JPH08503604A - Green fluorescently labeled nucleotide for use in a probe - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸合成において用いるための、特に、染色体識別においてＤＮＡプローブとして用いるために適当な緑色蛍光標識ヌクレオチドを提供する。該緑色蛍光標識は緑色ローダミン色素に由来し、そして更に、本発明は、該標識ヌクレオチドの製造法を含む。   (57) [Summary] The present invention provides green fluorescent labeled nucleotides suitable for use in nucleic acid synthesis, particularly as a DNA probe in chromosome identification. The green fluorescent label is derived from a green rhodamine dye, and further, the invention includes a method of making the labeled nucleotide.

Description

【発明の詳細な説明】 プローブで用いるための緑色蛍光標識ヌクレオチド 本発明は、概して、緑色蛍光化合物およびＤＮＡを標識するためのそれらの使 用、更に詳しくは、緑色ローダミン色素およびそれらの合成並びにＤＮＡを標識 する場合のそれらの使用に関する。本発明は、更に、緑色蛍光標識を含むＤＮＡ プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリッド形成法による染色体または染色 体領域の検出および識別に関する。 発明の背景 標識ＤＮＡプローブは、染色体の識別および実験において特に有用である。染 色体構造の変化は、しばしば、ある種の癌を含む多数の先天性遺伝的疾患および 変性症と一致し、しかもそれらの原因でありうる。このような変化は、染色体全 体の付加若しくは不存在または染色体の一部分の付加若しくは不存在の形をとり うる。染色体は、更に、転座によるように再配列されることがあり、異なる染色 体部位が互いに連結するようになる。逆位、増幅および完全な欠失を含む多数の 他の遺伝的欠損は、単独でまたは前記の欠損との組合せで存在しうる。適当に標 識されたＤＮＡプローブを用いて染色体およびそれらの任意の変化を検出するこ とは可能であり、極めて望ましい。 ＤＮＡプローブの使用による染色体識別は、概して、細胞試料中に存在する染 色体またはその部位に対するプローブのハイブリッド形成を必要とする。ＤＮＡ プローブの使用に対する一つのアプローチは、「間接標識」プローブの使用であ る。間接標識プローブは、標的染色体に対するプローブのハイブリッド形成後に 直接的に識別することができない残基によって標識された核酸プローブである。 しかしながら、次にプローブ上の残基を、識別することができる標識反応性物質 と反応させることができる。例えば、間接標識プローブは、ビオチンなどのハプ テンによって標識される。このようなプローブは、標的染色体に対してハイブリ ッド形成された後に、結合した蛍光標識を有する反応性物質、例えばビオチンに 対する抗体と引き続き反応させることができる。次に、ハプテンに対する反応性 物質の結合から得られた次の生成物を、蛍光顕微鏡によって識別することができ る。一般的には、このアプローチを蛍光Ｉｎ−Ｓｉｔｕハイブリッド形成法（以 下「ＦＩＳＨ」）と称する。例えば、グレイ（Ｇｒａｙ）ら、欧州特許出願第０ ４３０４０２号明細書を参照されたい。 ＦＩＳＨに対するもう一つのアプローチは、検出しうる残基が核酸プローブに 対して直接的に結合している「直接標識」蛍光プローブを用いた。直接標識ＤＮ Ａプローブを用いて、標的染色体に対するプローブのハイブリッド形成後に、プ ローブ／染色体ハイブリッドを、検出可能な標識を有する反応体による細胞性物 質の侵入を伴う別個の反応工程を必要とすることなく直接的に検出しうる。染色 体識別のための直接標識ＤＮＡプローブは、本明細書中に参考として包含されて いるＭ．Ｌ．ビットナー（Ｂｉｔｔｎｅｒ）、Ｌ．Ｅ．モリソン（Ｍｏｒｒｉｓ ｏｎ）およびＭ．Ｓ．リゲーター（Ｌｅｇａｔｏｒ）による１９９１年９月１９ 日出願の米国特許出願第０７／７６２，９１３号明細書に開示されている。 ＦＩＳＨは、高分解能染色体分析をもたらすことができると考えられる。しか しながら、大部分の商業的に利用可能な発蛍光団プローブは、シグナル対ノイズ 比に対して極めて敏感である蛍光顕微鏡の使用を必要とし、それによって日常的 な分析を難しくしている。フルオレセインは、ＦＩＳＨにおいて用いられてきた 緑色蛍光化合物である。しかしながら、フルオレセインは、核酸プローブ中で用 いられた場合、高光酸化速度に影響され、そしてこのようなプローブは有意のレ ベルの非特異的結合を示す。更に、同一試料の複数分析を可能にする異なる色の 蛍光標識プローブを有することは望ましい。したがって、核酸プローブのための より優れた性能の緑色蛍光標識化合物が望ましい。 更に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法において用いるのに適当であるよう に、発蛍光団標識は、一つには、核酸鎖を破壊することなく核酸に対して結合可 能である必要があり、そして二つには、核酸および標的染色体間のハイブリッド 形成反応を妨げない必要がある。これらの要件は容易に達成されない。 蛍光標識化合物およびそれらを含むヌクレオチドについてのいくつかの開示が ある。しかしながら、これらの開示には、ローダミン色素構造を有する緑色蛍光 化合物に関するものはない。 ローダミン色素であるローダミン１１０（緑色）、ローダミンＢ（橙色）およ びローダミン６Ｇ（赤色）は周知であり且つ商業的に入手可能である（コダック 光学製品カタログ＃ＪＪ−１６９、イーストマン・コダック・カンパニー（Ｅａ ｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロチェスター、ＮＹを参照された い）。１９８８年６月２２日公開の欧州特許出願第０２７２００７号明細書は、 ＤＮＡ配列決定に関わる、高分子のゲル電気泳動分離において用いるためのある 種のローダミン色素の異性体として純粋な５−および６−スクシンイミジルカル ボキシレートの製造法および単離法を開示している。そこで開示された５−およ び６−スクシンイミジルエステルは、完全に置換されたアミノ基を有するローダ ミン色素に由来する。この明細書は、染色体のｉｎ ｓｉｔｕ識別のための核酸 プローブ中の緑色蛍光標識として適当な緑色蛍光ローダミン色素を開示していな い。 ワード（Ｗａｒｄ）ら、米国特許第４，７１１，９５５号明細書は、ピリミジ ンの５位、プリンの８位および７−デアザプリンの７位におけるヌクレオチドへ のビオチン（または他のハプテン）の結合を開示している。ワードらの特許は、 ヌクレオチドに対してビオチンを結合する有機水銀法を用いる。しかしながら、 ビオチンおよびハプテン以外の標識基を修飾ヌクレオチドに対して結合しうると は示唆されていないし、蛍光直接標識ＤＮＡプローブについても全く示唆されて いない。 クレバン（Ｋｌｅｖａｎ）ら、米国特許第４，８２８，９７９号明細書もまた 、標識反応において引き続き用いるためのモノヌクレオチドの修飾を開示してい る。具体的には、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰを、長さが異なるリンカーアームによ ってそれぞれ６位および４位において誘導化する。更に、修飾ヌクレオチドをビ オチンに結合した後、それを、プローブとして用いるためにポリヌクレオチド中 に酵素的に取込ませることができる。クレバンらは、ＤＮＡプローブ中での蛍光 標識の使用を開示していない。 ムソー（Ｍｕｓｓｏ）ら、米国特許第４，８３３，２５１号明細書は、特異的 に誘導されたビオチンで標識された間接標識ポリヌクレオチドプローブの化学的 合成および使用を記載している。誘導されたビオチン標識は、ポリヌクレオチド 上のアミノ基転移されたシトシンＮ−４アミノ基に対してヒドラゾン結合によっ て結合される。更に、ムソーらは、固体支持体結合核酸の分析について記載して いるが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成プローブの使用については記載してい ない。 ウィーガント（Ｗｉｅｇａｎｔ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９，３２３７（１９９１）は、蛍光標識されたヒト核酸プローブを製造するた めのニックトランスレーションフォーマットにおけるフルオレセイン−ｄＵＴＰ の使用を開示している。プローブは、ヒト中期染色体のｉｎ ｓｉｔｕハイブリ ッド形成法に用いられる。しかしながら、他の緑色蛍光標識プローブは開示され ていない。 ウルデア（Ｕｒｄｅａ）およびホーン（Ｈｏｒｎ）、米国特許第４，９１０， ３００号明細書は、オリゴヌクレオチド合成において用いるための修飾ヌクレオ チドの合成を教示している。具体的な発蛍光団は開示されていないし、核酸プロ ーブに対するような結合の合成スキームも示されていない。 ルース（Ｒｕｔｈ）、米国特許第４，９４８，８８２号明細書は、オリゴヌク レオチド合成に適当な修飾ヌクレオチドを教示している。ルースは、それらのヌ クレオチド中で用いるための特定の蛍光化合物を全く明記していないし、蛍光標 識ＤＮＡプローブも開示していない。 したがって、特に、染色体またはその一部分のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形 成法識別のためのＤＮＡプローブ中で用いるためのヌクレオチド標識として用い るのに適当な安定高発光緑色蛍光化合物が必要とされている。本発明の概括的な 目的は、ヌクレオチドと反応しうる新規の緑色発光ローダミン色素化合物および プローブ中で用いるための緑色蛍光標識ヌクレオチドを提供することである。 発明の概要 本発明は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法において用いるための生体 分子に対して結合しうる化合物を生成するための緑色発光ローダミンの合成およ び修飾を記載する。本発明は、（１）染色体または染色体部位のｉｎ ｓｉｔｕ 検出に有用である緑色蛍光標識組成物並びにそれらを含む標識プローブおよびヌ クレオチド組成物、（２）このような標識並びにそれらを包含するヌクレオチド およびプローブ組成物の合成法、そして（３）染色体または染色体部位のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのこのようなプローブ組成物の使用法を提供する。 本発明は、概して、下記の式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇〜Ｒ₁₂は同じであるかまた は異なり、水素、ハロゲンおよびアルキル基から成る群より選択されＲ₅は、カ ルボキシル基かまたは炭素９′に対するラクトン結合であり、そしてＲ₆は、ヌ クレオチドに結合しうる反応性基である） を有する残基のヌクレオチド標識としての使用に関する。本発明の好ましい緑色 蛍光標識残基においては、Ｒ₇からＲ₁₂はそれぞれ水素であり、Ｒ₆はヌクレオチ ド上のアミンと結合しうるカルボキシル基である。 本発明の残基は、ヌクレオチドに対して結合することができ、そして結合後に 、ヌクレオチドに対して緑色発光性を与える。 本発明は、更に、 緑色蛍光性を有する標識ヌクレオチドであって、 （ａ）遊離ヌクレオチドかまたはポリヌクレオチドの形のヌクレオチド三リン 酸および （ｂ）一般式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、該ヌクレオチド三リ ン酸に結合した化学結合を含む） を有する緑色蛍光残基を含む上記ヌクレオチドを含む。この実施態様において、 化学結合は、好ましくは、ヌクレオチドに対するアミド結合を含む。 もう一つの態様において、本発明は、染色体または染色体部位のｉｎ ｓｉｔ ｕ検出のためのプローブの製造法であって、 （ａ）検出される染色体または染色体部位に関して本質的に相補的な塩基配列を 有するＤＮＡ配列中に含まれる多数のシトシン塩基をアミノ基転移させて、反応 性アミン基を有するアミノ基転移された塩基を有するＤＮＡ配列を製造し；そし て （ｂ）式１を有する残基を含む蛍光標識を、アミノ基転移された塩基の少なく とも一部分に対して共有結合させることを含み、多数のこのような塩基は、光学 技術によって検出するのに十分な共有結合した標識を有し、同時に、検出される 染色体または染色体部位に関してプローブのＤＮＡ配列の特異的結合性を本質的 に保持している上記方法に関する。 更にもう一つの態様において、本発明は、染色体または染色体部位のｉｎ ｓ ｉｔｕ検出のためのプローブの製造法であって、 （ａ）式２を有する残基を含む標識ヌクレオチドを製造し、 （ｂ）工程（ａ）から生じた不純物を除去することによって該標識ヌクレオチ ドを精製し、そして （ｃ）該標識ヌクレオチドを、検出される染色体に関して本質的に相補的な塩 基配列を有するＤＮＡ配列中に、標的染色体に対する該ＤＮＡ配列のハイブリッ ド形成後に光学技術を用いて検出を可能にする十分な量で酵素的に取込ませるこ とを含む上記方法に関する。 本発明の蛍光残基は、ＤＮＡプローブなどの標識ヌクレオチドに対して優れた シグナル強度および検出可能性を与える。それらは、慣用的な蛍光顕微鏡を用い るＦＩＳＨ法において容易に検出される。更に、それらをＤＮＡに対して結合さ せて直接標識ＤＮＡプローブを製造することができ、それを染色体ＤＮＡに対し てハイブリッド形成させることができる。本発明のもう一つの利点は、ローダミ ン色素出発物質の非置換アミノ基に対する保護基の付加を含む、式１を有する残 基の製造法である。保護基は、定量的収率に密接な出発物質に対する不可欠なス クシンイミジル基または他の反応性基の付加を可能にする。反応性基は、核酸に 対する標識の結合を達成するのに重要である。 発明の説明 本発明は、ヌクレオチドに対して結合しうる、好ましくは緑色の蛍光発光性ロ ーダミン残基、それらのスクシンイミジルエステルおよび他の誘導体、並びにそ れらの製造法および使用法を含む。本発明の重要な特徴は、式１を有するキサン テン様環の３′位および６′位の不安定なアミノ基の保護を含む合成法であり、 それが、引き続きのスクシンイミジル化または別の反応性基の付加を生じさせる 。核酸に対して緑色ローダミン構造を結合する次の結合工程は、結果としてほぼ 定量的に行なわれる。 蛍光化合物 本発明の緑色蛍光化合物は、前記の式１によって定義され、そこにおいて好ま しい置換基Ｒ6はカルボキシル基であり、遊離状態かまたはポリヌクレオチドの 形のヌクレオチド三リン酸に対する化学結合に適している。 本発明の標識ヌクレオチドを製造する好ましい合成経路は、 ＣＤＡＲ（または誘導体） ↓ 保護基付加 保護されたローダミン化合物 ↓ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによるエステル化 保護されたコハク酸ローダミン ↓ 反応性アミノ基を含むヌクレオチドとの結合 緑色ローダミン標識ヌクレオチド 本発明の好ましい発蛍光団出発残基は、緑色発蛍光団色素残基である５，（６ ）−カルボキシジアミノローダミン（ＣＤＡＲ）である。ＣＤＡＲは、以下の実 施例１に記載の反応のような任意の適当な合成技術によって合成することができ る。ＣＤＡＲ残基は、Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素である式１で表わされる。出願 人は、ＣＤ ＡＲの環上の水素Ｒ₇〜Ｒ₁₂のいずれかまたは全部が変化しても、 蛍光色は緑色から変化しないであろうと予想している。式１において、Ｒ_gは、 カルボキシル基かまたは炭素９′に結合したラクトンでありうる。ラクトン型は 無色であるが、核酸に対して結合する際にラクトンはカルボキシル基に変換され 、その結果、緑色蛍光性が生じる。 ヌクレオチド標識を誘導するためのＣＤＡＲまたはその置換誘導体の使用を拘 束するものは、Ｒ₁〜Ｒ₄が水素である場合の非置換アミノ基の反応性であり、そ れは、特にスクシンイミジル化反応の使用により、このような色素をヌクレオチ ド三リン酸に対して結合する能力を制限する。欧州特許出願第８７３１０２５６ ．０号明細書に開示されたジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）法のよう なスクシンイミジル化化学の典型的な条件が、非置換アミノ基との望ましくない 副反応を引き起こしてアシル化アミノ基を生じることは十分に理解される。例え ば、Ａ．Ｋ．ゴーシュ（Ｇｈｏｓｈ）らは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３ ，（２０）２７８１（１９９２）において、ＤＳＣが、Ｃ ＤＡＲまたはその誘導体上に存在するような非保護アミノ基と反応することを実 証している。したがって、本発明の特に重要な態様は、スクシンイミジル化の前 にアミノ基に対して保護化合物を加えて、望ましい反応性エステルを製造するこ とである。したがって、式１を有する蛍光残基は、最初にＣＤＡＲまたは誘導体 を保護基と反応させて保護されたローダミン化合物を製造することにより、ＣＤ ＡＲまたはその誘導体から製造される。次に、保護されたローダミン化合物をＮ −ヒドロキシスクシンイミドと反応させて式１を有する残基を製造する。実際に は、適当な保護基の選択は、反応性アミノ基を有するＤＮＡプローブ配列または 別個のアミノ化ヌクレオチドと共有結合することを可能にし、同時に、保護基を 除去して望ましい蛍光標識化合物を生成する。 本発明において、保護基は、酸感受性であるが塩基安定性の化合物であるのが 好ましく；それによってエステル化に必要な塩基性ｐｈ条件に対してそれを安定 性にし、更には、ヌクレオチドに対する結合のための酸性条件下で容易に除去し うるようにする。任意の適当な条件を用いて、出発物質に対して保護基を付加す ることができる。好ましくは、これらの条件は以下の実施例２において用いられ るものを含む。トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）は好ましい保護基である（以下 の実施例２を参照されたい）。一および多塩素化アセチル、例えば、トリクロロ アセチル（ＴＣＡ）およびジクロロアセチル（ＤＣＡ）を含む、ＴＦＡと同様の 既知の化学的性質を有する他の保護基も使用可能である。（ＴＦＡ）ＣＤＡＲな どの好ましいＴＦＡ発蛍光団色素中間体は、以下の実施例３の方法論を用いる引 き続きのスクシンイミジル化に適当である。 本発明の実施において用いられる式１を有する塩基性蛍光残基は、１分子当り 少なくとも１個の発蛍光団置換基（または基）、そして更には１分子当り１個の 反応性置換基（または基）を包含する。式１において、発蛍光団置換基はＣＤＡ Ｒの４個の環状残基である。反応性置換基は、ジエチルアミノ基のように、ヌク レオチド中の結合基中に包含された反応性基と反応性であり且つそれと結合する ように選択される。 発蛍光団に対して結合した式１の反応性置換基は、ヌクレオチドの結合基中に 存在するアミノ基かまたはカルボキシル基と反応性であるように選択しうる。好 ましくは、反応性置換基はカルボキシルであり、そして結合基の反応性基はアミ ノであって、アミド結合を生じる。結合基中のアミノ置換基との反応性のために 、カルボキシ置換基は、酸若しくは塩の形、アルデヒド基または類似のものであ りうる。式１の好ましい反応性置換基は、イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシ−７−オキサビシクロ［２，２，１］ ヘプタ−５−エン−２，３−ジカルボキシミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボル ネン−２，３−Ｏ−ジカルボキシミド、塩化スルホニル、クロロトリアジン、ヒ ドロキシベンゾトリアゾリド、カルボン酸アジド等から選択され、これらによっ て例示される。 結合基中のカルボキシ置換基との反応性のために、蛍光化合物の反応性置換基 は、カルボキシル反応性基、例えば、（前記に定義されたような）第一若しくは 第二の形のアミノ置換基等でありうる。この結合に好ましい反応性置換基は、第 一アミノ置換基である。 結合化合物 本明細書中で用いられる「結合化合物」、「結合基」または「化学結合」とい う用語は、概して、ヌクオチド、ポリヌクレオチド配列またはモノヌクレオチド に対する本発明の蛍光残基標識の化学的結合に適当な炭化水素残基を意味する。 したがって、結合化合物は、本発明の発蛍光団化合物と反応しうる必要がある。 本発明の実施において用いられる結合化合物を製造するための出発物質は、出 発物質１分子当り２個の置換基官能性（すなわち、反応性）置換基を有する二官 能性有機化合物である。結合化合物１分子当り少なくとも１個のこのような官能 性置換基は、共通に譲渡されたビットナーら、米国特許出願第０７／７６２，９ １３号明細書に開示されたような重亜硫酸塩に触媒された水性アミノ基転移条件 下においてポリヌクレオチド中のデオキシチジンヌクレオチドと反応性であるの が好ましい。ヌクレオチドと反応性の置換基の例としては、アルキル、アミノ（ 第一および第二）、ヒドラジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド等がある 。現在のところアミノ基が最も好ましい。 結合化合物上の他の官能性置換基は、本発明の蛍光残基と反応性である。この 官能性基は直ちに反応性、すなわち非保護でありうるしまたは保護されていても よい。適当な非保護第二官能性置換基の例としては、アミノ、カルボキシル、リ ン酸塩、スルホン酸塩、ヒドロキシル、ヒドラジド、セミカルバジド、チオセミ カルバジド等がある。好ましい非保護第二官能性置換基としては、アミノ（第一 または第二）およびカルボキシル基がある。適当な保護された第二官能性置換基 の例としては、保護されたスルホン酸塩、保護されたリン酸塩および保護された スルフヒドリルがある。適当な保護置換基の例としては、低級アルキル基、例え ば、メチル、エチルおよびプロピルがある。 このような二官能性結合化合物中に存在する２個の官能性置換基は、それぞれ 互いに隣接した炭素原子上の置換基でありうるし、またはそれらは、多数の介在 する相互に結合した原子（好ましくは炭素原子）によって互いに間隔を置くこと ができる。第一および第二官能性置換基は、リンカーまたは結合残基によって結 合している。この結合残基は、任意の好都合な構造を有することができるが、ア ミノ基転移の際にアミノ基転移媒質中に存在する他の物質と非反応性である必要 がある。結合残基は、非環状または環状であり、場合により他の原子を包含しう る２〜２０個の炭素を有する二価の炭化水素基である。エーテル基またはチオエ ーテル基が１個だけ存在するのが好ましい。結合化合物全体が、少なくとも２個 で合計約２０個以下の原子を有する有機基であるのが現在のところ好ましい。 プローブ製造 「プローブ」または「プローブ組成物」という用語は、個々の標識含有残基と 化学結合したＤＮＡ配列などのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド混合物 を意味する。ＤＮＡプローブのそれぞれのポリヌクレオチドは、典型的に、標的 染色体に対してハイブリッド形成する時点で一本鎖である。本発明のプローブは 、式１を有する蛍光残基に対して化学結合したポリヌクレオチドを含む。 任意の適当な手順を用いて本発明のプローブを製造することができ、適当な手 順は、ビットナーら、米国特許出願第０７／７６２，９１３号明細書に開示され ている。好ましい手順は、下記、 （ａ）任意の適当な手段によって、一つの予め選択された染色体または予め選 択された染色体部位に特異的なＤＮＡ配列をフラグメント化して（すなわち、破 壊して）ＤＮＡフラグメント（またはセグメント）にし； （ｂ）該ＤＮＡフラグメント中に存在するデオキシシチジンヌクレオチドを（ 前記のような）結合化合物によってアミノ基転移して、アミノ基を有するＤＮＡ フラグメントを製造し；そして （ｃ）適当な条件下においてＤＮＡフラグメントのアミノ基と式１を有する蛍 光残基とを共有結合させる（すなわち、化学結合させる）工程を含む。 本発明のプローブの製造において出発物質として用いるために、１種類または 複数の出発ＤＮＡ配列を種々の技法によって、例えば、（ａ）多染色体ゲノムの 単一の予め選択された染色体を多数流動選別することによって分離されるＤＮＡ ；（ｂ）予め選択された染色体の染色体ライブラリー、および（ｃ）予め選択さ れた染色体のＤＮＡを包含する種間ハイブリッドから得ることができる。好まし い出発染色体ＤＮＡは、標準法によって製造され且つ当業者に知られている伝統 的源、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）または ヒト若しくは他のクローン化遺伝物質の他の貯蔵所から入手可能な染色体ライブ ラリーである。ＡＴＣＣ寄託は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド州から入手 可能である。 本発明の実施においては部分染色体ＤＮＡを用い、それは多染色体ゲノムの染 色体の一つの予め選択された部位から直接的にかまたは間接的に誘導することが できる。このような出発部分染色体ＤＮＡは、典型的に、少なくとも１種類のＤ ＮＡ配列の形である。このような１種類または複数の配列はそれぞれ、少なくと も１種類のＤＮＡ反復セグメントを多数、好ましくは構造的に異なるＤＮＡ反復 セグメントを多数（すなわち、少なくとも２種類）包含することが現在のところ 好ましい。好ましくは、このような部分ＤＮＡ配列は、研究中の生物の全ゲノム の他の部位に相対して独特である。出発部分ＤＮＡは、一つの染色体の個々の予 め選択された部位の様々な位置および全体に個々に存在し且つ予め選択された部 位に存在しているＤＮＡを代表するものである多数のＤＮＡセグメントを包含す る。現在好ましいゲノムはヒトゲノムである。 ＤＮＡセグメントは、フラグメント化により、特定の予め選択された出発染色 体ＤＮＡまたは出発部分染色体ＤＮＡから得られる。フラグメント化後のＤＮＡ セグメントは、約２０〜約６００ｂｐの範囲内である平均寸法を有するのが好ま しく、好ましい平均寸法範囲は約１５０〜約６００ｂｐ、更に好ましい平均寸法 範囲は約２００〜約４００ｂｐ、そして現在最も好ましい平均寸法は約３００ｂ ｐである。これらのＤＮＡセグメントまたはフラグメントはそれぞれ、特定の予 め選択された染色体または予め選択された染色体部位に存在する１種類またはそ れ以上のＤＮＡ配列に対して相補的であると考えられる。 本発明において、特定の染色体ＤＮＡの音波処理によってフラグメント化され たＤＮＡフラグメントを生成することが好ましい。音波処理条件は、約０．０５ 〜約４ｍｇ／ｍｌの範囲内にある特定の出発染色体ＤＮＡの水性分散液を用いる 。適用される音波処理周波数は約２０，０００サイクル／秒であり、そしてそれ を、試料の加熱を低減させるように冷却浴（ドライアイスおよびエタノール）中 に浸漬されているのが好ましい試料含有試験管に約１〜約１０分間与える。ブラ ンソン・ソニファイアー（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）４５０型（ダン パリー（Ｄａｎｂｕｒｙ）、ＣＴ）を用いて水溶液中においてマイクロチップを 試験管底部から約２〜約５ｍｍに位置させた場合、適当な出力は約２５〜約３０ ワットの範囲内である。好ましくは、このような超音波エネルギーを、８０％オ ン、２０％オフのサイクルを用いて合計約５分間与える。 染色体またはその部分に特異的なＤＮＡが、例えば市販元から既に適当にフラ グメント化された状態で得られた場合、次のアミノ基転移処理工程を行なう前の 分離フラグメント化工程は不必要である。 本発明のプローブは、染色体、異数性または異常染色体および二動原体染色体 の識別に、生物の性別決定に、他の核酸プローブと一緒に用いられる調節に並び に他の適当な用途に有用である。 染色体プローブのアミノ基転移 「染色体ペイント」または「ペインティングプローブ」という用語は、ハイブ リッド形成条件下において、多染色体ゲノムの一つの予め決定された染色体を含 む標的とハイブリッド形成するように適合される本発明のポリヌクレオチド実施 態様のようなプローブまたはプローブ組成物を意味する。典型的に、本発明の一 つのペインティングプローブは、２種類の予め決定された染色体の同時染色およ び検出を可能にするように第二のペインティングプローブと混合することができ る。これに対し、「染色体列挙プローブ」は、動原体部位のような、染色体の標 的部位とハイブリッド形成するように適合されるＤＮＡプローブを意味する。 本発明の蛍光残基でＤＮＡプローブを標識することを可能にするために、好ま しくは、染色体ＤＮＡ中の全デオキシシチジン塩基の一部分を、シトシン（すな わちデオキシシチジンヌクレオチド）のアミノ基の炭素原子４位の（前記のよう な）二官能性結合化合物のアミノ基によってアミノ基転移させる。出発ＤＮＡ配 列またはＤＮＡフラグメントのこのような混合物中に含まれる全ヌクレオチドの 約０．２〜約８モル％がアミノ基転移される。いずれの場合にも、最も有効なア ミノ化百分率は、典型的に、用いられる特定の蛍光標識残基に影響される。 アミノ基転移は、便宜上、重亜硫酸塩触媒存在下の水性液相条件下において変 性ＤＮＡ配列またはセグメントを用いて達成される。結合化合物を、水性アミノ 基転移媒質中に溶解させる。アミノ基転移においてカオトロープを用いる技術お よび利点は、ビットナーら、同時係属米国特許第０７／７６２，９１３号明細書 に示されている。 酵素（直接）標識プローブ組成物 蛍光標識デオキシヌクレオシド三リン酸（フルオロ−ｄＮＴＰ）の合成 本発明の蛍光化合物は、上記のような、直接蛍光プローブ標識方法論において 用いられたようなリンカーによってｄＮＴＰに結合させることができる。好まし くは、該化合物は、適当に接近しうる部位においてヌクレオシド三リン酸に予め 結合されたリンカーの反応性基部分に対して化学的に反応する反応性カルボキシ 基を有する。本発明の蛍光残基は、一および二リン酸塩に対しても結合しうる。 反応性置換基部分を有する結合リンカーを有するヌクレオチドの適当な例は、 アミノ化デオキシリボヌクレオチドである５−（３−アミノアリル）−２′−デ オキシウリジン−５′−三リン酸（ＡＡｄＵＴＰ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入 手可能、カタログ番号Ａ５９１０）、Ｎ４−（３−アミノプロピル）−２′−デ オキシシチジン−５′−三リン酸（ＡＰｄＣＴＰ、クルイクシャンク （Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ）、米国特許第５，０９１，５１９号明細書を参照さ れたい）、およびＮ６−（６−アミノヘキシル）−２′−デオキシアデノシン− ５′−三リン酸（ＡＨｄＡＴＰ）ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッ ド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．）から入手可能、カタログ 番号９５１４ＳＡ）である。 フルオロ−ｄＮＴＰの合成は、以下の実施例９に記載のように実施することが できる。好ましくは、その方法は、蛍光化合物の反応性置換基とアミノ化デオキ シヌクレオチドとをホウ酸緩衝液中で反応させることを含む。ホウ酸緩衝液は、 更に、ＴＦＡ保護基を除去するように作用して、「結合」フルオロ−ｄＮＴＰを 生成する。 この方法で製造された蛍光標識ｄＮＴＰ′ｓは、当業者に周知の様々な方法に よってポリヌクレオチド中に酵素的に取込ませるのに適している。例えば、本発 明者は、ライフ・テクノロジーズから入手可能な標準的なニックトランスレーシ ョンプロトコルの変法を用いるニックトランスレーションによってフルオロ−ｄ ＮＴＰ′ｓを酵素的に取込むことを行なった（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ− ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド、カタログ番号８１６０ＳＢを 参照されたい）。 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法および染色 本発明の染色体ペインティングプローブ、染色体列挙プローブおよび酵素標識 プローブ組成物は、予め選択された染色体または染色体部位それぞれの染料とし ておよびそれらを識別するためにハイブリッド形成法で用いるのに十分に適して いる。操作は、（ａ）このような染色体または染色体部位（そのフラグメントを 含む）を含むと思われる検体を、ハイブリッド形成条件下において、染色体また は染色体部位の標的ＤＮＡとハイブリッド形成する本発明のプローブと接触させ て、標的ＤＮＡとプローブ組成物中に存在するプローブＤＮＡセグメントとのハ イブリッドを形成させ、（ｂ）得られた検体からプローブ組成物の残留部分を分 離し、そして（ｃ）得られた検体を検査する、３種類の連続工程を行なう。 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法は、予め選択された染色体または染色体部 位の全部または一部分のみを含む特定の検体を包含してもよい。現在、予備的に 製造され、且つスライド、例えば、ガラス製等のスライド上に固定された検体に ついて一般的に且つ好都合に実施される種類のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成 において本発明のプローブを用いることが好ましい。 このようなスライドに固定された検体中の予め選択された染色体または染色体 部位の識別を本発明のプローブを用いて達成するために、下記に例示した方法を 実施することができる。好ましくは、このようなスライドに固定された検体を予 備処理して、そこに存在していると予想されるＤＮＡを少なくとも部分的に脱水 し、そして更に少なくとも部分的に変性させる。慣用的な変性法および脱水法並 びに材料を用いることができ、続いて次のハイブリッド形成工程をハイブリッド 形成条件下で実施する。最初に、スライドに固定された検体を、本発明のプロー ブ組成物と接触させる。次に、検体およびそれに接触している処理用プローブ組 成物の組合せを約３０〜４５℃で適当な時間インキュベートする。次に、得られ たハイブリッド含有検体に液体洗浄操作を施して、未反応の残留する処理用プロ ーブ組成物を除去する。バット（Ｂｈａｔｔ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６ ：３９５１〜３９６１（１９８８）を参照されたい。 所望ならば、次に、対比染料を固定用媒質中に取り込ませることができる。 スライドは、処理直後に蛍光顕微鏡下で慣用的なフィルターを用いて観察する ことができるし、またはそれらを検査前に室温で数日間または同程度貯蔵するこ とができる。本発明の利点は、ＣＤＡＲ基剤緑色蛍光標識を有する好ましいプロ ーブを、フルオレセイン標識の検出用に広範囲に利用可能なフィルターセットを 用いて識別することができることである。 当業者は、スライドに固定された検体のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法に おいて（ａ）接触および（ｂ）分離の（上記のような）順序を、上記のように工 程（ｃ）（検査）を行なう前に２回以上好都合に実施することができることを理 解する。このような工程（ａ）および（ｂ）のそれぞれの反復において（便宜上 、それぞれ本明細書中前記のように実施される）異なるプローブ組成物が用いら れ、本発明のプローブ組成物を１回の反復で用い、もう一つの（異なる）プロー ブ組成物を他の反復のそれぞれにおいて用い、このような他のプローブ組成物を それぞれ、前記ゲノムの予め決定された異なる部分的部位に標的化させる。 当業者は、本発明の緑色蛍光ヌクレオチドが、異なるプローブ組成物の異なる 発蛍光団標識によって発せられた光の色と対比しうる色を発光することを容易に 理解する。したがって、本発明は、少なくとも２種類のこのような色対比発蛍光 団標識プローブを逐次的にまたは同時に用いて、核型、ゲノムまたは特定の染色 体若しくはその部位を区別することを可能にする。更に、異なる発光色を有する このような異なる蛍光化合物を、新規の個々のプローブ組成物と組合せることも できることが理解される。このような新規のプローブ組成物は、種々の発光色を 含むが同一標的に対してハイブリッド形成しうる蛍光標識プローブ組成物と組合 せることによって製造することができる。例えば、本発明の緑色発光ヌクレオチ ドおよび先行技術の橙赤色化合物を特定の比率で組合せることができ、その結果 、多数の異なる色のプローブ組成物を生じる。このような蛍光標識プローブ組成 物の種々の組合せを用いて、プローブ組成物が全染色体ペイントまたは染色体列 挙プローブを含む場合に、個々の染色体を識別することができる。このような組 合せの標識プローブ組成物セットを同時に用いて、特定の核型の染色体の全部で はないとしても、大部分を識別することができる。 プローブ混合物 本発明のプローブ組成物の特徴および利点は、それらを、それらの化学的構造 または機能的能力に悪影響を及ぼすことなく他のプローブ組成物、例えば、Ｎ， Ｎ，Ｎ′，Ｎ′テトラメチル−５，（６）−カルボキシ−３′，６′−ジアミノ ローダミン（Ｎ′ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＣＴＭＲ）橙色蛍光を 有する）等と組合せることができることである。例えば、２種類の異なる染色体 または染色体部位を標的とする橙色（ＣＴＭＲ）および緑色（ＣＤＡＲ）蛍光プ ローブを用いて、同一試料を付随的に処理することができる。したがって、混合 プローブ組成物がハイブリッド形成条件下で複雑なＤＮＡセグメント混合物を包 含するとしても、これらの個々のセグメントは相補的な標的ＤＮＡとハイブリッ ド形成するだけであり、所望の特定の染色体識別は達成される。本発明のプロー ブと一緒に用いられる他のプローブ組成物は、好ましくは、（本発明のプローブ 組成物に相対して）同様のハイブリッド形成条件下においてｉｎ ｓｉｔｕハイ ブリッド形成法で用いるのに適当であるべきである。 以下の実施例は、例示するものと考えられるべきであり、本発明を制限すると 考えられるべきではない。 実施例１．５，（６）−カルボキシジアミノローダミン（ＣＤＡＲ）の合成 ２５０ｍｌ二口フラスコに、３−アミノフェノール（２５．０ｇ、０．２２４ モル）、トリメリット酸無水物（２０．０ｇ、０．１０４モル）および濃硫酸（ １００ｍｌ）を入れた。サイドアームに、２１０型温度調節器（Ｊ−ケム・エレ クトロニクス・インコーポレーテッド（Ｊ−Ｋｅｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．））に連結されたテフロン製温度探針（反応混合物中に直接挿入される ）を取付け、そして混合物を窒素流下において１８０℃（＋または−２℃）まで 加熱しながら電磁撹拌した。 混合物は１８０℃に達するのに約４５分間を要し、その後、温度を１８０℃で 更に４時間維持した。得られた暗赤色溶液を室温まで冷却した後、電磁撹拌され た氷冷水（４００ｍｌ）に対して少しずつ加えた。反応フラスコを水（２×５０ ｍｌ）で洗浄した。しばらく撹拌後、得られた沈殿を真空濾過（ガラス濾過器） によって集め、制限量の氷冷水で洗浄し、そして自然乾燥させて、レンガ色固体 約５０ｇを生成した。薄層クロマトグラフィー［ＴＬＣ−アセトニトリル−酢酸 −水（８：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）］は、この固体が不純であり且つ１種類の主要 および数種類の少量の緑色蛍光成分から成ることを示した。 レンガ色固体の一部分（約１０ｇ）を濃アンモニア−水（１：４、ｖ／ｖ）１ ５０ｍｌ）中に溶解させ、氷上で冷却し、そして濃硫酸をｐＨ２まで加えること によって色素を沈殿させることにより更に精製を行なった。次に、沈殿を真空濾 過によって集め、冷水で洗浄し、そして自然乾燥させて約７ｇの物質を生成した 。最終精製は、沸騰０．５Ｍ水性ＨＣｌ（３０ｍｌ／グラム（色素））からの結 晶化と共に、活性炭処理（０．５ｇ／１０ｇ（色素））およびひだ付き濾紙を介 する熱濾過（深赤色結晶の回収率約５０％）によって達成された。システムＥに よるＴＬＣ分析は、両者とも緑色蛍光を有する一つの主要成分（カルボキシジア ミノローダミン、Ｒｆ＝０．４０）および一つの少量成分（Ｒｆ＝０．７１）を 示した。 組成物の追加検査を、ＴＬＣおよびスペクトル分析を用いて行なった。クロロ ホルム−メタノール−水（１２：７：１、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて、ＲｆはＣＤＡ Ｒについて０．２７であり、少量成分については０．３２であると決定された。 紫外線吸収極大は（０．１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４中に おいて）４９８ｎｍであり、蛍光発光極大は５２３ｎｍであり、４５０ｎｍで励 起した。メタノール中での吸収極大は５０３ｎｍであり、発光極大は５２８ｎｍ であった。実施例２：ビス（Ｎ−トリフルオロアセチル）−５，（６）−カルボキシ−３′ ，６′−ジアミノローダミン［ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ］の合成 トリフルオロ酢酸無水物（ＴＦＡＡ）（１２．０ｇ、５７．２ミリモル）を、 丸底フラスコ中のアセトニトリル−ピリジンの混合物（２：１ ｖ／ｖ；１２０ ｍｌ）に対して少しずつ加えた。混合物を−１０℃まで完全に冷却した（エタノ ール／液体窒素）。次に、精製ＣＤＡＲ（２．０ｇ、５．４ミリモル）を０．４ ｇずつ１．５時間にわたって加えた。 色素を加えた毎に、溶液の蛍光は徐々に退色して赤葡萄酒色溶液を生成した。次 に、溶液を１０℃まで０．５時間加温した後、０℃まで再冷却し、そして反応を 水５ｍｌで急冷した。最初にアスピレーター、次に真空ポンプを用いて溶液を蒸 発させた。次に、残留物をトルエン４０ｍｌと一緒に２回共蒸発させた。残留物 を酢酸エチル２００ｍｌ中に溶解させ、そして１Ｍ ＨＣｌ １００ｍｌで２回 抽出した。水性抽出物を酢酸エチル１００ｍｌで逆抽出した後、有機相抽出物を 混合し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。抽出の際、遊離カルボン酸は同一条件 下において水性相中に抽出され、かなりの減損が生じることがあるので注意を要 する。残留物を再度蒸発乾固させた後、トルエンと一緒に共蒸発させて残留する ピリジンを全て除去した。この工程は、黄色粉末〜暗色油状残留物の生成物を残 すことができる。暗色油状残留物は、最少量のエタノール中に残留物を溶解させ 、トルエンで希釈した後に蒸発させることによって粉末に変換された。これによ ってフラスコ壁に微細黄色固体が得られる。固体はスパチュラで取出すことがで きる。望ましい生成物は、主要移動ＴＬＣ成分（クロロホルム−メタノール（４ ：１、ｖ／ｖ）を用いてＲｆ＝０．３４）として現れ、紫外線ランプ下に放置後 に黄色になる。かなりの量の物質がベースラインにとどまる。実施例３．ビス（Ｎ−トリフルオロアセチル）−５，（６）−カルボキシ−３′ ，６′−ジアミノローダミン−（Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミド）エステル［ ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳ］の合成 上記工程２からの淡黄色粉末１．７６ｇとしてのビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲを、 ロータリーエバポレーターフラスコ中に入れ且つ無水Ｎ−Ｎジメチルホルムアミ トド（ＤＭＦ）３０ｍｌ中に溶解させ、それに対してＮ−ヒドロキシスクシンイ ミド（ＮＨＳ）０．５３６ｇを加えた。混合物を０℃まで冷却し、ＤＭＦ ３ｍ ｌ中のＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）０．５８８ｇを電 磁撹拌された溶液に対して加えた。ＤＩＰＣ（ＤＩＰＣ／ＮＨＳ／ＤＭＦ／０℃ 〜２５℃中）は、十分な純度の生成物を十分な収率で生成する。１時間後、氷浴 を除去し、混合物を室温で６時間撹拌した。更にＤＩＰＣ ０．２５ｇおよびＮ ＨＳ ０．２ｇを加え、混合物を室温で一晩中撹拌した。 次に、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール（４：１、ｖ／ｖ））は、反応が約９ ０％まで完了したことを示した。０℃まで再冷却した後、反応を氷酢酸１．５ｍ ｌで急冷し、そしてＤＭＦを真空中で除去した。残留物を酢酸エチル２５０ｍｌ 中に溶解させ、そして２Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ溶液２５０ｍｌで２回、続いて５％ｗ／ ｖ炭酸水素ナトリウム溶液２５０ｍｌで２回抽出した。この溶液はエマルジョン を生成する性質があり且つトリフルオロアセチルアミノ基が水性塩基性加水分解 に対して極めて感受性であるので注意を要する。次に、２Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ（２× ２５０ｍｌ）で更に抽出を行なった。水性抽出物を全て保存し、そして酢酸エチ ルで個別に逆抽出した。次に、有機相を混合し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、そして 蒸発させて橙色固体を生成した。重炭酸水素ナトリウム抽出は、ＴＬＣにおいて 望ましいＣＤＡＲ−ＮＨＳより僅かに下に移動する極めて黄色の蛍光副生成物の 大部分を、ＣＤＡＲを有意に除去することなく選択的に抽出する。これらの抽出 においては、ＴＦＡ基の塩基性加水分解を最小限にするようになお注意する必要 がある。この時点で、生成物は、ＴＬＣ（９：１、ｖ／ｖかまたは４：１、ｖ／ ｖのクロロホルム−メタノール）において若干のベースライン不純物をなお示す 。不純固体生成物を酢酸エチル中に溶解させ、完全に溶解させるために最少量の エタノールを加えた。最終精製は、クロロホルム−酢酸（９９：１、ｖ／ｖ）を 用いる充填されたシリカの１２×３．０ｃｍカラムでのフラッシュクロマトグラ フィーによって達成された。溶解した生成物を加えた後、カラムをクロロホルム −酢酸（９９：１、ｖ／ｖ）で溶離した。望ましい生成物は、溶媒最前部で溶離 されるべきである。溶離プロフィールについての問題は、通常、クロロホルムお よび２％ｖ／ｖメタノールを用いることによって克服することができ、淡黄色油 である生成物を溶離する。生成物を酢酸エチル−石油エーテル（４ｍｌ＋８０ｍ ｌ）から沈殿させ、そしてガラス濾過器での濾過によって淡黄色粉末として集め る。ガラス濾過器およびフラスコを酢酸エチルで洗浄することによって追加の生 成物を得た。粉末は、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール（９：１、ｖ／ｖ）） によって判定される１種類の主要成分および２種類の極めて少量の成分を含んで いた。更に、粉末は、位置異性体の約１：１混合物を示す納得のいく１Ｈ ＮＭ Ｒスペクトルを生じた。主要生成物５ｍｇはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） ５００μｌ中に完全に溶解して淡黄色溶液を生じ、そして種々の標識用途におい て成功して用いられた。実施例４．ビス（Ｎ−トリフルオロアセチル）−５，（６）−カルボキシ−３′ ，６′−ジアミノローダミン−（Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミド）エステル［ ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳ］からのＣＤＡＲの再生 実施例３で製造されたビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳの一部５ｍｇをメタノ ール１００μｌ中に溶解させた。溶液に対して水性０．１Ｍ Ｋ₂ＣＯ₃ １００ μｌを加えた。溶液は直ちに黄色／緑色に変わり始め、トリフルオロアセチル保 護基の部分加水分解を示した。同時脱保護／再生反応は数時間進行した。５〜６ 時間後、反応は、ＴＬＣ（クロロホルム−メタノール−水（１２：７：１、ｖ／ ｖ／ｖ）またはアセトニトリル−酢酸−水（８：１：１、ｖ／ｖ／ｖ））で判定 されることで完了したと考えられた。単一主要成分は、更に高いＲｆ緑色蛍光性 物質の痕跡と一緒に検出することができた。 実施例５．ヒト染色体特異的ＤＮＡプローブ ヒト染色体特異的ＤＮＡは、ヴァン・ディラ，Ｍ．Ａ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ ４：５３７〜５５２，１９８６）に記載されたように構築された、 ローレンス・リバーモア・ナショナル・ラボラトリーズ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌ ｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＬＬＮＬ ）からの組換え体ファージライブラリーとして得た。これらのライブラリーは、 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主菌株での増 殖によって増幅された。増幅されたファージを精製し、それらのＤＮＡを抽出し 、そしてこのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIによって消化した。インサートＤＮ ＡはλベクターＤＮＡから精製され、プラスミドベクターｐＢＳ（ストラタジー ン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ、ＣＡ）のＨｉｎｄIII部位中にクローン 化された。得られたプラスミドは、大腸菌菌株ＤＨ５α（ベセスダ・リサーチ・ ライブラリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ） 、ゲイサーズバーグ、メリーランド）中に形質転換された。 慣用的な発酵槽中の大腸菌菌株の増殖後、プラスミドＤＮＡを細菌細胞ペレッ トから抽出した（ビットナーら、１９９１年９月２０日出願の同時係属米国特許 第０７／７６２，９１２号明細書を参照されたい）。細胞を、細胞ペレット質量 （Ｍ）（ミリリットルで）の３倍の、５０ｍＭグルコース（濾過滅菌された）、 １０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ（ｐＨ７．５〜８．０）および２５ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）を含む溶液中に完全に再懸濁させた。０．２Ｍ ＮａＯＨおよび １％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液の６ｘＭ（ミリリ ットルで）を加えた後、細胞を激しく撹拌しながら溶解させた。溶液が透明にな ったら、４．５ｘＭ（ミリリットルで）の、氷酢酸５５．５ｍｌおよび酢酸カリ ウム１４７．５ｇを最終容量５００ｍｌ中に含む溶液を完全に混合し、結果とし て蛍光沈殿を生じた。上澄みを蛍光沈殿から分離し、この上澄みを７０００ｘｇ で１５分間遠心分離して残留する沈殿を除去した。 核酸を１容量のエタノールによって上澄みから沈殿させた後、７０００ｘｇで １０分間遠心分離し、そして核酸ペレットを総量０．５４ｘＭ（ミリリットルで ）中に再懸濁させた。次に、核酸を１／２容量の中性フェノールおよび１／２容 量のクロロホルムで抽出し且つ２倍容量エタノールで沈殿させた。核酸を、０． ３ｘＭ（ミリリットルで）の、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．０）および１０ ０ｍＭ酢酸ナトリウムの溶液中に再懸濁させた。次に、０．７７ｘＭ（マイクロ リットルで）の１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮアーゼ（加熱処理された）を加え、そして 室温で３０分間または４℃で一晩中消化させた。次に、０．６１５ｘＭ（マイク ロリットルで）のプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を加え、そして５ ５℃で３時間インキュベートした。ＤＮＡを１／２容量の中性フェノールおよび １／２容量のクロロホルムで抽出し且つ２倍容量のエタノールで沈殿させた。 ＤＮＡを０．４１５ｘＭ（ミリリットルで）の水中に再懸濁させ、０．０５ｘ Ｍミリリットルの５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１５５ｘＭミリリットルの５０％（ ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量６０００〜８０００）を加 え、氷水上で１時間インキュベートし、そして７，０００ｘｇで１５分間の遠心 分離によって沈殿させた。ＤＮＡを０．０４ｘＭミリリットルの水および１／１ ０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム中に再懸濁させ、１／２容量の中性フェノールおよ び１／２容量のクロロホルムで抽出し、そして２倍容量のエタノールで沈殿させ た。精製ＤＮＡを０．０４７６ｘＭミリリットルの脱イオンＨ₂Ｏ中に再懸濁さ せた。ＤＮＡ濃度を蛍光定量法によって決定した。 最後に、精製ＤＮＡを、ブランソン・ソニファイアー４５０（ダンバリー、コ ネチカット）を用いる音波処理によって破壊して、約３００塩基対の小フラグメ ントにした。このフラグメント寸法は、経験的に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド 形成法に用いられるＤＮＡプローブに最適であると確定された。上記で製造され た精製プラスミドＤＮＡの４ミリグラムを水２ｍｌ中に再懸濁させ、そして音波 処理中に沸騰させないようにドライアイス／エタノール浴中に浸漬した。音波処 理装置のマイクロチップを、チップが試験管の底部から２〜５ｍｍになるまでこ の溶液中に浸漬した。音波処理は、出力２５〜３０ワットで、不連続的に８０％ 仕事量サイクル（８０％オンタイム、２０％オフタイム）を用いて５分間行なっ た。音波処理後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）０．２ｍｌおよびエタノー ル４ｍｌを加えることによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿を８，０００ｘｇで５ 分間の遠心分離によって回収し、減圧乾燥させた。 実施例６．重亜硫酸塩に触媒されたＤＮＡのアミノ基転移 実施例１の方法によって得られたＤＮＡを、シトシン塩基のＣ４炭素原子に対 してエチレンジアミンを付加することによってアミノ基転移した。この反応は重 亜硫酸ナトリウムによって触媒される。重亜硫酸緩衝液を製造するために、発煙 ＨＣｌ １．７ｍｌを氷上の脱イオンＨ₂Ｏ １ｍｌに対して徐々に加えた。次 に、新たなエチレンジアミン１ｍｌを氷上に徐々に加えた。エチレンジアミンの 溶解後、溶液を室温まで加温し、そしてメタ重亜硫酸ナトリウム０．４７５ｇを 加えた。次に、発煙ＨＣｌを重亜硫酸塩混合物に対して、ｐＨが７．０に達する まで徐々に加えた。脱イオン水を最終容量５．０ｍｌまで加えた。ＤＮＡをアミ ノ基転移するために、音波処理済みＤＮＡ １ミリグラムをＨ₂Ｏ ０．３ｍｌ 中に再懸濁させた。ＤＮＡを１００℃で５分間沸騰させることによって変性させ た後、氷水浴中で急冷した。アミノ基転移反応は、このＤＮＡ溶液０．３ｍｌを 重亜硫酸緩衝液２．７ｍｌに対して加えることによって開始し、反応物を３７℃ で２日間インキュベートした。ＤＮＡ溶液を、５〜１０ミリモルホウ酸ナトリウ ム（ｐＨ８．０）に対する通常の透析によって脱塩した。透析後、３Ｍ酢酸ナト リウム（ｐＨ５．５）０．３ｍｌを透析液に対して加えた。アミノ化ＤＮＡを２ ．５容量のエタノールで沈殿させ、８，０００ｘｇで１０分間の遠心分離後に回 収した。ペレットを減圧乾燥させ、そしてＤＮＡ濃度３ｍｇ／ｍｌで再水和した 。この溶液を使用まで−８０℃で貯蔵した。 実施例７．ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳによる染色体１プローブの標識 非標識全染色体ペイント（ヒト染色体１に向けられたフラグメント化ポリヌク レオチド）５０μｇを、２．５ｍｌスクリューキャップ付きエッペンドルフ試験 管中に蒸発乾固させた。乾燥ペレットを脱イオン水５０μｌ中に再溶解させ、９ ５℃で５分間変性させた後、氷上で急冷した。氷上の試験管に対して１００ｍＭ ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０、３５０μｌ、ホウ酸から製造された）を 加え、混合物を簡単に撹拌し、そして室温まで加温した。次に、ビス（ＴＦＡ） ＣＤＡＲ−ＮＨＳのＤＭＳＯ中原液（原液は２０ｍＭ）色素６．６３ｍｇ／５０ ０μｌ（ＤＭＳＯ）であった）１００μｌを加え、混合物を簡単に撹拌し、銀泊 で覆い、そしてロータリーミキサー上に１８時間置いた。ＤＮＡを、３Ｍ酢酸ナ トリウム５０μｌに続いて無水エタノール１．２５０ｍｌを加えることによって 沈殿させ、−６０℃まで２時間冷却した。遠心分離後、上澄みを除去し、ペレッ トを７０％水性エタノールで洗浄し、そして減圧濃縮器中で乾燥させた。深赤色 ペレットは、しばしば溶解するのが遅く、脱イオン水１００μｌ中で定期的に撹 拌された。最終精製は、バイオスピン（Ｂｉｏｓｐｉｎ）３０スパンカラム（バ イオラド（ＢｉｏＲａｄ）、７３２６００６）を用いて達成された。２０ｍＭ水 酸化ナトリウムで１００５μｌまで希釈された溶出液のアリコート５μｌは、２ ６０ｎｍおよび５０８ｎｍでの吸光度を示し、Ａ₂₆₀／Ａ₅₀₈比６．５４（補正後 ）を与えた。したがって、塩基の２．８％がＣＤＡＲで標識された。２６０ｎｍ での吸光度は、以下のように色素吸光度に補正された。 Ａ₂₆₀（補正）＝Ａ₂₆₀−（Ａ₅₀₈×０．２７１） ０．１Ｍリン酸緩衝液における蛍光は、５０９ｎｍで吸収極大であり且つ５３３ ｎｍで発光最大であった。実施例８．ビス（ＴＦＡ）ＣＤＡＲ−ＮＨＳによる染色体列挙（ＣＥＰ−８）プ ローブの標識 ヒト染色体８（ＣＥＰ−８ ＤＮＡ）の特定部位に向けられた核酸ハイブリッ ド形成プローブ５０μｇを、２．５ｍｌスクリューキャップ付きエッペンドルフ 試験管中に蒸発乾固させた。ＣＥＰ−８ ＤＮＡの製法は、ビットナーら、１９ ９１年９月２０日出願の同時係属米国特許第０７／７６２，９１２号明細書に記 載されている。ペレットを脱イオン水（５０μｌ）中に再溶解させ、９５℃で５ 分間変性させた後、氷上で急冷した。氷上の試験管に対して１００ｍＭホウ酸ナ トリウム緩衝液（ｐＨ８．５、３５０μｌ、ホウ酸から製造された）を加え、混 合物を簡単に撹拌し、そして室温まで加温した。次に、ＣＤＡＲ−ＮＨＳのＤＭ ＳＯ中原液（色素１．５〜２．０ｍｇ／１００μｌ（ＤＭＳＯ）、２３〜３０ｍ Ｍ）１００μｌを加え、混合物を簡単に撹拌し、銀泊で覆い、そしてロータリー ミキサー上に１６時間置いた。色素の黄色／緑色蛍光は一晩中混合することによ って徐々に現れるにすぎないので、色素を加えた直後の溶液はほとんど無色（淡 黄色）であった。色素の完全な脱保護を確実にするために、１Ｍ炭酸ナトリウム 溶液（１０分の１容量、５０μｌ）を加え、混合を６〜２４時間続けた。混合物 を２ロットに分割し、そしてそれぞれに対して、酢酸ナトリウム（３Ｍ、２８μ ｌ）に続いて無水エタノール（６８８μｌ）を加えることによってＤＮＡを沈殿 させ、−６０℃まで２時間冷却した。遠心分離後、上澄みを除去し、ペレットを ７０％水性エタノールで洗浄し、そして減圧濃縮器中で乾燥させた。深赤色ペレ ットは、しばしば溶解するのが遅く、脱イオン水それぞれ５０μｌ中で定期的に 撹拌された。最終精製は、スパンカラム（バイオラド、バイオスピン３０）を用 いて達成された。溶出液は混合され、そして２０ｍＭ水酸化ナトリウムで１００ ５μｌまで希釈された溶液のアリコート５μｌは、補正後６．５４のＡ₂₆₀／Ａ_{5 08} 比、すなわち塩基の２．８％がＣＤＡＲで標識されたことを示した。実施例９．Ｎ４−（３−アミノプロピル）−２′−デオキシシチジン−５′−三 リン酸−カルボキシジアミノローダミン結合体の製造 ビス（ＴＦＡ）（ＣＤＡＲ−ＮＨＳ）（実施例４に記載のように製造された） ６．６ｍｇを、ＤＭＳＯ ５００μｌに溶解させ、そして０．１ホウ酸ナトリウ ム緩衝液（ｐＨ９）１．５ｍｌ中に溶解したＮ４−（３−アミノプロピル）−２ ′−デオキシシチジン−５′三リン酸（ＡＰｄＣＴＰ）クルイクシャンク、米国 特許第５，０９１，５１９号明細書を参照されたい）を含む溶液に対して加えた 。淡黄色混合物が入っている２．５ｍｌエッペンドルフ試験管を銀泊に包み、そ してロータリーミキサー上において室温で一晩中反応させた。 次に、反応混合物のアリコー卜２５μｌの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）による分析は、出発物質の変換が完全に達成されて、保持時間（Ｒｔ＝１８ ．０３分）が３７．０分および３８．３分の２種類の新規の化合物（異性体混合 物）が１対１の比率で生成したことを示した。トリフルオロアセチル保護基の完 全な除去を確実にするために、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液２００μｌを加え、そし て混合物を更に６時間ロータリーミキサーで混合した（ＨＰＬＣにより保持時間 には変化が見られなかったので、この処理はおそらく不必要であった）。 生成物は、最初に０．０５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）緩衝 液で平衡化されたＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム（１．５ｃｍ×２７ｃ ｍ）でのクロマトグラフィーによって精製された。溶媒は、２室勾配ミキサー（ ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＧＭ−１）から嬬動ポンプ（ファーマシア Ｐ−１、１００〜１２０ｍｌ／時をポンプ輸送するように設定された、１０×、 １．５設定、３．１ｍｍ管）、三方弁（ファーマシア、ＬＶ−３）、続いてカラ ム（エコノ（Ｅｃｏｎｏ）カラム、バイオラド）に対して供給された。カラムか らの溶離液は、キップ・アンド・ゾネン（Ｋｉｐｐ ＆ Ｚｏｎｅｎ）チャート レコーダー（チャート速度２ｍｍ／分、２０ｍＶ設定）に接続されたホロクロム （Ｈｏｌｏｃｈｒｏｍｅ）ＵＶ／ＶＩＳ検出器（１ＡＵＦＳ、５５２ｎｍ）へと 移動した。最終的に、溶出液画分（７ｍｌ、２２０滴）をジルソン（Ｇｉｌｓｏ ｎ）マイクロフラクショネーターで集めた。 試料を０．０５Ｍ ＴＥＡＢ ２ｍｌで希釈し、そして三方弁によってカラム 上部に入れた。次に、勾配を開始する前に、カラムを０．０５Ｍ ＴＥＡＢ（２ ５０ｍｌ）で洗浄した。ミキサーの前室に０．０５Ｍ ＴＥＡＢ、後部には０． ２５Ｍ ＴＥＡＢ（２５０ｍｌ）を充填した。次に、前室に０．２５Ｍ ＴＥＡ Ｂ、後部には０．５Ｍ ＴＥＡＢを充填した。最後に、０．５Ｍ〜０．７５Ｍの 勾配の緩衝液を、生成物が溶離されるまで流す。各種色素含有成分および副生成 物は、生成物が溶離される前に溶離される。 しばしば、試料注入工程は午後に行なわれ、溶離剤室が満たされ且つポンプが １×，５設定に低下されている勾配の第一段階は一晩中行なわれた。この流速は 、通常、液体７ｍｌを有するおよそ６５本の分別試験管を満たすであろう。次に 、勾配の次の段階は翌朝開始された。 純粋な（ＨＰＬＣ）生成物（実際は、２種類の異性体の混合物、５−および６ −カルボキシジアミノローダミン生成物ピーク）を含む画分をプールし、ロータ リーエバポレーター（浴温度＞３０℃）で油真空ポンプ圧下において蒸発乾固さ せた。残留物を無水エタノールで２回共蒸発させ、脱イオン水数ｍｌ中に溶解さ せ、そして５０３ｎｍの吸光度で定量した。５０３ｎｍで吸光係数６０，０００ と仮定すると、収量は０．５１６μモル（２６％）であった。最終的に、試料を サバント（Ｓａｖａｎｔ）減圧濃縮器で蒸発乾固させ、−２０℃で貯蔵した。実施例１０．新規の蛍光標識ヌクレオチド（フルオロ−ｄＮＴＰ′ｓ）のＤＮＡ プローブ中への酵素的取込み フルオロ−ｄＮＴＰ′ｓのニックトランスレーションによる酵素的取込みは、 標準的なニックトランスレーションプロトコル（ライフ・テクノロジーズ、ベセ スダ、ＭＤ）の変法を用いて以下のように実施された。氷冷された１．５ｍｌエ ッペンドルフ試験管に対して、脱イオン水６８μｌ、０．２ｍＭスペクトルオレ ンジｄＵＴＰ ２．５μｌ、各０．２ｍＭデオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ ｄＧＴＰ）（１０μｌ）、０．２ｍＭデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）（ ７．５μｌ）、Ａｌｕｌ制限ＣＥＰ鋳型（２．０μｌ）１μｇ／μｌ、大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼＩ溶液（１０μｌ）を（逐次的に）加えた。混合物を簡単に撹 拌し、ミクロ遠心分離機で１０分間回転させて混合した。次に、試験管を１６℃ で２時間インキュベートした後、０．３Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） （１０μｌ）で反応を停止させ、続いて撹拌し且つ遠心分離した。次に、各反応 混合物をバイオスピンゲル濾過カラム（バイオラド、カタログ＃７３２−６００ ６）において製造者によって与えられた取扱説明書にしたがって精製して、無色 またはほぼ無色の溶出液（１２０μｌ）を得た。次に、ＤＮＡを、４Ｍ酢酸ナト リウム（１２μｌ）およびエタノール（２８０μｌ）を加えることによって沈殿 させ、そして−２０℃で少なくとも２時間貯蔵した。上澄みをピペットで除去し 、目に見えないペレットをサバント「スピードバク（ＳｐｅｅｄＶａｃ）」冷却 減圧濃縮器で乾燥させた。ＤＮＡペレットは脱イオン水（２０μｌ）中に、パス ツールピペットで溶媒を試験管の側面に注意深く回すことによって再溶解させた 。回収率５０％と仮定すると、溶液は標識プローブ５０ｎｇ／μｌを含む。実施例１１．新規の標識ＤＮＡプローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形 成法による染色体＃８の動原体部位の検出 前述の実施例８のプローブ組成物を用いて、ヒト染色体＃８の動原体部位を以 下のように識別（検出）した。 標的ＤＮＡは、中期の細胞を捕捉するように処理された培養された正常白血球 から成った。これらの細胞を、顕微鏡スライド上に約２〜３フィート離れた所か ら滴下して核を破裂させ且つ染色体を暴露した。非破裂細胞および間期核もスラ イド表面上に存在した。ハイブリッド形成の前に、７０％ホルムアルデヒド／０ ．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０から成る変性溶液 中にスライドを７０℃で２分間入れた。次に、スライドを、７０％、８５％およ び１００％エタノール浴を（それぞれ２分間）通過させることによって脱水した 。次に、スライドを約４０℃まで加温した。 各スライド上に置かれたハイブリッド形成配合物は、常に５５％ホルムアミド ／１０％硫酸デキストラン／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／１５ｍＭクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ７．０であった。基本ハイブリッド形成配合物に対して加えられるプロ ーブ濃度は、許容しうるシグナル強度および特異性を得るのに必要な最適濃度を 決定するように変化させた。反応混合物は、更に、担体および保護ＤＮＡとして 加えられる音波処理済みヒト胎盤ＤＮＡ ４．５μｇを含んだ。非標識ヒト胎盤 ＤＮＡの他に、フルオレセインで標識された音波処理済みヒト胎盤ＤＮＡ約９６ ｎｇをゲノム対比染料として加えた。このようなゲノム対比染料の製造は、モリ ソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、１９９１年９月１９日出願の同時係属米国特許第 ０７／７６２，９２８号明細書に示されている。完成したハイブリッド形成混合 物１０μｌを、７０℃で５〜１５分間加熱することによって変性させた後、３７ ℃で５分間インキュベートした。配合物をスライドに直接的に塗布し、カバーガ ラスで覆い、その縁をラバーセメントで密封し、そして給湿室中において４２℃ で一晩中ハイブリッド形成させた。 翌日、カバーガラスをはずして、一連の洗浄、すなわち、０．３Ｍ ＮａＣｌ ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０％ホルムアルデヒドｖ／ｖ、ｐＨ７．０中 において４５℃でそれぞれ１５分間３回、次に、０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭ クエン酸ナトリウム（２×ＳＳＣ）、ｐＨ７．０中において４５℃で１５分間の １回洗浄、次に、０．Ｍリン酸ナトリウム／０．１％ＮＰ４０洗剤（カルビオケ ム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）カタログ＃４９２０１５）である「ＰＮ緩衝液」中 において４５℃で１５分間もう１回洗浄により、非結合プローブをスライドから 除去できるようにした。最後に、スライドをＰＮ緩衝液中において室温で２分間 ２回洗浄した後、自然乾燥させた。抗退色溶液１０マイクロリットルを標的細胞 上に置き、カバーガラスをその上に置いた。スライドを蛍光顕微鏡で観察した。 鮮明な緑色蛍光が染色体の標的部分で観察された。非特異的結合からの蛍光は観 察されなかった。比較例１ この比較例は、ＣＤＡＲとジスクシンイミジルカーボネートとの反応によって 直接的にＣＤＡＲ−ＮＨＳを製造する試みであった。実施例１からのＣＤＡＲ３ ４．０ｍｇおよびＤＳＣ ６４．０ｍｇの１Ｍ ＤＭＦ溶液０．２５ｍｌ中の不 完全溶液に対してＤＭＡＰ溶液１２２．１７ｍｇを加えた。深赤色溶液は直ちに 淡橙色に変わり、室温で撹拌することにより若干黒ずんだが、なおある程度淡色 のままであった。１．５時間後、反応混合物を薄層クロマトグラフィー（ＣＨ₃ ＣＮ：酢酸：Ｈ₂Ｏ；８：１：１）によって検査したが、ＴＨＣで橙色に現れる 主要成分および他の着色成分を含む出発物質も生成物の複合混合物も示されなか った。ＣＤＡＲ−ＮＨＳを製造する直接反応は成功しなかった。 本発明の好ましい実施態様を記載してきたが、本発明は、種々の変更が可能で ある。したがって、本発明は、本明細書中に記載の正確な詳細に制限されると考 えるべきではなく、以下の請求の範囲の範囲内の全実施態様および変更を包含す ると解釈されるべきである。Detailed Description of the Invention             Green fluorescently labeled nucleotide for use in a probe   The present invention generally relates to green fluorescent compounds and their use for labeling DNA. , More specifically green rhodamine dyes and their synthesis and DNA labeling Regarding their use when doing. The present invention further provides a DNA containing a green fluorescent label. Chromosomes or stains by in situ hybridization with a probe Body area detection and identification.                               Background of the Invention   Labeled DNA probes are particularly useful in chromosome identification and experiments. Dyeing Changes in chromophoric structure are often associated with a number of congenital genetic disorders, including certain types of cancer. Consistent with and may be the cause of degeneration. Such changes are Form of addition or absence of body or addition or absence of part of chromosome sell. Chromosomes may also be rearranged as if by a translocation, with different staining The body parts become connected to each other. Many, including inversions, amplifications and complete deletions Other genetic defects can be present alone or in combination with the aforementioned defects. Appropriately It is possible to detect chromosomes and any changes in them using a recognized DNA probe. Is possible and highly desirable.   Chromosome discrimination by the use of DNA probes generally involves staining present in cell samples. Requires hybridization of the probe to the chromophore or its site. DNA One approach to using probes is to use "indirectly labeled" probes. It Indirectly labeled probes are labeled after hybridization of the probe to the target chromosome. It is a nucleic acid probe labeled with a residue that cannot be directly identified. However, the label-reactive substance that can then identify the residue on the probe Can be reacted with. For example, an indirectly labeled probe may be Labeled by Ten. Such a probe hybridizes to the target chromosome. To a reactive substance, such as biotin, that has a fluorescent label attached to it after it is formed. The antibody can be subsequently reacted. Next, the reactivity to haptens The following products resulting from the binding of substances can be identified by fluorescence microscopy: It Generally, this approach is based on the fluorescent In-Situ hybridization method (hereinafter Below "FISH"). For example, Gray et al., European Patent Application No. 0. See 430402.   Another approach to FISH is to have detectable residues in the nucleic acid probe. A "directly labeled" fluorescent probe was used that was directly bound to. Directly labeled DN The A probe is used to hybridize the probe to the target chromosome and then The lobe / chromosome hybrid is a cellular product of a reactant with a detectable label. It can be detected directly without the need for a separate reaction step with quality invasion. staining Directly labeled DNA probes for body identification are included herein by reference. M. L. Bittner, L.A. E. FIG. Morrison on) and M.S. S. September 19th, 1991 by Legator It is disclosed in US patent application Ser. No. 07 / 762,913 filed in Japanese.   It is believed that FISH can provide high resolution chromosomal analysis. Only However, most commercially available fluorophore probes have signal-to-noise Requires the use of a fluorescence microscope, which is extremely sensitive to ratios, and Analysis is difficult. Fluorescein has been used in FISH It is a green fluorescent compound. However, fluorescein does not work well in nucleic acid probes. When subjected to high photo-oxidation rates, such probes are significantly affected. Bell non-specific binding is shown. In addition, different colors of different colors that allow multiple analyzes of the same sample It is desirable to have a fluorescently labeled probe. Therefore, for nucleic acid probes A green fluorescent labeling compound with better performance is desirable.   Furthermore, it appears to be suitable for use in in situ hybridization methods. In addition, fluorophore labels, in part, can bind to nucleic acids without breaking the nucleic acid strands. Must be capable of, and secondly, a hybrid between the nucleic acid and the target chromosome. It must not interfere with the formation reaction. These requirements are not easily achieved.   Some disclosures about fluorescently labeled compounds and nucleotides containing them are available. is there. However, these disclosures include green fluorescence with a rhodamine dye structure. There is nothing about compounds.   Rhodamine dyes Rhodamine 110 (green), Rhodamine B (orange) and And Rhodamine 6G (red) are well known and commercially available (Kodak Optical Product Catalog # JJ-169, Eastman Kodak Company (Ea Stman Kodak Company), Rochester, NY. I). European Patent Application No. 0272007, published June 22, 1988, For use in gel electrophoresis separation of macromolecules involved in DNA sequencing Isomerically pure 5- and 6-succinimidyl calcs of certain rhodamine dyes A method of making and isolating voxylate is disclosed. 5-and disclosed there And 6-succinimidyl esters are loaders with fully substituted amino groups. Derived from Min pigment. This specification describes nucleic acids for in situ discrimination of chromosomes. No suitable green fluorescent rhodamine dye was disclosed as a green fluorescent label in the probe Yes.   Ward et al., U.S. Pat. No. 4,711,955 To the nucleotides at position 5 of the peptide, position 8 of the purine and position 7 of 7-deazapurine. Biotin (or other hapten) binding of. The patents of Ward et al. The organomercury method of attaching biotin to nucleotides is used. However, The ability to attach labeling groups other than biotin and haptens to modified nucleotides Has not been suggested, and there has been no suggestion of a fluorescent direct labeled DNA probe. Not in.   Klevan et al., U.S. Pat. No. 4,828,979, also see Disclose modification of mononucleotides for subsequent use in labeling reactions. It Specifically, dATP and dCTP are linked by linker arms of different lengths. Thus derivatized at the 6th and 4th positions, respectively. In addition, modified nucleotides After binding to Otin, it can be used in a polynucleotide for use as a probe. Can be enzymatically incorporated into. Klevan et al. It does not disclose the use of labels.   Musso et al., U.S. Pat. No. 4,833,251, Chemistry of Indirectly Labeled Polynucleotide Probes Labeled with Biotin Derived to Water The synthesis and use are described. Derived biotin label is a polynucleotide The above transamination of cytosine N-4 amino group by hydrazone bond Are combined. In addition, Mussaw et al. Describe the analysis of solid support bound nucleic acids. But does not mention the use of in situ hybridization probes. Absent.   Wiegant et al.Nucleic Acids Res. 19, 3237 (1991), prepared a fluorescently labeled human nucleic acid probe. Fluorescein-dUTP in nick translation format for Discloses the use of. The probe is an in situ hybrid of a human metaphase chromosome. It is used in the pad formation method. However, other green fluorescently labeled probes are disclosed. Not not.   Urdea and Horn, US Pat. No. 4,910, No. 300 discloses modified nucleosides for use in oligonucleotide synthesis Teaches synthesis of chid. No specific fluorophore is disclosed and no nucleic acid The synthetic scheme of the linkage as to the probe is also not shown.   Ruth, U.S. Pat. No. 4,948,882, discloses oligonuclear compounds. It teaches suitable modified nucleotides for leotide synthesis. Ruth is those Nu It does not specify any particular fluorescent compound for use in cleotide and No DNA probe is disclosed.   Thus, in particular, an in situ hybrid form of the chromosome or part thereof Used as a nucleotide label for use in DNA probes for method identification There is a need for suitable stable high emission green fluorescent compounds. Summary of the invention The purpose is to provide a novel green-emitting rhodamine dye compound that can react with nucleotides and To provide green fluorescently labeled nucleotides for use in a probe.                               Summary of the invention   The present invention is a living organism for use in a fluorescence in situ hybridization method. Synthesis and Synthesis of Green-Emitting Rhodamine to Generate Compounds That Can Bind to Molecules And modifications are described. The present invention provides (1) in situ of a chromosome or a chromosomal site. Green fluorescent labeling compositions useful for detection and labeled probes and nucleic acids containing them Cleotide composition, (2) Such labels and nucleotides containing them And a method for synthesizing a probe composition, and (3) in the chromosome or chromosomal site Methods of using such probe compositions for in situ detection are provided.   The invention generally comprises the following formula: (In the formula, R₁, R₂, R₃And R_FourIs hydrogen and R₇~ R₁₂Is the same as Is selected from the group consisting of hydrogen, halogen and alkyl groups_FiveIs a A ruboxyl group or a lactone bond to carbon 9 ', and R₆Is Nu It is a reactive group that can bind to cleotide) Relates to the use of the residue having Preferred green of the present invention For fluorescently labeled residues, R₇To R₁₂Are each hydrogen and R₆Nucleochi It is a carboxyl group that can be bonded to the amine on the substrate.   Residues of the invention can be attached to nucleotides, and after attachment , Gives green luminescence to nucleotides.   The present invention further comprises   A labeled nucleotide having green fluorescence,   (A) Nucleotide triphosphates in the form of free nucleotides or polynucleotides Acid and   (B) General formula (In the formula, R₁, R₂, R₃And R_FourIs hydrogen and R₇, R₈, R₉, R_Ten, R₁₁Oh And R₁₂Are the same or different and are hydrogen, halogen and 1 to 8 carbons. Selected from the group consisting of alkyl groups having and R_FiveIs the nucleotide (Including chemical bond bound to acid) Including the above-described nucleotide containing a green fluorescent residue having In this embodiment, The chemical bond preferably comprises an amide bond to the nucleotide.   In another embodiment, the invention provides an in situ method for a chromosome or chromosomal site. A method of manufacturing a probe for detecting u, comprising: (A) a nucleotide sequence essentially complementary to the detected chromosome or chromosomal site Reaction of a large number of cytosine bases contained in the DNA sequence with amino group transfer Producing a DNA sequence having a transaminated base having a reactive amine group; hand   (B) a fluorescent label containing a residue having the formula 1 is used to reduce the number of bases that have been transamination And a covalent bond to a portion of the base, many such bases are Have sufficient covalently bound label to be detected by the technique and are simultaneously detected Inherent in the specific binding property of the DNA sequence of the probe with respect to the chromosome or chromosomal site The above method held in.   In yet another aspect, the invention provides an ins of a chromosome or chromosomal site. A method of manufacturing a probe for in situ detection, comprising:   (A) producing a labeled nucleotide containing a residue having formula 2,   (B) the labeled nucleotidies by removing the impurities resulting from step (a). Refine the code, and   (C) the labeled nucleotide is essentially a salt complementary to the chromosome to be detected. In the DNA sequence having the base sequence, the hybridization of the DNA sequence to the target chromosome is performed. After enzymatic formation, it should be enzymatically incorporated in sufficient quantity to allow detection using optical techniques. And the above method including and.   The fluorescent residue of the present invention is superior to labeled nucleotides such as DNA probes. Provides signal strength and detectability. They use a conventional fluorescence microscope It is easily detected by the FISH method. In addition, they bind to DNA Directly labeled DNA probe can be prepared by Can be hybridized. Another advantage of the present invention is that A residue having the formula 1 including the addition of a protecting group to the unsubstituted amino group of the dye starting material. It is a manufacturing method of the base. Protecting groups are an integral part of starting materials that are closely related to quantitative yield. Allows the addition of succinimidyl groups or other reactive groups. The reactive group It is important to achieve binding of the label to.                               Description of the invention   The present invention is directed to a fluorescent, preferably green, fluorescent moiety capable of binding to a nucleotide. -Damine residues, their succinimidyl esters and other derivatives, and Includes methods of making and using them. An important feature of the present invention is that the xane having formula 1 A synthetic method involving the protection of labile amino groups at the 3'and 6'positions of a ten-like ring, It causes subsequent succinimidylation or addition of another reactive group . The next conjugation step that attaches the green rhodamine structure to the nucleic acid results in almost It is done quantitatively.                               Fluorescent compound   The green fluorescent compound of the present invention is defined by Formula 1 above, in which the preferred The new substituent R6 is a carboxyl group, which is in the free state or in the polynucleotide. Suitable for chemical attachment to the form nucleotide triphosphate.   A preferred synthetic route for producing the labeled nucleotide of the present invention is     CDAR (or derivative)       ↓ Adding protecting group     Protected rhodamine compounds       ↓ Esterification with N-hydroxysuccinimide     Protected rhodamine succinate       ↓ Bonding with nucleotides containing reactive amino groups     Green rhodamine labeled nucleotide   The preferred fluorophore starting residue of the present invention is the green fluorophore dye residue 5, (6 ) -Carboxydiaminorhodamine (CDAR). CDAR is the following It can be synthesized by any suitable synthetic technique such as the reaction described in Example 1. It CDAR residue is R₇~ R₁₂Are each represented by formula 1 in which each is hydrogen. application Person is hydrogen R on the ring of CD AR₇~ R₁₂If any or all of We expect that the fluorescent color will not change from green. In Formula 1, R_gIs It can be a carboxylic group or a lactone attached to the carbon 9 '. Lactone type Although colorless, the lactone is converted to a carboxyl group when bound to nucleic acids. As a result, green fluorescence is generated.   Constrained to use CDAR or its substituted derivatives to induce nucleotide labels. The bundle is R₁~ R_FourIs the reactivity of an unsubstituted amino group when is hydrogen, It nucleotiates such dyes, especially by use of the succinimidylation reaction. It limits the ability to bind to triphosphate. European Patent Application No. 87310256 ． Like the disuccinimidyl carbonate (DSC) method disclosed in No. 0 Typical succinimidylation chemistry is not desirable with unsubstituted amino groups It is well understood that it causes side reactions to give acylated amino groups. example For example, A. K. Ghosh et al.Tetrahedron Letters 33 , (20) 2781 (1992), DSC is C It has been shown to react with unprotected amino groups such as are present on DAR or its derivatives. I testify. Therefore, a particularly important aspect of the present invention is that prior to succinimidylation To the amino group to give the desired reactive ester. And. Therefore, the fluorescent residue having the formula 1 is Is reacted with a protecting group to produce a protected rhodamine compound, It is produced from AR or a derivative thereof. Then, the protected rhodamine compound is added to the N Reacting with hydroxysuccinimide to produce a residue having formula 1. actually Is a DNA probe sequence having a reactive amino group or Allows covalent attachment to separate aminated nucleotides, while protecting groups are Remove to produce the desired fluorescently labeled compound.   In the present invention, the protecting group is an acid-sensitive but base-stable compound. Preferred; thereby stabilizing it against the basic ph conditions required for esterification And is easily removed under acidic conditions for binding to nucleotides. Make it profitable. Add a protecting group to the starting material using any suitable conditions. Can be Preferably, these conditions are used in Example 2 below. Including things. Trifluoroacetyl (TFA) is a preferred protecting group (hereinafter Example 2 of). Mono- and polychlorinated acetyls, eg trichloro Similar to TFA, including acetyl (TCA) and dichloroacetyl (DCA) Other protecting groups with known chemistries can also be used. (TFA) CDAR Any of the preferred TFA fluorophore dye intermediates are commercially available using the methodology of Example 3 below. Suitable for subsequent succinimidylation.   The basic fluorescent residue having the formula 1 used in the practice of the present invention is At least one fluorophore substituent (or group), and even one Includes reactive substituents (or groups). In Formula 1, the fluorophore substituent is CDA The four cyclic residues of R. Reactive substituents are Reactive with and bind to reactive groups contained within the linking group in leotide To be selected.   The reactive substituent of formula 1 attached to the fluorophore is a It may be chosen to be reactive with either amino or carboxyl groups present. Good Preferably, the reactive substituent is a carboxyl and the linking group's reactive group is an amine. No, resulting in an amide bond. Due to reactivity with amino substituents in the linking group , Carboxy substituents are in the acid or salt form, aldehyde groups or the like. Possible. Preferred reactive substituents of formula 1 are isothiocyanate, N-hydroxy Succinimide ester, N-hydroxy-7-oxabicyclo [2,2,1] Hepta-5-ene-2,3-dicarboximide, N-hydroxy-5-norbol Nene-2,3-O-dicarboximide, sulfonyl chloride, chlorotriazine, Selected from droxybenzotriazolide, carboxylic acid azide, etc. Is illustrated.   Reactive substituents on fluorescent compounds due to reactivity with carboxy substituents in the linking group Is a carboxyl-reactive group, such as a primary (as defined above) or It may be a second form of amino substituent or the like. The preferred reactive substituent for this linkage is the It is a mono-amino substituent.                               Binding compound   As used herein, "binding compound", "linking group" or "chemical bond" The term generally refers to a nucleotide, polynucleotide sequence or mononucleotide. Means a hydrocarbon residue suitable for chemical attachment of the fluorescent residue label of the present invention to. Therefore, the binding compound must be capable of reacting with the fluorophore compound of the present invention.   Starting materials for preparing the binding compounds used in the practice of the present invention are: A bifunctional compound having two substituent functional (ie, reactive) substituents per molecule of emissive material. It is a potent organic compound. At least one such functionality per molecule of binding compound Sexual substituents are described in commonly assigned Bitner et al., US patent application Ser. No. 07 / 762,9. Aqueous transamination conditions catalyzed by bisulfite as disclosed in No. 13 Below is reactive with deoxytidine nucleotides in the polynucleotide Is preferred. Examples of substituents reactive with nucleotides are alkyl, amino ( 1st and 2nd), hydrazide, semicarbazide, thiosemicarbazide, etc. . At present, the amino group is most preferred.   Other functional substituents on the binding compound are reactive with fluorescent moieties of the invention. this Functional groups can be immediately reactive, i.e. unprotected or protected Good. Examples of suitable unprotected secondary functional substituents are amino, carboxyl, Phosphate, sulfonate, hydroxyl, hydrazide, semicarbazide, thiosemi There are carbazides, etc. Preferred non-protected secondary functional substituents include amino (primary Or second) and a carboxyl group. Suitable protected second functional substituents Examples of protected sulfonates, protected phosphates and protected There is a sulfhydryl. Examples of suitable protective substituents include lower alkyl groups such as For example, methyl, ethyl and propyl.   The two functional substituents present in such a bifunctional linking compound are each There may be substituents on carbon atoms adjacent to each other, or they may have multiple intervening groups. Spacing each other by mutually bonded atoms (preferably carbon atoms) Can be. The first and second functional substituents are linked by a linker or linking residue. I am fit. The binding residue can have any convenient structure, Must be non-reactive with other substances present in the transamination medium during transamination There is. The bond residue is acyclic or cyclic and may optionally include other atoms. It is a divalent hydrocarbon group having 2 to 20 carbon atoms. Ether group or Thioe It is preferred that only one ether group is present. At least 2 total binding compounds It is presently preferred that the organic groups have a total of no more than about 20 atoms.                               Probe manufacturing   The term “probe” or “probe composition” refers to individual label-containing residues. Polynucleotides or mixtures of polynucleotides such as chemically linked DNA sequences Means Each polynucleotide in the DNA probe is typically a target It is single-stranded when it hybridizes to the chromosome. The probe of the present invention is , A polynucleotide chemically bound to a fluorescent residue having Formula 1.   Any suitable procedure can be used to produce the probes of the invention, with any suitable procedure. The sequence is disclosed in Bitner et al., US patent application Ser. No. 07 / 762,913. ing. The preferred procedure is   (A) One pre-selected chromosome or pre-selected by any suitable means. Fragment the DNA sequence specific for the selected chromosomal site (ie Breaking) into DNA fragments (or segments);   (B) the deoxycytidine nucleotides present in the DNA fragment ( DNA having an amino group which is transamination by a binding compound (as described above) Produce a fragment; and   (C) A firefly having the amino group of a DNA fragment and Formula 1 under appropriate conditions. The step of covalently bonding (ie, chemically bonding) the photo residue is included.   For use as a starting material in the manufacture of the probe of the invention, one or A plurality of starting DNA sequences can be prepared by various techniques, for example (a) DNA isolated by multiple flow sorting of a single preselected chromosome (B) a chromosomal library of preselected chromosomes, and (c) a preselected chromosome Can be obtained from an interspecies hybrid that includes the DNA of an isolated chromosome. Preferred The starting chromosomal DNA is produced by standard methods and is well known to those skilled in the art. Sources, such as the American Type Culture Collection (Americ an Type Culture Collection (ATCC) or Live chromosomes available from other reservoirs of human or other cloned genetic material It's a rally. ATCC deposit is American Type Culture Collection 12301 Park Lawn Drive, obtained from Rockville, MD It is possible.   In the practice of the present invention, partial chromosomal DNA is used, which is a dye for the polychromosomal genome. Can be derived directly or indirectly from one preselected part of the chromophore it can. Such a starting partial chromosomal DNA typically contains at least one D It is in the form of an NA array. At least one such array or arrays, respectively Also has a large number of one type of DNA repeat segment, preferably a structurally different DNA repeat It is currently possible to include a large number of segments (ie at least two) preferable. Preferably, such a partial DNA sequence has the entire genome of the organism under study. Is unique relative to other parts of the. The starting partial DNA is an individual segment of a chromosome. Pre-selected parts that are individually present at various locations and throughout the selected site for Includes a number of DNA segments that are representative of the DNA present at the position It The presently preferred genome is the human genome.   The DNA segment is fragmented into specific preselected starting stains. Obtained from somatic DNA or starting partial chromosomal DNA. DNA after fragmentation The segments preferably have an average size in the range of about 20 to about 600 bp. The preferred average size range is about 150 to about 600 bp, and the more preferred average size is The range is from about 200 to about 400 bp, and the currently most preferred average size is about 300 b. p. Each of these DNA segments or fragments has a specific For the selected chromosome or preselected chromosomal site It is considered to be complementary to more than one DNA sequence.   In the present invention, specific chromosomal DNA is fragmented by sonication. It is preferred to generate a DNA fragment that Sonication condition is about 0.05 Use an aqueous dispersion of the particular starting chromosomal DNA in the range of about 4 mg / ml . The applied sonication frequency is about 20,000 cycles / sec, and In a cooling bath (dry ice and ethanol) to reduce heating of the sample The sample-containing test tube, which is preferably dipped in, is provided for about 1 to about 10 minutes. bra Branson Sonifier 450 (Dan) Microchip in aqueous solution using Parry (Danbury, CT) When positioned about 2 to about 5 mm from the bottom of the test tube, a suitable output is about 25 to about 30. Within the range of watts. Preferably, such ultrasonic energy is 80% off. For about 5 minutes using a 20% off cycle.   DNA specific to a chromosome or part thereof has already been cloned appropriately, eg from commercial sources. When it is obtained in the state of A separate fragmentation step is unnecessary.   The probe of the present invention can be used for chromosomes, aneuploid or abnormal chromosomes and dicentric chromosomes. Of the controls used in conjunction with other nucleic acid probes to identify Also useful for other suitable applications.                     Transamination of chromosomal probes   The term "chromosome paint" or "painting probe" refers to hive Under lid formation conditions, it contains one pre-determined chromosome of the polysome genome. Implementation of a Polynucleotide of the Invention Adapted to Hybridize with a Target A probe or probe composition as in embodiments. Typically, one aspect of the invention One painting probe co-stained and stained two pre-determined chromosomes. And can be mixed with a second painting probe to allow detection. It In contrast, a "chromosome enumeration probe" is a marker for a chromosome, such as a centromere site. A DNA probe adapted to hybridize with a target site.   In order to be able to label the DNA probe with the fluorescent residue of the invention, preference is given to Specifically, a part of all deoxycytidine bases in the chromosomal DNA is replaced with cytosine (ie, (Wachi deoxycytidine nucleotide) at the 4-position carbon atom of the amino group (as described above) A) Transamination by the amino group of the bifunctional binding compound. Starting DNA distribution Of all the nucleotides contained in such a mixture of sequences or DNA fragments About 0.2 to about 8 mol% is transaminated. In either case, the most effective The percentage of mination is typically influenced by the particular fluorescent labeling residue used.   The transamination is expediently modified under aqueous liquid phase conditions in the presence of bisulfite catalyst. Is achieved using a sex DNA sequence or segment. Aqueous amino with binding compound Dissolve in group transfer medium. Techniques for using chaotropes in transamination And advantages are described in Bitner et al., Co-pending US patent application Ser. No. 07 / 762,913. Is shown in.                       Enzyme (direct) labeled probe composition     Synthesis of fluorescently labeled deoxynucleoside triphosphate (fluoro-dNTP)   The fluorescent compound of the present invention is used in the direct fluorescent probe labeling methodology as described above. It can be attached to dNTPs by a linker as used. Preferred In other words, the compound is preliminarily attached to the nucleoside triphosphate at an appropriately accessible site. Reactive carboxy that chemically reacts with the reactive group moiety of the attached linker Has a group. The fluorescent residue of the present invention may also bind to mono- and diphosphates.   Suitable examples of nucleotides having a bound linker with a reactive substituent moiety are: An aminated deoxyribonucleotide, 5- (3-aminoallyl) -2'-de Oxyuridine-5'-triphosphate (AAdUTP, from Sigma) Available, catalog number A5910), N4- (3-aminopropyl) -2'-de Oxycytidine-5'-triphosphate (APdCTP, Kruikshank (Cruckshank), US Pat. No. 5,091,519. , And N6- (6-aminohexyl) -2'-deoxyadenosine- 5'-Triphosphate (AHdATP) Life Technologies Incorporated Available from Life Technologies, Inc., catalog No. 9514SA).   The synthesis of fluoro-dNTPs can be performed as described in Example 9 below. it can. Preferably, the method comprises reacting a reactive substituent of a fluorescent compound with an aminated deoxy group. Reacting with a sinucleotide in a borate buffer. Borate buffer, In addition, it acts to remove the TFA protecting group, removing the "bound" fluoro-dNTP. To generate.   Fluorescently labeled dNTP's produced by this method can be prepared by various methods well known to those skilled in the art. Therefore, it is suitable for being incorporated enzymatically into a polynucleotide. For example, Tomorrow is the standard Nick Transrace available from Life Technologies Fluoro-d by nick translation using a modified version of Enzymatic incorporation of NTP's was performed (Gibco / BRL- Life Technologies, Inc., Catalog Number 8160SB Please refer).               In situ hybridization and staining   Chromosome painting probe, chromosome enumeration probe and enzyme label of the present invention The probe composition comprises a dye for each preselected chromosome or chromosomal site. And well-suited for use in hybridization methods to identify them There is. Manipulation is carried out by (a) Of the sample under the hybridization conditions. Contacted with the probe of the present invention which hybridizes with the target DNA at the chromosomal site. Between the target DNA and the probe DNA segment present in the probe composition. An ibrid is formed, and (b) the remaining portion of the probe composition is separated from the obtained sample. Separate, and (c) perform three consecutive steps of testing the resulting specimen.   In situ hybridization involves preselected chromosomes or chromosome parts. Certain analytes may be included that include all or only some of the positions. Currently preliminary For specimens manufactured and fixed on slides such as glass slides In situ hybridization of the type commonly and conveniently performed for In, it is preferable to use the probe of the present invention.   Preselected chromosomes or chromosomes in specimens fixed on such slides In order to achieve site identification using the probe of the present invention, the method exemplified below is used. It can be carried out. Preferably, a specimen fixed on such a slide is prepared. Prepare and at least partially dehydrate DNA that is expected to be present And at least partially denatured. Conventional denaturing and dehydration methods And the material can be used, followed by the next hybridizing step. Carried out under forming conditions. First, the sample fixed on the slide was attached to the probe of the present invention. Contact with the composition. Next, the sample and the processing probe set in contact with it The product combination is incubated at about 30-45 ° C for an appropriate time. Then obtained The hybrid-containing sample is subjected to a liquid washing operation to remove any unreacted residual processing sample. The oven composition. Bhatt et al.Nucleic Acids Research 16 : 3951-3961 (1988). If desired, the counterdye can then be incorporated into the fixing medium.   Slides are viewed immediately after processing under a fluorescent microscope using conventional filters. Or store them at room temperature for several days or similar before testing. You can The advantages of the present invention are that the preferred Probe with a widely available filter set for the detection of fluorescein labels. It can be identified by using.   Those skilled in the art will be interested in in situ hybridization methods for specimens immobilized on slides. The order of (a) contact and (b) separation (as described above) is set as described above. It is reasonable to say that it can be conveniently performed more than once before performing step (c) (inspection). Understand. In each such iteration of steps (a) and (b) (for convenience , Different probe compositions, each performed as described hereinabove). And the probe composition of the present invention was used in one iteration and another (different) probe was used. The probe composition was used in each of the other replicates to Each is targeted to different pre-determined partial sites of the genome.   Those skilled in the art will appreciate that the green fluorescent nucleotides of the invention will be different for different probe compositions. Easily emits a color that is comparable to the color of the light emitted by the fluorophore label to understand. Therefore, the present invention provides at least two such color contrast fluorophores. Karyotype, genomic or specific staining using group-labeled probes sequentially or simultaneously Allows the body or its parts to be distinguished. Furthermore, having different emission colors It is also possible to combine such different fluorescent compounds with novel individual probe compositions. It is understood that it is possible. Such a novel probe composition has various emission colors. In combination with a fluorescently labeled probe composition containing but hybridizable to the same target It can be manufactured by For example, the green-emitting nucleoti of the present invention And prior art orange-red compounds can be combined in specific ratios, resulting in , Yielding a number of differently colored probe compositions. Such a fluorescent labeled probe composition The probe composition was prepared using various combinations of Individual chromosomes can be identified if they include a probe. Such a pair The combined labeled probe composition sets can be used simultaneously for all chromosomes of a particular karyotype. Most, if not, can be identified.                             Probe mixture   The features and advantages of the probe compositions of the present invention are that they are characterized by their chemical structure. Or other probe composition without adversely affecting its functional capacity, eg N, N, N ', N' tetramethyl-5, (6) -carboxy-3 ', 6'-diamino Rhodamine (N 'hydroxysuccinimide ester) (CTMR) orange fluorescence Have) and the like. For example, two different chromosomes Or orange (CTMR) and green (CDAR) fluorescent probes targeting chromosomal sites Lobes can be used to incidentally process the same sample. Therefore mixed The probe composition encapsulates a complex mixture of DNA segments under hybridizing conditions. Even if included, these individual segments hybridize to complementary target DNA. The desired specific chromosomal identification is achieved. Plow of the present invention Other probe compositions for use with the probe are preferably (probes of the invention In situ under similar hybridization conditions (relative to composition) It should be suitable for use in the bridging process.   The following examples are to be considered as illustrative and limit the invention Should not be considered.   Example 1.5 Synthesis of (6) -Carboxydiaminorhodamine (CDAR)   In a 250 ml two-necked flask, 3-aminophenol (25.0 g, 0.224 Mol), trimellitic anhydride (20.0 g, 0.104 mol) and concentrated sulfuric acid ( 100 ml) was added. 210 type temperature controller (J-Chem Ele Ktronics Incorporated (J-Kem Electronics Inc. )) Connected to a Teflon temperature probe (inserted directly into the reaction mixture) ), And the mixture under nitrogen flow up to 180 ° C (+ or -2 ° C) Magnetically stirred while heating.   The mixture took about 45 minutes to reach 180 ° C, then the temperature was increased to 180 ° C. It was maintained for another 4 hours. The resulting dark red solution was cooled to room temperature and then magnetically stirred. Ice cold water (400 ml) was added in small portions. Place the reaction flask in water (2 x 50 ml). After stirring for a while, the precipitate obtained is vacuum filtered (glass filter). Collected, washed with a limited amount of ice-cold water, and air dried to give a brick-colored solid. About 50 g was produced. Thin layer chromatography [TLC-acetonitrile-acetic acid -Water (8: 1: 1, v / v / v)] means that this solid is impure and has one major And several small amounts of green fluorescent component.   A portion (about 10 g) of the brick-colored solid was concentrated ammonia-water (1: 4, v / v) 1 50 ml), cooled on ice and added concentrated sulfuric acid to pH 2 Further purification was carried out by precipitating the dye with. Then the precipitate is vacuum filtered. Collected by filtration, washed with cold water, and air dried to yield about 7 g of material. . Final purification was done by boiling 0.5 M aqueous HCl (30 ml / gram (dye)). Activated carbon treatment (0.5g / 10g (pigment)) with crystallization and through fluted filter paper Hot filtration (recovery of deep red crystals about 50%). To system E TLC analysis by Minorhodamine, Rf = 0.40) and one minor component (Rf = 0.71) Indicated.   Further testing of the composition was done using TLC and spectral analysis. Chloro Rf is CDA using form-methanol-water (12: 7: 1, v / v / v) It was determined to be 0.27 for R and 0.32 for minor components.   UV absorption maximum is (0.1M Na₂HPO_Four/ NaH₂PO_Four, At pH 7.4 498 nm, the fluorescence emission maximum is 523 nm, and the excitation at 450 nm is Raised. Absorption maximum in methanol is 503 nm, emission maximum is 528 nm Met.Example 2: Bis (N-trifluoroacetyl) -5, (6) -carboxy-3 ' Of 6, 6'-diaminorhodamine [bis (TFA) CDAR]   Trifluoroacetic anhydride (TFAA) (12.0 g, 57.2 mmol) was added to Acetonitrile-pyridine mixture in a round bottom flask (2: 1 v / v; 120 ml) was added little by little. The mixture was cooled completely to -10 ° C (Etano). Liquid / liquid nitrogen). Next, purified CDAR (2.0 g, 5.4 mmol) was added to 0.4 g was added over 1.5 hours. Each time the dye was added, the fluorescence of the solution gradually faded to form a red wine color solution. Next After that, the solution was warmed to 10 ° C for 0.5 hours, then recooled to 0 ° C, and the reaction It was quenched with 5 ml of water. Steam the solution first using an aspirator and then using a vacuum pump. I fired. The residue was then coevaporated twice with 40 ml of toluene. Residue Is dissolved in 200 ml of ethyl acetate and twice with 100 ml of 1M HCl. Extracted. After back-extracting the aqueous extract with 100 ml of ethyl acetate, the organic phase extract was Mix and dry over sodium sulfate. Free carboxylic acid under the same conditions during extraction Care should be taken as it may be extracted into the aqueous phase below and cause significant impairment. To do. The residue is evaporated to dryness again and then co-evaporated with toluene to remain. All the pyridine was removed. This step leaves the product as a yellow powder to a dark oily residue. You can Dark oily residue dissolves the residue in the minimum amount of ethanol. It was converted to a powder by diluting with toluene and then evaporating. This This gives a fine yellow solid on the flask wall. Solids can be removed with a spatula Wear. The desired product is the major mobile TLC component (chloroform-methanol (4 : 1, v / v) and appear as Rf = 0.34) and after standing under UV lamp Becomes yellow. A significant amount of the substance remains at the baseline.Example 3. Bis (N-trifluoroacetyl) -5, (6) -carboxy-3 ' , 6'-Diaminorhodamine- (N'-hydroxysuccinimide) ester [ Bis (TFA) CDAR-NHS]   Bis (TFA) CDAR as 1.76 g of pale yellow powder from step 2 above Place in a rotary evaporator flask and dry N-N dimethylformamide. Todo (DMF) was dissolved in 30 ml, to which N-hydroxysuccinyl was dissolved. 0.536 g of amide (NHS) was added. The mixture is cooled to 0 ° C., DMF 3 m 0.58 g of N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIPC) in 1 Added to the magnetically stirred solution. DIPC (DIPC / NHS / DMF / 0 ° C ˜25 ° C.) produces a product of sufficient purity in sufficient yield. 1 hour later, ice bath Was removed and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. Furthermore, 0.25 g of DIPC and N 0.2 g HS was added and the mixture was stirred at room temperature overnight. Next, TLC (chloroform-methanol (4: 1, v / v)) showed that the reaction was about 9 It was shown to be complete to 0%. After recooling to 0 ° C, the reaction was allowed to Quench with 1 and remove DMF in vacuo. 250 ml of the residue is ethyl acetate Dissolved in 2M NH_FourCl solution 250 ml twice, followed by 5% w / v Extracted twice with 250 ml of sodium hydrogen carbonate solution. This solution is an emulsion And the trifluoroacetylamino group has the property to generate Be careful because it is extremely sensitive to. Next, 2M NH_FourCl (2 x Further extraction was carried out with 250 ml). Save all aqueous extracts and wash with ethyl acetate. Back extracted individually. Next, the organic phases are mixed and Na₂SO_FourDried in, and Evaporated to produce an orange solid. Sodium bicarbonate extraction on TLC A very yellow fluorescent byproduct that migrates slightly below the desired CDAR-NHS Most are selectively extracted without significantly removing the CDAR. Extract these Care must be taken to minimize basic hydrolysis of the TFA group in There is. At this point, the product is TLC (9: 1, v / v or 4: 1, v / v). v chloroform-methanol) still show some baseline impurities . Dissolve the impure solid product in ethyl acetate and use a minimum amount to completely dissolve it. Ethanol was added. For the final purification, chloroform-acetic acid (99: 1, v / v) was used. Flash chromatograph of packed silica used on a 12 x 3.0 cm column. Achieved by Fee. After adding the dissolved product, the column is washed with chloroform. -Eluted with acetic acid (99: 1, v / v). The desired product elutes at the front of the solvent It should be. The problem with elution profile is usually chloroform and And 2% v / v methanol can be overcome and a light yellow oil The product which is The product was ethyl acetate-petroleum ether (4 ml + 80 m l) precipitated and collected as a pale yellow powder by filtration on a glass strainer It Additional raw material is obtained by washing the glass filter and flask with ethyl acetate. I got a product. The powder is TLC (chloroform-methanol (9: 1, v / v)). Containing one major component and two very small components as determined by I was there. Furthermore, the powder is a convincing 1H NM showing an approximately 1: 1 mixture of regioisomers. This produced an R spectrum. 5 mg of main product is dimethyl sulfoxide (DMSO) Dissolves completely in 500 μl to give a pale yellow solution and is suitable for various labeling applications. Was used successfully.Example 4. Bis (N-trifluoroacetyl) -5, (6) -carboxy-3 ' , 6'-Diaminorhodamine- (N'-hydroxysuccinimide) ester [ CDAR from Bis (TFA) CDAR-NHS]   A portion of 5 mg of bis (TFA) CDAR-NHS prepared in Example 3 was replaced with methano. It was dissolved in 100 μl. Aqueous solution 0.1M K₂CO₃  100 μl was added. The solution immediately begins to turn yellow / green and retains trifluoroacetyl It showed partial hydrolysis of the protecting group. The simultaneous deprotection / regeneration reaction proceeded for several hours. 5-6 After hours, the reaction was TLC (chloroform-methanol-water (12: 7: 1, v / v / v) or acetonitrile-acetic acid-water (8: 1: 1, v / v / v)) It was thought that it was completed by being done. Single major component has higher Rf green fluorescence It could be detected along with traces of the substance.                 Example 5. Human chromosome-specific DNA probe   Human chromosome-specific DNA is described in Van Dilla, M .; A. (Biotechn logic   4: 537-552, 1986), Lawrence Livermore National Laboratories (Lawrence L) Ivermore National Laboratories) (LLNL ) Was obtained as a recombinant phage library from These libraries are Increase in E. coli host strain Amplified by breeding. Purify the amplified phages and extract their DNA , And the DNA was digested with the restriction enzyme HindIII. Insert DN A was purified from the λ vector DNA and used as a plasmid vector pBS (Stratagene Cloned into the HindIII site of Stratagene, La Jolla, CA. Was transformed. The resulting plasmid is E. coli strain DH5α (Bethesda Research Libraries (Bethesda Research Libraries) , Gaithersburg, Maryland).   After growth of the E. coli strain in a conventional fermentor, the plasmid DNA was digested with bacterial cell pellets. (Bitner et al., Co-pending US patent filed Sep. 20, 1991) No. 07 / 762,912). Mass of cells, cell pellet (M) 3 times (in milliliters) 50 mM glucose (sterilized by filtration), 10 mM NaEDTA (pH 7.5-8.0) and 25 mM Tris-HCl It was completely resuspended in a solution containing (pH 8.0). 0.2M NaOH and A solution containing 1% (w / v) sodium dodecyl sulfate (SDS) at 6xM Cells) and the cells were lysed with vigorous agitation. The solution becomes clear Add 55.5 ml glacial acetic acid and potassium acetate, 4.5 x M (in milliliters). A solution of 147.5 g of Um in a final volume of 500 ml was mixed thoroughly, resulting in Caused a fluorescent precipitate. The supernatant was separated from the fluorescent precipitate and the supernatant was collected at 7000xg. The precipitate was removed by centrifugation for 15 minutes.   Nucleic acids were precipitated from the supernatant with 1 volume of ethanol and then at 7000xg Centrifuge for 10 minutes, and pellet the nucleic acid pellet in a total volume of 0.54 x M (in milliliters). ). Next, the nucleic acid was added to 1/2 volume of neutral phenol and 1/2 volume. Extracted with an amount of chloroform and precipitated with 2 volumes of ethanol. The nucleic acid was 3xM (in milliliters), 50 mM Tris HCl, pH 7.0 and 10 Resuspended in a solution of 0 mM sodium acetate. Next, 0.77xM (micro Liters) 10 mg / ml RNase (heat treated), and Digested for 30 minutes at room temperature or overnight at 4 ° C. Next, 0.615xM (microphone A solution of proteinase K (20 mg / ml) (in liters) and 5 Incubated at 5 ° C for 3 hours. DNA with 1/2 volume of neutral phenol and It was extracted with 1/2 volume of chloroform and precipitated with 2 volumes of ethanol.   Resuspend the DNA in 0.415xM (in milliliters) water, 0.05x M ml of 5 M NaCl and 0.155 x M ml of 50% ( w / v) Add polyethylene glycol (PEG) (molecular weight 6000-8000) Incubate for 1 hour on ice water and centrifuge for 15 minutes at 7,000 xg. Precipitated by separation. DNA in 0.04 x M milliliter water and 1/1 Resuspend in 0 volume of 3M sodium acetate to obtain 1/2 volume of neutral phenol and And 1/2 volume of chloroform and then precipitated with 2 volumes of ethanol. It was Purified DNA with 0.0476 x M milliliters of deionized H₂Resuspended in O I let you. DNA concentration was determined by fluorometry.   Finally, the purified DNA was added to Branson Sonifier 450 (Danbury, Co. Sonicate (Neticut) to destroy small fragments of about 300 base pairs. I made it. This fragment size is empirically determined to be in situ hybrid. It was determined to be optimal for the DNA probe used in the formation method. Manufactured above 4 mg of purified purified plasmid DNA was resuspended in 2 ml of water and sonicated. It was immersed in a dry ice / ethanol bath so as not to boil during the treatment. Sonic wave Insert the microchip of the processing device until the tip is 2 to 5 mm from the bottom of the test tube. It was immersed in the solution. Sonicated at 25-30 watts output and 80% discontinuously 5 minutes using work cycle (80% on-time, 20% off-time) It was After sonication, 0.2 ml of 3M sodium acetate (pH 5.5) and ethanol DNA was precipitated by the addition of 4 ml. Precipitate 5 at 8,000 xg It was recovered by centrifugation for 1 minute and dried under reduced pressure.           Example 6. Bisulfite-catalyzed transamination of DNA   The DNA obtained by the method of Example 1 was bound to the C4 carbon atom of the cytosine base. Then, the amino group was transferred by adding ethylenediamine. This reaction is heavy Catalyzed by sodium sulfite. Fuming to produce bisulfite buffer 1.7 ml of HCl is deionized H on ice₂O was added slowly to 1 ml. Next Then, 1 ml of fresh ethylenediamine was gradually added on ice. Of ethylenediamine After dissolution, the solution was warmed to room temperature and 0.475 g sodium metabisulfite was added. added. Next, fuming HCl was added to the bisulfite mixture to reach pH 7.0. Gradually added until. Deionized water was added to a final volume of 5.0 ml. Ami DNA 1 milligram of sonicated DNA for H transfer₂O 0.3 ml Resuspended in. Denature the DNA by boiling at 100 ° C for 5 minutes Then, it was quenched in an ice-water bath. For transamination reaction, 0.3 ml of this DNA solution is used. Start by adding to 2.7 ml of bisulfite buffer and allow reaction to reach 37 ° C. And incubated for 2 days. The DNA solution was added to 5-10 mM sodium borate. It was desalted by normal dialysis against sodium (pH 8.0). After dialysis, 3M sodium acetate 0.3 ml of lymium (pH 5.5) was added to the dialysate. 2 aminated DNA ． Precipitate with 5 volumes of ethanol and spin at 8,000 xg for 10 minutes. I got it. The pellet was vacuum dried and rehydrated at a DNA concentration of 3 mg / ml. . This solution was stored at -80 ° C until use.   Example 7. Labeling of chromosome 1 probe with bis (TFA) CDAR-NHS   Unlabeled whole-chromosome paint (fragmented polynuclears directed to human chromosome 1 Reotide) 50 μg, Eppendorf test with 2.5 ml screw cap Evaporated to dryness in a tube. Re-dissolve the dried pellet in 50 μl of deionized water, After denaturing at 5 ° C for 5 minutes, it was rapidly cooled on ice. 100 mM for test tubes on ice Sodium borate buffer (pH 9.0, 350 μl, made from boric acid) In addition, the mixture was briefly stirred and warmed to room temperature. Next, bis (TFA) CDAR-NHS stock solution in DMSO (stock solution is 20 mM) Dye 6.63 mg / 50 100 μl (which was 0 μl (DMSO)) was added, the mixture was briefly stirred and And placed on a rotary mixer for 18 hours. DNA was added to 3M sodium acetate By adding 50 μl thorium followed by 1.250 ml absolute ethanol Precipitated and cooled to −60 ° C. for 2 hours. After centrifugation, remove the supernatant and pellet. The cake was washed with 70% aqueous ethanol and dried in a vacuum concentrator. Deep red The pellet often dissolves slowly and is regularly agitated in 100 μl of deionized water. It was stirred. The final purification was done using a Biospin 30 span column Achieved using BioRad, 7326006). 20 mM water A 5 μl aliquot of the eluate diluted to 1005 μl with sodium oxide gives 2 Absorbance at 60 nm and 508 nm is shown, A₂₆₀/ A₅₀₈Ratio 6.54 (after correction) ) Was given. Therefore, 2.8% of the bases were labeled with CDAR. 260 nm The absorbance at was corrected to the dye absorbance as follows.     A₂₆₀(Correction) = A₂₆₀-(A₅₀₈× 0.271) The fluorescence in 0.1 M phosphate buffer has an absorption maximum at 509 nm and 533 The maximum emission was at nm.Example 8. Chromosome enumeration (CEP-8) by Bis (TFA) CDAR-NHS Robe sign   A nucleic acid hybrid directed to a specific site on human chromosome 8 (CEP-8 DNA). Eppendorff with 2.5 ml screw cap Evaporated to dryness in a test tube. The method for producing CEP-8 DNA is described in Bitner et al., 19 Described in co-pending US patent application Ser. No. 07 / 762,912 filed September 20, 1991 It is listed. Redissolve the pellet in deionized water (50 μl) and mix at 95 ° C for 5 After denaturing for a minute, it was rapidly cooled on ice. 100 mM sodium borate for test tubes on ice Add thorium buffer (pH 8.5, 350 μl, made from boric acid) and mix The mixture was briefly stirred and warmed to room temperature. Next, DM of CDAR-NHS Stock solution in SO (pigment 1.5-2.0 mg / 100 μl (DMSO), 23-30 m M) 100 μl was added, the mixture was briefly stirred, covered with silver foil and rotary Placed on mixer for 16 hours. The yellow / green fluorescence of the dye is due to mixing overnight. However, the solution immediately after adding the dye is almost colorless (pale). It was yellow). To ensure complete deprotection of the dye, 1M sodium carbonate The solution (1/10 volume, 50 μl) was added and mixing was continued for 6-24 hours. mixture Was divided into 2 lots and sodium acetate (3M, 28μ l) followed by the addition of absolute ethanol (688 μl) to precipitate the DNA And cooled to −60 ° C. for 2 hours. After centrifugation, remove the supernatant and pellet Washed with 70% aqueous ethanol and dried in a vacuum concentrator. Deep red pere Are often slow to dissolve and should be regularly reconstituted in 50 μl each of deionized water. It was stirred. For the final purification, use a span column (Bio-Rad, Bio-Spin 30) Was achieved. The eluates were mixed and 100 mM with 20 mM sodium hydroxide. A 5 μl aliquot of the solution diluted to 5 μl had an A of 6.54 after correction.₂₆₀/ A_{Five 08} The ratio, ie 2.8% of the bases, was shown to be labeled with CDAR.Example 9. N4- (3-aminopropyl) -2'-deoxycytidine-5'-3 Preparation of phosphoric acid-carboxydiaminorhodamine conjugate   Bis (TFA) (CDAR-NHS) (prepared as described in Example 4) 6.6 mg are dissolved in 500 μl DMSO and 0.1% sodium borate. N4- (3-aminopropyl) -2 dissolved in 1.5 ml of a buffer solution (pH 9) '-Deoxycytidine-5' triphosphate (APdCTP) Kluikshank, USA Patent No. 5,091,519)) to the solution containing . Wrap a 2.5 ml Eppendorf test tube containing the pale yellow mixture in Gintama and Then, the mixture was reacted overnight on a rotary mixer at room temperature. Next, 25 μl of high-performance liquid chromatography (HPL) of the reaction mixture was used. Analysis by C) shows that the conversion of the starting material has been completely achieved and the retention time (Rt = 18 ． (03 minutes) 37.0 minutes and 38.3 minutes two new compounds (mixture of isomers) Was produced in a 1: 1 ratio. The completion of the trifluoroacetyl protecting group To ensure total removal, add 200 μl of 1M sodium carbonate solution and And the mixture was mixed on a rotary mixer for another 6 hours (retention time by HPLC This treatment was probably unnecessary, as no changes were observed in.   The product was first buffered with 0.05M triethylammonium bicarbonate (TEAB) buffer. DEAE Sephadex A-25 column (1.5 cm x 27 c) equilibrated with liquid Purified by chromatography on m). The solvent is a two-chamber gradient mixer ( Pharmacia (Pharmacia GM-1) to jerk pump (Pharmacia) P-1, 10 ×, set to pump 100-120 ml / hour 1.5 setting, 3.1 mm tube), three-way valve (Pharmacia, LV-3), then color Column (Econo column, Bio-Rad). Column? These eluents are based on the Kipp & Zonen chart. Holochrome connected to a recorder (chart speed 2 mm / min, 20 mV setting) To (Holochrome) UV / VIS detector (1AUFS, 552nm) moved. Finally, the eluate fraction (7 ml, 220 drops) was added to Gilson (Gilso). n) Collected with micro fractionator.   The sample was diluted with 2 ml of 0.05M TEAB and the column was packed by a three-way valve. Put it on the top. Then, before starting the gradient, load the column with 0.05M TEAB (2 It was washed with 50 ml). 0.05M TEAB in front of mixer and 0. 25M TEAB (250 ml) was charged. Next, in the front chamber, 0.25M TEA B, the rear part was filled with 0.5M TEAB. Finally, from 0.5M to 0.75M A gradient of buffer is run until the product is eluted. Various pigment-containing components and by-products The product is eluted before the product is eluted.   Often, the sample injection process occurs in the afternoon, filling the eluent chamber and pumping The first step of the gradient, which was lowered to the 1x, 5 setting, was done overnight. This flow velocity is Will typically fill approximately 65 fractional test tubes with 7 ml of liquid. next The next stage of the gradient started next morning.   Pure (HPLC) product (actually a mixture of two isomers, 5- and 6 -Fractions containing carboxydiaminorhodamine product peak) were pooled and Evaporation to dryness under oil vacuum pump pressure with a Lee evaporator (bath temperature> 30 ° C) I let you. The residue was coevaporated twice with absolute ethanol and dissolved in a few ml of deionized water. And quantified by absorbance at 503 nm. Extinction coefficient 60,000 at 503 nm Assuming that, the yield was 0.516 μmol (26%). Finally, the sample Evaporated to dryness in a Savant vacuum concentrator and stored at -20 ° C.Example 10. Novel fluorescent labeled nucleotide (fluoro-dNTP's) DNA Enzymatic incorporation into the probe   Enzymatic incorporation by nick translation of fluoro-dNTP's Standard Nick Translation Protocol (Life Technologies, It was carried out as follows using a modified method of Suda, MD). 1.5 ml ice-cooled 68 μl of deionized water, 0.2 mM spectrum o DUTP 2.5 μl, 0.2 mM deoxycytosine triphosphate (dCTP) ), Deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxyguanosine triphosphate ( dGTP) (10 μl), 0.2 mM deoxythymidine triphosphate (dTTP) ( 7.5 μl), Alul restricted CEP template (2.0 μl) 1 μg / μl, E. coli D NA polymerase I solution (10 μl) was added (sequentially). Mix the mixture easily Stir and spin for 10 minutes in a microcentrifuge to mix. Next, test the tube at 16 ℃ After incubating at room temperature for 2 hours, 0.3M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) The reaction was stopped with (10 μl), followed by stirring and centrifugation. Then each reaction The mixture was applied to a Biospin gel filtration column (BioRad, Catalog # 732-600). Purified according to the instructions given by the manufacturer in 6) and colorless. Alternatively, an almost colorless eluate (120 μl) was obtained. Next, DNA is added to 4M sodium acetate. Precipitated by adding thorium (12 μl) and ethanol (280 μl) And stored at −20 ° C. for at least 2 hours. Remove the supernatant with a pipette Invisible pellets cooled by Savant "SpeedVac" It was dried in a vacuum concentrator. Pass the DNA pellet in deionized water (20 μl) and pass through. The solvent was redissolved by carefully rolling the solvent on the side of the test tube with a tool pipette . Assuming a 50% recovery, the solution contains 50 ng / μl labeled probe.Example 11. In situ hybrid type using novel labeled DNA probe Detection of centromeric part of chromosome # 8 by method   Using the probe composition of Example 8 above, the centromere region of human chromosome # 8 was determined. It was identified (detected) as follows.   Target DNA is cultured normal leukocytes treated to trap metaphase cells. Made of Place these cells approximately 2-3 feet apart on the microscope slide. Were dropped to burst the nuclei and expose the chromosomes. Non-ruptured cells and interphase nuclei also It was present on the id surface. 70% formaldehyde / 0 prior to hybridization ． Denaturing solution consisting of 3M NaCl / 30 mM sodium citrate, pH 7.0 The slide was placed therein at 70 ° C. for 2 minutes. Then slide 70%, 85% and And dehydrated by passing through a 100% ethanol bath (2 minutes each) . The slide was then warmed to about 40 ° C.   The hybridization formulation placed on each slide was always 55% formamide. / 10% dextran sulfate / 0.15M NaCl / 15 mM sodium citrate PH 7.0. Pro Added to Basic Hybridization Formulation Probe concentration should be the optimal concentration needed to obtain acceptable signal strength and specificity. Changed to make a decision. The reaction mixture is further used as carrier and protected DNA. It contained 4.5 μg of sonicated human placental DNA that was added. Unlabeled human placenta Approximately 96 sonicated human placental DNA labeled with fluorescein in addition to DNA ng was added as a genomic counterstain. The production of such a genomic counterstain is Morrison et al., Co-pending US patent filed Sep. 19, 1991 07 / 762,928. Finished hybrid mixing After denaturing 10 μl of the product by heating at 70 ° C. for 5 to 15 minutes, 37 Incubated at 0 ° C for 5 minutes. Apply the formulation directly to the slide and cover Cover with a lath, seal the edges with rubber cement, and in a humid chamber at 42 ° C. Hybridized overnight at.   The next day, remove the coverslip and perform a series of washes, namely 0.3M NaCl. In 30 mM sodium citrate, 50% formaldehyde v / v, pH 7.0 At 45 ° C., 3 times for 15 minutes each, then 0.3 M NaCl / 30 mM Sodium citrate (2 x SSC) at pH 7.0 for 15 minutes at 45 ° C Wash once, then 0. M sodium phosphate / 0.1% NP40 detergent (Calbioque In "PN buffer", which is Calbiochem catalog # 492015). Unbound probe from slide by another wash for 15 minutes at 45 ° C at It can be removed. Finally slide the slides in PN buffer for 2 minutes at room temperature After washing twice, it was naturally dried. Target cells with 10 microliters of anti-bleaching solution It was placed on top and the cover glass was placed on it. The slide was observed under a fluorescence microscope. Bright green fluorescence was observed at the target portion of the chromosome. The fluorescence from non-specific binding is I couldn't guess.Comparative Example 1   This comparative example is based on the reaction of CDAR with disuccinimidyl carbonate. It was an attempt to directly produce CDAR-NHS. CDAR3 from Example 1 A solution of 4.0 mg and DSC 64.0 mg in 0.25 ml of 1M DMF was added. 122.17 mg of DMAP solution was added to the complete solution. Deep red solution immediately It turned pale orange and became slightly dark by stirring at room temperature, but still pale to some extent It remained. After 1.5 hours, the reaction mixture was subjected to thin layer chromatography (CH₃ CN: acetic acid: H₂O; 8: 1: 1), but it appears orange on THC No starting material or complex mixture of products containing major components and other coloring components is shown It was. The direct reaction to produce CDAR-NHS was unsuccessful.   While the preferred embodiment of the invention has been described, the invention is susceptible to various modifications. is there. Accordingly, the invention is considered to be limited to the precise details set forth herein. Not included and embraces all embodiments and modifications within the scope of the following claims. Should be interpreted as.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 緑色蛍光性を有する標識ヌクレオチドであって、 （ａ）遊離ヌクレオチドかまたはポリヌクレオチドの形のヌクレオチド三リン 酸および （ｂ）一般式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、該ヌクレオチド三リ ン酸に結合した化学結合を含む） を有する緑色蛍光残基を含む上記ヌクレオチド。 ２． 化学結合が、 −ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯ）−、 −（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ₂）₂ＮＣＨＯ−および ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₅ＮＨＣＯ− から成る群より選択される残基である請求項１に記載のヌクレオチド。 ３． Ｒ₅が、Ｃ−５位に位置した炭素原子に結合している請求項１に記載の ヌクレオチド。 ４． ヌクレオチド三リン酸がデオキシシチジンを含み、Ｒ₅が、ピリミジン 環のＮ−４位に位置した窒素原子に結合した化学結合を含む請求項１に記載のヌ クレオチド。 ５． ヌクレオチド三リン酸がウリジンまたはデオキシウリジンを含み、Ｒ₅ が、プリン環のＣ−５位に位置した炭素原子に結合した化学結合である請求項１ に記載のヌクレオチド。 ６． ヌクレオチド三リン酸がデオキシアデノシンを含み、Ｒ₅が、プリン環 のＮ−６の窒素原子に位置した化学結合を含む請求項１に記載のヌクレオチド。 ７． 前記ヌクレオチド三リン酸が、ＤＮＡプローブとして用いるためのポリ ヌクレオチドを含む請求項２に記載のヌクレオチド。 ８． Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、そしてＲ₅が を含む請求項１に記載のヌクレオチド。 ９． 約５２３ｎｍの発光最大値を有する請求項１に記載のヌクレオチド。 １０．緑色蛍光性を有する標識ヌクレオチドであって、 （ａ）遊離ヌクレオチドかまたはポリヌクレオチドの形のヌクレオチドリン酸 および （ｂ）一般式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、該ヌクレオチドリン 酸に結合した化学結合を含む） を有する緑色蛍光残基を含む上記ヌクレオチド。 １１．リン酸塩が一リン酸塩を含む請求項１０に記載のヌクレオチド。 １２．リン酸塩が二リン酸塩を含む請求項１０に記載のヌクレオチド。 １３．Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、Ｒ₅が−（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ−であり 、そしてリン酸塩が三リン酸塩である請求項１０に記載のヌクレオチド。 １４．一般式 （式中、Ｒ₁およびＲ₃は塩基感受性酸安定性保護基を含み、Ｒ₂およびＲ₄は水素 または１〜８個の炭素を有するアルキル基を含み、そしてＲ₅は水素または金属 イオンを含む） を有する化合物。 １５．Ｒ₁およびＲ₃がＣＦ₃−ＣＯ−を含み、Ｒ₂およびＲ₄が水素を含み、そ してＲ₅が である請求項１４に記載の化合物。 １６．Ｒ₁およびＲ₃が、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチルおよびジ クロロアセチルの群より選択される請求項１４に記載の化合物。 １７．染色体または染色体の一部分をｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法によ って識別するためのＤＮＡプローブであって、式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、ヌクレオチド三リン 酸に結合した化学結合を含む） を有する標識を含む上記プローブ。 １８．Ｒ₇〜Ｒ₁₂が水素であり、Ｒ₅が−ＮＨ−（ＣＨ₂）₂−ＮＨＣＯ−を含む 請求項１７に記載のプローブ。 １９．少なくとも１種類のＤＮＡ配列を更に含み、Ｒ5が該ＤＮＡ配列に結合 している請求項１８に記載のプローブ。 ２０．検出される染色体の少なくとも一部分に対してそれそれ相補的な多数の ＤＮＡセグメントを更に含む請求項１７に記載のプローブ。 ２１．多数のＤＮＡセグメントのそれぞれの一部分が少なくとも１種類の標識 を含む請求項２０に記載のプローブ。 ２２．Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、Ｒ₅が −ＮＨ−（ＣＨ₂）₂−ＮＨＣＯ−を含む請求項２０に記載のプローブ。 ２３．多数のＤＮＡセグメントの少なくとも二つが、異なる染色体の少なくと も一部分に対応する請求項１９に記載のプローブ。 ２４．染色体または染色体部位をｉｎ ｓｉｔｕ識別するための試薬の製造法 であって、 （ａ）検出される染色体または染色体部位の少なくとも一部分に対して本質的に 相補的な塩基配列を有するＤＮＡセグメント中に含まれる多数のシトシン塩基を アミノ基転移させ；そして （ｂ）式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、工程（ａ）において 製造されたアミノ基転移されたシトシン塩基の少なくとも一部分に結合したアミ ド化学結合を含む） を有する標識を共有結合して標識ヌクレオチドを製造する工程を含む上記方法。 ２５．（ｃ）工程（ａ）から生じた不純物を除去することによって標識ヌクレ オチドを精製すること を更に含む請求項２４に記載の方法。 ２６．Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、Ｒ₅が、アミノ基転移した塩基の窒素 原子に結合した−（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ−である請求項２４に記載の方法。 ２７．染色体または染色体部位をｉｎ ｓｉｔｕ識別するための試薬の製造法 であって、 （ａ）式 （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は水素であり、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁お よびＲ₁₂は同じであるかまたは異なり、水素、ハロゲンおよび１〜８個の炭素を 有するアルキル基から成る群より選択され、そしてＲ₅は、ヌクレオチドに対す る化学結合を含む） を有する標識を共有結合して標識ヌクレオチドを生じ、そして（ｂ）該標識ヌク レオチドを、ハイブリッド形成の際に光学技術を用いて検出を可能にする十分な 量で、検出される染色体または染色体部位に対して本質的に相補的な塩基配列を 有するＤＮＡ配列中に酵素的に取込む工程を含む上記方法。 ２８．ヌクレオチドがｄＵＴＰである請求項２７に記載の方法。 ２９．Ｒ₇〜Ｒ₁₂がそれぞれ水素であり、Ｒ₅がアミド結合を含む請求項２７に 記載の方法。 ３０．ヌクレオチドがｄＣＴＰである請求項２７に記載の方法。 ３１．緑色蛍光ローダミン色素の反応性誘導体の製造法であって、該誘導体は ヌクレオチドに対して結合しうる反応性基を含み、 （ａ）非置換アミノ基を有する蛍光ローダミン色素を保護反応体と反応させて 保護されたローダミン色素を生じ、 （ｂ）該保護されたローダミン色素を反応性結合物質と反応させて反応性誘導 体を生じることを含む上記方法。 ３２．保護反応体がトリフルオロ酢酸無水物である請求項３１に記載の方法。 ３３．反応性結合物質がジスクシンイミジルカーボネートである請求項３１に 記載の方法。 ３４．ローダミン色素が５（６）−カルボキシ−３′，６′−ジアミノローダ ミンを含む請求項３１に記載の方法。[Claims] 1. A labeled nucleotide having green fluorescence, comprising: (a) a nucleotide triphosphate in the form of a free nucleotide or a polynucleotide, and (b) a general formula Where R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ are hydrogen and R ₇ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ and R ₁₂ are the same or different and are hydrogen, halogen and 1 A nucleotide selected from the group consisting of alkyl groups having ˜8 carbons, and R ₅ comprises a chemical bond attached to the nucleotide triphosphates). 2. Chemical _{bonds, -CH = CHCH 2 NHCO -,} - (CH 2) 6 NHCO) -, - (CH 2) 3 NHCO -, - (CH 2) 2 NCHO- and _{CH = CHCH 2 NHCO (CH 2} ) 5 The nucleotide according to claim 1, which is a residue selected from the group consisting of NHCO-. 3. R ₅ is the nucleotide of claim 1 which is attached to a carbon atom located in the C-5 position. 4. The nucleotide of claim 1 wherein the nucleotide triphosphate comprises deoxycytidine and R ₅ comprises a chemical bond attached to the nitrogen atom located at the N-4 position of the pyrimidine ring. 5. The nucleotide according to claim 1, wherein the nucleotide triphosphate contains uridine or deoxyuridine, and R ₅ is a chemical bond bonded to a carbon atom located at the C-5 position of the purine ring. 6. Nucleotide triphosphate comprises deoxyadenosine, R ₅ is The nucleotide of claim 1 containing a chemical bond which is located to the nitrogen atom of the N-6 of the purine ring. 7. The nucleotide of claim 2, wherein the nucleotide triphosphate comprises a polynucleotide for use as a DNA probe. 8. R _{7 to} R ₁₂ are each hydrogen, and R ₅ is The nucleotide according to claim 1, which comprises: 9. The nucleotide of claim 1 having an emission maximum of about 523 nm. 10. A labeled nucleotide having green fluorescence, comprising: (a) a nucleotide phosphate in the form of a free nucleotide or a polynucleotide, and (b) a general formula Where R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ are hydrogen and R ₇ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ and R ₁₂ are the same or different and are hydrogen, halogen and 1 A nucleotide selected from the group consisting of alkyl groups having ˜8 carbons, and R ₅ comprises a chemical bond attached to the nucleotide phosphate). 11. The nucleotide of claim 10, wherein the phosphate salt comprises monophosphate. 12. The nucleotide of claim 10, wherein the phosphate salt comprises diphosphate. 13. Is hydrogen R ₇ to R ₁₂ are each, R ₅ is - (CH _{2) 2} is NHCO-, and the nucleotide of claim 10 phosphate is triphosphate. 14. General formula Wherein R ₁ and R ₃ include a base sensitive acid stability protecting group, R ₂ and R ₄ include hydrogen or an alkyl group having 1 to 8 carbons, and R ₅ is hydrogen or a metal ion. Including). 15. R ₁ and R ₃ include CF ₃ —CO—, R ₂ and R ₄ include hydrogen, and R ₅ is 15. The compound of claim 14, which is 16. R ₁ and R ₃ is The compound of claim 14 selected from the group of trifluoroacetyl, trichloroacetyl and dichloroacetyl. 17． A DNA probe for identifying a chromosome or a portion of a chromosome by in situ hybridization, comprising: Where R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ are hydrogen and R ₇ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ and R ₁₂ are the same or different and are hydrogen, halogen and 1 8 pieces of selected from the group consisting of alkyl radicals having carbon, and R _5, the probe comprising a label having a containing chemical bond attached to the nucleotide triphosphate). 18. The probe according to claim 17, wherein R _{7 to} R ₁₂ are hydrogen, and R _{5 includes} —NH— (CH ₂ ) ₂ —NHCO—. 19. The probe according to claim 18, further comprising at least one DNA sequence, and R5 is bound to the DNA sequence. 20. 18. The probe of claim 17, further comprising multiple DNA segments, each of which is complementary to at least a portion of the chromosome to be detected. 21. 21. The probe of claim 20, wherein a portion of each of the multiple DNA segments comprises at least one label. 22. The probe according to claim 20, wherein R _{7 to} R ₁₂ are each hydrogen, and R _{5 includes} —NH— (CH ₂ ) ₂ —NHCO—. 23. 20. The probe of claim 19, wherein at least two of the multiple DNA segments correspond to at least a portion of different chromosomes. 24. A method for producing a reagent for identifying a chromosome or a chromosome site in situ, comprising: (a) including in a DNA segment having a base sequence essentially complementary to at least a part of the chromosome or the chromosome site to be detected. A plurality of cytosine bases are transaminated; and formula (b) Where R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ are hydrogen and R ₇ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ and R ₁₂ are the same or different and are hydrogen, halogen and 1 Selected from the group consisting of alkyl groups having ˜8 carbons, and R ₅ has an amide chemical bond attached to at least a portion of the transaminated cytosine base prepared in step (a)) The above method comprising the step of covalently attaching a label to produce a labeled nucleotide. 25. 25. The method of claim 24, further comprising (c) purifying the labeled nucleotide by removing the impurities resulting from step (a). 26. R ₇ to R ₁₂ are each hydrogen, R ₅ is bonded to the nitrogen atom of the amino group transfer bases - (CH _{2) 2} NHCO- The method according to claim 24 which is. 27. A method for producing a reagent for identifying a chromosome or a chromosome site in situ, comprising: Where R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ are hydrogen and R ₇ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ and R ₁₂ are the same or different and are hydrogen, halogen and 1 Selected from the group consisting of alkyl groups having ˜8 carbons, and R ₅ covalently attaches a label having a chemical bond to the nucleotide) to yield a labeled nucleotide, and (b) the labeled nucleotide Enzymatic incorporation into a DNA sequence having a base sequence essentially complementary to the detected chromosome or chromosomal site in an amount sufficient to allow detection using optical techniques during hybridization. The above method comprising. 28. 28. The method of claim 27, wherein the nucleotide is dUTP. 29. R ₇ to R ₁₂ are each hydrogen, A method according to claim 27 R ₅ comprises an amide bond. 30. 28. The method of claim 27, wherein the nucleotide is dCTP. 31. A method for producing a reactive derivative of a green fluorescent rhodamine dye, the derivative comprising a reactive group capable of binding to a nucleotide, comprising: (a) reacting a fluorescent rhodamine dye having an unsubstituted amino group with a protective reactant. Producing a protected rhodamine dye, and (b) reacting the protected rhodamine dye with a reactive binding substance to yield a reactive derivative. 32. 32. The method of claim 31, wherein the protected reactant is trifluoroacetic anhydride. 33. 32. The method of claim 31, wherein the reactive binding substance is disuccinimidyl carbonate. 34. 32. The method of claim 31, wherein the rhodamine dye comprises 5 (6) -carboxy-3 ', 6'-diaminorhodamine.