ES2586401T3 - Anticuerpos específicos para la esclerostina y métodos para aumentar la mineralización ósea - Google Patents
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Abstract
Un inmunógeno consistente en un péptido de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº 53.
Description
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cromatografía de exclusión por tamaños y la cromatografía de intercambio iónico (véanse, por ejemplo, Coligan, en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales pueden ser purificados por cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado en base a las propiedades particulares del anticuerpo (v.g., isotipo de cadena pesada o ligara, especificidad de unión, etc.). Como ejemplos de ligando adecuado, inmovilizado sobre un soporte sólido, se incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo antirregión constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo antiidiotipo y una proteína de unión a TGF-beta, o sus fragmentos o variantes.
Además, un anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Se pueden generar anticuerpos monoclonales humanos por cualquier técnica con la que estén familiarizados quienes tienen conocimientos ordinarios en este campo. Por ejemplo, se pueden obtener anticuerpos monoclonales humanos de ratones transgénicos que han sido sometidos a ingeniería para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a un desafío antigénico. Se describen métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos, por ejemplo, en Green et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994; Patente Estadounidense Nº 5.877.397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N . Y. Acad. Sci. 764: 525-35. En esta técnica, se introducen elementos del locus de las cadenas pesadas y ligeras humanas en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones buscadas de los loci de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras endógenas. (Véase también Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)), Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulinas humanas pueden ser construcciones de minigenes, o transloci sobre cromosomas artificiales de levaduras, que sufren reorganización e hipermutación de ADN específico de células B en el tejido linfoide del ratón. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales humanos inmunizando a los ratones transgénicos, que pueden entonces producir anticuerpos humanos específicos para el antígeno. Se pueden usar células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados para producir hibridomas secretores de anticuerpos humanos según los métodos aquí descritos. También se pueden obtener sueros policlonales que contengan anticuerpos humanos de la sangre de los animales inmunizados.
Otro método para generar anticuerpos monoclonales humanos específicos para la proteína de unión a TGF-beta incluye la inmortalización de células de sangre periférica humana mediante transformación con EBV. Véase, v.g., la Patente Estadounidense Nº 4.464.456. Dicha línea de células B (o línea de células linfoblastoides) inmortalizada que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una proteína de unión a TGF-beta (o una variante
o fragmento del mismo) puede ser identificada por métodos de inmunodetección como aquí se presentan, por ejemplo, un ELISA, y luego aislada por técnicas de clonación estándar. Se puede mejorar la estabilidad de la línea de células linfoblastoides productora de un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta fusionando la línea de células transformadas con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida murina-humana según métodos conocidos en la técnica (véase, v.g., Glasky et al., Hybridoma 8: 377-89 (1989)).
En ciertas realizaciones, se selecciona una célula B que produce un anticuerpo anti-SOST y se clonan las regiones variables de cadenas ligeras y de cadenas pesadas a partir de la célula B según técnicas de biología molecular conocidas en este campo (WO 92/02551; patente estadounidense 5.627.052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)) y aquí descritas. Preferiblemente, se aíslan células B de un animal inmunizado del bazo, del ganglio linfático o de una muestra de sangre periférica seleccionando una célula que produce un anticuerpo que se une específicamente a SOST. También se pueden aislar células B de humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Los métodos para detectar células B únicas que producen un anticuerpo con la especificidad deseada son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por formación de placa, clasificación de células activada por fluorescencia, estimulación in vitro seguida de detección de anticuerpos específicos y similares. Como métodos para la selección de células B productoras de anticuerpos específicos, se incluyen, por ejemplo, la preparación de una suspensión unicelular de células B en agar blando que contiene SOST o un fragmento peptídico del mismo. La unión del anticuerpo específico producido por la célula B al antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de seleccionar las células B productoras del anticuerpo específico, se pueden clonar los genes del anticuerpo específico aislando y amplificando el ADN o el ARNm según métodos conocidos en la técnica y aquí descritos.
Para usos particulares, se pueden desear fragmentos de anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta. Los fragmentos de anticuerpos, F(ab’)2, Fab, Fab’, Fv, Fc, Fd, conservan el sitio de unión a antígeno del anticuerpo entero y, por lo tanto, se unen al mismo epítopo. Estos fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo pueden ser obtenidos, por ejemplo, por hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, por digestión con pepsina o papaína de anticuerpos enteros según métodos convencionales. A modo de ilustración, se pueden producir fragmentos de anticuerpos por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para obtener un fragmento 5S denominado F(ab’)2. Este fragmento puede ser aún escindido usando un agente reductor tiol para producir fragmentos monovalentes Fab’ 3,5S. Eventualmente, la reacción de escisión puede ser llevada a cabo usando un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de uniones disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos están descritos, por ejemplo, en Goldenberg, patente estadounidense Nº 4.331.647, Nisonoff et al.,
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derivado de una segunda especie de mamífero distinta (véase, v.g., Morrison et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-55 (1984)). En realizaciones preferidas, se puede construir un anticuerpo quimérico clonando la secuencia polinucleotídica que codifica al menos un dominio de región variable derivado de un anticuerpo monoclonal no humano, tal como la región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de ratón, rata o hámster, en un vector que contiene una secuencia nucleotídica que codifica al menos una región constante humana (véanse, v.g., Shin et al., Methods Enzymol. 178: 459-76 (1989); Walls et al., Nucleic Acids Res. 21: 2921-29 (4993)). A modo de ejemplo, se puede insertar la secuencia polinucleotídica codificante de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal murino en un vector que contenga una secuencia nucleotídica codificante de la secuencia de región constante de la cadena ligera kappa humana. En un vector aparte, se puede clonar la secuencia polinucleotídica codificante de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal en marco con secuencias codificantes de una región constante de IgG humana, por ejemplo, la región constante de la IgG1 humana. La región constante humana particular seleccionada puede depender de las funciones efectoras deseadas para el anticuerpo particular (v.g., fijación de complemento, unión a un receptor Fc particular, etc.). Preferiblemente, los vectores construidos serán transfectados en células eucarióticas para la expresión estable del anticuerpo quimérico. Otro método conocido en la técnica para generar anticuerpos quiméricos es la recombinación homóloga (v.g., Patente Estadounidense Nº 5.482.856).
Se puede someter además un anticuerpo quimérico no humano/humano a ingeniería genética para crear un anticuerpo "humanizado". Dicho anticuerpo humanizado puede tener una pluralidad de CDR derivadas de una inmunoglobulina de una especie de mamífero no humano, al menos una región marco variable humana y al menos una región constante de inmunoglobulina humana. Como estrategias útiles para diseñar anticuerpos humanizados, se pueden incluir, por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, la identificación de regiones marco variables humanas que son más homólogas de las regiones marco no humanas del anticuerpo quimérico. Sin desear limitarnos a la teoría, dicha estrategia puede aumentar la probabilidad de que el anticuerpo humanizado conserve la afinidad de unión específica por una proteína de unión a TGF-beta, que, en algunas realizaciones preferidas, puede ser substancialmente la misma afinidad por una proteína de unión a TGF-beta o una variante o fragmento de la misma, y en otras ciertas realizaciones preferidas puede ser una afinidad mayor por una proteína de unión a TGFbeta. Véanse, v.g., Jones et al., 1986 Nature 321: 522-25; Riechmann et al., 1988 Nature 332: 323-27. El diseño de dicho anticuerpo humanizado puede, por lo tanto, incluir la determinación de las conformaciones de bucles CDR y de los determinantes estructurales de las regiones variables no humanas, por ejemplo, mediante modelos de ordenador, y la comparación después de los bucles CDR y de los determinantes con estructuras de bucles CDR y determinantes humanos conocidos. Véanse, v.g., Padlan et al., 1995 FASEB 9: 133-39; Chothia et al., 1989 Nature,
342: 377-383. También se pueden usar modelos de ordenador para comparar plantillas estructurales humanas seleccionadas por homología de secuencia con las regiones variables no humanas. Véanse, v.g., Bajorath et al., 1995 Ther. Immunol. 2: 95-103; EP-0578515-A3. Si la humanización de las CDR no humanas da lugar a una disminución de la afinidad de unión, los modelos de ordenador pueden ayudar a identificar residuos de aminoácidos específicos que podrían ser cambiados por mutagénesis dirigida a sitio u otras técnicas de mutagénesis para restaurar la afinidad parcial, completa o supraóptimamente (es decir, para aumentar hasta un nivel mayor del del anticuerpo no humanizado). Los que tienen conocimientos ordinarios en este campo están familiarizados con estas técnicas y apreciarán fácilmente numerosas variaciones y modificaciones de dichas estrategias de diseño.
Uno de tales métodos para preparar un anticuerpo humanizado se denomina revestimiento. Tal como se usan aquí, los términos "FR revestidos" y "FR revestidos recombinantemente" se refieren a la substitución selectiva de residuos FR de, v.g., una región V de cadena pesada o ligera de roedor con residuos FR humanos para obtener una molécula xenogénica que comprende un sitio de unión a antígeno que conserva substancialmente toda la estructura nativa de plegamiento del polipéptido FR. Las técnicas de revestimiento se basan en el conocimiento de que las características de unión a ligando de un sitio de unión a antígeno son primariamente determinadas por la estructura y la disposición relativa de los grupos de CDR de cadenas pesadas y ligeras en la superficie de unión a antígeno. Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59: 439-73, 1990. Así, se puede conservar la especificidad de unión a antígeno en un anticuerpo humanizado sólo cuando se mantienen cuidadosamente las estructuras CDR, su interacción entre sí y su interacción con el resto de los dominios de región V. Utilizando técnicas de revestimiento, se substituyen selectivamente los residuos FR exteriores (v.g., accesibles a solventes) que son fácilmente encontrados por el sistema inmune con residuos humanos para obtener una molécula híbrida que comprende una superficie revestida,
o bien débilmente inmunogénica, o bien substancialmente no inmunogénica.
El procedimiento de revestimiento utiliza los datos de secuencia disponibles para los dominios variables de anticuerpos humanos compilados por Kabat et al., en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), actualizaciones de la base de datos de Kabat y otras bases de datos accesibles de los EE.UU. y extranjeras (tanto de ácidos nucleicos como de proteínas). Se pueden deducir las accesibilidades a los solventes de los aminoácidos de la región V a partir de la estructura tridimensional conocida para fragmentos de anticuerpos humanos y murinos. Inicialmente, se comparan las FR de los dominios variables de una molécula de anticuerpo de interés con secuencias FR correspondientes de dominios variables humanos obtenidas de las fuentes antes identificadas. Se comparan entonces las regiones V humanas más homólogas residuo a residuo con aminoácidos murinos correspondientes. Se substituyen los residuos de la FR murina que difieren de la contrapartida humana por los residuos presentes en el resto humano usando
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derivados (véanse, por ejemplo, las Memorias Descriptivas de las Patentes Sudafricanas Nº 85/8794, Nº 88/8127 y Nº 90/2839).
Otras muchas toxinas, incluyendo agentes quimioterapéuticos, agentes antimitóticos, antibióticos, inductores de la apoptosis (o "apoptógenos", véase, v.g., Green y Reed, 1998, Science 281: 1309-1312) o similares, son conocidas para quienes están familiarizados con la técnica, y los ejemplos aquí proporcionados pretenden ser ilustrativos sin limitar el alcance y el espíritu de la invención. Como agentes antineoplásicos particulares, se incluyen agentes citotóxicos y citostáticos, por ejemplo agentes alquilantes, tales como mostazas nitrogenadas (v.g., clorambucilo, melfalán, mecloretamina, ciclofosfamida o mostaza de uracilo) y sus derivados, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, busulfán o cisplatina; antimetabolitos, tales como metotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido fluorocítrico, antibióticos, tales como bleomicinas (v.g., sulfato de bleomicina), doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicinas (v.g., mitomicina C), actinomicinas (v.g., dactinomicina), plicamicina, calicamicina y sus derivados o esperamicina y sus derivados; inhibidores mitóticos, tales como etopósido, vincristina o vinblastina y sus derivados; alcaloides, tales como elipticina; polioles, tales como taxicina-I o taxicina-II; hormonas, tales como andrógenos (v.g., dromostanolona o testolactona), progestinas (v.g., acetato de megestrol o acetato de medroxiprogesterona), estrógenos (v.g., difosfato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol o fosfato de estramustina) o antiestrógenos (v.g., tamoxifén); antraquinonas, tales como mitoxantrona; ureas, tales como hidroxiurea; hidrazinas, tales como procarbazina; o imidazoles, tales como dacarbazina.
Como metales quelados útiles como moléculas efectoras, se incluyen quelatos de metales di-o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8 inclusive. Como ejemplos particulares de dichos metales, se incluyen tecnecio (Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), itrio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd) y escandio (Sc). En general, el metal es preferiblemente un radionúclido. Como radionúclidos particulares, se incluyen 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi,207Bi, 111In, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd y 47Sc. El metal quelado puede ser, por ejemplo, uno de los tipos anteriores de metales quelados con cualquier agente quelante polidentado adecuado, por ejemplo, poliaminas acíclicas o cíclicas, poliéteres (v.g., éteres corona y sus derivados), poliamidas; porfirinas; y derivados carbocíclicos. En general, el tipo de agente quelante dependerá del metal utilizado. Un grupo particularmente útil de agentes quelantes en los conjugados según la invención, sin embargo, incluyen poliaminas acíclicas y cíclicas, especialmente ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo, ácido dietilentriaminopentaacético y sus derivados, y aminas macrocíclicas, v.g., derivados triaza y tetraaza cíclicos (por ejemplo, como se describe en la Memoria Descriptiva de la Patente Internacional Nº WO 92/22583); y poliamidas, especialmente desferrioxamina y sus derivados.
Cuando se usa un grupo tiol en el anticuerpo como punto de unión, la molécula efectora puede unirse según una reacción que se produce con un grupo reactivo a tiol presente en la molécula efectora o indicadora. Como ejemplos de tales grupos, se incluyen un ácido o éster á-halocarboxílico, tal como yodoacetamida, una imida, tal como maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. Estos y otros procedimientos adecuados de unión están descritos en general y más en particular en las Memorias Descriptivas de las Patentes Internacionales Nº WO 93/06231, Nº WO 92/22583, Nº WO 90/091195 y Nº WO 89/01476.
Se puede usar un anticuerpo que se une específicamente a SOST para detectar la expresión del polipéptido SOST. Se puede exponer un anticuerpo o un panel de anticuerpos a células que expresan un polipéptido SOST y se puede determinar la expresión del polipéptido SOST por detección usando otro anticuerpo específico de SOST que se une a un epítopo diferente que el anticuerpo o anticuerpos primeramente usados en el ensayo.
Ensayos
La presente invención proporciona un método para identificar un anticuerpo que aumenta el contenido mineral del hueso consistente en: (a) poner en contacto (i) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido SOST que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de la SEC. ID. Nº 1 con (ii) al menos un péptido SOST según se define en la invención en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la formación de un complejo anticuerpo/péptido SOST; y (b) detectar el nivel de complejo anticuerpo/péptido SOST, y así detectar la presencia de un anticuerpo que aumenta el contenido mineral del hueso.
El método puede ser llevado a cabo usando SPR o cualquier número de diferentes inmunoensayos conocidos en la técnica y aquí desvelados, incluyendo un ELISA, inmunotransferencia o similar. Una ruta de señalización TGF-beta incluye una ruta de señalización mediante la cual una BMP se une a un receptor de tipo I y de tipo II en una célula para estimular o inducir la ruta que modula el contenido mineral del hueso. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, un anticuerpo que se une específicamente a SOST estimula o potencia la ruta para aumentar el contenido mineral del hueso. Dicho anticuerpo puede ser identificado usando los métodos aquí desvelados para detectar la unión de un anticuerpo a péptidos específicos SOST.
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Marcajes detectables
Un marcaje detectable es una molécula o un átomo que puede conjugarse a un polipéptido (incluyendo un anticuerpo o fragmento del mismo) o un polinucleótido para producir una molécula útil para diagnóstico. Como ejemplos de marcajes detectables, se incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos, enzimas y otros restos marcadores. Un anticuerpo puede ser marcado con una variedad de compuestos, incluyendo, por ejemplo, moléculas fluorescentes, toxinas y radionúclidos. Como ejemplos representativos de moléculas fluorescentes, se incluyen fluoresceína, ficobiliproteínas, tales como ficoeritrina, rodamina, rojo Texas y luciferasa. Como ejemplos representativos de toxinas, se incluyen ricina, abrina, toxina diftérica, toxina del cólera, gelonina, proteína antivírica de fitolaca, tritina, toxina de Shigella y exotoxina A de Pseudomonas. Como ejemplos representativos de radionúclidos, se incluyen Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 y Bi
212. Además, los anticuerpos antes descritos pueden ser también marcados o conjugados con un compañero de una pareja de unión a ligando. Como ejemplos representativos, se incluyen avidina-biotina, estreptavidina-biotina y riboflavina-proteína de unión a riboflavina.
Los métodos para conjugar o marcar las moléculas aquí descritas con los marcajes representativos indicados anteriormente pueden ser fácilmente llevados a cabo por alguien con conocimientos ordinarios en la técnica (véanse Conjugado de Tricoteceno y Anticuerpo, Patente Estadounidense Nº 4.744.981; Conjugado de Anticuerpo, Patente Estadounidense Nº 5.106.951; Materiales Fluorogénicos y Técnicas de Marcaje, Patente Estadounidense Nº 4.018.884; Proteínas Marcadas con Radionúclidos Metálicos para Diagnóstico y Terapia, Patente Estadounidense Nº 4.897.255; y Compuestos Quelantes Radionúclidos Metálicos para una Mejor Cinética de Quelación, Patente Estadounidense Nº 4.988.496; véase también Inman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Parte B, Jakoby y Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; véase también Wilchek y Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications", Anal. Biochem. 171: 1-32, 1988). Un inmunoconjugado es una composición que comprende un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta, o un fragmento de anticuerpo del mismo, y un marcaje detectable. Preferiblemente, el resto de anticuerpo del inmunoconjugado se une específicamente a su antígeno relacionado con la misma o ligeramente reducida afinidad de unión después de la conjugación que antes de la conjugación.
Composiciones farmacéuticas
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica consistente en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención y un soporte fisiológicamente aceptable. Se puede emplear cualquier soporte adecuado conocido para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los soportes para uso terapéutico son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985)). En general, dichos soportes deben ser no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Normalmente, la preparación de dichas composiciones conlleva la combinación del agente terapéutico con tampones; antioxidantes, tales como el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas; aminoácidos; carbohidratos, incluyendo maltosa, glucosa, sacarosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como el EDTA; glutatión; y otros estabilizadores y excipientes. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con seroalbúmina inespecífica son ejemplos de diluyentes. De manera alternativa, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas como un liofilizado.
En general, el tipo de soporte es seleccionado en base al modo de administración. Se pueden formular composiciones farmacéuticas para cualquier modo apropiado de administración, incluyendo, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intratecal, rectal, vaginal, sublingual o parenteral, incluyendo la inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracavernosa, intrameato o intrauretral. Una composición farmacéutica (v.g., para administración oral o administración por inyección) puede estar en forma de líquido (v.g., un elixir, un jarabe, una solución, una emulsión o una suspensión). Una composición farmacéutica líquida puede incluir, por ejemplo, uno o más de los siguientes: diluyentes estériles, tales como agua para inyección, solución salina, preferiblemente suero fisiológico, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijados, que pueden servir como solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos; antioxidantes; agentes quelantes; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. Se puede introducir una preparación parenteral en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o de plástico. Se prefiere el uso de suero fisiológico, y una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril.
Las composiciones aquí descritas pueden ser formuladas para liberación mantenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o una esponja que efectúa una liberación lenta de compuesto tras su administración). Dichas composiciones pueden ser generalmente preparadas usando tecnología bien conocida y administradas mediante, por ejemplo, implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio diana deseado. Las formulaciones para liberación mantenida pueden contener un agente disperso en una matriz de soporte y/o
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disolver una dosificación en 1 ml de solución isotónica de NaCl y o bien añadirla a 1.000 ml de fluido de hipodermoclisis, o bien inyectarla en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15ª ed., pp. 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. Además, para administración humana, las preparaciones por supuesto cumplirán preferiblemente con las normas de esterilidad, pirogenicidad y las generales de seguridad y pureza requeridas por la FDA Office of Biologics Standards.
En otra realización de la invención, las composiciones aquí desveladas pueden ser formuladas en forma neutra o de sal. Como sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas, se incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivar también de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Al realizar la formulación, las soluciones serán administradas de un modo compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva.
Los soportes pueden además incluir todos y cada uno de solventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, soluciones de soporte, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para principios activos farmacéuticos es bien conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar principios activos adicionales a las composiciones. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción indeseada alérgica o similar cuando se administran a un humano.
En ciertas realizaciones, se usan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente invención en células/organismos huésped adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para suministro encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similar. De manera alternativa, las composiciones de la presente invención pueden ser unidas, covalente o no covalentemente, a la superficie de dichos vehículos de soporte.
La formación y el uso de preparaciones de liposomas y de tipo liposoma como soportes potenciales de fármacos son generalmente conocidos para los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7): 30721, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3): 691-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 35(8): 801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3): 233-61, 1995; Patente Estadounidense Nº 5.567.434; Patente Estadounidense Nº 5.552.157; Patente Estadounidense Nº 5.565.213; Patente Estadounidense Nº 5.738.868 y Patente Estadounidense Nº 5.795.587). Se han usado liposomas con éxito con una serie de tipos celulares que normalmente son difíciles de transfectar por otros procedimientos, incluyendo suspensiones de células T, cultivos de hepatocitos primarios y células PC 12 (Renneisen et al., J. Biol. Chem. 265(27): 16337-42, 1990; Muller et al., DNA Cell Biol. 9(3): 221-29, 1990). Además, los liposomas están libres de las restricciones de longitud del ADN típicas de los sistemas de suministro basados en virus. Se han usado liposomas eficazmente para introducir genes, diversos fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de transcripción, efectores alostéricos y similares en una variedad de líneas celulares cultivadas y animales. Además, el uso de liposomas no parece ir asociado a respuestas autoinmunes o a toxicidad inaceptable tras su suministro sistémico. En ciertas realizaciones, los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que están dispersos en un medio acuoso y que forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (también llamadas vesículas multilamelares (VML).
De manera alternativa, en otras realizaciones, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos de una forma estable y reproducible (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1113-28, 1998). Para evitar efectos colaterales debidos a sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de alrededor de 0,1 m) pueden ser diseñadas usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Dichas partículas pueden ser producidas como se describe, por ejemplo, en Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1): 1-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3): 31-40, 1998; y Patente Estadounidense Nº
5.145.684.
Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser introducidas en recipientes, junto con material de envasado que proporcione instrucciones relativas al uso de dichas composiciones farmacéuticas. En general, dichas instrucciones incluirán una expresión tangible que describa la concentración de reactivo, así como, en ciertas realizaciones, las cantidades relativas de excipiente, ingredientes o diluyentes (v.g., agua, solución salina
o PBS) que pueden ser necesarias para reconstituir la composición farmacéutica.
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Tratamiento
La presente invención también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la invención para uso en métodos para aumentar el contenido mineral y la densidad mineral del hueso. Brevemente, numerosas afecciones dan como resultado la pérdida de contenido mineral óseo, incluyendo, por ejemplo, enfermedad, predisposición genética, accidentes que dan lugar a la falta de uso del hueso (v.g., debido a fracturas), agentes terapéuticos que afectan a la resorción ósea o que matan a las células formadoras de hueso y envejecimiento normal. A través del uso de los anticuerpos y de los fragmentos de unión a antígeno aquí descritos que inhiben la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia TGF-beta, dichas afecciones pueden ser tratadas o prevenidas. Tal como se usa aquí, se entiende que ese contenido mineral óseo ha aumentado si el contenido mineral óseo ha aumentado de un modo estadísticamente significativo en un sitio seleccionado.
Se puede tratar una amplia variedad de afecciones que dan como resultado pérdida del contenido mineral del hueso con las moléculas aquí descritas. Los pacientes con dichas afecciones pueden ser identificados por diagnóstico clínico usando técnicas bien conocidas (véase, v.g., Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Como ejemplos representativos de enfermedades que pueden ser tratadas, se incluyen displasias, donde el crecimiento o el desarrollo del hueso es anormal. Como ejemplos representativos de dichas afecciones, se incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exostosis múltiples hereditarias, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, fracturas, enfermedad periodontal, pseudoartrosis y osteomielitis piogénica.
Otras afecciones que pueden ser tratadas o prevenidas incluyen una amplia variedad de causas de osteopenia (es decir, una afección que causa más de una desviación estándar del contenido o la densidad mineral del hueso por debajo del pico de contenido mineral esquelético en la juventud). Como ejemplos representativos de dichas afecciones, se incluyen estados anémicos, afecciones causadas por esteroides, afecciones causadas por la heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteoporosis idiopática, osteopenia u osteoporosis congénita, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, senilidad, estado posmenopáusico, oligomenorrea, amenorrea, gestación, diabetes mellitus, hipertiroidismo, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o mal uso, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional transitoria y osteomalacia.
Como ejemplos de animales de sangre caliente que pueden ser tratados, se incluyen tanto vertebrados como mamíferos, incluyendo, por ejemplo, humanos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, perros, gatos, ratas y ratones.
Se puede determinar el aumento en el contenido mineral del hueso directamente mediante el uso de rayos X (v.g., Absorciometría de rayos X de Energía Dual o "DEXA"), o por inferencia a través de marcadores de la renovación ósea, tales como fosfatasa alcalina específica de osteoblastos, osteocalcina, propéptido de procolágeno C' de tipo 1 (PICP) y fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7: 243 (1995)), o por marcadores de resorción ósea, incluyendo, aunque sin limitación, piridinolina, desoxipiriridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas ácidas resistentes a tartrato plasmáticas y galactosilhidroxilisina (véase Comier, id.). También se puede calcular la cantidad de masa ósea por los pesos corporales o utilizando otros métodos (véase Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5: 177-181, 1984).
Como resultará evidente para un experto en la técnica, la cantidad y la frecuencia de administración dependerán, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y la severidad de la indicación que se esté tratando, la respuesta deseada, el estado del paciente, etc. Típicamente, las composiciones pueden ser administradas por una variedad de técnicas, como se ha indicado anteriormente.
Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1
Modelado de la región central de la esclerostina
Las técnicas de reconocimiento de homología (v.g., PSI-BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)), FUGUE (Shi et al., J. Mol. Biol. 310: 243-57 (2001))) sugerían que la región central de SOST (SOST_Core) adopta un pliegue de nudo de cistina. FUGUE es un método sensible para detectar homología entre secuencias y estructuras. La Gonadotropina Coriónica Humana (hCG-), para la que se conoce una estructura 3D experimentalmente determinada, fue identificada por FUGUE (Shi et al., supra) como el homólogo más próximo de SOST_Core. Por lo tanto, se utilizó hCG- como plantilla estructural para construir modelos 3D para SOST_Core.
Se muestra una alineación de SOST_Core y sus homólogos próximos en la Figura 1. Entre los homólogos
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mostrados en la alineación, sólo hCG- (CGHB) tenía una estructura 3D conocida. La identidad de secuencia entre SOST_Core y hCG- era de aproximadamente el 25%. Se conservaban ocho residuos de CYS a través de la familia, lo que destaca la similitud estructural global entre SOST_Core y hCG-. Tres pares de cistinas (1-5, 3-7, 4-8) formaban enlaces disulfuro (mostrados con líneas continuas en la Figura 1) en una configuración de "nudo", que es característica del pliegue de nudo de cistina. Un enlace disulfuro extra (2-6), mostrado como una línea discontinua en la Figura 1, era único para esta familia y distinguía la familia de proteínas de otras familias de nudo de cistina (v.g., TGF-, BMP).
SOST_Core fue modelado usando PDB (Berman et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58 (Pt 6 Pt 1): 899-907 (2002)) entrada 1HCN, la estructura 3D de hCG- (Wu et al., Structure 2: 545-58 (1994)), como plantilla estructural. Se calcularon los modelos con MODELER (Sali & Blundell, J. Mol. Biol. 234: 779-815 (1993)). Se muestra una foto del mejor modelo en la Figura 2.
La mayoría de las proteínas de nudo de cistina forman dímeros debido a la falta de centro hidrofóbico en un monómero (Scheufler et al., supra; Schlunegger y Grutter, J. Mol. Biol. 231: 445-58 (1993)); Wu et al., supra). SOST sigue probablemente la misma regla y forma un homodímero para aumentar su estabilidad. La construcción de un modelo para la región SOST_Core dimerizada presentaba varios desafíos, ya que (1) la similitud de secuencia entre SOST_Core y hCG- era baja (25%); (2) en lugar de un homodímero, hCG- formaba un heterodímero con hCG-,y
(3) se ha observado una serie de diferentes conformaciones relativas de monómeros en proteínas de nudo de cistina dimerizadas de diferentes familias (v.g., PDGF, TGF-, Neurotrofina, IL-17F, Gonadotropina), lo que sugería que la conformación dimérica de SOST podría desviarse significativamente de la conformación de heterodímero hCG-/. Al construir el modelo, se substituyó hCG- con hCG- de la estructura heterodimérica (1HCN) usando técnicas de superimposición de estructura combinadas con ajuste manual, y se construyó entonces un modelo homodimérico SOST_Core según la estructura pseudohomodimérica hCG-. Se muestra el modelo final en la Figura 3.
Ejemplo 2
Modelación de la interacción SOST-BMP
Este ejemplo describe la modelación de proteínas de los sitios de unión a receptor de tipo I y tipo II en BMP que están implicados en la interacción entre BMP y SOST.
Estudios de competencia demostraron que SOST competía con los receptores tanto de tipo I como de tipo II por la unión a BMP. En un ensayo de competencia basado en ELISA, BMP-6 interaccionaba selectivamente con la superficie revestida de esclerostina (300 ng/pocillo) con gran afinidad (KD = 3,4 nM). Cantidades crecientes de receptor IA de BMP (construcción de fusión FC) competían con la esclerostina por la unión a BMP-6 (11 nM) (CI50 = 114 nM). Un exceso 10 veces molar del receptor de BMP era suficiente para reducir la unión de la esclerostina a BMP-6 en aproximadamente un 50%. Esta competencia era también observada con una proteína de fusión receptor II de BMP-FC (CI50 = 36 nM) y DAN (CI50 = 43 nM). La especificidad del ensayo quedó mostrada por la falta de competencia por la unión a BMP-6 entre la esclerostina y una proteína de fusión rActivina R1B-FC, un miembro de la familia de receptores TGF- que no se unía a BMP.
Se mapearon los sitios de unión a receptores de tipo I y de tipo II en un polipéptido BMP y se separaron espacialmente (Scheufler et al., supra; Innis et al., supra; Nickel et al., supra; Hart et al. supra). Noggin, otro antagonista de BMP que se une a BMP con gran afinidad, contacta con BMP en ambos sitios de unión a receptores de tipo I y de tipo II a través de la porción N-terminal de Noggin (Groppe et al., supra). Las dos hebras en la región central próxima al extremo C también contactan con BMP en el sitio de unión a receptores de tipo II.
Una alineación manualmente ajustada de Noggin y SOST indicaba que los dos polipéptidos compartían similitud de secuencia entre las porciones N-terminales de las proteínas y entre las regiones centrales. Se presenta una alineación de secuencia de aminoácidos en la Figura 4. Los residuos de cisteína que forman el nudo cys característico estaban conservados entre Noggin y SOST. La identidad de secuencia global era del 24% y la identidad de secuencia en la región de unión N-terminal (posiciones de alineación 1-45) era del 33%. Se dijo que dos residuos en la región de unión N-terminal de Noggin, a saber, Leu (L) en la posición de alineación 21 y Glu (E) en la posición 23, desempeñaban papeles importantes en la unión a BMP (Groppe et al., supra). Ambos residuos estaban también conservados en SOST. La similitud de secuencia en la región central (posiciones de alineación 131-228) era de aproximadamente el 20%, pero se mantenía la estructura del nudo de cys y se conservaban un número suficiente de residuos clave, respaldando la homología entre Noggin y SOST.
Se comparó la estructura de Noggin con SOST también para entender cómo se dimerizan dos monómeros de SOST. Tal como se muestra en la Figura 5, la estructura de Noggin sugería que el conector entre la región Nterminal y la región central no sólo tenía un papel en la conexión de las dos regiones, sino que también formaba parte de la interfaz de dimerización entre dos monómeros Noggin. Una diferencia importante entre Noggin y SOST era que el conector entre la región N-terminal y la región central era mucho más corto en SOST.
La región C-terminal de SOST puede desempeñar un papel en la dimerización de SOST. La secuencia de Noggin terminaba con la región central, mientras que SOST tenía una región C-terminal extra. En la estructura de Noggin, un enlace disulfuro conectaba los extremos C de dos monómeros de Noggin. Así, la región C-terminal de SOST comenzaba próxima a la interfaz de dos monómeros y podía contribuir a la dimerización. Además, la predicción de la 5 estructura secundaria muestra que algunas porciones de la región C-terminal de SOST tenían una tendencia a formar hélices. Esta región en SOST puede ser responsable de la actividad de dimerización, posiblemente a través de un empaquetamiento hélice-hélice, que imitaba la función del conector más largo en Noggin. Otra diferencia entre la estructura de Noggin y SOST era la inserción de aminoácido en la región central de SOST en las posiciones de alineación 169-185 (véase la Figura 4). Esta inserción extendía una horquilla , que señalaba hacia la interfaz de
10 dimerización en la estructura de Noggin (mostrada en la Figura 5 como una región de bucle en el centro de los monómeros y por encima del residuo de Cys C-terminal). Esta horquilla alargada podría contribuir también a la dimerización de SOST.
Ejemplo 3
15 Diseño y preparación de inmunógenos peptídicos SOST
Este Ejemplo describe el diseño de inmunógenos peptídicos SOST utilizados para inmunizar a animales y que generan anticuerpos que bloquean las interacciones entre BMP y SOST y que previenen la formación de dímeros de
20 monómeros SOST.
Fragmentos de unión a BMP
La similitud global entre SOST y Noggin y la similitud entre las regiones N-terminales de los dos polipéptidos
25 sugieren que SOST puede interaccionar con BMP de un modo similar a Noggin. Es decir, que la región N-terminal de SOST puede interaccionar con los sitios de unión a receptores tanto de tipo I como de tipo II en BMP, y una porción de la región central (posiciones de alineación de aminoácidos 190-220 en la Figura 4) puede interaccionar con el sitio de unión a receptores de tipo II, de tal forma que los anticuerpos específicos para estas regiones de SOST pueden bloquear o alterar la unión de BMP a SOST.
30 Se presentan las secuencias de aminoácidos de estos fragmentos de polipéptido SOST para SOST de rata y humano como sigue.
SOST_N_Linker: La región N-terminal (incluye el conector corto que conecta con la región central) Humano: 35
Rata:
SOST_Core_Bind: Porción de la región central que es probable que contacte con BMP en su sitio de unión a receptores de tipo II (extendida ligeramente en ambos extremos para incluir los anclajes de residuos de CYS):
45 Humano: CIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASC (SEC. ID. Nº 49) Rata: CIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASC (SEC. ID. Nº 50)
Fragmentos de dimerización de SOST
50 La región C-terminal de SOST está probablemente implicada en la formación de homodímeros de SOST (véase el Ejemplo 2). La horquilla alargada puede también desempeñar un papel en la formación de homodímeros. Los anticuerpos que se unen específicamente a dichas regiones pueden prevenir o alterar la dimerización de monómeros de SOST, lo que a su vez puede interferir con la interacción entre SOST y BMP. Los fragmentos polipeptídicos en el SOST de rata y humano correspondientes a estas regiones son los siguientes.
55 SOST_C: la región C-terminal Humano:
Rata:
SOST_Core_Dimer: Porción de la región central que está probablemente implicada en la dimerización de SOST (extendida ligeramente en ambos extremos para incluir los anclajes de residuos de Cys):
10 Humano: CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEC. ID. Nº 53) Rata: CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFRC (SEC. ID. Nº 54)
Fragmento de unión a BMP en el extremo N de SOST
15 Se modeló la región de unión N-terminal clave de SOST (posiciones de alineación 1-35 en la Figura 4) en base a la estructura del complejo Noggin/BMP-7 (Entrada del Banco de Datos de Proteínas Nº 1M4U) y a la alineación de secuencia de aminoácidos (véase la Figura 4) para identificar residuos de aminoácidos del extremo N de SOST que probablemente interaccionan con BMP. Se presenta el modelo de SOST en la Figura 6. En el modelo comparativo, la fenilalanina (Phe, F) en la posición de alineación 8 (véanse la flecha y el texto acompañante) en la secuencia de
20 SOST se proyecta hacia un bolsillo hidrofóbico sobre la superficie del dímero de BMP. Se ha observado la misma característica de "knobs-into-holes" en la estructura compleja de BMP y receptor de tipo I (Nickel et al., supra), donde la Phe85 del receptor encaja en el mismo bolsillo, lo cual es una característica clave en el reconocimiento ligando-receptor de tipo I para los miembros de la superfamilia TGF- (incluyendo, por ejemplo, la familia TGF-, la familia BMP y similares). Según el modelo, también se conserva un giro dirigido por prolina (Pro), que permite que el
25 fragmento de unión N-terminal se enrosque a lo largo de la superficie del dímero de BMP, viajando desde el sitio de unión al receptor de tipo I hasta el sitio de unión al receptor de tipo II en el otro lado del complejo. También se conserva otro giro dirigido por Pro cerca del extremo carboxi del fragmento de unión, que conecta entonces con la región conectora. Son evidentes contactos extensos entre SOST y BMP en la Figura 6.
30 Inmunógenos peptídicos
Se diseñaron péptidos para que incluyeran la región N-terminal de SOST que se predecía que contacta con proteínas BMP. A continuación, se presentan las secuencias peptídicas. Para inmunizar a animales, se diseñaron las secuencias peptídicas de manera que se solaparan, y se añadió una cisteína adicional al extremo C-terminal
35 para facilitar el entrecruzamiento con KLH. Se usaron entonces los péptidos para la inmunización. Las secuencias peptídicas de los inmunógenos son las siguientes.
SOST humano:
40 QGWQAFKNDATEIIPELGEY (SEC. ID. Nº 2) TEIIPELGEYPEPPPELENN (SEC. ID. Nº 3) PEPPPELENNKTMNRAENGG (SEC. ID. Nº 4) KTMNRAENGGRPPHHPFETK (SEC. ID. Nº 5) RPPHHPFETKDVSEYS (SEC. ID. Nº 6)
45 Péptidos SOST humanos con Cys adicional:
QGWQAFKNDATEIIPELGEY-C (SEC. ID. Nº 7)
TEIIPELGEYPEPPPELENN-C (SEC. ID. Nº 8)
50 PEPPPELENNKTMNRAENGG-C (SEC. ID. Nº 9) KTMNRAENGGRPPHHPFETK-C (SEC. ID. Nº 10) RPPHHPFETKDVSEYS-C (SEC. ID. Nº 11)
SOST de rata:
55 QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEC. ID. Nº 12) PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEC. ID. Nº 13) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEC. ID. Nº 14) TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEC. ID. Nº 15)
60 Péptidos SOST de rata con Cys adicional:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP-C (SEC. ID. Nº 16) PEPPQELENNQTMNRAENGG-C (SEC. ID. Nº 17)
15
25
35
45
55
65
ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS-C (SEC. ID. Nº 18) TEIIPGLREYPEPPQELENN-C (SEC. ID. Nº 19)
Los siguientes péptidos fueron diseñados para contener la porción de aminoácidos de la región central que se predecía que contacta con las proteínas BMP. Se añadió cisteína en el extremo C-terminal de cada péptido para conjugación con KLH y se usaron los péptidos conjugados para la inmunización. En el péptido N-terminal de Docking Core, se cambió una cisteína interna a una serina para evitar una doble conjugación con KLH.
Para SOST humano:
Secuencia de aminoácidos sin residuos de Cys añadidos:
Docking_Core_N-terminal_Peptide: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP (SEC. ID. Nº 21) Docking_Core_Cterm_Peptide: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS (SEC. ID. Nº 22) Docking_Core-N-terminal_Peptide: IPDRYRAQRVQLLCPGGEAP-C (SEC. ID. Nº 23) Docking_Core_Cterm_Peptide: QLLCPGGEAPRARKVRLVAS-C (SEC. ID. Nº 24)
Para SOST de rata:
Secuencia de aminoácidos sin residuos de Cys añadidos o substituidos:
Docking_Core_N-terminal_Peptide: IPDRYFAQRVQLLCPGG (SEC. ID. Nº 25) Docking_Core_Cterm_Peptide: PGGAAPRSRKVRLVAS (SEC. ID. Nº 26)
Inmunógenos peptídicos con adición y substitución de Cys:
Docking_Core_N-terminal_Peptide: IPDRYRAQRVQLLSPGG-C (SEC. ID. Nº 27) Docking_Core_Cterm_Peptide: PGGAAPRSRKVRLVAS-C (SEC. ID. Nº 28)
Dos regiones en SOST que interaccionan potencialmente para formar homodímeros de SOST incluyen los aminoácidos con la región central de SOST que no están presentes en Noggin. Los péptidos SOST humanos diseñados para contener esta secuencia tenían una Cys C-terminal o N-terminal que estaba conjugada con KLH. Para el péptido SOST de rata, se añadió una cisteína al extremo carboxi de la secuencia (SEC. ID. Nº 31). Se usaron los péptidos conjugados con KLH para la inmunización.
Para SOST humano:
CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEC. ID. Nº 29) IGRGKWWRPSGPDFRC (SEC. ID. Nº 30)
Para SOST de rata:
PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEC. ID. Nº 31)
Péptido SOST de rata con cisteína añadida:
PNAIGRVKWWRPNGPDFR-C (SEC. ID. Nº 32)
La segunda región en SOST que interacciona potencialmente para formar homodímeros de SOST incluye la región C-terminal. Se diseñaron inmunógenos peptídicos para que incluyeran secuencias de aminoácidos en esta región (véase a continuación). Para la conjugación con KLH, se añadió un residuo de cisteína al extremo C-terminal, y se usaron los péptidos conjugados para la inmunización.
Para SOST humano:
KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA (SEC. ID. Nº 33) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP (SEC. ID. Nº 34) RPQKGRKPRP RARSAKANQA (SEC. ID. Nº 35) RARSAKANQA ELENAY (SEC. ID. Nº 36)
Inmunógenos peptídicos con Cys añadida en el extremo C:
KRLTRFHNQS ELKDFGTEAA-C (SEC. ID. Nº 37) ELKDFGTEAA RPQKGRKPRP-C (SEC. ID. Nº 38) RPQKGRKPRP RARSAKANQA-C (SEC. ID. Nº 39)
RARSAKANQA ELENAY-C (SEC. ID. Nº 40)
Para SOST de rata:
5 KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEC. ID. Nº 41) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEC. ID. Nº 42) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEC. ID. Nº 43)
Inmunógenos peptídicos con Cys añadida en el extremo C:
10 KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ-C (SEC. ID. Nº 44) KGRKPRPRARGAKANQAELENAY-C (SEC. ID. Nº 45) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR-C (SEC. ID. Nº 46)
15 Ejemplo 4
Ensayo para detectar la unión de anticuerpos a una proteína de unión a TGF-beta
Este ejemplo describe un ensayo para detectar la unión de un ligando, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento 20 del mismo, a esclerostina.
Se preparó una proteína de fusión FLAG®-esclerostina según protocolos facilitados por el fabricante (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y como se describe en la Patente Estadounidense Nº 6.395.511. Se reviste cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con anticuerpo monoclonal anti-FLAG® (Sigma Aldrich) y se bloquean después con
25 BSA al 10% en PBS. Se añade la proteína de fusión (20 ng) a 100 l de PBS/0,2% de BSA y se adsorbe sobre la placa de 96 pocillos durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se retira esta solución de proteína y se lavan los pocillos para eliminar la proteína de fusión no unida. Se diluye una BMP, por ejemplo, BMP-4, BMP-5, BMP-6 o BMP-7, en PBS/0,2% de BSA y se añade a cada pocillo a concentraciones que van desde 10 pM hasta 500 nM. Tras una incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, se retira la solución de unión y se lava la placa tres
30 veces con volúmenes de 200 l de PBS/0,2% de BSA. Se detecta la unión de la BMP a la esclerostina usando antisuero policlonal o anticuerpo monoclonal específico para la BMP y un reactivo de segunda etapa conjugado a enzima apropiado según técnicas ELISA estándar (véase, v.g., Ausubel et al., Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22 (1998)). Se calcula la unión específica restando la unión no específica de la unión total y se analiza usando el programa LIGAND (Munson y Podbard, Anal. Biochem. 107: 220-39 (1980)).
35 También se detecta la unión de esclerostina a una BMP por detección de fluorescencia con resolución temporal homogénea (Mellor et al., J Biomol. Screening, 3: 91-99 (1998)). Se une operativamente una secuencia polinucleotídica codificante de esclerostina a una región constante de inmunoglobulina humana en una construcción de ácido nucleico recombinante y se expresa como una proteína de fusión Fc humano-esclerostina según métodos
40 conocidos en la técnica y aquí descritos. De forma similar, se somete un ligando de BMP a ingeniería y se expresa como una proteína de fusión BMP-Fc de ratón. Se incuban estas dos proteínas de fusión conjuntamente y se lleva a cabo el ensayo como describen Mellor et al.
Ejemplo 5
45 Ensayo de cribado para anticuerpos que inhiben la unión de los miembros de la familia TGF-beta a la proteína de unión a TGF-beta
Este ejemplo describe un método para detectar un anticuerpo que inhibe la unión de un miembro de la familia TGF
50 beta a esclerostina. Se realiza un ELISA esencialmente como se describe en el Ejemplo 4, excepto por mantener fija la concentración de BMP a su Kd (determinada, por ejemplo, mediante análisis BIAcore). Además, se añade un anticuerpo o una genoteca o colección de anticuerpos a los pocillos a una concentración de 1 M. Se incuban los anticuerpos durante 2 horas a temperatura ambiente con la BMP y la esclerostina, se retira la solución y se cuantifica la BMP unida como se ha descrito (véase el Ejemplo 4). Los anticuerpos que inhiben un 40% de la unión
55 de BMP observada en ausencia de anticuerpo se consideran antagonistas de esta interacción. Estos anticuerpos son además evaluados como inhibidores potenciales realizando estudios de titulación para determinar sus constantes de inhibición y su efecto sobre la afinidad de unión de la proteína de unión a TGF-beta. También se pueden realizar ensayos de control de especificidad comparables para establecer el perfil de selectividad para el antagonista identificado usando ensayos dependientes de la acción del ligando de BMP (v.g., un estudio competitivo
60 de BMP/receptor de BMP).
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