミジンを含む10mlの冷培地（温度４℃）を添加することにより停止させる。細胞を十分に洗浄する（３回）。細胞を再懸濁し、注射に望ましい濃度（通常マウス１匹当たり0.3〜0.5ml中に２〜４×10⁴細胞）に希釈する。１グループ当たり８〜10匹の受容マウスに注射の６時間以上前に放射線照射する。９日目〜12日目に受容体の脾臓を採取し、そしてTellesnitsky溶液に固定し、目視によりコロニーを計測する。Ｓ期にある細胞の割合を下式を用いて計算する：ここでａ−³H-チミジンを有さないCFU数ここでｂ−³H-チミジンを有するCFU数実施例12B ：より大量のINPROLを単離するための他の方法最初の単離新鮮なブタの胴体から採った肋骨から筋繊維および脂肪を除き、次いでこれを刻んで細かくし、リン酸緩衝生理食塩水に1:1（重量／容量）の比率で浸漬する。得られた混合物を水圧プレス（hydraulic press）で粉砕し、固体骨物質と骨髄とを分離する。骨髄細胞懸濁液を回収し、そして４層のチーズ・クロース（cheese-cloth）を通して固形粒子を濾過する。濾液を56℃で40分間インキュベートし、次いで氷浴で４℃まで冷却する。分離した沈澱物を10,000gで30分間４ ℃で遠心分離することにより除去し、廃棄する。清澄化した上清を、１容量％の濃塩酸を含む10容量の撹拌された氷冷アセトンに30分間滴下して添加する。得られた混合物を４℃で16時間保存し、完全な沈澱物を形成させる。次いで、沈澱物を20,000gで30分間４℃で遠心分離することによりペレットにする。このペレットを冷アセトンにより洗浄し、そして乾燥する。 HPLC精製ペレットを、５％アセトニトリル（MeCN）および0.1％トリフルオロ酢酸（TFA ）を含むHPLC溶出緩衝液Ａに溶かし、最終タンパク質濃度を８〜10mg/mlとする。この溶液（0.5〜0.6ml）をPolisilODS-300（10mcm）で充填され、そして同じ緩衝液Ａにより平衡化された250×4.6mmのHPLCカラムにかける。溶出は緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂ（90％MeCN、0.1％TFA）の勾配により、流速１ml ／ｌ分で、以下のプログラムに従って行う。時間、分Ｂの％００４０５ 25 25 90 100％のＢを５分間流すさらなる工程を用いて再平衡化の前にカラムを洗浄する。次いで、カラムを開始時の状態に戻すため再び平衡化し、そして次の部分のタンパク質溶液をカラムにかける。分離の間、カラム溶出物をタンパク質ピークの検出のため280nmでモニターする。タンパク質物質を含む画分を回収し、分離したピークをプールして、30℃でロータリーエバポレーターにかけて乾燥させる。得られた残渣を蒸留水に溶解し、生物活性試験およびSDS-PAGE（14％ゲル、還元条件）によりアッセイする。活性物質を含むピークは、緩衝液Ｂが70％と80％との間に溶出し、SDS-PAGEによってアッセイされたように、16kDの主要なタンパク質バンドおよび速く移動するタンパク質の痕跡を含む。活性物質の分析を図１５に示す。500μgの精製INPROLをC4逆相カラム（Vydac ）にかけ、そして0.1％トリフルオロ酢酸中の５〜95％アセトニトリルの直線勾配を用いて溶出した。その物質は53％アセトニトリルで単一ピークとして溶出した（図１５Ａ）。しかし、250μgのMIP-1α（R & D Systems）を同じ条件で流した場合、それは43.9％アセトニトリルで溶出した（14％アセトニトリルより前に溶出する初期のピークは人工的で検出器内の気泡によることを銘記されたい）。従って、INPROLは、実質的には、このような条件下ではMIP-1αより疎水性である。TGF-βはこの条件下ではINPROLで観察される濃度より低い濃度で溶出することが知られている（Miyazon oら、J.Biol.Chem．263:6407-15、1988）。溶出したINPROL物質のゲルを図15Cに示す。レーン１は粗抽出物質、レーン２は、分子量マーカー、そしてレーン３は精製物質である。２本の主要なバンドがあり、１本は約14kD、そしてもう１本は約35kDである。この35kDのバンドは14kD のバンドのマルチマー形態であると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/39 8517−4ＨＣ０７Ｋ 1/34 Ｃ０７Ｈ 21/04 8517−4Ｈ 16/18 Ｃ０７Ｋ 1/20 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ 1/30 9455−4Ｃ 37/02 ＡＤＳ 1/34 ＡＢＤ 16/18 ＡＤＵ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＶ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の性質によって特徴付けられる幹細胞増殖インヒビター：（a）ネズミCFU-Sアッセイにおいて比活性（IC50）が＜20ng/mlである；（b）限外濾過により分子量が10,000ダルトンより大きく、100,000ダルトンより小さい；および（c）逆相クロマトグラフィーによりMIP1αまたはTGFβのいずれよりも疎水性である。２．前記インヒビターがタンパク質である、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビター。３．前記インヒビターが非炎症性である、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビター。４．前記インヒビターが熱安定性である、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビター。５．前記インヒビターが酸安定性である、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビター。６．前記インヒビターが、胃腸細胞、胃腸組織、上皮細胞、上皮組織、生殖細胞、または生殖組織において活性を有する、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビター。７．前記インヒビターが、造血細胞または造血組織において活性を有する、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビター。８．前期比活性が、ネズミCFU-Sアッセイにおいて＜２ng/mlである、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビター。９．請求項１に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と共に含有する薬学的組成物。１０．非経口投与のための、請求項９に記載の薬学的組成物。１１．インビトロ増殖アッセイにおいて因子が常に存在することを必要としない、抑制活性を有する幹細胞増殖インヒビター。１２．前記インヒビターがタンパク質である、請求項１１に記載の抑制活性を有する幹細胞増殖インヒビター。１３．前記インヒビターが非炎症性である、請求項１１に記載の幹細胞増殖インヒビター。１４．前記インヒビターが熱安定性である、請求項１１に記載の幹細胞増殖インヒビター。１５．前記インヒビターが酸安定性である、請求項１１に記載の幹細胞増殖インヒビター。１６．前記インヒビターが、胃腸細胞、胃腸組織、上皮細胞、上皮組織、生殖細胞、または生殖組織において活性を有する、請求項１１に記載の幹細胞増殖インヒビター。１７．前記インヒビターが、造血細胞または造血組織において活性を有する、請求項１１に記載の幹細胞増殖インヒビター。１８．前期比活性が、ネズミCFU-Sアッセイにおいて＜２ng/mlである、請求項１１に記載の幹細胞増殖インヒビター。１９．請求項１１に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と共に含有する薬学的組成物。２０．非経口投与のための、請求項１９に記載の組成物。２１．短時間のプレインキュベーションの間のみに存在する場合に活性である、抑制活性を有する幹細胞増殖インヒビター。２２．前記インヒビターがタンパク質である、請求項２１に記載の抑制活性を有する幹細胞増殖インヒビター。２３．前記インヒビターが非炎症性である、請求項２１に記載の幹細胞増殖インヒビター。２４．前記インヒビターが熱安定性である、請求項２１に記載の幹細胞増殖インヒビター。２５．前記インヒビターが酸安定性である、請求項２１に記載の幹細胞増殖インヒビター。２６．前記インヒビターが、胃腸細胞、胃腸組織、上皮細胞、上皮組織、生殖細胞、または生殖組織において活性を有する、請求項２１に記載の幹細胞増殖インヒビター。２７．前記インヒビターが、造血細胞または造血組織において活性を有する、請求項２１に記載の幹細胞増殖インヒビター。２８．前期比活性が、ネズミCFU-Sアッセイにおいて＜２ng/mlである、請求項２１に記載の幹細胞増殖インヒビター。２９．請求項２１に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と共に含有する薬学的組成物。３０．非経口投与のための、請求項２９に記載の組成物。３１．Ｂ細胞の成長を刺激する方法であって、リンパ球の発育を促進するために有効量の請求項１に記載のインヒビターを投与する工程を包含する、方法。３２．以下の工程を包含する、癌を治療する方法：（a）患者の骨髄を除去する工程；（b）培養物中の該骨髄をインヒビターで処理する工程；（c）該骨髄を細胞障害性化学療法剤で処理して、癌細胞を破壊する工程；および（d）骨髄破壊処理の後、患者に移植する工程。３３．以下の工程を包含する、白血病を治療する方法：（a）患者の骨髄を除去する工程；（b）培養物中の該骨髄をインヒビターで処理する工程；（c）該骨髄を細胞障害性化学療法剤で処理して、白血病細胞を破壊する工程；および（d）骨髄破壊処理の後、患者に移植する工程。３４．***中の幹細胞を損傷させ得るかまたは破壊し得る薬剤に曝された哺乳動物の幹細胞***を阻害するのに有用な薬学的組成物。３５．前記幹細胞増殖インヒビターが、骨髄移植（自家移植または同種移植）あるいは遺伝子導入のために、骨髄細胞または末梢血液細胞または臍帯（cord）血液細胞の長期培養物において哺乳動物の造血幹細胞をエクスビボで良好に維持または拡張するために用いられる、請求項３４に記載の薬学的組成物。３６．前記幹細胞阻害因子が、骨髄増殖疾患または自己免疫疾患における造血幹細胞の過剰増殖あるいは上皮幹細胞の過剰増殖の治療のために用いられる、請求項３４に記載の組成物。３７．以下の工程により単離される幹細胞増殖インヒビター：（a）骨髄を単離し、そして抽出物から粒子状物質を除去する工程；（b）該抽出物を加熱し、そして沈澱物を除去する工程；（c）該抽出物を酸沈澱させ、そして沈澱物を集める工程；および（d）逆相クロマトグラフィーにより該インヒビターを単離する工程。３８．請求項３７に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と共に含有する薬学的組成物。３９．非経口投与のための、請求項３８に記載の組成物。４０．化学療法または放射線照射から白血病細胞でなく正常細胞を区別して保護するために有用な薬学的組成物。４１．細胞障害性薬剤または放射線照射手法に曝すことによって幹細胞が増殖するように誘導された後に、前記幹細胞増殖インヒビターが投与される、哺乳動物を治療する方法。４２．前記幹細胞増殖インヒビターが、免疫応答を増大させる能力に基づいて、ワクチン投与の前またはと同時にアジュバントとして投与される、哺乳動物を治療する方法。４３．実質的に他のタンパク性物質を含まない幹細胞増殖インヒビターを精製する方法であって、以下の工程を包含する方法：（a）骨髄を単離し、そして抽出物から粒子状物質を除去する工程；（b）該抽出物を加熱し、そして沈澱物を除去する工程；（c）該抽出物を酸沈澱させ、そして沈澱物を集める工程；および（d）逆相クロマトグラフィーにより該インヒビターを単離する工程。４４．細胞障害性薬剤による損傷に対して造血幹細胞を保護するために、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、哺乳動物を治療する方法。４５．細胞障害性薬剤による損傷に対して造血幹細胞を保護するために、請求項１１に記載の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、哺乳動物を治療する方法。４６．細胞障害性薬剤による損傷に対して造血幹細胞を保護するために、請求項２１に記載の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、哺乳動物を治療する方法。４７．細胞障害性薬剤による損傷に対して造血幹細胞を保護するために、請求項３７に記載の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、哺乳動物を治療する方法。４８．幹細胞増殖インヒビターが、幹細胞過剰増殖によって引き起こされる免疫低下を逆転させるために作用する、哺乳動物を治療する方法。４９．請求項１に記載のインヒビターに対する抗体。５０．請求項１１に記載のインヒビターに対する抗体。５１．請求項２１に記載のインヒビターに対する抗体。５２．請求項３７に記載のインヒビターに対する抗体。５３．抗ウイルス剤と一緒に用いられる、請求項１に記載の幹細胞増殖インヒビター。５４．抗ウイルス剤と一緒に用いられる、請求項１１に記載の幹細胞増殖インヒビター。５５．抗ウイルス剤と一緒に用いられる、請求項２１に記載の幹細胞増殖インヒビター。５６．抗ウイルス剤と一緒に用いられる、請求項３７に記載の幹細胞増殖インヒビター。５７．前記インヒビターに感受性である白血病細胞の抑制を包含する、哺乳動物の白血病を治療する方法。５８．免疫学的にMIP1αまたはTGFβとは異なり、ネズミCFU-Sアッセイにおいて＜２g/mlの比活性を有する、幹細胞増殖インヒビター。５９．前記インヒビターがタンパク質である、請求項５８に記載の幹細胞増殖インヒビター。６０．前記インヒビターが非炎症性である、請求項５８に記載の幹細胞増殖インヒビター。６１．前記インヒビターが熱安定性である、請求項５８に記載の幹細胞増殖インヒビター。６２．前記インヒビターが酸安定性である、請求項５８に記載の幹細胞増殖インヒビター。６３．前記インヒビターが、胃腸細胞または胃腸組織、上皮細胞または上皮組織、または生殖細胞または生殖組織において活性を有する、請求項５８に記載の幹細胞増殖インヒビター。６４．前記インヒビターが、造血細胞または造血組織において活性を有する、請求項５８に記載の幹細胞増殖インヒビター。６５．請求項５８に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と共に含有する薬学的組成物。６６．非経口投与のための、請求項６５に記載の薬学的組成物。６７．免疫学的にMIP1αまたはTGFβとは異なり、ネズミCFU-Sアッセイにおいて＜５ng/mlの比活性を有する、幹細胞増殖インヒビター。６８．免疫学的にMIP1αまたはTGFβとは異なり、ネズミCFU-Sアッセイにおいて＜１ng/mlの比活比を有する、幹細胞増殖インヒビター。６９．生物学的活性を有し免疫学的にMIP1αまたはTGFβとは異なるポリペプチドをコードする組換えDNA分子を含む遺伝子であって、該生物学的活性が幹細胞増殖の阻害である、遺伝子。７０．請求項１記載のインヒビターに対するアナログ。