JPH08506731A

JPH08506731A - デンプン分解酵素

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Publication number: JPH08506731A
Application number: JP6518568A
Authority: JP
Inventors: トロエルスヨルゲンセン，ステーン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-02-19
Filing date: 1994-02-18
Publication date: 1996-07-23
Anticipated expiration: 2016-08-20
Also published as: WO1994019454A3; EP0694063A1; WO1994019454A2; JP3201526B2; EP1460129A2; DE69433741D1; EP0694063B1; AU6107094A; CA2156302A1; KR960701209A

Abstract

(57)【要約】デンプン分解活性を示す酵素をエンコードしており、そしてａ）部分的アミノ酸配列（Ｉ）の中の少なくとも１をエンコードしているDNA配列を含んで成り、そして／又はｂ）配列番号１−６中に示すDNA配列の中のいずれかに基づいて、そのDNA配列の中のいずれかによりエンコードされているアミノ酸配列又は配列番号９中に示すアミノ酸配列に基づいて、又は上記ａ）中に列記した部分的アミノ酸配列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれかに基づいて、調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズするDNA配列を含んで成り、そして／又はｃ）配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性をもつポリペプチドをエンコードしている、DNA構築物、並びにそのDNA構築物によりエンコードされたデンプン分解酵素。本デンプン分解酵素は、好ましくは、始原細菌起源をもち、例えば、ピロコッカス種（Py rococcus sp.）の株、例えば、ピロコッカス・フリオサス（P．furiosus）から得られることができ、そして例えば、デンプン液化のために使用されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】デンプン分解酵素発明の分野本発明は、デンプン分解酵素（amylolytic enzyme）、特にピロコッカス（Pyr ococcus ）α−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列を含んで成るDNA構築物、並びにそのDNA構築物を宿しているベクター及び細胞に関する。さらに本発明は、組換えDNA技術による上記デンプン分解酵素の製造方法に関する。発明の背景ここ10年間、好熱性微生物、例えば始原細菌により生産される酵素は、多くの工業的用途のために望ましい主にそれらの高い熱安定性のために益々重要な対象となってきた。このような超好熱性酵素の例は、好熱性始原細菌ピロコッカス（Pyrococcus）の株にあり生産されたものである。例えば、WO90／11352は、ピロコッカス株を培養し、そしてそれからアルファ−アミラーゼ調製物を単離することを含む慣用の発酵手順によりピロコッカス・ウォエセイ（P．woesei）及びピロコッカス・フリオサス（P．furiosus）の株から得られた新規のピロコッカスのアルファ− アミラーゼについて開示している。さらに、Koch et al.（1990）及びBrown et al.（1990）は、部分的に精製されたピロコッカス・フリオサス（P．furiosus）のα−アミラーゼについて記載している。WO92／02614は、ピロコッカス種から得られた新規の熱安定性プルラナーゼについて開示している。それぞれ、WO90／11352及びWO92／02614中に開示されたピロコッカスα−アミラーゼ及びプルラナーゼは、他の公知のα−アミラーゼ及びプルラナーゼに比べて非常に高い熱安定性を有することが発明され、そしてα−アミラーゼ又はプルラナーゼ活性を含む高温プロセスにおいて有用であると述べられている。その純度を改良する観点並びにその酵素を発現することができる親株を培養することにより可能であるものよりも低コストでより多量の精製酵素を提供する観点の両方において、上記デンプン分解酵素、及び一般的なデンプン分解酵素の生産を容易にすることが望ましいであろう。発明の簡単な開示本発明者は、今般、始原細菌種の株ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus f uriosus ）からα−アミラーゼをエンコードしているDNAをクローニングし、そしてそのDNAを宿している宿主細胞からのα−アミラーゼの発現を得ることに成功した。本発明は、この発明に基づく。より特に、第一の態様においては、本発明は、ピロコッカスα−アミラーゼを又はα−アミラーゼ活性をもち、そして／又はピロコッカスα−アミラーゼと免疫学的に交差反応性であるその変異体をエンコードしているDNA配列を含んで成るDNA構築物に関し、そのDNA配列は、ｉ）配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示す部分的DNA配列又は配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示すDNA配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる上記部分的配列のアナログを含んで成り、 ii）配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示すDNA配列に基づき調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズする５kbのゲノムDNA配列内に位置するゲノム・ピロコッカスDNA配列に一致し、そして／又は iii）配列番号１中に示すDNA配列又は配列番号１中に示すDNA配列に基づき調製されることができるオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる上記配列のアナログを含んで成る。図１中に示すDNA配列は、α−アミラーゼをエンコードしているオープン・リーディング・フレームを含んで成る。その部分的DNA配列２−６は、以下にさらに説明するように、このオープン・リーディング・フレームの部分から成るか又はそれに隣接する。本発明のDNA構築物の特性ii）をもつDNA配列について使用するとき用語“一致する（corresponds）”は、そのDNA配列が、以下にさらに説明するようにゲノム、cDNA及び／又は合成起源を含むいずれかの起源を有することができることを意図される。さらなる態様においては、本発明は、デンプン分解活性を示す酵素をエンコードしているDNA構築物であって、そのDNA構築物が、ａ）以下の部分的アミノ酸配列の中の少なくとも１をエンコードしているDNA 配列を含んで成り（a） AKYLELEEGG（配列番号10）；（b） VIMQAFYWDV（配列番号11）；（c） PGGGIWWDHI（配列番号12）；（d） RSKIPEWYEA（配列番号13）；（e） GISAIWLPPP（配列番号14）；（f） SKGMSGGYSM（配列番号15）；（g） GYDPYDYFDL（配列番号16）；（h） GEYYQKGTVE（配列番号17）；（i） TRFGSKEELV（配列番号18）；（j） RLIQTAHAYG（配列番号19）；（k） IKVIADVVIN（配列番号20）；（l） HRAGGDLEWN（配列番号21）；（m） PFVGDYTWTD（配列番号22）；（n） FSKVASGKYT（配列番号23）；（o） ANYLDFHPNE（配列番号24）；（p） LHCCDEGTFG（配列番号25）；（q） GFPDICHHKE（配列番号26）；（r） WDQYWLWKSN（配列番号27）；（s） ESYAAYLRSI（配列番号28）；（t） GFDGWRFDYV（配列番号29）；（u） KGYGAWVVRD（配列番号30）；（v） WLNWWGGWAV（配列番号31）；（x） GEYWDTNVDA（配列番号32）；（y） LLSWAYESGA（配列番号33）；（z） KVFDFPLYYK（配列番号34）；（A） MDEAFDNNNI（配列番号35）；（B） PALVYALQNG（配列番号36）；（C） QTVVSRDPFK（配列番号37）；（D） AVTFVANHDT（配列番号38）；（E） DIIWNKYPAY（配列番号39）；（F） AFILTYEGQP（配列番号40）；（G） VIFYRDFEEW（配列番号41）；（H） LNKDKLINLI（配列番号42）；（I） WIHDHLAGGS（配列番号43）；（J） TTIVYYDNDE（配列番号44）；（K） LIFVRNGDSR（配列番号45）；（L） RPGLITYINL（配列番号46）；（M） SPNWVGRWVY（配列番号47）；（N） VPKFAGACIH（配列番号48）；（O） EYTGNLGGWV（配列番号49）；（P） DKRVDSSGWV（配列番号50）；（Q） YLEAPPHDPA（配列番号51）；（R） NGYYGYSVWSYCGVG（配列番号52）、そして／又は、ｂ）配列番号１−６中に示すDNA配列の中のいずれかに基づいて、そのDNA配列の中のいずれかによりエンコードされているアミノ酸配列又は配列番号９中に示すアミノ酸配列に基づいて、又は上記ａ）中に列記した部分的アミノ酸配列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれかに基づいて、調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズするDNA配列を含んで成り、そして／又はｃ）配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性をもつポリペプチドをエンコードする、ようなDNA構築物に関する。さらなる態様においては、本発明は、上記DNA構築物によりエンコードされたデンプン分解酵素に関する。本文脈中、用語“デンプン分解活性（amylolytic activity）”は、問題の酵素がデンプン−分解能力をもつことを示すことを意図される。デンプン分解活性をもつ酵素、すなわちデンプン分解酵素の特定の例は、 α−アミラーゼ、プルラナーゼ（pullulanases）、neo−プルラナーゼ（neo-pul lulanases）、iso−アミラーゼ（iso-amylases）、ベータ−アミラーゼ（beta-a mylases）、CTGases、マルトゲナーゼ（maltogenases）並びにＧ−４及びＧ−６アミラーゼを含む。一般的に、先に述べた共通の機能的特徴にも抱らず、デンプン分解酵素は、共通の構造的特徴をもつことが知られている。デンプン分解酵素の２次構造は、高い相同性の領域を含んで成る、いいかえれば、アミノ酸領域が異なるタイプのデンプン分解酵素間で高く保存されていることが発明されている。例えば、Padkov yrov（1992）；Zhou（1989）及びSrensson（1988）を参照のこと。配列番号９中に示すアミノ酸配列をもつピロコッカスα−アミラーゼの一部を構成し、そしてそれ自体新規であると発見されている先に示した部分的アミノ酸配列は、それ故、本明細書に開示するピロコッカスα−アミラーゼについてだけでなく、他のデンプン分解酵素についても同様に特徴的であることが見い出されることができる。これらの部分的配列は、新規のデンプン分解酵素の同定及び単離における重要な道具を構成するよう企図される。さらなる態様においては、本発明は、本発明のDNA構築物を宿すベクター、及びそのDNA構築物又は本発明のベクターのいずれかを宿す細胞に関する。本発明を導く研究の経過において、要求されるそのDNA配列のいずれの修飾を伴わずにピロコッカスDNA配列により形質転換されたバチルス（Bacillus）株からのα−アミラーゼ発現を得ることが可能であることが、恐くべきことに発見された。例えば、翻訳されるべき遺伝子のリボソーム結合部位の修飾又は置換を含むこのような修飾は、正常には、バチルス内での効率的な翻訳、そしてそれによる非−グラム陽性DNA配列からの発現の獲得に不可欠であると考えられる。以下の実施例６中に与える説明をも参照のこと。本発明者らが知っている限り、バチルスにおけるピロコッカスα−アミラーゼ遺伝子の発現についての先行する開示は全く存在しない。本出願の優先日の直後に公開されたWO93／10248は、ピロコッカスα−アミラーゼを含む特定のタンパク質の組換え生産のための宿主細胞としてのバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）の使用について開示している。先に記載した発見に基づいて、ピロコッカスα−アミラーゼ遺伝子の直接的発現が一般的に、バチルスの株において獲得されることができると企図され、そして、従って、特定の態様において、本発明は、バチルス・リケニホルミスの細胞とは異なり、そして、ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列を含んで成るDNA構築物であって、場合により、発現ベクター上に存在するものを宿す、組換え体バチルス細胞に関する。さらなる態様においては、本発明は、組換え体デンプン分解酵素、特に組換え体ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の生産方法であって、そのデンプン分解酵素の発現を許容する条件下、好適な培養基中先に記載したような細胞を培養し、そしてそのカルチャーから得られたデンプン分解酵素を回収する、ことを含んで成る方法に関する。本発明に係る方法の使用により、デンプン分解酵素、例えば、本発明のDNA構築物によりエンコードされているピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体は、高い量において、かつ高い純度において生産され、それにより、例えば、いずれかの他の酵素活性を本質的に含まない単一成分形態における問題のデンプン分解酵素の生産を最適化することができる。本発明は、配列番号９中に示すアミノ酸を含んで成る組換えピロコッカスα− アミラーゼ又は配列番号９中に示すアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドと免疫学的に交差反応性であり、そして／又は配列番号９中に示すアミノ酸配列に少なくとも70％の相同性をもつその変異体にも関する。本文脈中、用語“変異体”は、１以上のアミノ酸残基により配列番号９のものとは異なったアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを含むことを意図される。変異体は、α−アミラーゼのＮ−末端とＣ−末端のいずれか又は両方への１以上のアミノ酸残基の付加、アミノ酸配列内の１以上の異なる部位における１以上のアミノ酸残基の置換、α−アミラーゼのいずれかの端又は両端における又はアミノ酸配列内の１以上の部位における１以上のアミノ酸残基の欠失、あるいはアミノ酸配列内の１以上の部位における１以上のアミノ酸残基の挿入をもたらすα− アミラーゼをエンコードしているDNA配列、好ましくは本発明のDNA構築物内に存在するDNA配列を好適に修飾することにより、調製されることができる。DNA配列の修飾は、よく知られた手順に従って、部位指定突然変異誘発により又はランダム突然変異誘発により、あるいはこれらの技術の組み合わせにより行われることができる。修飾の後、修飾されたDNAの遺伝子産物が発現され、そしてα−アミラーゼ活性、精製ピロコッカスα−アミラーゼとの免疫学的交差反応性、又は配列番号９中に示すアミノ酸配列との相同性についてテストされる。用語“変異体（variant）”は、α−アミラーゼ活性をもち、そして／又はピロコッカスα− アミラーゼに対して作られた抗体と反応性であるピロコッカスα−アミラーゼのサブ配列を含むことを意図されると理解されよう。本発明のDNA構築物によりエンコードされたピロコッカスα−アミラーゼは、高温において行われるデンプン融解における使用に特に好適である。従って、さらなる態様においては、本発明は、ピロコッカスα−アミラーゼ又は本発明の変異体の存在中、水性デンプン・スラリーを酵素融解に供することを含んで成るデンプン融解方法（starch liquefaction process）に関する。最後の態様においては、本発明は、デンプン融解及び／又は糖化（saccharifi cation）、デンプンの枝切断、さまざまなシロップ、例えばマルトース・シロップの生産、サイクロデキストリンの生産、及びオリゴ糖の生産、を含むデンプン修飾のための本発明に係るデンプン分解酵素の使用に関する。発明の詳細な説明配列番号２，３，４，５及び６から明らかな部分的DNA配列は、α−アミラーゼ活性をエンコードしている約５kbのDNA配列を宿す始原細菌種ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）の株から調製されたゲノム・クローンから得られる。以下の実施例を参照のこと。異なるクローン内で同定された部分的DN A配列番号３及び６は、その配列番号６が配列番号３よりも長いことを除けば、同一である。この配列の両方が、７位（GTG）に始まるα−アミラーゼのコーディング配列のＮ−末端部分を含んで成る。配列番号２及び４は、その同一のXba Ｉ部位（TCTAGA）内に始まる配列番号１中に示すコーディング配列の内部部分を構成する。配列番号２は、上流方向に読まれ、一方、配列番号４は、下流方向に読まれる。配列番号５は、そのコーディング配列の３′末端の約3.3kb下流に位置し、そして上流に読まれる。部分的DNA配列（配列番号２，３，４，５及び６）は、別々にか又は２以上の組み合わせのいずれかにおいて、ピロコッカスα−アミラーゼをエンコードしているDNA配列の単離において使用されることができる。本明細書中の実施例を参照のこと。従って、これらの配列は、配列番号１内で同定されたDNA配列の単離において、そしてそれ故に組換え体ピロコッカスα− アミラーゼの調製において重要な道具を構成することが見い出された。ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしている本発明のDN A構築物中、配列番号１中に示すDNA配列の又は配列番号２，３，４，５及び６中に示す部分的DNA配列の中のいずれかのアナログは、例えば、これらのDNA配列、よく知られた手順、例えば、部位指定突然変異誘発により調製されることができるこれらの配列の遺伝子操作された修飾物、又はピロコッカス種の株から単離されたピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列の中のいずれかのサブ配列であることができる。いずれの事件においても、類似のDNA配列は、配列番号１中に示すDNA配列又はサブ配列又はその配列全体を構成する配列番号２，３，４，５又は６の部分的DNA配列の中のいずれかに基づいて調製されることができるオリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズしなければならない。あるいは、好適なオリゴヌクレオチド・プローブは、例えば、配列番号８又は９中に示すアミノ酸配列のいずれかの部分に基づき、配列番号１，２，３，４，５、及び６の１以上のDNA配列を宿す本発明のDNA構築物によりエンコードされたアミノ酸配列に基づいて調製されることができる。成熟α−アミラーゼ酵素の配列番号９中に示すアミノ酸配列に基づき、配列番号１中に示すDNA配列がそのα−アミラーゼのエンコーディング能力に影響を及ぼさずに変化することができるような程度で分析を行った。この分析の結果として、配列番号９中に示すアミノ酸配列をもつポリペプチドをエンコードする能力を保持している最も“異なった”DNA配列が配列番号１中に示すDNA配列と約62.6％の相同性を示すものであることが判明した。従って、配列番号１中に示すDNA配列のアナログは、上記DNA配列と少なくとも 62.5％の相同性をもつもの、より好ましくは、配列番号１中に示すDNA配列と少なくとも70％の相同性、例えば少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％の相同性をもつものである。本文脈中、相同性は、第１配列の第２配列からの逸脱（ずれ）を示すその２配列間の同一性の程度として決定される。特定の態様においては、配列番号１中に示すDNA配列のアナログは、合成遺伝子である。 DNA配列のその関連オリゴヌクレオチド・プローブ（単数又は複数）とのハイブリダイゼーションは、そのDNA配列がハイブリダイズすることを許容するいずれかの好適な条件の下で行われることができる。例えば、このような条件は、例えば、５×SSC中での前浸漬、及び20％ホルムアミド、５×Denhardt's溶液、50m Mリン酸ナトリウム、pH 6.8、及び50μｇの変性音波処理ウシ胸腺DNAの溶液中、１時間〜40℃における前ハイブリダイジング、その後の、〜40℃において18時間 100μＭ ATPを補った同一溶液中でのハイブリダイゼーション、又は例えばSambr ook et al.，1989により記載された他の方法を含む特定の条件下でのハイブリダイゼーションである。本発明のDNA構築物によりエンコードされているピロコッカスα−アミラーゼの変異体の免疫交差反応性は、組換え体又は天然起源を有し、そして好ましくは本発明のDNA構築物によりエンコードされることができるピロコッカスα−アミラーゼの少なくとも１のエピトープに対して生じ又はそれと反応性の抗体を使用して検定されることができる。モノクロナール又はポリクロナールのいずれかであることができる抗体が、例えばHudson et al.，1989により記載されたように本分野において公知の方法により作られることができる。この免疫学的交差反応性は、本分野において公知の検定法を使用して測定されることができ、これらの例は、ウェスタン・ブロッティング又は、例えば、Hudson et al. ，1989中に記載されたような免疫拡散検定である。配列番号５及び６中に同定される部分的DNA配列は、以下の実施例中に記載するようなP．furiosus株DSM 3638から単離されたゲノムDNA配列のα−アミラーゼ・エンコーディング部分に隣接し、そのα−アミラーゼ・エンコーディングDNA の開始コドンが部分的配列番号６の一部を構成していることが見つかった。先に定義されたような類似のDNA配列は、同様に、他のピロコッカスのα−アミラーゼ・エンコーディング配列又は他のデンプン分解酵素をエンコードしている配列に隣接して在ることができる。従って、本発明のDNA構築物中、デンプン分解酵素、及び特にピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしている DNA配列は、好ましくは、配列番号５と６中に示すDNA配列に基づき、それぞれ調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる添付の配列番号５と６又はそれらのアナログ内で同定された部分的DNA配列の間に位置し、そして場合によりそれを含んで成るゲノムのピロコッカスDNA断片に一致する。また、先の特性ｉ）−iii）の中のいずれかをもつDNA配列とハイブリダイズするDNA配列を宿すDNA構築物も本発明の内にあると考えられる。このようなDNA構築物は、配列番号１−６中に示す配列又はそのアナログの中の１以上を含んで成ることができるが、含む必要はない。先に述べたように、配列番号１−６中に示すDNA配列は、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）株、Deutsche Samm lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHから入手可能なピロコッカス・フリオサス（P．furiosus）株DSM 3638から調製されたゲノム・クローンから決定された。デンプン分解酵素の群内に正常に在る高程度の相同性のために配列番号１−６中に示すDNA配列に相同であり、そして本明細書中に開示するピロコッカス・アミラーゼ以外のデンプン分解酵素をエンコードしているDNA配列が、好熱性生物、例えば、始原細菌を含む他の生物及び極限条件下で生存する他タイプの生物内で同定されることができることが企図される。従って、本発明に係るDNA構築物のDNA配列は、始原細菌、特に好熱始原細菌、例えばピロコッカス（Pyrococcus）属の株から、特にピロコッカス・ウォエセイ（P．woesei）又はピロコッカス・フリオサス（P．furiosus）の株から得られることができる。このような株は、始原細菌を宿すと期待される場所、例えば、温泉、等から確立された手順により単離されることができ、又は公に入手可能なカルチャー・コレクションから獲得されることができる。類似のDNA配列の例は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul turen GmbHから入手可能なピロコッカス・ウォエセイ（P．woesei）株DSM 3773 から得ることができるDNA配列である。この株から単離された染色体DNAは、ピロコッカス・フリオサスからのα−アミラーゼ遺伝子を含む4.5kbのゲノム断片とハイブリダイズすることが発見され（実施例３及び４を参照のこと）、そしてそれ故、先の特性ｉ）−iii）をもつDNA配列とハイブリダイズするDNA配列の例を構成する。さらに、本発明のDNA構築物の類似のDNA配列が、それらのα−アミラーゼ生産能力を保持している寄託されたピロコッカス・フリオサス株DSM 3638とピロコッカス・ウォエセイ株DSM 3773の突然変異体及び誘導体から獲得されることができる。デンプン分解酵素をエンコードしているDNA配列を含んで成る本発明のDNA構築物においては、配列番号９中に示すアミノ酸配列との相同性、すなわち特性ｃ）は、第一配列の第二配列からのずれを示す、そのDNA配列によりエンコードされたポリペプチドと、配列９中に示すアミノ酸配列との間の同一性の程度を示すことを意図される。特に、対応のアミノ酸配列の比較が約70％より大きい、例えば約75％、80％、85％、90％又はさらに95％より大きな同一性を現わす場合、配列番号９中に示すアミノ酸配列に相同性をもつと考えられる。配列の比較は、公知のアルゴリズム、例えば、Lipman and Pearsonにより記載されたもの（1985）を介して行われることができる。デンプン分解酵素をエンコードしている本発明のDNA構築物の好ましい例は、先に記載したようなピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA構築物である。本発明のDNA構築物のDNA配列は、よく知られた方法により調製されることができる。従って、DNA配列は、例えば、その配列を宿すことが予想される生物、例えば、先に記載されたような細胞からcDNA又はゲノム・ライブラリーを樹立し、そして慣用の手順により陽性クローンについてスクリーニングすることにより、単離されることができる。このような手順の例は、標準的な技術に従う先に記載したようなオリゴヌクレオチド・プローブへのハイブリダイゼーション（Sambro ok et al.，1989参照）、及び／又はデンプン分解性、例えば、α−アミラーゼ活性を発現するクローンについての選択、及び／又はデンプン分解酵素、例えば、本発明のDNA構築物によりエンコードされたピロコッカスα−アミラーゼに対して生じた抗体と反応性であるタンパク質を生産するクローンについての選択、である。 cDNA又はゲノム・ライブラリーからの本発明に係るDNA構築物の好ましい単離方法は、配列番号２−６中に示すDNA配列の又は本発明のDNA構築物によりエンコードされているアミノ酸配列、例えば、配列番号８又は９中に示すようなアミノ酸配列の中のいずれか、又は先に開示した部分的アミノ酸配列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれかに基づき調製された縮重オリゴヌクレオチド・プロームを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用による。例えば、このPCRは、米国特許第4, 683,202号中に、又はR.K.Saiki et al.（1988）により記載された技術を使用して行われることができる。あるいは、本発明のDNA構築物のDNA配列は、確立された標準的な方法、例えば、Beaucage and Caruthersにより記載されたホスホアミジット法（1981）、又は Matthes et alにより記載された方法（1984）により合成的に調製されることができる。このホスホアミジット法に従って、オリゴヌクレオチドが、例えば、自動DNA 合成装置内で合成され、精製され、アニールされ、リゲートされ、そして適当なベクター内でクローン化される。最終的に、このDNA構築物は、標準的な技術に従って、（適宜）合成、ゲノム又はcDNAの起源の断片、組換えDNA分子全体のさまざまな部分に対応する断片をリゲートすることにより調製された、混合ゲノムと合成、混合合成とcDNA又は混合ゲノムとcDNAの起源を有することができる。先に述べたように、本発明に係るDNA構築物は、遺伝子修飾されたDNA配列を含んで成ることができる。このような配列は、例えばよく知られた手順に従って相同的組換えのために所望のアミノ酸配列をエンコードしている合成オリゴヌクレオチドを使用した部位指定突然変異誘発により、又は例えば放射線照射を通じてのランダム突然変異誘発、化学的処理又はランダム・オリゴヌクレオチド・プライマーを使用したPCRの使用により、アミノ酸置換が導入されることが望まれるポリペプチドの部位（単数又は複数）に対応する部位において好適に修飾された、デンプン分解性の、例えば、α−アミラーゼ活性をエンコードしているゲノム又はcDNA配列に基づき調製されることができる。このDNA配列の好適な修飾の例は、ポリペプチドの他のアミノ酸配列を生じさせないが、組換えDNA分子がその中に導入される宿主生物のコドンの用い方に対応することができるヌクレオチド置換、又は、先に記載したようなデンプン分解活性及び／又は免疫学的交差反応性に関するポリペプチドに不可欠な特性を弱めずに、異なるアミノ酸配列、そしてそれ故、たぶん、異なるポリペプチド構造を生じさせるヌクレオチド置換である。他の可能性のある修飾の例は、その配列中への１以上のヌクレオチドの挿入、その配列のいずれかの端における１以上のヌクレオチドの付加、及びその配列のいずれかの端又はその内における１以上のヌクレオチドの欠失である。好ましくは、組換え体発現ベクターである本発明のDNA構築物を担持するベクターは、便利には、組換え体DNA手順に供されることができるいずれかのベクターであることができ、そして発現ベクターの選択は、それがその中に導入されるであろう宿主細胞に、しばしば依存するであろう。従って、このベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の存在物として存在し、その複製が染色体の複製から独立しているベクター、例えば、プラスミド又はバクテリオファージであることができる。あるいは、このベクターは、宿主細胞内に導入されるとき、その宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体（単数又は複数）と一緒に複製されることができるものである。 DNA構築物又はベクター中、DNA配列は、好適なプロモーター配列に作用可能な状態で接続されなければならない。プロモーターは、選択の宿主細胞内で転写活性を示すいずれかのDNA配列であることができ、そしてその宿主細胞と同種又は異種のいずれかのタンパク質をエンコードしている遺伝子から得られることができる。本発明のDNA構築物の転写に向けるのに好適なプロモーターの例は、Ｅ．コリ（E．coli）のlacオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ（agarase）遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus ste arothermophilus ）のマルトゲニック（maltogenic）アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus Amyloliquef aciens ）α−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、等である。本発明のDNA構築物及び／又は発現ベクターは、デンプン分解酵素、例えば、本発明のピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA 配列に作用可能な状態で接続された好適なターミネーターをも含んで成ることができる。好適なターミネーターの例は、バチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子のものである。本DNA構築物及び／又はベクターは、そのベクターが問題の宿主細胞内で複製することを可能にするDNA配列をさらに含んで成る。このような配列の例は、プラスミドpUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1、及びpIJ702の複製起点である。本DNA構築物及び／又はベクターは、選択マーカー、例えば、その産物が宿主細胞内の欠陥を補なう遺伝子、例えば、バチルス・サブチリス（B．subtilis）又はバチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis ）からのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する選択マーカーをも含んで成ることができる。例えば、宿主細胞として特定のバクテリアを使用するとき、細胞内発現がいくつかの点で有利であることができるけれども、一般的には、発現が、細胞外であることが好ましい。細胞外発現を得るために、そのDNA構築物及び／又は発現ベクターは、正常には、さらに、プレ領域、すなわち、発現されたデンプン分解酵素、例えば、ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をその培養基中に分泌することを許容するシグナル・ペプチドを含んで成らなければならない。デンプン分解酵素、例えば、ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードするDNA配列、プロモーター、ターミネーター及び他の要素をそれぞれリゲートすることを含んで成る本発明のDNA構築物を構築し、そして、それを、複製に必要な情報を含む好適なベクター内に挿入するために使用される手順は、当業者によく知られている（例えば、Sambrook et al.（1989）参照）。先に定義したような本発明に係るDNA構築物又は発現ベクターのいずれかを含んで成る本発明の細胞は、本発明のポリペプチドの組換え体生産において宿主細胞として有利に使用される。この細胞は、便利には、そのDNA構築物をその宿主の染色体に組み込むことにより、本発明のDNA構築物により形質転換されることができる。但し、このDNA構築物は、染色体外の存在物として存在することもできる。しかしながら、この組み込みは、一般的に有利であると考えられる。なぜなら、そのDNA配列が、その細胞内でより安定して維持される傾向があるからである。宿主染色体内へのDNA構築物の取り込みは、常法に従って、例えば、相同的組換えにより行われることができる。あるいは、その細胞は、さまざまなタイプの宿主細胞と関連して以下に記載するような発現ベクターにより形質転換されることができる。本発明に係る細胞は、高等生物、例えば哺乳動物又は昆虫の細胞であることができるが、好ましくは、微生物細胞、例えば、バクテリア又は（酵母を含む）菌の細胞である。好適なバクテリアの例は、グラム陽性菌、例えば、バチルス・サブチリス（Ba cillus subtilis ）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus br evis ）、バチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B acillus thuringiensis ）又はストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces li vidans ）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）、あるいはグラム陰性菌、例えば、Ｅ．コリ（E．coli）である。これらのバクテリアの形態転換は、例えば、それ自体公知のやり方でプロトプラスト形質転換又はコンピテント細胞の使用により行われることができる。酵母生物は、好ましくは、サッカロミセス（Saccharomyces）又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）の種、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から選択されることができる。糸状菌は、有利には、アスペルギルス（Aspe rgillus ）の種、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillusoryzae）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に属することができる。菌の細胞は、それ自体公知のやり方で、プロトプラスト形成及びそのプロトプラストの形質転換その後のその細胞壁の再生を含む方法により、形質転換されることができる。バチルス・リケニフォルミスの細胞とは異なり、そしてピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNAを含んで成るDNA構築物を宿す、本発明に係る組換え体バチルス細胞は、好ましくは、バチルス・サブチリス（Ba cillus subtilis ）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stea rothermophilus ）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Baci llus circulans ）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、又はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の株から選ばれる。本発明に係る組換え体バチルス細胞内に宿されたDNA構築物は、好ましくは、先に定義したようなDNA構築物であり、その中では、ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列は、ピロコッカス・ウォエセイの株又はピロコッカス・フリオサスの株から、特に、ピロコッカス・ウォエセイ株DSM 3773又はピロコッカス・フリオサス株DSM 3638から、あるいはそれらのα −アミラーゼ生産能力を保持している上記株の突然変異体又は誘導体から得られることができる。デンプン分解酵素、例えば、ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体を製造するための本発明の方法において、先に定義したような本発明の細胞は、そのデンプン分解酵素の発現を許容する条件下で好適な培養基中で培養され、そして、得られた酵素は、そのカルチャーから回収される。これらの細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞の成長に好適ないずれかの慣用の培地であることができる。好適な培地は、商業的な供給者から入手可能であり、又は（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中の）公開されたレシペに従って調製されることができる。デンプン分解酵素、例えば、ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体は、適宜、細胞の破壊後に、遠心分離又はろ過により培地から細胞を分離し、塩、例えば、硫酸アンモニウムによるその上清又はろ液のタンパク質成分の沈殿、その後の、さまざまなクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、等による精製を含む慣用の手順によりその培地から回収されることができる。本発明のDNA構築物によりエンコードされ、そして／又は本発明の方法により生産されたピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体は、α−アミラーゼ活性が必要とされるいずれかの工程、例えば、ワイン又は果実産業において使用されるデンプン交換又は融解において、パルプ及び製紙工業において使用されるべきデンプンの修飾のために、あるいは、繊維の製造における繊維の糊抜き（desizi ng）用途のために、使用されることができる。また、本ポリペプチドは、ドウ及び／又はベークされた製品の特性を改良するためのベーキングにおいて、そして例えば洗剤添加物又は洗剤組成物の構成成分としての洗剤目的のために、使用されることができる。他の用途は、生物学的廃棄物の分解、バイオマス交換又は分解、あるいは生物学的材料からのエネルギーの調製を含む。その高い熱安定性のために、本発明に係るピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体は、高い熱安定性が有利である工程のために特別の用途を有することが企図される。このような工程の例は、例えば、WO90／11352（この内容を引用により本明細書中に取り込む。）中に開示されているように行われるデンプン融解（液化）工程である。より特に、本発明のデンプン液化工程は、デンプンを糖に酵素的に変換するために、例えば、燃料アルコール又は高フルクトース・シロップ（HFS）の生産のために、使用されることができる。好適な液化条件は、100−140℃において120 分間以上、より好ましくは、100−120℃において１−60分間、最も好ましくは、 105−110℃において１−30分間であり、場合によりその後の、約30−120分間90 −100℃のレンジ内で保持されるであろう上記温度の減少である。上記水性デンプン・スラリーにカルシウム塩を添加しないことが好ましい。このpHは、3.5−6 .0内、より好ましくは、4.0−5.5、最も好ましくは、4.2−4.8内に保たれなければならない。連続工程が好ましく、そして加熱は、最も好ましくは、ジェット− クッキングによるものである。本発明のα−アミラーゼ又はその変異体の投与レベルは、典型的には、デンプン１ｇDS（乾燥物質）当り５−500NU、好ましくは、10−50NUのレンジ内にある。このデンプン濃度は、普通には、15−45％DS（ｗ／ｗ％乾燥物質）、最も普通には25−30％DSのレンジ内にあるであろう。（NOVO α−アミラーゼ・ユニットの略号である）活性標準NUは、７−20分間の反応時間にわたり、37℃、pH 5.6及び0.0043ＭのCa⁺⁺において、１時間当り5. 26mgの溶解デンプンを加水分解する酵素の量である。この分析法について記載する折本AF９／６は、NOVO NORDISK A/Sに対する要求に基づき入手可能である。ピロコッカスα− アミラーゼの活性は、60℃において測定され、そして同一条件下で検定されたTe rmamyl標準に関係付けられる。液化したデンプンは、その後、中間のpH調整を実質的に伴わずに、グルコアミラーゼの存在中の酵素的糖化に供されることができる。この場合において、デンプンは、pH 3.5−6.0において、より好ましくは、pH 4.0−4.5、最も好ましくは pH 4.2−4.8において、本発明のα−アミラーゼ又は変異体により融解される。この液化デンプンは、枝切断酵素、例えば、プルラナーゼ（pullulanase、詳細についてはEP 63 909を参照のこと。）との組み合わせにおけるグルコアミラーゼ及び／又は例えば、アスペルギルス・ニガー（詳細については、EP 140 410を参照のこと。）からの酸安定α−アミラーゼの存在中、その後の酵素的糖化に供されることもできる。本発明の液化方法は、エタノールの製造のために使用されることもできる。この場合において、デンプンは、3.5−6.0の、より好ましくは、4.0−5.5のpHにおいてα−アミラーゼにより、その後の、グルコアミラーゼによる糖化及び酵母による同時又はその後の発酵により液化される。その後、アルコールは、本分野において公知の方法により回収されることができる。好ましくは、中間のpH調整のいずれをも伴わずに約4.5のpHにおいて行われ、そして同時糖化及び発酵が96時間までの間30−35℃において行われる。この液化は、低いDSレベル（15−20％）又は高いDSレベル（20−40％）のいずれかにおいて行われることができる。この高いDS工程においては、そのDSレベルは、ほとんどの酵母が耐えることができるほぼ最大である約10容量％のアルコールを得るために、発酵に先立って約20％まで減少されなければならない。アルコール製造のための原材料は、精製デンプン、例えば、湿式粉砕トウモロコシ・デンプン；生の未加工材料、例えば、トウモロコシ（corn）、小麦、米、ソールガム、カッサバ（cassawa）及びポテト（これらのデンプン含量は、15〜80％のレンジにある。）；並びに工業からの廃棄物及び副生成物のような物質を含む他のデンプンを含むことができる。さらに、このデンプン液化は、ａ）場合により、好適な発現ベクター内に存在する、ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしている本発明に係るDNA構築物を、好適な宿主生物内に、挿入し、ｂ）そのピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の発現を許容する条件下、好適な培養基中で、その宿主生物を培養し、そしてそのカルチャーから、得られたピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体を回収し、そしてｃ）上記段階のそれぞれを先に記載したように行いながら、水性デンプン・スラリーを、段階ｂ）において回収したピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の存在中での酵素的液化に、供する、を含んで成る工程により、行われることができる。図面の簡単な説明本発明を、添付図面を参照しながら、以下に記載する。ここで、図１は、そのヌクレオチド配列を配列番号７中に示す、プラスミドpSJl678を表し、図２は、プラスミドpSJ2467を表し、図３は、プラスミドpSJ2481を表し、図４は、プラスミドpSJ2482を表し、図５と６は、実施例５中に記載するサザン分析の結果を表し、図７は、プラスミドpSJ2487とpSJ2488を表し、図８は、プラスミドpSJ2489とpSJ2490を表し、図９は、実施例６中にさらに記載するような本発明に係るDNA構築物のα−アミラーゼ活性を表し、そして図10と11は、それぞれ、24と48時間にわたり本発明に係るDNA構築物によりエンコードされたα−アミラーゼに晒されたデンプンから得られたオリゴ糖の分布を表すクロマトグラムである。以下の略号を、プラスミド図上で使用する： rep pUB110 Repタンパク質のための遺伝子（Gryczyn et al.，1978） cat pC194からのクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼのための遺伝子（Horinouchi and Weisblum，1982） p15A Ori Ｅ．コリ（E．coli）のクリプティック（cryptic ）プラスミドからの複製機能（Chang and Cohen， 1978） PamyM バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus S tearothermophilus）からのプロモーター領域（ Diderichsen and Chnistiansen，1988） KanD それ自体のプロモーターについて欠失されたpUB1 10からのカナマイシン耐性遺伝子 pUB110 Ori pUB110のための２本鎖複製起点 amyA・pfu ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosu s）からのアルファ−アミラーゼ遺伝子 bla pUCプラスミドからのベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Yanish-Perron et al.，1985） Plac pUCプラスミドからのベータ−ガラクトシダーゼ・プロモーター 'amyA・pfu ５′末端内で切り詰められたamy・pfu遺伝子 amyA−pfu′ ３′末端内で切り詰められたamyA−pfu遺伝子本発明を、本明細書中に定義するように本発明の範囲をいずれの方法によるかを問わず限定することを意図されない以下の実施例により、さらに説明する。材料及び方法バクテリア Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Brausch neig，Germanyから入手可能なピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）DSM3638及びピロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）DSM3773。これらの株を、その株と一緒に上記DSMから供給されるような記載に従って培地中で成長させた。Ｅ．コリ（E．coli）SJ2は、Diderichsen et al.，1990により記載されており、そして細胞を、供給者により記載されたようにBIO-RADからのGene Pulser^TMエレクトロポレーターを使用したエレクトロポレーションのために調製し、そして、それにより形質転換した。バチルス・サブチリス（B．subtilis）DN1885は、Diderichsenet al.，1990により記載されており、そしてコンピテント細胞を、Yasbin et al.，1975により記載されるように調製し、そして形質転換した。プラスミド pSJ1678（図１）を、遺伝子ライブラリーの構築におけるクローニング・ベクターとして使用した。pSJ1678の全体配列を、添付の配列番号７中に与える。 pUC19（Yanish-Perron et al.，1985）を、サブクローニングのために使用した。一般的方法上記プラスミドを構築するために使用した実験技術は、組換えDNA技術の分野内の標準的な技術であった。Sambrook et al.，1989を参照のこと。制限エンドヌクレアーゼを、New England Biolabs及びBoehringer Mannheimから購入し、そしてその製造者により推奨されるように使用した。T4 DNAリガーゼを、New England Biolabsから購入し、そしてその製造者により推奨されるように使用した。全ての株からのプラスミドDNAの調製を、Kieserにより記載された方法、1984 により行った。ト；Pharmacia Diagnostics，SW）を使用して、620nmにおける吸収／mlとして測定されることができる。この検定を、請求により入手可能なNovo Nordisk AF出版物AF-207／-GB中に記載された手順に従って、0.15mMカルシウムの存在中、60 ℃、pH 7.3において15分間、行う。この酵素活性を、酵素標準の活性と比較し、そしてその結果を、その酵素標準のものと同一のユニットにおいて表した（例えば、本明細書中に定義したようなNU）。培地プラスミド調製のための液体カルチャーを、適当な抗生物質を補ったTY培地中で成長させた。トリプチカーゼ（Trypticase） 20ｇ／ｌ酵母エキス 5ｇ／ｌ FeCl₂・4H₂O 6mg／ｌ MnCl₂・4H₂O 1mg／ｌ MgSO₂・7H₂O 15mg／ｌ pH 7.3 酵素生産及び特徴付けのための液体カルチャーを、関連抗生物質を補ったTerr ificブロス中で成長させた。バクト−トリプトン 12ｇバクト酵母エキス 24ｇグリセロール 4ml 水 900mlまでオートクレーブ後、100mlの以下の別々にオートクレーブした溶液を添加した。 KH₂PO₄ 0.17Ｍ K₂HPO₄ 0.72Ｍ固体培地は、LB寒天であった。バクト−トリプトン 10ｇ／ｌバクト酵母エキス 5ｇ／ｌ NaCl 10ｇ／ｌバクト寒天 15ｇ／ｌ NaOHによりpH 7.5に調整した。アミラーゼ活性の可視化のための培地は、以下のように調製した10mlの染色されたアミロペクチン溶液を、500ml寒天当りに含むLB寒天であった。 12.5ｇのアミロペクチン（Serva 2000-4000kD）を、250ml水中に沸騰により溶解し、室温まで冷却し、30ml 4Ｍ NaOHと2.5ｇ Cibacron Rot Bを添加し、そしてその溶液を一夜インキュベートした。pHを、４Ｍ HClにより７に調整する。50 0mlの96％エタノールを、撹拌しながら添加して、赤色の粘性沈澱物としてアミロペクチンを沈澱させる。その上清を、捨て、そのアミロペクチンを、わずかな加熱により200mlの水中に溶解し、そしてエタノールによる沈澱を繰り返す。このアミロペクチンを再び200mlの水に溶解し、オートクレーブにかけ、そして使用に備える。実施例実施例１ピロコッカス・フリオサスα−アミラーゼ遺伝子のクローニングピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）DSM 3638からのゲノムDNA を、Pitcher et al.，1989の方法により単離した。約100μｇのDNAを、Sau3Aにより部分消化し、スクロース勾配上でサイズ分画し、そして３〜７kb間の断片をプールした。クローニング・ベクターpSJ1678を、BamHＩにより消化し、そして3.8kb断片を、アガロース・ゲルから精製した。約0.75μｇベクター断片を、約４μｇのサイズ分画されたP．furiosusの染色体DNAにリゲートし、そしてエレクトロポレーションによりE．coli SJ2を形質転換するために使用した。遺伝子バンクを、10μｇ／mlのクロラムフェニコールを補い、そして染色されたアミロペクチンを含むLBプレート上にプレートした。37℃において一夜インキュベートした後、それぞれのプレートを、２つの新たなプレート上にレプリカ・プレートし、そしてそれを次に、37℃において一夜インキュベートした。これらの中の１を、その後、一夜60℃においてインキュベートした。アミロペクチンの分解を示す透明の輪（clear halos）が、60℃のプレート上（全部で10000の中の）５コロニーの周囲に観察され、一方、37℃に維持されたプレート上のコロニーの周囲には輪は全く観察されなかった。これらの37℃プレートから採取したこれらの５株を、SJ2463−SJ2467として保存した。制限消化は、４クローン、SJ2463，SJ2464，SJ2465及びSJ2467上のP．furiosus DNA挿入物が、その挿入物が全体として同一ではないが共通のDNA 領域を共有していることを現わし、一方、pSJ2466上に含まれるDNAは、これらの４クローンと無関係であるようであった。pSJ2467（図２）は、約4.5kbの挿入物を含み、そしてさらなる分析のために使用された。実施例２pSJ2467から生産されたアミラーゼを使用したデンプン分解 E．coli SJ2467（pSJ2467を宿す先に記載したE．coli SJ2）を、37℃において３日間、６μｇ／mlクロラムフェニコールを補ったTerrificブロス培地中で成長させた。その培養ブロス中のE．coli細胞を、音波処理により溶解させた。１のサンプルを直接的に滅菌ろ過し、他のサンプルを短時間の熱処理後に滅菌ろ過した。２ｇのモチ・トウモロコシ（waxy corn）デンプンを、180×18mmガラス培養管内で、40ppmのCa⁺⁺を含むpH値4.3，5.0と5.5の、10mlの0.1Ｍアセテート・バッファーによりスラリーとした。約２NU／mlのピロコッカス・フリオサス・アミラーゼを含む２mlの熱処理（105℃、５分間）E．coli音波処理抽出物を、添加し、そしてそのpHを、周囲温度において調整した。この密封ガラス管を、105℃における定熱油浴に移し、そして激しく撹拌した。ゲル化の数分以内に、そのデンプンは液化した。サンプルを定期的に取り出し、そしてヨウ素（５ml脱イオン水中の１滴の0.1Ｍヨウ素）によりテストした。以下の結果を得た。上記テストは、E．coli内で発現されたP．furiosusアミラーゼが、活性であり、高温及び低pHにおいて、デンプンの存在中、安定である、ということを立証している。さらに、上記テストは、E．coli内で活性形態における極めて好熱性のP．furi osus アミラーゼの発現を得ることができるということを立証している。その生来の環境において合成され、分泌され、そして100℃において活性な３次構造に折り畳まれているピロコッカスα−アミラーゼが、37℃においても活性形態で生産されることができるということが恐ろくべきことに考えられる。さらなる実験において、２ｇのトウモロコシ・デンプンを、180×18mmガラス培養管内で、２mlの１Ｍアセテート・バッファー、pH5.5によりスラリーとした。約１NU／mlのP．furiosusアミラーゼを含む10mlのE．coli音波処理抽出物を添加し、そしてそのpHを周囲温度において5.5に調整した。この密封ガラス管を、105℃における定熱油浴に移し、そして激しく撹拌した。ゲル化の数分以内に、そのデンプンは液化した。サンプルを定期的に取り出し、そしてヨウ素（５ml脱イオン水中の１滴の0.1Ｍヨウ素）によりテストした。サンプルをHPLC分析のためにも採取した。以下の結果を得た。図10と11中に示すクロマトグラム中に見られるオリゴ糖の分布は、エンド−アミラーゼ攻撃の典型である。長い加水分解の間に形成された主なオリゴ糖は、DP 5，DP6及びDP7である（ここで、DP＝重合度）。実施例３P．furiosusα−アミラーゼ遺伝子のサブクローニング pSJ2467をClaＩにより消化し、そしてα−アミラーゼ遺伝子を含む4.5kb断片を、AccＩ消化pUC19 DNAとリゲートし、そしてリゲーション混合物をE．coli SJ 2に形質転換した。そのクローニング・ベクターに対して２つの可能な方向のそれぞれにおいてその挿入物を含む形質転換体が得られた。これらは、pSJ2481（図３）を含むSJ2481、及びpSJ2482（図４）を含むSJ2482であった。両方のクローンは、60℃におけるインキュベーションの後に染色されたアミロペクチン・プレート上での透明の輪の出現により可視化されるようにα−アミラーゼを生産する。このアミラーゼ−産生形質転換体は、pUC19ベクター・プラスミドだけを含む形質転換体と比べていくぶん病的に見える。それらは、より小さく、より半透明なコロニーを形成する。さらなるサブクローニングを、pSJ2481から行った。pSJ2487（図７）を、pSJ2 481からの１kb XbaＩ断片の欠失及びE．coli SJ2内への再リゲート・プラスミドの形質転換により行った。得られた形質転換体は、染色されたアミロペクチンを含むLBプレート上で輪を作り出すことができず、このことは、上記の欠失が、活性アミラーゼ・タンパク質の発現に重要なDNA領域を除去したということを示している。 pSJ2481からの１kb XbaＩ断片を、XbaＩ消化pUC19内に挿入して、pSJ2489とpS J2490（同じ図８）を得た。実施例４DNA配列 pUC19内の数サブクローン上の挿入物の端を、そのpUC19マルチリンカー領域のちょうど外側にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド・プライマー及びSequen ase^TMを使用して２本鎖プラスミド上で直接的に、配列決定した。得られた配列を、配列番号２，３，４，５及び６中に与える。配列番号２は、pSJ2490から得られ、そしてpUCポリリンカー内のEcoRＩ部位の次の挿入物の端から読まれる。配列番号３は、pSJ2489から得られ、そしてpUCポリリンカー内のHindIII部位の次の挿入物の端から読まれる。配列番号４は、pSJ2487から得られ、そしてpUCポリリンカー内のEcoRＩ部位の次の挿入物の端から読まれる。配列番号５は、pSJ2482から得られ、そして上記ポリリンカー内のEcoRＩ部位の次の挿入物の端から読まれる。配列番号６は、pSJ2482から得られ、そしてpUCポリリンカー内のHindIIIの次の挿入物の端から読まれる。本明細書中に与えるDNA配列に基づき、PCR反応においてピロコッカス・フリオサスの染色体DNAからpSJ2467及びpSJ2481／2482上に含まれるピロコッカス・フリオサスDNA挿入物の全体を増幅するために使用されることができるオリゴヌクレオチド・プライマーを合成し、それにより、入手可能な材料からこれらのプラスミドを再構築することができるであろう。実施例５サザン分析 pSJ2481を、Amershamから得た商業的キットを使用してニック−トランスレーションにより³²Ｐ−ラベルし、そしてサザン分析におけるプローブとして使用した。ハイブリダイゼーションは、一夜、60℃における、10×Denhardts溶液、１％SDS、10mM EDTA及び５×SSC中、その後の、２×SSC、0.1％ SDS中室温における２回の15分間洗浄、そして60℃における１回の15分間の洗浄であった。得られた露出物を図５と６中に示す。図５は、１）pSJ2463，pSJ2464，pSJ2465及びpSJ2467が先に述べたような共通DNA領域を含むこと（約0.5kbのHindIII断片がpSJ2463（レーン１）、pSJ2464（レーン２）、pSJ2465（レーン３）、pSJ2467（レーン５）及び染色体P．furiosus DNA（レーン７）に共通である。）２）pSJ2481上の挿入物が、P．furiosusの染色体（レーン７）から得られること、を表している。図６は、３）相同DNA領域が、P．woeseiの染色体内に存在すること（染色体P．woesei DN AはPitcher et al．1989に従う方法により単離されている。）を表している。従って、pSJ2481は、HindIII消化P．furiosus DNA（図５、レーン７）内のものとまったく同一の、HindIII消化P．woesei DNA（レーン２）内の断片にハイブリダイズする。明確さのために、レーン２のより長い露出を、図６のレーン０として加えて、0.5kbのHindIII断片を表す。 pSJ2481、又はpSJ2481から得られる本明細書中に得られる配列情報は、それ故に、P．furiosus又はP．woeseiのいずれかの染色体からのα−アミラーゼ遺伝子を同定し、そしてそれによりそのクローニングを支援するための道具として使用されることができる。実施例６バチルス・サブチリス内でのα−アミラーゼ遺伝子の発現遺伝子ライブラリーの構築のために使用したプラスミドpSJ1678は、E．coliとB．subtilis の両方の中で複製することができるシャトル・ベクターである。 B．subtilis内でのアミラーゼ活性の発現についてテストするために、pSJ2467 を、それ故、DN1885のコンピテント細胞に形質転換して、染色されたアミロペクチンを含むLBプレート上でのクロラムフェニコール（６μｇ／ml）に対する耐性について選択した。10の形質転換体を、対照としてDN1885／pSJ1678であるSJ167 8と一緒に、染色されたアミロペクチンを含む新たなプレート上に拾い上げた。3 7℃において一夜インキュベートした後、１のプレートを65℃に移し、一方、他を、37℃に維持した。７時間後、pSJ2467による10の形質転換体の周りのアミロペクチンの分解は、透明な輪の形成として、65℃においてインキュベートされたプレート上で明らかであった。対照株の周りには、輪は全く形成されなかった（図９）。ピロコッカスα−アミラーゼ遺伝子からのアミラーゼ活性の発現が、例えば、翻訳のより効率的な開始を可能にするリボソーム結合部位の修飾又は置換の形態における、その遺伝子の修飾のいずれをも伴わずに、バチルス・サブチリス内で獲得されることができるという事実は、まったく恐ろくべきことである。一般的には、非−グラム陽性菌からクローン化された遺伝子のほとんどは、B．subtiliS内でのそれら自身の発現シグナルからの発現に失敗し（Mountain，A.，1989）、そしてB．s ubtilis 内でのピロコッカスからの遺伝子の直接発現に関する先の報告は我々の知る限り全く存在しない。実施例７ pSJ2467上でクローン化された4.5kbのP．furiosus DNA挿入物（実施例１）を、Sequenase^TM並びに先に決定された配列に基づくサブクローンとオリゴヌクレオチド・プライマーとの組み合わせを使用して、両ストランドに対して配列決定した。 α−アミラーゼ遺伝子に対応するオープン・リーディング・フレームをサブクローニングにより位置決めした（α−アミラーゼを生産する個々のサブクローンの能力を、染色されたアミロペクチンを含むプレート上で検定した。）。このオープン・リーディング・フレームによりエンコードされたα−アミラーゼは、バクテリア、昆虫及び植物を含むさまざまな生物からのα−アミラーゼ及び他のデンプン分解酵素に対する相同性を現した。B．licheniformis α−アミラーゼと並べられたとき、その配列内のさまざまな部位において18ギャップが導入されるとき約36％の同一性の程度が観察されることができるであろう。そのシグナル・ぺプチド・コーディング領域を含むα−アミラーゼ・コーディング領域のDNA配列を、配列番号１中に示す。配列番号１中に示すDNA配列に基づき、そのシグナル・ペプチド（配列番号８）とその成熟α−アミラーゼ（配列番号９）のアミノ酸配列を演繹した。 pSJ2467のマップ（図２）上、反時計廻りに読んで、α−アミラーゼ遺伝子は、4.5〜3.0位の間に位置する。本明細書中に引用した文献 S.L.Beaucage and M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters 22，1981，pp.1859-1 869、又は、Matthes et al.，The EMBO J．３，1984，pp.801-805により記載された方法。 Brown et al.，Applied and Environmental Microbiology，July 1990，pp.1985 -1991 Chang，A.C.Y.，Cohen，S.N.（1978）．p15Aクリプティック・ミニプラスミドから得られた増幅可能なマルチコピーDNAクローニング媒体の構築及び増幅、J.Bac teriol.，134，1141-1156． Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.（ 1990）．α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ、バチルス・ブレビス（Ba cillus brevis ）からのエキソ酵素をエンコードしているaldBのクローニング、J .Bacteriol.，172，4315-4321． Diderichsen，B．and Christiansen，L．バチルス・ステアロサーモフィルスからマルトゲニックα−アミラーゼのクローニング。FEMS Microbiol.Lett．5653- 60，1988． Gryczan，T．et al.（1978）．バチルス・サブチリス内への形質転換により導入されたスタフィロコッカス・アウレウスの特徴付け、J.Bacteriol.，134，318-3 29． Horinouchi et al.（1982b）“Nucleotide sequence and functionalmap of pE1 94，a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide，lincosam ide，and streptogramin type B antibiotics”J.Bacteriol.，150，804-814． Hudson et 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NOVO NORDISK A/S （Ｂ）街 Novo Alle （Ｃ）市 Bagsvaerd （Ｅ）国デンマーク（Ｆ）郵便番号 DK-2880 （Ｇ）電話 +45 44448888 （Ｈ）ファックス +45 4449 3256 （Ｉ）テレックス 37304 （ii）発明の名称デンプン分解酵素（iii）配列の数 52 （iv）コンピュータ読み込み形態（Ａ）媒質タイプフロッピー・ディスク（Ｂ）コンピュータ IBM PC互換性（Ｃ）オペレーティング・システム PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア PatentIn Release＃1.0，Version＃1.25 （EPO）Nove Nordisk A/S （２）配列番号１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 1380塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM 3638 （xi）配列番号１（２）配列番号２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 303塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM 3638 （xi）配列番号２（２）配列番号３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 117塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM 3638 （xi）配列番号３（２）配列番号４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 207塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM 3638 （xi）配列番号４（２）配列番号５の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 237塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ DNA（ゲノム）（vi）起源（Ａ）生物ピロコッカス・フリオサス（Ｂ）株 DSM 3638 （xi）配列番号５（２）配列番号６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 192塩基対（Ｂ）タイプ核酸（Ｃ）鎖１本鎖（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプ 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（２）配列番号45の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号45 （２）配列番号46の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号46 （２）配列番号47の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号47 （２）配列番号48の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号48 （２）配列番号49の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号49 （２）配列番号50の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号50 （２）配列番号51の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 10アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号51 （２）配列番号52の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ 15アミノ酸（Ｂ）タイプアミノ酸（Ｄ）トポロジー線状（ii）分子タイプタンパク質（xi）配列番号52

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１０月１０日【補正内容】請求の範囲１．ピロコッカスα−アミラーゼを又はα−アミラーゼ活性をもち、そして／又はピロコッカスα−アミラーゼと免疫学的に交差反応性であるその変異体をエンコードしているDNA配列を含んで成るDNA構築物であって、そのDNA配列が、配列番号１中に示すDNA配列又は配列番号１中に示すDNA配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる上記配列のアナログを含んで成るようなDNA構築物。２．ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列が、ｉ）配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示す部分的DNA配列又は配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示すDNA配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる上記部分的配列のアナログを含んで成り、又は ii）配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示すDNA配列に基づき調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズする５kbのゲノムDNA配列内に位置するゲノム・ピロコッカスDNA配列に一致し、例えば、配列番号５及び６中に示すDNA配列に基づいてそれぞれ調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる添付の配列番号５及び６又はそれらのアナログ中に同定された部分的DNA配列の間に位置し、そして場合によりそれを含んで成るゲノム・ピロコッカスDNA断片に一致するような、請求項１に記載のDNA構築物。３．請求項１又は２中に定義したような特性の中のいずれかをもつDNA配列とハイブリダイズするピロコッカスDNA配列を含んで成るDNA構築物。４．デンプン分解活性を示す酵素をエンコードしているDNA構築物であって、そのDNA構築物が、ａ）以下の部分的アミノ酸配列：（a）AKYLELEEGG（配列番号10）；（b）VIMQAFYWDV（配列番号11）；（c）PGGGIWWDHI（配列番号12）；（d）RSKIPEWYEA（配列番号13）；（e）GISAIWLPPP（配列番号14）；（f）SKGMSGGYSM（配列番号15）；（g）GYDPYDYFDL（配列番号16）；（h）GEYYQKGTVE（配列番号17）；（i）TRFGSKEELV（配列番号18）；（j）RLIQTAHAYG（配列番号19）；（k）IKVIADVVIN（配列番号20）；（l）HRAGGDLEWN（配列番号21）；（m）PFVGDYTWTD（配列番号22）；（n）FSKVASGKYT（配列番号23）；（o）ANYLDFHPNE（配列番号24）；（p）LHCCDEGTFG（配列番号25）；（q）GFPDICHHKE（配列番号26）；（r）WDQYWLWKSN（配列番号27）；（s）ESYAAYLRSI（配列番号28）；（t）GFDGWRFDYV（配列番号29）；（u）KGYGAWVVRD（配列番号30）；（v）WLNWWGGWAV（配列番号31）；（x）GEYWDTNVDA（配列番号32）；（y）LLSWAYESGA（配列番号33）；（z）KVFDFPLYYK（配列番号34）；（A）MDEAFDNNNI（配列番号35）；（B）PALVYALQNG（配列番号36）；（C）QTVVSRDPFK（配列番号37）；（D）AVTFVANHDT（配列番号38）；（E）DIIWNKYPAY（配列番号39）；（F）AFILTYEGQP（配列番号40）；（G）VIFYRDFEEW（配列番号41）；（H）LNKDKLINLI（配列番号42）；（I）WIHDHLAGGS（配列番号43）；（J）TTIVYYDNDE（配列番号44）；（K）LIFVRNGDSR（配列番号45）；（L）RPGLITYINL（配列番号46）；（M）SPNWVGRWVY（配列番号47）；（N）VPKFAGACIH（配列番号48）；（O）EYTGNLGGWV（配列番号49）；（P）DKRVDSSGWV（配列番号50）；（Q）YLEAPPHDPA（配列番号51）；（R）NGYYGYSVWSYCGVG（配列番号52）、をエンコードしているDNA配列を含んで成り、そして／又はｂ）配列番号１−６中に示すDNA配列の中のいずれかに基づいて、そのDNA配列の中のいずれかによりエンコードされているアミノ酸配列又は配列番号９中に示すアミノ酸配列に基づいて、又は上記ａ）中に列記した部分的アミノ酸配列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれかに基づいて、調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズするDNA配列を含んで成り、そして／又はｃ）配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性をもつポリペプチドをエンコードしている、ようなDNA構築物。５．デンプン分解活性を示す酵素が、α−アミラーゼ、特に、ピロコッカスα −アミラーゼ又はα−アミラーゼ活性をもつその変異体である、請求項４に記載のDNA構築物。６．DNA配列が、好熱性始原細菌から得られることができる、請求項１−５の中のいずれかに記載のDNA構築物。７．DNA配列が、ピロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）の株又はピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）の株から得られることができる、請求項６に記載のDNA構築物。８．DNA配列が、ピロコッカス・ウォエセイ株DSM 3773又はピロコッカス・フリオサス株DSM 3638から、あるいはα−アミラーゼ生産能力をもつこれらの株のいずれかの突然変異体又は誘導体から、得られることができる、請求項７に記載のDNA構築物。９．請求項１−８の中のいずれかに記載のDNA構築物を宿すベクター。 10．プラスミド又はバクテリオファージである、請求項９に記載のベクター。 11．デンプン分解酵素、例えばピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の発現を許容するDNA配列をさらに含んで成る発現ベクターである、請求項９又は1 0に記載のベクター。 12．請求項１−８の中のいずれかに記載のDNA構築物又は請求項９−10の中のいずれかに記載のベクターを宿す宿主細胞。 13．微生物である、請求項12に記載の宿主細胞。 14．バクテリア又は菌である、請求項13に記載の宿主細胞。 15．グラム陽性菌、例えば、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（B acillus amyloliquefacience ）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagula ns ）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensi s ）又はストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）、あるいはグラム陰性菌、例えば、Ｅ．コリ（E．coli）である、請求項14に記載の宿主細胞。 16．バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）の細胞とは異なり、そしてピロコッカス（Pyrococcus）α−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列を含んで成るDNA構築物を宿す、バチルス細胞。 17．ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列が、ピロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）の株又はピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）の株から得られることができる、請求項1 6に記載のバチルス（Bacillus）細胞。 18．DNA配列が、ピロコッカス・ウォエセイ株DSM 3773又はピロコッカス・フリオサス株DSM 3638又はα−アミラーゼ活性を作り出すことができるこれらの株のいずれかの突然変異体又は誘導体から、得られることができる、請求項17に記載のバチルス細胞。 19．バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・レンタス（Bac illus lentus ）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacil lus amyloliquefacience ）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Ba cillus lautus ）又はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis ）から得られる、請求項16に記載のバチルス細胞。 20．デンプン分解酵素、特にピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の製造方法であって、そのデンプン分解酵素の発現を許容する条件下、好適な培養基中、請求項12−19の中のいずれかに記載の細胞を培養し、そしてそのカルチャーから得られたデンプン分解酵素を回収することを含んで成る方法。 21．請求項20に記載の方法により製造された、デンプン分解酵素、特に、ピロコッカスα−アミラーゼ又はα−アミラーゼ活性をもつその変異体。 22．配列番号９中に示すアミノ酸配列を含んで成るピロコッカスα−アミラーゼ、あるいはα−アミラーゼ活性をもち、そして／又は配列番号９中に示すアミノ酸配列を含んで成るα−アミラーゼと免疫学的に交差反応性であり、そして／又は配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性をもつその変異体。 23．ａ）以下の部分的配列：（a）AKYLELEEGG（配列番号10）；（b）VIMQAFYWDV（配列番号11）；（c）PGGGIWWDHI（配列番号12）；（d）RSKIPEWYEA（配列番号13）；（e）GISAIWLPPP（配列番号14）；（f）SKGMSGGYSM（配列番号15）；（g）GYDPYDYFDL（配列番号16）；（h）GEYYQKGTVE（配列番号17）；（i）TRFGSKEELV（配列番号18）；（j）RLIQTAHAYG（配列番号19）；（k）IKVIADVVIN（配列番号20）；（l）HRAGGDLEWN（配列番号21）；（m）PFVGDYTWTD（配列番号22）；（n）FSKVASGKYT（配列番号23）；（o）ANYLDFHPNE（配列番号24）；（p）LHCCDEGTFG（配列番号25）；（q）GFPDICHHKE（配列番号26）；（r）WDQYWLWKSN（配列番号27）；（s）ESYAAYLRSI（配列番号28）；（t）GFDGWRFDYV（配列番号29）；（u）KGYGAWVVRD（配列番号30）；（v）WLNWWGGWAV（配列番号31）；（x）GEYWDTNVDA（配列番号32）；（y）LLSWAYESGA（配列番号33）；（z）KVFDFPLYYK（配列番号34）；（A）MDEAFDNNNI（配列番号35）；（B）PALVYALQNG（配列番号36）；（C）QTVVSRDPFK（配列番号37）；（D）AVTFVANHDT（配列番号38）；（E）DIIWNKYPAY（配列番号39）；（F）AFILTYEGQP（配列番号40）；（G）VIFYRDFEEW（配列番号41）；（H）LNKDKLINLI（配列番号42）；（I）WIHDHLAGGS（配列番号43）；（J）TTIVYYDNDE（配列番号44）；（K）LIFVRNGDSR（配列番号45）；（L）RPGLITYINL（配列番号46）；（M）SPNWVGRWVY（配列番号47）；（N）VPKFAGACIH（配列番号48）；（O）EYTGNLGGWV（配列番号49）；（P）DKRVDSSGWV（配列番号50）；（Q）YLEAPPHDPA（配列番号51）；（R）NGYYGYSVWSYCGVG（配列番号52）、を含んで成り、そして／又はｂ）配列番号１−６中に示すDNA配列の中のいずれかに基づいて、そのDNA配列の中のいずれかによりエンコードされているアミノ酸配列又は配列番号９中に示すアミノ酸配列に基づいて、又は上記ａ）中に列記した部分的アミノ酸配列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれかに基づいて、調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズするDNA配列によりエンコードされており、そして／又はｃ）配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性をもつ、デンプン分解酵素。 24．酵素が、ピロコッカスα−アミラーゼ又はα−アミラーゼ活性をもつその変異体である、請求項23に記載のデンプン分解酵素。 25．請求項21−24の中のいずれかに記載のピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の存在中、水性デンプン・スラリーを酵素的液化に供することを含んで成るデンプン液化方法。 26．方法が、デンプン・スラリーへのカルシウム塩の添加を本質的に伴わずに行われる、請求項25に記載のデンプン液化方法。 27．方法が、120分までにわたる100〜140℃のレンジ内の温度におけるジェット−クッキング、場合によりその後の、約30〜120分にわたる90〜100℃のレンジ内において保持されるであろう上記温度の減少により行われ、その後、このようにして液化されたデンプンが老化（retrogradation）に対して安定であり、その pHが、その方法の全体を通じて約4.0〜5.5において保持されるような、請求項25 又は26に記載のデンプン液化方法。 28．液化された酵素が、中間のpH調整を実質的に伴わずに、グルコアミラーゼの存在中、酵素的糖化に供される、請求項25−27の中のいずれかに記載のデンプン液化方法。 29．糖化と同時の又はその後の酵母によるエタノール発酵をさらに含んで成る、請求項28に記載のデンプン液化方法。 30．デンプン液化方法であって、ａ）ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の発現を許容する条件下、好適な培養基中、ピロコッカスα−アミラーゼ又はα−アミラーゼ活性をもつその変異体をエンコードしているDNA配列を担持している請求項12−19 の中のいずれかに記載の好適な宿主細胞を培養し、そしてそのカルチャーから得られたα−アミラーゼ又はその変異体を回収し、そしてｂ）段階ａ）において回収されたα−アミラーゼ又はその変異体の存在中、水性デンプン・スラリーを酵素的液化（融解）に供する、を含んで成る方法。 31．デンプンの液化及び／又は糖化、デンプンの枝切断、シロップの生産、シクロデキストリンの生産、又はオリゴ糖の生産のための、請求項21−24の中のいずれかにおいて定められたデンプン分解酵素の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 7/06 9548−4Ｂ 19/14 Ｚ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:01） (31)優先権主張番号１２４５／９３ (32)優先日 1993年11月３日 (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＲＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．ピロコッカスα−アミラーゼを又はα−アミラーゼ活性をもち、そして／又はピロコッカスα−アミラーゼと免疫学的に交差反応性であるその変異体をエンコードしているDNA配列を含んで成るDNA構築物であって、そのDNA配列が、ｉ）配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示す部分的DNA配列又は配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示すDNA配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる上記部分的配列のアナログを含んで成り、又は ii）配列番号２，３，４，５及び／又は６中に示すDNA配列に基づき調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズする５kbのゲノムDNA配列内に位置するゲノム・ピロコッカスDNA配列に一致し、又は iii）配列番号１中に示すDNA配列又は配列番号１中に示すDNA配列に基づき調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる上記配列のアナログを含んで成る、ようなDNA構築物。２．ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列が、配列番号５及び６中に示すDNA配列に基づいてそれぞれ調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズすることができる添付の配列番号５及び６又はそれらのアナログ中に同定された部分的DNA配列の間に位置し、そして場合によりそれを含んで成るゲノム・ピロコッカスDNA断片に一致するような、請求項１に記載のDNA構築物。３．請求項１中に定義したような特性ｉ）−iii）のいずれかをもつDNA配列とハイブリダイズするピロコッカスDNA配列を含んで成るDNA構築物。４．デンプン分解活性を示す酵素をエンコードしているDNA構築物であって、そのDNA構築物が、ａ）以下の部分的アミノ酸配列：（a） AKYLELEEGG（配列番号10）；（b） VIMQAFYWDV（配列番号11）；（c） PGGGIWWDHI（配列番号12）；（d） RSKIPEWYEA（配列番号13）；（e） GISAIWLPPP（配列番号14）；（f） SKGMSGGYSM（配列番号15）；（g） GYDPYDYFDL（配列番号16）；（h） GEYYQKGTVE（配列番号17）；（i） TRFGSKEELV（配列番号18）；（j） RLIQTAHAYG（配列番号19）；（k） IKVIADVVIN（配列番号20）；（l） HRAGGDLEWN（配列番号21）；（m） PFVGDYTWTD（配列番号22）；（n） FSKVASGKYT（配列番号23）；（o） ANYLDFHPNE（配列番号24）；（p） LHCCDEGTFG（配列番号25）；（q） GFPDICHHKE（配列番号26）；（r） WDQYWLWKSN（配列番号27）；（s） ESYAAYLRSI（配列番号28）；（t） GFDGWRFDYV（配列番号29）；（u） KGYGAWVVRD（配列番号30）；（v） WLNWWGGWAV（配列番号31）；（x） GEYWDTNVDA（配列番号32）；（y） LLSWAYESGA（配列番号33）；（z） KVFDFPLYYK（配列番号34）；（A） MDEAFDNNNI（配列番号35）；（B） PALVYALQNG（配列番号36）；（C） QTVVSRDPFK（配列番号37）；（D） AVTFVANHDT（配列番号38）；（E） DIIWNKYPAY（配列番号39）；（F） AFILTYEGQP（配列番号40）；（G） VIFYRDFEEW（配列番号41）；（H） LNKDKLINLI（配列番号42）；（I） WIHDHLAGGS（配列番号43）；（J） TTIVYYDNDE（配列番号44）；（K） LIFVRNGDSR（配列番号45）；（L） RPGLITYINL（配列番号46）；（M） SPNWVGRWVY（配列番号47）；（N） VPKFAGACIH（配列番号48）；（O） EYTGNLGGWV（配列番号49）；（P） DKRVDSSGWV（配列番号50）；（Q） YLEAPPHDPA（配列番号51）；（R） NGYYGYSVWSYCGVG（配列番号52）、の中の少なくとも１をエンコードしているDNA配列を含んで成り、そして／又はｂ）配列番号１−６中に示すDNA配列の中のいずれかに基づいて、そのDNA配列の中のいずれかによりエンコードされているアミノ酸配列又は配列番号９中に示すアミノ酸配列に基づいて、又は上記ａ）中に列記した部分的アミノ酸配列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれかに基づいて、調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズするDNA配列を含んで成り、そして／又はｃ）配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性をもつポリペプチドをエンコードしている、ようなDNA構築物。５．デンプン分解活性を示す酵素が、α−アミラーゼ、特に、ピロコッカスα −アミラーゼ又はα−アミラーゼ活性をもつその変異体である、請求項４に記載のDNA構築物。６．DNA配列が、好熱性始原細菌から得られることができる、請求項１−５の中のいずれかに記載のDNA構築物。７．DNA配列が、ピロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）の株又はピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）の株から得られることができる、請求項６に記載のDNA構築物。８．DNA配列が、ピロコッカス・ウォエセイ株DSM 3773又はピロコッカス・フリオサス株DSM 3638から、あるいはα−アミラーゼ生産能力をもつこれらの株のいずれかの突然変異体又は誘導体から、得られることができる、請求項７に記載のDNA構築物。９．請求項１−８の中のいずれかに記載のDNA構築物を宿すベクター。 10．プラスミド又はバクテリオファージである、請求項９に記載のベクター。 11．デンプン分解酵素、例えばピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の発現を許容するDNA配列をさらに含んで成る発現ベクターである、請求項９又は10に記載のベクター。 12．請求項１−８の中のいずれかに記載のDNA構築物又は請求項９−10の中のいずれかに記載のベクターを宿す宿主細胞。 13．微生物である、請求項12に記載の宿主細胞。 14．バクテリア又は菌である、請求項13に記載の宿主細胞。 15．グラム陽性菌、例えば、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（B acillus amyloliquefacience ）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagula ns ）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensi s ）又はストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）、あるいはグラム陰性菌、例えば、Ｅ．コリ（E．coli）である、請求項14に記載の宿主細胞。 16．バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）の細胞とは異なり、そしてピロコッカス（Pyrococcus）α−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列を含んで成るDNA構築物を宿す、バチルス細胞。 17．ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体をエンコードしているDNA配列が、ピロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）の株又はピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）の株から得られることができる、請求項16に記載のバチルス（Bacillus）細胞。 18．DNA配列が、ピロコッカス・ウォエセイ株DSM 3773又はピロコッカス・フリオサス株DSM 3638又はα−アミラーゼ活性を作り出すことができるこれらの株のいずれかの突然変異体又は誘導体から、得られることができる、請求項17に記載のバチルス細胞。 19．バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・レンタス（Bac illus lentus ）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacil lus amyloliquefacience ）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Ba cillus lautus ）又はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis ）から得られる、請求項16に記載のバチルス細胞。 20．デンプン分解酵素、特にピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の製造方法であって、そのデンプン分解酵素の発現を許容する条件下、好適な培養基中、請求項12−19の中のいずれかに記載の細胞を培養し、そしてそのカルチャーから得られたデンプン分解酵素を回収することを含んで成る方法。 21．請求項20に記載の方法により製造された、デンプン分解酵素、特に、ピロコッカスα−アミラーゼ又はα−アミラーゼ活性をもつその変異体。 22．配列番号９中に示すアミノ酸配列を含んで成るピロコッカスα−アミラーゼ、あるいはα−アミラーゼ活性をもち、そして／又は配列番号９中に示すアミノ酸配列を含んで成るα−アミラーゼと免疫学的に交差反応性であり、そして／又は配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性をもつその変異体。 23．ａ）以下の部分的配列：（a） AKYLELEEGG（配列番号10）；（b） VIMQAFYWDV（配列番号11）；（c） PGGGIWWDHI（配列番号12）；（d） RSKIPEWYEA（配列番号13）；（e） GISAIWLPPP（配列番号14）；（f） SKGMSGGYSM（配列番号15）；（g） GYDPYDYFDL（配列番号16）；（h） GEYYQKGTVE（配列番号17）；（i） TRFGSKEELV（配列番号18）；（j） RLIQTAHAYG（配列番号19）；（k） IKVIADVVIN（配列番号20）；（l） HRAGGDLEWN（配列番号21）；（m） PFVGDYTWTD（配列番号22）；（n） FSKVASGKYT（配列番号23）；（o） ANYLDFHPNE（配列番号24）；（p） LHCCDEGTFG（配列番号25）；（q） GFPDICHHKE（配列番号26）；（r） WDQYWLWKSN（配列番号27）；（s） ESYAAYLRSI（配列番号28）；（t） GFDGWRFDYV（配列番号29）；（u） KGYGAWVVRD（配列番号30）；（v） WLNWWGGWAV（配列番号31）；（x） GEYWDTNVDA（配列番号32）；（y） LLSWAYESGA（配列番号33）；（z） KVFDFPLYYK（配列番号34）；（A） MDEAFDNNNI（配列番号35）；（B） PALVYALQNG（配列番号36）；（C） QTVVSRDPFK（配列番号37）；（D） AVTFVANHDT（配列番号38）；（E） DIIWNKYPAY（配列番号39）；（F） AFILTYEGQP（配列番号40）；（G） VIFYRDFEEW（配列番号41）；（H） LNKDKLINLI（配列番号42）；（I） WIHDHLAGGS（配列番号43）；（J） TTIVYYDNDE（配列番号44）；（K） LIFVRNGDSR（配列番号45）；（L） RPGLITYINL（配列番号46）；（M） SPNWVGRWVY（配列番号47）；（N） VPKFAGACIH（配列番号48）；（O） EYTGNLGGWV（配列番号49）；（P） DKRVDSSGWV（配列番号50）；（Q） YLEAPPHDPA（配列番号51）；（R） NGYYGYSVWSYCGVG（配列番号52）、の中の少なくとも１を含んで成り、そして／又はｂ）配列番号１−６中に示すDNA配列の中のいずれかに基づいて、そのDNA配列の中のいずれかによりエンコードされているアミノ酸配列又は配列番号９中に示すアミノ酸配列に基づいて、又は上記ａ）中に列記した部分的アミノ酸配列（ａ）−（Ｒ）の中のいずれかに基づいて、調製されたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズするDNA配列によりエンコードされており、そして／又はｃ）配列番号９中に示すアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性をもつ、デンプン分解酵素。 24．酵素が、ピロコッカスα−アミラーゼ又はα−アミラーゼ活性をもつその変異体である、請求項23に記載のデンプン分解酵素。 25．請求項21−24の中のいずれかに記載のピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の存在中、水性デンプン・スラリーを酵素的液化に供することを含んで成るデンプン液化方法。 26．方法が、デンプン・スラリーへのカルシウム塩の添加を本質的に伴わずに行われる、請求項25に記載のデンプン液化方法。 27．方法が、120分までにわたる100〜140℃のレンジ内の温度におけるジェット−クッキング、場合によりその後の、約30〜120分にわたる90〜100℃のレンジ内において保持されるであろう上記温度の減少により行われ、その後、このようにして液化されたデンプンが老化（retrogradation）に対して安定であり、その pHが、その方法の全体を通じて約4.0〜5.5において保持されるような、請求項25 又は26に記載のデンプン液化方法。 28．液化された酵素が、中間のpH調整を実質的に伴わずに、グルコアミラーゼの存在中、酵素的糖化に供される、請求項25−27の中のいずれかに記載のデンプン液化方法。 29．糖化と同時の又はその後の酵母によるエタノール発酵をさらに含んで成る、請求項28に記載のデンプン液化方法。 30．デンプン液化方法であって、ａ）ピロコッカスα−アミラーゼ又はその変異体の発現を許容する条件下、好適な培養基中、ピロコッカスα−アミラーゼ又はα−アミラーゼ活性をもつその変異体をエンコードしているDNA配列を担持している請求項12−19の中のいずれかに記載の好適な宿主細胞を培養し、そしてそのカルチャーから得られたα−アミラーゼ又はその変異体を回収し、そしてｂ）段階ａ）において回収されたα−アミラーゼ又はその変異体の存在中、水性デンプン・スラリーを酵素的液化（融解）に供する、を含んで成る方法。 31．デンプンの液化及び／又は糖化、デンプンの枝切断、シロップの生産、シクロデキストリンの生産、又はオリゴ糖の生産のための、請求項21−24の中のいずれかにおいて定められたデンプン分解酵素の使用。