JPH08507765A - 合成粒子状ベクターおよび調製方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
非脂質の親水性核、ならびに少なくとも部分的に両親媒性化合物からできていて、かつ疎水性相互作用および/またはイオン結合によりその核と組合わさる外部層を含む合成粒子状ベクター。イオン化可能な活性成分を被包化することにより粒子状ベクターを調製するための方法、前記方法を通して取得されるベクター、およびこのようなベクターを含む薬剤学的、化粧品学的、もしくは食品組成物も開示される。
Description
【発明の詳細な説明】
合成粒子状ベクターおよび調製方法
本発明は、単独で、もしくは様々な化合物用のベクターとして使用することが
できる新規の種類の粒子に関する。本発明はまた、活性成分の充填化の調節の改
善を可能にする粒子状ベクターの製造のための方法にも関する。
超分子バイオベクターすなわちSMBVは身体の内因性ベクターの生物疑似物
であり、かつ具体的には製薬学的、化粧品的、もしくは農事産業的使用のための
多大な数の活性成分を被包化および担持することが可能な粒子である。
最初の種類のSMBVは欧州特許第344,040号明細書に記載されていた
。これらの構造は、結果として特にそれらのサイズ、およびその分子もしくは輸
送される分子に従うそれらの組成、およびそれらの利用法を変化させることの可
能性からベクターの役目には非常に良く適している。
SNBVは、以下に示す3つの連続段階において合成され、それらは
− イオン性の基により誘導でき、かつ特に超粉砕により所望のサイズ(所望の
用途に従い10ナノメーターと数ミクロンとの間)にすることができる、例えば
架橋天然多糖から構成されている中心核の合成、
− その中心核の周囲にその内部の親水性を保持させながら中心核に周辺疎水性
を付与する目的で、中心核の周辺へ単に共有結合的にグラフトされた脂肪酸のコ
ロナの確立、
− 特に、リン脂質もしくはセラミドで構成され、時としては生物学的な膜の構
成成分を例とする他の構成成分の添加を伴う、一つもしくは複数の外部脂質ラメ
ラの安定化、
である。
活性成分はそれらの物理化学的特性に従い、外部脂質ラメラ内(親油性もしく
は両親媒性化合物の場合)、あるいは親水性核の中(極性化合物の場合)のいず
れかに輸送することができる。
極性の性質の活性成分の被包化は後者の構造に従い、脂肪酸コロナの形成前、
もしくはこの段階と外部ラメラの安定化との間のいずれかに実施することができ
る。
多くの用途へのそれらの適性にもかかわらず、SMBVの合成は時としては問
題を生じることがあり、そしてそれらは特に、
− 不確実な段階である脂肪酸コロナのグラフトを調節することを必要とし、
− 核の周辺でのみ実施されるこのグラフトは均一に実施する必要があり、そし
てこれは特に非常に特異的な条件下での前乾燥段階を必要とし、
− この活性成分を脂肪酸コロナのグラフト前に被包化する場合には、それらの
被包化後に核の周辺に局在するそれら分子のうちの幾つかのものは脂肪酸により
誘導化されて、この活性成分の特性の改変を生じることがあり、
− この活性成分を脂肪酸コロナのグラフト後に被包化する場合には、脂肪酸は
親水性核内への活性成分の浸透にとって有害である可能性がある、
ということである。
本出願人らは、驚くべきことに特定の適用法においては脂肪酸コロナを架橋親
水性核の周辺にグラフトさせないことによりこの反応機構を縮小することが可能
であることを見い出した。
本出願人らは、このようにして取得される多糖粒子がそのまま使用できること
を見い出した。そしてそれらを、超分子バイオベクターとの類似性によりPS−
タイプのSMBVと命名した。
本出願人らは、たとえ小さいサイズであったとしても適切な充填化プロトコー
ルを適用させればこの多糖粒子を使用することができることをさらに見い出した
。
これらはまた、天然の両親媒性化合物、特にはリン脂質と組み合わせても使用
することができ、そして本出願人らは、外部脂質ラメラがSMBVの場合のよう
なグラフトされた脂質コロナの非存在下でこの核の周辺に整列させることが可能
であることを見い出した。これらの粒子は超分子の性質を有し、そしてL−タイ
プのSMBVとして知られている。
これが、本発明の主題が合成粒子状ベクターであることの理由であり、この合
成粒子状ベクターは、
− 非液体の親水性核、
− 疎水性相互作用および/またはイオン結合を介して核と組合わされるか、あ
るいは親水性核の外部コロナによるか、あるいはこのコロナ内における活性成分
の被包化を回避し、そしてその核の内部に活性成分を濃縮する特定の方法を用い
ることによって少なくとも部分的に両親媒性化合物から構成されている外部層、
を含むことを特徴とする。
この事例においてはベクターの概念は広い意味で理解されるべきであ
り、すなわちその概念は、そういったものとしてか、あるいは活性化合物の輸送
、提示、および/または安定化のためかのいずれかで、例えばある組成物中にそ
れらが取り込まれる場合などに支持体の役割を有する粒子を含むということであ
る。
非液体の親水性核(もしくはマトリックス)は親水性ポリマーであることがで
きる。この親水性マトリックスは具体的には天然もしくは化学的に架橋された多
糖もしくはオリゴ糖から構成することができる。多糖は、デキストラン、デンプ
ン、セルロース、およびそれらの誘導体から選択されることが好ましい。
2種類の相互作用が、例えば、イオン性の基によりその容積全体が誘導化され
ている架橋多糖で構成された核上でのリン脂質の安定化を説明することができ、
これらの相互作用は疎水性タイプの相互作用か、あるいはイオン性タイプの結合
かのいずれかであり、この2つの様式がこれらのラメラの安定化に共同作用する
ことが可能である。
実際のところ、リン脂質はグリセロール単位を基にする際には、場合によって
は様々な極性基により誘導化される強力な陰イオン性電荷を有するリン酸基を含
む極性ヘッド、ならびに親水性テイルを構成する2本の脂肪酸からできている。
この極性ヘッドは、リン酸基を介してか、あるいはリン脂質のリン酸上にグラ
フトされたイオン性の基を介してのいずれかで、多糖マトリックスにグラフトさ
れたイオン性の基とのイオン性相互作用によりそれ自体に結合する能力を有する
。
その上、多糖は総体的に親水性の性質を有するが疎水性の溝を有することが知
られており、その溝は、極性ヒドロキシル基が所定の方向に向
いていて、疎水性の性質の炭素−炭素結合からなる糖の基本構造へのアクセスを
可能にするという理由で存在する。
L−タイプのSMBVの核を構成する多糖粒子の場合には、リン脂質のような
化合物の安定化は2つの結合様式の間の共同作用現象に起因することがある。
リン脂質/多糖核の組み合わせは、蛍光エネルギー移動技術により確認するこ
とができる。エネルギー移動の論理は、第一発蛍光団(F1)の放射バンドが第
二発蛍光団(F2)の放射バンドに重なる際に2つの発蛍光団の間に存在する相
互作用に基づく。この2つの構成成分が接近する場合には、発蛍光団F1により
吸収される光量子のエネルギーを発蛍光団F2に移動させることができ、このF
2はその後にはそれが直接励起された場合と同様に蛍光を発するであろう。その
後にF1の蛍光は完全に消滅するまで減少することがある。従って2つの発蛍光
団の間のエネルギー移動効率はそれぞれの空間的間隔に依存する。ローダミンイ
ソチオシアネートを用いて多糖核を、そしてニトロベンゾジアゾール(NBD)
を用いてリン脂質をラベル化した後には、1μm、200nm、もしくは20n
mのL−タイプのSMBVのいずれの場合であってもこの2つの発蛍光団の間に
エネルギー移動を示すことができる。この移動は4℃、37℃、そして100℃
においてさえインキュベーションの後安定であり続ける。
親水性核は数々の方法により取得することができ、そして特に、多糖の性質の
核である場合には、分岐したもしくは直線の生物分解可能な多糖を用いることに
より取得することができる。この多糖は、例えばデンプンもしくはその誘導体の
内の一つであることができる。架橋方法は当
業者に知られており、そしてこれを、エピクロロヒドリンもしくは塩化ホスホリ
ルのような二官能性もしくは三官能性試薬により実施することができる。
外部脂質ラメラの安定化およびイオン性活性成分の被包化のために重要な酸性
もしくは塩基性のイオン性官能基によりその糖を置換することによって多糖の特
性を改変することができる。
親水性活性成分の被包化は合成のこの段階において実施することができる。合
成段階中に取得されるゲルをその後に洗浄し、そして遠心分離技術を例とする手
法により部分的に脱水し、その後に活性成分の存在下に持って行き、そしてゆっ
くりと再水和させる。ゲルが水で膨潤する能力を有するため活性成分は多糖網状
構造内に運ばれ、その網状構造内ではその活性成分はゲル内のグラフトされた基
とイオン結合により固定することができる。
被包化される化合物を含んでいてもいなくても、取得されるゲルは、所望され
るサイズの粒子を取得する目的で機械的に粉砕する必要がある。超粉砕方法は当
該技術分野において既知であり、そして特に、ホモジナイザーを用いる高圧噴出
を伴うことがある。
L−タイプのSMBV内への親水性化合物の被包化は、一般的にはこの段階に
実施される。このためにはこの粒子懸濁液を、凍結乾燥もしくは噴霧のような乾
燥方法を使用することにより事前に乾燥される。
この乾燥粒子を例えば、やはり乾燥形態である活性成分と混合する。漸進的再
水和はゲルの場合と同様に活性成分を溶解し、そしてその後にはそれをその粒子
内に担持することを可能にし、その粒子内ではその活性成分はイオン性結合によ
り固定される。
L−タイプのSMBVの外部脂質ラメラはリン脂質およびセラミドを初めとす
る様々な種類の天然もしくは合成脂質ばかりでなく、ミセルとして整列させるこ
とが可能なイオン性もしくは非イオン性界面活性剤を用いて作成することもでき
、これらに対して、コレステロール、脂肪酸、もしくは油溶性ビタミンのような
脂質化合物もしくは両親媒性化合物のいずれかである他の化合物も添加すること
もできる。
このラメラはリポソームの製造に用いられる方法、すなわち逆相調製法、洗剤
透析、もしくは高圧押出を使用することにより取得することが好ましい。L−タ
イプのSMBVの表面に担持するかもしくは予め存在させる活性成分は、界面活
性剤と混合することでこの段階の間に取り込ませることができる。
本発明の他の主題は、
a)少なくとも一つの塩基性イオン化可能活性成分を、酸性リガンドがグラフト
された架橋親水性マトリックス内に、その活性成分のpKa以下のpHで被包化
すること、
b)溶媒のpHをその活性成分のpKa以上の値に増加させること、
c)前記マトリックスの中心に主に局在する活性成分を含む親水性マトリックス
を回収すること、
を特徴とする粒子状ベクターの調製のための方法である。
実際のところ、親水性核の荷電に適切なプロトコールを選択することで荷電の
トポロジーを調節することが可能になる。
親水性マトリックスは天然にもしくは化学的に架橋結合される多糖もしくはオ
リゴ糖で構成されていることが好ましい。
SMBVと共に使用することができるこの方法は、外部脂質ラメラが
減少しているか(L−タイプのSMBV)、あるいは除去されている(PS−タ
イプのSMBV)粒子を利用することが、先に記載される方法に関してはより具
体的な意味で重要である。本出願人らは、従来の充填方法を用いては、イオン性
活性成分の被包化のためのベクターとして脂質ラメラが減少しているこのような
SMBVを使用することが困難であるとの所見を得た。
実際、活性成分の分子が核の周辺に維持されながらも核の多糖粒子と結合する
場合には、このことにより粒子懸濁液内の不安定性がもたらされることがあり、
活性分子に起因する粒子内結合によりそれらの粒子が相互に凝集する可能性があ
る。この現象は活性粒子の低レベル充填にとっては比較的少規模で済む一方、活
性粒子の高レベル充填にとっては非常に重要になる。同様に、粒子のサイズが非
常に重要である。大きなサイズの粒子(例えば100ナノメーターを上回る大き
さ)に関しては、その粒子の内部容積に対する表面積の比率は非常に低く、この
理由のために被包化される活性成分の総量と比較するとその粒子の周辺に結合す
る活性成分の量は非常に低く、このことが粒子間結合の可能性を制限する。それ
とは対照的に、粒子のサイズが非常に小さい場合にはこの凝集現象は非常に顕著
となる。核にグラフトされた脂肪酸の層を有し、そのために粒子間相互作用から
孤立するように働くSMBVに関してはこの現象は非常に顕著という訳ではない
ことも銘記すべきである。
これを克服する目的で、本出願人らは、被包化のイオン性条件を調節すること
により粒子内への活性成分の侵入をトポロジカルに調節することが可能であるこ
とを見い出した。
多糖核を多電解質マトリックスとして見なすことができ、そしてそれ
らはそれ自体、粒子の内側と外側との間にpH差を有する。この現象は、対イオ
ンの多少は有意な解離、および多糖網状構造上のイオン性官能基の固定化に起因
する。この特性は、内部だけでの被包化、あるいは核の表面もしくは別の場合で
は周辺のみにおける被包化を生じることにより、取り込まれるべき活性成分の局
在化の調節を可能にする。
取り込まれるべき活性成分がそれ自体塩基性である場合には、そのpKa以下
のpHを有する媒体中における可溶性のために活性成分はイオン化形態で存在す
るようになり、そしてそのため活性成分は多糖核上にグラフトされた陰イオン性
の基に付着できるようになる。pHがpKa以上に上昇する場合には、活性成分
は脱イオン化形態をとり、このため活性成分がマトリックスと相互作用すること
ができなくなる。従って、被包化される活性成分の局在化を調節する目的でその
粒子の内側と外側との間に存在するpH差を利用すると、外部媒体が過度に高い
pHを有する場合には活性成分は核の周辺に局在するイオン性の基とは相互作用
することができない。酸性リガンドにより誘導化された核の内部pHが外部pH
よりも低い場合には、脱イオン化形態の粒子内に入り込んでいる活性成分は再度
イオン性となり、そしてそのためL−タイプのSMBVの陰イオン性基に結合す
る。この特異的な事例においては、活性成分は周辺領域を除外してその粒子の中
心にのみ局在するであろう。従って、この種類の被包化は粒子の至適分散にとっ
て非常に好ましい。
酸性の活性成分の場合には、以下に示す、
a)少なくとも一つの酸性イオン化可能な活性成分を、塩基性イオン性リガンド
がグラフトされた架橋親水性マトリックス内に、その活性成分のpKa以上のp
Hで被包化する段階、
b)その媒体のpHを活性成分のpKa以下の値に低下させる段階、
c)前記マトリックスの中心に主に局在する活性成分を含む親水性マトリックス
を回収する段階、
に従って、塩基性リガンドにより誘導化される核を用いる方法を対称的に適用さ
せることが可能である。
多糖核内の活性成分の局在化のトポロジカルな調節を伴うこの種の充填は、外
部脂質ラメラが減少している(L−タイプのSMBV)もしくは除去されている
(PS−タイプのSMBV)SMBVを用いるベクター法の適用にとって特に有
利であるが、充填の程度を増大させるか、あるいは認識単位を例とする、そして
特にアポ蛋白質であるマクロ分子の外部付着の場合には外部リン脂質ラメラの構
造に起因する障害を最小限に抑える目的では、先の特許において既に記載される
SMBVもまた適切でありかつ所望される。
本発明の他の目的はイオン性基がグラフトされた架橋親水性核で構成されてい
る粒子状ベクターであり、そしてこれは本明細書ではPS−タイプのSMBVと
称される。このイオン性基は、例えば、リン酸塩、コハク酸塩、もしくはカルボ
キシメチレートのような陰イオン性の基、あるいは第四級アンモニウムもしくは
アミンを例とする陽イオン性の基であることができる。このPS−タイプのSM
BVのサイズは20nmと200nmとの間であることが好ましい。
架橋親水性核は、天然もしくは化学的に架橋された天然もしくは合成のポリマ
ーで構成することができる。特に、デンプン、デキストラン、セルロース、およ
びそれらの誘導体のような多糖もしくはオリゴ糖を利用する。
活性成分をマトリックスの中央に主に局在するPS−タイプのSMBV内に被
包化すると有利であり、この核の外部部分は実質的には活性成分を欠損しており
、このことにより一般的に小サイズの粒子に生じる凝集現象を回避することが可
能となる。
従って本発明の主題の一つは、活性成分を含む架橋多糖マトリックスで構成さ
れている粒子状ベクターであって、前記活性成分がこのマトリックスの中心に主
に局在することが好ましい。
更に他の態様に従うと、本発明の主題は、懸濁液の形態であることができる完
全なSMBV、PS−タイプのSMBV、もしくはL−タイプのSMBV内に活
性成分を被包化することを可能にする充填方法である。
充填は粒子状ベクター上で実施され、このベクター上には、適切であらば様々
な脂質および/または両親媒性層が固定される。これを行うためには、親水性核
がイオン性の基を含む必要がある。従ってこの方法は以下に示す、
a)イオン性基が固定された架橋親水性核を調製する段階、
b)場合によっては、例えば脂肪酸のような脂質化合物をこの架橋核上に固定し
、そして/または両親媒性ラメラ(例えばリン脂質ラメラ)を、場合によっては
アシル化された核上に形成する段階
c)活性成分をこの活性成分に適するpHで、かつエネルギーを補給しながらこ
のベクター内に充填する段階
d)活性成分を取り込ませてから、そのベクターを回収する段階、
を必要とする。
PS−タイプのSMBVの場合には、イオン性活性成分を取り込ませるために
通常の充填方法を使用することは困難である。トポロジカルな
調節を伴う方法がこの問題を克服することを可能にすることは事実である。しか
しながらトポロジカルな調節は、活性成分とベクターとに適合する必要があるp
Hの厳密な調節を必要とする。
普通のSMBVもしくはL−タイプのSMBVの場合には、今日までに開発さ
れている方法は核内への活性成分の取り込みおよびその後のリン脂質ラメラの形
成を含む。これらの方法は確かに非常に有利な取り込み結果を生じるが、その調
製方法のすべての段階において活性成分を取り扱う必要がある。非常に毒性が強
いか、あるいは非常に高価な活性成分の場合には、これらの方法は安全性もしく
は価格という理由のために推奨することができない。
従って本出願人らは、これらの問題を克服するための別法を開発した。ベクタ
ーの多糖網状構造内にグラフトされたイオン性リガンドが、反対の電荷のイオン
性活性成分への有意な親和性をもたらす。しかしながら取り込みの際には、ベク
ターの凝集を回避し、そして活性成分が主にその粒子内に局在することを可能に
する目的でその親和性を調節する必要がある。予備充填のためにはこの調節はp
Hの厳密な調節もしくは低レベルの取り込みを必要とする。この凝集は大半は表
面上での活性成分の局在化に起因しており、この局在化はそれ自体、粒子表面に
おけるリガンドの存在に起因する。
この新規の種類の充填化を成し遂げるには、
a)活性成分の取り込みを提供する目的での、活性成分のそのベクターに対する
有意な親和性(この親和性は架橋ポリマー内にグラフトされた酸性もしくは塩基
性のイオン性リガンドにより作成され、このリガンドの密度および濃度は活性成
分に従って調節することができる)、
b)凝集を亢進させる粒子間の相互作用を回避させる目的での、取り込みの際の
ベクターの有意な分散(この分散は、粒子間相互作用を減少させるのに十分な濃
度であるばかりでなく、薬剤学的適用法にも適合する濃度の反応培地中でのベク
ターの希釈により提供することができる)、
c)ベクター内への活性成分の侵入を亢進するためのいずれかの方法の使用(撹
拌もしくは加熱を例とする形態でのエネルギーの寄与は活性成分の侵入の速度を
加速させるであろうが、ベクターの分散をも亢進させるであろう。活性成分の適
切な形態は、活性成分を付着させることを可能にするのに十分なイオン性を帯び
ているばかりでなく、表面相互作用を回避する目的で最小電荷状態である必要が
ある)、
という3つの因子を作用させる。
SMBV、あるいはL−タイプもしくはPS−タイプのSMBVについては、
これらの必要条件に相当する取り込みプロトコールを使用することが可能である
。架橋ポリマー内のグラフトされたイオン性リガンドの存在はこれら3つの種へ
の活性成分の付着を提供する。ベクターの分散は水中にPS−タイプのSMBV
を懸濁させることにより実施することができる。SMBVもしくはL−タイプの
SMBVは、アシル化させたもしくはさせていない多糖核、および水性媒体中に
予め分散させてあるリン脂質から調製し、そしてその後にこれを水中に懸濁させ
る。撹拌もしくは加熱の形態を例とするエネルギーの寄与はSMBVに損傷を与
えることがない。pHを変化させ、そしてこの種類の充填化に適合するpH領域
を特定することが可能である。
SMBVおよびL−タイプのSMBVの場合には、脂質および/またはリン脂
質ラメラは活性成分が横断しなければならない障壁を表す。し
かしながら記述される充填化方法においては2つの追加的な因子がこの横断を亢
進させるために介在し、それらは、
a)脂質およびリン脂質ラメラを流動化させ、そしてベクター内への活性成分の
侵入の速度を増加させることができるエネルギーの寄与、
b)ベクターの内側と外側との間に存在する濃度勾配の存在に起因して非常に弱
いイオン性を示すことがある活性成分の形態、
である。
加えて、活性成分と架橋多電解質ポリマーとの間の強力な親和性が活性成分の
連結を提供し、そして強度の分散がベクター同士の凝集を回避させる。
この新規の方法は、元のベクターのサイズを保持しながらも活性成分が充填さ
れるいずれかの種類のSMBVを調製することを可能にし、そして多くの利点を
有する。この方法は取り込み前の活性成分を伴わない空のベクターを調製するこ
とであり、このことによりベクターに適し、そして活性成分に依存しない条件に
従って空のベクターを処理し、そしてその後に充填を行うことが可能になる。従
って、これらの条件は多少徹底したものであることがある。これらはまた、元の
実体として空のベクターの特徴決定を行うことを可能にもする。
取り込み段階はこの方法の最終段階であり、これは毒性を示しそして高価であ
ることが可能な活性成分をこの方法の内の唯一の段階で取り扱うようにする。従
ってこの方法は、活性成分の取り扱いおよび可能な損失を減少させる。そのため
、この方法は安全性に関してより確実であるばかりでなく、より有益であること
可能にする。
その上幾つかの活性成分にとっては、取り込み条件は比較的単純であ
ることがあり、このことは使用時にその活性成分でベクターを充填するという企
画を可能にする。使用時における調製の方法は、液体状態での保存の問題を排除
することができる。
この新規の充填方法は、ベクターとイオン性活性成分との間の有意な親和性ば
かりでなく、ベクターおよびイオン性形態の活性成分の分散による取り込みの単
純な調節にも基づいている。この方法は、活性成分に依存しない空のベクターの
調製、単一段階のみにおける活性成分の取り扱い、および使用時の調製の可能性
、という非常に立派な利点を有している。
本発明の他の主題は、内側から外側にかけて、イオン化可能な活性成分を含む
架橋多糖マトリックス、共有結合によりそのマトリックスに固定される第一脂質
層、および蛋白質もしくはペプチド分子が場合によってはグラフトされている両
親媒性化合物の第二層を含む粒子状ベクターである。
本発明に従う粒子状ベクターは、10nmと5μmとの間の直径、およびより
好ましくは20nmと70nmとの間の直径を有することが好ましい。
これらの粒子状ベクターは、生物学的活性を保持する一つもしくは複数の分子
をその表面に担持するかもしくはそれがその表面に存在することを意図する。こ
れらの分子は中でも、
− 抗生物質および抗ウイルス剤、
− 蛋白質、プロテオグリカン、ペプチド、
− 多糖、リポ多糖、
− 抗体、
− 抗原、
− 殺虫剤および殺カビ剤、
− 心臓血管系に作用する化合物、
− 抗癌剤、
− 抗マラリア剤、
− 喘息薬、
− 皮膚における効果を有する化合物、
− 乳製品の脂質小球体の構成成分、
を記載する必要があるが、このリストは制限ではない。
以下の実施例においては、それらの特徴に従う様々な製品の充填化の記載がな
され、そしてそれらは具体的には、
− 全身投与を意図する小サイズの親水性製品、
− 抗癌活性を保持する活性成分の製品、
− 抗菌活性を保持する2つの酵素、ラクトパーオキシダーゼおよびグルコー
スオキシダーゼの製品、
− 酸化防止剤活性を保持するプロシアニドール(procyanidol)
オリゴマーからなる植物抽出物の製品、
− 牛乳の脂肪小球体の構成成分からなる製品、
である。
グラフトされた脂肪酸のコロナを有するSMBVと同様に、L−タイプのSM
BVを濾過もしくはオートクレーブ処理のいずれかにより安定化させることがで
きる。これらはまた、例えば添加物の存在下で凍結もしくは凍結乾燥を行うか、
あるいは別法では噴霧することもできる。
L−タイプもしくはPS−タイプのSMBVの利点は、具体的には、
− 担持もしくは存在すべき産物への適用を可能にするモジュラー式構造法、
− リポ蛋白質もしくは乳製品の脂質小球体のような天然の構造に関する生物
模倣性、
− 脂肪酸コロナを含むSMBVに関する合成および産業化のより高い簡便性
、
− 核の高分子構造に起因する高い化学的安定性および熱安定性、
− 特定のサイズおよび非常に小さいサイズ(20nm)を均一に取得するこ
との可能性、
− 核内に被包化される化合物、および具体的には酵素もしくは酸化防止剤化
合物を安定化させるそれらの能力、
である。
従って本発明の主題は、本発明に従う粒子状ベクターおよびその投与のための
薬剤学的に許容される支持体を含むことを特徴とする薬剤学的組成物である。本
発明に従うベクターは、具体的には、治療および免疫学的適用法に有用である。
本発明の他の主題は、既述の粒子状ベクターおよび化粧品学的に許容される賦
形剤を含むことを特徴とする化粧品学的組成物である。
最後に、本発明に従う粒子状ベクターを含む食品組成物が本発明の一部分を形
成する。
以下の実施例は本発明の範囲を制限することなく本発明を詳細に説明すること
が意図される。
これらの実施例においては、以下の図に対する引用が行われるであろう。
図1:2種類の蛍光リガンドでラベル化されるL−タイプのSMBVにおけるエ
ネルギー移動。多糖核をローダミンを用いてラベル化し、そしてリン脂質層をN
BDを用いてラベル化する。
図2:ローダミンを用いてラベル化されるPS−タイプのSMBVとNBDを用
いてラベル化されるリポソームとの間のエネルギー移動。
図3:2種類の蛍光リガンドでラベル化されるSMBVについてのエネルギー移
動。アシル化させた核をローダミンを用いてラベル化し、そしてリン脂質層をN
BDを用いてラベル化する。
実施例1:塩化ホスホリルによるデキストリンの二重架橋結合による平均直径2
0ナノメーターの多糖粒子の調製
100gのデキストリン(Roquette社)を3リットルのジャケット形
反応器内に導入し、そして350mlの脱イオン水および100mlの10N水
酸化ナトリウムに溶解する。
均一化後に35.3mlのPOCl3および225mlの10N水酸化ナトリ
ウムを同時に添加する。
反応物の添加終了後に、この反応混合物を更に15分間撹拌し、そしてその後
に塩酸の添加により中和する。
このゲルを2リットルの脱イオン水中に希釈し、そして高圧ホモジナイザー(
Westfalia社)を使用して900バール下で均質化する。この段階は平
均直径20nmのマトリックスを取得することを可能にする。
このマトリックスをその後に塩を除去する目的のエタノールでの沈殿により洗
浄し、そしてその後に30g/lのマトリックスおよび20g/lの重炭酸アン
モニウムの濃度での凍結乾燥により乾燥させる。
75gの凍結乾燥化マトリックスが回収される(反応収率75%)。
実施例2:陽イオン性第四級アンモニウム基がグラフトされた多糖マトリックス
の調製
200グラムのアミロペクチン(Roquette社、Lille、Fr.)
を5リットルの反応器内の500ミリリットルの2N水酸化ナトリウム中に分散
させる。この溶液が良好に均一化された時点で、0.5等量/グルコース残基に
相当し、150ミリリットルの水中に溶解される93.6グラムの塩化グリシジ
ルトリメチルアンモニウム(Fluka社、CH)、および0.1等量/グルコ
ース残基に相当する11.4グラム(すなわち9.7ミリリットル)のエピクロ
ロヒドリン(Fluka社、CH)を同時に導入する。この混合物を1〜2時間
均一化させ、そしてその後に8時間放置する。重合化したデンプン調製物をその
後に酢酸の添加によりpH6にする。得られるゲルはその後に、全ての塩および
反応副産物が除去されるまで蒸留水で複数回洗浄する。
凍結乾燥後に244グラムの架橋ゲルが取得され、これはすなわち反応収率8
0%である。
実施例3:カルボキシメチルタイプ(「CM−タイプ」)の陰イオン性の基がグ
ラフトされた多糖マトリックスの調製
200グラムのデキストリン(Roquette社)を5リットルの反応器内
の300ミリリットルの7N水酸化ナトリウムに溶解する。この溶液が良好に均
質化された時点で、0.1等量/グルコース残基に相当する9.6ミリリットル
のエピクロロヒドリン(Fluka社、CH)および80ミリリットルの水中に
溶解される117.2グラムの塩酸を同時に導入する。
1時間の撹拌後、9.6ミリリットルのエピクロロヒドリンおよび150ミリ
リットルの20N水酸化ナトリウムを激しく撹拌しながら添加する。添加終了後
にこの調製物を6時間均一化させ、そしてその後に一晩放置する。このようにし
て得られるゲルを1リットルの水に懸濁させ、そして2Nの塩酸の添加によりp
H3〜4に酸性化する。その後にこのゲルを濾過し、そして蒸留水で洗浄する。
凍結乾燥後に276グラムのカルボキシメチルタイプのゲルが取得され、これは
すなわち80%を上回る収率である。
実施例4:塩化ホスホリルによるデンプンの架橋化による平均直径1μmの親水
性マトリックスの調製
100gの小麦デンプン(Roquette社)を3リットルのジャケット形
反応器内に導入し、そして375mlの脱イオン水および100mlの10N水
酸化ナトリウムに溶解する。
この混合物を15分間室温で撹拌する。
この混合物が均一化されたら、11mlのPOCl3および50mlの10N
水酸化ナトリウムを同時に添加する。これらの反応物の添加終了後にこの混合物
を更に15分間撹拌し、そしてその後に酢酸の添加によりpH7に中和する。
このゲルは蒸留水を用いて30分間遠心機(Rousselet社)内で洗浄
して余剰な塩および反応副産物を除去する。
このようにして取得されるゲルをその後に高圧下(500バール、Westf
alia社のミニラボ(minilab)ホモジナイザー)で均一化する。この
段階は平均サイズ1μmのマトリックスを取得することを可能にする。自動滴定
機(Methrom 682 タイトロプロ
セッサー(titroprocessor))を用いる1gの架橋結合化ゲルの
滴定により、架橋結合化ゲルのグラム当たり0.3モル等量(meq)のホスホ
ジエステル官能基の架橋結合の度合いが示される。
直径1μmのPS−タイプのSMBVはこのようにして取得される。
実施例5:200ナノメーターのイオン性多糖粒子の生成
実施例2に従って取得されるゲルもしくは実施例3に従って取得されるCM−
タイプのゲルの15グラムを500ミリリットルの蒸留水中に分散させ、そして
ラニーミニラボ(Rannie MiniLab)12−51ホモジナイザー(
APV Rannie社、Copenhagen、DK)により均一化する。適
用させる均一化圧は600バールを12分間である。
塩基性もしくは酸性架橋多糖粒子の液体懸濁液が取得され、カルターN4MD
ナノサイザー(Coulter N4MD Nanosizer)で測定される
粒子サイズは200ナノメーター付近に集中する。このナノ粒子をその後に20
グラム/リットルの重炭酸アンモニウムの存在下での凍結乾燥により乾燥させる
。直径200nmのPS−タイプのSMBVはこのようにして取得され、これを
そのまま、もしくはL−タイプのSMBVに変換させて使用することができる。
実施例6:20ナノメーターの粒子からのL−タイプのSMBVの調製空のL−
タイプのSMBVの調製
10mgの20−nm多糖核を2mlの50mMのオクチルグルコピラノシド
OGP(Fluka社)中に分散させる。これらを超音波下で、2mlの50
mM OGP内に分散される精製卵黄レシチン(Sigma社)とコレステロー
ル(Sigma社)との80/20混合物の
溶液10mgと混合する。その後にこの調製物を超音波下で急激に5mMの最終
OGP質量モル濃度に希釈し、そしてその後に48時間長期的に透析する。サイ
ズの分析はカルターN4ナノサイザー(Coulter N4 Nanosiz
er)を用いて実施し、97%の粒子が23nmの直径を有することが示される
。
実施例7:20ナノメーターのL−タイプのSMBV上でのエネルギー移動によ
る特性決定
A− 蛍光によりラベル化されるL−タイプのSMBVの調製
a− ローダミン(λ ex540nm−λ ex580nm)でラベル化さ
れる多糖核の調製
実施例6に従って調製される50mgの20−nm多糖核を1mlの100m
M、pH10の重炭酸ナトリウム(Sigma社)中に分散させる。ジメチルホ
ルムアミド(SDS)中に溶解される0.5mgのローダミンBイソチオシアン
酸エステル(Sigma社)を添加するが、これはすなわち多糖核の重量に関し
て1%のローダミンである。室温での18時間の撹拌後、未反応のローダミンを
除去する目的でエタノールでの複数回の洗浄を実施する。その後にこの核を凍結
乾燥により乾燥する。
b− ニトロベンゾジアゾール(NBD)(λ ex470nm−λ ex5
30nm)でラベル化されるリン脂質ラメラの形成
*蛍光多糖核から
ローダミンイソチオシアン酸エステルを用いてラベル化される20nmの核の
10mgを2mlの50mMのオクチルグルコピラノシド OPG(Fluka
社)の存在下で分散させる。2mlの50mM OG
P中に分散される精製卵黄レシチン(Sigma社)、コレステロール(Sig
ma社)、およびホスファチジルエタノールアミンのニトロベンゾジアゾール
NBD(Sigma社)でラベル化される10mgの79/20/1混合物をそ
の後にその懸濁液中に導入するが、これはすなわち多糖核に関して100%のリ
ン脂質混合物である。この溶液をその後に超音波下で急激に5mMの最終OGP
質量モル濃度に希釈し、そしてその後に48時間長期的に透析する。
*非蛍光多糖核から
L−タイプのSMBVを非蛍光多糖核以外は同一の様式で調製する。この調製
物を対照として使用し、これはエネルギー移動のゼロレベルを表す。
B− 対照蛍光多糖核の調製:PS−タイプのSMBV
10mgの20−nm蛍光核を2mlの50mM OGPの存在下に分散させ
る。この溶液をその後に超音波下で急激に5mMの最終OGP質量モル濃度に希
釈し、そしてその後に48時間長期的に透析する。
C− 対照蛍光リポソームの調製
10mgの先のリン脂質混合物を2mlの50mM OGP中に分散させる。
この溶液を超音波下で急激に5mMの最終OGP質量モル濃度に希釈し、そして
その後に48時間長期的に透析する。
D− 対照SMBVの調製
2種類の蛍光リガンドでラベル化させるSMBV(ローダミンを用いてラベル
化されるアシル化核およびNBDを用いてラベル化されるリン脂質)、ならびに
非蛍光アシル化核およびNBDを用いてラベル化されるリン脂質層を保持するS
MBVを先の特許(欧州特許第344,04
0号)内に記載される方法に従って調製した。
このエネルギー移動はNBDの蛍光(530nmの放射波長)の減少により定
量化される。リン脂質層のみが蛍光的にラベル化されるL−タイプのSMBVに
関しては、2種類の蛍光リガンドでラベル化されるL−タイプのSMBVにおい
て20%の蛍光エネルギー移動が示された(図1)。この移動は4℃での4時間
のインキュベーション後、ならびに100℃での2時間のインキュベーション後
にも安定のままである。このことは、リン脂質および多糖核は空間的に近接して
いることを示すのに役立つ。密接なリン脂質/多糖核の組み合わせが確認される
。対照蛍光多糖核(PS−タイプのSMBV)と対照蛍光リポソームとの単純な
混合化では先のインキュベーション条件下であっても2つの発蛍光団の間のエネ
ルギー移動は生じない。
L−タイプのSMBVについて観察されるこのエネルギー移動は、同じ実験条
件下でのSMBVについて観察されるエネルギー移動に矛盾しない(図3)。
実施例8:200ナノメーターの多糖粒子からのL−タイプのSMBVの調製
実施例5に従って調製されるPS−タイプのSMBVの10グラムを500ミ
リリットルの蒸留水中に分散させ、そして300バールの圧力下、10リットル
/時間の流速でのラニーミニラボ(Rannie MiniLab)12−51
ホモジナイザー(APV Rannie社、Copenhagen、DK)内に
入れる。0.5グラムの水素化ダイズホスファチジルコリン(Natterma
nn社、Fr.)をホモジナイザー内に循環される懸濁液中に直接注入する。こ
の調製物を12分
間均一化する。
得られる懸濁液は分散される約200nmのL−タイプのSMBVを含む。
実施例9:実施例4に従って調製される親水性マトリックスの表面への牛乳の蛋
白質およびリン脂質構成成分の付着
実施例4に従って調製される親水性マトリックス100gを3リットルのミキ
サー内に入れる。10gの蛋白質およびリン脂質構成成分を添加する。
1リットルの水を累進的に、かつ撹拌しながら添加する。
この全混合物を80L/時間の割合および200バール下で均一化する(We
stfalia社のホモジナイザー)。
クリーム状の調製物が取得され、これは遊離の蛋白質およびリン脂質構成成分
をほとんど含んでおらず、そして2つの対照実験を蛋白質およびリン脂質構成成
分のみを用いて実施する。対照(No.1)および調製物を遠心分離する。未遠
心対照、遠心した対照の上清、および調製物の上清中の蛋白質のレベルをブラッ
ドフォード(Bradford)法により測定する。分析は100mlについて
実施する。0.5gの蛋白質が遠心した対照の上清中に測定され、そして0.0
5gが調製物の上清中に測定される。これらの結果から、対照No.1の遠心物
中に存在する蛋白質の量が演繹され、これはすなわち0.05gであり、そして
その結果、親水性マトリックスに結合した蛋白質量はすなわち0.4gである。
連結される蛋白質のパーセンテージは最初に取り込まれる蛋白質の量に関して
80%である。
その上、この調製物の遠心物を乾燥させ、そしてその後にクロロホルムでの濾
過により洗浄してリン脂質を抽出する。その後にクロロホルムを蒸発させ、そし
て残存するリン脂質の重量測定を行う。測定により0.4gが示され、これはつ
まり最初に取り込まれるリン脂質構成成分の量に関して80%である。
実施例10:L−タイプのSMBV内への酵素グルコースオキシダーゼ(GO)
の取り込み
グルコースオキシダーゼ(GO)は3.5の等電点および180,000ダル
トンの平均分子量を有する酸性蛋白質である。
実施例2およびその後に実施例5に従って取得されるQAE−タイプの核0.
3グラムならびに0.6グラムのGOを乾燥状態で混合する。この混合物をその
後に、GOのpI以上のpH7の緩衝液1.5ミリリットルの添加により、室温
で撹拌しながら累進的に水和させ、そしてその後に冷蔵庫内(4℃)で一晩撹拌
させたままにする。その後にpHをGOのpI以下の3に調節し、そして追加的
に30分間インキュベートする。その後にこの調製物を48.5ミリリットルの
蒸留水中に分散させ、pHを7に調節し、そして重炭酸アンモニウムの存在下で
凍結乾燥する。このようにして取得されるGOが充填される核を粉末の水素化ダ
イズホスファチジルコリン(Nattermann社、Fr.)0.15グラム
と混合する。この混合物を150ミリリットルの蒸留水で水和し、そしてラニー
ミニラボ(Rannie MiniLab)12−51ホモジナイザー(APV
Rannie社、Copenhagen、DK)内、300バールの圧力下で
均一化する。GOが充填されるL−タイプのSMBVはこのように取得され、懸
濁液の限外濾過後に278nmの
UVにより定量的に決定したところ、被包化収率は92%であり、そして核の重
量に関して184%の取り込み度合いである。
実施例11:PS−タイプのSMBV内への酵素ラクトパーオキシダーゼ(LP
)の取り込み
ラクトパーオキシダーゼ(LP)は抗菌性の酵素である。これは9.6の等電
点および約80,000ダルトンの平均分子量を有する塩基性蛋白質である。
実施例3およびその後に実施例5に従って取得される陰イオン性(CM)のP
S−タイプのSMBVの0.5グラムを、250mlの丸底フラスコ内のLPの
pI以下のpH7に調節される緩衝液100ミリリットル中に懸濁させる。1ミ
リリットルの水に溶解される0.5gのLP(BioSerae社)をその後に
撹拌しながら導入する。
この混合物を冷蔵庫(4℃)内で一晩撹拌する。その後にpHをLPのpI以
上の9.8に調節し、そして30分間インキュベートする。その後にpHを7に
戻し、そしてその後にこの懸濁液を重炭酸アンモニウム(20グラム/リットル
)の存在下で凍結乾燥する。LPが充填されるPS−タイプのSMBVは412
nmのUVによる定量的決定から、99%の充填化収率および核の重量に関して
99%の取り込み度合いで取得される。
実施例12:PS−タイプのSMBV内に被包化されるLPとL−タイプのSM
BV内に被包化されるGOとの混合物の抗菌活性
*インビトロでの定量的な活性の決定
1mlの1Mグルコース溶液、0.2mlのオルト−フェニレンジアミン溶液
(クエン酸緩衝液中の1mg/ml、pH5.6、10mM濃
度)、および1.6mlのクエン酸緩衝溶液(10mM、pH5.6)を混合す
る。
その上、実施例11に従って調製されるラクトパーオキシダーゼを含む0.2
mgのPS−タイプのSMBV、および実施例10に従って調製されるグルコー
スオキシダーゼを含む1.8mgのL−タイプのSMBVを1mlの水中で混合
する。
この懸濁液の0.2mlを先に調製される2.8mlに添加し、そして撹拌を
室温で2分間実施する。
展開される発色反応を1mlの2N硫酸で停止させ、そしてその発色を、SM
BVを含まないブランクに対して490nmで計測する。
強い輝度の発色の存在は、L−タイプのSMBV内に被包化される2つの酵素
がそれぞれの活性を保持することを示す。被包化される酵素の活性の定量的測定
は、同一条件下での水溶液中の酵素で取得されるものに匹敵する結果を生じる。
*大腸菌(Escherichia coli)のある株に対する抗菌活性
ゲロースアガー(gelose agar)と混合させたLBグルコース培養
培地を調製し、そして耐性記録用皿内に注ぎ入れる。大腸菌(E. coli)
の株を200μl/皿の率でゲロースの表面に接種する。被包化させた酵素もし
くは被包化させていない酵素を滅菌した濾紙ディスクに染み込ませ、そして接種
させた皿のゲロース上に乗せる。この皿を24時間、37℃でインキュベートさ
せたままにし、そしてディスク周辺の阻害直径を測定する。
ディスクに0.05mg/mlから10.6mg/mlまで変化する
酵素濃度のLPおよび0.8mg/mlから10mg/mlまで変化する酵素濃
度のGOを染み込ませた。阻害直径は12mmから20mmまで変化し、そして
これは酵素が被包化されていてもいなくても同程度である。
実施例13:SMBV内に被包化される酵素の抗菌活性の安定化
グルコースオキシダーゼの3つのバッチを調製した。バッチ1は0.2mg/
mlのGO水溶液で構成され、バッチ2は先の特許に従って調製されるSMBV
中に被包化され、粒子の重量に関しては200%の被包化の度合いを有するGO
の水性懸濁液(そしてこの懸濁液中ではGO濃度は0.2mg/mlである)で
構成され、そしてバッチ3は実施例10に従うL−タイプのSMBV中に被包化
されるGOの水性懸濁液(そしてこの懸濁液中でもGO濃度は0.2mg/ml
である)で構成される。
これらの3つの懸濁液を4℃に放置し、そして毎週そしてその後には毎月、実
施例12に記載される方法により定量的決定を行う。GO溶液の活性は時間と共
に減少し、そして250日後にはゼロになる。それとは対照的に、SMBVもし
くはL−タイプのSMBVのいずれかの中に被包化されるGOの2つの懸濁液の
活性は定常状態に落ち着いており、そして320日後にも当初の活性の100%
に等しいままである。
その上、0.1mg/mlのラクトパーオキシダーゼ水溶液、ならびに実施例
11に従って調製されるPS−タイプのSMBV中に被包化され、そしてLP濃
度がやはり0.1mg/mlであるLPの懸濁液も調製する。
これらの2つの懸濁液を4℃に放置し、そして毎週そしてその後には
毎月、実施例12に記載される方法により定量的決定を行う。LP溶液の活性は
時間と共に減少し、そして90日後では当初の活性の35%に過ぎないものとな
る。それとは対照的に、PS−タイプのSMBV内に被包化されるLPの懸濁液
の活性は定常状態に落ち着いており、そして90日後にも当初の活性の100%
に等しいままである。
実施例14:L−タイプもしくは完全なSMBV中のプロシアニドールオリゴマ
ー(PCO)の取り込み
A− 第四級アンモニウムタイプのゲル内へのPCOの取り込み
プロシアニドールオリゴマー(PCO)は加水分解可能なタンニン一族(フラ
ボノイド類)の酸化防止剤である。これらは遊離ラジカルを駆除するための特性
を有する。それらの平均分子量は約2000ダルトンである。これらは7以下の
pHで水に可溶性となる。
5グラムのPCOを最低量の蒸留水(約5ミリリットル)に溶解し、そして実
施例2に従って調製される第四級アンモニウムタイプのゲル10グラムを取り込
ませる。この混合物を、均一なペーストを取得する目的でPCOの平均pKa以
上のpH6の緩衝液の180ミリリットルで撹拌しながら水和させる。この混合
物を一晩撹拌させたままにする。その後にpHをPCOの平均pKa以下の3.
5にもってゆき、30分間撹拌しながらインキュベートしたままにさせ、そして
その後に遊離のPCOを除去する目的で遠心分離により蒸留水で洗浄する。この
懸濁液中の遊離のPCOの量を280nmのUVにより定量的に決定する。82
%の披包化収率およびゲルの重量に関する41%の充填の度合いが得られる。
この充填化ゲルをその後に500ミリリットルの蒸留水中に分散させ、
そしてラニーミニラボ(Rannie Mini Lab)12−51ホモジナ
イザー(APV Rannie社、Copenhagen、DK)内、600バ
ールの圧力下で15分間、10リットル/時間のUV流速で均一化する。200
nm付近に集中するサイズであってPCOで充填されるPS−タイプのSMBV
の懸濁液が取得される。
B− PCOが充填される200nmのL−タイプのSMBVの産生
先に取得されるPS−タイプのSMBV懸濁液を300バールの圧力下でラニ
ー ミニラボ(Rannie Mini Lab)12−51ホモジナイザー内
に入れる。
0.5グラムの水素化ダイズホスファチジルコリン(Nattermann社
、Fr.)をその後には300バールの圧力下でのホモジナイザー内で再循環し
ている懸濁液内に直接注入し、そして均一化を10リットル/時間の流速で12
時間実施する。取得される懸濁液は約200nmの分散粒子を含む。
C− PCOが充填される200nmの「完全な」SMBVの産生
「完全な」SMBVは、PCOが充填されるPS−タイプのSMBVによって
、乾燥化(凍結乾燥)、有機溶媒中の部位選択的アシル化、および外部リン脂質
ラメラの形成により既述のように調製される。
D− L−タイプのSMBV内のプロシアニドールオリゴマー(PCO)の安定
化
油中水型の種類の乳液を調製し、そしてこれを3つのバッチに分割する。PC
Oを0.05%の最終濃度で第一バッチに取り込ませる。L−タイプのSMBV
中に被包化されるPCOを第二バッチに取り込ませ、そして「完全な」SMBV
中に被包化されるPCOを第三バッチに取り
込ませる。PCO中のこれらの後二つのバッチの最終濃度もやはり0.05%で
ある。これらの3つの乳液は均一な乳白色を有する。
この3つのバッチの各々の試料をUVランプ(254nm)下に48時間置き
、そしてその後に遮光放置する。10日後、遊離のPCOを含む乳液は非常に強
い輝度の茶色を有し、L−タイプのSMBV内に被包化されるPCOを含む乳液
はやや強い輝度の乳白色を有する一方で、「完全な」SMBV中に被包化される
PCOを含む乳液は変化を示さなかった。
同じ様式で3つの乳液中のPCOの安定性を40℃で6カ月間にわたり検査す
る。「完全な」SMBV中に被包化されるPCOを含むクリーム状物は発色にお
いて有意には変化せず、L−タイプのSMBV内に被包化されるPCOを含むも
のはややより強い輝度の色を有する一方で、遊離のPCOを含むものは茶色味を
帯びるようになる。
実施例15:トポロジカルな調節による充填方法を用いることによるL−タイプ
のSMBV中への抗癌性抗生物質ドキソルビシンの取り込み
ドキソルビシンはアントラサイクリン一族に属する抗癌性抗生物質である。ド
キソルビシンは、その分子に特徴的な蛍光特性を付与するポリ芳香族性アグリコ
ン、ならびにアミノ糖ダウノサミンを特徴とする両親媒性産物である。塩酸物の
分子量は580であり、そしてそのpKaは8.5である。
先のように調製される多糖核を用いる。
1− トポロジカルな調節を伴わないドキソルビシンの取り込み
水溶液中のドキソルビシン(0.1g)を磁石撹拌を行いながら多糖核(0.
5g)に累進的に添加する。得られる懸濁液をその後に室温で
17時間、撹拌しながら遮光放置する。
このようにしてドキソルビシンが充填される多糖核は完全に沈殿した。セッケ
ンおよびリン脂質の存在下であってもこれらは20nmのサイズで正しく分散す
ることができない。
トポロジカルな調節を伴わないドキソルビシンの取り込みにより多糖核の完全
凝集がもたらされ、そしてこれを20nmのL−タイプのSMBVを形成するの
に用いることはできない。
2− トポロジカルな調節を伴うドキソルビシンの取り込み
水溶液中のドキソルビシン(0.1g)を磁石撹拌を行いながら多糖核(0.
5g)に累進的に添加する。pHは、添加中にドキソルビシンのpKa以下の7
に調節する。得られる懸濁液を室温で17時間、遮光撹拌する。その後にpHを
ドキソルビシンのpKa以上の9に調節し、そして30分間インキュベートする
。多糖核の懸濁液をその後に2つに分割し、一つの部分を多糖核として分析し、
そしてその多糖核のもう一方の部分をL−タイプのSMBVとして調製する。
a− PS−タイプのSMBV
pH9におけるインキュベーション段階後、得られる懸濁液を1Lの水に希釈
し、そしてpH7にする。このように充填される核を分析すると、0.2μmを
通すその懸濁液の濾過により95%を上回るドキソルビシンの収率が示され、こ
のことはこの多糖核のサイズが20nmであることを示し、そして上清のアリコ
ートの遠心式限外濾過により遊離のドキソルビシンの不在が証明される。この結
果は限外濾過物中の4mgのドキソルビシンおよび多糖核中の46mgのドキソ
ルビシンの存在を示し、これは92%の収率およびドキソルビシンの内の18%
の被包化
の度合いに相当する。0.2μmを通す得られる懸濁液の濾過により95%を上
回る収率が示され、これはSMBVのサイズが20nmであることを示す。
b− L−タイプのSMBV
多糖核をその後に10g/Lの濃度で50mMのヘカメグ(hecameg)
中に予め分散させてあるリン脂質(0.25g)(80/20のEYPC/コレ
ステロール重量比)と共に分散させる。得られる懸濁液を急激に1Lの水に希釈
する。その後に洗剤を限外濾過により除去する。その後に限外濾過物中および得
られるSMBV中のドキソルビシンを定量的に決定する。この結果により、限外
濾過物中の2.5mgのドキソルビシンおよびSMBV中の47.5mgのドキ
ソルビシンの存在が示され、これは95%のドキソルビシン収率および多糖核に
関する19%のドキソルビシンの被包化の度合いに相当する。0.2μmを通す
得られる懸濁液の濾過により95%を上回る収率が示され、これはSMBVのサ
イズが20nmであることを示す。
実施例16:多糖核中のドキソルビシンの後充填
ドキソルビシンはアントラサイクリン一族に属する抗癌性抗生物質である。ド
キソルビシンは、その分子に特徴的な蛍光特性を付与するポリ芳香族性アグリコ
ン、ならびにアミノ糖ダウノサミンを特徴とする両親媒性産物である。塩酸物の
分子量は580であり、そしてそのpKaは8.2〜8.5である。
*多糖核中へのドキソルビシンの取り込み
用いられる多糖核を架橋結合化させ、かつPOCI3により官能基付加を施し
てあり、そして20nmのサイズを有する。これらのイオン強
度は1.59モル等量のPO4/gである。
多糖核(10mg)を超音波下で水(10ml)中に分散させる。この核懸濁
液のpHを0.1NのNaOHで7に調節する。水中の5mg/ml溶液として
のドキソルビシン(4.6mg)を、20μlづつ超音波処理を施しながらゆっ
くりと添加する。必要であらば、0.1NのNaOHでpHを7に調節する。
このように充填される多糖核は、
− 0.2μmを通して濾過される能力:濾過収率は濾過後および濾過前の濃度
の比率により決定される。取り込み後には、充填される多糖核の懸濁液100μ
Lをドキソルビシン濃度を決定する目的で取り出す。残りの懸濁液を0.2μm
の気孔率の膜を通して濾過する。100μlのアリコートを、ドキソルビシンの
定量的決定のために再度取り出す。ドキソルビシンは多糖核の放出後にHPLC
により定量的に決定する。
− 遠心式限外濾過により決定される未取り込みの分画。濾過後には、1/2に
希釈してある多糖核の懸濁液1mlを遠心式限外濾過系(Microsep社)
上に置き、そしてその後に7500gで30分間遠心する。得られる限外濾過物
は、HPLCによるドキソルビシンについての定量的測定を行う。
濾過収率は97%であり、そして未取り込みの分画は5%より少なく、これに
より取り込み収率が99%であることが導かれる。
*多糖核内およびSMBV内に取り込まれるドキソルビシンの生理学的条件下で
の挙動の比較
ドキソルビシン、ポリ多糖核、もしくはSMBV内に後充填される粒子を50
μg/mlのドキソルビシン濃度で37℃下、PBS中でインキュベートする。
0時間目および4時間目に1mlの粒子懸濁液を取り出し、そして放出されるド
キソルビシン分画を決定する目的でミクロセップ(Microsep)で遠心す
る(7500g、30分)ことによる限外濾過を行う。得られる限外濾過物はそ
の後に、HPLCによりドキソルビシンについての定量的測定を行う。結果を以
下の表に示す。
後充填によりドキソルビシンを取り込ませてある多糖核およびSMBVの生理学
的条件下での挙動
得られる結果はこれらの2種類の粒子中に取り込まれるドキソルビシンの挙動
における差を示し、ドキソルビシンはSMBV中と比較すると多糖核内に取り込
まれた状態をより強く保つ。
実施例17:SMBV中のドキソルビシンの後充填
*SMBV(L−タイプもしくはそうでないもの)中へのドキソルビシンの取り
込み
SMBVは、リン脂質ラメラ(100重量%)を洗剤法により形成す
るアシル化核から調製される。
簡潔に述べると、80/20のEYPC/コレステロール(重量比)の組成を
伴うリン脂質(10ml)を50nMのヘカメグ(2ml)中に分散させる。ア
シル化核(10mg)をこのリン脂質に添加し、そして5分間超音波浴に供する
。得られる懸濁液を蒸留水8ml中に希釈して20nMであるヘカメグのCMC
以下にさせ、そしてその後に長期的に透析する。得られるSMBVを0.2μm
lを通して濾過し、そして滅菌条件下に保存する。
L−タイプのSMBVは、アシル化核の代わりに多糖核を用いることによると
いうことを除外しては同一のプロトコールに従って調製する。
SMBV(20mg)懸濁液のpHを、0.1NのNaOHで7に調節する。
水中の5mg/ml溶液としてのドキソルビシン(4.6mg)を20μlづつ
超音波処理しながらゆっくりと添加する。必要であらばこのpHを0.1NのN
aOHで7に調節する。
このようにして充填されるSMBVは、
− 0.2μmを通して濾過される能力:濾過収率は濾過後および濾過前の濃度
の比率により決定される。取り込み後には、充填されるSMBVの懸濁液100
μlをドキソルビシン濃度を決定する目的で取り出す。残りの懸濁液を0.2μ
mの気孔率の膜を通して濾過する。100μlのアリコートを、ドキソルビシン
の定量的決定のために再度取り出す。ドキソルビシンは多糖核の放出後にHPL
Cにより定量的に測定する。
− 遠心式限外濾過により決定される未取り込みの分画。濾過後には、
1/2に希釈してあるSMBVの懸濁液1mlを遠心式限外濾過系(Micro
sep社)上に置き、そしてその後に7500gで30分間遠心する。得られる
限外濾過物は、HPLCによるドキソルビシンについての定量的測定を行う。
濾過収率は95%であり、そして未取り込みの分画は5%より少なく、これに
より取り込まれた収率が99%であることが導かれる。
*L−タイプのSMBV中に取り込まれるドキソルビシンの生理学的条件下での
挙動
ドキソルビシン、L−タイプのSMBV、もしくはSMBVを後充填させてあ
る粒子を、50μg/mlのドキソルビシン濃度で37℃下、PBS中でインキ
ュベートする。0時間目および4時間目に1mlの粒子懸濁液を取り出し、そし
て放出されるドキソルビシン分画を決定する目的でミクロセップ(Micros
ep)上で遠心する(7500g、30分)ことによる限外濾過を行う。得られ
る限外濾過物はその後に、HPLCによるドキソルビシンについての定量的測定
を行う。結果を以下の表に示す。
後充填によりドキソルビシンを取り込ませてあるL−タイプのSMBV
もしくはSMBVの生理学的条件下での挙動
得られる結果は、ドキソルビシンが充填されるL−タイプのSMBVはSMB
Vのものに類似する生理学的条件下での挙動を有することを示す。図1の説明文
:
◆ 37℃
□ 100℃図2の説明文
:
◆ 37℃
□ 100℃
◇ 37℃、超音波図3の説明文
:
◆ 37℃
□ 100℃
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ジビラロ,ジヨエル
フランス国エフ―37000トウール・リユジ
ロド199
(72)発明者 デイルソン,ローズリヌ
フランス国エフ―33550カピアン・ドメヌ
ドラビル(番地なし)
(72)発明者 セルビラ,モニク
フランス国エフ―31400トウルーズ・シユ
マンド ペシユビユスク100
(72)発明者 ド・ミゲル,イグナシオ
フランス国エフ―31400トウルーズ・リユ
アンリ―ド―サユク28
(72)発明者 デイング,リ
フランス国エフ―31400トウルーズ・リユ
デユガイトウルーアン14
(72)発明者 グエン,フレデリク
フランス国エフ―17640ボ―シユール―メ
ール・シユマンド シヨシヤン12
(72)発明者 スレ,ナデイーヌ
フランス国エフ―11410サル―シユール―
レル・フアジヤクラルランク(番地なし)
(72)発明者 ソレル,コリヌ
フランス国エフ―66140カネ―アン―ルシ
ヨン・リユジユイダルノ1
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. − 非液体の親水性核、 − 疎水性相互作用および/またはイオン結合を介してその核と組合わ さっている両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、 を含むことを特徴とする合成粒子状ベクター。 2. 親水性核が天然もしくは化学的に架橋された多糖もしくはオリゴ糖のマ トリックスでできていることを特徴とする、請求の範囲1に記載の粒子状ベクタ ー。 3. イオン性リガンドが親水性核にグラフトされていることを特徴とする、 請求の範囲1および2に記載の粒子状ベクター。 4. 外部層の両親媒性化合物が、リン脂質、セラミド、イオン性界面活性剤 、もしくは非イオン性界面活性剤を含む群から選択される、請求の範囲1〜3の 内の一つに記載の粒子状ベクター。 5. 外部層が追加的に、コレステロール、天然脂肪酸、および油溶性ビタミ ンを含む群から選択される少なくとも一つの脂質化合物を含むことを特徴とする 、請求の範囲1〜4の内の一つに記載の粒子状ベクター。 6. 核内もしくは外部層内に位置する活性成分を追加的に含むことを特徴と する、請求の範囲1〜5の内の一つに記載の粒子状ベクター。 7. 架橋された多糖マトリックスで構成されていることを特徴とする合成粒 子状ベクター。 8. 活性成分を含むことを特徴とする、請求の範囲7に記載の粒子状ベクタ ー。 9. 活性成分がマトリックスの中心に主に局在するイオン化可能分子である ことを特徴とする、請求の範囲7および8のいずれかに記載の粒子状ベクター。 10. 10nmと5μmとの間の直径を有することを特徴とする、請求の範囲 1〜9の内の一つに記載の粒子状ベクター。 11. 20nmと200nmとの間の直径を有することを特徴とする粒子状ベ クター。 12. − 抗生物質および抗ウイルス剤、 − 蛋白質、プロテオグリカン、ペプチド、 − 多糖、リポ多糖、 − 抗体、 − 抗原、 − 殺虫剤および殺カビ剤、 − 心臓血管系に作用する化合物、 − 抗癌剤、 − 抗マラリア剤、 − 喘息薬、 − 皮膚における効果を有する化合物、 − 乳製品の脂質小球体の構成成分、 を含む群から選択される活性成分を含むことを特徴とする、請求の範囲1〜11 の内の一つに記載の粒子状ベクター。 13. a)酸性もしくは塩基性イオン化可能な活性成分を、その活性成分のも のに相補的なイオン種のリガンドがグラフトされた架橋親水性マトリックス内に 、その活性成分がイオン化形態であるpHで被包化す ること、 b)培地のpHを、その活性成分のpKaに関してその活性成分がイオ ン性形態をとらない値にまで変化させること、 c)前記マトリックスの中心に主に局在する活性成分を含む親水性マト リックスを回収すること、 を特徴とする粒子状ベクターの調製のための方法。 14. a)少なくとも一つの塩基性イオン化可能な活性成分を、酸性イオン性 リガンドがグラフトされた架橋親水性マトリックス内に、その活性成分のpKa 以下のpHで被包化すること、 b)その培地のpHを、その活性成分のpKa以上の値にまで増加させ ること、 c)前記マトリックスの中心に主に局在する活性成分を含む親水性マト リックスを回収すること、 を特徴とする請求の範囲13に記載の粒子状ベクターの調製のための方法。 15. a)少なくとも一つの酸性イオン化可能な活性成分を、塩基性イオン性 リガンドがグラフトされた架橋親水性マトリックス内に、その活性成分のpKa 以上のpHで被包化すること、 b)その培地のpHを、その活性成分のpKa以下の値にまで低下させ ること、 c)前記マトリックスの中心に主に局在する活性成分を含む親水性マト リックスを回収すること、 を特徴とする請求の範囲13に記載の粒子状ベクターの調製のための方法。 16. 親水性マトリクスが天然もしくは化学的に架橋された多糖もしくはオリ ゴ糖でできていることを特徴とする、請求の範囲13〜15の内の一つの記載の 方法。 17. その後に活性成分を含むマトリックスに脂質コロナを共有結合により固 定することを特徴とする、請求の範囲13〜16の内の一つの記載の方法。 18. 両親媒性化合物の層を、共有結合により固定される第一脂質層を場合に よっては含み、段階c)の完結の際に取得されるマトリックスに固定することを 特徴とする、請求の範囲13〜17の内の一つの記載の方法。 19. 請求の範囲13〜18の内の一つに記載の方法により取得することがで きるような粒子状ベクター。 20. 内側から外側にかけて、イオン化可能な活性成分、共有結合によりマト リックスに固定される第一脂質層、および蛋白質もしくはペプチド分子が場合に よっては連結する両親媒性化合物の第二層を含む架橋結合化多糖マトリックスを 含むことを特徴とする、請求の範囲19に記載の粒子状ベクター。 21. a) i)イオン性リガンドが固定された架橋結合化親水性核、および ii)場合によっては、脂質化合物の層および/または両親媒性化 合物、 で構成されている粒子状ベクターを調製すること、 b)活性成分がややイオン化するpHの溶液内に粒子状ベクターを懸濁 させること、 c)活性成分を、エネルギーを供給しながら段階b)の懸濁液に添加す ること、 d)この溶液を取り出し、そして活性成分が充填される粒子状ベクター を回収すること、 を特徴とする、活性成分が充填される粒子状ベクターの調製のための方法。 22. 請求の範囲1〜12に記載のベクターの調製に用いられることを特徴と する、請求の範囲19に記載の方法。 23. 請求の範囲1〜12の内の一つに記載の、もしくは請求の範囲13〜2 2の内の一つに記載の方法により取得される粒子状ベクター、ならびにその投与 のための薬剤学的に許容される支持体を含むことを特徴とする薬剤学的組成物。 24. 請求の範囲1〜12の内の一つに記載の、もしくは請求の範囲13〜2 2の内の一つに記載の方法により取得される粒子状ベクター、ならびに化粧品学 的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする化粧品学的組成物。 25. 請求の範囲1〜12の内の一つに記載の、もしくは請求の範囲13〜2 2の内の一つに記載の方法により取得されるベクターを含むことを特徴とする食 品使用のための組成物。 26. 請求の範囲1〜12の内の一つに記載の、もしくは請求の範囲13〜2 2の内の一つに記載の方法により取得されるベクターの医療薬としての使用。
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