JPH08509215A

JPH08509215A - 移植治療のための神経由来胎児セルラインの使用

Info

Publication number: JPH08509215A
Application number: JP6523361A
Authority: JP
Inventors: オー．メージャー，ユージーン; エス．トーナトア，カルロ; バンキーウィッツ，クリス
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-04-13
Filing date: 1994-04-11
Publication date: 1996-10-01
Also published as: PT696205E; US5690927A; EP0696205A1; DK0696205T3; DE69429721D1; AU6531294A; ES2170096T3; WO1994023754A1; AU690548B2; CA2159738A1; EP0696205B1; ATE212237T1; US5869463A; DE69429721T2; US20020110546A1

Abstract

(57)【要約】ヒト胎児神経由来セルラインを宿主組織内に移植する。本法は、さまざまな神経学的失調及び他の疾患の治療を可能にする。好ましいセルラインはSVGである。

Description

【発明の詳細な説明】移植治療のための神経由来胎児セルラインの使用発明の背景本発明は、一般的に、宿主内に遺伝的に無関係な細胞を移植することにより宿主を治療するための方法に関する。より特に、本発明は、不死化ヒト胎児神経由来細胞の移植により宿主を治療する方法を提供する。臓器移植は、さまざまな疾患の治療の首尾よく、かつ、広く行われた手段になってきた。心臓、腎臓、そしてさらに肝臓移植は、多くの医療センターにおいてほとんど日常化している。不幸なことに、多くの臓器の失調は、全臓器移植による治療に従わない。例えば、中枢神経系の病変は、損傷組織を置換するための全臓器移植により治療されることができない。全臓器移植治療による損傷組織の置換は、多くの疾患について、又はさらに、適当な疾患をもつ患者の全てについて不可能であるため、細胞移植の方法を開発するための試みがなされてきた。Sun et al.，Biomat.，Art.Cells，Art.Org.， 15：483-496（1987）。生物学的に活性な化合物の欠陥をもたらす柔組織（paren chymal）病変は、その生物学的に活性な化合物を分泌する単離細胞又は細胞クラスターを移植することにより治療されることができる。例えば、糖尿病の動物は、ドナーの膵臓から分離されたランゲルハンス島の移植により首尾よく治療されてきた。Noel et al.，Metabolism，31：184（1982）。細胞移植治療は、特に、神経学的疾患の治療を哀願している。固形組織移植は、いくつかの理由のために神経学的疾患のために特に不適切である。固形組織移植のために必要とされるような、脳の開外科手術露出は、臨床的な神経学的欠陥をもたらす神経系経路に対する取返しのつかない損傷を引き起こすことができる。また、神経学的機能は、しばしば、外科学的に確立されることができない複雑な細胞間結合に依存する。さらに、中枢神経系の細胞は、無酸素症（anoxia）及び栄養欠乏（nutrient deprivation）に鋭く感受性である。固形組織移植の速い血管新生（vascularization）が不可欠である。なぜなら、固形移植の内部の細胞が生存力を維持するための十分な灌流をしばしば欠くからである。１つの一般的な神経学的症候群、パーキンソニズム（Parkinsoni l.，Brain Res.，177：555-560（1979）；Lindvall et al.，Sciece，247：574- 577（1990）；Freed，Restor.Neurol.Neurosci．，3：109-134（1991）。パーキンソニズムは、脳幹神経節（basal ganglia）の黒質（substantia nigra）におけるドーパミン生産ニューロンの損失によって引き起こされる。Burns et al.，N.Engl.J.Med．，312：1418-1421（1985）；Wolff et al.，Neurobiology，86： 9011-9014（1989）。パーキンソン病、パーキンソニズムの臨床的顕出を特徴とする未知の病因の疾患は、これらのドーパミン生産ニューロンの特発性の破壊を引き起こされる。パーキンソニズムは、さまざまな薬物、例えば、抗精神病薬、又は化学剤、例えば、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピロリジンにより引き起こされることができる。Burns et al.，Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA ，80：4546-4550（1983）及びBankiewicz et al.，Life Sci．，39： 7-16（1986）。罹患した動物の線状体内にドーパミン作動性細胞を移植することにより実験的に誘発されたパーキンソニズムの臨床的顕出を反転させる試みが行われている。（チロシン水酸化酵素をコードするDNAによりトランスフェクトされた）遺伝子修飾された線維芽細胞が、ドーパミン作動性経路の病変をもつ動物内に首尾よく移植された。これらの動物の運動機能及び姿勢は、これらのドーパミン生産線維芽細胞の移植後に改善された。Wolff et al.，Proc.N atl.Acad.Sci.USA ，86：9011-9014（1989）；Fisher et al.，Neuron，６：371- 380（1991）。出生後に得られた細胞に比べて、胎児組織の移植により、移植生存率は高められ、そしてそれ故臨床的改善が延長されることができる。Gage and Fisher，Neuron，6：1-12（1991）。新鮮な胎児のドーパミン作用性ニューロンは、その黒質線状体のドーパミン系に対する化学的損傷の後にサルの尾状核（ca udate nucleus）内に移植された。移植後、この損傷誘導姿勢欠陥が改善された。Bankiewicz et al.，J.Neurosurg.，72：231-244（1990）及びTaylor et al. ，Prog.Brain Res.，82：543-559（1990）。パーキンソニズムを患うヒトは、ドーパミン作用性ニューロンの線状体移植により治療された。Lindvall et al.，Arch.Neurol.，46：615-631（1989）；Widn er et al.，New Engl.J.Med．，327：1556-1563（1992）。これらの移植細胞は、中絶（abortion）から得られた。中絶に先立って、女性を、いくつかの疾患を引き起こすウイルスに対する抗体についてスクリーニングした。外科手術後、治療された患者は、神経学的機能の改善を示した。しかしながら、これらの患者は、維持免疫抑制治療を必要とした。最近の研究は、中枢神経系の支持細胞（星状細胞及び稀突起神経膠細胞）から放出される向性因子が細胞培養におけるニューロンの生存に不可欠である。O'Ma lley et al.，Exp.Neurol.，112：40-48（1991）。神経成長因子を発現するように遺伝子変更された移植線維芽細胞は、アルツハイマー病において観察される基底前脳内でのアセチルコリン・ニューロンの消滅を引き起こす采−脳弓（fimbria-fornix）に対する損傷後の基底前脳のコリン作用性ニューロンの生存を強化することが示された。Rosenberg et al.，Science，242：1575-1577（1988）。神経学的失調のための細胞移植治療における先の企ては、有望な結果を提供してきたけれども、いくつかの重大な問題が残存している。細胞移植のための胎児組織の供給は、ひじょうに限られている。最大生存能力を強化するために、それらの胎児細胞は、移植に先立って新鮮に収穫されなければならない。これは、選択的な中絶とのその移植手順の協調を必要とする。さらに、胎児組織は、米国内においては広く入手することができない。また、細胞が得られる胎児の妊娠期間が移植片生存に影響を与える。Gage and Fisher，前掲。一定の妊娠期間だけの胎児組織を得ることは、移植のための胎児細胞の入手可能性に追加の限定を加える。さらに、倫理的な考慮が、いくつかの潜在的な移植受容者を、新鮮な胎児細胞が移植されるときに上記手順を経験することをいやがらせる。上記胎児組織は、新鮮な流産児から得られるので、感染汚染のかなりの危険が存在する。胎児組織を供給するであろう中絶を経験する女性はさまざまな感染についてスクリーニングされるけれども、いくつかの感染、例えば、HIVは臨床的に検出されることができず、そしてこれ故に、このスクリーニング過程の間に同定されることができない。それ故、広く行われる場合、新鮮な胎児細胞の移植は、多くの感染続発症を引き起こす傾向がある。不死化セルラインの使用は、入手可能性及び感染のこれらの困難性の多くを克服することができるであろう。しかしながら、たった１の不死化ヒト胎児神経由来セルラインが報告されている。Major et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82： 1257-1262（1985）及び米国特許第4,707,448号。さらに、それらの現実の性質により不死化されたセルラインは、インビボにおける移植後に腫瘍形成を引き起こす素因となる。それ故、不死化細胞の治療的脳内移植は、頭蓋内腫瘍を引き起こす高い危険を担持し、そしてさらに、良性組織をもつ腫瘍は、頭蓋冠（calvarium）内に存在するとき、僅かな予後を担持することができる。遺伝的無関係な細胞の移植は、免疫学的な移植片拒絶及び頭蓋内炎症の危険性を伴う。Widner and Brundin，Brain Res.Rev.，13：287-324（1988）。遺伝的に無関係な細胞の全ての移植は、この危険を伴う。それ故、頭蓋内細胞移植により治療された患者は、移植された不死化細胞の非存在中でさえも感染及び悪性合併症の高いリスクを伴う長期間の維持免疫抑制を必要としている。不死化細胞の移植だけが、これらの合併症の危険を増大させる。本分野において緊急に必要とされるのは、不死化ヒト胎児神経由来細胞を治療的に移植する方法である。理想的には、これらの方法は、移植後に腫瘍形成をもたらさず又は重度の感染を顕出しないであろう。望ましくは、これらの方法は、感染汚染及び限定された細胞入手可能性の危険が最小化されるように、セルラインから得られた細胞を使用することができるであろう。ひじょうに驚くべきことに、本発明は、これらの及び他の関連の必要性を達成している。発明の要約本発明は、宿主に、不死化ヒト神経由来胎児セルラインからの細胞を移植することを含んで成る、宿主の治療方法を提供する。一般的には、このセルラインは、ヒト胎児星状細胞、例えば、SVGセルラインから誘導されるであろう。これらの細胞は、しばしば、その宿主の中枢神経系に移植されるであろう。これらの細胞は、その宿主の抗体に対して非透過性である膜により取り囲まれることができる。本発明のいくつかの態様においては、細胞は、ペプチドをコードする核酸配列によりトランスフェクトされることができる。これらのペプチドは、一般的に、酵素、例えば、チロシン水酸化酵素（tyrosine hydroxylase）、又は成長因子、例えば、神経成長因子であろう。これらのペプチドは、疾患関連抗原であることもできる。これらの細胞は、治療又は予防の目的のために移植されることができる。いくつかの場合においては、これらの細胞は移植後に除去されることができる。図面の簡単な説明図１は、インビトロにおけるSVG細胞の形態を表す。図２は、SVG細胞内のSV 40 Tタンパク質に対する抗体の免疫ペルオキシダーゼ染色を表す。図３は、低倍率における脳幹神経節内の針跡（needle track）を表す。図４は、脳幹神経節内の針跡の高倍率視野を表す。図５は、脳幹神経節内の針跡の他の高倍率視野を表す。図６は、側室の壁上のSVG細胞の巣を表す。図７は、グリア線維酸性タンパク質に対する抗体により染色された側室の壁上に移植されたSVG細胞を表す。図８は、抗−Ｔタンパク質抗体により染色された移植SVG細胞のインビボにおけるセクションを表す。図９は、移植６ケ月後のサルの脳の（ガドリニウム濃縮による）Ｔ₁加重MRIを表す。図10は、インビボにおける移植SVG細胞の層上のチロシン水酸化酵素ニューロンの成長を表す。特定の態様の説明本発明は、中枢神経系の細胞から誘導される不死化ヒト胎児細胞を移植することにより宿主を治療する方法を提供する。移植片拒絶、強度脳内炎症、及び腫瘍形成が、その中枢神経系内にこのような細胞の移植後に立証されていない。さらに、これらの細胞は、ニューロン転移及び神経突起伸長を誘導することが示されている。これは、これらの細胞が、ニューロン応答を刺激する向性因子を作り出すように機能していることを立証している。中枢神経系の細胞から誘導された不死化ヒト胎児細胞の移植は、多くの疾患の治療の手段を提供する。例えば、パーキンソン病は、罹患宿主の脳幹神経節内へのこれらの細胞の移植により治療されることができる。移植細胞により作り出される向性因子（tropic factors）は、ドーパミン作動性ニューロンの消滅を阻害し、そしてさらに、ドーパミン作動性ニューロンの再生を誘導することができる。ドーパミン作動性ニューロンの増加した集団は、パーキンソニズムを患う者の臨床的改善を提供することができる。あるいは、これらの移植された細胞は、チロシン水酸化酵素をコードするDNAによりトランスフェクトされることができる。これらの移植細胞によるチロシン水酸化酵素の発現は、これらの細胞がドーパミンを生産し、そして分泌することを可能にする。従って、これらの移植細胞は、黒質内のドーパミン濃度を増加させ、そしてドーパミン作動性ニューロンの損失の効果を制限し又は反転させることができる。本発明に係る方法は、神経学的失調、例えば、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、又は多発性硬化症を治療するために使用されることもできる。不死化ヒト胎児神経由来細胞が中枢神経系（CNS ）と互換できるので、これらの細胞は、生理学的に活性なペプチドをコードする DNA配列によりトランスフェクトされ、そしてCNS内に移植されることができる。例えば、ハンチントン舞踏病及び筋萎縮性側硬化病においては、ペプチドは、興奮性神経伝達物質、例えばグルタミン酸を遮断することができる。多発性硬化症においては、ペプチドは、髄鞘形成の向性刺激物質、例えば、血小板由来成長因子であることができ、又は、稀突起神経膠細胞の消滅を遮断することができる毛様体向性因子であることができる。これらの疾患は、局所的病変よりもより一般化されるため、これらの細胞は、脳脊髄液に晒された表面上に移植されることができる。発現及び分泌の後、ペプチドは、その脳脊髄液の自然の循環によりその脳の表面全体にわたり洗浄されるであろう。移植に好適な部位は、側室、腰椎鞘（lumbar thecal）領域、等を含む。アルツハイマー病においては、これらの細胞は、Rosenberg et al.，Science，242：1575-1578（1988）（引用により本明細書中に取り込む）により記載されたように、基底前脳のニューロンを支援するための神経成長因子を生産するために移植されることができる。本発明に係る方法は、神経外部位内の細胞の移植により宿主を治療するために使用されることもできる。本発明のこの態様は、特に、宿主の予防的治療に有用である。不死化ヒト胎児神経由来細胞は、疾患関連抗原、例えば、米国特許第5, 166,050号中に記載されたようなHIVの主中和ドメインを包含するHIV gp120ポリペプチドをコードするDNAによりトランスフェクトされることができる。これらの細胞は、次に、このトランスフェクトされたDNAによりコードされた抗原を発現し、そして分泌することができる。抗原は、移植された細胞により連続的に分泌され、そして強い免疫応答を顕出することができる。宿主を十分に免疫感作させる適当な時間間隔の後、これらの細胞を除去することができる。本明細書中に使用するとき、“宿主を治療する”は、疾患過程における、予防的、軽減的、そして治癒的仲裁を含む。宿主は、いずれかの温血哺乳類、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、等であることができる。多種多様な疾患及び症候群が、本発明に係る方法により治療されることができる。一般的には、疾患は、神経学的疾患、例えば（パーキンソン病を含む）パーキンソニズム、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側硬化症、Gaucher病、Tay-Sachs病、ニューロパチー、脳腫瘍、等であろう。本発明に係る方法は、非−神経学的疾患の治療において使用されることもできる。例えば、本発明に係る方法は、感染性疾患、例えば、ウイルス、バクテリア、原生動物、及びこれらに類似するものに対して宿主を免疫感作するために使用されることができる。不死化ヒト胎児神経由来細胞は、生理学的に活性なペプチド又は免疫学的エピトープを含むペプチドをコードするDNAによりトランスフェクトされることができる。本発明に係る方法は、ペプチド生産細胞を移植し、そして他のタイプのペプチド、例えば、成長ホルモンの、宿主への連続的なインビボにおけるデリバリーを提供するために使用されることができる。本発明の方法により移植される細胞は、不死化されたヒト胎児神経由来細胞である。“神経誘導（Neuro-derived）”は、不死化に先立って、細胞が神経学的細胞の表現型をもっていた、又は神経学的細胞型への分化に委ねられる胚細胞であったことを意味する。神経学的細胞型は、ニューロン、星状細胞、稀突起神経膠細胞（oligodendrocytes）、脈絡叢（chroid plexus）上皮細胞、等を含む。胎児細胞は、選択的中絶の後に採取されることができる。中絶後女性により寄贈された胎児は、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、並びにヘルペス・ウイルス１型及び２型を含むさまざまな感染性疾患について血清学的にスクリーニングされなければならない。胎児は、一般的には、妊娠期間の９−11週目（懐妊後７−９週目）であろう。胎児の齢は、超音波により確認されることができる。胎児は、胎児の脳外傷を最小化するために超音波のガイダンスの下で取り出されることができる。取り出した後、この胎児の脳を、同定し、そしてその流産児から切除する。これらの細胞を、以下のように調製する。脳組織を、19ゲージ針を通して吸引し、そしてEagle's最小必須培地（E-MEM，Gibco，New York，N.Y.）中で２回洗浄した。これらの細胞を、ポリ−Ｄ−リシンにより処理された（0.1mg／ml 5分間）培養皿上にプレートした。これらの細胞を、20％胎児ウシ血清、75μｇ／mlストレプトマイシン、75ユニット／mlペニシリン、１％デキストロース及び２μｇ／ mlファンジゾン（fungizone）（Gibco）を補ったE-MEM上で増殖させた。不死化に先立って、細胞を、５％Co₂湿環境中37℃においてインキュベートする。当業者は、細胞を調製するための他の方法を使用することもできるということを認めるであろう。本発明に係る方法により移植されるべき細胞は、さまざまな技術により不死化されることができる。典型的には、これらの細胞は、以下のように不死化されるであろう。細胞カルチャーは、一般的に、Major and Vacante，J.Neuropath．an d Exp.Neurol. ，48：425-436（1988）（引用により本明細書中に取り込む）により記載されたように、先祖の神経及びグリア細胞、並びにニューロンを作り出すであろう。規則的な再フィードにより、これらの脳細胞は、数ケ月間生存するであろうが、僅かな細胞増殖を示すであろう。細胞は、 SV 40欠失突然変異体によるトランスフェクションにより形質転換される。この突然変異体DNAは、複製起点（ori-）を欠いており、***することができない。しかしながら、このDNAのトランスフェクションは、Gluzman，Cell，23：175-18 2（1981）により記載されているように無制限増殖能力にそれらの細胞を形質転換するであろう。３週間胎児細胞カルチャーを増殖させた後に、それらの細胞は、Graham et al．Virol.，52：456-467（1973）により記載されたようにリン酸カルシウム沈降技術を用いてSV 40 ori−突然変異体を含む100μｇ／フラスコのプラスミドDNA（pMK16）によりトランスフェクトされることができる。あるいは、これらの細胞は、エレクトロポレーション、又はSambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Press，1988（引用により本明細書中に取り込む）中に記載されたような他のよく知られた技術、によりトランスフェクトされることができる。トランスフェクション後、これらのカルチャーを、１週間毎に再フィードしながら増殖させる。数週間後、プレートの別々の領域内でのグリア細胞の増殖が、明らかになる。次にこれらの細胞を、形質転換細胞により発現されるSV 40 Tタンパク質を検出するための蛍光抗体検定により同定することができる（図２）。これらの細胞を、Ｔタンパク質陽性細胞の数における増加が検出されるまで10日毎に継代培養する。形質転換された細胞は、連続的なセルラインの表現型を示すであろう。特に、これらの細胞は、18時間の寿命をもって、高い飽和密度まで増殖するであろう。これらの細胞は、形質転換された表現型又は非足場依存性増殖を示さない、しかしながら、それは、非突然変異体SV 40形質転換細胞に特徴的である。また、細胞形態は、このセルラインの樹立の経過の間に変更されない。これらの細胞のフォーカスは、一般的に、検出されない。特に有用なのは、American Type Cultur e Collection，Rockville MD,（A.T.C.C．CRL 8621）に寄託されたSVGセルラインからの細胞であり、これは、米国特許第4,707,448号（引用により本明細書中に取り込む）中に記載されている（図１）。以下、“SVG細胞”又は“SVGセルライン”は、セルラインA.T.C.C．CRL 8621から誘導体された細胞又は細胞系を意味する。誘導体は、セルラインA.T.C.C．CRL 8621の、サブクローン、複製物、又は遺伝子操作された突然変異体を意味する。あるいは、これらの細胞は、本分野においてよく知られている他の技術により不死化されることができる。例えば、エプスタインーバール・ウイルスによる不死化を、米国特許第4,464,465号（引用により本明細書中に取り込む）中に記載されたように、用いることができる。Ori P及びOri Lyt複製起点を欠いたエプスタインーバール・ウイルスが特に有用である。他の有用な不死化の方法は、Bart lett et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：3255-3259（1988）（引用により本明細書中に取り込む）により記載された、増殖制御のための細胞遺伝子、例えば、c-mycの過剰発現である。一般的に、移植に好適な形質転換細胞は、足場依存性であろうし、柔寒天中で増殖せず、そしてフォーカス形成を示さないであろう。好ましくは、これらの細胞は、受容体宿主からの免疫応答を顕出しないであろうし、そしてそれ故に、移植後の宿主の免疫抑制を必要としないであろう。便利には、これらの細胞、例えば、SVG細胞は、MHCクラスII分子又はMHCクラスＩ分子を発現することができない。MHCクラスＩ又はクラスII分子の発現を欠く細胞は、免疫応答を顕出することができない。MHCクラスII分子の発現を欠く細胞は、SVG細胞から誘導され又は米国特許第4,707,448号（引用により本明細書中に取り込む）中に記載されたように組換えにより構築されることができる。機能的なMHCクラスＩ又はクラスII分子の遺伝子は、非機能的なMHC分子配列を担持するベクターとの相同的組換えにより除去されることもできる。得られた細胞は、それぞれ、機能的なMHCクラスＩ又はクラスII分子を生産しないであろう。あるいは、MHCクラスＩ又はクラスII分子の発現は、他の細胞内で抑制されることができる。抑制は、例えば、MHCクラスＩ又はクラスI I分子をそれぞれコードする核酸配列（DNA又はRNA）の転写又は翻訳を遮断するためのアンチセンス核酸配列により、達成されることができる。MHCクラスＩ又はクラスII分子遺伝子又はRNAの保存領域に相補的な核酸配列を構成的に発現する発現ベクターは、それらの遺伝子の発現を抑制するために細胞内にトランスフェクトされることができる。形質転換細胞の組織学的起源が、次に、決定されることができる。特徴的には、星状グリア細胞は、グリア線維状酸性タンパク質、GFAPから成る中間フィラメントの存在により認識されることができる。稀突起神経膠細胞は、他方において、ミエリン生産細胞であり、そしてミエリンの成分であるガラクトセレブロシド、gal Cのそれらの合成により同定されることができる。形質転換の後、これらの細胞は、移植のために調製されるであろう。これらの細胞は、生理学的に適合性の担体、例えば、細胞培養基（例えば、Eagle's最小必須培地）又はホスフェート・バッファー生理食塩水中に懸濁される。細胞密度は、一般的には、約10⁴〜10⁷細胞／mlである。細胞懸濁液は、移植前にゆるくロックされる。移植されるべき細胞懸濁液の容量は、移植部位、治療目的、及び溶液中の細胞密度に依存して変化するであろう。例えば、パーキンソニズムの治療においては、５μｌ〜60μｌの細胞懸濁液が、それぞれの注射において投与されるであろう。数回の注射を、各宿主において使用することができる。当業者は、適当な細胞投与量をどのように決定するかを理解するであろう。これらの細胞は、脳の柔組織内に、脳脊髄液を含む空間、例えば、蜘蛛膜下空間又は室内に、又は神経外に、移植されることができる。本明細書中に使用するとき、用語“神経外に（extraneurally）”は、中枢神経系又は、末梢神経組織、例えば、腹膜神経節（celiac ganglion）又は坐骨神経（sciatic nerve）内にない宿主の領域を示すことを意図される。“神経外”領域は、末梢神経を含むことができる。“中枢神経系”は、硬膜（dura mater）内のすべての構造物を含むと意味される。これらの細胞が脳内に移植されるとき、Leksell and Jernberg，Acta Neuroch ir .，52：1-7（1980）及びLeksellet al.，J.Neurosurg.，66：626-629（1987）（これらの両方を引用により本明細書中に取り込む）中に記載されたような定位法（stereotaxic methods）が一般的に使用されるであろう。標的領域の位置決めは、一般的に、Liksell et al.，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，48：14-18 （1985）（引用により本明細書中に取り込む）中に記載されたような移植前MRI を含むであろう。標的座標は、移植前MRIから決定されるであろう。移植に先立って、細胞の生存能力が、Brundin et al.，Brain Res.，331：251 -259（1985）（引用により本明細書中に取り込む）により記載されたように評価されることができる。簡単に言えば、細胞懸濁液のサンプル・アリコート（１− ４μｌ）を、10μｌの、アクリジン・オレンジと臭化エチジウムの混合物（0.9 ％生理食塩水中3.4μｇ／mlの各成分；Sigma）と、ガラス・スライド上で混合する。この懸濁液を、血球計に移し、そして可視及び非可視細胞を、その計数チャンバー格子を可視化するために白光トランスー照明と併合された、390nmにおけるエピー照明下で、蛍光顕微鏡を用いて、肉眼カウントした。アクリジン・オレンジは、生きた核を緑に染め、一方、臭化エチジウムは、死んだ細胞に侵入し、オレンジ−赤の蛍光をもたらす。細胞懸濁液は、一般的に、約98％以上の可視細胞を含まなければならない。注射は、一般的には、23−27ゲージ針をもつ滅菌lOμｌ Hamiltonシリンジにより行われるであろう。細胞を充填されたシリンジは、定位フレームの頭内に直接的に載せられる。この注射針は、頭蓋内の小さなバール孔を通して所定の座標まで下げられ、40−50μｌの懸濁液が約１−２μｌ／分の速度において挿入され、そしてさらに２−５分間、その針をゆっくり抜く前に拡散に供される。しばしば、２つの別個の挿入（deposits）が１−３mm離されて、同一針の貫通に沿って行われ、そしてその標的領域上に散らされた５以下の挿入が、同一方向において容易に行われることができる。その針を抜いた後の外科手術の終わりに、宿主はそのフレームから取り外され、そしてその外傷が縫合される。予防的な抗生物質又は免疫抑制治療を、適宜投与することができる。より一般的な神経学的失調の治療のために、細胞は、治療的化合物を発現するようにトランスフェクトされ、そして室（ventricles）又は腰椎膜（lumbar the ca）内に移植されることができる。治療的化合物が、これらの細胞により分泌されるとき、脳脊髄液の自然の循環がその中枢神経系を通してその治療的化合物を洗浄して、一般的な治療手段を提供する。室内への移植は、Madrazo et al.，Ne w Engl.J.Med．，316：831-834（1987）又はPenn et al.，Neurosurgery，22：9 99-1004（1988）（これらの両方を引用により本明細書中に取り込む）中に記載されたような開口手術により達成されることができる。腰椎膜内への細胞の移植は、最も便利には、腰椎穿孔を介しての抗腫瘍医療又はラジオグラフ造影剤の点滴注入も同様の標準的な手順により達成される。いくつかの例においては、本発明に従って神経外に細胞を移植することが望ましいかもしれない。これらの細胞は、針又は内視鏡を通して経皮的に又は開口手術により、移植されることができる。当業者は、特定の用途のために細胞を移植する最も適当な方法を容易に理解するであろう。これらの細胞は、移植に先立って膜により取り囲まれることができる。これらのカプセル化は、宿主の免疫系に対するバリアを提供し、そして移植片拒絶及び炎症を阻害する。細胞カプセル化のいくつかの方法を用いることができる。いくつかの場合においては、細胞は、個々にカプセル化されるであろう。他の場合においては、多数の細胞が、同一膜内にカプセル化されるであろう。これらの細胞が移植後に除去されるであろうとき、単一膜内に多数の細胞をカプセル化している比較的大きなサイズの構造が、移植された細胞の回復のための便利な手段を提供する。細胞カプセル化のいくつかの方法がよく知られており、例えば、欧州特許公開第301,777号、又は米国特許第4,353,888号、第4,744,933号、第4,749,620 号、第4,814,274号、第5,084,350号、又は第5,089,272号（これらのそれぞれを引用により本明細書中に取り込む）中に記載されている。細胞カプセル化の中の１の方法は以下のようなものである。形質転換された細胞を、アルギン酸ナトリウム（ポリアニオン性海藻エキス）と混合し、そして塩化カルシウム中にエクストルードして、ゲル・ビーズ又は滴を作る。これらのゲル・ビーズを高分子量（MW60−500×10³）濃度（0.03−0.1％ｗ／ｖ）のポリアミノ酸、例えば、ポリ−Ｌ−リシンと、短時間（３−20分）間インキュベートして膜を形成する。形成されたカプセルの内部を、クエン酸ナトリウムによる処理により再液化する。これらの細胞の周囲の単一膜は、高く透過性である（MWカット・オフ200−400×10³）。この細胞を含む単一膜カプセルを、１ −３時間生理食塩水中でインキュベートして補獲されたアルギン酸ナトリウムをそのカプセルから外に拡散させ、そしてそのカプセルを平衡状態に膨張させる。得られたアルギネート減少カプセルを、低分子量のポリアミノ酸（MW 10−30×1 0³）例えば、ポリ−Ｌ−リシン（PLL）又はキトサン（脱アセチル化キチン；MW 240×lO³）と反応させて、相互作用された低透過性の膜（MWカット・オフ40−80 ×10³）を作り出した。この２重膜にカプセル化された細胞を次に、先に記載したように２〜３週間、E-MEM中で培養する。アルギン酸ナトリウム・ビーズに特別に言及したが、それが入れられる媒質中の条件における変化により形状を保持する塊を形成することができるようにゲル化されることができるいずれかの非毒性の水溶性物質を用いることができることは当業者に明らかであろう。このようなゲル材料は、一般的に、その表面層が架橋して、反対電荷のポリマーに晒されたときに永久膜を形成することができるように、アニオン又はカチオン基を形成するように容易にイオン化されるいくつかの化学的部分を含んで成る。ほとんどの多糖類ガム、天然と人工の両方は、正に帯電した反応基、例えば、アミノ基を含むポリマーにより架橋されることができる。アルギン酸ナトリウム・ガムと反応することができる架橋生体適合性ポリマーは、ポリリシン及び他のポリアミノ酸を含む。形成された膜の透過性の程度は、望ましい分子量をもつポリアミノ酸を注意して選択することにより制御されることができる。ポリ−Ｌ−リシン（PLL）は、好ましいポリマー材料であるが、他は、キトサン及びポリアクリレートを含む。分子量は、典型的には、約10⁴〜約10⁶の間で変化する。本発明のいくつかの態様においては、移植された細胞は、ペプチドをコードするDNA配列によりトランスフェクトされることができる。ペプチドは、直接的な治療化合物、例えば、ハンチントン舞踏病の治療における運動阻害物質であることができる。あるいは、ペプチドは、治療的化合物の生産を触媒する酵素、であることができ、例えば、このDNAは、パーキンソニズムの治療において有効であるドーパミンの合成を触媒するチロシン水酸化酵素をコードすることができるであろう。このDNAは、向性因子、例えば、神経成長因子、阻害的成長因子、又は脳腫瘍の治療において有用なサイトカインをコードすることもできる。一般的には、このDNA配列は、転写プロモーターと転写ターミネ一ターに作用可能な状態で連結されるであろう。移植された細胞内でのこのDNAの表現は、構成的又は誘導的であることができる。これらの特徴をもつさまざまな発現ベクターは、Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spri ng Harbor Press，1988（先に、引用により本明細書中に取り込んだ）中に記載されたように、細胞のトランスフェクションのためのDNA）例えば、プラスミド・ベクターpTK2、pHyg、及びpRSVneo、シミアン・ウイルス40ベクター、ウシ乳頭腫ウイルス・ベクター又はエプスタイン−バール・ウイルス・ベクターを担持することができる。これらのベクターは、標準的な方法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、ポリブレン・トランスフェクション、等により細胞内に導入されることができる。以下の実施例を、限定のためでなく、説明のために提供する。実施例１本実施例は、アカゲザル内への移植のためのSVG細胞（A.T.C.C.CRL 8621）の調製について記載する。これらの細胞は、マイコプラズマ、HIV-1、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアン・ウイルス40、単純ヘルペス・ウイルス、サイトメガロウイルス、及びJCウイルスについてスクリーニングされた。 SVG細胞を集密まで増殖させた。細胞増殖は足場依存性であった。フォーカス形成は、生じず、そして細胞の形態は均一であった。これらの細胞を、Hank'sバランス塩溶液中の0.01Ｍ EDTA（Versene Buffer）中の0.05％トリプシンによる消化により組織培養プレートから取り出した。細胞を遠心分離により集め、３回洗浄し、そしてホスフェート・バッファー生理食塩水中に再懸濁させた。最終的な細胞密度は10⁶細胞／mlであった。この細胞懸濁液を移植まで４℃において保存した。実施例２本実施例は、６匹のアカゲザルの脳幹神経節内へのSVG細胞の移植について記載する。これらの移植は、外科的合併症を伴わずに定位法により行われた。これらの動物を、最初にケタミン（ketamine）により麻酔し、そして外科手術の経過の間イソフルオリン（isofluorine）ガス麻酔上で維持した。これらの動物を、その定位フレーム（kopf）内に置き、そして移植のための標認点を、その定位座標を通じて確立した。上矢状静脈洞（superior sagittal sinus）を、その中心線を確立するために露出させた。マークを、両側上、尾状核（caudate）と被殻（putamen）の上にその頭蓋上に置いた。これらの座標は、以下のようであった：APは、０の前方＋24mmであった。横の座標は、尾状核について上記中心線から５mmであり、そして被殻について上記中心線から10mm横であった。５つのバール孔を作った。１は、上矢状静脈洞上に行い、２つを尾状核上に、そして２つを被殻上に行った。２つの異なる移植技術を使用した。１．26ゲージ針をつけた10μｌハミルトン・シリンジ又は23ゲージ針をもつ50 μｌハミルトン・シリンジを使用した。脳SVG細胞の右側上に移植した。これらのシリンジを使用して、２つの挿入（deposits）を、その被殻内に行った。１の挿入は、側被殻内にあり、そして２番目は中央被殻にあった。これらの針をその皮質から18mm下方に下げ、次に10μｌの細胞懸濁液を、kopfマイクロインジェクターを使用して移植した。最初の移植後、その針を、１分間当り１mm、３分間で取り出し、そして次に、その細胞懸濁液の10μｌの第２の注射を行った。この第２の注射の後、その針を１分間当り１mmにおいて取り出した。第２の移植を同一技術により同一座標における反対側の被殻内で行った。その被殻に注射した後、その尾状核内への移植を、同一細胞懸濁液により行った。２つの注射を、側及び中央面内で、その尾状核内に行った。この注射の深さは、15mmであり、そして10μｌを移植した。このシリンジを３分間、１分間当り１mmで引き抜き、次に、その細胞懸濁液の10μｌの第２の注射を行った。非−トランスフェクトSVG細胞を、被殻内に移植し、そしてトリプシン水酸化酵素遺伝子によりトランスフェクトされたSVG細胞を、被殻内に移植した。これらの細胞の濃度は、１mL当り２×10⁶細胞であった。２．針をつけたシリンジを用いた移植の使用に加えて、22ゲージ針に接続された青の中が見えるチューブのカニューレを作った。このチューブを、０のデッド・ボリュームのコネクターを用いて１ccのツベルクリン・シリンジに接続した。標的内への挿入の後、この針を注入に先立って15分間放置した。この細胞懸濁液を保持するHarvard注入ポンプを、次に0.2μｌ／分において開始させた。O.2μ ｌ／分において15分間の注入の後、この速度を、0.4μｌ／分に増加させ、そして100分間続けた。この注入の終了後、針を、引き抜きに先立って30分間その場に放置した。次に、これらの針を、その脳からひじょうにゆっくりと引き抜いた。この外傷を、濯ぎ、そして次に解剖層内に閉じた。これらの動物を麻酔から醒まし、そして外科手術の20分後にそれらの元の檻に移した。実施例３本実施例は、移植１ケ月後に殺したサルの中の２における移植されたSVG細胞の首尾よい移植について立証する。これらの移植された細胞は、組織学的に健康であった。腫瘍形成又は炎症の証拠は全く存在しなかった。これらの移植領域内の脳組織を以下のよう検査した：組織病因学的研究のために、動物を、ペントバルビタールの過剰投与（460mg 、静脈内）により殺し、15mlの氷冷ホスフェート・バッファー生理食塩水（PBS ）その後の10％ホルマリンにより上行大動脈を通して灌流した。これらの脳を素早く取り出し、６mmの冠状セクションに切断し、そして同一固定剤中で30分間後固定した。これらの組織スライスを、PBS中30％スクロース中で48時間濯ぎ、そして次に−70℃において急速冷凍した。組織を、冷却マイクロトーム内で40μｍの冠状セクションに切断し、そして一連のセクションを、PBS中に集めた。これらのセクションを、チロシン水酸化酵素、グリア線維酸性タンパク質及びＴ−プロテインに対する抗体との免疫組織化学のために処理した。TH-IRについて検査されたものに隣接するセクションを、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。インプラントを含む組織のいくつかのブロックを、５μｍパラフィン・セクション内で処理し、そして先に記載したように染色した。図３は、低倍率におけるサルの中の１の脳幹神経節内の針跡を表す。この針跡のより高い倍率の視界（図４−５）は、その跡内の可視SVG細胞を表す。これらの細胞は、インビトロにおけるSVG細胞により示されるような多数の核小体を含む大きな核により容易に同定される。この移植細胞の形態は、周囲の細胞の形態も著しく異なっている。実施例４本実施例は、４つの残りのサルの移植の１ケ月後の脳のMRI評価について記載する。腫瘍形成の証拠は、サルのいずれにおいても全く存在しなかった。麻酔の導入後、サルを、標準的なMRIフレーム内に置いた。造影剤によらないＴ₁及びＴ₂加重画像とガドリニウムによるＴ₁加重画像を、1.5 Teslaマグネット（Signa）を用いて行った。これらの走査は、節又は腫瘍形成の証拠を全く現わさなかった（図９）。実施例５本実施例は、中枢神経系内に移植されたSVG細胞の機能について立証する。宿主のニューロンは、移植された細胞、ニューロンのドーパミン作動性体の方に転移し、そして宿主起源のドーパミン作動性過程は、その移植された細胞に伸ばされた。先の実施例２中に記載したようなSVG細胞移植を受容した存在サルの中の２を、記載したように殺した。これらの脳を、先に記載したように無傷で取り出し、そして切片化した。各セクションを、ゼラチン・コート・スライド上に置いた。代表セクション、ヘマトキシリンとエオシンにより染色してその解剖学的構造を特徴付けた（図６）。移植された細胞は、多数の核小体をもつ大きな核をもつ特徴的なSVG形態を示した。隣接セクションは、グリア線維酸性タンパク質（GFAP）、SV 40 Tプロテイン、又はチロシン水酸化酵素に対するいずれかのモノクローナル抗体により染色した。次に、これらのセクションを、ヘマトキシリン単独で対染色した。図７は、GFAP、星状細胞系の細胞質タンパク質に対する抗体により染色された隣接セクションを表している。この星状細胞起源は、濃縮細胞質染色により立証される。これらの細胞の起源は、抗−Ｔプロテイン抗体により染色された移植細胞を明瞭に示す図８中にも表わされる。尾状核及び被殻内の移植細胞は、先に記載したように抗−Ｔプロテイン抗体により可視化され、そして容易に同定された。SVG細胞は、全てのサルの側室の壁上にも同定された。ドーパミン作動性ニューロンは、移植された細胞の方への軸索の外成長を示した（図10は、インビボにおけるSVG細胞の層内の抗−チロシン水酸化酵素抗体により染色されたチロシン水酸化酵素ニューロンを表している）。ドーパミン作動性ニューロン体は、移植されたSVG細胞の領域内にも存在した。この軸索外成長（Neurite outgrowth）及びニューロン体の存在は、これらのS VG細胞が、ニューロン転移及びニューロン過程の伸長を引き起こす神経向性因子を生産したということを示している。炎症、移植拒絶、腫瘍又は節形成の証拠は、いずれのセクションにおいても全く発見されなかった。実施例６本実施例は、SVG細胞の個々のカプセル化及び移植のための細胞の調製について記載する。これらの細胞を、アルギン酸ナトリウム・ペレット内にカプセル化する。 SVG細胞を、培養皿内で集密まで増殖させる。これらの細胞を、Dulbecco'Sホスフェート−バッファー生理食塩水（PBS）中のO.05％トリプシン及び１mM EDTA によりその培養皿から取り出した。これらの細胞を、MgCl₂、CaCl₂、0.1％グルコース、及び５％胎児ウシ血清を補ったPBS中に懸濁する。これらの細胞を、遠心分離により集め、先に記載したように懸濁液中で２回洗浄し、そして遠心分離してペレットにした。この遠心分離管の底に残った細胞ペレットを、1.5％（ｗ／ｖ） go，Illinois）の５mL中に再懸濁する。このアルギネート細胞懸濁液を、50mLの 1.5％（ｗ／ｖ）CaCl₂溶液中にエクストルードする。この懸濁液の球状滴を、エアー・ジェットーシリンジ・ポンプ滴発生装置により形成する。この装置により、細胞−アルギン酸ナトリウム懸濁液を、空気が制御された速度（９Ｌ／分）において流れる被覆管（３mm内径）の内側に置かれた22−ゲージの針を通してエクストルードする。液滴は、（20cc／時間において）上記シリンジ・ポンプにより針の端から外に押し出されるので、それらの滴は、速く流れる空気流により作られた剪断力により引き離される。針の先端のCaCl₂溶液の表面上８cmに保ち、均一で、球状のゲル滴が約300−1000ミクロンの直径をもつように形成されることを確保した。ゲル化されたマイクロビーズのサンプルを、換算アイ−ピース（eye-piece）を装着された解剖顕微鏡（Wild Heerbrugg Model M8）を用いてサイズと形状の一貫性について検査する。固定化細胞を含むアルギン酸カルシウムゲル・ビーズを、円錐の底をもつ50mLのプラスチック遠心分離管に移した後、これらのビーズを、0.1％（ｗ／ｖ）CHESと1.1％（ｗ／ｖ）CaCl₂溶液のそれぞれ30mLで洗浄する。この上清容量を、真空アスピレーターを用いてそれぞれ洗浄した後に減少させる。半−透過性カプセル膜を、８分間、水性0.05％（ｗ／ｖ）PLL溶液（PLLのＭ／Ｖ＝22.000）とそのゲル滴を反応させることにより形成する。このPLL溶液の添加の後、この遠心分離管に蓋をし、そしてそれらのカプセルが共にくっつかないように、その反応の経過の間、端と端を接して手でたたいた。得られたマイクロカプセル、直径 300−1000ミクロンを、0.1％CHESと1.1％CaCl₂のそれぞれ30mL及び等張性生理食塩水の２つの30mLアリコートで洗浄する。このカプセル化された細胞を、４分間 30mLの0.03％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム溶液と接触させて、それらのカプセル上に外層を形成させた。このマイクロカプセルの内側を、６分間30mLの0.05 Ｍクエン酸ナトリウム溶液で液化する。これらのマイクロカプセル、直径400−1 400ミクロンを、生理食塩水中で７回洗浄して過剰のシトレートを除去し、そして次に５つの１mLアリコートに分けた。それぞれのアリコートを、等温Series 4 00 CO₂インキュベーター（モデル413D，Fisher Scientific Co.，Nepean，Ontar io）内で37℃において25cm³の培養フラスコ内の10mL DMEM培地中でインキュベートする。実施例７本実施例は、トリプシン水酸化酵素をコードする核酸によるSVG細胞のトランスフェクトについて記載する。チロシン水酸化酵素（tyrosine hydroxylase）を発現するSVG細胞は、トランスフェクション後のカルチャー中に同定された。 SVG細胞の非集密単層を、サイトメガロウイルス・プロモーターに作用可能な状態で結合されたヒト・チロシン水酸化酵素・cDNAを含むプラスミドによりトランスフェクトした。これらの細胞を、リン酸カルシウム沈降によりトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、カルチャーからの細胞を同定し、そしてチロシン水酸化酵素に対する標識抗体により染色した。チロシン水酸化酵素を発現する細胞が同定された。本明細書に述べた全ての刊行物、特許及び特許出願を、あたかも、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が特別に且つ個々に引用により本明細書中に取り込まれることを意図されるような程度において、引用により本明細書中に取り込む。これまで、本発明を、理解の明確さを目的として説明と実施例によりいくぶん詳細に説明してきたが、添付クレームの範囲内で、特定の変更及び修正が行われることができるということは、自明であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年５月５日【補正内容】請求の範囲１．パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側硬化症又は多発性硬化症を患う宿主を治療する方法であって、その宿主にSVGセルラインからの細胞を移植することを特徴とする方法。２．細胞が、抗体に対して非透過性である膜によりカプセル化されている、請求項１に記載の方法。３．細胞が宿主の中枢神経系内に移植される、請求項１に記載の方法。４．細胞が宿主の脳幹神経節内に移植される、請求項３に記載の方法。５．細胞が宿主の腰椎膜内に移植される、請求項３に記載の方法。６．細胞が宿主の側室内に移植される、請求項３に記載の方法。７．細胞が神経外に移植される、請求項１に記載の方法。８．細胞が皮下に移植される、請求項７に記載の方法。９．細胞が、それらの細胞による発現のために、ペプチドをコードする核酸配列を含んで成るベクターによりトランスフェクトされている、請求項１に記載の方法。 10．ペプチドが酵素である、請求項９に記載の方法。 11．ペプチドが疾患関連抗原である、請求項９に記載の方法。 12．移植後に細胞を除去することをさらに含んで成る、請求項11に記載の方法。 13．細胞が、抗体に対して非透過性である膜によりカプセル化される、請求項 11に記載の方法。 14．宿主においてパーキンソン病を治療するための方法であって、SVGセルラインから誘導された細胞をその宿主の脳幹神経節内に移植することを特徴とする方法。 15．SVG細胞が、転写プロモーターと転写ターミネーターに作用可能な状態で結合されたチロシン水酸化酵素をコードする核酸配列によりトランスフェクトされる、請求項14に記載の方法。 16．宿主が、細胞の移植後に免疫抑制治療を必要としない、請求項14に記載の方法。 17．パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側硬化症又は多発性硬化症である宿主の中枢神経系における病変を治療する方法であって： SVGセルライン由来の細胞の懸濁液をその中枢神経系に注射すること、を特徴とする方法。 18．病変が、中枢神経系の領域に制限され、そして細胞がその領域内に注射される、請求項17に記載の方法。 19．病変がパーキンソン病である、請求項17に記載の方法。 20．細胞が輸注ポンプにより注射される、請求項17に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者トーナトア，カルロエス. アメリカ合衆国，メリーランド，20782, ユニバーシティーパーク，クラゲットロード 4315 (72)発明者バンキーウィッツ，クリスアメリカ合衆国，カリフォルニア 94596, ウォールナットクリーク，キャッスルクレストロード 30

Claims

【特許請求の範囲】１．不死化ヒト神経由来胎児セルラインの細胞を宿主内に移植することを特徴とする宿主の治療方法。２．胎児セルラインがヒト胎児星状細胞から誘導される、請求項１に記載の方法。３．細胞がSVGセルラインから誘導される、請求項２に記載の方法。４．細胞が、抗体に対して非透過性である膜によりカプセル化されている、請求項１に記載の方法。５．細胞が宿主の中枢神経系内に移植される、請求項１に記載の方法。６．細胞が宿主の脳幹神経節内に移植される、請求項５に記載の方法。７．細胞が宿主の腰椎膜内に移植される、請求項５に記載の方法。８．細胞が宿主の側室内に移植される、請求項５に記載の方法。９．細胞が神経外に移植される、請求項１に記載の方法。 10．細胞が皮下に移植される、請求項９に記載の方法。 11．細胞が、それらの細胞による発現のために、ペプチドをコードする核酸配列を含んで成るベクターによりトランスフェクトされている、請求項１に記載の方法。 12．ペプチドが酵素である、請求項11に記載の方法。 13．ペプチドが疾患関連抗原である、請求項11に記載の方法。 14．移植後に細胞を除去することをさらに含んで成る、請求項13に記載の方法。 15．細胞が、抗体に対して非透過性である膜によりカプセル化される、請求項13に記載の方法。 16．宿主においてパーキンソン病を治療するための方法であって、SVGセルラインから誘導された細胞をその宿主の脳幹神経節内に移植することを特徴とする方法。 17．SVG細胞が、転写プロモーターと転写ターミネーターに作用可能な状態で結合されたチロシン水酸化酵素をコードする核酸配列によりトランスフェクトされる、請求項16に記載の方法。 18．宿主が、細胞の移植後に免疫抑制治療を必要としない、請求項16に記載の方法。 19．宿主の中枢神経系における病変により引き起こされる神経学的疾患を治療する方法であって：針をその中枢神経系内に入れ；そしてその針を通して細胞の懸濁液をその中枢神経系内に注射する、ここでこれらの細胞は不死化ヒト神経由来胎児セルライン由来である、ことを特徴とする方法。 20．病変が、中枢神経系の領域に制限され、そして細胞がその領域内に注射される、請求項19に記載の方法。 21．細胞がSVG細胞である、請求項19に記載の方法。 22．神経学的失調がパーキンソニズムである、請求項19に記載の方法。 23．細胞が輸注ポンプにより注射される、請求項19に記載の方法。