JPH08509356A

JPH08509356A - 細胞の移植システム及び方法

Info

Publication number: JPH08509356A
Application number: JP6501772A
Authority: JP
Inventors: エロフエリックソン; ピーターエムヴォークト
Original assignee: エロフエリックソン
Priority date: 1992-06-11
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 1996-10-08
Also published as: ES2149818T3; AU4535693A; DE69329241D1; ATE420156T1; DE69329241T2; CA2137914A1; PT644929E; GR3034758T3; EP0955359B1; ATE195551T1; US5423778A; EP0955359A1; EP0644929B1; WO1993025660A1; DK0644929T3; DE69334257D1; EP0644929A1

Abstract

(57)【要約】傷治療チャンバーと組合せた、ケラチノサイト、特に表皮幹細胞を高割合で含有するケラチノサイト中への、ウィルスベクター又はプラスミドによる遺伝子物質の遺伝子的転移が、遺伝子的に加工された細胞の移植手段として、また長期生存化のための手段として特に有用であることが実証された。傷チャンバーシステムを使用することによって、直接インビボ遺伝子移転を、開口した傷において露出した細胞に対しても実行できる。毛包中に位置する皮膚幹細胞を使用することにより、長期生存化が大幅に高まる。遺伝子転移のための傷チャンバーシステムを使用すると、傷液体中に発現された蛋白の存在を分析することによって、早期発現の同一の評価を達成するために、例えば、バイオプシーのような従来の攻撃的な技術の使用に比べて、転移の成就の非攻撃的な評価を行うことができる。一般の血液又はリンパ系中への分泌のために、又は蛋白の特性を変更するために、例えば、移植された細胞に対する免疫応答を誘導する蛋白を発現しないようにするために、広範囲の蛋白及び物質を発現させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】細胞の移植システム及び方法発明の分野本発明は、正常及び遺伝子工学により得た細胞の培養及び患者への移植システムに関するものである。ケラチノサイトは、体の表面を覆う主要な細胞である。この細胞は、体の主な表面バリアーを構成するたんぱく質、特にケラチンをつくることができる。種々の異なった理由から、ケラチノサイトは遺伝子転移の魅力的なターゲットである。この細胞は、体の表面に位置しているので、遺伝子の操作とモニターの両方のために容易に利用できる。遺伝子転移から合併症、例えば、局部的な腫瘍や局部的な感染が発生した場合には、それらは、他の部署においてよりも容易に皮膚内で治療することができるであろう。これまでに、ケラチノサイトの遺伝子操作は１つの方法で行われてきた。皮膚を採取し、ケラチノサイトを繊維芽細胞より分離し、ケラチノサイトを個々に単利して懸濁状態にしてきた。次いで、ケラチノサイトのこのような懸濁物は、レインワルドら（Rheinwald，J．G.，Green，H.）により表皮ケラチノサイトの種々の培養”The Formation of keratinizing Colonies From Cells”Cell G，331 -343，1975おいて報告されているように、組織培養技術を用いてコンフルエンス（confluence）になるまで培養してきた。ウイルス性ベクター又はプラスミドを用いてインビトロで成長させながら、ケラチノサイトに新規な遺伝子材料が導入されてきた。これは、モルガンら（Morg an，J．R.，Barrandon，Y.，Green，H．Mulligan，R.C．“Expression of an Ex ogenous Growth Hormone Glue by Transplantable Human Epidernal Cells”Sci ence， Vol．237，1476-1479（1987）及びテンナーら（Temner，J.，Lindahl，A. ，Green，H．“Human Growth Hormone in the Blood of Athymic Mice Grafted with Cultures of Hormone Secreting Human Keratinocytes”FASEB J．4:3245- 3250（1990）．次いで、トランスフェクションの収率を向上させるためにトランスフェクトした細胞を通常再懸濁し、選択培地で成長させる。次に、ケラチノサイトのシートを、該ケラチノサイトを取った哺乳動物に移植しなおす。インビトロにおける収率が受入れ可能であった場合であってさえも、インビボでの収率は、短期間及び長期間の両方において受け入れることができない程低かった。例えば、ガーリックら（Garlick，J．A.，Katz，A.B.，Fenvjes Esitaich man，L.B.）により“Retrovirous Mediated Transduction of Cultured Epidoma l Keratinocytes”Invest．Dermatol.，97:824-829，1991において報告されている。従って、本発明の目的は、患者に細胞、特にケラチノサイト及び遺伝子工学により得た細胞を移植する改良された方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、経済的で、実際的で、容易に構築でき、かつ患者に対して最小の努力と費用で変更することができる移植手段を提供することである。発明の概要ウイルスベクター、プラスミド又は遺伝子銃を用いたケラチノサイトへの遺伝子材料の遺伝子転移、特に高割合の表皮幹細胞を含むもの、をインビボ培養チャンバーの使用とを組み合わせると、ケラチノサイトの培養に特に効果的であることが実証された。傷チャンバーシステムを使用すると、直接インビボ遺伝子移植を、開口した傷の中にある細胞に対して行うことができる。もしこれらの細胞が該チャンバーでカバーされないと、それらは乾燥し、かつ死滅してしまう。該チャンバーは、外部から傷を完全に密封し、遺伝子材料やベクターが傷の外側に広がるのを防止している。同時に、該チャンバーは、ウイルス、他の微生物や化学汚染物質を含む望ましくない汚染物質が突発的に傷に混入するのを防止する。初期の発現の同様の評価を行うために、バイオプシーのように組織を採取する攻撃的（invasive）技術を用いる先行技術とは異なり、遺伝子移転について傷チャンバーシステムを使用すると、傷液中における発現蛋白質の存在の検定により移転の成功の評価を組織を採取することなく行うことができる。毛根や皮膚の基底層（basal layer）に存在する皮膚幹細胞を用いると、大幅に長期生存を促進できる。他の細胞、特にケラチノサイトを単独で又は該幹細胞とともに使用することができる。チャンバーは、ケラチノサイトの培養に好ましい手段であるが、ケラチノサイトにおける遺伝子移転や発現は、遺伝子材料をタトー（tattoo）技術を用いて直接細胞に注射することにより、直接達成できることが実証された。一般血液系やリンパ系に分泌するために又はたんぱく質の特性を変えるために、例えば、移転した細胞に対する免疫応答を誘導する蛋白質を発現しないために、広範囲の蛋白質と材料を発現できる。図面の簡単な説明図１は、毛髪の小胞を露出して表皮幹細胞を得るのに使用する部分的な厚みを有する皮膚フラップの露出した下面の概略図である。図２は、患者のケラチン生成細胞を培養するためのチャンバーの好ましい実施態様を示す図面である。図３は、ケラチン生成細胞を培養するためのチャンバーの好ましい実施態様を示す図面である。図４は、細胞に遺伝子材料を挿入するためのタトー装置の概略図である。図５は、図４に示したマイクロニードル１０の横断面図である。図６は、タトー装置を使用して表皮細胞に遺伝子材料を挿入することを示す写真である。図７は、タトー装置を使用して表皮細胞に遺伝子材料を挿入することを示す写真である。図８は、タトー装置を使用して遺伝子材料が挿入されたケラチン生成細胞を示す組織スライドの写真である。図９は、タトー装置を使用して遺伝子材料が挿入されたケラチン生成細胞を示す組織スライドの写真である。図１０は、タトー装置を使用して遺伝子材料が挿入されたケラチン生成細胞を示す組織スライドの写真である。図１１は、ケラチン生成細胞中のヒト成長ホルモンをコードする遺伝子の発現（時間（日）当たりのng/ml）を示すグラフである。図１２ａは、レトロウイルス遺伝子転移による主豚ケラチン生成細胞の、lacZ 遺伝子による高頻度トランスフェクション、β-Gal陽性細胞、の写真である。図１２ｂは、レトロウイルストランスフェクトした移植ケラチン生成細胞により再生されたlacZ遺伝子の発現、β-Galステイニング、を示す写真である。図１３は、治療チャンバー中で傷に対して適用されたケラチン生成細胞懸濁液（△）に対する普通の塩水処置（□）に関し、６頭の豚における全深さの傷からの内生蛋白質の流出と比較した、時間（日）に対する傷流体中への蛋白質の漏出（mg/dl）を示すグラフである。図１４ａは、レトロウイルス遺伝子転移後、主豚ケラチン生成細胞培養によるインビトロにおけるヒト成長ホルモン（hGH）の時間（日）に対する連続生産（n g/ml）を示すグラフであり、２回の実験の平均値である。図１４ｂは、レトロウイルス遺伝子転移後、豚ケラチン生成細胞の移植懸濁液により生産された全深さの傷からの傷流体中のインビボにおける時間（日）に対するヒト成長ホルモン（hGH）（ng/ml）を示すグラフである。完全な再上皮化（組織的に、６日）及び多層上皮の形成後、数値はベースラインに戻る。平均値± SE。発明の詳細な説明米国出願０７／７０７，２４８は、処置流体をチャンバーに出し入れするための入口手段を有し、傷の周囲に固定することができるチャンバーと、処置流体と、少なくとも１種の処置添加剤と、処置変数の制御手段と、傷の状態をモニターするためのモニター手段とを有する、傷及び他の皮膚疾患の処置のための装置を記載する。処置流体及び添加剤は、傷の症状によって選択され、成長因子、抗生物質、麻酔薬、酵素及び酸素が挙げられる。温度、コロイド浸透圧、ｐＨ、イオン濃度及び酸素含有量等の処置変数は、傷の症状により制御される。チャンバーを傷の周囲に固定し、処置流体、少なくとも１種の処置添加剤をチャンバーに導入し、処置変数を、傷の状態により制御する。処置可能な疾患の例としては、火傷、痛み、腫瘍及び感染等の傷が挙げられる。このチャンバーはまた、傷の上で細胞を培養するのに使用することもでき、そこで、分散した細胞をチャンバー中に導入し、傷の部分に落ち着かせ成長させる。ここで説明した方法は２つの主要な要素を基礎としている。その１は、遺伝子転移のために表皮幹細胞を標的にすることである。その２は、インビボ組織培養環境を創り出すために傷チャンバーを使用することであり、これにより、細胞中に遺伝子材料を導入する際に、インビトロで細胞を培養する必要がなくなる。表皮ケラチン生成細胞は、全身血液循環において検出可能なアポリポプロテインＡのような生理活性物質の分泌並びに機械的安定性及び一体性において重要な機能を有するが故に、表皮の傷の治癒において、遺伝子の転移及び組換えＤＮＡ発現に理想的なものである。遺伝子的に操作したケラチン生成細胞の懸濁液をオープンの傷の上に移植することにより、それらをシート中で生育させる必要がないことがわかった。これは、ケラチン生成細胞中の遺伝子転移プロセスをより簡単にかつ短時間で可能にするものである。細胞ケラチン生成細胞は、ディスパーゼ（dispase）により真皮から分離され、トリプシンでバラバラにされ、繊維芽細胞（fibroblast）が除かれる。多数の幹細胞を提供する毛髪の小胞（毛胞）中のケラチン生成細胞を標的にすることにより、トランスフェクションの収率が高くなり、これらの細胞は表皮の基層に安定に導入されることがわかった。毛包細胞は、“表皮の幹細胞”として働く。この領域から表皮のレスト（rest）の機械的分離を使用することにより、これらの細胞は、ダーマトーム法を用いて取り出すことができ、また遺伝子材料をこれらの細胞にその場で（in situ）直接に導入することができる。細胞は、患者の他の部分、例えば、骨髄細胞、筋肉細胞、及び内分泌器官細胞等の他の組織をはじめとする部分から、必要により採取することができる。遺伝子材料の導入遺伝子材料は、プラスミド、レトロウイルス、又は標準的な方法を用いた遺伝子銃転移により細胞中に導入することができる。遺伝子材料は、成長因子、ホルモン、他の治療用蛋白質等の蛋白質をコードする。これらは、傷の治癒を促進し、上皮小体、成長ホルモン、及び他のホルモン欠乏症等の或る種の欠乏症、因子 VIIIのような或る種の凝固因子の欠乏症等を治癒することができる。細胞は、免疫応答に関与する蛋白質、例えば、ヒト白血球抗原（HLA）等の蛋白質を発現しないように操作することもできる。ケラチン生成細胞を培養し、まずディスパーゼ、次いでトリプシンに暴露して懸濁し、インキュベーターでサブコンフルエントになるまで生育させる。次いで組換えＤＮＡを、ウイルスベクター、プラスミド又は遺伝子銃法を用いて細胞中に導入する。その後、ケラチン生成細胞を懸濁し、傷チャンバーにより被われた全深さの傷に注入する。これらのケラチン生成細胞は生存するだけでなく、表皮の基層中でマーカー遺伝子を発現する細胞が継続して存在していることを示す。傷のケラチン生成細胞と繊維芽細胞は、これらの細胞のゲノム又は細胞質に、例えば、成長因子をコードする遺伝子が導入されると、成長因子を生産することができる。発現した成長因子は傷の治癒を促進するだけでなく、治らないような傷の治癒を促進する。従って、遺伝子操作したケラチン生成細胞を使用して、傷の環境自体によって決定されるように、傷中に成長因子を導入することができる。このアプローチは、各種の皮膚疾患で欠けた機能を再生するために、ケラチン生成細胞に所望の他の遺伝子を挿入するのに使用することができる。また、通常ある因子を生成しない細胞内で、その因子を表現するという点において、細胞の ***活動における様式を、パラクライン（paracrine）からオートクライン経路（autocrine pathway）に変化させる。本来の細胞に代えて、遺伝子工学的に処理されたケラチン生成細胞を植付け、治癒過程において傷に対し新しい蛋白質を分泌できる。同様の様式で、ケラチン生成細胞を遺伝子工学的に処理し、エピダーモリシスブロサ（epidermolysis bullosa）のような固有の遺伝的欠損を直すことができる。次いで、これらの細胞を表面的な切除の傷に植付け、所望の特性を有する新しい表皮を発生させることができる。問題のある傷は、欠損を覆うこと及び速い治癒を必要とする。次のプロトコールは、移転した遺伝子の系統的な表現を達成するため、直接的なインビボ遺伝子移動を利用する。表皮接合部深くの毛包にある幹細胞を、組織弁の深部が表皮の基本層を含むような表皮の組織弁を形成することにより暴露することができる。この暴露された傷の表面は幹細胞ケラチン生成細胞を伴う毛包部分を含んでいる。次いでこの遺伝子物質を遺伝子銃を用いて導入し（ACCELL登録商標、Dr．Dennis McCabe 1986 ）、次いで傷チャンバー内で覆う。それに代わり、この組織弁の暴露された表面下の傷（図１参照）を、傷チャンバー内に暴露し、ウイルストランスファー又はプラスミドトランスファーに用いる適当なベクターに入れた遺伝子を該チャンバー内に導入する。該遺伝子の早期の表現は、24時間及び48時間後に、このチャンバー液の試料をアッセイする。この後、表皮組織弁を適切に縫合し、その傷を包帯で覆う。チャンバー好ましい実施態様においては、細胞を、チャンバー、処理液（栄養液、生理食塩、又は他のこれに相当する溶液でよい。）、処理添加剤（例えば、抗生物質及び緩衝剤）、処理変化を制御する手段及び細胞の成長をモニターする手段などを含むシステムで培養する。ビニル、又はポリウレタンのような他の可撓性で透明な材料で作られている傷チャンバーは、ベローズ型で、慢性の傷、又は遺伝子移動の目的で特に形成された表面的な傷、その傷のサイズに対応する開口部を有する。このチャンバーは、抗生微生物剤を含む通常の食塩水を少量含んでいる。プラスミド又はレトロウイルスのベクターを使用する場合、このチャンバーを単に傷を覆うように付ければよく、該ベクターをチャンバーに注入し、次いで該チャンバーで再度密閉する。遺伝子銃を使用する場合、該ＤＮＡを細胞内に届け、次いで通常の食塩水と抗生物質を入れたチャンバーを傷の周辺に付着させる。24時間及び48時間後に、分泌性遺伝子産物の発現を分析するために、傷からの液体を採取する。この傷を、治癒するまでチャンバー内で治療する。該チャンバーで培養部位当たりの前もって定めた表面領域を覆う。該チャンバーにより、傷は周辺の殺菌されていない環境から保護され、処置の変化が抑えられ、継続的な液体処理が含まれ、添加剤の有効な配送システムを与え、かつ細胞成長の直接的な監視ができるようになる。該チャンバーが透明な材料で形成されていれば、又はチャンバーから液体を抽出し分析すれば、監視が可能である。このシステムから抽出された液体から、治癒の状況を示すファクター、並びに微生物、低酸素、高二酸化炭素のような望ましくない成分の存在及び不都合なpHをアッセイすることができる。この液体で、細菌及び他の微生物の数及びタイプ、細胞の数及びタイプ、患者から分泌されるタンパク質の量及びタイプ、及びチャンバー内の細胞、及び薬剤の水準、酸素、二酸化炭素及びpHなどその他の成分について試験することができる。この処理システムは、温度、特定のイオン濃度、コロイド浸透圧、グルコース濃度、アミノ酸内容、脂質濃度、酸素濃度、及び二酸化炭素濃度、並びにpHを含む変化の制御ができるようにする。入口手段は処理液及び処理添加剤の導入、ならびにチャンバーからの液体の抽出にアクセスを与える。図２に示すような幾つかの実施態様では、好ましくは、可撓性で自己修理性のプラスチックから出来ているチャンバーの壁を介して、通常の皮下注射器を用いて注入することにより、処理液を該チャンバーに導入する。図３に示すような幾つかの他の実施態様では、該チャンバーは入口及び出口部分、又は別れた入口及び出口部分を有する。該装置が処理液貯蔵器及び排出口と連結されていない、又は連続還流系と連結されていない場合は、バルブ機構が必要である。該部分の密封は、例えば、病院において、例えば還流装置のような他の装置との連結のために、適当な時間、失われることになる。該処理システムの実施態様では、入口及び出口部分を介して処理液の連続的な還流を組み合わせるのが好ましい。ポンプ又は重力を用いて、処理液を移動させることができる。該処理液は、濾過及び他の適当な処置（例えば、加熱又は冷却）した後、再循環させることができる。その代わりに、新鮮な処理液を導入し、汚染された液体を廃棄してもよい。U.S.S.N.07/707248に記載されている実施態様においては、該チャンバーが、貯蔵器又は１以上のチャンバーとともに、新鮮な培養培地、酸素及び処理添加物の供給源として役立つ追加のチャンバーを含む。図２ａ及びｂは、チャンバー１０の好ましい実施態様を示し、図２ａは上面図であり、図２ｂは側面図である。該チャンバー１０は、チャンバーの多くの部分が傷に接触するのを妨げるベロースタイプ構造を有し、事実、傷からチャンバーを押し離すのに役立つ作用をしている。該チャンバー１０は、透明なビニル又は他の滅菌可能で、可撓性、熱密閉が可能で、気体及び水分非透過性材料で構成されているのが好ましい。ベロース折り畳み１２は、処理溶液の容量を大きくすること、並びに収縮を容易にする。収縮を行うために、環状ベース１４を、環状ベロース折り畳み１２片と溶接し、かつ円形頂点１６を環状ベロース折り畳み１２片と溶接する。円形頂点１６は、実質的に透明な材料である。残りの部分は透明にする必要はないが、透明にしてもよい。透明な環状ベースにより、漏出が容易に目視点検できるようになる。環状ベース１４の開口部１８は傷のサイズ又は移植部位のサイズに対応するようにする。環状ベース１４の底部サイズ１５は、チャンバーを皮膚にしっかり固定するのに適した粘着テープ又は被覆とする。当業者は、粘着性でチャンバー内部を滅菌状態に保つ保護用の除去可能なシートが望ましいことを容易に認識するであろう。該チャンバーは滅菌パックで数年に渡り保存することができるであろう。このチャンバーは、１cm²のサイズから非常に広範囲に渡るサイズまでの傷に適合するよう、多くの形にすることができる。この粘着表面は、皮膚表面に包帯をし、漏れのないシールを確実にするため十分なものにすることが重要である。先に述べたように、処理液及び処理添加剤の導入及びそれに続く抽出を、針と注射器によりチャンバーの壁を通して直接行ってもよい。チャンバー１０を構成するのに自己修理性材料を意図している。他の方法として、チャンバー内に様々な物質を導入し、抽出するのに、入口及び出口部分を使用することもできる。図３は、細胞が培養されるべき患者の部位の予め定めた表面領域を覆うチャンバー２０の図であり、該チャンバーは皮膚２４に開かれており、粘着部により、傷周辺の末端部２６を密封している。該チャンバー２０は目視で傷を監視できる透明部２２と、処理液と処理添加剤をチャンバー内に導入し、保護チャンバーから液体を抽出する入口手段２８及び２９、及び予め定めた変化及び傷の状態をアッセイするための監視手段（図示せず。）を有する。遺伝子物質のケラチン細胞への直接導入タトー及びマイクロインジェクションの異種交配はＤＮA物質の細胞への直接の挿入にも使用し得る。図４に示したように、複数のマイクロニードル10をハンドル上に１列に装着する。マイクロニードル10は図５に示したように尖っており中空である。遺伝子材料、好ましくはＤＮＡを含む溶液が上皮の上に置かれる。ニードル10を次に皮膚を横切るグループとして動かして「注射」し、いくつかの平行な線にそって、皮膚の表面中からその下の上皮中に遺伝子物質を分配する。タトーのようなマイクロニードルはこの目的に理想的である。好ましくは、図６〜10に示したように、例えばそれに付着したＤＮＡを有する酸化鉄微粒子のような微粒子を分配するのに使用される。あるいは、マイクロニードルの列を、ＤＮＡ物質が付着した微粒子の溶液を含む中央ディスペンサーに付け、溶液を皮膚細胞、例えばケラチン細胞に注射する。更に、この技術は、微粒子に付着していない、ＤＮＡ物質単独の懸濁物の分配にも有用である。スキャナに装着したこのシステムは、皮膚又はその他の組織の特定の領域をシステマティックにカバーし、所定の領域の多数の細胞中に非常に均一にＤＮＡ物質を付着することができる。遺伝子材料をケラチン細胞に導入するこの方法は、プラスミドあるいはレトロウィルスベクターを使用する遺伝子形質導入よりも優れている。というのも、後者は収率が許容できないほど低いからである。「遺伝子ガン」を使用した、促進粒子による遺伝子材料の移送はプラスミドあるいはレトロウィルス形質導入よりも高い収率を有するが、その他の不利な点、例えば大きな騒音、予期しない排出等を有する。振動するマイクロニードルによる遺伝子材料を細胞に入れるタトーとマイクロインジェクションを組み合わせたこの方法は実用的であり、廉価であり、全身発現のためのＤＮＡの細胞挿入の可能性のある方法を提供する。細胞を培養するための部位の調製細胞を培養するための部位は、必要により、感染した、あるいは火傷した皮膚を除去することにより、あるいは加工した細胞を移植するための適当な傷を形成することにより調製される。傷に隣接した皮膚を次に清浄にし、チャンバーと皮膚の良好な接着が得られるようにする。次にチャンバーの開口部を、前記部位の上に位置させ、接着端部によりチャンバーを皮膚に固定し、そして適当な培養培地及び細胞を密閉チャンバーに導入する。連続的又はバッチプロセスにより処理液を導入し、新鮮な培養培地のためにそれを取り出すことができる。選択された処置添加物をチャンバーに連続的に、あるいは所定の時間に、あるいは定期的な間隔をおいて導入することができる。治療変動の適当な制御を行うことができる。監視は、患者の診察、及びチャンバー内の液体及び傷そのものの視覚による観察により行うことができる。さらに、液体の試料を分析及び診断のためにチャンバーから抜き取ることができる。傷の充分な回復が一旦得られたら、チャンバーを除去する。例えば、傷が回復したかどうかを判断するために、抜き取った液体の蛋白質含量を分析する。抜き取った液体の蛋白質含量が正常な皮膚の上に置かれた液体を含むチャンバーに存在するレベルに減少したとき、傷は回復したものである。蛋白質含量を測定する方法は当業界でよく知られており、安価で迅速である。蛋白質の種類及びその蛋白質の種類の相対的な量も測定することができ、更に回復や外来遺伝物質の発現を評価することができる。治療又は培養変数の制御各患者の治療はチャンバー内の条件に特異的である。治療変数の制御としては最初の24時間、34℃に連続的に冷却することを含み得る。監視は、24時間毎に抜き取った試料により、抜き取った液体を蛋白質及び微生物について分析することを含み得る。例えば、微生物の数がmlあるいはccあたり10〜４分の１以下であるとき、感染は解消されたものである。毎日チェックされる蛋白質レベルは、24mg /dl/cm²未満でなければならない。上記したように、システムにより制御できるいくつかの治療変動がある。制御できるそのような治療変動の１つは温度である。約27℃の温度（下半身末端部の傷の通常の温度）から37℃に傷を加熱することは、傷の回復を促進することが見出された。実験データによれば、約37℃の温度においては、傷の回復速度は、27 ℃の温度よりも２倍速かった。傷領域の温度は治療液体を加熱することによって達成される。冷却も、急性火傷及びその他の外傷的傷の場合は有効であることが判明した。冷却は痛み、はれ、組織の破壊を減じる。一般的には、急性の傷については傷が発生した最初の１時間は冷却が有効であり、その後は約37℃の温度が有効である。冷却は、同様に治療液体を冷却することにより行うことができる。他の治療変動も最適化することができる。例えば、イオン濃度は細胞外イオンレベルに近く維持されるべきである。グルコース、アミノ酸及び脂肪濃度は、血漿に存在する濃度又は皮膚組織培養培地に対応するものに近く維持されるべきである。酸素及び二酸化炭素濃度も正常な組織のレベルに維持されるべきである。酸素は重要な治療添加物であり、細胞増殖に必須である。治療添加物及び培養培地通常のあるいは生理的緩衝食塩水が基本的な培養培地である。緩衝剤、リドカインのような麻酔剤、ペニシリンあるいはストレプトマイシンのような抗生物質、化学治療剤、上皮成長因子（ＥＦＧ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＦＧ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含むを含む成長因子、及びコレラ毒素（ＣＴ）を培養／治療培地に添加することができる。組織培養培地及び浸透圧を増加させる液体及び酸素利用可能性も治療添加物としてチャンバーに導入することができる。治療添加物の選択は傷特異的である。例えば、感染が診断された場合、液体の 1000ccあたり１単一非経口投与量の抗生物質が添加される。更に、シュードモナスによる傷感染には、ゲンタマイシン、トブラマイシンあるいはカルベニシリンの治療添加物が適当である。低酸素症が診断された場合には、液体をチャンバーに入れる前に酸素化チャンバーに通す。癌が診断された場合は、液体の1000ccあたり１単一非経口投与量の化学治療剤が与えられる。傷が壊死組織及び破片を含む場合は、液体にタンパク質分解酵素が添加される。炎症反応が示されたときには治療液体に免疫調製剤が添加される。必要な場合には、１ccあたり10ngの濃度の上皮成長因子が添加される。以下の非制限的実施例を参照することにより、本発明は更に理解されるであろう。実施例１：ケラチノサイトの形質変換及び培養液中でのヒト成長ホルモンの発現及びそれに続く部分的厚さの傷への移植第１の一連の実験において、ケラチノサイトを収穫し、培養液フラスコ中で培養し、ウィルソン（Wilson，J.M.）、ビリウイ（Biriuyi，L.U．）、サロモン（ Salomon，R.U．）らのTransplantation of Vascular Grafts Lined With Geneti cally Modified Endothelial Cells（Science，244:1344-1346（1980））の方法を用いたウィルスベクター法、又は、フェルナー（Felgner，P.L．）、ガリク（ Galik，T.R．）、ホルマー（Holmer）らのLipofection：An Efficient，Lipid M ediated DNA-Transfection Procedures（Proc．Natl．Acad．Sci.，84:7413-741 7（1987））に記載のプラスミド転移法により、移植した。これらの手法はここに含まれるものとする。ブタの皮膚は回転時間を含む多くの面においてヒトの皮膚と類似するため、ブタはヒトの皮膚に対する外挿用の標準動物モデルとされる。具体的には、部分的厚さの皮膚を切除し、表皮のディスパーゼ分離を行い（0. 25％ディスパーゼ、２〜３時間、37℃）、トリプシン化し（0.1％トリプシン、0 .02％EDTA、30分、37℃）、ひとつの細胞懸濁液に細分化することにより２頭のメスのヨークシャー種のブタからケラチノサイトを収穫した。それらを準全面生長させ（60〜70％）、複製欠損ネズミモロニー白血病レトロウィルスベクターとともに温置した。hGHについてのDNA連鎖をウィルスゲノムに挿入し、ウィルス長末端反復（LTR）のプロモーター制御下に置いた。感染ケラチノサイトをトリプシン化し、ペニシリン（100 U/ml）及びストレプトマイシン（100 μg/ml）を含む塩化ナトリウム水溶液中に再懸濁した。オートロガス法により、背部に設けた完全厚さの傷（n=10）にそれらを移植した。コントロールとして、未修飾のケラチノサイト（n=10）及び塩化ナトリウム水溶液（n=10）を蒔いた完全厚さの傷を作製した。実験の間液体傷環境を維持するための殺菌ビニルチャンバーで、全ての傷を覆った。培養液又は傷液体中のhGHの存在は、放射線免疫検定法により決定した。 lacZ遺伝子、即ち細胞間マーカー遺伝子についても、同様の方法論を用いた。図11及び12a及びbに示したように、このシステムの何れの遺伝子についても著しい発現が得られた。皮膚の組織断面から、lacZマーカー遺伝子を有するケラチノサイトは基底層に安定に浸透しないが、表面に浸透して層状のコルネウム（co rneum）へ消失することが示された。この背景にある理由を分析して、表皮からの皮膚のディスパーゼ分離は、十分な量の幹細胞の収穫を見越していないとの結論に達した。他の理由は、細胞収穫の繰返しトラウマ（trauma）、比較的高カルシウムの細胞培養液への露出、及びウィルス又はプラスミド培地による細胞傷害による、ケラチノサイトの末端付近での分化であった。従って、毛包から得た表皮幹細胞を用い、カルシウム及びウィルス又はプラスミド培地への露出を減少させることにより、結果は非常に改善された。インビトロ（培養液）hGHは、レトロウィルス形質変換の４日後に、日平均産生量2.0ng/mlで検出された。インビボ（傷液体）hGHは、形質変換の24時間後に最初に検出され（0.1ng/ml）、132時間後にピークとなり（0.42ng/ml）、10日後までにベースラインに戻った。hGH-ケラチノサイトを受けた傷の傷液体中のタンパク質流出検定により評価した治癒時間（12.1±1.0日）は、非感染ケラチノサイトを受けた傷の場合と相違しなかったが、移植をしなかったコントロールの傷の場合（14.7±0.6日）よりも著しく短かった。組織学的に移植したケラチノサイトは、６日以内に多層上皮を形成した（塩化ナトリウム水溶液処理したコントロールでは11日であった）。結果から、hGH遺伝子を有するオートロガス法によるケラチノサイトは、完全厚さの傷に移植した場合にhGH遺伝子を発現し続けると考えられることが示された。産生したhGHは、治癒時間に影響を及ぼさない。インビトロケラチノサイト培養と比較して、インビボhGH産生は時間依存性の様式をもって調節されている。これは、セルデン（Selden）らの“Human Growth Hormone as a Reporter Gen e in Regulation Studies Employing Transient Gene Expression”（Mol．Cell Biol．6（9）:3173-3179（1986））に記載のように、上皮化の過程でのケラチノサイトによるhGH遺伝子発現の調節、末端分化によるhGH産生ケラチノサイトの損失、又は外来タンパク質に対する抗体反応のいずれかによると考えられる。遺伝子的に処理したケラチノサイトは完全厚さの傷の再表皮化を改善するのみでなく、治癒の間組換えDNA産生物を放出するので、傷の治癒の間成長因子のように治療ペプチドを誘導し発現するよう用いることが可能である。局所チャンバーシステムを使用することにより、遺伝子的に処理した細胞の直接適用及び遺伝子産生物の観察が容易に可能となる。実施例２遺伝子的に変性させたケラチン細胞のin vivo培養未変性、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子及びヒト成長ホルモン遺伝子（hGH ）を発現するレトロウイルス−形質導入ケラチン細胞をヨークシアピッグ（York shire pig）の囲った皮膚の傷内へ移植した。移植後４週間にわたるバイオプシーにより得られた一連の皮膚試料の分析は、移植された細胞の生存及びβ−ガラクトシダーゼの発現を示した。トランスフェクトされたケラチン細胞をまず傷の深い部分に、その後、再生した表皮の基底層へ提供した。これらの細胞は通常の皮膚構造及び障壁機能を付与し、その新しい遺伝子産物を有棘層の最終分化細胞に変形させた。hGH遺伝子で形質導入したケラチン細胞を傷内へ移植した時、hGHは傷の分泌液中に10日間まで検出された。対照的に、in vitroのhGH生産は連続的に4 7日間検出された。その発現パターンは、形質導入されたケラチン細胞が新しい表皮を再構成し、最終分化を受け、皮膚病における治療用タンパク質の導入及び発現のために利用されて皮膚置換及び治癒を促進することができることを表す。豚の傷（部分的及び完全な厚さの火傷、切開及び切除）及びヒトの傷（慢性的に完全な厚さ）を個々に、添加物とともにプラセボ液を含むビニルチャンバーで囲った。特に記載しない限り、該プラセボ液はペニシリン100 IU/ml及びストレプトマイシン100 μg/mlを含む未緩衝の0.9% NaClであった。ケラチン細胞の培養のために多様な培地もまた使用した。チャンバーシステムの維持管理は１日２回、毎日、１日おき、または連続的に行った。傷は治癒するまでチャンバーの中で処置した。傷は肉眼的に、また、生化学的に（チャンバー内の液体を分析することにより）、又は顕微鏡的で評価した。傷の液及びヒト成長ホルモン遺伝子（ hGH）のin vitro培養液の両方をアレグロ（商品名）ラジオイムノアッセイ（ニコールスインスティテュートディアグノスティックス、サンジュアンカピストラノ、CA）で評価した。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（la cZ）を、ネズミ科のマロニー白血病ベクターでの形質導入により豚ケラチン細胞へ挿入し、該ベクターにおいてはDanosら、Proc．Natl．Acad．Sci．85:6560-64 64（1988）に記載されるように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子はレトロウイスルの長い末端繰り返しのコントロール下にある。天然の、あるいはレトロウイルスで形質導入されたケラチン細胞の懸濁液は、13匹の雌のヨークシアピッグにおける外科的に作られた皮膚の完全な厚みの傷に、一時的なin vivoインキュベーターとしてのビニルチャンバーを用いて移植した。豚の皮膚はヒトの皮膚と幾つかの点で（例えば、再編成時間）似ていて、それゆえこの研究に最も適したモデルである。飼育された雌のヨークシアピッグ（３〜４週齢；40〜45kg）を使用した。初期ケラチン細胞の培養は、全身吸入麻酔下のピッグの背頚部から取り出した部分的厚さの皮膚片（厚さ0.012”）から確立された。切片を0.25%のディスパーゼ（Dispase 商品名）を含む無血清培地で37℃で２〜３時間インキュベートして真皮から表皮を分離した。ケラチン細胞の単一細胞懸濁液を、0.1%のトリプシン及び0.02%のEDTAにおけるインキュベーション（37℃、30分間）及び注意深い機械的破壊により得た。その溶液を100 μmメッシュで濾過して培地で再懸濁した。細胞をその後、0.12×10⁶細胞/cm²の密度で培養フラスコ中に蒔き、20% の胎児牛血清（fetal bovine serum）を含むWeymouth培地で生育させた。 60〜80％のコンフルエンスで、遺伝子転換に割当られたケラチン細胞の培養物を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）を含む無-両性ヘルパー（amphotropic helper）ネズミ科白血病ウイルス（ψ−ＣＲＩＰ）でトランスフェトした。サブコンフルエントになった細胞培養物を３日間連続でレトロウイルス含有培地でインキュベートした。未変性ケラチン細胞を操作なしでコンフルエントになるまで成長させた。全体で170の完全な厚みの傷を、組織層カルノサス筋（panniculus carnosus m uscle）を完全に残して、13匹のピッグの背に作った。注意深い止血の後、液体の漏れないビニルチャンバーをin vivo細胞培養装置として各傷に適用した。そのチャンバー（P.A．Medical Corp.，Columbia，TN）は、粘着性ベースに結合した柔軟な透明ビニルのトップからなる。そのベースは作られた傷の縁に和合する中央の開口を持つ。チャンバーは、100 μgのストレプロマイシン及び100IUのペニシリン/ml（n-67）、形質導入された皮膚ケラチン細胞（lacZ、n=22 hGW、n=1 0）または未形質導入のケラチン細胞（コントロール、n=71）を含む1.2mLの通常の生理食塩水で満たした。開始２日で（細胞に、表面に接着する時間を与えるように）、生理食塩水チャンバーを交換し毎日補充した。再上皮化へのケラチン細胞の移植の効果は、肉眼的に、組織学的に、及びチャンバー液の内因性タンパク質の測定（上皮の障壁機能の非侵襲的に評価可能なパラメーターとして）により、調査した。各傷から収集した液体を2,000×gで10分間遠心して、その後フィルター（孔サイズ0.45mm、Millipore，Corp.，Bedford ，MA）を通過させた。上皮障壁機能の再生の非侵襲的マーカーとして内因性タンパク質を、先にBreuingらのJ．Srug．Res．52:50-58（1992）に記載されるように、濁度測定による分析（STANBIO CSF，Stanbio Laboratory Inc.，San Antoni o， TX）で測定した。チャンバーで処理した傷は組織的壊死を発達しなかったが、通常の包帯で覆われた傷は、極めて壊死的であった。この相違は、肉眼でも見えるものであった。４日後、フィブリル性の凝血は、室内で処理した傷の全てのグループで発達した。６日目から、未変性の又はレトロウイルスで形質導入したケラチノサイトを移植した傷は、薄い上皮で覆われた。この発達は、図13で示される様に、12日までは食塩調節ではみられなかった。傷の収縮は３つのグループで異ならなかった。傷をつけた後の、３、６及び９日での豚の全層性の傷についての肉眼観察を試験した。コンフルエントにおいて、ケラチノサイトが、0.01％のトリプシンでフラスコから取り出され、１００Ｕのペニシルン及び１００μｇストレプトマイシン／ｍｌを含む通常の非緩衝食塩水（０．９％）に、３×１０⁶ｃells/mlの濃度で再懸濁した。この懸濁液の1.2mlを豚に背中に設けた全層性の傷（15x15mm、深さ9mm）に注射した。食塩水中に懸濁されたケラチノサイトは、90%より多くが生存可能であることが分かった。これは、トリパンブルーの吸収により、及び個々の注射器の内容物を培養フラスコ中で再培養する事によって確認された。平均及び標準エラーをグループ毎に計算した。グループ間の統計的有意差は、Mann-Whi tney U-testで分析した。新しい表皮の再形成の対数回帰分析は、組織学的に評価される様に行なった。移植したケラチノサイトを移植した傷は、６日で早くも上皮を発達させたが、食塩水処理した比較例は、再上皮化凝血ではない凝血を含んでいた。傷の収縮の速度は影響を受けなかった。それ故、上皮的障害は、食塩水だけの処理後よりも、自己ケラチノサイトの懸濁液の移植後の早い時期に顕著に確立された（平均±SD 12.66±16日対14.7±.7日、ｐ<0.05）。この相違は、移植後12日で、食塩水での処理後16日で完全な上皮形成の証拠書類によって組織学的に確認された。ケラチノサイトを移植した傷では、次の特性パターンが観察された。レトロウイルスを導入した、lacZ-発現のケラチノサイトは、４日目に傷の底のクラスター中に最初に現れ、次いで６日目に見られる様に、新たに発達した母体と共に上方に移動した。８日で、それらは上皮の全ての層に存在した。それ故、これらの細胞のクラスターは、深部の傷の表面上で４日目に最初に見られ、その後は発達し母体中で見られた。これらのクラスターは、新たな上皮が発達しするまでははっきりとみえたが、その後消滅した。試験管での、移植lacZ-陽性ケラチノサイトを持つ傷の染色は、４日目で、皮下組織に近い傷の底部コロニーのクラスター内でβ−ガラクトシダーゼポジティブ細胞を示した。６日目で、細胞が新たに発達した連続組織の中心に現れた。ヘマトキシリン及びエオシンで、及びMasson'sトリクロムで染色した連続部分は、それらの巣が濃いコラーゲンバンドルで囲まれていた事を示した。８日で、lacZ−発現ケラチノサイトは、胚芽層を含む新たな再生上皮の全ての細胞層中に分散した。27日で生体組織検査した傷は、顆粒層の上部でのみlacZ− 発現を示し、基底層或いは有輔層では示さなかった。傷をつけていない皮膚の縁を含む断面生体組織検査サンプルを、４日から27日で傷から採取した。半分を10 ％ホルマリンに漬け、パラフィンに封入し、ヘマトキシリン／エオシン、又はトリクロムで染色した。残り半分を液体窒素で瞬間冷凍し、分割し、その中でβ− ガラクトシダーゼ活性を検出する為に、導入細胞中で青い沈殿物を形成する、５ −ブロモ−４−クロロ−３−イノリβ−Ｄ−ガラクトサイド（Ｘ−Gal chromoge n）で染色した。27日まで、ケラチノサイトの追加の巣は表皮下組織では検出されなかった。形質導入したか又は未変性の何れかのケラチノサイトの移植後の上皮の組織学的観察は、類似しており、角質化多層上皮の特徴であった。上皮の水平部分は、導入した細胞（280/mm²）の均等な分布を示した。LacZ及びhGH（n=34の傷）の両方を移入したケラチノサイトを、図14bで示す様に、６日で頂点に達し、１０日迄に０に減衰する濃度で、一時的方法でhGHを発生させた傷の中に移植した。この実験は、ケラチノサイトの懸濁液は、遺伝子を安定的に導入でき、これらの細胞は、豚の全層性の傷に移植後に遺伝子を発現し続ける事を証明する。皮膚チャンバー系では、細胞は旨く移植され、生存し、クラスター形成から新たな上皮の再構成へと進む。表皮は層を成し、機能的に無傷の上皮バリヤーを形成する。この閉鎖チャンバー系の湿潤環境は、細胞の移植には好ましい環境をつくる。それは、生理的浸透性及びpHでの血清電解質の様な全ての必須成分及びケラチノサイトに対してミトゲン活性を示す様々な成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子、表皮成長因子）を含む。 LacZの減衰発現は、導入したケラチノサイトの初期のそして急速な末端分別で説明可能であり、これはlacZ発現の特殊パターンが考慮される時と同様である。液中の高カルシウム濃度は、他の媒介物の存在及び傷中でのその媒介物と細胞との相互反応物の存在と同様に、末端ケラチノサイト分別を示唆する。lacZ−発現ケラチノサイトの上皮バリヤーの生体内での形態的且つ機能的形成は、細胞が層を成し、最終的に分別された事を示す。この結論は、27日後の表皮の最上層に形成された層中においてのみlaxZ−発現ケラチノサイトを見出す事によって支持されるそれ故、この実験は、レトロウイルス形質導入ケラチノサイトの懸濁液は、全層性の傷に自己移植後、生体内で多層表皮を形成すると言うことを示す。更に、これらの細胞は、未変性のケラチノサイトに類似の方法で機能を提供す。細胞は層を成し、水及び蛋白質損失に対し上皮バリヤーを形成する。この様に、遺伝子的に操作されたケラチノサイトを使用して生理的性質を持った新たな表皮を再生する事が可能である。実施例３タトー（tatooing）による、ケラチノサイト及び繊維芽細胞中へのDNAの導入直径0.05〜１ミクロンの大きさの酸化鉄粒子をトリス−EDTAバッファー中でDN Aプラスミドと混合した。この材料の滴を無傷のヒト皮膚上に置いた。マイクロニードルを含有するタトー装置を皮膚上の上記材料の上に置き、図６に示されるように表面のケラチノサイトに、また図７に示されるように深部表皮の幹細胞ケラチノサイト、又は図８に示されるように皮膚繊維芽細胞中に、DNAを挿入又は注入した。

Claims

【特許請求の範囲】１．患者上又は内部において、細胞を培養する方法であって、細胞を成長させようとする患者上の部位に、可撓性でかつ湿気及び気体に対して非透過性の材料から形成したチャンバーを接着させ、前記チャンバーが、細胞の培養に適し、かつ患者に接触するように該患者に対して開口している液体培地を含有することを特徴とする方法。２．培養すべき細胞を前記チャンバーに添加することを更に含有する請求項１に記載の方法。３．前記細胞が、ケラチノサイト又は表皮幹細胞である請求項２に記載の方法。４．前記細胞が、外来遺伝子材料を発現するように加工されている請求項２に記載の方法。５．前記細胞が、該細胞に対する免疫反応を誘導する蛋白質を発現しないように加工されている請求項２に記載の方法。６．部分厚の皮膚フラップの下側における毛包から前記細胞を除去することによって、前記表皮皮膚細胞を単離する請求項３に記載の方法。７．前記細胞が、ホルモン、イムノモデュレーター、凝血因子、抗原及び抗体からなる群から選択される蛋白質を発現するように加工されている請求項４に記載の方法。８．前記細胞が、ＨＬＡ抗原を発現しない請求項５に記載の方法。９．前記チャンバーにおける培養変数を調整する工程を更に含有する請求項１に記載の方法。１０．前記変数が、pH、気体濃度、イオン濃度及び温度からなる群から選択される請求項９に記載の方法。１１．抗生物質、麻酔薬、化学療法剤、イムノモデュレーター及び成長因子からなる群から選択される化合物を前記チャンバーに添加する工程を更に含有する請求項１に記載の方法。１２．前記チャンバーにおいて、外来遺伝子材料を前記細胞に導入する工程を更に含有する請求項２に記載の方法。１３．患者上の部位において細胞を培養するためのチャンバーであって、可撓性でかつ湿気及び気体に対する非透過性の物質から形成され、前記患者の皮膚の近接部分に確保できる開口部を含有し、しかも液体培地において培養すべき細胞を含有することを特徴とするチャンバー。１４．前記細胞が、ケラチノサイト又は表皮幹細胞である請求項１３に記載のチャンバー。１５．前記細胞が、外来遺伝子材料を発現するように加工されている請求項１３に記載のチャンバー。１６．前記細胞が、該細胞に対する免疫反応を誘導する蛋白質を発現しないように加工されている請求項１３に記載のチャンバー。１７．前記細胞が、ホルモン、イムノモデュレーター、凝血因子及び成長因子からなる群から選択される蛋白質を発現するように加工されている請求項１３に記載のチャンバー。１８．前記細胞が、ＨＬＡ抗原を発現しない請求項１６に記載のチャンバー。１９．抗生物質、麻酔薬、化学療法剤、イムノモデュレーター及び成長因子からなる群から選択される化合物を更に含有する請求項１３に記載のチャンバー。２０．患者に移植された遺伝子的に加工された細胞の収量を増加させる方法であって、加工及び移植すべき細胞として、表皮幹細胞を選択することを特徴とする方法。２１．前記細胞を、前記患者と同一種から選択する工程を更に含有する請求項２０に記載の方法。２２．遺伝子的に加工した表皮幹細胞。２３．患者において遺伝子的に加工した細胞の生存力を増強する方法であって、細胞を加工しようとする患者上の部位に、可撓性でかつ湿気及び気体に対して非透過性の材料から形成したチャンバーを接着させ、前記チャンバーが、細胞の培養に適し、かつ加工しようとする細胞に対して開口している液体培地を含有し、かつ前記チャンバーによってカバーされている前記細胞に、遺伝子材料を導入することを特徴とする方法。２４．前記細胞が、ケラチノサイトである請求項２３に記載の方法。２５．前記遺伝子材料を、ウィルスベクター又はプラスミドを使用して前記細胞に導入する請求項２３に記載の方法。２６．遺伝子材料を前記細胞に導入し、更に、該細胞がコンフルエンスとして治癒するまで、温度、pH、微生物の成長、並びに気体及びイオン濃度を調整する工程を更に含有する請求項２３に記載の方法。２７．前記チャンバーに、抗生物質、麻酔薬、化学療法剤、イムノモデュレーター及び成長因子からなる群から選択される化合物を提供する工程を更に含有する請求項２３に記載の方法。２８．細胞に遺伝子材料を導入する方法であって、前記遺伝子材料を含有する液体をマイクロニードルによって皮膚細胞中に注入することを特徴とする方法。２９．前記皮膚細胞が、表面ケラチノサイト、幹細胞ケラチノサイト及び皮膚繊維芽細胞からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。３０．前記遺伝子材料が、微粒子に接着したDNAである請求項２８に記載の方法。３１．前記微粒子が、直径0.5〜１ミクロンの酸化鉄である請求項３０に記載の方法。