JPH08503604A - プローブで用いるための緑色蛍光標識ヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸合成において用いるための、特に、染色体識別においてＤＮＡプローブとして用いるために適当な緑色蛍光標識ヌクレオチドを提供する。該緑色蛍光標識は緑色ローダミン色素に由来し、そして更に、本発明は、該標識ヌクレオチドの製造法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 プローブで用いるための緑色蛍光標識ヌクレオチド 本発明は、概して、緑色蛍光化合物およびＤＮＡを標識するためのそれらの使 用、更に詳しくは、緑色ローダミン色素およびそれらの合成並びにＤＮＡを標識 する場合のそれらの使用に関する。本発明は、更に、緑色蛍光標識を含むＤＮＡ プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリッド形成法による染色体または染色 体領域の検出および識別に関する。 発明の背景 標識ＤＮＡプローブは、染色体の識別および実験において特に有用である。染 色体構造の変化は、しばしば、ある種の癌を含む多数の先天性遺伝的疾患および 変性症と一致し、しかもそれらの原因でありうる。このような変化は、染色体全 体の付加若しくは不存在または染色体の一部分の付加若しくは不存在の形をとり うる。染色体は、更に、転座によるように再配列されることがあり、異なる染色 体部位が互いに連結するようになる。逆位、増幅および完全な欠失を含む多数の 他の遺伝的欠損は、単独でまたは前記の欠損との組合せで存在しうる。適当に標 識されたＤＮＡプローブを用いて染色体およびそれらの任意の変化を検出するこ とは可能であり、極めて望ましい。 ＤＮＡプローブの使用による染色体識別は、概して、細胞試料中に存在する染 色体またはその部位に対するプローブのハイブリッド形成を必要とする。ＤＮＡ プローブの使用に対する一つのアプローチは、「間接標識」プローブの使用であ る。間接標識プローブは、標的染色体に対するプローブのハイブリッド形成後に 直接的に識別することができない残基によって標識された核酸プローブである。 しかしながら、次にプローブ上の残基を、識別することができる標識反応性物質 と反応させることができる。例えば、間接標識プローブは、ビオチンなどのハプ テンによって標識される。このようなプローブは、標的染色体に対してハイブリ ッド形成された後に、結合した蛍光標識を有する反応性物質、例えばビオチンに 対する抗体と引き続き反応させることができる。次に、ハプテンに対する反応性 物質の結合から得られた次の生成物を、蛍光顕微鏡によって識別することができ る。一般的には、このアプローチを蛍光Ｉｎ−Ｓｉｔｕハイブリッド形成法（以 下「ＦＩＳＨ」）と称する。例えば、グレイ（Ｇｒａｙ）ら、欧州特許出願第０ ４３０４０２号明細書を参照されたい。 ＦＩＳＨに対するもう一つのアプローチは、検出しうる残基が核酸プローブに 対して直接的に結合している「直接標識」蛍光プローブを用いた。直接標識ＤＮ Ａプローブを用いて、標的染色体に対するプローブのハイブリッド形成後に、プ ローブ／染色体ハイブリッドを、検出可能な標識を有する反応体による細胞性物 質の侵入を伴う別個の反応工程を必要とすることなく直接的に検出しうる。染色 体識別のための直接標識ＤＮＡプローブは、本明細書中に参考として包含されて いるＭ．Ｌ．ビットナー（Ｂｉｔｔｎｅｒ）、Ｌ．Ｅ．モリソン（Ｍｏｒｒｉｓ ｏｎ）およびＭ．Ｓ．リゲーター（Ｌｅｇａｔｏｒ）による１９９１年９月１９ 日出願の米国特許出願第０７／７６２，９１３号明細書に開示されている。 ＦＩＳＨは、高分解能染色体分析をもたらすことができると考えられる。しか しながら、大部分の商業的に利用可能な発蛍光団プローブは、シグナル対ノイズ 比に対して極めて敏感である蛍光顕微鏡の使用を必要とし、それによって日常的 な分析を難しくしている。フルオレセインは、ＦＩＳＨにおいて用いられてきた 緑色蛍光化合物である。しかしながら、フルオレセインは、核酸プローブ中で用 いられた場合、高光酸化速度に影響され、そしてこのようなプローブは有意のレ ベルの非特異的結合を示す。更に、同一試料の複数分析を可能にする異なる色の 蛍光標識プローブを有することは望ましい。したがって、核酸プローブのための より優れた性能の緑色蛍光標識化合物が望ましい。 更に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法において用いるのに適当であるよう に、発蛍光団標識は、一つには、核酸鎖を破壊することなく核酸に対して結合可 能である必要があり、そして二つには、核酸および標的染色体間のハイブリッド 形成反応を妨げない必要がある。これらの要件は容易に達成されない。 蛍光標識化合物およびそれらを含むヌクレオチドについてのいくつかの開示が ある。しかしながら、これらの開示には、ローダミン色素構造を有する緑色蛍光 化合物に関するものはない。 ローダミン色素であるローダミン１１０（緑色）、ローダミンＢ（橙色）およ びローダミン６Ｇ（赤色）は周知であり且つ商業的に入手可能である（コダック 光学製品カタログ＃ＪＪ−１６９、イーストマン・コダック・カンパニー（Ｅａ ｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロチェスター、ＮＹを参照された い）。１９８８年６月２２日公開の欧州特許出願第０２７２００７号明細書は、 ＤＮＡ配列決定に関わる、高分子のゲル電気泳動分離において用いるためのある 種のローダミン色素の異性体として純粋な５−および６−スクシンイミジルカル ボキシレートの製造法および単離法を開示している。そこで開示された５−およ び６−スクシンイミジルエステルは、完全に置換されたアミノ基を有するローダ ミン色素に由来する。この明細書は、染色体のｉｎ ｓｉｔｕ識別のための核酸 プローブ中の緑色蛍光標識として適当な緑色蛍光ローダミン色素を開示していな い。 ワード（Ｗａｒｄ）ら、米国特許第４，７１１，９５５号明細書は、ピリミジ ンの５位、プリンの８位および７−デアザプリンの７位におけるヌクレオチドへ のビオチン（または他のハプテン）の結合を開示している。ワードらの特許は、 ヌクレオチドに対してビオチンを結合する有機水銀法を用いる。しかしながら、 ビオチンおよびハプテン以外の標識基を修飾ヌクレオチドに対して結合しうると は示唆されていないし、蛍光直接標識ＤＮＡプローブについても全く示唆されて いない。 クレバン（Ｋｌｅｖａｎ）ら、米国特許第４，８２８，９７９号明細書もまた 、標識反応において引き続き用いるためのモノヌクレオチドの修飾を開示してい る。具体的には、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰを、長さが異なるリンカーアームによ ってそれぞれ６位および４位において誘導化する。更に、修飾ヌクレオチドをビ オチンに結合した後、それを、プローブとして用いるためにポリヌクレオチド中 に酵素的に取込ませることができる。クレバンらは、ＤＮＡプローブ中での蛍光 標識の使用を開示していない。 ムソー（Ｍｕｓｓｏ）ら、米国特許第４，８３３，２５１号明細書は、特異的 に誘導されたビオチンで標識された間接標識ポリヌクレオチドプローブの化学的 合成および使用を記載している。誘導されたビオチン標識は、ポリヌクレオチド 上のアミノ基転移されたシトシンＮ−４アミノ基に対してヒドラゾン結合によっ て結合される。更に、ムソーらは、固体支持体結合核酸の分析について記載して いるが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成プローブの使用については記載してい ない。 ウィーガント（Ｗｉｅｇａｎｔ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９，３２３７（１９９１）は、蛍光標識されたヒト核酸プローブを製造するた めのニックトランスレーションフォーマットにおけるフルオレセイン−ｄＵＴＰ の使用を開示している。プローブは、ヒト中期染色体のｉｎ ｓｉｔｕハイブリ ッド形成法に用いられる。しかしながら、他の緑色蛍光標識プローブは開示され ていない。 ウルデア（Ｕｒｄｅａ）およびホーン（Ｈｏｒｎ）、米国特許第４，９１０， ３００号明細書は、オリゴヌクレオチド合成において用いるための修飾ヌクレオ チドの合成を教示している。具体的な発蛍光団は開示されていないし、核酸プロ ーブに対するような結合の合成スキームも示されていない。 ルース（Ｒｕｔｈ）、米国特許第４，９４８，８８２号明細書は、オリゴヌク レオチド合成に適当な修飾ヌクレオチドを教示している。ルースは、それらのヌ クレオチド中で用いるための特定の蛍光化合物を全く明記していないし、蛍光標 識ＤＮＡプローブも開示していない。 したがって、特に、染色体またはその一部分のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形 成法識別のためのＤＮＡプローブ中で用いるためのヌクレオチド標識として用い るのに適当な安定高発光緑色蛍光化合物が必要とされている。本発明の概括的な 目的は、ヌクレオチドと反応しうる新規の緑色発光ローダミン色素化合物および プローブ中で用いるための緑色蛍光標識ヌクレオチドを提供することである。 発明の概要 本発明は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法において用いるための生体 分子に対して結合しうる化合物を生成するための緑色発光ローダミンの合成およ び修飾を記載する。本発明は、（１）染色体または染色体部位のｉｎ ｓｉｔｕ 検出に有用である緑色蛍光標識組成物並びにそれらを含む標識プローブおよびヌ クレオチド組成物、（２）このような標識並びにそれらを包含するヌクレオチド およびプローブ組成物の合成法、そして（３）染色体または染色体部位のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのこのようなプローブ組成物の使用法を提供する。 本発明は、概して、下記の式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は同じであるかまた は異なり、水素、ハロゲンおよびアルキル基から成る群より選択されＲ₅は、カ ルボキシル基かまたは炭素９′に対するラクトン結合であり、そしてＲ₆は、ヌ クレオチドに結合しうる反応性基である） を有する残基のヌクレオチド標識としての使用に関する。本発明の好ましい緑色 蛍光標識残基においては、Ｒ₇からＲ₁₂はそれぞれ水素であり、Ｒ₆はヌクレオチ ド上のアミンと結合しうるカルボキシル基である。 本発明の残基は、ヌクレオチドに対して結合することができ、そして結合後に 、ヌクレオチドに対して緑色発光性を与える。 本発明は、更に、 緑色蛍光性を有する標識ヌクレオチドであって、 （ａ）遊離ヌクレオチドかまたはポリヌクレオチドの形のヌクレオチド三リン 酸および （ｂ）一般式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、該ヌクレオチド三リ ン酸に結合した化学結合を含む） を有する緑色蛍光残基を含む上記ヌクレオチドを含む。この実施態様において、 化学結合は、好ましくは、ヌクレオチドに対するアミド結合を含む。 もう一つの態様において、本発明は、染色体または染色体部位のｉｎ ｓｉｔ ｕ検出のためのプローブの製造法であって、 （ａ）検出される染色体または染色体部位に関して本質的に相補的な塩基配列を 有するＤＮＡ配列中に含まれる多数のシトシン塩基をアミノ基転移させて、反応 性アミン基を有するアミノ基転移された塩基を有するＤＮＡ配列を製造し；そし て （ｂ）式１を有する残基を含む蛍光標識を、アミノ基転移された塩基の少なく とも一部分に対して共有結合させることを含み、多数のこのような塩基は、光学 技術によって検出するのに十分な共有結合した標識を有し、同時に、検出される 染色体または染色体部位に関してプローブのＤＮＡ配列の特異的結合性を本質的 に保持している上記方法に関する。 更にもう一つの態様において、本発明は、染色体または染色体部位のｉｎ ｓ ｉｔｕ検出のためのプローブの製造法であって、 （ａ）式２を有する残基を含む標識ヌクレオチドを製造し、 （ｂ）工程（ａ）から生じた不純物を除去することによって該標識ヌクレオチ ドを精製し、そして （ｃ）該標識ヌクレオチドを、検出される染色体に関して本質的に相補的な塩 基配列を有するＤＮＡ配列中に、標的染色体に対する該ＤＮＡ配列のハイブリッ ド形成後に光学技術を用いて検出を可能にする十分な量で酵素的に取込ませるこ とを含む上記方法に関する。 本発明の蛍光残基は、ＤＮＡプローブなどの標識ヌクレオチドに対して優れた シグナル強度および検出可能性を与える。それらは、慣用的な蛍光顕微鏡を用い るＦＩＳＨ法において容易に検出される。更に、それらをＤＮＡに対して結合さ せて直接標識ＤＮＡプローブを製造することができ、それを染色体ＤＮＡに対し てハイブリッド形成させることができる。本発明のもう一つの利点は、ローダミ ン色素出発物質の非置換アミノ基に対する保護基の付加を含む、式１を有する残 基の製造法である。保護基は、定量的収率に密接な出発物質に対する不可欠なス クシンイミジル基または他の反応性基の付加を可能にする。反応性基は、核酸に 対する標識の結合を達成するのに重要である。 発明の説明 本発明は、ヌクレオチドに対して結合しうる、好ましくは緑色の蛍光発光性ロ ーダミン残基、それらのスクシンイミジルエステルおよび他の誘導体、並びにそ れらの製造法および使用法を含む。本発明の重要な特徴は、式１を有するキサン テン様環の３′位および６′位の不安定なアミノ基の保護を含む合成法であり、 それが、引き続きのスクシンイミジル化または別の反応性基の付加を生じさせる 。核酸に対して緑色ローダミン構造を結合する次の結合工程は、結果としてほぼ 定量的に行なわれる。 蛍光化合物 本発明の緑色蛍光化合物は、前記の式１によって定義され、そこにおいて好ま しい置換基Ｒ6はカルボキシル基であり、遊離状態かまたはポリヌクレオチドの 形のヌクレオチド三リン酸に対する化学結合に適している。 本発明の標識ヌクレオチドを製造する好ましい合成経路は、 ＣＤＡＲ（または誘導体） ↓ 保護基付加 保護されたローダミン化合物 ↓ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによるエステル化 保護されたコハク酸ローダミン ↓ 反応性アミノ基を含むヌクレオチドとの結合 緑色ローダミン標識ヌクレオチド 本発明の好ましい発蛍光団出発残基は、緑色発蛍光団色素残基である５，（６ ）−カルボキシジアミノローダミン（ＣＤＡＲ）である。ＣＤＡＲは、以下の実 施例１に記載の反応のような任意の適当な合成技術によって合成することができ る。ＣＤＡＲ残基は、Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素である式１で表わされる。出願 人は、ＣＤ ＡＲの環上の水素Ｒ₇〜Ｒ₁₂のいずれかまたは全部が変化しても、 蛍光色は緑色から変化しないであろうと予想している。式１において、Ｒ_gは、 カルボキシル基かまたは炭素９′に結合したラクトンでありうる。ラクトン型は 無色であるが、核酸に対して結合する際にラクトンはカルボキシル基に変換され 、その結果、緑色蛍光性が生じる。 ヌクレオチド標識を誘導するためのＣＤＡＲまたはその置換誘導体の使用を拘 束するものは、Ｒ₁〜Ｒ₄が水素である場合の非置換アミノ基の反応性であり、そ れは、特にスクシンイミジル化反応の使用により、このような色素をヌクレオチ ド三リン酸に対して結合する能力を制限する。欧州特許出願第８７３１０２５６ ．０号明細書に開示されたジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）法のよう なスクシンイミジル化化学の典型的な条件が、非置換アミノ基との望ましくない 副反応を引き起こしてアシル化アミノ基を生じることは十分に理解される。例え ば、Ａ．Ｋ．ゴーシュ（Ｇｈｏｓｈ）らは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３ ，（２０）２７８１（１９９２）において、ＤＳＣが、Ｃ ＤＡＲまたはその誘導体上に存在するような非保護アミノ基と反応することを実 証している。したがって、本発明の特に重要な態様は、スクシンイミジル化の前 にアミノ基に対して保護化合物を加えて、望ましい反応性エステルを製造するこ とである。したがって、式１を有する蛍光残基は、最初にＣＤＡＲまたは誘導体 を保護基と反応させて保護されたローダミン化合物を製造することにより、ＣＤ ＡＲまたはその誘導体から製造される。次に、保護されたローダミン化合物をＮ −ヒドロキシスクシンイミドと反応させて式１を有する残基を製造する。実際に は、適当な保護基の選択は、反応性アミノ基を有するＤＮＡプローブ配列または 別個のアミノ化ヌクレオチドと共有結合することを可能にし、同時に、保護基を 除去して望ましい蛍光標識化合物を生成する。 本発明において、保護基は、酸感受性であるが塩基安定性の化合物であるのが 好ましく；それによってエステル化に必要な塩基性ｐｈ条件に対してそれを安定 性にし、更には、ヌクレオチドに対する結合のための酸性条件下で容易に除去し うるようにする。任意の適当な条件を用いて、出発物質に対して保護基を付加す ることができる。好ましくは、これらの条件は以下の実施例２において用いられ るものを含む。トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）は好ましい保護基である（以下 の実施例２を参照されたい）。一および多塩素化アセチル、例えば、トリクロロ アセチル（ＴＣＡ）およびジクロロアセチル（ＤＣＡ）を含む、ＴＦＡと同様の 既知の化学的性質を有する他の保護基も使用可能である。（ＴＦＡ）ＣＤＡＲな どの好ましいＴＦＡ発蛍光団色素中間体は、以下の実施例３の方法論を用いる引 き続きのスクシンイミジル化に適当である。 本発明の実施において用いられる式１を有する塩基性蛍光残基は、１分子当り 少なくとも１個の発蛍光団置換基（または基）、そして更には１分子当り１個の 反応性置換基（または基）を包含する。式１において、発蛍光団置換基はＣＤＡ Ｒの４個の環状残基である。反応性置換基は、ジエチルアミノ基のように、ヌク レオチド中の結合基中に包含された反応性基と反応性であり且つそれと結合する ように選択される。 発蛍光団に対して結合した式１の反応性置換基は、ヌクレオチドの結合基中に 存在するアミノ基かまたはカルボキシル基と反応性であるように選択しうる。好 ましくは、反応性置換基はカルボキシルであり、そして結合基の反応性基はアミ ノであって、アミド結合を生じる。結合基中のアミノ置換基との反応性のために 、カルボキシ置換基は、酸若しくは塩の形、アルデヒド基または類似のものであ りうる。式１の好ましい反応性置換基は、イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシ−７−オキサビシクロ［２，２，１］ ヘプタ−５−エン−２，３−ジカルボキシミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボル ネン−２，３−Ｏ−ジカルボキシミド、塩化スルホニル、クロロトリアジン、ヒ ドロキシベンゾトリアゾリド、カルボン酸アジド等から選択され、これらによっ て例示される。 結合基中のカルボキシ置換基との反応性のために、蛍光化合物の反応性置換基 は、カルボキシル反応性基、例えば、（前記に定義されたような）第一若しくは 第二の形のアミノ置換基等でありうる。この結合に好ましい反応性置換基は、第 一アミノ置換基である。 結合化合物 本明細書中で用いられる「結合化合物」、「結合基」または「化学結合」とい う用語は、概して、ヌクオチド、ポリヌクレオチド配列またはモノヌクレオチド に対する本発明の蛍光残基標識の化学的結合に適当な炭化水素残基を意味する。 したがって、結合化合物は、本発明の発蛍光団化合物と反応しうる必要がある。 本発明の実施において用いられる結合化合物を製造するための出発物質は、出 発物質１分子当り２個の置換基官能性（すなわち、反応性）置換基を有する二官 能性有機化合物である。結合化合物１分子当り少なくとも１個のこのような官能 性置換基は、共通に譲渡されたビットナーら、米国特許出願第０７／７６２，９ １３号明細書に開示されたような重亜硫酸塩に触媒された水性アミノ基転移条件 下においてポリヌクレオチド中のデオキシチジンヌクレオチドと反応性であるの が好ましい。ヌクレオチドと反応性の置換基の例としては、アルキル、アミノ（ 第一および第二）、ヒドラジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド等がある 。現在のところアミノ基が最も好ましい。 結合化合物上の他の官能性置換基は、本発明の蛍光残基と反応性である。この 官能性基は直ちに反応性、すなわち非保護でありうるしまたは保護されていても よい。適当な非保護第二官能性置換基の例としては、アミノ、カルボキシル、リ ン酸塩、スルホン酸塩、ヒドロキシル、ヒドラジド、セミカルバジド、チオセミ カルバジド等がある。好ましい非保護第二官能性置換基としては、アミノ（第一 または第二）およびカルボキシル基がある。適当な保護された第二官能性置換基 の例としては、保護されたスルホン酸塩、保護されたリン酸塩および保護された スルフヒドリルがある。適当な保護置換基の例としては、低級アルキル基、例え ば、メチル、エチルおよびプロピルがある。 このような二官能性結合化合物中に存在する２個の官能性置換基は、それぞれ 互いに隣接した炭素原子上の置換基でありうるし、またはそれらは、多数の介在 する相互に結合した原子（好ましくは炭素原子）によって互いに間隔を置くこと ができる。第一および第二官能性置換基は、リンカーまたは結合残基によって結 合している。この結合残基は、任意の好都合な構造を有することができるが、ア ミノ基転移の際にアミノ基転移媒質中に存在する他の物質と非反応性である必要 がある。結合残基は、非環状または環状であり、場合により他の原子を包含しう る２〜２０個の炭素を有する二価の炭化水素基である。エーテル基またはチオエ ーテル基が１個だけ存在するのが好ましい。結合化合物全体が、少なくとも２個 で合計約２０個以下の原子を有する有機基であるのが現在のところ好ましい。 プローブ製造 「プローブ」または「プローブ組成物」という用語は、個々の標識含有残基と 化学結合したＤＮＡ配列などのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド混合物 を意味する。ＤＮＡプローブのそれぞれのポリヌクレオチドは、典型的に、標的 染色体に対してハイブリッド形成する時点で一本鎖である。本発明のプローブは 、式１を有する蛍光残基に対して化学結合したポリヌクレオチドを含む。 任意の適当な手順を用いて本発明のプローブを製造することができ、適当な手 順は、ビットナーら、米国特許出願第０７／７６２，９１３号明細書に開示され ている。好ましい手順は、下記、 （ａ）任意の適当な手段によって、一つの予め選択された染色体または予め選 択された染色体部位に特異的なＤＮＡ配列をフラグメント化して（すなわち、破 壊して）ＤＮＡフラグメント（またはセグメント）にし； （ｂ）該ＤＮＡフラグメント中に存在するデオキシシチジンヌクレオチドを（ 前記のような）結合化合物によってアミノ基転移して、アミノ基を有するＤＮＡ フラグメントを製造し；そして （ｃ）適当な条件下においてＤＮＡフラグメントのアミノ基と式１を有する蛍 光残基とを共有結合させる（すなわち、化学結合させる）工程を含む。 本発明のプローブの製造において出発物質として用いるために、１種類または 複数の出発ＤＮＡ配列を種々の技法によって、例えば、（ａ）多染色体ゲノムの 単一の予め選択された染色体を多数流動選別することによって分離されるＤＮＡ ；（ｂ）予め選択された染色体の染色体ライブラリー、および（ｃ）予め選択さ れた染色体のＤＮＡを包含する種間ハイブリッドから得ることができる。好まし い出発染色体ＤＮＡは、標準法によって製造され且つ当業者に知られている伝統 的源、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）または ヒト若しくは他のクローン化遺伝物質の他の貯蔵所から入手可能な染色体ライブ ラリーである。ＡＴＣＣ寄託は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド州から入手 可能である。 本発明の実施においては部分染色体ＤＮＡを用い、それは多染色体ゲノムの染 色体の一つの予め選択された部位から直接的にかまたは間接的に誘導することが できる。このような出発部分染色体ＤＮＡは、典型的に、少なくとも１種類のＤ ＮＡ配列の形である。このような１種類または複数の配列はそれぞれ、少なくと も１種類のＤＮＡ反復セグメントを多数、好ましくは構造的に異なるＤＮＡ反復 セグメントを多数（すなわち、少なくとも２種類）包含することが現在のところ 好ましい。好ましくは、このような部分ＤＮＡ配列は、研究中の生物の全ゲノム の他の部位に相対して独特である。出発部分ＤＮＡは、一つの染色体の個々の予 め選択された部位の様々な位置および全体に個々に存在し且つ予め選択された部 位に存在しているＤＮＡを代表するものである多数のＤＮＡセグメントを包含す る。現在好ましいゲノムはヒトゲノムである。 ＤＮＡセグメントは、フラグメント化により、特定の予め選択された出発染色 体ＤＮＡまたは出発部分染色体ＤＮＡから得られる。フラグメント化後のＤＮＡ セグメントは、約２０〜約６００ｂｐの範囲内である平均寸法を有するのが好ま しく、好ましい平均寸法範囲は約１５０〜約６００ｂｐ、更に好ましい平均寸法 範囲は約２００〜約４００ｂｐ、そして現在最も好ましい平均寸法は約３００ｂ ｐである。これらのＤＮＡセグメントまたはフラグメントはそれぞれ、特定の予 め選択された染色体または予め選択された染色体部位に存在する１種類またはそ れ以上のＤＮＡ配列に対して相補的であると考えられる。 本発明において、特定の染色体ＤＮＡの音波処理によってフラグメント化され たＤＮＡフラグメントを生成することが好ましい。音波処理条件は、約０．０５ 〜約４ｍｇ／ｍｌの範囲内にある特定の出発染色体ＤＮＡの水性分散液を用いる 。適用される音波処理周波数は約２０，０００サイクル／秒であり、そしてそれ を、試料の加熱を低減させるように冷却浴（ドライアイスおよびエタノール）中 に浸漬されているのが好ましい試料含有試験管に約１〜約１０分間与える。ブラ ンソン・ソニファイアー（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）４５０型（ダン パリー（Ｄａｎｂｕｒｙ）、ＣＴ）を用いて水溶液中においてマイクロチップを 試験管底部から約２〜約５ｍｍに位置させた場合、適当な出力は約２５〜約３０ ワットの範囲内である。好ましくは、このような超音波エネルギーを、８０％オ ン、２０％オフのサイクルを用いて合計約５分間与える。 染色体またはその部分に特異的なＤＮＡが、例えば市販元から既に適当にフラ グメント化された状態で得られた場合、次のアミノ基転移処理工程を行なう前の 分離フラグメント化工程は不必要である。 本発明のプローブは、染色体、異数性または異常染色体および二動原体染色体 の識別に、生物の性別決定に、他の核酸プローブと一緒に用いられる調節に並び に他の適当な用途に有用である。 染色体プローブのアミノ基転移 「染色体ペイント」または「ペインティングプローブ」という用語は、ハイブ リッド形成条件下において、多染色体ゲノムの一つの予め決定された染色体を含 む標的とハイブリッド形成するように適合される本発明のポリヌクレオチド実施 態様のようなプローブまたはプローブ組成物を意味する。典型的に、本発明の一 つのペインティングプローブは、２種類の予め決定された染色体の同時染色およ び検出を可能にするように第二のペインティングプローブと混合することができ る。これに対し、「染色体列挙プローブ」は、動原体部位のような、染色体の標 的部位とハイブリッド形成するように適合されるＤＮＡプローブを意味する。 本発明の蛍光残基でＤＮＡプローブを標識することを可能にするために、好ま しくは、染色体ＤＮＡ中の全デオキシシチジン塩基の一部分を、シトシン（すな わちデオキシシチジンヌクレオチド）のアミノ基の炭素原子４位の（前記のよう な）二官能性結合化合物のアミノ基によってアミノ基転移させる。出発ＤＮＡ配 列またはＤＮＡフラグメントのこのような混合物中に含まれる全ヌクレオチドの 約０．２〜約８モル％がアミノ基転移される。いずれの場合にも、最も有効なア ミノ化百分率は、典型的に、用いられる特定の蛍光標識残基に影響される。 アミノ基転移は、便宜上、重亜硫酸塩触媒存在下の水性液相条件下において変 性ＤＮＡ配列またはセグメントを用いて達成される。結合化合物を、水性アミノ 基転移媒質中に溶解させる。アミノ基転移においてカオトロープを用いる技術お よび利点は、ビットナーら、同時係属米国特許第０７／７６２，９１３号明細書 に示されている。 酵素（直接）標識プローブ組成物 蛍光標識デオキシヌクレオシド三リン酸（フルオロ−ｄＮＴＰ）の合成 本発明の蛍光化合物は、上記のような、直接蛍光プローブ標識方法論において 用いられたようなリンカーによってｄＮＴＰに結合させることができる。好まし くは、該化合物は、適当に接近しうる部位においてヌクレオシド三リン酸に予め 結合されたリンカーの反応性基部分に対して化学的に反応する反応性カルボキシ 基を有する。本発明の蛍光残基は、一および二リン酸塩に対しても結合しうる。 反応性置換基部分を有する結合リンカーを有するヌクレオチドの適当な例は、 アミノ化デオキシリボヌクレオチドである５−（３−アミノアリル）−２′−デ オキシウリジン−５′−三リン酸（ＡＡｄＵＴＰ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入 手可能、カタログ番号Ａ５９１０）、Ｎ４−（３−アミノプロピル）−２′−デ オキシシチジン−５′−三リン酸（ＡＰｄＣＴＰ、クルイクシャンク （Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ）、米国特許第５，０９１，５１９号明細書を参照さ れたい）、およびＮ６−（６−アミノヘキシル）−２′−デオキシアデノシン− ５′−三リン酸（ＡＨｄＡＴＰ）ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッ ド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）から入手可能、カタログ 番号９５１４ＳＡ）である。 フルオロ−ｄＮＴＰの合成は、以下の実施例９に記載のように実施することが できる。好ましくは、その方法は、蛍光化合物の反応性置換基とアミノ化デオキ シヌクレオチドとをホウ酸緩衝液中で反応させることを含む。ホウ酸緩衝液は、 更に、ＴＦＡ保護基を除去するように作用して、「結合」フルオロ−ｄＮＴＰを 生成する。 この方法で製造された蛍光標識ｄＮＴＰ′ｓは、当業者に周知の様々な方法に よってポリヌクレオチド中に酵素的に取込ませるのに適している。例えば、本発 明者は、ライフ・テクノロジーズから入手可能な標準的なニックトランスレーシ ョンプロトコルの変法を用いるニックトランスレーションによってフルオロ−ｄ ＮＴＰ′ｓを酵素的に取込むことを行なった（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ− ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、カタログ番号８１６０ＳＢを 参照されたい）。 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法および染色 本発明の染色体ペインティングプローブ、染色体列挙プローブおよび酵素標識 プローブ組成物は、予め選択された染色体または染色体部位それぞれの染料とし ておよびそれらを識別するためにハイブリッド形成法で用いるのに十分に適して いる。操作は、（ａ）このような染色体または染色体部位（そのフラグメントを 含む）を含むと思われる検体を、ハイブリッド形成条件下において、染色体また は染色体部位の標的ＤＮＡとハイブリッド形成する本発明のプローブと接触させ て、標的ＤＮＡとプローブ組成物中に存在するプローブＤＮＡセグメントとのハ イブリッドを形成させ、（ｂ）得られた検体からプローブ組成物の残留部分を分 離し、そして（ｃ）得られた検体を検査する、３種類の連続工程を行なう。 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法は、予め選択された染色体または染色体部 位の全部または一部分のみを含む特定の検体を包含してもよい。現在、予備的に 製造され、且つスライド、例えば、ガラス製等のスライド上に固定された検体に ついて一般的に且つ好都合に実施される種類のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成 において本発明のプローブを用いることが好ましい。 このようなスライドに固定された検体中の予め選択された染色体または染色体 部位の識別を本発明のプローブを用いて達成するために、下記に例示した方法を 実施することができる。好ましくは、このようなスライドに固定された検体を予 備処理して、そこに存在していると予想されるＤＮＡを少なくとも部分的に脱水 し、そして更に少なくとも部分的に変性させる。慣用的な変性法および脱水法並 びに材料を用いることができ、続いて次のハイブリッド形成工程をハイブリッド 形成条件下で実施する。最初に、スライドに固定された検体を、本発明のプロー ブ組成物と接触させる。次に、検体およびそれに接触している処理用プローブ組 成物の組合せを約３０〜４５℃で適当な時間インキュベートする。次に、得られ たハイブリッド含有検体に液体洗浄操作を施して、未反応の残留する処理用プロ ーブ組成物を除去する。バット（Ｂｈａｔｔ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６ ：３９５１〜３９６１（１９８８）を参照されたい。 所望ならば、次に、対比染料を固定用媒質中に取り込ませることができる。 スライドは、処理直後に蛍光顕微鏡下で慣用的なフィルターを用いて観察する ことができるし、またはそれらを検査前に室温で数日間または同程度貯蔵するこ とができる。本発明の利点は、ＣＤＡＲ基剤緑色蛍光標識を有する好ましいプロ ーブを、フルオレセイン標識の検出用に広範囲に利用可能なフィルターセットを 用いて識別することができることである。 当業者は、スライドに固定された検体のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法に おいて（ａ）接触および（ｂ）分離の（上記のような）順序を、上記のように工 程（ｃ）（検査）を行なう前に２回以上好都合に実施することができることを理 解する。このような工程（ａ）および（ｂ）のそれぞれの反復において（便宜上 、それぞれ本明細書中前記のように実施される）異なるプローブ組成物が用いら れ、本発明のプローブ組成物を１回の反復で用い、もう一つの（異なる）プロー ブ組成物を他の反復のそれぞれにおいて用い、このような他のプローブ組成物を それぞれ、前記ゲノムの予め決定された異なる部分的部位に標的化させる。 当業者は、本発明の緑色蛍光ヌクレオチドが、異なるプローブ組成物の異なる 発蛍光団標識によって発せられた光の色と対比しうる色を発光することを容易に 理解する。したがって、本発明は、少なくとも２種類のこのような色対比発蛍光 団標識プローブを逐次的にまたは同時に用いて、核型、ゲノムまたは特定の染色 体若しくはその部位を区別することを可能にする。更に、異なる発光色を有する このような異なる蛍光化合物を、新規の個々のプローブ組成物と組合せることも できることが理解される。このような新規のプローブ組成物は、種々の発光色を 含むが同一標的に対してハイブリッド形成しうる蛍光標識プローブ組成物と組合 せることによって製造することができる。例えば、本発明の緑色発光ヌクレオチ ドおよび先行技術の橙赤色化合物を特定の比率で組合せることができ、その結果 、多数の異なる色のプローブ組成物を生じる。このような蛍光標識プローブ組成 物の種々の組合せを用いて、プローブ組成物が全染色体ペイントまたは染色体列 挙プローブを含む場合に、個々の染色体を識別することができる。このような組 合せの標識プローブ組成物セットを同時に用いて、特定の核型の染色体の全部で はないとしても、大部分を識別することができる。 プローブ混合物 本発明のプローブ組成物の特徴および利点は、それらを、それらの化学的構造 または機能的能力に悪影響を及ぼすことなく他のプローブ組成物、例えば、Ｎ， Ｎ，Ｎ′，Ｎ′テトラメチル−５，（６）−カルボキシ−３′，６′−ジアミノ ローダミン（Ｎ′ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＣＴＭＲ）橙色蛍光を 有する）等と組合せることができることである。例えば、２種類の異なる染色体 または染色体部位を標的とする橙色（ＣＴＭＲ）および緑色（ＣＤＡＲ）蛍光プ ローブを用いて、同一試料を付随的に処理することができる。したがって、混合 プローブ組成物がハイブリッド形成条件下で複雑なＤＮＡセグメント混合物を包 含するとしても、これらの個々のセグメントは相補的な標的ＤＮＡとハイブリッ ド形成するだけであり、所望の特定の染色体識別は達成される。本発明のプロー ブと一緒に用いられる他のプローブ組成物は、好ましくは、（本発明のプローブ 組成物に相対して）同様のハイブリッド形成条件下においてｉｎ ｓｉｔｕハイ ブリッド形成法で用いるのに適当であるべきである。 以下の実施例は、例示するものと考えられるべきであり、本発明を制限すると 考えられるべきではない。 実施例１．５，（６）−カルボキシジアミノローダミン（ＣＤＡＲ）の合成 ２５０ｍｌ二口フラスコに、３−アミノフェノール（２５．０ｇ、０．２２４ モル）、トリメリット酸無水物（２０．０ｇ、０．１０４モル）および濃硫酸（ １００ｍｌ）を入れた。サイドアームに、２１０型温度調節器（Ｊ−ケム・エレ クトロニクス・インコーポレーテッド（Ｊ−Ｋｅｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．））に連結されたテフロン製温度探針（反応混合物中に直接挿入される ）を取付け、そして混合物を窒素流下において１８０℃（＋または−２℃）まで 加熱しながら電磁撹拌した。 混合物は１８０℃に達するのに約４５分間を要し、その後、温度を１８０℃で 更に４時間維持した。得られた暗赤色溶液を室温まで冷却した後、電磁撹拌され た氷冷水（４００ｍｌ）に対して少しずつ加えた。反応フラスコを水（２×５０ ｍｌ）で洗浄した。しばらく撹拌後、得られた沈殿を真空濾過（ガラス濾過器） によって集め、制限量の氷冷水で洗浄し、そして自然乾燥させて、レンガ色固体 約５０ｇを生成した。薄層クロマトグラフィー［ＴＬＣ−アセトニトリル−酢酸 −水（８：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）］は、この固体が不純であり且つ１種類の主要 および数種類の少量の緑色蛍光成分から成ることを示した。 レンガ色固体の一部分（約１０ｇ）を濃アンモニア−水（１：４、ｖ／ｖ）１ ５０ｍｌ）中に溶解させ、氷上で冷却し、そして濃硫酸をｐＨ２まで加えること によって色素を沈殿させることにより更に精製を行なった。次に、沈殿を真空濾 過によって集め、冷水で洗浄し、そして自然乾燥させて約７ｇの物質を生成した 。最終精製は、沸騰０．５Ｍ水性ＨＣｌ（３０ｍｌ／グラム（色素））からの結 晶化と共に、活性炭処理（０．５ｇ／１０ｇ（色素））およびひだ付き濾紙を介 する熱濾過（深赤色結晶の回収率約５０％）によって達成された。システムＥに よるＴＬＣ分析は、両者とも緑色蛍光を有する一つの主要成分（カルボキシジア ミノローダミン、Ｒｆ＝０．４０）および一つの少量成分（Ｒｆ＝０．７１）を 示した。 組成物の追加検査を、ＴＬＣおよびスペクトル分析を用いて行なった。クロロ ホルム−メタノール−水（１２：７：１、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて、ＲｆはＣＤＡ Ｒについて０．２７であり、少量成分については０．３２であると決定された。 紫外線吸収極大は（０．１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４中に おいて）４９８ｎｍであり、蛍光発光極大は５２３ｎｍであり、４５０ｎｍで励 起した。メタノール中での吸収極大は５０３ｎｍであり、発光極大は５２８ｎｍ であった。実施例２：ビス（Ｎ−トリフルオロアセチル）−５，（６）−カルボキシ−３′ ，６′−ジアミノローダミン［ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ］の合成 トリフルオロ酢酸無水物（ＴＦＡＡ）（１２．０ｇ、５７．２ミリモル）を、 丸底フラスコ中のアセトニトリル−ピリジンの混合物（２：１ ｖ／ｖ；１２０ ｍｌ）に対して少しずつ加えた。混合物を−１０℃まで完全に冷却した（エタノ ール／液体窒素）。次に、精製ＣＤＡＲ（２．０ｇ、５．４ミリモル）を０．４ ｇずつ１．５時間にわたって加えた。 色素を加えた毎に、溶液の蛍光は徐々に退色して赤葡萄酒色溶液を生成した。次 に、溶液を１０℃まで０．５時間加温した後、０℃まで再冷却し、そして反応を 水５ｍｌで急冷した。最初にアスピレーター、次に真空ポンプを用いて溶液を蒸 発させた。次に、残留物をトルエン４０ｍｌと一緒に２回共蒸発させた。残留物 を酢酸エチル２００ｍｌ中に溶解させ、そして１Ｍ ＨＣｌ １００ｍｌで２回 抽出した。水性抽出物を酢酸エチル１００ｍｌで逆抽出した後、有機相抽出物を 混合し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。抽出の際、遊離カルボン酸は同一条件 下において水性相中に抽出され、かなりの減損が生じることがあるので注意を要 する。残留物を再度蒸発乾固させた後、トルエンと一緒に共蒸発させて残留する ピリジンを全て除去した。この工程は、黄色粉末〜暗色油状残留物の生成物を残 すことができる。暗色油状残留物は、最少量のエタノール中に残留物を溶解させ 、トルエンで希釈した後に蒸発させることによって粉末に変換された。これによ ってフラスコ壁に微細黄色固体が得られる。固体はスパチュラで取出すことがで きる。望ましい生成物は、主要移動ＴＬＣ成分（クロロホルム−メタノール（４ ：１、ｖ／ｖ）を用いてＲｆ＝０．３４）として現れ、紫外線ランプ下に放置後 に黄色になる。かなりの量の物質がベースラインにとどまる。実施例３．ビス（Ｎ−トリフルオロアセチル）−５，（６）−カルボキシ−３′ ，６′−ジアミノローダミン−（Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミド）エステル［ ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳ］の合成 上記工程２からの淡黄色粉末１．７６ｇとしてのビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲを、 ロータリーエバポレーターフラスコ中に入れ且つ無水Ｎ−Ｎジメチルホルムアミ トド（ＤＭＦ）３０ｍｌ中に溶解させ、それに対してＮ−ヒドロキシスクシンイ ミド（ＮＨＳ）０．５３６ｇを加えた。混合物を０℃まで冷却し、ＤＭＦ ３ｍ ｌ中のＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）０．５８８ｇを電 磁撹拌された溶液に対して加えた。ＤＩＰＣ（ＤＩＰＣ／ＮＨＳ／ＤＭＦ／０℃ 〜２５℃中）は、十分な純度の生成物を十分な収率で生成する。１時間後、氷浴 を除去し、混合物を室温で６時間撹拌した。更にＤＩＰＣ ０．２５ｇおよびＮ ＨＳ ０．２ｇを加え、混合物を室温で一晩中撹拌した。 次に、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール（４：１、ｖ／ｖ））は、反応が約９ ０％まで完了したことを示した。０℃まで再冷却した後、反応を氷酢酸１．５ｍ ｌで急冷し、そしてＤＭＦを真空中で除去した。残留物を酢酸エチル２５０ｍｌ 中に溶解させ、そして２Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ溶液２５０ｍｌで２回、続いて５％ｗ／ ｖ炭酸水素ナトリウム溶液２５０ｍｌで２回抽出した。この溶液はエマルジョン を生成する性質があり且つトリフルオロアセチルアミノ基が水性塩基性加水分解 に対して極めて感受性であるので注意を要する。次に、２Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ（２× ２５０ｍｌ）で更に抽出を行なった。水性抽出物を全て保存し、そして酢酸エチ ルで個別に逆抽出した。次に、有機相を混合し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、そして 蒸発させて橙色固体を生成した。重炭酸水素ナトリウム抽出は、ＴＬＣにおいて 望ましいＣＤＡＲ−ＮＨＳより僅かに下に移動する極めて黄色の蛍光副生成物の 大部分を、ＣＤＡＲを有意に除去することなく選択的に抽出する。これらの抽出 においては、ＴＦＡ基の塩基性加水分解を最小限にするようになお注意する必要 がある。この時点で、生成物は、ＴＬＣ（９：１、ｖ／ｖかまたは４：１、ｖ／ ｖのクロロホルム−メタノール）において若干のベースライン不純物をなお示す 。不純固体生成物を酢酸エチル中に溶解させ、完全に溶解させるために最少量の エタノールを加えた。最終精製は、クロロホルム−酢酸（９９：１、ｖ／ｖ）を 用いる充填されたシリカの１２×３．０ｃｍカラムでのフラッシュクロマトグラ フィーによって達成された。溶解した生成物を加えた後、カラムをクロロホルム −酢酸（９９：１、ｖ／ｖ）で溶離した。望ましい生成物は、溶媒最前部で溶離 されるべきである。溶離プロフィールについての問題は、通常、クロロホルムお よび２％ｖ／ｖメタノールを用いることによって克服することができ、淡黄色油 である生成物を溶離する。生成物を酢酸エチル−石油エーテル（４ｍｌ＋８０ｍ ｌ）から沈殿させ、そしてガラス濾過器での濾過によって淡黄色粉末として集め る。ガラス濾過器およびフラスコを酢酸エチルで洗浄することによって追加の生 成物を得た。粉末は、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール（９：１、ｖ／ｖ）） によって判定される１種類の主要成分および２種類の極めて少量の成分を含んで いた。更に、粉末は、位置異性体の約１：１混合物を示す納得のいく１Ｈ ＮＭ Ｒスペクトルを生じた。主要生成物５ｍｇはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） ５００μｌ中に完全に溶解して淡黄色溶液を生じ、そして種々の標識用途におい て成功して用いられた。実施例４．ビス（Ｎ−トリフルオロアセチル）−５，（６）−カルボキシ−３′ ，６′−ジアミノローダミン−（Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミド）エステル［ ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳ］からのＣＤＡＲの再生 実施例３で製造されたビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳの一部５ｍｇをメタノ ール１００μｌ中に溶解させた。溶液に対して水性０．１Ｍ Ｋ₂ＣＯ₃ １００ μｌを加えた。溶液は直ちに黄色／緑色に変わり始め、トリフルオロアセチル保 護基の部分加水分解を示した。同時脱保護／再生反応は数時間進行した。５〜６ 時間後、反応は、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール−水（１２：７：１、ｖ／ ｖ／ｖ）またはアセトニトリル−酢酸−水（８：１：１、ｖ／ｖ／ｖ））で判定 されることで完了したと考えられた。単一主要成分は、更に高いＲｆ緑色蛍光性 物質の痕跡と一緒に検出することができた。 実施例５．ヒト染色体特異的ＤＮＡプローブ ヒト染色体特異的ＤＮＡは、ヴァン・ディラ，Ｍ．Ａ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ ４：５３７〜５５２，１９８６）に記載されたように構築された、 ローレンス・リバーモア・ナショナル・ラボラトリーズ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌ ｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＬＬＮＬ ）からの組換え体ファージライブラリーとして得た。これらのライブラリーは、 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主菌株での増 殖によって増幅された。増幅されたファージを精製し、それらのＤＮＡを抽出し 、そしてこのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIによって消化した。インサートＤＮ ＡはλベクターＤＮＡから精製され、プラスミドベクターｐＢＳ（ストラタジー ン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ、ＣＡ）のＨｉｎｄIII部位中にクローン 化された。得られたプラスミドは、大腸菌菌株ＤＨ５α（ベセスダ・リサーチ・ ライブラリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ） 、ゲイサーズバーグ、メリーランド）中に形質転換された。 慣用的な発酵槽中の大腸菌菌株の増殖後、プラスミドＤＮＡを細菌細胞ペレッ トから抽出した（ビットナーら、１９９１年９月２０日出願の同時係属米国特許 第０７／７６２，９１２号明細書を参照されたい）。細胞を、細胞ペレット質量 （Ｍ）（ミリリットルで）の３倍の、５０ｍＭグルコース（濾過滅菌された）、 １０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ（ｐＨ７．５〜８．０）および２５ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）を含む溶液中に完全に再懸濁させた。０．２Ｍ ＮａＯＨおよび １％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液の６ｘＭ（ミリリ ットルで）を加えた後、細胞を激しく撹拌しながら溶解させた。溶液が透明にな ったら、４．５ｘＭ（ミリリットルで）の、氷酢酸５５．５ｍｌおよび酢酸カリ ウム１４７．５ｇを最終容量５００ｍｌ中に含む溶液を完全に混合し、結果とし て蛍光沈殿を生じた。上澄みを蛍光沈殿から分離し、この上澄みを７０００ｘｇ で１５分間遠心分離して残留する沈殿を除去した。 核酸を１容量のエタノールによって上澄みから沈殿させた後、７０００ｘｇで １０分間遠心分離し、そして核酸ペレットを総量０．５４ｘＭ（ミリリットルで ）中に再懸濁させた。次に、核酸を１／２容量の中性フェノールおよび１／２容 量のクロロホルムで抽出し且つ２倍容量エタノールで沈殿させた。核酸を、０． ３ｘＭ（ミリリットルで）の、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．０）および１０ ０ｍＭ酢酸ナトリウムの溶液中に再懸濁させた。次に、０．７７ｘＭ（マイクロ リットルで）の１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮアーゼ（加熱処理された）を加え、そして 室温で３０分間または４℃で一晩中消化させた。次に、０．６１５ｘＭ（マイク ロリットルで）のプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を加え、そして５ ５℃で３時間インキュベートした。ＤＮＡを１／２容量の中性フェノールおよび １／２容量のクロロホルムで抽出し且つ２倍容量のエタノールで沈殿させた。 ＤＮＡを０．４１５ｘＭ（ミリリットルで）の水中に再懸濁させ、０．０５ｘ Ｍミリリットルの５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１５５ｘＭミリリットルの５０％（ ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量６０００〜８０００）を加 え、氷水上で１時間インキュベートし、そして７，０００ｘｇで１５分間の遠心 分離によって沈殿させた。ＤＮＡを０．０４ｘＭミリリットルの水および１／１ ０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム中に再懸濁させ、１／２容量の中性フェノールおよ び１／２容量のクロロホルムで抽出し、そして２倍容量のエタノールで沈殿させ た。精製ＤＮＡを０．０４７６ｘＭミリリットルの脱イオンＨ₂Ｏ中に再懸濁さ せた。ＤＮＡ濃度を蛍光定量法によって決定した。 最後に、精製ＤＮＡを、ブランソン・ソニファイアー４５０（ダンバリー、コ ネチカット）を用いる音波処理によって破壊して、約３００塩基対の小フラグメ ントにした。このフラグメント寸法は、経験的に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド 形成法に用いられるＤＮＡプローブに最適であると確定された。上記で製造され た精製プラスミドＤＮＡの４ミリグラムを水２ｍｌ中に再懸濁させ、そして音波 処理中に沸騰させないようにドライアイス／エタノール浴中に浸漬した。音波処 理装置のマイクロチップを、チップが試験管の底部から２〜５ｍｍになるまでこ の溶液中に浸漬した。音波処理は、出力２５〜３０ワットで、不連続的に８０％ 仕事量サイクル（８０％オンタイム、２０％オフタイム）を用いて５分間行なっ た。音波処理後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）０．２ｍｌおよびエタノー ル４ｍｌを加えることによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿を８，０００ｘｇで５ 分間の遠心分離によって回収し、減圧乾燥させた。 実施例６．重亜硫酸塩に触媒されたＤＮＡのアミノ基転移 実施例１の方法によって得られたＤＮＡを、シトシン塩基のＣ４炭素原子に対 してエチレンジアミンを付加することによってアミノ基転移した。この反応は重 亜硫酸ナトリウムによって触媒される。重亜硫酸緩衝液を製造するために、発煙 ＨＣｌ １．７ｍｌを氷上の脱イオンＨ₂Ｏ １ｍｌに対して徐々に加えた。次 に、新たなエチレンジアミン１ｍｌを氷上に徐々に加えた。エチレンジアミンの 溶解後、溶液を室温まで加温し、そしてメタ重亜硫酸ナトリウム０．４７５ｇを 加えた。次に、発煙ＨＣｌを重亜硫酸塩混合物に対して、ｐＨが７．０に達する まで徐々に加えた。脱イオン水を最終容量５．０ｍｌまで加えた。ＤＮＡをアミ ノ基転移するために、音波処理済みＤＮＡ １ミリグラムをＨ₂Ｏ ０．３ｍｌ 中に再懸濁させた。ＤＮＡを１００℃で５分間沸騰させることによって変性させ た後、氷水浴中で急冷した。アミノ基転移反応は、このＤＮＡ溶液０．３ｍｌを 重亜硫酸緩衝液２．７ｍｌに対して加えることによって開始し、反応物を３７℃ で２日間インキュベートした。ＤＮＡ溶液を、５〜１０ミリモルホウ酸ナトリウ ム（ｐＨ８．０）に対する通常の透析によって脱塩した。透析後、３Ｍ酢酸ナト リウム（ｐＨ５．５）０．３ｍｌを透析液に対して加えた。アミノ化ＤＮＡを２ ．５容量のエタノールで沈殿させ、８，０００ｘｇで１０分間の遠心分離後に回 収した。ペレットを減圧乾燥させ、そしてＤＮＡ濃度３ｍｇ／ｍｌで再水和した 。この溶液を使用まで−８０℃で貯蔵した。 実施例７．ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳによる染色体１プローブの標識 非標識全染色体ペイント（ヒト染色体１に向けられたフラグメント化ポリヌク レオチド）５０μｇを、２．５ｍｌスクリューキャップ付きエッペンドルフ試験 管中に蒸発乾固させた。乾燥ペレットを脱イオン水５０μｌ中に再溶解させ、９ ５℃で５分間変性させた後、氷上で急冷した。氷上の試験管に対して１００ｍＭ ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０、３５０μｌ、ホウ酸から製造された）を 加え、混合物を簡単に撹拌し、そして室温まで加温した。次に、ビス（ＴＦＡ） ＣＤＡＲ−ＮＨＳのＤＭＳＯ中原液（原液は２０ｍＭ）色素６．６３ｍｇ／５０ ０μｌ（ＤＭＳＯ）であった）１００μｌを加え、混合物を簡単に撹拌し、銀泊 で覆い、そしてロータリーミキサー上に１８時間置いた。ＤＮＡを、３Ｍ酢酸ナ トリウム５０μｌに続いて無水エタノール１．２５０ｍｌを加えることによって 沈殿させ、−６０℃まで２時間冷却した。遠心分離後、上澄みを除去し、ペレッ トを７０％水性エタノールで洗浄し、そして減圧濃縮器中で乾燥させた。深赤色 ペレットは、しばしば溶解するのが遅く、脱イオン水１００μｌ中で定期的に撹 拌された。最終精製は、バイオスピン（Ｂｉｏｓｐｉｎ）３０スパンカラム（バ イオラド（ＢｉｏＲａｄ）、７３２６００６）を用いて達成された。２０ｍＭ水 酸化ナトリウムで１００５μｌまで希釈された溶出液のアリコート５μｌは、２ ６０ｎｍおよび５０８ｎｍでの吸光度を示し、Ａ₂₆₀／Ａ₅₀₈比６．５４（補正後 ）を与えた。したがって、塩基の２．８％がＣＤＡＲで標識された。２６０ｎｍ での吸光度は、以下のように色素吸光度に補正された。 Ａ₂₆₀（補正）＝Ａ₂₆₀−（Ａ₅₀₈×０．２７１） ０．１Ｍリン酸緩衝液における蛍光は、５０９ｎｍで吸収極大であり且つ５３３ ｎｍで発光最大であった。実施例８．ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳによる染色体列挙（ＣＥＰ−８）プ ローブの標識 ヒト染色体８（ＣＥＰ−８ ＤＮＡ）の特定部位に向けられた核酸ハイブリッ ド形成プローブ５０μｇを、２．５ｍｌスクリューキャップ付きエッペンドルフ 試験管中に蒸発乾固させた。ＣＥＰ−８ ＤＮＡの製法は、ビットナーら、１９ ９１年９月２０日出願の同時係属米国特許第０７／７６２，９１２号明細書に記 載されている。ペレットを脱イオン水（５０μｌ）中に再溶解させ、９５℃で５ 分間変性させた後、氷上で急冷した。氷上の試験管に対して１００ｍＭホウ酸ナ トリウム緩衝液（ｐＨ８．５、３５０μｌ、ホウ酸から製造された）を加え、混 合物を簡単に撹拌し、そして室温まで加温した。次に、ＣＤＡＲ−ＮＨＳのＤＭ ＳＯ中原液（色素１．５〜２．０ｍｇ／１００μｌ（ＤＭＳＯ）、２３〜３０ｍ Ｍ）１００μｌを加え、混合物を簡単に撹拌し、銀泊で覆い、そしてロータリー ミキサー上に１６時間置いた。色素の黄色／緑色蛍光は一晩中混合することによ って徐々に現れるにすぎないので、色素を加えた直後の溶液はほとんど無色（淡 黄色）であった。色素の完全な脱保護を確実にするために、１Ｍ炭酸ナトリウム 溶液（１０分の１容量、５０μｌ）を加え、混合を６〜２４時間続けた。混合物 を２ロットに分割し、そしてそれぞれに対して、酢酸ナトリウム（３Ｍ、２８μ ｌ）に続いて無水エタノール（６８８μｌ）を加えることによってＤＮＡを沈殿 させ、−６０℃まで２時間冷却した。遠心分離後、上澄みを除去し、ペレットを ７０％水性エタノールで洗浄し、そして減圧濃縮器中で乾燥させた。深赤色ペレ ットは、しばしば溶解するのが遅く、脱イオン水それぞれ５０μｌ中で定期的に 撹拌された。最終精製は、スパンカラム（バイオラド、バイオスピン３０）を用 いて達成された。溶出液は混合され、そして２０ｍＭ水酸化ナトリウムで１００ ５μｌまで希釈された溶液のアリコート５μｌは、補正後６．５４のＡ₂₆₀／Ａ_{5 08} 比、すなわち塩基の２．８％がＣＤＡＲで標識されたことを示した。実施例９．Ｎ４−（３−アミノプロピル）−２′−デオキシシチジン−５′−三 リン酸−カルボキシジアミノローダミン結合体の製造 ビス（ＴＦＡ）（ＣＤＡＲ−ＮＨＳ）（実施例４に記載のように製造された） ６．６ｍｇを、ＤＭＳＯ ５００μｌに溶解させ、そして０．１ホウ酸ナトリウ ム緩衝液（ｐＨ９）１．５ｍｌ中に溶解したＮ４−（３−アミノプロピル）−２ ′−デオキシシチジン−５′三リン酸（ＡＰｄＣＴＰ）クルイクシャンク、米国 特許第５，０９１，５１９号明細書を参照されたい）を含む溶液に対して加えた 。淡黄色混合物が入っている２．５ｍｌエッペンドルフ試験管を銀泊に包み、そ してロータリーミキサー上において室温で一晩中反応させた。 次に、反応混合物のアリコー卜２５μｌの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）による分析は、出発物質の変換が完全に達成されて、保持時間（Ｒｔ＝１８ ．０３分）が３７．０分および３８．３分の２種類の新規の化合物（異性体混合 物）が１対１の比率で生成したことを示した。トリフルオロアセチル保護基の完 全な除去を確実にするために、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液２００μｌを加え、そし て混合物を更に６時間ロータリーミキサーで混合した（ＨＰＬＣにより保持時間 には変化が見られなかったので、この処理はおそらく不必要であった）。 生成物は、最初に０．０５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）緩衝 液で平衡化されたＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム（１．５ｃｍ×２７ｃ ｍ）でのクロマトグラフィーによって精製された。溶媒は、２室勾配ミキサー（ ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＧＭ−１）から嬬動ポンプ（ファーマシア Ｐ−１、１００〜１２０ｍｌ／時をポンプ輸送するように設定された、１０×、 １．５設定、３．１ｍｍ管）、三方弁（ファーマシア、ＬＶ−３）、続いてカラ ム（エコノ（Ｅｃｏｎｏ）カラム、バイオラド）に対して供給された。カラムか らの溶離液は、キップ・アンド・ゾネン（Ｋｉｐｐ ＆ Ｚｏｎｅｎ）チャート レコーダー（チャート速度２ｍｍ／分、２０ｍＶ設定）に接続されたホロクロム （Ｈｏｌｏｃｈｒｏｍｅ）ＵＶ／ＶＩＳ検出器（１ＡＵＦＳ、５５２ｎｍ）へと 移動した。最終的に、溶出液画分（７ｍｌ、２２０滴）をジルソン（Ｇｉｌｓｏ ｎ）マイクロフラクショネーターで集めた。 試料を０．０５Ｍ ＴＥＡＢ ２ｍｌで希釈し、そして三方弁によってカラム 上部に入れた。次に、勾配を開始する前に、カラムを０．０５Ｍ ＴＥＡＢ（２ ５０ｍｌ）で洗浄した。ミキサーの前室に０．０５Ｍ ＴＥＡＢ、後部には０． ２５Ｍ ＴＥＡＢ（２５０ｍｌ）を充填した。次に、前室に０．２５Ｍ ＴＥＡ Ｂ、後部には０．５Ｍ ＴＥＡＢを充填した。最後に、０．５Ｍ〜０．７５Ｍの 勾配の緩衝液を、生成物が溶離されるまで流す。各種色素含有成分および副生成 物は、生成物が溶離される前に溶離される。 しばしば、試料注入工程は午後に行なわれ、溶離剤室が満たされ且つポンプが １×，５設定に低下されている勾配の第一段階は一晩中行なわれた。この流速は 、通常、液体７ｍｌを有するおよそ６５本の分別試験管を満たすであろう。次に 、勾配の次の段階は翌朝開始された。 純粋な（ＨＰＬＣ）生成物（実際は、２種類の異性体の混合物、５−および６ −カルボキシジアミノローダミン生成物ピーク）を含む画分をプールし、ロータ リーエバポレーター（浴温度＞３０℃）で油真空ポンプ圧下において蒸発乾固さ せた。残留物を無水エタノールで２回共蒸発させ、脱イオン水数ｍｌ中に溶解さ せ、そして５０３ｎｍの吸光度で定量した。５０３ｎｍで吸光係数６０，０００ と仮定すると、収量は０．５１６μモル（２６％）であった。最終的に、試料を サバント（Ｓａｖａｎｔ）減圧濃縮器で蒸発乾固させ、−２０℃で貯蔵した。実施例１０．新規の蛍光標識ヌクレオチド（フルオロ−ｄＮＴＰ′ｓ）のＤＮＡ プローブ中への酵素的取込み フルオロ−ｄＮＴＰ′ｓのニックトランスレーションによる酵素的取込みは、 標準的なニックトランスレーションプロトコル（ライフ・テクノロジーズ、ベセ スダ、ＭＤ）の変法を用いて以下のように実施された。氷冷された１．５ｍｌエ ッペンドルフ試験管に対して、脱イオン水６８μｌ、０．２ｍＭスペクトルオレ ンジｄＵＴＰ ２．５μｌ、各０．２ｍＭデオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ ｄＧＴＰ）（１０μｌ）、０．２ｍＭデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）（ ７．５μｌ）、Ａｌｕｌ制限ＣＥＰ鋳型（２．０μｌ）１μｇ／μｌ、大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼＩ溶液（１０μｌ）を（逐次的に）加えた。混合物を簡単に撹 拌し、ミクロ遠心分離機で１０分間回転させて混合した。次に、試験管を１６℃ で２時間インキュベートした後、０．３Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） （１０μｌ）で反応を停止させ、続いて撹拌し且つ遠心分離した。次に、各反応 混合物をバイオスピンゲル濾過カラム（バイオラド、カタログ＃７３２−６００ ６）において製造者によって与えられた取扱説明書にしたがって精製して、無色 またはほぼ無色の溶出液（１２０μｌ）を得た。次に、ＤＮＡを、４Ｍ酢酸ナト リウム（１２μｌ）およびエタノール（２８０μｌ）を加えることによって沈殿 させ、そして−２０℃で少なくとも２時間貯蔵した。上澄みをピペットで除去し 、目に見えないペレットをサバント「スピードバク（ＳｐｅｅｄＶａｃ）」冷却 減圧濃縮器で乾燥させた。ＤＮＡペレットは脱イオン水（２０μｌ）中に、パス ツールピペットで溶媒を試験管の側面に注意深く回すことによって再溶解させた 。回収率５０％と仮定すると、溶液は標識プローブ５０ｎｇ／μｌを含む。実施例１１．新規の標識ＤＮＡプローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形 成法による染色体＃８の動原体部位の検出 前述の実施例８のプローブ組成物を用いて、ヒト染色体＃８の動原体部位を以 下のように識別（検出）した。 標的ＤＮＡは、中期の細胞を捕捉するように処理された培養された正常白血球 から成った。これらの細胞を、顕微鏡スライド上に約２〜３フィート離れた所か ら滴下して核を破裂させ且つ染色体を暴露した。非破裂細胞および間期核もスラ イド表面上に存在した。ハイブリッド形成の前に、７０％ホルムアルデヒド／０ ．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０から成る変性溶液 中にスライドを７０℃で２分間入れた。次に、スライドを、７０％、８５％およ び１００％エタノール浴を（それぞれ２分間）通過させることによって脱水した 。次に、スライドを約４０℃まで加温した。 各スライド上に置かれたハイブリッド形成配合物は、常に５５％ホルムアミド ／１０％硫酸デキストラン／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／１５ｍＭクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ７．０であった。基本ハイブリッド形成配合物に対して加えられるプロ ーブ濃度は、許容しうるシグナル強度および特異性を得るのに必要な最適濃度を 決定するように変化させた。反応混合物は、更に、担体および保護ＤＮＡとして 加えられる音波処理済みヒト胎盤ＤＮＡ ４．５μｇを含んだ。非標識ヒト胎盤 ＤＮＡの他に、フルオレセインで標識された音波処理済みヒト胎盤ＤＮＡ約９６ ｎｇをゲノム対比染料として加えた。このようなゲノム対比染料の製造は、モリ ソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、１９９１年９月１９日出願の同時係属米国特許第 ０７／７６２，９２８号明細書に示されている。完成したハイブリッド形成混合 物１０μｌを、７０℃で５〜１５分間加熱することによって変性させた後、３７ ℃で５分間インキュベートした。配合物をスライドに直接的に塗布し、カバーガ ラスで覆い、その縁をラバーセメントで密封し、そして給湿室中において４２℃ で一晩中ハイブリッド形成させた。 翌日、カバーガラスをはずして、一連の洗浄、すなわち、０．３Ｍ ＮａＣｌ ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０％ホルムアルデヒドｖ／ｖ、ｐＨ７．０中 において４５℃でそれぞれ１５分間３回、次に、０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭ クエン酸ナトリウム（２×ＳＳＣ）、ｐＨ７．０中において４５℃で１５分間の １回洗浄、次に、０．Ｍリン酸ナトリウム／０．１％ＮＰ４０洗剤（カルビオケ ム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）カタログ＃４９２０１５）である「ＰＮ緩衝液」中 において４５℃で１５分間もう１回洗浄により、非結合プローブをスライドから 除去できるようにした。最後に、スライドをＰＮ緩衝液中において室温で２分間 ２回洗浄した後、自然乾燥させた。抗退色溶液１０マイクロリットルを標的細胞 上に置き、カバーガラスをその上に置いた。スライドを蛍光顕微鏡で観察した。 鮮明な緑色蛍光が染色体の標的部分で観察された。非特異的結合からの蛍光は観 察されなかった。比較例１ この比較例は、ＣＤＡＲとジスクシンイミジルカーボネートとの反応によって 直接的にＣＤＡＲ−ＮＨＳを製造する試みであった。実施例１からのＣＤＡＲ３ ４．０ｍｇおよびＤＳＣ ６４．０ｍｇの１Ｍ ＤＭＦ溶液０．２５ｍｌ中の不 完全溶液に対してＤＭＡＰ溶液１２２．１７ｍｇを加えた。深赤色溶液は直ちに 淡橙色に変わり、室温で撹拌することにより若干黒ずんだが、なおある程度淡色 のままであった。１．５時間後、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（ＣＨ₃ ＣＮ：酢酸：Ｈ₂Ｏ；８：１：１）によって検査したが、ＴＨＣで橙色に現れる 主要成分および他の着色成分を含む出発物質も生成物の複合混合物も示されなか った。ＣＤＡＲ−ＮＨＳを製造する直接反応は成功しなかった。 本発明の好ましい実施態様を記載してきたが、本発明は、種々の変更が可能で ある。したがって、本発明は、本明細書中に記載の正確な詳細に制限されると考 えるべきではなく、以下の請求の範囲の範囲内の全実施態様および変更を包含す ると解釈されるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 緑色蛍光性を有する標識ヌクレオチドであって、 （ａ）遊離ヌクレオチドかまたはポリヌクレオチドの形のヌクレオチド三リン 酸および （ｂ）一般式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、該ヌクレオチド三リ ン酸に結合した化学結合を含む） を有する緑色蛍光残基を含む上記ヌクレオチド。 ２． 化学結合が、 −ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯ）−、 −（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ₂）₂ＮＣＨＯ−および ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₅ＮＨＣＯ− から成る群より選択される残基である請求項１に記載のヌクレオチド。 ３． Ｒ₅が、Ｃ−５位に位置した炭素原子に結合している請求項１に記載の ヌクレオチド。 ４． ヌクレオチド三リン酸がデオキシシチジンを含み、Ｒ₅が、ピリミジン 環のＮ−４位に位置した窒素原子に結合した化学結合を含む請求項１に記載のヌ クレオチド。 ５． ヌクレオチド三リン酸がウリジンまたはデオキシウリジンを含み、Ｒ₅ が、プリン環のＣ−５位に位置した炭素原子に結合した化学結合である請求項１ に記載のヌクレオチド。 ６． ヌクレオチド三リン酸がデオキシアデノシンを含み、Ｒ₅が、プリン環 のＮ−６の窒素原子に位置した化学結合を含む請求項１に記載のヌクレオチド。 ７． 前記ヌクレオチド三リン酸が、ＤＮＡプローブとして用いるためのポリ ヌクレオチドを含む請求項２に記載のヌクレオチド。 ８． Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、そしてＲ₅が を含む請求項１に記載のヌクレオチド。 ９． 約５２３ｎｍの発光最大値を有する請求項１に記載のヌクレオチド。 １０．緑色蛍光性を有する標識ヌクレオチドであって、 （ａ）遊離ヌクレオチドかまたはポリヌクレオチドの形のヌクレオチドリン酸 および （ｂ）一般式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、該ヌクレオチドリン 酸に結合した化学結合を含む） を有する緑色蛍光残基を含む上記ヌクレオチド。 １１．リン酸塩が一リン酸塩を含む請求項１０に記載のヌクレオチド。 １２．リン酸塩が二リン酸塩を含む請求項１０に記載のヌクレオチド。 １３．Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、Ｒ₅が−（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ−であり 、そしてリン酸塩が三リン酸塩である請求項１０に記載のヌクレオチド。 １４．一般式 （式中、Ｒ₁およびＲ₃は塩基感受性酸安定性保護基を含み、Ｒ₂およびＲ₄は水素 または１〜８個の炭素を有するアルキル基を含み、そしてＲ₅は水素または金属 イオンを含む） を有する化合物。 １５．Ｒ₁およびＲ₃がＣＦ₃−ＣＯ−を含み、Ｒ₂およびＲ₄が水素を含み、そ してＲ₅が である請求項１４に記載の化合物。 １６．Ｒ₁およびＲ₃が、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチルおよびジ クロロアセチルの群より選択される請求項１４に記載の化合物。 １７．染色体または染色体の一部分をｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によ って識別するためのＤＮＡプローブであって、式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、ヌクレオチド三リン 酸に結合した化学結合を含む） を有する標識を含む上記プローブ。 １８．Ｒ₇〜Ｒ₁₂が水素であり、Ｒ₅が−ＮＨ−（ＣＨ₂）₂−ＮＨＣＯ−を含む 請求項１７に記載のプローブ。 １９．少なくとも１種類のＤＮＡ配列を更に含み、Ｒ5が該ＤＮＡ配列に結合 している請求項１８に記載のプローブ。 ２０．検出される染色体の少なくとも一部分に対してそれそれ相補的な多数の ＤＮＡセグメントを更に含む請求項１７に記載のプローブ。 ２１．多数のＤＮＡセグメントのそれぞれの一部分が少なくとも１種類の標識 を含む請求項２０に記載のプローブ。 ２２．Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、Ｒ₅が −ＮＨ−（ＣＨ₂）₂−ＮＨＣＯ−を含む請求項２０に記載のプローブ。 ２３．多数のＤＮＡセグメントの少なくとも二つが、異なる染色体の少なくと も一部分に対応する請求項１９に記載のプローブ。 ２４．染色体または染色体部位をｉｎ ｓｉｔｕ識別するための試薬の製造法 であって、 （ａ）検出される染色体または染色体部位の少なくとも一部分に対して本質的に 相補的な塩基配列を有するＤＮＡセグメント中に含まれる多数のシトシン塩基を アミノ基転移させ；そして （ｂ）式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、工程（ａ）において 製造されたアミノ基転移されたシトシン塩基の少なくとも一部分に結合したアミ ド化学結合を含む） を有する標識を共有結合して標識ヌクレオチドを製造する工程を含む上記方法。 ２５．（ｃ）工程（ａ）から生じた不純物を除去することによって標識ヌクレ オチドを精製すること を更に含む請求項２４に記載の方法。 ２６．Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、Ｒ₅が、アミノ基転移した塩基の窒素 原子に結合した−（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ−である請求項２４に記載の方法。 ２７．染色体または染色体部位をｉｎ ｓｉｔｕ識別するための試薬の製造法 であって、 （ａ）式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、ヌクレオチドに対す る化学結合を含む） を有する標識を共有結合して標識ヌクレオチドを生じ、そして（ｂ）該標識ヌク レオチドを、ハイブリッド形成の際に光学技術を用いて検出を可能にする十分な 量で、検出される染色体または染色体部位に対して本質的に相補的な塩基配列を 有するＤＮＡ配列中に酵素的に取込む工程を含む上記方法。 ２８．ヌクレオチドがｄＵＴＰである請求項２７に記載の方法。 ２９．Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、Ｒ₅がアミド結合を含む請求項２７に 記載の方法。 ３０．ヌクレオチドがｄＣＴＰである請求項２７に記載の方法。 ３１．緑色蛍光ローダミン色素の反応性誘導体の製造法であって、該誘導体は ヌクレオチドに対して結合しうる反応性基を含み、 （ａ）非置換アミノ基を有する蛍光ローダミン色素を保護反応体と反応させて 保護されたローダミン色素を生じ、 （ｂ）該保護されたローダミン色素を反応性結合物質と反応させて反応性誘導 体を生じることを含む上記方法。 ３２．保護反応体がトリフルオロ酢酸無水物である請求項３１に記載の方法。 ３３．反応性結合物質がジスクシンイミジルカーボネートである請求項３１に 記載の方法。 ３４．ローダミン色素が５（６）−カルボキシ−３′，６′−ジアミノローダ ミンを含む請求項３１に記載の方法。