JPH08507077A - ワクチン送達系、および活性成分の遠隔封入のための保存安定性前駆溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗原を粘膜部位に送達して免疫グロブリン産生を刺激するためにＳＤＭＣを用いるワクチン送達系が記載されている。ワクチンは、ＳＤＭＣに組み込まれた病原サブユニットを含む。ワクチン送達系を調製するのに用いられ、活性成分の遠隔封入に役立つ保存安定性前駆溶液の製法も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン送達系、および活性成分の遠隔封入のための保存安定性前駆溶液 ［発明の技術分野］ 本発明は、粘膜部位にワクチン類を送達して免疫グロブリン産生を刺激するた めの機構系、ならびにワクチン類および脂質被包活性成分の生産に関する。 ［発明の背景］ ある特定のワクチンの投与経路は、いくつかの要因に依存する。考慮すべき要 因としては、感染開始の部位、疾病の進行の部位、全身的または非全身的な併発 、用いた特定のワクチンの病原性、および誘導したいと思う免疫の型式などがあ る。ワクチンは、経口的にも、非経口的にも、また吸入によっても与えられてい る。ワクチンの経口および吸入投与は、感染に対する防衛の第一線として分泌性 免疫グロブリンの産生を刺激するのが望ましいときに、好ましい。また、ワクチ ンの経口投与は、特定の病原生物の場合には、たとえその生物が投与の前に減毒 されていても好ましいことがある。 ワクチンとして投与される特定の生物の病原性が増大するにつれて、不完全な 減毒に関する懸念も増大する。完全な生物体に代えて、生物体の表面に発現され た抗原分子の蛋白質サブユニットを利用する代替策が開発されている。しかし、 そのような材料は、抗原性であるのが一般的であるとはいえ、必ずしも免疫原性 であるとは限 らない。免疫原性は、その他の要因の中でもとりわけ、大きさに依存する。特に 病原性の強い生物の抗原−免疫原二分類法に取り組むいくつかの試みがなされて いる。これに関しては、特定の抗原の免疫原性を増強するために、様々なアジュ バントが開発され、それらは、キーホールリンペットヘモシアニン、水酸化アル ミニウムゲル、アルギン酸ナトリウム、合成ポリヌクレオチド、ムラミルジペプ チド、百日咳菌（Bordetellapertussis）、フロインド完全アジュバント（鉱油 、水およびマイコバクテリア抽出物のエマルジョン）ならびにフロインド不完全 アジュバント（水および油のみのエマルジョン）のような材料を包含する。リポ ソームもアジュバントとして用いられている。 リポソームは、問題の各種の分子を捕捉できる脂質含有小胞である。以前は、 ほとんどのリポソームは、中心核内への抗原の捕捉という原理によるアジュバン トとして機能した。しかし、脂質二重層内での抗原の統合を試みるリポソームが 開発されている。 Bolcsakらに対して1992年３月31日に発行された米国特許第5,100,662号明細書 は、ステロールを単独にか、または追加のリポソーム形成脂質とともに含むリポ ソーム類もしくはリポソーム状の構造を記載している。ミセル、逆ミセル、六方 相、多重膜小胞または単一膜小胞のようなリポソーム構造が記載されている。リ ポソームは、有機溶媒を用いて、または用いずに調製してよく、 免疫原の捕捉または会合後に、ワクチンとして機能してよい。 ワクチンの調製に特に指向されてはいないが、Gilbertらに対して1991年９月1 7日に発行された米国特許第5,049,388号明細書は、医療用の微粒子エアゾルのリ ポソームおよびリポソーム−薬物結合体を記載し、該薬物または医薬は、リポソ ーム膜と相互作用性であるため、その破裂に際しても、該薬物または医薬はリポ ソームから失われないことを開示している。エアゾル化する前は、リポソームは 大きさが不均一である。 de Vriesに対して1990年２月13日に発行された米国特許第4,900,549号明細書 は、免疫原性複合体の調製法に関する。該特許は、疎水性および親水性領域を含 む洗剤、ステロールならびにグリコシドを含有する溶液に接触させた両親媒性の 抗原性蛋白質またはペプチドを記載している。その後、洗剤を除去し、免疫原性 複合体を精製する。あるいは、溶液は、リン脂質、好ましくはホスファチジルエ タノールアミンを更に含んでもよい。この構造は、リン脂質が存在するか否かに 応じて、それぞれ籠状の、または二次元の凝集体からなるとして記載されている 。 病原サブユニットをリポソーム製剤に組み込んで免疫応答を刺激することは、 以前から記載されている。より詳細には、ウシ流産菌（Brucella abortus）の可 溶性抗原抽出物と、ウマ流産菌（Salmonella abortus equi ）、大腸菌（Escherichia Coli）およびセラチア・マルセッセンス（Serrat ia marcescens）のリポ多糖類（ＬＰＳ）との組込みである［Fountainら：「ウ シ流産菌の可溶性抗原を含有するホスファチジルコリンリポソームの、植物血球 凝集素に対するウシリンパ球の応答に対する効果（Effect of Phosphatidylchol ine Liposomes Containing Brucella abortus Soluble Antigen on the Respons e of Bovine Lymphocytes to Phytohemagglutinin）」、Current Microbiology ）第６巻61〜64ページ（1981年）］。これらの製剤は、Schusterら：「脂質Ａを 含有するリポソームの注入によるホスホコリン、ホスファチジルコリン、スフィ ンゴミエリンおよび脂質Ａに対する抗体の産生（Production of Antibodies Aga inst Phosphocholine，Phosphatidylcholine，Sphingomyelin and Lipid A by I njection of Liposomes Containing Lipid A）」、American Journal of Immuni ty、第122巻4,003〜4,009ページ（1979年）に記載されたホスファチジルコリン リポソーム製剤への抗原の組込みを必要とし、該リポソーム内へのサブユニット の捕捉を必要とした。 慣用のリポソーム製剤、すなわち、問題の分子を捕捉するそれらは、いくつか の理由からワクチン形成には不充分である。それらは、一般に、大きさが不均一 であり、生体内での適用のために滅菌するのが困難である。それらの安定性また は保存性は、非常に限られているこ とが多い。更に、捕捉のためのパッセンジャー分子の選択が限定されることがあ る。 溶媒希釈微小担体（ＳＤＭＣ）と呼ばれる両親媒性賦形剤からなる新たなリポ ソームが開発され、これは、小胞の形成の際に球形の二重層によって作られる空 間内にではなく、脂質小胞それ自体の二重層内にか、または二重層の成分と会合 して、特定の分子の統合を可能にすることができる。ＳＤＭＣの調製は、Michae l W.Fountainに対して1992年７月28日に発行された米国特許第5,133,965号明細 書に記載されている。 特に、米国特許第5,133,965号明細書は、大きさが実質的に均一性であり、加 熱またはＵＶ照射をはじめとする様々な方法によって滅菌できるＳＤＭＣの製法 を記載している。 米国特許第5,133,965号明細書に記載された方法の変更によって、ＳＤＭＣと 、通常は非免疫原性であるか、または弱免疫原性である抗原との免疫原性複合体 の調製が実施できることが見出された。その上、ＳＤＭＣと病原のサブユニット との免疫原性複合体を形成できることが見出されている。更に、ＳＤＭＣの使用 は、経口摂取および経鼻吸入をはじめとする様々な手段を用いてそのように調製 された免疫原の投与を容易にする。 更に、保存安定性であるＳＤＭＣ前駆溶液を調製することができ、ワクチンに 用いようとする抗原性材料を加えたいと思うまで、室温で貯蔵できることも見出 されて いる。ＳＤＭＣ前駆溶液は、本来は熱不安定であるか、溶媒不耐性であるか、ま たは経時的に不安定である他の活性成分を遠隔封入する方法に用いることもでき る。このように、ＳＤＭＣ前駆体は、原材料として保存し、問題の封入された活 性体を新たに調製するのに用いることができる。 ［発明の概要］ 一面では、本発明は、抗原を粘膜組織の部位へと送達して、分泌性免疫グロブ リンと全身性免疫グロブリン産生との双方の産生を刺激する方法に関する。該方 法は、ＳＤＭＣの脂質二重層への抗原の統合を含む。次いで、ＳＤＭＣに統合さ れた抗原を、粘膜組織の部位にこのＳＤＭＣ統合抗原を接触させるのに効果的な 方式で投与することができる。 もう一面では、本発明は、病原のサブユニットから免疫原を調製する方法に関 する。該方法は、病原のサブユニットおよびＳＤＭＣ前駆溶液の段階的添加を用 いる、ＳＤＭＣの脂質二重層への病原サブユニットの統合を含む。 更なる一面では、本発明は、特定の粘膜の位置に抗原を送達し、それによって 分泌性および全身性免疫グロブリンの応答を開始させるためのワクチン送達系に 関する。該ワクチン送達系は、その脂質二重層に抗原を統合したＳＤＭＣである 。 もう一つの実施態様では、保存安定性であるＳＤＭＣ 前駆溶液であって、該保存安定性前駆溶液の製造から遠く離れた位置または時間 において、活性成分を封入する方法に用いてよい前駆溶液が提供される。 ［図面の簡単な説明］ 図１は、本発明に従って調製されたＳＤＭＣ／ＦＨＡ粒子の粒度分布を示す。 図２は、本発明に従って調製されたＳＤＭＣ／ＰＴ粒子の粒度分布を示す。 ［詳細な説明］ 本発明は、ワクチンにＳＤＭＣを用いることに関する。ＳＤＭＣ、ＳＤＭＣ前 駆溶液およびそれらの調製は、Fountainに対して1992年７月28日に発行された、 引例として本明細書に組み込まれる米国特許第5,133,865号明細書に記載されて いる。この手法の変更が、ワクチン調製のためのＳＤＭＣへの抗原、特に細菌の 蛋白質サブユニットの統合を提供する。その他の病原のサブユニットも組み込む ことができる。例えば、百日咳菌、大腸菌、ウマ流産菌およびセラチア・マルセ ッセンスのような細菌からのリポ多糖類（ＬＰＳ）、ウシ流産菌の可溶性抗原抽 出物、外膜蛋白質、莢膜抗原、ウイルスのコート蛋白質、連鎖球菌やブドウ球菌 のようなグラム陽性菌からの表面コート蛋白質、肺炎球菌の抗原、ならびに線毛 および／またはfembri蛋白質はすべて、ＳＤＭＣに組み込むことができる。この リストは例示的であるものとし、網羅的ではないものとする。 具体的には、ＳＤＭＣ前駆溶液を最初に調製する。前駆溶液は、下記のホスフ ァチド：すなわち、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、 ホスファチジン酸およびホスファチジルイノシトールをほぼ６．５：２．５：０ ．７：０．３の比率で含むリン脂質材料をエタノールに、エタノールの溶媒約５ ．０〜７．５mlに対してリン脂質材料を１ｇとして溶解することによって調製す る。ホスファチドは、好ましくは、精製した大豆のホスファチドからなることが でき、米国ニューヨーク州ニューヨークのAmerican Lecithin Companyによって 供給された。次いで、このリン脂質／溶媒混合物に水を加えて、混濁した懸濁液 を形成する。この混濁懸濁液に、第二の量の溶媒、この場合はエタノールを、懸 濁液が清澄になるまで加える。室温で光学的な清澄さを有し、室温で単相性であ ることを特徴とするＳＤＭＣ前駆溶液が得られる。 次いで、ＳＤＭＣ前駆溶液と抗原との結合を、段階的な様式で実施する。この 方式での結合は、米国特許第5,133,865号明細書で必要とされた組織化の段階を 回避し、免疫原提示のための抗原の適正な統合を確保することが見出された。特 に、抗原は、このようにして、脂質二重層それ自体に組み込まれるか、または表 面と会合するかして、効果的な免疫提示がなされた。 抗原は、可溶性であるか、不溶性であるか、または多分散性であることができ る。溶解度は、水への溶解度と して定義される。段階的添加は、３型式の抗原すべてのＳＤＭＣへの組込みを可 能にすることが見出された。不溶性および多分散性抗原の特定の場合には、段階 的添加は、抗原と脂質二重層との相互作用を強いる。多分散性抗原では、相互作 用は専ら物理的である。不溶性抗原では、相互作用は主として化学的であるが、 結合は伴わない。可溶性抗原では、化学結合が生じる。 添加すべき前駆体の体積は、抗原の溶解度に依存する。必要とされる前駆溶液 の体積は、抗原の溶解度の低下とともに増大し、容易に決定できる。 好適実施態様では、５００μｇの可溶性抗原が、与えられた時間に前駆溶液に よって処理される。抗原とある体積の前駆溶液とは、前駆体５容に対して抗原１ 容という比率で混合する。前駆体と抗原との溶液の添加のそれぞれの後に、材料 を渦流に付す。この様式で、望みの量の抗原が処理されるまで、抗原と前駆溶液 とを結合させる。このようにして、脂質二重層に抗原を統合する。直ちに投与で きる、大きさの実質的な均一性を有する小胞が調製される。約２００〜４００nm の範囲の小胞の大きさが得られた。 抗原と前駆溶液との結合の後、組み込まれなかった抗原は、サイズ排除クロマ トグラフィーを用いて除去する。最終的なワクチン製剤は、セファデックスＧ− ２５のカラムを通過する。ＳＤＭＣに統合した抗原（小胞）は、ゲル層から排除 され、空隙容積で回収される。統合 されなかった抗原は、真空中に保持される。ＳＤＭＣ統合抗原の粒度の決定は、 コールター亜ミクロン粒子分析器Ｎ４ＭＤ（米国フロリダ州Hialeah、Coulter E lectronics Inc.）を用いて実施する。 組み込もうとする抗原が、弱免疫原性または寛容原性であるときは、小胞にア ジュバントを組み込むこともできる。例えば、ボイド赤痢菌（Shigella boydii ）、１型志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）およびソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）からの２％外膜蛋白質に会 合させたＬＰＳからなる抗原は、弱い免疫応答を与える。そのような場合、調製 の際に、すなわち、前駆溶液への組込みを通じて、ムラミルジ−もしくはトリ− ペプチド、脂質Ａまたは脂質Ａ誘導体を脂質二重層に組み込むことができる。あ るいは、非特異的免疫促進剤、例えば***促進因子を組み込むこともできる。 小胞は、噴霧器からの圧送またはトリガーポンプを用いるようなエアゾル化に よって経鼻的に投与することができる。あるいは、小胞を経口的に投与すること もできる。 上記のＳＤＭＣ前駆溶液は、病院、内科医、製薬業者、農業使用者その他のよ うな末端または中間使用者のための原溶液として用いることもできる。これらの 末端または中間使用者は、原ＳＤＭＣ前駆体を用いて、ワクチン剤、医薬用薬剤 、除草剤その他のような様々な活性 薬剤を封入できる。在庫ＳＤＭＣ前駆体を用いる活性薬剤の封入法は、不安定で あるか、熱不安定性であるか、または溶媒不耐性である活性成分に特に適してい る。米国特許第5,133,965号明細書は、この明細書において示された限りでの活 性体またはパッセンジャー分子を含有する安定的なＳＤＭＣ前駆溶液を製造する 方法を開示している。しかし、この明細書の方法は、活性体も同様に保存安定性 でないならば、保存安定性である前駆体を調製するには不適当であると思われる 。 本方法では、脂質を、その完全な溶解を実施するのに適切な、望まれる用途に 適合できる有機溶媒に溶解する。水を加えて混濁懸濁液を形成する。同じ型式ま たは異なる型式のいずれかの有機溶媒を追加して、光学的に清澄な、（室温で） 保存安定性であるＳＤＭＣ前駆溶液を形成する。この前駆体は、例えば、１クォ ート入りプラスチックボトルまたは不活性の５５ガロン入り貯蔵ドラム缶に梱包 するのが好ましく、末端使用者の部所、または中間的な使用に向けて出荷できる 。封入したときに、封入された活性体が、おおよそ数ケ月または数週間用い得る 消費者向け製品として販売されることができるのに充分な安定性を有する活性体 を、中間使用者が製造施設で封入するのが適切であり得る。あるいは、問題の活 性体は、末端使用の部所またはその近傍で封入し、即座に用いなければならない ような限定された安定性を有していてもよい。本発明のＳＤＭＣ前駆溶液は、そ うし た汎用性を備えている。その上、州間通商や輸出に関する規制のためにその発送 が困難であり得る活性体を含まないことから、商業で容易に出荷し得る。 本発明は、それの例示であることを意図した下記の実施例によって、より良く 理解されると思われる。 実施例１ 繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）ワクチンの調製 Satoら：「百日咳菌からの血球凝集素の分離と精製（Separation and Purific ation of the Hemagglutinins from Bordetella pertussis）」、Infection and Immunity、第41巻313〜320ページ（1983年）によって記載されたように、百日 咳菌からＦＨＡを精製した。ＦＨＡはドイツ国生物工学会（Gesellschaft fur B iotechnologiesche Forschung）から供給された。ＦＨＡの初期濃度は、pH７． ６の２０ミリモル塩化ナトリウム中で０．５mg／mlであった。全体積で３．２ml の抗原を用いた。ＦＨＡを１mlのアリコートに混合し、ＳＤＭＣ前駆溶液２００ μｌに加えた。抗原／前駆溶液の添加のそれぞれの後に、混合物を渦流に付した 。最終材料は、ＦＨＡ４〜３．２mlおよび前駆溶液８００μｌからなった。ＦＨ Ａの最終濃度は４００μｇ／mlであった。ＳＤＭＣ統合ＦＨＡ（ＳＤＭＣ／ＦＨ Ａ）の小胞の大きさを、上記に考察したとおり、コールターカウンターで測定し た。ＦＨＡ／ＳＤＭＣについての粒度分布を図１に示す。平均粒度は２３６nmで あった。９５％信頼限界は ２１９〜２５３nmであった。 実施例２ 百日咳毒ワクチン（ＰＴ）の調製 百日咳毒は、スイス国ベルンのスイス血清ワクチン研究所（Swiss Serum and Vaccine Institute）のS.Cryzにより供給された。百日咳毒の濃度は１００μｇ ／mlであった。この毒素は、pH７．６の２０ミリモル塩化ナトリウム中に供給さ れた。当初の体積は２８．８mlであった。毒素のアリコート５mlを前駆溶液１ml に加え、渦流に付した。最終生成物は、前駆体５．７mlとともにＰＴ２８．８ml からなった。ＰＴの最終濃度は８３．５μｇ／mlであった。調製された粒子の粒 度分布を図２に示す。ＳＤＭＣ統合ＰＴ（ＳＤＭＣ／ＰＴ）の小胞の大きさを、 上記に前述したとおり、コールターカウンターで測定した。ＳＤＭＣ／ＰＴ小胞 の平均粒径は２４４nmであった。９５％信頼限界は２２６〜２６２nmであった。 実施例３ 免疫化 ５〜６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（Charles Rivers）をＦＨＡ、ＳＤＭ Ｃ／ＦＨＡ、ＰＴおよびＳＤＭＣ／ＰＴで経口的に免疫化した。蛋白質４μｇと いう１投与量を０日目および４日目に与え、その後、同一投与量のブースターを ３０日目に与えた。投与の前に、マウスを６〜８時間脱水状態にし、次いで、リ ン酸緩衝食塩 水に希釈したワクチン５０μｌ、および等量のリン酸緩衝食塩水への３％重炭酸 ナトリウム、pH８．０を経口的に与えて、望みの投与量を達成した。ブースター の１０日後に、動物をエーテルで麻酔し、頸椎脱臼によって屠殺した。血液試料 を採集し、血清を分離し、試験まで−２０℃で貯蔵した。経気管挿管、およびメ チルプロテアーゼ阻害剤として２ミリモルのフッ化フェニル−メチル−スルホニ ルを含有する氷冷ＰＢＳ０．７mlでの穏やかな洗浄によって、肺洗浄液の試料を 採集した。各マウスから約０．５mlの肺洗浄液が回収された。肺洗浄液を４℃、 10,000ｘｇで５分間遠心分離して砕片を除去し、次いで、−２０℃で貯蔵した。 実施例４ 抗体の決定 酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を実施して、ＦＨＡおよびＰＴ特異性抗 体の存在を決定した。Nunc Maxisorp Immunomoduleという９６穴プレートを、１ ウェルあたり５０μｌ中に６０mgとして０．１モルＮａＨＣＯ₃（pH９．６）に 希釈したＦＨＡまたはＰＴで被覆し、４℃で１晩インキュベートした。プレート を、ＰＢＳへの１０％ウシ胎児血清（ＩＣＮ−Flow Biomedicals）１００μｌに よって３７℃、２時間で遮断した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳへの１０％ ウシ胎児血清に１：５０に希釈した血清、または１：１０に希釈した肺洗浄液１ ００μｌをウェルに加えた。プレートを ３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳへの１ ０％ウシ胎児血清で１：５００に希釈した、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ（Sout hern Biotechnology Associates，Inc.社）に対するヤギのアルカリ性ホスファ ターゼ複合抗マウス抗体１００μｌを各ウェルに加えた。ウェルを３７℃で２時 間インキュベートし、プレートを洗浄し、基質溶液１００μｌを加えた。基質溶 液は、ジエタノールアミン緩衝液、pH９．８中に二ナトリウム塩を有する、１ml あたり１０mgのｐ−ニトロフェニルリン酸塩からなっていた。２２〜２７℃の室 温で３０分間、インキュベーションを実施した。３．０モル水酸化ナトリウム５ ０μｌを加えて反応を停止した。４０５nmでの吸光度を測定した。 得られた結果は、血清および粘膜双方の抗体の応答が誘発されたことを示した 。粘膜の応答は肺洗浄液によって決定した。ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体が 検出された。抗体の応答を、対照としてＦＨＡおよびＰＴのみを用いる免疫化に よって得られた応答と比較した。ＳＤＭＣ／ＦＨＡによる抗体の応答は、血清で は３クラスの抗体のすべてについて、また肺洗浄液ではＩｇＧおよびＩｇＡにつ いて、ＦＨＡ蛋白質のみよりも約３倍強かった。ＳＤＭＣ／ＰＴについても、同 様の結果が得られた。 百日咳菌のリポ多糖類または外膜蛋白質をそれに組み込んだＳＤＭＣ（それぞ れＳＤＭＣ／ＬＰＳおよびＳＤ ＭＣ／ＯＭＰ）を用いて、鼻内でも免疫化を実施した。これらの鼻内免疫化を、 同じ材料の経口免疫化と比較した。鼻内免疫化のためには、マウスをエーテルで 麻酔し、次いで、リン酸緩衝食塩水に希釈したワクチン（小胞製剤）５０μｌを 外鼻孔に蓄積し、吸入させた。ＳＤＭＣ／ＯＭＰについては蛋白質４μｇ、ＳＤ ＭＣ／ＬＰＳについては１５μｇの乾燥重量の投与量となる希釈を実施した。希 釈は、望みの投与量によって決定されるものと思われ、約１：２〜約１：1,000 であることができる。 鼻内および経口免疫化からの肺洗浄液での抗体価は同程度であった。分泌抗体 は免疫化の７５日後に検出された。ブースターは３０日目に与えた。免疫応答は 、ブースターによって２回目の刺激を与えられ得ることも見出された。 上記の結果は、（１）ＳＤＭＣに統合された病原サブユニットは免疫原性であ り、（２）ＳＤＭＣに統合された病原サブユニットは、粘膜組織を標的として分 泌性の応答を誘発する際に効果的であり、（３）ＳＤＭＣは、非経口的でなく投 与されたときでさえ、分泌性および全身性の双方の免疫応答を刺激するのに効果 的なワクチン送達系として役立ち、そして（４）こうして刺激された免疫応答は 、持続性を有し、追加刺激できることを示している。 実施例５ 保存安定性の前駆溶液の調製、および経時的な安定性の立証 下記の方法によってＳＤＭＣ前駆溶液を調製した。前駆体調製後に異なる時間 的間隔で小胞を調製できること、そしてこれらの小胞は、同様の特性を有するで あろうことが決定された。 ＳＤＭＣ形成用前駆溶液の安定性を調べるために、ダイズレシチン３０．６kg をエタノール９６kgに加えることによって、前駆溶液の６個の複製ロットを調製 した。この混合は、低速回転プロペラを備えたステンレス鋼製の混合容器内で達 成した。室温で混合を実施した。エタノールへのダイズレシチンの混合物に、水 ９kgを加えて混濁懸濁液を形成した。次いで、エタノール３７．７kgを加えて最 終的なＳＤＭＣ前駆溶液を形成した。ＳＤＭＣ前駆溶液を混合容器から取り出し 、貯蔵用ドラム缶に貯蔵し、密閉した。貯蔵用ドラム缶を密閉する前に、前駆溶 液の各ロットのアリコートを取り出し、２４か月後に再度試料を採取した。ＳＤ ＭＣ形成用前駆溶液を、水１０mlへの各前駆溶液１mlの希釈によって、ＳＤＭＣ へと転換した。コールターＮ−４型亜ミクロン粒子分析器を用いて、各試料から のＳＤＭＣの平均粒度を決定した。結果は、ＳＤＭＣ形成用前駆溶液は、少なく とも２４カ月間安定であって、経時的にＳＤＭＣの平均粒径の僅かな増大を示す にすぎないことを示している。 実施例６ 保存安定性ＳＤＭＣ前駆溶液のワクチンの遠隔封入への使用 保存安定性のＳＤＭＣ前駆溶液、例えば、実施例５に例示したもの、または本 明細書に示した本発明の方法に従って調製したもう一つのものを基本成分として 用い、これに問題のワクチンを遠隔の部所および／または遠隔の時間で加えるこ とができる。 ＳＤＭＣ前駆体は、室温で調製かつ保持することができる。これは、前駆溶液 を調製した後、少なくとも２年間まで、おそらくはそれよりも長期間、もう一つ の部所へと出荷し、抗原の蛋白質サブユニット成分を前駆溶液に加えることがで きる。前駆溶液は、時間の経過につれて単相から分離しない限り適切である。前 駆溶液は、溶 解した抗原約１容対前駆溶液５容の比率で抗原と、望みの量の抗原が小胞に完全 に統合されるまで、段階的な様式で混合できる。組み込まれなかった抗原は、サ イズ排除クロマトグラフィーによって除去できる。 実施例７ 保存安定性のＳＤＭＣ前駆溶液の、表皮増殖因子または他の小型のペプチドも しくは蛋白質の遠隔封入への使用 実施例６に記載した方法は、皮膚または粘膜への局所的外用が望ましい封入さ れたペプチドもしくは蛋白質を調製するのに用いることもできる。 望まれるならば、加湿剤その他の許容された製剤用担体のような他の薬剤を加 えてもよい。 実施例８ 保存安定性のＳＤＭＣ前駆溶液の、熱不安定性、不安定性または溶媒不耐性で ある活性成分の遠隔封入への使用 本発明の方法は、不安定であるか、熱不安定性であるか、または溶媒不耐性で ある活性成分を送達するよう迅速に調製できるＳＤＭＣを調製するのに用いるこ とができる。保存安定性ＳＤＭＣ前駆溶液は、原溶液または基材として役立ち、 使用のまさに数週間、数日または短時間前に、活性成分をこれに加えることがで きる。この製法は、研究室、薬局、農業試験所または製造業者が活性成分をそれ に加えた結果、完成されたＳＤＭＣが、活性 成分の保存安定性について適切である、保存上安定的な時間的枠組みを有するよ うな調製済み前駆体という利点を与える。完成された製品は、活性成分がそれに 適していて、それに従って適用される目的に向けて販売してよい。例えば、ＳＤ ＭＣ中の除草性活性体の農業製剤を、望ましくない植物の葉に吹付けてもよい。 ビタミンＣという活性体を含有するＳＤＭＣ製剤を調製し、注射により、または 局所的に即座に患者に投与してもよい。日焼け防止剤または陽光濾光剤を前駆溶 液に加えて、皮膚を紫外線の露光から保護するのに役立つＳＤＭＣを与えること ができるであろう。 前述の実施例は、本発明を例示するものであって、いかなる方式でも本発明を 限定するものではない。当業者には、様々な変更が利用可能であり、そのような 変更を付記の請求項の範囲内にあるとして網羅することが意図されていることは 明白であると思われる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗原を粘膜部位に送達して、分泌性および全身性免疫グロブリンの産生を刺 激する方法であって、 （ａ）抗原を溶媒希釈微小担体に組み込んで、溶媒希釈微小担体統合抗原を形 成し； （ｂ）免疫グロブリン産生を刺激するのに充分な投与量で、該溶媒希釈微小担 体統合抗原を粘膜表面に接触させる ことを含む方法。 ２．溶媒希釈微小担体統合抗原を投与のためにエアゾル化する請求項１記載の方 法。 ３．該エアゾル化された溶媒希釈微小担体統合抗原を吸入させる請求項２記載の 方法。 ４．該溶媒希釈微小担体統合抗原を経口的に投与する請求項１記載の方法。 ５．該抗原が病原のサブユニットである請求項１記載の方法。 ６．体内の粘膜部位に抗原を送達して、分泌性および全身性免疫グロブリン応答 を開始させるためのワクチン送達系であって、 溶媒希釈微小担体内で担送される抗原 を含む送達系。 ７．該ワクチン送達系が投与のためにエアゾル化される請求項６記載の送達系。 ８．該ワクチン送達系が経口的に投与される請求項６記 載の送達系。 ９．予防接種投与のための病原サブユニットの免疫原複合体を調製する方法であ って、 （ａ）下記の段階： （ｉ）両親媒性材料を、該両親媒性材料を可溶化するのに適した第一量の 非水性溶媒中で可溶化して、第一混合物を形成し； （ii）ある量の水を該第一混合物に、混濁懸濁液を形成するのに充分な量 で添加し；そして （iii）第二量の適切な非水性溶媒を該混濁懸濁液に、室温で光学的清澄 さを有し、室温で単相であることを特徴とする前駆溶液を含む第二混合物を形成 させるのに充分な量で添加する段階 によって溶媒希釈微小担体前駆溶液を調製し、そして （ｂ）第三混合物を形成するために、水性媒体に希釈した病原のサブユニット を含む、小胞への該第三混合物の組織化を実施するのに適した所定量の抗原溶液 を該前駆溶液に添加する ことを含む方法。 １０．該所定量の該抗原溶液を２またはそれ以上のアリコート中の該前駆溶液に 添加して、該サブユニットの段階的添加を実施する請求項９記載の方法。 １１．該第三混合物を渦流に付す追加的段階を更に含む請求項９記載の方法。 １２．該抗原溶液の各アリコートを加えた後に第三混合 物を渦流に付す追加的段階を更に含む請求項１０記載の方法。 １３．該抗原溶液の１アリコートあたり５００μｇの該病原サブユニットを添加 する請求項１０記載の方法。 １４．該前駆溶液５容あたり１容の該抗原溶液を加える請求項１０記載の方法。 １５．形成された小胞が約２００nm〜約４００nmの直径である請求項１０記載の 方法。 １６．活性成分を脂質小胞中に封入する方法であって、 活性成分を前駆溶液と混合して、装荷された前駆体混合物を形成する段階を含 み、 該前駆溶液は、下記の段階： （ｉ）両親媒性材料を、該両親媒性材料を可溶化するのに適した第一量の 非水性溶媒中で可溶化して、第一混合物を形成し； （ii）ある量の水を該第一混合物に、混濁懸濁液を形成するのに充分な量 で添加し；そして （iii）第二量の適切な非水性溶媒を該混濁懸濁液に、室温で光学的清澄 さを有し、室温で単相であることを特徴とする前駆溶液を含む第二混合物を形成 させるのに充分な量で添加する段階 に従って作成されている方法。 １７．該装荷された前駆体混合物を過剰な水に希釈して、該活性成分が装荷され た溶媒希釈微小担体という賦 形剤を形成する段階を更に含む請求項１６記載の方法。 １８．該装荷された前駆体混合物を空気と混合して、該活性成分が装荷された溶 媒希釈微小担体という賦形剤を形成する段階を更に含む請求項１６記載の方法。 １９．下記の段階： （ａ）両親媒性材料を、該両親媒性材料を可溶化するのに適した第一量の非水 性溶媒中で可溶化して第一混合物を形成し； （ｂ）ある量の水を該第一混合物に、混濁懸濁液を形成するのに充分な量で添 加し；そして （ｃ）第二量の適切な非水性溶媒を該混濁懸濁液に、室温で光学的清澄さを有 し、室温で単相であることを特徴とする前駆溶液を含む第二混合物を形成させる のに充分な量で添加する段階 に従って調製された前駆溶液。 ２０．該前駆溶液を活性成分と混合して溶媒希釈微小担体という賦形剤を形成す るための指示を与えるラベルと接着されるか、またはそれを随伴する、該前駆溶 液を保持する容器を更に含む請求項１９記載の前駆溶液。