JPH08510997A - 幹細胞増殖インヒビターおよびその使用 - Google Patents
幹細胞増殖インヒビターおよびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
異常な幹細胞周期を制御し、化学療法後の末梢血液の回復を速めるための幹細胞阻害因子の単離および使用が開示され、そして請求される。さらに、幹細胞増殖インヒビターも開示されそして請求される。
Description
【発明の詳細な説明】
幹細胞増殖インヒビターおよびその使用
発明の分野
本発明は、自己免疫疾患、加齢、癌、脊髄形成異常、前白血病、白血病、乾癬
、または過剰増殖状態を含む他の疾患を有するヒトまたは動物の治療において、
幹細胞の細胞周期を調節するための幹細胞増殖インヒビターの使用に関する。本
発明はまた、細胞周期の進行している幹細胞に損傷を与える化学療法剤または他
の薬剤に曝されること、あるいは放射線に曝されること、を受けることが予想さ
れるかまたは受けたヒトまたは動物の治療方法に関する。最後に、本発明は、自
家移植または同種移植の手法あるいは遺伝子導入のための幹細胞の維持または拡
張培養の改良に関する。
発明の背景
再生系のほとんどの終期細胞は、短命であり、一生を通じて連続的に置き換え
られなければならない。例えば、血液細胞は、多能性造血幹細胞(HSC)の自己
再生集団から生じる。造血幹細胞は造血系および免疫系の全ての成熟細胞の発育
に必要であるので、化学療法剤または他の薬剤により治療される被験体における
十分な機能的宿主防御系を再確立するために、造血幹細胞の生存は必須である。
造血細胞の産生は、造血細胞の成長および分化を刺激する一連の因子によって
調節され、それらのいくつかは、例えば、エリスロポエチンおよびG-CSFは、現
在では臨床的な実用に用いられている。しかし、広範に特徴付けられていない制
御ネットワークの一部分は、調節プロセスのネガティブアームを形成するフィー
ドバック機構である(Eavesら、Blood 78:110-117、1991)。
Lordとその共同研究者による初期の研究は、正常なネズミおよびブタの骨髄抽
出物中に、HSCの細胞周期の進行を可逆的に阻害し得る可溶性タンパク質因子が
存在することを示した(Lordら、Br.J.Haem.34:441-446、1976)。この阻害活
性(分子量50〜100kD)は幹細胞インヒビター(SCI)と呼ばれた。
一次供給源からのこの因子の精製は、放射線照射された多数のマウスを必要と
するインビボアッセイにはつきものの困難さにより達成されなかった。これらの
問題を克服しようとして、Pragnellとその共同研究者とは、原始造血細胞(CFU-
A)のインビトロアッセイを開発し、そして阻害活性源として細胞系をスクリー
ニングした。
初期の研究がSCIの可能な供給源としてマクロファージを同定していたので(L
ordら、Blood Cells 6:581-593、1980)、マウスマクロファージ細胞系のJ774.2
が選別された(Grahamら、Nature 344:442-444、1990)。この細胞系からの調整
培地が精製に用いられた。阻害ペプチドが単離され、それは、前述のサイトカイ
ンマクロファージ炎症性タンパク質1−α(MIP-1
-α)と同一であることが証明された。従って、MIP-1-αは、細胞系から単離さ
れたのであって、一次材料から単離されたのではない。Grahamらは、MIP-1-αに
対する抗体が骨髄の粗抽出物の活性を失わせることを観察したが、他の研究者は
、他の阻害活性が重要であることを示した。例えば、Grahamら(J.Exp.Med.178
:925-32、1993)は、MIP-1αではなくTGFβが造血幹細胞の主要なインヒビター
であることを示唆した。さらにEavesら(PNAS 90:12015-19、1993)は、MIP-1α
およびTGFβの両方が最適下限のレベルで正常骨髄中に存在し、そして阻害には
これら2つの因子間の相乗作用が必要であることを示唆した。
他の研究者は、さらに別の幹細胞阻害因子を記載した。Frindelとその共同研
究者は、仔ウシの骨髄および肝臓の抽出物から幹細胞阻害活性を有するテトラペ
プチドを単離した(Lenfantら、PNAS 86:779-782、1989)。Paukovitsら(Cance
r Res.50:328-332、1990)は、ペンタペプチドの特徴を調べあげ、そのモノマー
体のものはインヒビターであり、そしてそのダイマー体のものは幹細胞の細胞周
期の進行の刺激因子である。他の因子もまた、種々のインビトロ系において阻害
性を有すると主張されている(Bailliere's Cllnical Haematology第5巻(Bail
liere Tinadall、Paris)、pp723-39、1992中のWrightおよびPragnell参照)。
現在までこれらの因子のいずれも臨床的使用に対して認可されていない。しか
し、効果的な幹細胞インヒビターの必要
性は存在している。化学療法または放射線治療に関連する主要な毒性は、正常増
殖細胞の破壊であり、これにより骨髄の抑制または胃腸に対する毒性を生じ得る
。効果的な幹細胞インヒビターは、これらの細胞を保護し、そしてこれらの治療
レジメ(regimen)を最適化し得る。臨床状況に応じて種々の刺激性サイトカイ
ン(例えば、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン、IL-11)が必要とされることが
実証されているように、同様に異なる臨床上の必要性に関して種々の阻害因子が
必要とされるようである。
I.癌の化学療法および放射線療法
刺激性成長因子についての生産面での研究は、多くのこれらの因子(エリスロ
ポエチン、G-CSF、GM-CSFなど)の臨床的な使用につながる。これらの因子は化
学療法および放射線照射治療に関連した死亡率および罹患率を低下させる。化学
療法または放射線照射を受けている患者にとってのさらなる臨床的利点は、幹細
胞が細胞周期に入るのをブロックし、それによって幹細胞を有毒な副作用から保
護するという別のストラテジーにより実現され得たという点である。
II.骨髄移植
骨髄移植(BMT)は、種々の血液疾患、自己免疫疾患および悪性疾患にとって
有用な治療である。細胞のエクスビボ操作は、現在では、原始幹細胞を移植に適
した集団に拡張するために
用いられている。この手法を最適化するには以下のことが必要である:(1)造
血の長期の再構築を維持し得るのに十分な数の幹細胞;(2)移植片対宿主が誘
導するTリンパ球の除去(depletion)、および:(3)悪性細胞の残留がない
こと。この手法は、エクスビボ拡張のための幹細胞インヒビターを含むことによ
り最適化され得る。
残留の悪性細胞を排除するために細胞障害性薬剤を用いて骨髄細胞を除去する
ことの効果は、正常な造血細胞および特に幹細胞に対するこれらの化合物の毒性
により制限される。除去中は、正常細胞を効果的に保護する必要性がある。保護
は、効果的なインヒビターを用いて、幹細胞をその細胞周期からはずすことによ
り与えられ得る。
III.末梢幹細胞の採取
末梢血液幹細胞(PBSC)は、自家移植に対して骨髄よりも多くの潜在的な利点
を提供する。腫瘍を含むことにより、または以前の放射線治療により適切な骨髄
採取部位を持たない患者は、さらにPBSC採集を受け得る。血液幹細胞の使用は、
一般的な麻酔法および外科的手技に十分に耐えられない患者におけるそれらの必
要性を排除する。血液細胞を採集するのに必要な血液成分分離(apheresis)技
術は、効率的であり、ほとんどの主要な医療センターで広く利用されている。こ
の方法の主要な限界点は、末梢血液中の幹細胞の正常な定常状態頻度が低いこと
、および薬剤または成長因子(例えば、シクロ
ホスファミド、G-CSF、幹細胞因子)を用いた動員手法(mobilization procedur
es)の後では細胞周期の状態が速いこと、の両方である。効果的な幹細胞インヒ
ビターは、そのような細胞を休止状態に戻すために有用であり、それによって分
化の間にそれらが消失することを防ぐ。
IV.過剰増殖性疾患の治療
多くの疾患は、調節異常の幹細胞が、終期の細胞の過剰生産を引き起こす過剰
増殖状態によって特徴付けられる。このような病態は、表皮細胞の過剰生産であ
る乾癬、および腸ポリープの出現を特徴とする胃腸管における前悪性状態を包含
するが、それらに限定されることはない。幹細胞インヒビターはこのような状態
の治療に有用である。
V.遺伝子導入
遺伝情報を造血細胞に導入する能力は、現在では、臨床的設定に利用されてい
る。アクセスの容易さ、エクスビボでこの組織を操作し治療する幅広い経験のた
め、および血液細胞が組織に浸透する能力のため、骨髄は遺伝子治療の有用な標
的である。さらに、特定のヒトの遺伝子欠損の修正は機能的遺伝子をヒト造血系
の原始骨髄幹細胞に導入することにより可能であり得る。
レトロウイルスベクターまたは遺伝子導入の物理的技術のいずれかを用いて、
遺伝子をヒト造血細胞に導入することに
はいくつかの制限がある:(1)造血組織中の幹細胞の頻度の低さは、効率の高
い遺伝子導入技術の開発を必要とする;および(2)より迅速に細胞周期の進行
している幹細胞はベクターの感染をより受けやすくすることが証明されたが、成
長因子による幹細胞増殖の刺激によって感染頻度が増加することは、導入遺伝子
を含む細胞が不可逆的に分化させられ、それらの自己再生ができなくなるので、
長期の遺伝子発現に良くない影響を与えることが示されている。これらの問題は
、幹細胞の使用によって改善され、分化および自己再生の損失を妨げ得る。
発明の要旨
本発明は、以下の性質により特徴付けられる幹細胞増殖インヒビターである:
(a)ネズミコロニー形成脾臓(CFU-S)アッセイにおいて比活性(IC50)が20
ng/ml以下である(実施例4参照);
(b)(限外濾過により)分子量が10,000ダルトンより大きく、100,000ダルト
ンより小さい;
(c)活性がトリプシンによる分解に対して感受性である;
(d)MIP-1αまたはTGFβよりも疎水比であり、そして逆相クロマトグラフィ
ーにより両者から分離可能である(実施例12参考);
(e)水溶液中で37℃、55℃または75℃で1時間加熱した後でも生物学的活性
が保持されている;
(f)1%塩酸のアセトン溶液を用いて沈澱させた後でも生物学的活性が保持
されている。
本発明はさらに、短時間のプレインキュベーションの後のインビトロアッセイ
における阻害の達成能力によって特徴付けられ、他の幹細胞インヒビター候補(
例えば、MIP-1α、TGFβ、および種々のオリゴペプチド)と区別される(実施例
5参照)。
本発明はまた、種々の疾患の治療のためのINPROLを含有する薬学的組成物を包
含する。
本発明は、被験体に有効量の幹細胞阻害性組成物を投与することにより、幹細
胞を死減させるかまたは損傷し得る薬剤に曝されることが予想される被験体を治
療する方法を提供する。この方法によって保護された幹細胞は、通常は骨髄中に
存在しかつ骨髄中で***している造血幹細胞であり得る。あるいは、幹細胞は上
皮性であり得、例えば腸管または頭皮または身体の他の領域に位置し得、あるい
は生殖器官内に位置する生殖細胞に位置し得る。本発明の方法は、望ましくは、
ヒトに用いられ得るが、動物の治療もまた、本発明に包含される。
他の局面では、本発明は、化学療法を受けている患者の造血幹細胞系、免疫幹
細胞系または他の幹細胞系を保護しかつ回復させる方法を提供する。この方法は
患者に有効量のINPROLを投与する工程を包含する。
さらに別の局面では、本発明は、癌を有する患者に有効量
のINPROLを投与して、骨髄、胃腸管、または他の器官の幹細胞を、化学療法また
は放射線療法の有害な作用から保護することにより、固形腫瘍によって特徴付け
られる癌を含むあらゆる癌を補助的に治療する方法を包含する。
本発明のさらに別の局面は、正常幹細胞の増殖を阻害するために、増殖性白血
病細胞を内部に有する骨髄細胞を有効量のINPROLで処理する工程、および白血病
細胞を破壊するために、細胞障害性薬剤で骨髄を処理する工程、を含む白血病の
治療を包含する。この方法は、骨髄の増殖を刺激する他の薬剤(例えば、コロニ
ー刺激因子)で骨髄を継続治療することによって効果が高まる。1つの実施態様
において、この方法はインビボで行われる。あるいは、この方法はまた、移植の
ためにエクスビボで骨髄細胞を除去し拡張するのに有用である。
さらに別の局面では、この方法は、増殖する幹細胞によって引き起こされるあ
らゆる疾患を有する被験体を治療する工程を包含する。乾癬、脊髄形成異常、あ
る種の自己免疫疾患、加齢による免疫低下のような疾患は、被験体に有効量のIN
PROLを投与して問題の幹細胞の増殖を部分的に阻害することにより治療される。
本発明は、幹細胞を死滅させるかまたは損傷し得る細胞障害性薬剤由来の損傷
から幹細胞を可逆的に保護する方法を提供する。この方法は、そのような薬剤に
曝されることが予想される被験体に有効量のINPROLを投与する工程を包含する。
本発明は、その範囲内にブタのINPROLの精製を含み、そしてそのような精製タ
ンパク質を使用して、INPROLのcDNAまたは遺伝子のクローニングに有用な配列デ
ータを得ることを予想する。
本発明はまた以下を提供する:
以下の手順によってブタまたは他の骨髄から単離された幹細胞増殖インヒビタ
ー(実施例12参考):
(a)骨髄を抽出し、濾過によって粒子状物質を除去する;
(b)56℃で40分間熱処理した後、氷浴で冷却する;
(c)4℃で30分間10,000gで遠心分離することによって沈澱物を除去する;
(d)10容量の撹拌された氷冷アセトン(1容量%濃度の塩酸を含む)に上清
を添加し、4℃で16時間インキュベーションすることにより酸沈澱させる;
(e)4℃で30分間20,000gで遠心分離することにより沈澱物を単離し、そし
て冷アセトンで洗浄した後、乾燥させる;
(f)逆相クロマトグラフィーによって単離し、そして5-フルオロウラシルで
前処理してネズミIL-3存在下でインキュベートした骨髄細胞によるコロニー形成
の阻害、および280nmにおける吸光度およびSDS-PAGEにより活性をモニターする
。
本発明はまた以下を提供する:
実質的に他のタンパク性物質を含まない幹細胞増殖インヒビターを精製する方
法であって、前記の工程を包含し、さらに以下により詳細に記載される、方法。
本発明はまた以下を提供する:
幹細胞増殖インヒビターが、幹細胞の過剰増殖によって引き起こされる免疫抑
制を改善するように作用する、ヒトまたは動物を治療する方法。
本発明はまた以下を提供する:
前記幹細胞増殖インヒビターが、細胞障害性薬剤または放射線照射手技に曝さ
れることによって幹細胞が増殖するように誘導された後、投与される、ヒトまた
は動物を治療する方法。幹細胞は、通常は休止しているが、化学療法後、細胞周
期に入るように刺激される。これによって幹細胞は2回目の化学療法剤の投与に
対してより感受性となる;本方法はこの治療から幹細胞を保護する。
本発明はまた以下を提供する:
前記幹細胞増殖インヒビターが、免疫応答を増大させるためにワクチン投与の
前またはと同時にアジュバントとして投与される、ヒトまたは動物を治療する方
法。
本発明はまた以下を提供する:
幹細胞を損傷から保護するために有効量の幹細胞増殖インヒビターを投与する
工程を包含する、細胞障害性薬剤または放射線治療を受けたヒトまたは動物を治
療する方法。
本発明は、INPROLと呼ばれる幹細胞インヒビターを記載している。このインヒ
ビターは、MIP-1-α、TGF-β、Frindelおよびその同僚のテトラペプチド、また
はPaukovitsとその共同研究者のペンタペプチド(Wright & Pragnell、1992(前
出)参
照)のような当該分野で公知のインヒビターとは異なる。INPROLは、INPROLと上
記テトラペプチドおよび上記ペンタペプチドとを区別する限外濾過によれば、10
,000ダルトンを超える分子量を有する。それは、逆相クロマトグラフィー系にお
いてはMIP-1αまたはTGFβよりも疎水性であり、逆相クロマトグラフィーはそれ
をそれらのサイトカインと区別する。さらに、その作用様式は、前記のいずれの
インヒビターの作用様式とも異なり、そのモードにおいては、プレインキュベー
ションの期間でのみ用いられる場合、それはインビトロアッセイにおいて活性で
ある。例えば、MIP-1-αは、プレインキュベーションの期間でのみ用いられる場
合、効果的ではない(実施例5)。さらに、INPROLは、「高増殖性潜在細胞(hi
gh prollferative potential cells)」(HPP-PFC)を測定するアッセイにおい
て活性であるが、MIP-1-αは活性ではない(実施例6)。
図面の簡単な説明
図1〜4は、各精製段階後の生成物のSDSポリアクリルアミドゲル泳動を示す
。
図5は、最終精製物のHPLCクロマトグラムを示す。
図6は、INPROLを含まない場合(コントロール=100%)および、種々の濃度
のINPROLを含む場合のFDCP混合系の細胞内へのトリチル化チミジンの取り込み(
cpm)を示す。データは、コントロールの値に対して正規化される。
図7は、テストステロンプロピオネート(TSP)、TSP+INPROL、または賦形剤
(vehicle)(コントロール)を用いてマウスを処理した後の細胞周期のS期に
ある細胞の%を示す。各グループは25匹を含んでいた(時点毎に3〜4匹)。
図8は、2用量の5-FUで処理され、INPROL処理を受けたかまたは受けていない
マウスの生存を示す。各グループは30匹を含んでいた。
図9は、放射線照射され、INPROL処理を受けた場合および受けていない場合の
マウスの生存を示す。各グループは50匹を含んでいた。
図10Aおよび10Bは、Ara-CまたはAra-C+INPROLで処理した後、1週間目
(10A)および3週間目(10B)の正常骨髄の長期培養細胞の再生を示す。
図11は、致死量の放射線照射を行い、培地(コントロール)またはINPROL(
25ng/ml)で4時間プレインキュベーションした後に、3×104個の骨髄細胞を移
植した後のマウス(各グループ75匹)の生存を示す。生存は30日間モニターされ
た。
図12は、致死量の放射線照射を行い、INPROLまたは培地で4時間プレインキ
ュベートされたドナーの骨髄細胞により回復した後のマウスの骨髄細胞により14
日後に培養物中で形成されたCFU-GMの数を示す。
図13は、リンパ球の長期培養物から毎週取り出し、洗浄し、そして培地また
はINPROLで4時間プレインキュベートした後にIL-7(10ng/ml)と共に接種され
る懸濁細胞を示す。
図14は、INPROLで処理された白血病の末梢血液細胞の改善された再生能(re
populating ability)を示す。長期培養開始細胞(LTC-IC)は、粘着性および非
粘着性LTC細胞をINPROLと共に、およびINPROLなしで接種し、7日目にCFU-GMの
数を数えることにより測定された。データはコントロールの値に対して正規化さ
れる。
図15Aは、53%アセトニトリルで溶出した精製INPROLのC4逆相クロマトグ
ラムを示す。図15Bは、43.9%アセトニトリルで溶出したMIP-1-αのC4逆相
クロマトグラムを示す。図15Cは、INPROLの粗調製物および逆相の後精製され
た調製物のSDS-PAGEクロマトグラムを示す。
本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細
な説明を記載する。この説明は、本発明の例示であるが、本発明を特に限定する
と解釈されるべきではなく、そして当業者の理解範囲であるような変化は本発明
の範囲に入ると考えられるべきである。
好適な実施態様の詳細な説明
INPROLは、可逆的に幹細胞の***を阻害する。特に、INPROLは、造血幹細胞の
細胞***を一時的に阻害することに効果的である。従って、本発明の方法は、癌
またはウイルスに感染した細胞を破壊するために用いられる化学療法剤または放
射線によって引き起こされる損傷から幹細胞を保護することによって、患者の造
血系、骨髄系および免疫系に関する化学
療法の望ましくない副作用を軽減することに用いられ得る。本発明の一つの実施
態様では、INPROLは、化学療法剤が疾患細胞に作用している間に、幹細胞***を
阻害するのに十分な用量で患者に投与される。化学療法剤がその機能を発揮した
後、INPROLによって阻害された幹細胞は、さらなる治療を受けずに***細胞に戻
る。造血再生を高めることが所望されるならば、刺激性成長因子またはサイトカ
インがさらに用いられ得る。
代表的な臨床状況においては、INPROLは、例えば、0.01〜1mg/kgの精製また
は組換えINPROLを、例えば標準的化学療法または放射線治療の4〜60時間前に投
与することを用いて、静脈注射または点滴により患者に投与される。本発明の別
の実施態様では、INPROLによる前処理は、患者が通常耐えられる用量を超える増
加した化学療法剤用量または放射線量を可能にする。必要に応じて、G-CFS、幹
細胞因子のような刺激性成長因子が、化学療法または放射線治療の後に用いられ
て、さらに造血再構築を改良する。
本発明の別の実施態様では、INPROLは、移植のために自家骨髄を調製する方法
において用いられる。骨髄は、有効量のINPROLでエクスビボで処理されて、細胞
***を阻害し、次いで骨髄培養物に有効量の化学療法剤または放射線を投与する
ことによって癌性細胞を除去する。細胞周期が進行している細胞に特異性を有す
る化学療法剤が好ましい。このように処理された骨髄は、自家ドナー内に再注射
される。必要に応じ
て、患者は、造血を刺激することが知られている薬剤で治療されて、患者の造血
再構築を改善する。
本発明の別の実施態様では、INPROLは、白血病治療の補助的な治療として用い
られる。例えば、白血病細胞がINPROLに応答しない病態では、白血病の骨髄細胞
はエクスビボでINPROLにより処理される。正常幹細胞の増殖はINPROLの投与によ
り妨げられる。従って、増殖する白血病細胞が細胞周期に特異的な細胞障害性薬
剤により処理されている間は、正常幹細胞の集団は損傷から保護される。さらに
、IL-3またはGM-CSFのような刺激性サイトカインは、薬剤治療または放射線治療
の間に必要に応じて投与されて白血病細胞における細胞周期の進行を誘導するが
、正常幹細胞はINPROLにより保護される。患者は、白血病細胞を破壊するために
化学療法剤または放射線により治療され、次いで除去された骨髄は、造血再構築
を確立するために患者内に移植されて戻される。
同様に、血液細胞または白血球を含む重篤なウイルス感染(例えば、HIV感染
)にかかった患者を治療するための本発明の別の実施態様においては、骨髄はエ
クスビボでINPROLにより処理され、その後抗ウイルス薬剤、感染細胞を破壊する
薬剤、または感染細胞を排除するための抗体による系により処理される。患者か
らウイルスの宿主細胞を根絶するために、骨髄の機能を破壊する(myeloablativ
e)抗ウイルス剤または骨髄の機能を破壊する化学療法の後、INPROL処理した骨
髄は患者に戻される。
本発明の別の実施態様では、INPROLは過剰増殖性幹細胞に関連した疾患を治療
するために用いられる。例えば、乾癬は、皮膚の過剰増殖する上皮細胞によって
引き起こされる疾患であり、時には細胞障害性薬剤により治療される。幹細胞増
殖を含む他の前腫瘍性病変は、幹細胞の増殖を全体的にまたは部分的に阻害する
ために用いられる有効量のINPROLに影響されやすい。これらの使用のため、INPR
OLを含む局所的または経皮的な送達組成物は、非経口投与の代わりとして、適切
な場面で用いられる。ほとんどの白血病の場合、白血病前駆細胞は、INPROLによ
り影響を受けない分化細胞集団であり、従って上記のようなINPROLを用いる方法
によって治療される分化細胞集団である。白血病前駆細胞が非常に原始期のもの
であり、INPROLによる阻害に対して直接的に感受性である場合には、白血病細胞
の増殖は有効量のINPROLの投与によって弱められる。
モノクローナルまたはポリクローナルである抗体は、INPROLポリペプチドに対
して標準的な技術によって開発される。これらの抗体またはINPROLポリペプチド
は、当該分野では公知の多くのタイプの検出可能な標識により標識される。次い
で、標識されたINPROLまたは抗INPROL抗体は、幹細胞マーカーとして用いられ、
診断を目的として患者に直接それらを投与することによって幹細胞を同定および
単離する。あるいは、これらの標識されたポリペプチドまたは抗体はエクスビボ
で用いられ、骨髄中の新生物細胞を除去する前にそれらを除き
得るように骨髄調製物中の幹細胞を同定する。同様の方法で、このような標識さ
れたポリペプチドまたは抗体は、上皮性または他の幹細胞を単離および同定する
ために用いられる。さらに、このような抗体は、標識されていても標識されてい
なくても、INPROL活性の中和化によって治療的に、または循環しているINPROLレ
ベルを検出することによって診断的に用いられる。
もしブタの因子がヒト免疫系から著しく有害な抗体の産生を誘発しないならば
、ブタの因子は本発明の方法に用いられる。INPROLの活性と同様の活性を有する
類似または同種のヒトタンパク質は、本発明の範囲内に入る。そのようなタンパ
ク質は、標準的な技術を用いて、ヒト遺伝子または組換えヒトINPROLの発現用の
cDNAライブラリーからクローニングされる。例えば、精製タンパク質から得られ
る配列情報を用いて、例えば32-リンで標識され得るオリゴヌクレオチドプロー
ブが構築され、そして適切なcDNAライブラリー(例えば、骨髄)をスクリーニン
グするために用いられる。あるいは、適切な供給源(例えば、骨髄)由来の発現
ライブラリーは、抗体を用いて、または適切な機能的アッセイ(例えば、実施例
2に記載されるようなアッセイ)を用いて、INPROLをコードするcDNAに対してス
クリーニングされる。
他の種に由来するINPROLの同種または類似のバージョンは、上記の本発明の治
療上の実施態様と同様に、種々の獣医学的使用に用いられる。
さらに、幹細胞阻害因子は、細胞周期の進行している幹細胞を***しない「休
止」期に可逆的に移行させることによって、それらに作用する。休止している幹
細胞を刺激して***させることが望ましい場合、例えば、癌の化学療法剤または
放射線により患者を治療した後、コロニー刺激因子および他の造血刺激剤が被験
体に投与される。このような因子の例としては以下のものが挙げられるが、それ
らに限定されない:M-CSF、CSF-1、GM-CSF、G-CSF、巨核球-CSF、または他のサ
イトカイン、例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-1
1、IL-12、IL-13、IL-14、あるいはエリスロポエチン。
INPROLポリペプチドまたは幹細胞阻害活性を有する活性フラグメントは、下記
のプロトコルで例示されるように、精製されるか、または幹細胞阻害活性用の適
切なバイオアッセイを組み合わせた従来の化学的プロセスによって合成される。
本発明の1つの実施態様では、治療的に有効な量のINPROLタンパク質または治
療的に有効なそれらのフラグメントは、薬学的に受容可能なキャリアと混合して
用いられる。このINPROL組成物は、一般的に、非経口的注射または点滴によって
投与される。皮下注射、静脈注射、または筋肉内注射の経路が、達成される治療
的効果によって選択される。
計画的に投与される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、発熱
物質がなく、非経口的に受容可能な水溶液の形態である。薬学的に受容可能なタ
ンパク質溶液は、pH、
等張性、安定性、キャリアタンパク質などに関する要件を有し、当該分野の技術
に属する。過剰増殖性幹細胞を治療する方法における投与に関しては、INPROLを
含有する組成物は、局所的にまたは経皮的なパッチを介して過剰増殖領域に投与
され、その効力を局在化および最適化する。
そのような細胞障害性薬剤に曝されることが予想される被験体を治療する方法
または過剰増殖性幹細胞を処理する方法に含まれる投与量レジメは、担当の医師
により、薬剤の作用を改変する種々の要因;例えば、症状、体重、性別、患者の
規定食、感染の重度、投与時間、および他の臨床的要因を考慮して決定される。
一般に、毎日のレジメは、1〜100μg/kg(体重1kg当たりのINPROLタンパク
質またはそのフラグメントマイクログラム数)の範囲である。
被験者が細胞障害性薬剤または放射線に曝された後、本発明の治療方法は、必
要に応じて、被験体に1種またはそれ以上のリンホカイン、コロニー刺激因子、
または他のサイトカイン、造血素、インターロイキン、または一般に幹細胞の成
長および***を刺激し、INPROLによる前処理により阻害される成長因子(および
それらの派生物)を投与することを用いる。造血を促進するこのような治療剤と
しては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、Meg-CSF、M-CSF、CSF-1
、GM-CSF、G-CSF、またはエリスロポエチンが挙げられる。これらの薬剤の投与
量は、化学療法または骨髄移植後の造血再構築の促進における効能に対する臨床
試験にそれらを用いたと
きに得られる知見によって選択される。これらの投与量は、患者の身体症状の変
化および被験体が曝された化学療法剤または放射線の量およびタイプを補償する
ように調整される。治療を受けた患者内へのINPROLの投与によって引き起こされ
る幹細胞の阻害の回復の進展は、従来の方法によってモニターされる。
白血病の治療では、正常な幹細胞の細胞周期の進行を阻害するINPROLと、IL-3
またはGM-CSFのような白血病細胞の成長の刺激因子の両方を、細胞障害性薬剤治
療または放射線照射の間に同時に投与することが有利である。このプロトコルに
より、正常細胞と白血病細胞との間の細胞周期の進行状態および薬剤感受性に最
も大きな違いを達成し得る。実施例1
:インビボ幹細胞増殖阻害アッセイ
幹細胞増殖の検出のために、細胞周期のS期にあるCFUの数を3H-チミジン「自
殺(suicide)」法(Beckerら、Blood 26:296-308、1965)により測定した。
未成熟の造血前駆細胞--脾臓のコロニー形成単位(CFU-S)--を、致死量の放
射線を照射したマウスの脾臓において肉眼で見えるコロニーを形成させることに
より、インビボで、造血細胞の静脈注射の8〜12日後に検出した(Till & McCul
loch、1961)。
標準的CFU増殖アッセイに関しては、H-チミジン「自殺」の方法が通常適用さ
れる(Beckerら、1965)。この方法は、DNAの
前駆体である放射標識したチミジン(3H-チミジン)をDNA合成中の細胞内に取り
込むことに基づいている。試験の時点で細胞周期のS期にあるこのCFU-Sは、高
い放射活性により死滅しており、そのため脾臓ではコロニーを形成できない。従
って、3H-チミジンなしでインキュベートされた細胞サンプルの注射によって形
成されるCFU-Sの数と、3H-チミジンと共にインキュベートされた同じ細胞との間
の違いは、元のサンプルにあった増殖性CFU-Sのパーセンテージを示す。
インヒビター試験は、インヒビターが細胞周期が進行しているCFU(正常マウ
スの骨髄では7〜10%程の低さ)に影響する限り、刺激を受けていない動物由来
の骨髄幹細胞集団に行うことはできない。
CFUの増殖を刺激するために、フェニルヒドラジン(PHZ)刺激、または致死量
以下の放射線照射を用いた(Lord、1976)。
本発明者らは、テストステロンプロピオネート(TSP)がCFUの細胞周期の進行
に刺激効果を及ぼすこと(Byronら、Nature228:1204、1970)に基づいて、TSPの
注射を発明し、それによって試験は簡素化され、いかなる副作用も引き起こされ
なかった。TSPは、注射後20〜24時間以内にCFU増殖の刺激を誘導し、そしてその
効果は少なくとも7日間見られた。
インヒビターの精製の間に画分のスクリーニングに用いられた手順は以下の通
りである:
マウス:全ての試験を通じてBDF1またはCBF1マウス種を用いた。
30〜35%のCFUをS期に誘導するために、ドナーマウスを、0.2ml/マウスの腹
腔内注射によって10mg/100gの用量のTSPで処理した。
24時間後、細胞懸濁調製物のため骨髄を大腿骨から取り出す。次いで、1ml当
たり5×106から10×105個の細胞を異なるコントロールおよび試験画分と、37℃
で3.5時間水浴中でインキュベーションする(各グループは試験管2本ずつ、標
識したものと標識していないもの用)
3.5時間後、3H-チミジン(1mCi/ml、比活性18〜25Ci/mmole)を、標識したも
の用の各試験管に細胞懸濁液1ml当たり200μlずつの容量で添加し、標識してい
ないもの用の試験管には何も添加せず、37℃でさらに30分間インキュベーション
し続ける。
30分間のインキュベーションの後、400μg/mlの放射能活性のないチミジンを
含む10mlの冷培地(4℃)を添加することにより、死滅反応を停止させる。細胞
を十分に洗浄する(3回)。
細胞を再懸濁し、そして注射にとって所望の濃度、通常マウス1匹当たり0.3
〜0.5ml中2〜4×104個細胞、まで希釈する。
1グループ当たり8〜10匹のレシピエントマウスを注射の6時間以上前に放射
線照射する。
9〜12日目にレシピエントの脾臓を集め、そしてTellesnitsky溶液中で固定し
て、コロニー数を目で数える。式を用い
てS期にある細胞のパーセンテージを計算する。
ここで、a--3H-チミジンを有するCFUの数
ここで、b--3H-チミジンを有するCFUの数
表4に示されるINPROLの試験データは、INPROLによる処理の後に細胞周期の進
行している幹細胞が3H-チミジンの作用に対して耐性になることを示していた。
同じことは、S期特異的細胞障害性薬剤であるシトシンアラビノシドおよびヒド
ロキシ尿素にも当てはまる(データは示していない)。次いで、処理された幹細
胞を放射能活性のないチミジンを含む冷培地で洗浄した場合、生き残った幹細胞
はマウス脾臓内で増殖して、正常にコロニーを形成する。
実施例2:インビトロ幹細胞増殖阻害アッセイ
以下の試験システム(Lordら、The Inhibitors of Hematop
oiesis
pp.227-239、1987)を用いて、INPROLの直接的効果を示した。多系統(m
ultilineage)因子(IL-3)依存性幹細胞系であるFDCP mix A4(A4)を、コロニ
ー刺激性IL-3の供給源として、20%ウマ血清および10%WEHI-3調整培地を添加し
たIMDM培地中で維持した。
増殖のためのトリチル化チミジン取り込みアッセイを測定した:20%ウマ血清
および50%WEHI-3 CMを有する100μlの培地中の5×104個のA4細胞を、5%CO2
中で37℃、16時間インキュベーションした。
INPROLまたは粗製のBME(画分IV)を開始時点で添加した。次いで、3HtdR(50
μl中3.7KBq、740 GBq/mmole)を各グループに添加し、さらに3時間インキュベ
ーションした。増殖レベルを集めた細胞によって測定した。
正常骨髄抽出物またはINPROLを段階的な用量で存在させて成長したFDCPmix-A4
細胞によるトリチル化チミジン(3H-Tdr)取り込みを図6に示す。INPROLの精製
組成物は開始物質より少なくとも1000倍活性が高いことがわかった。曝す時間(
16時間)は、効果的な阻害に対して重要な因子であり、そしてA4細胞系の幹細胞
に直接的な効果を及ぼしている証拠を示している。実施例3
:インビボのINPROL注射によるCFU増殖の阻害:用量 および効果の持続期間
インビボで注射されたINPROLの効果の研究は、INPROLがCFUの細胞周期への加
入を効果的にブロックし得、これによりそれらの細胞をさらなる処理の細胞障害
効果から保護し、その臨床使用への可能性を示すことを示した。
実験プロトコルには2つの到達点がある:インビボで注射された場合にCFUに
対するINPROLの効果をチェックすること、および、細胞周期の進行している幹細
胞に関してINPROL活性の有効持続期間を明確にすること。
CFUの増殖を刺激するために、上記の実施例1で述べた効果に基づいて、テス
トステロンプロピオネートの注射を用いた。
マウスBDF1をTSP(10mg/100g)と共に第0日に注射した;24時間後に、各実験
グループのマウス(各グループ4匹)に0μg、5μg、10μg、15μg/マウスの
用量範囲で腹腔内にSCPI注射を1回行った。
SCPI注射の24時間後、マウスを屠殺し、そして細胞周期の進行しているCFU-S
のパーセントを実施例1に記載されたアッセイにより測定した。TSP注射は、未
処理のマウスでは7%であったのに対し、約50%のCFU-Sを細胞周期に誘導した
。2μg/マウスという程に低い用量のINPROLは、TSPに誘導される増殖を阻害し
て正常レベルまで下げることができた。
有効持続期間の評価に関しては、1グループのマウス(1
グループ当たりマウス21匹)にTSPのみを注射し、そしてもう一方のグループにT
SPとINPROL(TSPの24時間後)の両方を注射した。CFUの細胞周期の進行は、各グ
ループから3匹ずつドナーを取り出して、記載した方法で骨髄のCFU-Sの細胞周
期の状態を測定することにより、24時間毎に1週間測定した(実施例1参照)。
図7に示すデータは、TSPの有効持続期間は少なくとも7日間であるが、1回のI
NPROLの注射によりCFU-Sは休止期に入り、たった48〜72時間は細胞周期に入らな
いようにすることができることを示している。癌および白血病の化学療法に用い
られる化学療法剤の大多数は、インビボでは比較的半減期が短い(通常24時間よ
り短い)ので、INPROLの効果は、得られたデータによれば、シトシンアラビノシ
ドまたはヒドロキシ尿素のような化学療法剤がインビボで活性である間は有効期
間よりも長く維持される。さらに重要なことは、長い間隔(24時間より長く96時
間より短い)を有する化学療法および放射線照射の治療は、第1回目(幹細胞に
損傷を与えない)と第2回目のCFUに損傷を与える細胞障害性手法との間に必要
であり、化学療法剤または放射線照射の2回の適用の間の間隔にINPROLを1回注
射すれば十分である。何回かの繰り返し行う細胞障害性治療または放射線照射に
関しても、INPROL効果の持続期間に基づいて同じストラテジーを適用し得た。実施例4
:5-FUによる処理の後、迅速に周期に入るように刺 激された最も原初の造血幹細胞は、INPROLにより第2回目の5-FU被曝から保護さ れる
薬剤5-フルオロウラシル(5-FU)は、骨髄およびリンパ球の区画(compartmen
t)中の細胞数を劇的に低減する。それは通常、細胞周期特異的であり、細胞周
期のS期の間または前にヌクレオチドアナログをDNA内に取り込むことは細胞死
となるので、増殖細胞を迅速に標的とすると考えられている。マウスの骨髄の長
期生存および免疫造血再構築は、5-FUの1回の用量では影響を受けない;しかし
、多能性造血幹細胞(PHSC)は最初の投薬後約3〜5日間という短い期間に第2
回目の5-FUの投薬に対して攻撃されやすくなるということが示された(Harrison
ら、Blood 78:1237-1240、1991)。PHSCは、通常、5-FUの1回の投薬に対して細
胞周期に入るのが遅すぎて効果的ではなく、そして第1回目の5-FU処理の結果起
こる刺激により刺激されて迅速に細胞周期に入ることが説明され得る。本発明者
らは、PHSCは、INPROLにより遅い細胞周期状態に戻り得、これにより2回目の5-
FU処理から保護され得るということを提案した。
これらの実験に用いられたマウスは、BDF1雄マウスであった。5-FU(Sigma)
の貯蔵液を生理食塩水中で10μg/mLの濃度となるように調製した。各処理マウス
は、実験第0日に尾部静脈を介して体重10g当たり2mgの5-FUを受けた;24時間
後、マウスにINPROL(10μg/体重100g)を腹膜内注射し、そして第3日に第2回
目の5-FUの用量を注射した。生存研究は、各々30
匹のマウスからなる実験グループ(INPROL処理)およびコントロールグループに
おいて、マウスの死亡をモニターすることにより行った。生存曲線を図8に示し
た。実施例5
:骨髄細胞においてINPROLでプレインキュベーションした場合とMIP1α でプレインキュベーションした場合の効果
この実験の目的は、インビトロでマウス骨髄細胞に対するInprolおよびMIP1α
でプレインキュベーションした場合の阻害効果を比較することであった。
以下の手順を用いた:
インビボ:大腿骨から骨髄を集める48時間前に、6〜15週齢のBDF1マウスに20
0mg/kgの5-FUを腹腔内に注射する。
インビトロ:単一の細胞をプールした懸濁液を計数し、そして5×106細胞を
、InprolまたはMIP-1αと一緒にまたはなしで、5%ウマ血清、L-グルタミン添
加のIMDM培地と総容量2mlとして、37℃で5%CO2で4時間インキュベーション
する。次いで、細胞を2回洗浄し、そして再計数した。それらを以下の最終条件
下でメチルセルロースに接種する:
0.8% メチルセルロース
25% ウマ血清
20ng/ml 組換えネズミIL3
L-グルタミン添加
5×105細胞/ml
IMDM培地
プレートを11日間37℃で湿度100%中5%CO2でインキュベーションした。50細
胞より多いコロニーを計数した。
実施例6:INPROLはHPP-CFC増殖を阻害する
ネズミ再構築幹細胞および初期前駆体を評価するインビトロアッセイは、高増
殖性潜在コロニー(HPP-PFC)アッセイである;他の関連アッセイ、例えばCFU-A
、CFU-GM、CFU-EおよびCFU-GEMMは、徐々に制限された前駆細胞の集団を検出す
る(M.Moore、Blood 177:2122-2128、1991)。この例は、INPROLによる細胞の前
処理がそれらの増殖を阻害するのに対し、MIP-1αは、これらの実験条件下では
阻害しないということを示す。
BDF1マウスを、それらの骨髄をHPP-CFC数に関してアッセイする前に、5-フル
オロウラシル(200mg/kg腹腔内)で処理した。細胞を遠心分離により洗浄し、そ
して添加剤のない培地(コントロール)、INPROL(25ng/ml)またはMIP-1α(20
0ng/ml)を含む培地において、106〜5×106/mlの密度で4時間インキュベーシ
ョンした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そして30%FCSと、5637細胞
系およびWEHI-3B細胞系由来の組合
せ調整培地とを有する寒天(0.3%)に接種した(7.5%の各調整培地、Sharpら、
1991の勧めによる)。接種濃度は、60mmの皿に5×104細胞/mlであった。14日
目にコロニー数を計数し、そして結果を以下に示す。
これらの結果により、MIP-1αは、プレインキュベーションの期間中にのみ存
在した場合には、ほとんどの未成熟な前駆体の増殖を阻害しなかった。INPROLは
、これらの条件下で増殖を効果的に阻害し、生物学的活性という点から見るとIN
PROLとMIP-1αとの間には基本的な違いがあることを示している。実施例7
:放射線誘導性骨髄形成不全からの回復に対するINPROL治療の効果
骨髄形成不全は、放射線癌治療の一次的制限毒性(primary limiting toxicit
y)である。ある種の成長因子(例えば、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン)は
、放射線誘導性骨髄形成不全からの回復を促進し得るということが示されてきた
。幹細胞増殖のインヒビターの使用による保護という概念は、血液学的な損傷に
上手く対処することにおける異なった補足
的なアプローチである。初期に開発された処理手順(実施例3、4)に従うよう
に、致死量の放射線を照射されたマウスのモデルを確立した。9Gyのコバルト60
を受けたマウスは10〜14日後に死亡し始め;30日目までには死亡率は約50%とな
る、ということは当該分野では公知である。この致死用量を、それを連続した2
回の適用に分けて各4.5Gyずつとし、投薬と投薬の間は3日間の間隔を置いて、
本発明者らのモデルに用いた。予備データは、そのモデルの生存曲線が、9Gyに
よる1回の放射線照射で知られた生存曲線と非常に近いことを示した;さらに、
CFU増殖に関する試験は、第1回目の放射線照射の24時間後に35〜50%のCFUが増
殖するように誘導されることを示した。このような細胞は第2回目の投薬の前に
送達される幹細胞インヒビターにより保護され得る。
この可能性を試験するために、マウス(50匹/グループ)に第0日に4.5Gyを
照射し、その24時間後に腹腔内にINPROL2μg/マウスを投与し、コントロール
グループには生理食塩水を注射し、そして第2回目の放射線の照射量(4.5Gy)
を第3日目に与えた。
図9は、INPROLの1回の用量を投与した後の増大した生存を示す。モデルの状
態は、固形腫瘍により特徴付けられる癌を含むいかなる癌の治療にも臨床的に適
切であり、このような治療は、2回続けた放射線照射の間に有効量のINPROLを送
達することにより癌を有する患者に施され、それによって癌の治療に用いられる
放射線の照射線量をより多くすることが
できる。この様式を化学療法剤に広げることも可能であるべきである。実施例8
:自家骨髄移植へのINPROLの使用
骨髄移植は、いくつかの白血病(CML、AML、およびその他)にとっては唯一知
られた治癒的な治療である。点滴のための自家BMTのエクスビボ調整、白血病細
胞の混入のない正常幹細胞の潜在的な自己供給源を提供し、そしてレシピエント
の造血系を再生させて(repopulate)、積極的で効果的な治療を可能にする。
1.INPROL効果の研究用の長期骨髄培養物L1210白血病モデルはAraCによる除 去の間、正常な造血を保持する
長期骨髄培養物(LTBMC)をToksozら(Blood 55;931-936、1980)に従って確
立し、そして白血病細胞系L1210を2週間の間LTBMCと共培養した。正常前駆細胞
および白血病前駆細胞の同時成長はこれらのLTBMC/L1210の混合培養物内で起こ
り、それは白血病患者の骨髄内と同様の状況である。正常なコロニー形成単位CF
Uと白血病CFUとの間の区別は、WEHI-3(ネズミIL-3産生細胞系)由来の調整培地
の存在下または非存在下での寒天コロニーとしてそれらを成長させることにより
可能であった。正常細胞はIL-3非存在下でアポプトーシス(apoptosis)を受け
るのに対し、白血病細胞はIL-3非存在下でコロニーを形成し得る。LTBMC-L1210
組成物由来の懸濁細胞は、接種され
た50,000細胞当たり、IL-3存在下で約150コロニー(正常造血クローン)を示し
、IL-3なしで成長した場合70コロニー(白血病クローン)を示した。
除去手順は、以下の通りであった:第0日に、全ての懸濁細胞および培地(10
ml/フラスコ)をLTBMC-L1210の入っているフラスコから取り出し、200μgのシ
トシンアラビノシド(AraC)を含む2mlの培地で置き換えた(Tsyrlovaら、Leuk emia:Advances in Biology and Therapy
、第35巻、1988);20時間のインキュベ
ーション後、フラスコを洗浄し、そして2mlの新鮮な培地のみ(コントロールグ
ループ)または25ng/mlのINPROLを含む培地と4時間置き換えた。このプレイン
キュベーションの後、細胞を100μg/フラスコのAraCと一緒に37℃で3時間再び
インキュベーションした。各グループは4本のフラスコを含んだ。LTBMC-L1210
培養物を3回洗浄し、そして新鮮なLTBC培地で置き換えた;それらを再生研究の
ため前述のように3〜4週間維持した。
データを図10に示す。AraCのみで処理されたコントロール培養物には細胞の
成長が見られなかったが、INPROLで保護されたフラスコ内では、粘着層由来の前
駆細胞の増殖のため、造血再生が非常に急速に起こった。さらに、実験グループ
由来の細胞は、寒天に接種された場合、IL-3存在下では50,000細胞当たりわずか
約100 CFUしか成長しなかった;少なくとも4週間の間には白血病細胞の成長は
観察されなかった。従って、エクスビボでINPROLと組み合わせて有効量のAraCに
より
処理された骨髄は、癌性細胞を除去されるが、幹細胞は保護される。この様式は
他の形態の化学療法または放射線治療に広げることが可能であるべきである。
2.骨髄再生能(MRA)および30日間放射線防御は、インビトロのINPROL治療 により増大する
。
MRAは、致死量の放射線を照射されたマウスの骨髄を再生する細胞の能力であ
り、30日間の放射線防御を付与する能力を伴っていて、骨髄抑制動物を救うため
の可能性(potential)の直接的なインビボ測定である(Visserら、Blood Cells
14:369-384、1988)。
放射線防御研究に関して、BDF1マウスは9.5Gyで放射線照射され、テストステ
ロンで刺激されたドナー由来の骨髄の移植により回復する。レシピエントの1グ
ループは培地で(コントロール−グループA)、そして別のグループ(グループ
B)は25ng/mlのINPROLで、4時間プレインキュベートされた骨髄細胞により回
復した。両グループの細胞を洗浄し、そしてマウス1匹当たり30,000細胞を放射
線照射された動物に移植した。生存データを示す(図11)。3つの実験の合計
を、コントロールを100%に正規化して示す。30日目までに、コントロールグル
ープの生存マウスが36.5%であるのに対し、INPROLによるインキュベーションは
61.8%まで増加させている。
INPROLによるプレインキュベーションによって誘導されるMRAの増加は、放射
線防御を改善するメカニズムの1つであり得る。この仮説を試験するため、Viss
erら(前出)に従って
MRAを測定した。簡単にいえば、ドナーBDF1マウスをテストステロンで前処理し
、それらの骨髄を培地またはINPROLで4時間プレインキュベーションし、そして
放射線照射された動物に注射した。13日目に、レシピエントの大腿骨由来の骨髄
細胞を、20%ウマ血清、および10%WEHI-CMの存在下で、3つの異なる濃度(0.0
1、0.05、0.1当量の大腿骨(equivalent of a femur))で寒天に接種した。7
日目のコロニー数は、その時点のレシピエントの骨髄中のコロニー形成細胞がド
ナーの未成熟幹細胞の前駆細胞である限り、MRAのことを表す。
図12に見られるように、INPROLでプレインキュベーションされた細胞集団の
MRAは、コントロールグループ(B)の場合より多い。実施例9
:INPROLの幹細胞への抗過剰増殖効果は、それらの分化の異常を変化さ せ得る
CFUの過剰増殖は、細胞障害性薬剤または放射線照射からの回復中に見られる
だけでなく、正常な加齢の結果としても見られ、そして骨髄異形成症候群(MDS
)の主要な特徴であると考えられている。それは、顆粒球に沿った分化の間、赤
血球が分化する有病率のような分化障害を伴う。
骨髄細胞を25ng/mlのINPROLまたは培地(コントロール)と共に37℃で4時間
インキュベーションし、洗浄し、次いで20%ウマ血清、2U/mlエリスロポエチン
、および10%WEHI-CMを有する寒天に接種した。BFU-eおよびGM-CFUコロニーの数
を7
日目に計数した。表5に示されるデータは、3つの実験をまとめたものであり、
各グループから各時点で4匹を取り出した:4枚の皿に接種した。
表5から明らかなように、無傷の動物(8〜12週齢のBDF1)由来の正常骨髄(
NBM)をINPROLと共にインキュベートすることにより、異なるタイプのコロニー
の数および割合は変化しなかった;テストステロンプロピオネート(TSP)で前
処理されたBDF1ドナーは、前に示されたように(実施例1、3、4)、CFU増殖
の増加、および赤血球前駆細胞の数(BFUeコロニー)の増加、およびGM-CFUの減
少を示し、それはINPROLとのインキュベーションにより完全に取り消された。異
常に高いレベルのCFU増殖はまた、細胞周期のS期のCFUの10%に戻った。CFUの
過剰増殖は、例えばBalb/cマウス(表5)のようにウイルス性白血病誘発を高度
に受けやすいある種のマウス種の特徴であることが知られており、そしてより高
齢の動物においても観察し得る(表5)。TSP処理したBDF1マウスに見られる分
化方向の決定付けられた(committed)前駆細胞の同じ再分布がBalb/cおよび23
〜25ヶ月齢のBDF1において観察され、それは一般に異常に高いレベルのCFU増殖
を有する。CFUの増殖および分化の両方の修正は、INPROLとのインキュベーショ
ンによって可能であった。より一層臨床に適したものは、研究により、INPROLの
インビボ注射(2μg/マウス)がCFUの増殖ならびに赤血球(BFUe)とGM-コロ
ニーとの比の変化の両方に効果を及ぼすことが示された(表5)。
実施例10:INPROLの免疫刺激活性
高比率の増殖CFUを含む骨髄細胞とINPROLとのインキュベーションは、CFUの周
期を変えるだけでなく、それらの分化を変えて、主に赤血球の分化から顆粒球お
よびリンパ球の前駆細胞へ変換する。このINPROLの性質は、細胞障害性の化学療
法および放射線療法の免疫抑制的な副作用および過剰増殖幹細胞障害および加齢
に伴う免疫抑制のため重要である。
本実施例は、Wittlock & Witte(Ann.Rev.Immun.3:213-35、
1985)によって確立されたリンパ球長期培養(LLTC)由来の未成熟前駆体の前B
前駆細胞への分化に及ぼすINPROLの直接的な影響を示し、これはIL-7を含むメチ
ルセルロース中のコロニー形成によって測定される。
LLTCを、記載されたように確立し、そして新鮮なLLTC培地(Terry Fox Labs.
,Vancouver,Canada)を1週間に2回与えた。非粘着細胞を1週間に1度採取
し、因子を洗い流し、そして25ng/mlのINPROLとまたはコントロールとして培地
のみと4時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、濃
度が105細胞/mlとなるように、30%FCSおよび10ng/mlのIL-7を含むメチルセル
ロースに接種した。3週間のデータを図13に示す。大きな前Bコロニーの数はコ
ントロール中で変化し、時間とともに増加したが、INPROLとのプレインキュベー
ションは、常にコロニーの成長をコントロールレベルの4〜8倍に刺激した。こ
のことは、免疫不全状態を抑制し、そして例えばワクチン投与に対して所望の免
疫応答を増加させるのに有用であるINPROLの免疫刺激特性を示す。実施例11
:INPROLは幹細胞の再生能を改善する--CMLの患者由来の長期培養開始 細胞
慢性骨髄性白血病(CML)は、造血幹細胞の致死的な悪性疾患である。慢性期
にあるCMLを単一薬剤による化学療法、組み合わせ化学療法、脾摘出、または脾
臓への放射線照射によって治療することは臨床的徴候および症状を制御し得るが
、生存
を有意に伸ばすことはない。CMLが慢性状態から促進状態に進むと、標準的な治
療は効果的でない。現在では、骨髄移植(BMT)が唯一の既知の効果的なCML治療
である。血縁でないドナーのBMTを用いる治療は組織不適合性の問題により困難
である。適格なCML患者の40%未満にしか適合する血縁者がいない;従って自家
移植が好ましい。長期培養(LTC)において成長するPh陽性患者由来の非白血病
(Ph-陰性)骨髄前駆細胞を選択する能力と共に注入のための自己BMTのエクスビ
ボ調整は、正常幹細胞の自己供給源がCMLの積極的で効果的な治療を行い得る可
能性を示唆する。
BMTの状況においては、造血幹細胞は、長期間にわたって成熟した血液細胞を
生成する能力を有する細胞として定義され得る。本発明者らはC.Eaves & A.Eave
sによって開発されたヒトLTC系を、幹細胞数の定量用およびそれらの治療的使用
のための操作手段として用いた。このことは、予め確立され、放射線照射された
ヒト骨髄粘着層上に細胞を接種することを包含し、次いでこれらの培養物を5週
間維持した。エンドポイント(end point)はこの期間の終わりに採取された培
養物の総クローン原性細胞内容物(粘着および非粘着)である。このような条件
下で生じたクローン原性細胞は、最初に添加された前駆細胞(長期培養開始細胞
(LTC-IC))の数と直線関係にある;個々のヒトLTC-ICから生じた平均は、1LT
C-ICにつき4クローン原性前駆細胞である。CML患者の骨髄が同様の条件下に置
かれた場合、白血病性(Ph陽性)クローン原性細胞は
迅速に衰退し、CML患者の残った正常LTC-ICの定量を用いることにより、培養自
己移植片の移植により支持される集中治療から利益を得易い細胞を選択すること
が可能であることが既に示されている(Phillipsら、Bone Marrow Transplantat
ion8:477-487、1991)。
以下の手順を用いて、CML患者の末梢血液から確立された骨髄移植細胞中のク
ローン原性細胞(LTC-IC)の数におよぼすINPROLの影響を試験した。
予め放射線照射した間質(stroma)上の長期培養と同様に培養を開始した。健
常ドナーの末梢血液をコントロールとして用いた。CML患者のCML患者由来末梢血
液細胞を、INPROL(25ng/ml)と共にまたはなしで4時間プレインキュベートし
、洗浄し、そしてLTC-IC系に10日間置き、それに平行してLTC-IC中に5週間置い
た。LTC-ICの数は、粘着細胞および非粘着細胞の両方を適当な成長因子を有する
メチルセルロース(Terry Fox Laboratories、Vancouver、Canada)に接種する
ことにより、クローン原性前駆細胞の数によって推定した。10日間成長させた培
養由来の粘着および非粘着細胞の混合物を、INPROLと共にまたはなしでプレイン
キュベートし、さらに8週間予め確立させたフィーダー上に置き、クローン原性
細胞の数の測定のため4週目と8週目に採取した。図14に示したデータは、健常
ドナーの骨髄から始めた最初の10日間の培養ではLTC-ICに損失がなく、そして投
入したLTC-IC数のおよそ30%が5週間たってもなお培養中に存在していたことを
示す。CML患者の
LTC-IC数は10日間の間に約8%にまで劇的に低下し、そしてさらなるインキュベ
ーションによっても元には戻らなかったが、INPROLとの細胞のプレインキュベー
ションは、最初の数の30%までLTC-ICレベルを増加させ、そしてそれを8週間維
持した。
これらの予備データによって予想されるINPROLの臨床関連の適用は、新鮮なま
たは培養の骨髄移植物の正常幹細胞内容物を選択的に改善するストラテジー、イ
ンビボの残留正常幹細胞の補充を高めるストラテジー、さらに患者へのさらなる
移植のために新しい遺伝子物質をヒト骨髄幹細胞に転移させるプロトコルにおけ
るそれらの使用を包含する。実施例12
:骨髄調製物由来の幹血液細胞増殖の免疫活性インヒビターの単離方法
骨髄はブタの肋骨から単離した。ブタの胴体から肋骨を分離して筋繊維および
脂肪を除き、断片に刻んで骨髄をBiophyzpribor社製の水圧プレス(hydropress
)によって抽出した。骨髄細胞を遠心機K-70中で2,000rpmで20分間遠心分離する
ことにより分離する。次いで、抽出上清をAmicon USAメンブレンXM-100、PM-30
、PM-50をそれぞれ用いて限外濾過にかける。電気泳動による分析によると、こ
の生成物の主要な成分はアルブミンである(図1参照)。
生物化学的精製
画分の骨髄抽出物およびタンパク質成分を、精製の各段階で、0.1%ドデシル
硫酸ナトリウムを含む10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
電気泳動は20Ycmのゲルで5時間行った。次いでゲルを、エタノール:水:酢
酸が5:5:1の混合物中の0.25クーマシーCBBC250で20℃で1時間染色し、そ
して7%酢酸を数回交換して洗浄した。7%までのドデシル硫酸ナトリウムおよ
び0.5〜1%までのメルカプトエタノールをサンプルに添加し、そしてそのサン
プルをゲルに流す前に70℃で5分間インキュベートした。
生成物の活性を幹造血細胞増殖の阻害方法により評価した(CFU)。この方法
を以下に詳細に述べる。
ステージ1.硫安沈澱による精製
活性を、表1の結果に基づいて選択された飽和度40〜80%で25%の硫安を用い
て沈澱させることにより精製した。
精製の各工程の後の試験に用いられる調製物の量は、精製レベルによって決定
し、始めの生成物の2×10-2mgの用量と
同じであった。活性を下式により決定した:
変化%=Sa%−Sb%
ここで、aは、コントロールのS%であり、
bは、試験画分とのインキュベーション後のS%である。
画分は、各活性試験の前、および次の各精製工程の前に硫安濃度を20倍低くす
るために脱塩した。
ステージ2.ステージ1の不純物のあるインヒビターを脱塩後にイオン交換ク
ロマトグラフィー(本発明者らの場合DEAE23セルロース)にかけて分画し、次い
で酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)の勾配を用いて溶出する。
インヒビターの活性画分は3〜5mMの間に溶出する。
カラム体積は1mlであり、溶出速度は1時間に4mlであった。検出はクロマト
グラフMillicromeにより230および280nmで行った。最も高い活性を示した画分1
(図2参照)を単離し、5mM酢酸ナトリウム緩衝液中に溶出した(表2参照)。
電気泳動データは、主なタンパク質混入物であるアルブミ
ン(図3参照)がこの画分から除かれることを示し、さらに4回の精製に続く。
ステージ3.ステージ2から部分精製されたインヒビターを直接G-75Sephadex
カラムにかける。
カラム体積は20ml(20×1)、溶出速度は2ml/時間である。溶出緩衝液は50mM
NaCl、10mM Tris-HCl、pH7.5である。検出はクロマトグラフMillichromeにより
230および280nmで行った。最も高い活性を示した画分5を単離した。
ステージ4.Pro-RECカラムを用いた逆相クロマトグラフィー(Pharmacia FPL
C System)をアセトニトリル勾配における0.1%トリフルオロ酢酸中のUltrasfer
a matrix 10μg上で行った。
分子量16〜17kDの生成物の均質度は、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたアクリ
ルアミドゲル分析に示されるように90%に等しい(図6参照)。この結果を図4
に示す。分画5についての活性を測定する。生成物の最終回収率は5%である。
結果として、精製後の分子量16kDのタンパク質の総量は始めの生成物の650ng/ml
である。精製プロセスの間、生成物は70℃の加熱インキュベーションを数分受け
たが、生物学的活性の損失は検出されなかった。
2.インビボ幹細胞増殖アッセイ(CFU)
未成熟造血前駆細胞--脾臓のコロニー形成単位--CFUは、致死的に放射線照射
されたマウスの脾臓中に、造血細胞の静脈注射後8〜12日後に、肉眼で見えるコ
ロニーを形成することにより検出され得る(Till & McCulloch、1961)。
標準的なCFU増殖アッセイである3Hチミジン「自殺」法が通常用いられる(Bec
kerら、1970)。この方法は放射性標識チミジン(3H-チミジン)、即ちDNAの前
駆体のDNA合成(細胞周期のS期)の間の細胞への取り込みに基づく。試験時に
細胞周期のS期にあるCFUは、高い放射活性により死滅させられ、そして脾臓内
で容易にコロニーを形成し得ない。従って、3H-チミジンなしでインキュベート
した細胞サンプルの注射によって形成されたCFUの数と3H-チミジンとともにイン
キュベートした同じ細胞の注射によって形成されたCFUの数との違いは、増殖し
ているCFUのパーセンテージを示す。
インヒビター試験は、インヒビターが細胞周期にあるCFU(正常マウスの骨髄
中に7〜10%の低率で存在する)に効果を及ぼす限り、刺激されなかった動物由
来の骨髄幹細胞群に関わることができない。
CFUの増殖を刺激するために、フェニルヒドラジン(phenylhydrazine:PHZ)刺
激または致死量以下の放射線照射を用いた(Lord、Br.J.Haem.34:441-445、1976
)。
本発明者らは、CFUの細胞周期に及ぼすテストステロン−プロピオネート(TSP
)の刺激効果(Byronら、Nature 228:1204、1970)に基づくテストステロンプロ
ピオネート(TSP)の注射を発明した。それは試験を簡便にし、いかなる副作用
も引き起こさなかった。TSPはCFU増殖の刺激を注射後20〜24時間以内に誘導し、
その効果は少なくとも7日間見ることができた。
インヒビターについての精製中の画分のスクリーニングに用いられた手順は、
以下の通りであった:
マウス:全ての試験を通じてBDF1またはCBF1マウス血統を用いた。
S期に30〜50%のCFUを誘導するために、ドナーマウスを1匹当たり0.2mlの腹
腔内注射により10mg/100gの用量でTSPで処理した。
24時間後、細胞懸濁液調製用に大腿骨から骨髄を取り出す。次いで1ml当たり
5〜10×106細胞を、各グループ試験管2本ずつ(放射性含有用と非含有用)、
異なるコントロールおよび試験画分とともに水浴中37℃で3〜5時間インキュベ
ートする。
3〜5時間後、3H-チミジン(1mCi/ml、比活性18〜25Ci/m.mole)を各放射性
含有試験管に細胞懸濁液1ml当たり200μlずつ添加し、非含有用の試験管には何
も添加せず、37℃でさら
に30分間インキュベートする。
30分間のインキュベーションの後、死滅反応を400μg/mlの非放射性チミジン
を含む10mlの冷培地(温度4℃)を添加することにより停止させる。細胞を十分
に洗浄する(3回)。
細胞を再懸濁し、注射に望ましい濃度(通常マウス1匹当たり0.3〜0.5ml中に
2〜4×104細胞)に希釈する。
1グループ当たり8〜10匹の受容マウスに注射の6時間以上前に放射線照射す
る。
9日目〜12日目に受容体の脾臓を採取し、そしてTellesnitsky溶液に固定し、
目視によりコロニーを計測する。S期にある細胞の割合を下式を用いて計算する
:
ここでa−3H-チミジンを有さないCFU数
ここでb−3H-チミジンを有するCFU数実施例12B
:より大量のINPROLを単離するための他の方法
最初の単離
新鮮なブタの胴体から採った肋骨から筋繊維および脂肪を除き、次いでこれを
刻んで細かくし、リン酸緩衝生理食塩水に1:1(重量/容量)の比率で浸漬する
。得られた混合物を水圧プレス(hydraulic press)で粉砕し、固体骨物質と骨
髄とを分離する。
骨髄細胞懸濁液を回収し、そして4層のチーズ・クロース
(cheese-cloth)を通して固形粒子を濾過する。濾液を56℃で40分間インキュベ
ートし、次いで氷浴で4℃まで冷却する。分離した沈澱物を10,000gで30分間4
℃で遠心分離することにより除去し、廃棄する。
清澄化した上清を、1容量%の濃塩酸を含む10容量の撹拌された氷冷アセトン
に30分間滴下して添加する。得られた混合物を4℃で16時間保存し、完全な沈澱
物を形成させる。次いで、沈澱物を20,000gで30分間4℃で遠心分離することに
よりペレットにする。このペレットを冷アセトンにより洗浄し、そして乾燥する
。
HPLC精製
ペレットを、5%アセトニトリル(MeCN)および0.1%トリフルオロ酢酸(TFA
)を含むHPLC溶出緩衝液Aに溶かし、最終タンパク質濃度を8〜10mg/mlとする
。この溶液(0.5〜0.6ml)をPolisilODS-300(10mcm)で充填され、そして同じ
緩衝液Aにより平衡化された250×4.6mmのHPLCカラムにかける。
溶出は緩衝液A中の緩衝液B(90%MeCN、0.1%TFA)の勾配により、流速1ml
/l分で、以下のプログラムに従って行う。
時間、分 Bの%
0 0
4 0
5 25
25 90
100%のBを5分間流すさらなる工程を用いて再平衡化の前にカラムを洗浄す
る。次いで、カラムを開始時の状態に戻すため再び平衡化し、そして次の部分の
タンパク質溶液をカラムにかける。
分離の間、カラム溶出物をタンパク質ピークの検出のため280nmでモニターす
る。タンパク質物質を含む画分を回収し、分離したピークをプールして、30℃で
ロータリーエバポレーターにかけて乾燥させる。得られた残渣を蒸留水に溶解し
、生物活性試験およびSDS-PAGE(14%ゲル、還元条件)によりアッセイする。活
性物質を含むピークは、緩衝液Bが70%と80%との間に溶出し、SDS-PAGEによっ
てアッセイされたように、16kDの主要なタンパク質バンドおよび速く移動するタ
ンパク質の痕跡を含む。
活性物質の分析を図15に示す。500μgの精製INPROLをC4逆相カラム(Vydac
)にかけ、そして0.1%トリフルオロ酢酸中の5〜95%アセトニトリルの直線勾
配を用いて溶出した。その物質は53%アセトニトリルで単一ピークとして溶出し
た(図15A)。しかし、250μgのMIP-1α(R & D Systems)を同じ条件で流し
た場合、それは43.9%アセトニトリルで溶出した(14%アセトニトリルより前に
溶出する初期のピークは人工的で検出器内の気泡によることを銘記されたい)。
従って、INPROLは、実質的には、このような条件下ではMIP-1αより疎水性であ
る。TGF-βはこの条件下ではINPROLで観察される濃度より低い濃度で溶出するこ
とが知られている(Miyazon
oら、J.Biol.Chem.263:6407-15、1988)。
溶出したINPROL物質のゲルを図15Cに示す。レーン1は粗抽出物質、レーン2
は、分子量マーカー、そしてレーン3は精製物質である。2本の主要なバンドが
あり、1本は約14kD、そしてもう1本は約35kDである。この35kDのバンドは14kD
のバンドのマルチマー形態であると考えられる。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
A61K 39/39 8517−4H C07K 1/34
C07H 21/04 8517−4H 16/18
C07K 1/20 9284−4C A61K 39/395 D
1/30 9455−4C 37/02 ADS
1/34 ABD
16/18 ADU
// A61K 39/395 ADV
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AT,AU,BB,BG,BR,BY,
CA,CH,CN,CZ,DE,DK,ES,FI,G
B,HU,JP,KP,KR,KZ,LK,LU,LV
,MG,MN,MW,NL,NO,NZ,PL,PT,
RO,RU,SD,SE,SK,UA,US,VN
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下の性質によって特徴付けられる幹細胞増殖インヒビター: (a)ネズミCFU-Sアッセイにおいて比活性(IC50)が<20ng/mlである; (b)限外濾過により分子量が10,000ダルトンより大きく、100,000ダルトン より小さい;および (c)逆相クロマトグラフィーによりMIP1αまたはTGFβのいずれよりも疎水 性である。 2.前記インヒビターがタンパク質である、請求項1に記載の幹細胞増殖インヒ ビター。 3.前記インヒビターが非炎症性である、請求項1に記載の幹細胞増殖インヒビ ター。 4.前記インヒビターが熱安定性である、請求項1に記載の幹細胞増殖インヒビ ター。 5.前記インヒビターが酸安定性である、請求項1に記載の幹細胞増殖インヒビ ター。 6.前記インヒビターが、胃腸細胞、胃腸組織、上皮細胞、上皮組織、生殖細胞 、または生殖組織において活性を有する、請求項1に記載の幹細胞増殖インヒビ ター。 7.前記インヒビターが、造血細胞または造血組織において活性を有する、請求 項1に記載の幹細胞増殖インヒビター。 8.前期比活性が、ネズミCFU-Sアッセイにおいて<2ng/mlである、請求項1に 記載の幹細胞増殖インヒビター。 9.請求項1に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤 と共に含有する薬学的組成物。 10.非経口投与のための、請求項9に記載の薬学的組成物。 11.インビトロ増殖アッセイにおいて因子が常に存在することを必要としない 、抑制活性を有する幹細胞増殖インヒビター。 12.前記インヒビターがタンパク質である、請求項11に記載の抑制活性を有 する幹細胞増殖インヒビター。 13.前記インヒビターが非炎症性である、請求項11に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 14.前記インヒビターが熱安定性である、請求項11に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 15.前記インヒビターが酸安定性である、請求項11に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 16.前記インヒビターが、胃腸細胞、胃腸組織、上皮細胞、上皮組織、生殖細 胞、または生殖組織において活性を有する、請求項11に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 17.前記インヒビターが、造血細胞または造血組織において活性を有する、請 求項11に記載の幹細胞増殖インヒビター。 18.前期比活性が、ネズミCFU-Sアッセイにおいて<2ng/mlである、請求項1 1に記載の幹細胞増殖インヒビター。 19.請求項11に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希 釈剤と共に含有する薬学的組成物。 20.非経口投与のための、請求項19に記載の組成物。 21.短時間のプレインキュベーションの間のみに存在する場合に活性である、 抑制活性を有する幹細胞増殖インヒビター。 22.前記インヒビターがタンパク質である、請求項21に記載の抑制活性を有 する幹細胞増殖インヒビター。 23.前記インヒビターが非炎症性である、請求項21に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 24.前記インヒビターが熱安定性である、請求項21に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 25.前記インヒビターが酸安定性である、請求項21に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 26.前記インヒビターが、胃腸細胞、胃腸組織、上皮細胞、上皮組織、生殖細 胞、または生殖組織において活性を有する、請求項21に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 27.前記インヒビターが、造血細胞または造血組織において活性を有する、請 求項21に記載の幹細胞増殖インヒビター。 28.前期比活性が、ネズミCFU-Sアッセイにおいて<2ng/mlである、請求項2 1に記載の幹細胞増殖インヒビター。 29.請求項21に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希 釈剤と共に含有する薬学的組成物。 30.非経口投与のための、請求項29に記載の組成物。 31.B細胞の成長を刺激する方法であって、リンパ球の発 育を促進するために有効量の請求項1に記載のインヒビターを投与する工程を包 含する、方法。 32.以下の工程を包含する、癌を治療する方法: (a)患者の骨髄を除去する工程; (b)培養物中の該骨髄をインヒビターで処理する工程; (c)該骨髄を細胞障害性化学療法剤で処理して、癌細胞を破壊する工程; および (d)骨髄破壊処理の後、患者に移植する工程。 33.以下の工程を包含する、白血病を治療する方法: (a)患者の骨髄を除去する工程; (b)培養物中の該骨髄をインヒビターで処理する工程; (c)該骨髄を細胞障害性化学療法剤で処理して、白血病細胞を破壊する工 程;および (d)骨髄破壊処理の後、患者に移植する工程。 34.***中の幹細胞を損傷させ得るかまたは破壊し得る薬剤に曝された哺乳動 物の幹細胞***を阻害するのに有用な薬学的組成物。 35.前記幹細胞増殖インヒビターが、骨髄移植(自家移植または同種移植)あ るいは遺伝子導入のために、骨髄細胞または末梢血液細胞または臍帯(cord)血 液細胞の長期培養物において哺乳動物の造血幹細胞をエクスビボで良好に維持ま たは拡張するために用いられる、請求項34に記載の薬学的組成物。 36.前記幹細胞阻害因子が、骨髄増殖疾患または自己免疫 疾患における造血幹細胞の過剰増殖あるいは上皮幹細胞の過剰増殖の治療のため に用いられる、請求項34に記載の組成物。 37.以下の工程により単離される幹細胞増殖インヒビター: (a)骨髄を単離し、そして抽出物から粒子状物質を除去する工程; (b)該抽出物を加熱し、そして沈澱物を除去する工程; (c)該抽出物を酸沈澱させ、そして沈澱物を集める工程; および (d)逆相クロマトグラフィーにより該インヒビターを単離する工程。 38.請求項37に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希 釈剤と共に含有する薬学的組成物。 39.非経口投与のための、請求項38に記載の組成物。 40.化学療法または放射線照射から白血病細胞でなく正常細胞を区別して保護 するために有用な薬学的組成物。 41.細胞障害性薬剤または放射線照射手法に曝すことによって幹細胞が増殖す るように誘導された後に、前記幹細胞増殖インヒビターが投与される、哺乳動物 を治療する方法。 42.前記幹細胞増殖インヒビターが、免疫応答を増大させる能力に基づいて、 ワクチン投与の前またはと同時にアジュバントとして投与される、哺乳動物を治 療する方法。 43.実質的に他のタンパク性物質を含まない幹細胞増殖インヒビターを精製す る方法であって、以下の工程を包含する 方法: (a)骨髄を単離し、そして抽出物から粒子状物質を除去する工程; (b)該抽出物を加熱し、そして沈澱物を除去する工程; (c)該抽出物を酸沈澱させ、そして沈澱物を集める工程; および (d)逆相クロマトグラフィーにより該インヒビターを単離する工程。 44.細胞障害性薬剤による損傷に対して造血幹細胞を保護するために、請求項 1に記載の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、哺乳動物を治療 する方法。 45.細胞障害性薬剤による損傷に対して造血幹細胞を保護するために、請求項 11に記載の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、哺乳動物を治 療する方法。 46.細胞障害性薬剤による損傷に対して造血幹細胞を保護するために、請求項 21に記載の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、哺乳動物を治 療する方法。 47.細胞障害性薬剤による損傷に対して造血幹細胞を保護するために、請求項 37に記載の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を包含する、哺乳動物を治 療する方法。 48.幹細胞増殖インヒビターが、幹細胞過剰増殖によって引き起こされる免疫 低下を逆転させるために作用する、哺乳動物を治療する方法。 49.請求項1に記載のインヒビターに対する抗体。 50.請求項11に記載のインヒビターに対する抗体。 51.請求項21に記載のインヒビターに対する抗体。 52.請求項37に記載のインヒビターに対する抗体。 53.抗ウイルス剤と一緒に用いられる、請求項1に記載の幹細胞増殖インヒビ ター。 54.抗ウイルス剤と一緒に用いられる、請求項11に記載の幹細胞増殖インヒ ビター。 55.抗ウイルス剤と一緒に用いられる、請求項21に記載の幹細胞増殖インヒ ビター。 56.抗ウイルス剤と一緒に用いられる、請求項37に記載の幹細胞増殖インヒ ビター。 57.前記インヒビターに感受性である白血病細胞の抑制を包含する、哺乳動物 の白血病を治療する方法。 58.免疫学的にMIP1αまたはTGFβとは異なり、ネズミCFU-Sアッセイにおいて< 2g/mlの比活性を有する、幹細胞増殖インヒビター。 59.前記インヒビターがタンパク質である、請求項58に記載の幹細胞増殖イ ンヒビター。 60.前記インヒビターが非炎症性である、請求項58に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 61.前記インヒビターが熱安定性である、請求項58に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 62.前記インヒビターが酸安定性である、請求項58に記載の幹細胞増殖イン ヒビター。 63.前記インヒビターが、胃腸細胞または胃腸組織、上皮細胞または上皮組織 、または生殖細胞または生殖組織において活性を有する、請求項58に記載の幹 細胞増殖インヒビター。 64.前記インヒビターが、造血細胞または造血組織において活性を有する、請 求項58に記載の幹細胞増殖インヒビター。 65.請求項58に記載のインヒビターを薬学的に受容可能なキャリアまたは希 釈剤と共に含有する薬学的組成物。 66.非経口投与のための、請求項65に記載の薬学的組成物。 67.免疫学的にMIP1αまたはTGFβとは異なり、ネズミCFU-Sアッセイにおいて< 5ng/mlの比活性を有する、幹細胞増殖インヒビター。 68.免疫学的にMIP1αまたはTGFβとは異なり、ネズミCFU-Sアッセイにおいて< 1ng/mlの比活比を有する、幹細胞増殖インヒビター。 69.生物学的活性を有し免疫学的にMIP1αまたはTGFβとは異なるポリペプチ ドをコードする組換えDNA分子を含む遺伝子であって、該生物学的活性が幹細胞 増殖の阻害である、遺伝子。 70.請求項1記載のインヒビターに対するアナログ。
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